KR100373375B1 - 인터루킨-1b-컨버팅효소및아포파인/cpp-32에대한저해제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 ICE 또는 아포파인/CPP-32의 활동을 방해하는 저해제에 관한 것으로서, 지금까지 알려지지 않은 새로운 골격, 즉 이소옥사졸린 및 이소옥사졸을 이용하였다. 발명을 구성하는 주요 부분인 합성법과 바인딩을 측정하는 법을 예시하였다. 이로부터 얻어진 저해제는 ICE 또는 아포파인/CPP-32의 작용으로 인하여 생겨나는 여러 형태의 질병을 완화하거나, 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

인터루킨-1β-컨버팅 효소 및 아포파인/CPP-32 에 대한 저해제

본 발명은 인터루킨-1β-컨버팅 효소(interleukin-1β converting enzyme, ICE or caspase 1) 및 아포파인/CPP-32 저해제(inhibitors)의 개발에 관한 것이다. ICE는 사이토카인(cytokines)의 한 종류로 생물학적으로 비활성인 프로 인터루킨 1β(prointerleukin-1β)를 활성화된 인터루킨-1β(interleukin-1β)로 변환시키는데 관여하는 효소이다. 인터루킨-1은 인터루킨-1α(interleukin-1α)와 인터루킨-1β(interleukin-1β)로 이루어져 있으며, 두 종류 모두 단핵세포(monocytes) 에서 31KDa의 전구물질형태로 합성되어, 그 중 프로인터루킨-1β 만이 ICE 에 의해 활성화된다. ICE에 의해 가수분해되는 위치는 Asp²⁷-Gly²⁸과 Asp¹¹⁶-Ala¹¹⁷인데 후자의 위치만 가수분해되면 인터루킨-1β가 얻어진다. 인터루킨-1β가 주요성분이며 또한 염증(inflammation)을 일으키는데 중요한 매개체로 작용하는 것으로 알려져 있다(1.3). ICE는 1989년에 처음으로 발견되었고, 1994년에 두 그룹에서 독립적으로 3차원적인 구조가 X-ray 결정구조학적 방법으로 밝혀졌다. 이효소는 α₂β₂형태의 테트라머이며, 시스테인 프로테아제(cysteine protease)로 알려저 있다. CPP-32의 3차원적인 구조도 1996년에 밝혀졌다(2).

ICE 저해제란 ICE의 활동을 방해함(inhibition)으로서 ICE의 작용으로 인하여 유발되는 염증이나 세포자살현상(apoptosis)등을 컨트롤할 수 있는 화합물을 말한다. 이들을 투여하여 증상을 없애거나, 완화시킬 수 있는 질병으로는 다음과 같이 여러 가지가 있다; 류마티스성 관절염(reumatoid arthritis), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease), 이식편대숙주질환(Graft vs. host disease), 패혈증(sepsis), 골관절염(Osteoarthritis), 골다공증(Osteoporosis), 급성 및 만성 골수백혈병(acute and chronic myelogenous leukemia), 뇌막염(meningitis), 난관염(salpingitis), 패혈성 쇼크(septic shock), 담도염(chalongitis), 대장염(colitis), 뇌염(encephalitis), 심내막염(endocarditis), 사구체신염(glomerulonephritis), 간염(hepatitis), 심근염(myocarditis), 췌장염(pancreatitis), 타입 I 당뇨병(Type I diabetes mellitus), 다발성 경화증(Multiple sclerosis), 알츠하이머 병(Alzheimer's disease), 파킨슨씨병(Parkinson's disease).

CPP-32 는 ICE 와 유사한 효소로서 아직 그 메커니즘이나 작용 방법, 역할이 잘 연구되어 있지는 않으나, 본 발명에서 P-4 사이트를 단순히 카복실산 moiety 로 치환하여 쉽게 CPP-32 의 억제제를 합성할 수 있다. CPP-32 의 활성화된 형태가 아포파인(apopain)이며, 가수분해하는 위치는 (P₄)ASP-X-X-Asp(P₁) 모티프이다. 알려진 기질은 폴리(ADP-리보오스) 폴리머라제, U1 70,000 Mr small nuclearribonuclcoprotein 및 460,000 Mr의 DNA-의존성 프로테인 키나아제의 촉매적 서브유닛 등이다. 아포파인/CPP-32 는 세포자살현상 초기에 관여하는 것으로 알려져 있는데, 저해제를 투여함으로서 세포자살현상과 관련된 질병들을 치료하는데 유용하게 사용할 수 있다.

참고문헌:

이에 본 발명자들은 지금까지 보고된 저해제와는 근본적으로 다른 화학구조를 가지는 화합물들을 새로 디자인하여 합성한 후, ICE와 CPP-32 에 대한 바인딩을 측정하고, 유사한 효소들에 대한 높은 선택성을 가지도록 하였으며, 그 결과 하기 화학식 1의 화합물이 본 발명의 소기 목적에 부합됨을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 인터루킨-1β-컨버팅 효소 및 아포파인/CPP-32(caspase-3) 저해제로서 유용한 하기 화학식 1의 신규한 헤테로환 화합물을 제공함을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 화학식 1의 화합물을 제조하는 신규한 방법을 제공함을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 화학식 1의 화합물을 함유함을 특징으로 하는 인터루킨-1β-컨버팅 효소 및 아포파인/CPP-32 저해제 조성물을 제공함을 목적으로 한다.

발명의 범위를 제한함에 앞서 다음의 중요한 용어 몇 가치부터 정의하기로 한다.

a) 단순알킬체인 (Simple Alkyl Chain, 약칭이 필요할 경우는 SAC로 나타낸다): 탄소수 1-8개로 구성된 탄화수소로서, 가지형(branched isomeric form)으로 이루어진 경우도 포함한다.

b) 단순시클로알킬체인 (Simple CycloAlkyl Chain, 약칭이 필요할 경우는 SCAC로 나타낸다): 탄소수3-10개로 구성된 고리형 화합물이다.

c) 아릴그룹 (aryl group, 약칭하여 Ar로 나타낸다): 벤젠{benzene[1:2,3,4,5,6]}, 나프탈렌{naphthalene[1,2:1,2,3,4,5,6,7,8,]}, 피리딘{pyridine [2,3,4:2,3,4,5,6]}, 인돌{indole[1,2,3,4,5,6,7: 1,2,3,4,5,6,7]}, 퀴놀린{quinoline[2,3,4,5.6,7,8: 2,3,4.5,6,7,8]}, 이소퀴놀린 {isoquinoline[1,3,4,5,6,7,8: 1,3,4,5,6,7,8]}, 푸란{furan[2,3:2,3,4,5]}, 티오펜 {thiophene[2,3:2,3,4,5]}, 피롤{pyrole[1,2,3: 1,2,3,4,5]}, 피리미딘{pyrimidine[2,4,5,6: 2,4,5,6]}, 이미다졸{imidazole[1,2,4,5:1,2,4,5]}을 나타낸다. 여기서 중괄호안의 앞쪽의 숫자는 해당되는 아릴그룹이 본 발명에 나타낸 저해제와 연결되어 있는 포지션을 나타내고, 쌍점(콜론)뒤의 숫자는 다음에서 따로 정의된 치환체(=Y)가 치환될수 있는 위치를 나타낸다. 치환체는 다음에 정의된 것들 중에서 순서와 종류에 관계없이 치환 가능한 수 만큼 최대한 치환될 수 있다.

치환체(=Y): -OH, OR(R=-SAC, -SCAC), -C(=O)R (R= -H, -SAC, -SCAC), -F, -Cl, -Br, -I, -CN, -N₃, -CO₂H, CF₃, -CO₂R(R= -SAC, -SCAC), -C(=O)NHR (R= -SAC, -SCAC), -C(=O)NR₂(R= -SAC, -SCAC)

자주 등장하는 용어를 다음과 같이 약칭한다.

Nl-클로로석신이미드(N-chlorosuccinimide) : NCS

N-메틸몰포린(N-methylmorporline) : NMM

N,N-디메틸포름아미드 (N,N-dimethyl formamide) : DMF

1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 {1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide}: EDC

1-히드록시벤조트리아졸 수화물(1-hydroxybenzotriazole hydrate) : HOBt

트리플로로아세트산(trifluoroacetic acid): TFA

t-부틸옥시카보닐(t-butoxycarbonyl): Boc

벤질옥시카보닐(benzyloxycarbonyl) : Cbz

메틸(methyl) : Me

에틸(ethyl) : Et

당량(equivalent) : Eq

본 발명은 인터루킨-1β-컨버팅 효소 및 아포파인/CPP-32의 억제효능을 지니는 하기 화학식 1의 신규한 이소옥사졸(또는 이소옥사졸린) 유도체 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기식에서 치환체 R, R₁, R₂, R₃, R₄, X에 대한 구체적인 정의는 다음과 같다.

I)은 단일결합 또는 이중결합을 나타낸다(단,이 이중결합인 경우 R₂는 존재하지 않는다).

II) R 은 독립적으로 단순한 알킬그룹(-SAC)이거나, 시클로알킬(-SCAC), 아로마틱(-Ar), 아로마틱으로 치환된 알킬(-SAC-Ar) 또는 수소를 나타내며, 바람직하게는 수소를 나타낸다.

III) R₁및 R₃는 각각 독립적으로 -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar 일 수 있으며, 모든 천연아미노산의 곁가지(side chain residue)를 포함한다. R₁또는 R₃로 인하여인접위치가 스테레오센터가 되는 경우 두가지 경우의 입체 화합물이 모두 포함되며, 두 가지형의 화합물이 공존하는 경우(디아스테레오머릭 혼합물을 말함)도 포함된다. R₁또는 R₃가 아미노산의 곁가지(side chain residue)로서 카르복스산이나, 염기로 구성되어 있을 경우 단순 에스테르등으로 보호기가 붙어있는 경우나, 약제학적으로 허용되는 염(salt) 형태로 존재하는 경우도 포함된다.

IV) R₂는 SAC, SCAS, Ar, -SAC-Ar일 수 있으며, 모든 천연아미노산의 곁가지(side chain residue)를 포함한다. R₂로 인하여 인접위치가 스테레오센터가 되는 경우 두가지 경우의 입체화합물이 모두 포함되며, 두가지형의 화합물이 공존하는 경우(디아스테레오머릭 혼합물을 말함)도 포함된다. R₂가 아미노산의 곁가지(side chain residue) 로서 카르복스산이나, 염기로 구성되어 있을 경우 단순 에스테르등으로 보호기일 경우 단순 에스테르등으로 보호기가 붙어있는 경우나, 약제학적으로 허용되는 염(salt) 형태로 존재하는 경우도 포함된다. R₂는 다음의 특별한 경우도 포함한다, 즉, -(CH₂)_nOR(R = -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar: n = 1,2), -(CH₂)_nOC(=O)R (R=-SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar: n=1,2)

V) R₄는 모든 아미노산의 유기산 아실그룹(acyl group)이 모두 포함된다. 뿐만 아니라, -C(=O)R (R = H, -SAC, -ACAC, -Ar, -SAC-Ar), -C(=O)OR (R=-SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar), -C(=O)NRR' (R,R'=H, -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar), -SOR(R= -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar), -SO₂R (R = -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar)도 포함한다.

VI) R₁과 인접한 R, 그리고 R₃와 인접한 R 은 각각 서로 연결되어 고리형 화합물을 형성할 수 있다. 즉 R₁-R, R₃-R= (CH₂)n. (CH₂)n-O-(CH₂)m, (CH₂)n-NR'-(CH₂)m[ n+m <9. R'= SAC, ACAC, Ar, SAC-Ar, -C(=O)-SAC, -C(=O)-ACAC, -C(=O)-Ar, -C(=O)-SAC-Ar]을 포함한다.

VII) X는 -CN, -CHO, -C(=O)R[R=-SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar]. -C(=O)OR[R=-SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar]. -CONRR'[R,R'=각각 독립적으로, -H, -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar], -C(=O)CH₂OR[R=-SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar], -C(=O)CH₂OC(=O)R[R=-SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar]이다.

X가 -COCH₂-W의 형태인 경우 W로는 다음의 그룹이 특별히 포함된다{Y의 정의는 앞에서 논의되었다. R =-SAC.-SCAC, -Ar, -SAC-Ar}.

본 발명에서 나타난 이소옥사졸린이나 이소옥사졸을 합성하는 법은 하기 반응식 1 및 2에 나타낸 바와 같다. 이 설명은 단지 가장 일반적으로 본 발명에서 사용된 방법 만을 나타낸 것일 뿐 단위조작의 순서는 얼마든지 바꿀 수 있으므로 아래에서 설명하는 방법에만 국한 되는 것은 아니다.

아미노기가 보호된 아미노산 1을 환원하여 N-프로텍티드 아미노알콜 2를 합성하고, 2 를 다시 산화하여 N-프로텍티드 아미노 알데히드 3 을 만든다. N-프로택티드 아미노 알데히드 3 을 알콜-물 혼합용액에서 히드록실아민-히드로클로라이드 및 탄산나트륨과 반응하여 옥심4 (syn 및 anti 옥심)를 합성한다. 얻어진 옥심유도체 4 를 디메틸포름아미드 용액에서 NCS (N-chlorosuccinimide)를 처리하여 히드록사모일클로라이드 유도체 5 (hydroxamoyl chloride)를 합성한다. 히드록사모일클로라이드 유도체를 합성하는데 사용한 치화체로는 다음과 같응 그룹들이 대표적이다. P₁은 Cbz, t-Boc, Fmoc, Teoc(트리메틸실릴에틸옥사카보닐: trimethylsilyl- ethyloxycarbonyl)등이며, R 은 주로 H이고, R₃는 -CH₂CH₂CO₂Bu(t), -CH₂CO₂Me, -CH₂CO₂Bu(t), -isopropyl 등이다.

[반응식 1]

얻어진 히드록사모일클로라이드 5 를 아크릴레이트 유도체 6와 반응시켜 이소옥사졸린 유도체 7을 얻는다(반응식 2). 경우에 따라서는 옥심유도체 4에서 직접 이소옥사졸린 유도체 7을 얻기도 한다. 보호기 P₁를 바로 억제제에 사용할 수 있는 경우(예로서 Cbz 그룹을 들 수 있다)에는, 이소옥사졸린 유도체 7을 직접 화합물 9와 반응시켜 일반식으로 표시된 화합물을 억고, 보호기 P₁을 새로윤 치환기로 변환할 필요가 있는 경우는 P₁를 제거하고 다시 R₄기를 도입한다.

[반응식 2]

위의 식에 나타낸 화합들 9 에서 작용기(functional group) X는 왼쪽의 화합물 7 또는 8을 반응시킨 후에 다시 몇 번의 단위조작을 거쳐 합성할 수도 있고, X가 이미 원하는 형태를 가진 상태로 화합물 7 또는 8을 반응시킬 수도 있다.

화학식 1의 화합물중 이소옥사졸 억제제의 경우는 위에서 언급한 이소옥사졸린 합성법과 유사하나, 단지 하이드록사모일 클로라이드 유도체 5와 반응하는 파트너를 아크릴레이트 유도체 6 대신 3중결합을 가진 프로피온산 유도체로 사용한다는 점만 다르다.

아크릴레이트 유도체 6 을 합성하는 발명은 하기 반응식 3에 나타낸 바와 같이 크게 두가지로 나뉜다. 에스테르 유도체 11을 디에틸 옥살레이트와 반응하여 옥살레이트 유도체 12을 합성하고 다시 포름알데히드와 염기 존재하에 반응시키면 원하는 아크릴레이트 유도체 6을 합성할 수 있다. 또 다른 방법으로는 알려진 화합물13a로부터 출발하는 여러가지 변형법을 들 수 있다. 즉 알려진 화합물 13a를 13b, 6e, 6f, 6g등으로 쉽게 변형시켜서 사용한다.

[반응식 3]

아래에서 본 발명으로 합성한 대표적인 화합물의 구조식을 기술하였다. 이는이들의 합성법을 실시예를 통하여 보다 상세하게 기술하기 위한 목적일 뿐이다. 그러므로 하기의 실시예는 본 발명이 실제로 행하여 졌고 또 가능하다는 사실을 증명하기 위한 예시일 뿐, 본 발명이 이로써 제한되는 것은 아니다.

4. 합성및 바인딩 측정의 실시예

a) 히드록사모일 클로라이드 (hydroxamoyl chloride)의 합성

(실시예1) : 중간체 N-t-부톡시카르보닐-(S)-발린알 [N-t-butoxycarbonyl-(S)-valinal](3b) 의 합성 및 N-t-부톡시카르보닐-(S)-발린알옥심 [N-t-butoxy-carbonyl-(S)-valinal oxime](4b) 의 합성

디메틸술폭시드(11.7 mL, 3.0 당량)를 질소 기압하에 정제된 무수 디클로로메탄(약 200 mL)에 녹이고. 약 -60℃ 에서 옥살릴클로라이드(oxalyl chloride, 5.78 mL, 1.2 eq)을 천천히 가하였다. 10분후에 N-t-부톡시카르보닐-(S)-발리놀(2b)[N-t-butoxycarbonyl-(S)-valinol, 11.23g, 55.24 mmol)을 무수 디클로로메탄(30 mL)에 녹인 용액을 천천히 가하고. 플라스크를 20mL의 디클로로매탄으로 헹구어 넣었다. 결과로 얻어지는 흰색의 스셔펜션을 약 -50 ℃로 유지하면서 한시간 동안 교반하였다. 디이소프로필에틸아민(diisopropylethylamine, 28.8 mL, 3.0 당량)을 가하고 온도를 -23 ℃ 정도로 약 20분 유지시켰다. 이 용액에 헥산(hexanes, 400 mL)을 가하고, 분액 깔때기에서 물(150 mL). 1N-KHSO₄용액(total 1 L)으로 3번 씻은후, 건조(무수 Na₂SO₄)-감압 농축하였다. 얻어진 옅은 노랑색의 액체(3b)를 더 이상의 정제나 조작을 거치지 않고 바로 다음 단계반응에 사용하였다.

위애서 얻은 알데히드(3b)를 에탄올(60 mL)-물(30 mL)에 녹이고 상온 물 중탕에서 히드록실아민히드로클로라이드(hydroxylamine hydrochloride, 5.76g, 1.5 당량)과 무수탄산나트륨(Na₂CO₃. 4.39g. 0.75 당량)을 가하였다. 약 1분후 많은 양의 고체가 생성되어 물-에탄올(1:1, 60 mL)를 가하고 한시간 동반 교반 하였다. 포화된 소금물(100 mL)를 가하고 에틸아세테이트로 두번 추출하였다(300 mL). 추출액을 옅은 농도의 탄산수소나트륨 용액(NaHCO₃, 100mL × 2)으로 씻고, 건조(무수 Na₂SO₄)-감압농축 하였다. 11.34g 의 흰색분말의 옥심(4b)이 syn,anti 혼합물 형태로 얻어졌다.

(실시예2) : 중간체 2-(t-부톡시카보닐)아미노-(2S)-1-클로로-3-메틸-부탄-1-온 옥심 [2-(t-butoxy carbonyl)amino-(2S)-1-chloro-3-methyl-butane-1-one oxime} (5b) 의 합성

위에서 얻은 옥심(4b, 11.34g)을 디메틸포름아미드(100mL)에 녹이고 NCS(7.75g)을 가하였다. 이 용액을 약 40℃ 물 중탕에서 교반한 다음 휘발성 용매를 감압 증류하여 제거하였다. 잔류물질을 에틸아세테이트-헥산(1:1, 150 mL)에 녹이고 물(100mL × 3)로 씻고, 건조(무수 Na₂SO₄) 하여 감압 농축하였다. 다시 헥산에 녹이고 감암 농축하여 13.69g의 원하는 화합물(5b)을 얻었다.

(실시예3) : 4-(9-플로레닐메톡시카보닐)아미노-(4S)-5-하이드록시펜타노일산 t-부틸에스테르[4-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)amino-(4S)-5-hydroxypentanoic acid t-butyl ester] (2c)의 합성

N-(9-플로레닐메톡시카보닐)-γ-t-부틸글루탐산[N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-γ-t-butyl glutamic acid, 1c, 8.51g, 20.0 mmol)을 질소 기압하에 약 110mL의 무수테트라히드로푸란에 녹이고, 얼음물로 0℃로 유지한 다음, NMM (2.42mL, 1.1 eq)과 이소부틸클로로포메이트(isobutyl chloroformate, 2.72mL, 1.05eq)를 가하고 20분 동안 교반하였다. 또 다른 둥근 플라스크에 NaBH₄(1.5g)를 무수테트라히드로푸란(120mL)-메탄올(30 mL)에 녹인 용액을 -78 ℃로 유지한 상태에서, 앞의 반응에서 생성된 흰색의 스서펜션을 질소기압을 유지하면서 걸러면서 가하였다(filter-add). 플라스크를 20mL의 무수 테트라히드로푸란으로 헹구어 넣고, 그 온도에서 2.5 시간 교반한 다음 무수초산(13mL)로 반응을 중지시켰다. 감압증류하여 약 50mL정도가 남도록 농축하고, 이 잔류물을 헥산-에틸아세테이트(200 mL,1:1)에 녹인 다음, 물(150 mL×2)로 씻었다. 수용액 층을 다시 헥산-에틸아세테이트(150 mL, 1:1)로 추출하고. 유기층을 합쳐서, 포화탄산수소나트륨 수용액(150 mt × 2)으로 씻었다. 건조(무수 Na₂SO₄)-감압 농축하여 8.30g의 알콜유도체(2c)를 유리형의 고체로 얻었다. 더 이상 분리정제 없이 다음단계로 진행하였다.

(실시예4) : 4-(9-플로레닐메톡시카보닐)아미노-(4S)-5-클로로-5-히드록시이미노-펜타노일산 t-부틸에스테르 [4-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)amino-(4S)-5-chloro-5-hydroxyimino-pentanoic acid t-butyl ester ] (5c) 의 합성

디메틸술폭시드(3.0 mL)를 질소 기압하에 무수 디클로메탄 (100 mL) 녹이고 온도를 약-65℃로 유지한다음, 옥살릴클로라이드 (oxalyl chloride, 2.10mL, 1.2eq)를 천천히 가하였다. 15분 동안 교반 한 후, 전 단계에서 합성한 알코올 유도체(2c)를 무수 디클로메탄 (50 mL)녹인 용액을 천천히 가하였다. 무수 디클로로메탄(20mL)으로 헹구어서 가하고 2 시간 동안, 온도를 -40∼-50 ℃로 유지하면서 교반하였다. EtN(i-Pr)₂(10.45 mL, 3.0eq)를 가하고 서서히 온도를 올리면서, TLC로 알데히드의 생성을 관찰하였다. 약 1시간동안 -10 ℃정도 까지 온도를 올리면 반응이 완결되었다. 반응물을 헥산(300mL)으로 묽히고, 물(150 mL)과 1N-KHSO₄(3번, 총 500mL)수용액으로 씻었다. 건조(무수 Na₂SO₄)-감압 농축하여 고체의 알데히드(3c)를 얻어, 바로 다음 단계로 진행하였다.

앞에서 얻은 알데히드(3c)를 에탄올(60 mL)-디클로로메탄(30mL)-물(10 mL)에 녹이고 0℃로 유지한 다음, H₂NOH.HCI (2.08g, 1.5eq)와 무수탄산나트륨(1.60g, 0.75 eq)을 가하고 상온에서 교반 하였다. 30분 후에 물(10 mL)을 가하고, 1시간더 교반한 후에, 다시 H₂NOH.HCl (400mg)와 무수탄산나트륨(320mg)을 가하고 1시간 더 교반하였다. 대부분의 용매를 감압하에 제거하고, 잔류물을 에틸아세테이트(200mL)에 녹인다음, 물 (100mL), 포화탄산수소나트륨용액(100mL)로 씻었다. 건조(무수 Na₂SO₄)-감압농축하여 흰색분말의 옥심(4c, 8.30g, syn + anti)을 얻었다.

위에서 얻은 옥심(4c)을 디메틸포름아미드(35 mL)에 녹이고 NCS(2.67g, 20.0 mmol)를 가하였다. 반응 용기를 약 40℃ 정도의 물중탕 속에서 1시간 교반하고, 대부분의 디메틸포름아미드를 감압 증류하여 제거하였다. 잔류물을 헥산-에틸아세테이트(1:1, 150 mL)에 녹이고, 물(100mLx3)로 씻고, 건조(무수Na₂SO₄)-감압 농축하여 흰색의 히드록사모일클로라이드 유도체(5c, 9.25g) 를 syn, anti 의 혼합물로 얻었다.

이와 유사한 방법으로 5a, 5d, 5e, 5f 도 합성하였다.

b) 아크릴레이트 유도체의 합성

(실시예5): 에틸2-아세톡시메틸아크릴레이트 [Ethyl 2-acetoxymethylacryl-ate] (6c) 의 합성

에틸 2-히드록시메틸아크릴레이트 (Ethyl 2-hydroxymethyl acrylate, 13a, 17.3g, 133 mmol, 순도 약 70%, 합성법: Villieras, J. and Rambaud, M. Synthesis, 1982, 914)를 질소 기압하에 약 200 mL의 무수 디클로로메탄에 녹이고, 0℃로 유지한 다음 초산 무수물 (18.8 mL, 1.5 eq)과 트리에틸아민(37 mL, 2.0 eq)을 가하였다. 하룻밤 교반 한 후에, 헥산(400 mL)을 가하고, 포화 탄산수소나트륨용액(300 mL x 2)으로 씻었다. 건조(무수 Na₂SO₄) 하여 감압 농축한 다음, 단순증류(simple distillation)하여 14.6g 의 투명한 액체를 얻었다.¹H-NMR(CDCl₃, 500 MHz)로 분석한 결과 약 70%의 순도를 가진 원하는 화합물임이 밝혀졌다.

(실시예6): 에틸 2-페녹시메틸아크릴레이트 (Ethyl 2-phenoxymethylacrylate) (6g) 의 합성

에틸 2-브로모메틸아크릴레이트(Ethyl 2-bromomethylacrylate, 13b, 2.00g, 10.4 mmol, 합성법: Villieras, J. and Rambaud, M. Synthesis, 1982, 914)와페놀(975 mg, 1.0eq)을 질소 기압하에 무수 테트라히드로푸란(20 mL)애 녹이고0℃로 유지한 다음, 무수탄산칼륨(1.43g, 1.0 mol eq)을 가하였다. 1시간동안 교반 하였으나, 아무런 반응이 일어나지 않아, 무수디메틸포름아미드(20 mL)를 가하고0℃에서 2시간, 상온에서 1 시간 동안 교반 하였다. 감압 농축한후, 물(100 mL)를 가하고, 에틸아세테이트로(100 mLx2) 추출하였다. 유기층을 소금물(100 mL)로 씻고, 건조(무수 Na₂SO₄) 하여 감압 농축한후, 관 크로마토그래피로 분리(40% 디클로로메탄/헥산)하여 1.712g (80%)의 원하는 화합물을 얻었다.

(실시예7): 에틸2-(4-브로모페닐) 아크릴레이트[Ethyl 2-(4-bromophenyl)acrylate] (6b) 의 합성

이미 알려진 에틸 2-페닐프로페노에이트(Ethyl 2-phenylpropenoate)의 제법을 따라서 합성하였다. (Helvetica Chimica Acta 1986. 69 2048)

에틸2-(나프탈렌-1-일) 아크릴레이트 [Ethyl 2-(naphthalen-1-yl)acrylate](6c)

에틸2-(나프탈렌렌-2-일) 아크릴레이트 [Ethyl 2-(naphthalen-2-yl)acrylate] (6d)

C) 본 발명에서 사용한 이소옥사졸린(isoxazoline)의 일반적인 합성방법:

(실시예8): 3-(1-벤질옥시카보닐아미노-2-메틸-프로필)-5-페녹시메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르복실산 에틸 에스테르 [3-(1-benzyloxycarbonylamino-2-methyl-propyl)-5-phenoxymethyl-4,5-dihydro-isoxazole-5-carboxylic acid ethylester] (7c) 의 합성

히드록사모일 클로라이드(hydroxanloyl chloride 5a, 640 mg, 2.25mmol)과 에틸2-페녹시메틸아크릴레이트 (Ethyl 2-phenoxymethylacrylate, 6g, 464mg)을 질소기압하에 무수 에테르(10 mL)에 녹이고-78℃로 유지한 다음, 트리에틸아민(627mL, 2.0eq)을 가하였다. 서서히 온도를 상온으로 가도록 유지하면서 하룻밤동안 교반하였다. 물(100 mL)를 가하고, 에틸아세테이트(100mLx2)로 추출한 다음, 물(100mL)로 씻고, 건조(무수 Na₂SO₄) 하여 감압 농축하였다. 관 크로마토그래피로 분리(15% 에틸아세테이트-헥산)하여 851mg(8%)의 원하는 화합물을 얻었다.¹H-NMR로 분석한 결과 거의 1:1디아스테레오머 혼합물이었다.

3-[(1S)-1-t-부톡시카보닐아미노-2-메틸프로필)-5-(나프탈렌-2-일)-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르복실산 에틸 에스테르] {3-[(1S)-1-t-butoxycarbonylamino-2-methylpropyl]-5-(naphthalene-2-yl)-4,5-dihydro-isoxazole-5-carboxylic acidethyl ester } (7j)

3-[(1S)-1-t-부톡시카보닐아미노-2-메틸프로필)-5-페닐메틸-4.5-디히드로-이소옥사졸-5-카르복실산 에틸 에스테르] {3-[(1S)-1-t-butoxycarbonylamino-2-methylpropyl]-5-phenylmethyl-4,5-dihydro-isoxazole-5-carboxylic acid ethyl ester} (~1:1 디아스테레오머)) (7g)

5-아세톡시메틸-3-[(1S)-t-부톡시카보닐아미노-2-메틸프로필]-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르복실산 에틸 에스테르, 5-acetoxymethyl-3-[(1S)-1-t-butoxy-carbonylamino-2-methylpropyl]-4,5-dihydro-isoxazole-5-carhoxyl ic acid ethylester (7m)

(실시예 9) : 3-[(1S)-1-(9-플로레닐메톡시카보닐아미노)-3-t-부톡시카보닐-프로펄]-5-메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸튼-카르복실산 메틸 에스테르, 3-[(1S)-1-(9-fluorenylmethoxycarbonylamino)-3-t-butoxycarbonyl-propyl]-5-methyl-4,5-dihydro-isoxazole-5-carboxylic acid methyl ester (7e) 의 합성

N-Fmoc-γ-t-부틸 글루탐산 (N-Fmoc-γ-t-butyl glutamic acid)에서 합성한 히드록사모일 클로라이드 (5c, 3.44g, 7.50 mmol)와 메틸 메타아크릴레이트(methyl methacrylate 2.40mL, 3.0eq)를 EtN(i-Pr)₂(1.96mL, 1.5eq)존재하에 무수 에테르애서 앞에서 기술한 방법으로 반응하여 3.46g (89% overall)의 이소옥사졸린 유도체를 얻었다(괸 크로마토그래피로 정재, 25-30% 에틸아세테이트/헥산)

d) isoxazoline 의 변환 (보호기 제거, P₄그룹의 도입, 에스테르 가수분해)

(실시예 10) : 3-{2-메틸-(1S)-1-[(나프탈렌-2-카보닐)-아미노]-프로필}-5-페녹시메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르복실산 에틸 에스테르, 3-{2-methyl-(1S)-1-[(naphthalene-2-carbonyl)-amino]-propyl}-5-phenoxymethyl-4,5-dihydro-isoxazole-5-carboxylic acid ethyl ester (8g)의 합성

5-페녹시메틸-3-{(1S)-1-t-부톡시카보닐아미노-2-메틸-프로필}-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르복실산 에틸 에스테르, 5-phenoxymethyl-3-{(1S)-1-t-butoxycarbonylamino-2-methyl-propyl}-4,5-dihydro-isoxazole-5-carboxylic acid cthyl ester (7h, 2.00g, 4.76 minol)을 질소 기압하애 10 mL 의 디클로로메탄에 녹이고 0℃로 유지한 다음 TFA (6 mL)를 가하엿다. 1.5 시간 후에 감압 증류하여 농축한 다음 잔류물을 약 200 mL 의 에틸아세테이트에 녹이고, 포화탄산수소나트륨 수용액(100 mL x 2)으로 씻고, 건조(무수 Na₂SO₄)-감압 농축하였다. 얻어진 화합물에 EDC(1.09g, 1.2 eq), 2-Naphthoic acid (983 mg, 1.2 eq), HOBt (771 mg, 1.2 eq)를 가하고 0℃로 유지한 다음, DMF (20 mL)를 가하였다. 여기에트리에틸아민(663mL, 1.0 eq)를 가하고, 하룻밤 동안 상온에서 교반 하였다. 감압 증류하여 DMF와 휘발성 물질을 제거한 다음. 잔류물을 약 250 mL 의 에틸아세테이트애 녹이고, 물 (100 mL)과 포화탄산수소나트륨 수용액(100 mL x 2)으로 씻고, 건조(무수 Na₂SO₄)-감압 농축하였다. 관 크로마토그래피 법으로 정제(25-33% 에틸아세테이트/헥산) 하여 2.04g (90%)의 원하는 화합물 (8g)을 얻었다.

위의 화합물은 다음과 같이 가수분해 하였다.

(실시예 11) 위의 화합물(8g, 2.04g)을 증류한 테트라히드로푸란(40 mL)에 녹이고(완전히 녹지는 않는다), 1N-NaOH(5.2 mL, 1.2 eq)를 가하였다. 약 4시간 후에 (∼50% completion) 1N-NaOH(1.0 mL) 를 다시 가하고 하룻밤 동안 교반하였다. 1N-HCl로 중화하고 감압증류하여 대부분의 테트라히드로푸란을 제거하고, 잔류물을 과랑의 디크로로메탄(>700 mL)에 녹이고, 물로 씻고 건조(무수 Na₂SO₄)-감압 농축하였다. 얻어진 흰색 분말의 목적화합물 (8h, 1.948g, 103%)은 더 이상 정제하지 않고 다음단계 반응에 사용하였다.

아래의 화합물들도 위와 동일한 조작을 거쳐 합성하고, 가수분해도 유사한 방법으로 실시하였다.

3-{2-메틸-(1S)-1-[(나프탈렌-1-카보닐)-아미노]-프로필}-5-페녹시메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르복실산 에틸 에스테르, 3-{2-methyl-(1S)-1-[(naphthalene-1-carbonyl)-amino]-propyl}-5-phenoxymethyl-4,5-dihydro-isoxazole-5-carboxylic acid ethyl ester (8e)

3-{2-메틸-(1S)-1-[(나프탈렌-2-카보닐)-아미노]-프로필}-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르복실산 에틸 에스테르, 3-{2-methyl-(1S)-1-[(naphthalene-2-carbonyl)-amino]-propyl}-4,5-diliydro-isoxazole-5-carboxylic acid ethyl ester(8q)

3-[2-메틸-(1S)-1-아미노-프로필]-5-(나프탈렌2-일)-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르복실산 에틸 에스테르, 3-[2-methyl-(1S)-1-amino-propyl]-5-(naphthalene-2-yl)-4,5-dihydro-isoxazole-5-carboxylic acid ethyl ester (∼1.3:1 디아스테레오머)

(실시예 12) : 3-{[(1S)-1-(나프탈렌-2-카보닐)-아미노-3-부톡시 카보닐]-프로필)-5-메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카르복실산 메틸 에스테르, 3-{[(1S)-1-(naphthalene-2-carbonyl)-amino-3-t-butoxycarbonyl]-propyl}-5-methyl-4,5-dihydro-isoxazole-5-carboxylic acid methyl ester (8i)의 합성

위에서 얻은 Fmoc으로 보호된 이소옥사졸린(7e, 440mg, 0.842 mmol)을 디메틸포름아미드(8.0 mL)에 녹이고, 상온에서 피페리딘 (2.5 mL) 을 가하었다. 약 5분후에, 피페리딘과 디메틸포름아미드를 감압하에 제거하였다. 잔류물을 디메틸포름아미드(10 mL)에 녹이고, 2-나프토산 (174 mg, 1.2 eq), EDC (210 mg, 1.3 eq)와 HOBt (148 mg, 1.3 eq)와 반응시켰다 (0℃ 에서 상온으로). 앞에서 언급하였던 방법으로 처리하여 133 mg의 정제된 목적물(8i)과 260mg (∼50% 순도)의 혼합물을 얻었다.

e) 아스파르트산 유도체의 합성방법

(실시예 13) : N-벤질옥시카르보닐-β-t-부틸 아스파르트산 N,O-디메틸히드록실아민 아미드, (N-benzyloxycarbonyl-β-t-butyl aspartic acid N, O-dimethylhydroxylamine amide) (9j) 의 합성

N-벤질옥시카르보닐-β-t-부틸 아스파르트산 ((N-benzyloxycarbonyl-β-t-butyl aspartic acid, 2.0g, 6.2 mmol), N,O-디메틸히드록실아민 히드로크로라이드 (N, O-dimethylhydroxylamine hydrochloride, 724 mg, 1.2 eq)과 HOBt (1.00g, 1.2 eq)를 디메틸포름아미드(20 mL)에 녹이고 0℃로 식힌다음, 트리에틸아민 (1.29 mL, 1.5 eq)를 가하였다. 이 용액에 EDC (1.42g. 1 2 eq)를 가하고 서서히 상온으로 가도록 유지하면서 하룻밤 동안 교반하였다. 물(100mL)로 묽히고, 에틸아세테이트-헥산(1:1, 100 mL x 2)으로 추출한 다음, 유기층을 물(100 mL)로 씻고, 건조(무수 Na₂SO₄) 하여 감압 농축하였다. 관 크로마토그래피로 분리(에틸아세테이트-헥산=3:7)하여 2.039g (90%)의 원하는 화합물(9j)을 얻었다.

(실시예 14): β-t-부틸아스파르트산 N,O 디메틸-히드록실아민 아미드( b-t-butyl aspartic acid N, O-dimethylhydroxylamine amide (9k)

N-벤질옥시카르보닐-2-t-부틸아스파르트산N-매틸-N-메톡시아미드(9j) (N-benzyloxy-carbonyl-β-t-butyl aspartic acid N-methyl-N-methoxyamide)를 통상적인 방법으로 탈 벤질옥시카르보닐화하여 (수소풍선, 10% Pd/C 에탄올) 얻었다(수율 100%).

(실시예 15) : N-벤질옥시카르보닐-β-t-부틸아스파르트산 메틸 에스테르 (N-benzyloxycarbonyl-β-t-butyl aspartic acid methyl ester ) (9a) 의 합성

N-벤질옥시카르보닐-β-t-부틸아스파르트산(N-benzyloxycarbonyl-β-t-butyl aspartic acid)를 디아조메탄으로 처리하여 메틸에스테르를 얻었다(100%).

(실시예 16):위의 화합물 9a를 통상적인 방법으로 염산이 첨가된 에탄올에서 탈벤질옥시화 반응(수소풍선, Pd/C)을 행하여 아민 히드로크로라이드(9b)를 얻었다.

(실시예 17) : (3S)-3-벤질옥시카르보닐아미노-4-히드록시-5-페녹시-펜타노익산-β-t-부틸 에스테르 [(3S)-3-benzyloxycarbonylamino-4-hydroxy-5-phenoxy-pentanoic acid t-butyl ester] (9f)

N-벤질옥시카르보닐-β-t-부틸아스파르트산(N-bezyloxycarbonyl-β-t-buthyl-aspartic acid , 5.03g, 15.6 mmol), NMM (1.90 mL, 17.1 mmol)에 무수 테트라히드로푸란 (60 mL)을 질소 기압하에서 가하고, -15℃로 유지한 다음 이소부틸크로로포름메이트(2.12 mL, 16.3 mmol)를 가하여 약 20분간 교반하였다. 반응물을 0℃로 유지한 상태에서 디아조메탄-에테르 용액 (2.0 eq 의 1-methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine 으로 합성된, 60 mL)을 가하여 디아조케톤 유도체를 함성한다 (∼30분). 여기에 30% HBr/AcOH (6.42 mL, 2.0 eq)를 가하여 브로모메틸케톤 유도체를 합성하였다 (30-60 분). 에틸아세테이트로 추출하고, 포화탄산수소나트륨 수용액 두번, 소금물로 씻었다. 건조 (무수 Na₂SO₄)-감압 농축하여 브로모메틸케톤 유도체(6.4g)를 얻었다.

브로모메틸케톤 유도체(4.36g), 페놀 (1.13g, 1.1 eq)을 디메틸포름아미드(18 mL)에 녹이고 KF (1.58g, 2.5 eq)을 가하여 2 시간 교반하였다. 통상적인 방법으로 처리하여 페녹시메틸케톤 유도체를 얻었다. 이를 메탄올(20 mL)에 녹이고 NaBH₄(412 mg)-메탄올 용액(40 mL)을 가하여 반응 시켰다(78 ℃-상온, 2 시간). 아세트산으로 반응을 중지 시키고, 통상적인 방법으로 처리한 다음, 관 크로마토그래피로 분리-정제하여 (에틸아세테이트-헥산, 1:5) 2.58g (57%)의 원하는 화합물을 디아스테레오머릭 형태로 얻었다.

위와 동일한 방법으로 아래의 화합물도 합성하였다.

(3S)-3-벤질옥시카르보닐아미노-4-히드록시-5-(나프탈렌-1-일)옥시펜타노익산-β-t-부틸 에스테르[(3S)-3-benzyloxycarbonylamino-4-hydroxy-5-(naphthalene-1-yl)oxy-pentanoic acid t-butyl ester] (91)

(실시예 18) : (3S)-3-아미노-4-히드록시-5-페녹시-펜타노익산-β-t-부틸 에스테르 [(3S)-3-amino-4-hydroxy-5-phenoxy-pentanoic acid t-butyl ester ] (9g)

화합물 9f 를 통상적인 방법으로 수소 풍선하에서탈벤질옥시카르보닐화(Pd/C)하여 얻었다 (100%).

(3S)-3-아미노-4-히드록시-5-(나프탈렌-1-일)옥시펜타노익산-β-t-부틸 에스테르 [(3S)-3-amino-4-hydroxy-5-(naphthalene-1-yl)oxy-pentanoic acid t-butyl ester] (9m)

f) 이소옥사졸린 유도체와 아스파르트산 유도체와의 반응 및 그 이후 변환과정

(실시예19) : (2S)-2-{3-[(1S)-1-벤질옥시카르보닐아미노-2-메틸-프로필]-5-페녹시 메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카보닐-아미노}-석시닉산 4-t-부틸에스테르1-N-메틸-N-메톡시 아미드, (2S)-2-{3-[(1S)-1-benzyloxycarbonylamino-2-methyl-propyl]-5-phenoxymethyl-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino}-succinic acid 4-t-butyl ester 1-N-methyl-N-methoxy amide ( 10aa)

3-[(1S)-1-벤질옥시카르보닐아미노-2-메틸-프로필]-5-페녹시메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카보실산 에틸 에스테르{3-[(1S)-1-benzyloxycarbonylamino-2-methyl-propyl]-5-phenoxymethyl-4,5-dihydro-isoxazole-5-carboxylic acid ethyl ester. 7c, 502mg, 1.10 mmol}을 테트라히드로푸란(6.6 mL)에 녹이고, 1N-NaOH(1.33mL)를 가하였다.상온에서 2.5 시간 교반후, 1N-HCl (1.33 mL)를 가하고 감압 농축하였다. 잔류물에 포화 소금물 (50 mL+ 2-3 mL의1N-HCl)을 가하고 에틸아세테이트(100 mLx2)로 추출한 후 건조(무수 Na₂SO₄), 감압 농축하여 476mg(101 %)의 이소옥사졸린카르복스산(7d)을 얻었다. 더 이상의 정제를 거치지 않고 다음 단계에 바로 사용하였다.

위에서 얻은 이소옥사졸린카르복스산(7d, 320 mg, 0-75 mmol)과 β-t-부틸아스파틱산 N-메틸-N-메톡시아미드 (β-t-butyl aspartic acid N-methyl-N-methoxy amide, 9k, 209 mg, 1.2 eq)를 약 5mL의 디메틸포름아미드에 녹이고0℃로 유지한 다음 HOBt (122mg, 1.2 eq)와 EDC (172mg, 1.2 eq)를 가하고, 서서히 온도를 상온으로 가도록 유지하면서 3 시간 동안 교반 하였다. 감압 농축하여 용매를 제거하고, 잔류물을 일반적인 방법으로 처리하여 저극성 이성체(less polar isomer)(160mg)과 고극성 이성체(more polar isomer) (213mg, 33%)를 얻었다.

(실시예 20) : (3S)-3-{3-[(1S)-1-벤질옥시카르보닐아미노-2-메틸-프로필]-5-페녹시메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카보닐-아미노}-4-케토 펜타노익산 t-부틸 에스테르, (3S)-3-{3-[(1S)-1-benzyloxycarbonylamino-2-methyl-propyl]-5-phenoxymethyl-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino}-4-keto-pentanoic acid t-butyl ester (10ab)

less polar Weinreb amide (10aa, 110 mg, 0.17 mmol)를 LiCl로 포화시킨 무수 테트라히드로푸란(2mL)+ 무수 테트라히드로푸란(5mL)에 녹이고 과량(>3.0eq)의 MeMgBr (3.0M in ether)를 가하여 반응시켜서 (0℃-상온)원하는 메틸케톤(10ab, less polar) (44mg, 43%)얻었다.

같은 방법으로 more polar Weinreb amide(135 mg)을 반응시켜 52mg (41%)의 메틸케톤(10ab, more polar)을 얻었다.

(실시예 21) : (2S)-2-{3-[2-메틸-(1S)-1-(나프탈렌-2-카르보닐)-아미노-프로필]-5-페닐메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카보닐-아미노}-석시닉산 4-t-부틸 에스테르 1-메틸에스테르, (2S)-2-{3-[2-methyl-(1S)-1-(naphthalene-2-carbonyl)-amino-propyl]-5-phenylmethyl-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino}-succinic acid 4-t-butyl ester 1-methyl ester

3-{2-메틸-(1S)-1-[(나프탈렌-2-카르보닐)-아미노-프로필]-5-페닐메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카보실산{3-{2-methyl-(1S)-1-[(naphthalene-2-carbonyl)-amino]-propyl}5-phenylmethyl-4,5-dihydro-isoxazole-5-carboxylic acid, 2.14g, 5.07 mmol}, 아스파르트산 β-t-부틸에스테르 메틸에스테르 히드로클로라이드(aspartic acid β-t-butyl ester methyl ester hydrochloride, 1.46g, 1.2 eq), EDC (1.17g, 1.2 eq) 와 HOBt (822 mg, 1.2 eq)를 DMF (19 mL)에 녹이고 트리에틸아민(2.12 mL, 3.0 eq)를 가하였다. 하룻밤 동안 교반 한 후 통상적인 방법으로 처리하고 관 크로마토그래피(40-50% 에틸아세테이트-헥산)를 행하여 원하는 표제 화합물 2.94g (94%)을 white foam 상태로 얻었다.

이 화합물을 앞에서 기술한 방법(1N-NaOH in THF)으로 methyl ester를 가수분해 하여 카르복스산 (10a, 수율 100%)을 얻었다.

(2S)-2-{3-[2-메틸-(1S)-1-(나프탈렌-2-카르보닐)-아미노-프로필]-5-페녹시메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카보닐-아미노}-석시닉산 4-t-부틸 에스테르 1-메틸에스테르, (2S)-2-{3-[2-methyl-(1S)-1-(naphthalene-2-carbonyl)-amino-propyl]-5-phenoxymethyl-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino}-succinic acid4-t-butyl ester 1-methyl ester

위의 화합물도 같은 방법으로 합성하고 가수분해 하였다.

(2S)-2-{3-[(1S)-1-(벤질옥시카르보닐)-아미노-2-메틸-프로필]-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카보닐-아미노}-석시닉산 4-t-부틸 에스테르 1-메틸에스테르, (2S)-2-{3-[(1S)-1-(benzyloxycarbonyl)-amino-2-methyl-propyl]-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino}-succinic acid 4-t-butyl ester 1-methyl ester(10ac)

(실시예 22) : (3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(나프탈렌-2-카르보닐-아미노)-프로필]-5-페닐메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카보닐-아미노}-4-케토-5-(2,6-디클로로벤조일옥시)-펜타노익산-t-부틸 에스테르, (3S)-3-{3-[2-methyl-(1S)-1-(naphthalene-2-carbonylamino)-propyl]-5-phenylmethyl-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino}-4-keto-5-(2,6-dichlorobenzoyloxy)-pentanoic acid-t-buthyl ester (10c)

위에서 얻은 카르복실산 (2.86g, 4.75 mmol)과 NMM (0.57 mL, 1.1 eq)를 질소 기압하에 무수 테트라히드로푸란에 녹이고 약 20℃ 로 식힌 다음 이소부틸크로로포름메이트(0.65 mL, 1.05eq)를 가하였다. 이 용액을 이 온도에서 20 분간 교반한 다음, 디아조메탄 가하고 0℃ 에서 30분간 교반하였다. TLC로 체크한 결과 반응이 완결되지 않아서 디아조메탄을 다시 가하고 1 시간 동안 더 교반 하였다. 여기에 30% HBr/AcOH (4.0 mL, 4.0 eq)를 가하고 0℃ 에서 1시간 교반하였다. 에틸아세테이트로 두번 추출하고, 물, 포화탄산수소 나트륨 수용액, 소금물 로 각각 씻고, 건조(무수 Na₂SO₄)-감압 농축하여 3.36g의 옅은 노랑색 고체를 얻었다. 여기서 얻은 고체를 반으로 나누어 (∼2.375 mmol) 무수 KF (345 mg, 2.5 eq) 및 2,6-dichlorobenzoic acid (545 mg, 1.2 eq)와 질소 기압하에 DMF (10 mL)에서 반응시키고, 통상적인 처리와 관 크로마토그래피로 일차 정제하여 표제화합물을 디아스테레오며 상태로 얻었다 (1.53g). 이를 다시 HPLC (38% EtOAc/Hexane)로 분리하여 저극성 디아스테레오머(less polar diastereomer) (585 mg)와 고극성 디아스테레오머(more polar diasteremer) (358mg) 를 얻었다.

위와 유사한 방법으로 아래의 화합물도 합성하였다.

(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(나프탈렌-2-카르보닐-아미노)-프로필]-5-페녹시메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카보닐-아미노}-4-케토-5-(2,6-디클로로벤조일옥시)-펜타노익산-t-부틸 에스테르, (3S)-3-{3-[2-methyl-(1S)-1-(naphthalene-2-carbonylamino)-propyl]-5-phenoxymethyl-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino}-4-keto-5-(2,6-dichlorobenzoloxy)-pentanoic acid-t-butyl ester

(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(벤질옥시카르보닐아미노)-프로필]-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카보닐-아미노}-4-케토-5-(2,6-디클로로벤조일옥시)-펜타노익산-t-부틸 에스테르, (3S)-3-{3-[2-methyl-(1S)-1-(benzyloxycarbonylamino)-propyl]-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino}-4-keto-5-(2,6-dichlorobenzoyloxy)-pentanoic acid-t-butyl ester (10ad): 디아스테레오머

(실시예 23) : (3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(나프탈렌-2-카르보닐아미노)-프로필]-5-페녹시메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카보닐-아미노}-4-케토-5페녹시메틸)-펜타노익산-t-부틸 에스테르, (3S)-3-{3-[2-methyl-(1S)-1-(naphthalene-2-car-bonylamino)-propyl]-5-phenoxymethyl-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino}-4-keto-5-phenoxy-pentanoic acid-t-butyl ester (10d)

카르복스산 유도체 (8h, 1.00g, 2.24 mmol)와 아미노알콜 유도체 (9g, 630 mg, 1.0 eq)를 EDC (558 mg, 1.3 eq) 와 HOBt(394 mg, 1.3 eq)를 사용하여 통상적인 방법으로 DMF 용매에서 반응하고, 후처리(workup) 과정을 거친 후, 관 크로마토그래피로 정제하여 1.44g 의 화합물을 얻었다. 이 화합물과 데스-마르틴 시약(Dess-Martin reagent) (2.15g. 2.5 mol eq)에 무수 디클로로메탄(25mL)을 가하여 상온에서 1 시간 교반하고, 이소프로필알콜(3 mL)로 반응을 중지 시켰다. 통상적인 처리를 한후, 관 크로마토그래피로(36% 에틸아세테이트-헥산) 일차 정제하여 1.27g 의 디아스테레오머릭 목적물을 얻었다. HPLC (36% 에틸아세테이트-헥산, 10 mL/min, 278 nm UV detection) 로 분리하여 저극성 디아스테레오머 (352 mg)과 고극성 디아스테레오머 (536 mg)를 얻었다.

위와 동일한 방법으로 아래의 화합물도 합성하였다.

(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(나프탈렌-2-카르보닐아미노)-프로필]-5-페녹시 메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카보닐-아미노}-4-케토-5-(2-나프틸옥시)-펜타노익산-t-부틸 에스테르, (3S)-3-{3-[2-methyl-(1S)-1-(naphthalene-2-carhonylamino)-propyl]-5-phenoxymethyl-4,5-dihydro-isoxazol-5-carbonyl-amino}-4-keto-5-(2-naphthyloxy)-pentanoic acid-t-butyl ester (10f)

(실시예 24) : (3S)-3-{3-[(1S)-1-벤질옥시카르보닐아미노-2-메틸-프로필]-5-페녹시메틸-4.5-디히드로-이소옥사졸-5-카보닐-아미노}-4-케토-펜타노익산, (3S)-3-{3-[(1S)-1-benzyloxycarbonylamino-2-methyl-propyl]-5-Phenoxymethyl-4,5-dihydro-isoxazole-5-carbonyl-amino}-4-keto-pentanoic acid (Ab 및 Ac)

저극성 디아스테레오머에서 합성한 메틸케톤-t-부틸에스테르(44mg)을 디클로메탄(2 mL)에 녹이고 0℃에서 TFA(1 mL)를 가하였다. 서서히 온도를 상온으로 가도록 유지하면서 2 시간동안 교반한 후 감압농축하여 원하는 최종화합물(Ab)을 정량적으로 얻었다.

고극성 디아스테레오머에서 합성한 메틸케톤-t-부틸에스테르(52mg)도 같은 방법으로 처리하여 최종화합물(Ac)을 얻었다.

모든 최종화합물은 위와 동일한 조작을 거쳐 합성하였다.

(3S)-3-{3-[(1S)-1-벤질옥시카르보닐아미노-2-메틸-프로필]-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카보닐-아미노}-4-케토-펜타노익산 (Aa) : 디아스테레오머

(3S)-3-{3-[(1S)-1-벤질옥시카르보닐아미노-2-메틸-프로필]-이소옥사졸-5-카보닐-아미노}-4-케토-펜타노익산 (Ba): 디아스테레오머

(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(벤질옥시카르보닐아미노)-프로필]-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카보닐-아미노}-4-케토-5-(2,6-디클로로벤조일옥시)-펜타노익산 (Af) : 디아스테레오머

(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(나프탈렌-1-카르보닐아미노)-프로필]-5-페녹시메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카보닐-아미노}-4-케토-5페녹시메틸)-펜타노익산 (Ag) : 디아스테레오머

(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(나프탈렌-2-카르보닐아미노)-프로필]-5-페녹시메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카보닐-아미노}-4-케토-5페녹시메틸)-펜타노익산(Ah)

(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(나프탈렌-2-카르보닐-아미노)-프로필]-5-페녹시메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카보닐-아미노}-4-케토-5-(2,6-디클로로벤조일옥시)-펜타노익산 (Ai)

(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(나프탈렌-2-카르보닐-아미노)-프로필]-5-페닐메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카보닐-아미노}-4-케토-5-(2,6-디클로로벤조일옥시)-펜타노익산 (Aj) : 디아스테레오머

(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(나프탈렌-2-카르보닐-아미노)-프로필]-5-페닐메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카보닐-아미노}-4-케토-5-(2,6-디클로로벤조일옥시)-펜타노익산 (Ak)

(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(퀴놀릴-2-카르보닐아미노)-프로필]-5-페녹시메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카보닐-아미노}-4-케토-5-페녹시펜타노익산 (Am)

(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(나프탈렌-2-카르보닐아미노)-프로필]-5-페녹시 메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카보닐-아미노}-4-케토-5-(2-나프틸옥시)-펜타노익산 (Ao)

고극성 디아스테레오머의 메틸에스테르 :

(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(나프탈렌-2-카르보닐아미노)-프로필]-5-페녹시메틸-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카보닐-아미노}-4-케토-5-(1-나프틸옥시)-펜타노익산 (AP) : 디아스테레오머

(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(나프탈렌-2-카르보닐아미노)-프로필]-4,5-디히드로-이소옥사졸-5-카보닐-아미노}-4-케토-5-(2-나프틸옥시)-펜타노익산 (As) : 디아스테레오머

에세이 방법:

α₂β₂형태의 시스테인 프로테아제로 알려진 ICE를 이미 보고된 방법 (참조:Thornberry, N. A. et al. Nature, 1992. 356, 768. Thornberry, N. A. Methods in Enzymology, 1994, 244, 615. Walker. N. P. C. et al. Coll. 1994. 78. 343)에 의해 발현, 정제 및 활성화 단계를 거쳐 얻었고, 이를 사용하여 약효평가를 실시하였다. p10과 p20 서브유닛 (Thornberry, N. A. et al. Nature, 1992. 356, 768)을 각각 대장균에서 발현시켜 인클루젼 바디(inclusion body)로 얻었고, 6 M 우레아 조건에서 사이즈 익스클루젼(size exclusion), 음이온교환 크로마토그래피 단계로 정제한 후 p10과 p20를 당량비로 혼합하여 완충용액 교환 과정을 거쳐 프로테아제 활성을 재활성화시켜 ICE를 얻었고. ICE와 형광기질 AcYVAD-AMC를 사용하여 합성된 저해제들의 바인딩 활성을 측정하였다. 효소 반응은 50 mM HEPES (pH 7.50), 10 % (w/v) 수크로오스, 0.1 % (w/v) CHAPS, 10 mM DTT를 포함한 완충용액에서 10 nM ICE (total protein), 5 mM AcYVAD-AMC와 여러 농도의 저해제를 사용하여 25 ℃에서 시켰고, 형광 분광기로 반응 속도를 시간에 따라 추적하여 초기 속도상수 (initialrate constant)를 구한 후, 저해제의 저해 상수인 K_i값들을 Lineweaver Burk Plot로부터 얻었다. 형광 분광기로 AMINCO-Bowman 시리즈 2 루미네센스 분광계(Luminescence Spectrometer)를 사용하였고, 여기(excitation) 파장 350 nm, 방출(emission) 파장 460 nm를 사용하였다. 이 방법으로 위에서 얻어진 저해제를 측정한 결과 Ki 값들은 300 mM -10 pM 의 사이로 나타났다.

Claims (7)

1. 하기 화학식 1의 신규한 이소옥사졸(또는 이소옥사졸린) 유도체, 그의 약제학적으로 허용되는 염, 에스테르 또는 입체이성체 :

   화학식 1

   상기식에서 치환체 R, R₁, R₂, R₃, R₄, X에 대한 구체적인 정의는 다음과 같다.

   I)은 단일결합 또는 이중결합을 나타내며 (단,이 이중결합인 경우 R₂는 존재하지 않는다);

   II) R 은 독립적으로 탄소수 1 내지 8의 사슬 또는 분지형 알킬그룹 (이하 -SAC로 약칭), 탄소수 3 내지 10의 사이클로알킬 (이하 -SCAC로 약칭), 벤젠, 나프탈렌, 피리딘, 인돌, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 푸란, 티오펜, 피롤, 피리미딘 및 이미다졸로 구성된 그룹으로부터 선택된 아로마틱 (이하 -Ar로 약칭), 벤젠, 나프탈렌, 피리딘, 인돌, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 푸란, 티오펜, 피롤, 피리미딘 및 이미다졸로 구성된 그룹으로부터 선택된 아로마틱으로 치환된 탄소수 1 내지 8의 사슬 또는 분지형 알킬 그룹 (이하 -SAC-Ar로 약칭) 또는 수소를 나타내고;

   III) R₁은 -SAC, -SCAC, -Ar 또는 -SAC-Ar를 나타내거나, 또는 모든 천연아미노산의 곁가지(side chain residue)를 나타내고, R₁으로 인하여 인접위치가 스테레오센터가 되는 경우 두가지 경우의 입체화합물이 모두 포함되며, 두가지형의 화합물이 공존하는 경우 (디아스테레오머릭 혼합물을 말함)도 포함되고;

   IV) R₃는 -SAC, -SCAC, -Ar 또는 -SAC-Ar를 나타내거나, 또는 모든 천연아미노산의 곁가지를 나타내고, R₃로 인하여 인접위치가 스테레오센터가 되는 경우 두가지 경우의 입체화합물이 모두 포함되며, 두가지형의 화합물이 공존하는 경우 (디아스테레오머릭 혼합물을 말함)도 포함되고;

   V) R₂는 수소, -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar, -(CH₂)_nOR (R = -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar; n = 1, 2) 또는 -(CH₂)_nOC(=O)R (R= -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar; n = 1,2)를 나타내거나, 또는 모든 천연아미노산의 곁가지(side chain residue)를 나타내고, R₂로 인하여 인접위치가 스테레오센터가 되는 경우 두가지 경우의 입체화합물이 모두 포함되며, 두가지형의 화합물이 공존하는 경우(디아스테레오머릭 혼합물을 말함)도 포함되고;

   VI) R 과 R₁그리고 R 과 R₃(여기서 앞의 R과 뒤의 R은 독립적임을 유의한다)은 각각 독립적으로 -(CH₂)_n, -(CH₂)_n-O-(CH₂)_m또는 -(CH₂)_n-NR'-(CH₂)_m[n+m < 9, R'= -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar, -C(=O)-SAC, -C(=O)-SCAC, -C(=O)-Ar, -C(=O)-SAC-Ar]의 고리를 형성할 수 있으며;

   VII) R₄는 모든 천연아미노산의 유기산 아실그룹을 나타내거나, 또는 -C(=O)R (R = H, -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar), -C(=O)OR (R= -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar), -C(=O)NRR' (R, R'= -H, -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar), -S(=O)R (R= -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar), -SO₂R (R= -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar)를 나타내며;

   VIII) X 는 -CN, -CHO, -C(=O)R [R= -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar], -C(=O)OR [R= -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar], -CONRR' [R, R'= 각각 독립적으로, -H, -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar], -C(=O)CH₂OR [R= -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar], -C(=O)CH₂OC(=O)R [R= -SAC, -SCAC, Y에 의해 치환 또는 비치환된 Ar (Y는 아래에서 정의한 바와 같다), -SAC-Ar]이되, X 가 -COCH₂-W의 형태인 경우 W로는 다음의 그룹이 포함된다 {Y -OH, -OR (R= -SAC, -SCAC), -C(=O)R (R= -H, -SAC, -SCAC), -F, -Cl, -Br, -I, -CN, -N₃, -CO₂H, -CF₃, -CO₂R (R= -SAC, -SCAC), -C(=O)NHR (R= -SAC, -SCAC), -C(=O)NR₂(R= -SAC, -SCAC)이며, R 은 -SAC, -SCAC, -Ar 또는 -SAC-Ar 이다}.
2. 류마트스성 관절염, 염증성 장 질환, 이식편대숙주질환, 패혈증, 골관절염, 골다공증, 급성 및 만성 골수백혈병, 뇌막염, 난관염, 패혈성 쇼크, 담도염, 대장염, 뇌염, 심내막염, 사구체신염, 간염, 심근염, 췌장염, 타입 I 당뇨병, 다발성 경화증, 알츠하이머병 또는 파킨슨씨병을 치료 또는 예방하기 위한, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제 1 항에 정의된 화합물을 함유함을 특징으로 하는 의약 조성물.
3. 제 2 항에 있어서, 경구투여형, 주사제형 또는 패취형으로 제조된 조성물.
4. 제 1 항에 있어서, R₁이 -CH₂COOH 인 화합물.
5. 제 1 항에 있어서, R₂가 -(CH₂)_n(O)_mAr (n = 1, 2; m = 0, 1; Ar = 치환된 페닐 또는 이미다졸), -SAC 또는 수소인 화합물.
6. 제 1 항에 있어서, R₃이 -CH(CH₃)₂, -(CH₂)₂CO₂H 또는 -(CH₂)₃C(O)NH₂인 화합물.
7. 제 1 항에 있어서, R 이 수소이고; R₁이 -CH₂COOH 이며; R₂가 (CH₂)_n(O)_mAr(n = 1, 2; m = 0, 1; Ar = 치환된 페닐 또는 이미다졸), -SAC 또는 수소이고; R₃이 -CH(CH₃)₂, -(CH₂)₂CO₂H 또는 -(CH₂)₃C(O)NH₂이며; X 는 -C(=O)CH₂OC(=O)R [R= -SAC, -SCAC, Y에 의해 치환되거나 비치환된 Ar (Y는 제1항에서 정의된 바와 동일하다)인 화합물.