KR100399361B1 - 캐스파제 억제제 함유 치료제 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 유효성분으로서 캐스파제 억제제, 특히 바람직하게는 하기 화학식 1의 이속사졸린 유도체, 그의 약제학적으로 허용되는 염, 에스테르 또는 입체이성체를 함유함을 특징으로 하는 소염 및 세포고사 방지용 치료제 조성물, 및 이 치료제를 제조하는 방법에 관한 것이다:
상기식에서
R, R', R1, R2, R3, R4및 X 는 명세서에 정의된 바와 같다.

Description

캐스파제 억제제 함유 치료제 조성물 {Therapeutic composition comprising caspase inhibitor}
본 발명은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 유효성분으로서 캐스파제 억제제, 특히 바람직하게는 하기 화학식 1의 이속사졸린 유도체, 그의 약제학적으로 허용되는 염, 에스테르 또는 입체이성체를 함유함을 특징으로 하는 소염 및 세포고사 방지용 치료제 조성물, 및 이 치료제 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다:
[화학식 1]
상기식에서
R 및 R' 는 각각 독립적으로 수소, 알킬(-SAC), 사이클로알킬(-SCAC), 방향족(-Ar), 또는 방향족에 의해 치환된 알킬(-SAC-Ar)을 나타내고;
R1은 -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar, 또는 -CH2COOH를 나타내거나, 천연 아미노산의 잔기(잔기가 카복실산 또는 염기인 경우 단순 에스테르 등으로 보호기가 결합되어 있을 수 있다)를 나타내며;
R3은 -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar 또는 천연 아미노산의 잔기(잔기가 카복실산 또는 염기인 경우 단순 에스테르 등으로 보호기가 결합되어 있을 수 있다)를 나타내거나, -CH(CH3)2, -CH2COOH, -(CH2)2CO2H, -CH2C(=O)NH2또는 -(CH2)2C(=O)NH2를 나타내고;
R2는 -H, -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar 또는 천연 아미노산의 잔기(잔기가 카복실산 또는 염기인 경우 단순 에스테르 등으로 보호기가 결합되어 있을 수 있다)를 나타내거나, -(CH2)n(O)mR5(여기서 R5= -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar; n = 0, 1, 2; m = 0, 1), -(CH2)nOC(=O)R6(여기서 R6= -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar; n = 1, 2), 또는 (CH2)n(O)mAr' (여기서 n = 0, 1, 2; m = 0, 1; Ar'=치환된 페닐 또는 이미다졸)을 나타내며;
R4는 모든 천연 아미노산의 유기산 아실그룹을 나타내거나, -C(=O)R7(여기서 R7= -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar), -C(=O)OR8(여기서 R8= -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar), -C(=O)NR9R10(여기서 R9, R10= -H, -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar), -SOR11(여기서 R11= -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar), 또는 -SO2R12(여기서 R12= -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar)를 나타내고;
R1및 인접한 R', R3및 인접한 R 은 각각 함께 연결되어 (CH2)n, (CH2)n-O-(CH2)m, 또는 (CH2)n-NR13-(CH2)m[여기서 n+m <9, R13= -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar, -C(=O)-SAC, -C(=O)-SCAC, -C(=O)-Ar, 또는 -C(=O)-SAC-Ar]의 사이클릭 화합물을 형성할 수 있고;
X 는 -CN, -CHO, -C(=O)R14[여기서 R14= -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar], -C(=O)OR15[여기서 R15= -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar], -CONR16R17[여기서 R16및 R17은 각각 -H, -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar], -C(=O)CH2OR18[여기서 R18은 -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar], 또는 -C(=O)CH2OC(=O)R19[여기서 R19= -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar]을 나타내며, X 가 -COCH2-W 인 경우, W 는 -N2, -F, -Cl, -Br, -I, -NR20R21또는 -SR22[여기서 R20, R21및 R22는 각각 독립적으로 -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar 이거나 R20및 R21이 함께 결합하여 사이클릭 화합물을 형성할 수 있다]를 나타내거나; W 는 또한 하기 구조식을 나타낼 수 있고:
상기식에서 Y 는 -OH, OR23(여기서 R23= -SAC, 또는 -SCAC), -C(=O)R24(여기서 R24= -H, -SAC, 또는 -SCAC), -F, -Cl, -Br, -I, -CN, -NC, -N3, -CO2H, CF3, -CO2R25(여기서 R25= -SAC, 또는 -SCAC), -C(=O)NHR26(여기서 R26= -SAC, 또는 -SCAC), 또는 -C(=O)NR27R28(여기서 R27, R28= -SAC, 또는 -SCAC) 를 나타낼 수 있고, 차수(order) 및 종류에 무관하게 최대한도로 모노- 또는 폴리-치환될 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물에 대한 설명에서 몇가지 중요한 용어는 다음과 같이 정의된다:
a) 알킬(Simple Alkyl Chain; SAC)은 탄소수 1 내지 8의 탄화수소를 의미하며 측쇄이성체를 포함한다.
b) 사이클로알킬(Simple CycloAlkyl Chain; SCAC)은 탄소수 3 내지 10의 사이클릭 화합물을 의미한다.
c) 아릴(Ar)은 벤젠[1:2,3,4,5,6], 나프탈렌[1,2:1,2,3,4,5,6,7,8,], 피리딘 [2,3,4:2,3,4,5,6], 인돌[1,2,3,4,5,6,7: 1,2,3,4,5,6,7], 퀴놀린[2,3,4,5,6,7,8: 2,3,4,5,6,7,8], 이소퀴놀린[1,3,4,5,6,7,8: 1,3,4,5,6,7,8], 푸란[2,3:2,3,4,5], 티오펜[2,3:2,3,4,5], 피롤[1,2,3: 1,2,3,4,5], 피리미딘[2,4,5,6: 2,4,5,6], 이미다졸[1,2,4,5:1,2,4,5], 등을 의미하며, 괄호안에서 앞의 수치는 상응하는 아릴 그룹이 본 발명에 따른 억제제에 결합되는 위치를 나타내고, 뒤의 수치는 치환체 Y가 부착되는 위치를 나타낸다
간세포의 대량 고사(apoptosis)나 간기능의 심각한 손상은 돌발성 간부전증 (Fulminant hepatic failure; FHF)과 같은 심각한 임상적 증상을 야기시킨다(참조: Trey, C. et al., 1970,Progress in liver disease, Popper, H. and F. Schaffner, eds. Grune and stratton, New York, pp282-298). FHF의 원인으로는 간염바이러스 감염, 약물 및 독소, 알콜, 국소빈혈, 대사성 질환, 악성침윤, 만성 자가면역 간염 등의 여러가지를 들 수 있다. 그러나, 그 메카니즘이 완전히 밝혀지지는 않았다. FHF의 예후는 명확하지 않고 그 진행은 매우 빠르므로 증상이 발현된 후 1-2주일 내에 치명적인 상태에 이르는 일이 빈번하다. 따라서, 치사율은 매우 높다. 그러나, 간병변의 치료는 가역적이며 생존자는 보통 완전히 회복된다.
지금까지는 FHF를 치료하기 위하여 항생제, 이뇨제, 코르티코스테로이드, 수혈, 약용탄 혈관류 및 혈장분리반출 등의 방법이 사용되었다(참조: Sherlock, S. 1993,Adv. Intern. Med.38: 245-267). 그러나, 이들중의 어떤 방법도 제어된 연구에서 효과적인 것으로 나타나지 않았다. 최근에는 간이식이 상기 증상의 예후를 실제로 개선시킬 수 있는 유일한 치료책으로 인정되었다. 그러나, 면역합병증, 바이러스 또는 세균감염 및 이식편의 입수와 같은 문제로 인하여 간이식 역시 FHF에 대한 완전한 치료방법은 될 수 없다. 따라서, 병이 급진전되고 있는 중에 대량사망으로부터 간세포를 보호할 수 있는 강력한 치료제의 개발이 간절히 요구되는 실정이다.
고사는 특정의 세포기관에 의해 달성되며, 일련의 서로 명확히 구별되는 형태학적 및 생화학적 변화에 의해 특징지어지는 세포사망의 한 유형이다. 고사는 과도하게 존재하는, 불필요하고 유해한 세포를 제거하며 항상성을 유지하기에 필수적인 과정이면서, 동시에 부적합한 고사는 신경변성질환, 국소빈혈성 손상, 자가면역질환, 여러형태의 암과 같이 많은 인체 질환을 유발시킨다. 바이러스성 간염, 알콜성 간염 및 돌발성 간염에서의 급성 간부전증에서 간세포의 고사가 간손상의 주된 원인이라는 사실은 분명해졌다. 고사신호를 받은 세포내에서는 많은 변화가 일어나며 캐스파제로 불리는 일련의 시스테인 프로테아제에 의해 복잡한 생화학적 반응이 진행된다. 캐스파제는 살아있는 세포가 고사되는 것을 방지하는 단백질, 예를들어 DNA 단편화에 작용하는 뉴클레아제의 억제제인 ICAD/DFF45과 Bcl-2를 불활성화시킨다. 또한, 캐스파제는 세포구조를 직접 해체시킬 뿐아니라 세포골격의 조절에 관여하는 여러 단백질들을 분해하여 간접적으로 세포 구조를 재구성함으로써 고사에 기여한다. 캐스파제는 고사신호를 증폭시키고 전파시키며, 세포 생존에 필요한 세포내 단백질들을 분해시킴으로써 고사 프로그램을 실행시킨다. 이러한 캐스파제의 활성화는 여러 형태의 고사를 시작하게하고, 진행시키고, 종결시키는 과정과 밀접하게 관련되어 있으므로 과도한 고사 또는 불충분한 고사에 기인하는 질환을 치료하기 위한 매력적인 잠재적 표적으로 인식되어 왔다.
여러종류의 캐스파제 억제제가 개발된 바 있다. 바이러스성 억제제에는CrmA, p35, IAP 패밀리(고사 억제제) 및 B형 간염 바이러스에 의해 코드화된 HBx 단백질과 같이 4가지의 구별되는 그룹이 있다(참조: Gottlob, K. et al., 1998,J. Biol. Chem.273: 33347-33353). 그러나, 이들은 치료제로서 적합하지 못하다. z-VAD-fmk, z-DEVD-fmk 및 Ac-YVAD-cmk와 같은 펩타이드성 캐스파제 억제제는 연구목적으로 폭넓게 이용되고 있으며, 이들 억제제는 세포수준(참조: Sane, A. T. et al., 1998, Cancer Res. 58: 3066-3072), Fas 또는 TNFα에 의해 유발된 간질환의 설치류 모델(참조: Kunstle, G. et al., 1997,Immunol. Lett. 55: 5-10), 또는 간이식후의 국소빈혈(참조: Cursio, R. et al., 1999,FASEB J. 13: 253-261)에서 고사-차단 활성을 보인다. 페탁(Petak) 등은 관능성(bifunctional) 항암제 BCNU(1,3-비스(2-클로로에틸)-1-니트로소우레아)가 캐스파제 억제활성을 보유하며 시험관내에서 약물-유발성 고사를 억제한다고 보고하였다(참조: Petak, I. et al., 1998,Cancer Res. 58: 614-618). 최근에는 사이클로옥시게나제-2(COX-2) 억제제가 FHF의 잠재적인 치료제로서 주목받고 있다(참조: McCormick, P. A. et al., 1999,Lancet353: 40-41). 그러나, 이 물질의 효과에 대해서는 아직 임상적으로 확인되지 않았다.
한편, 간질환에 대한 신약의 개발은 일차적으로 인체에 있어서의 간염이나 간세포성 손상과 관련된 적합한 동물모델에 의존한다. 따라서, 인간 FHF에 대한 치료제 후보물질의 효과를 검증하기 위해 적합한 동물모델을 채택하는 것은 매우 중요하다. 현재까지 보고된 실험적 간염모델에는 두가지가 있다. 하나는 박테리아 리포폴리사카라이드와 D-갈락토스아민에 의해 유발된 간손상이고(참조: Galanos, C. et al., 1979,Proc. Natl. Acad. Sci., 76: 5939; Lehman, V. et al., 1987,J. Exp. Med. 165-657), 다른 하나는 최근에 개발된 것으로서 ConA-유발성 간염이다(참조: Tiegs, G. et al., 1992,J. Clin. Invest. 90: 196-203; .Mizuhara, H. et al., 1994,J. Exp. Med. 179: 1529-1537). ConA는 T 림프구를 활성화시킴으로써 마우스에서 고사성 및 괴사성 세포사망을 일으키는 간질환을 유발시키며, ConA-유발성 간염모델은 많은 점에서, 특히 병인에 있어서의 Fas의 역할 측면에서 인간 FHF와 유사하다. Fas는 간세포에서 많이 발현되며, FasL은 활성화된 T 세포에서 발현되어 세포독성 림프구의 주효인자로서 기능한다. 성숙 마우스에 아고니스트성 모노클로날 항-Fas 항체를 주입하면 급속한 간질환을 야기시키는데, 이는 비정상적으로 활성화된 Fas-FasL 시스템이 세포독성 T 세포와 같은 면역시스템을 활성화시켜 돌발성 인체 간염을 일으킬 수 있음을 나타낸다. FHF의 병인에 특정 CTLs가 관여한다거나, 시험관내에서 Fas-매개된 고사에 대한 일차적 간세포의 민감성, 및 인간 간염바이러스에 의해 형질전환된 간세포에서의 Fas의 과발현과 같은 축적된 데이타가 상기 가설과 일치하고 있다. 최근의 연구에서는 Fas-FasL 시스템의 활성화가 ConA-유발성 간염에 의한 간세포의 손상에 중요한 역할을 하는 것으로 입증되었다(참조: Tagawa, Y. et al., 1998,Eur. J. Immunol.28: 4105-4113). FasL은 ConA가 주입된 직후 간에서 유도되며, 간내부의 T 세포상에서 우세하게 발현되는데, 이는 Fas-FasL 시스템이 ConA-유발성 간염의 진전에 중요한 인자임을 가리킨다. 또한, ConA-간염은 IL-2, IFN ν , TNFα, IL-6, IL-4 및 IL-10과 같은 다양한 사이토킨류의 생산과 관련되어 있다.
이러한 기술적 배경하에 본 발명자들은 세포의 대량고사에 기인하는 돌발성 간부전증과 같은 질환에 대한 효과적인 치료제를 개발하기 위해 집중적인 연구를 수행하였으며, 그 결과 생체내에서 캐스파제 억제제로서 작용하는 물질, 특히 바람직하게는 하기 화학식 1의 비펩타이드성 이속사졸린 유도체를 이용하는 경우 본 발명의 목적이 완벽하게 달성될 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다:
[화학식 1]
상기식에서
R 및 R' 는 각각 독립적으로 수소, 알킬(-SAC), 사이클로알킬(-SCAC), 방향족(-Ar), 또는 방향족에 의해 치환된 알킬(-SAC-Ar)을 나타내고;
R1은 -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar, 또는 -CH2COOH를 나타내거나, 천연 아미노산의 잔기(잔기가 카복실산 또는 염기인 경우 단순 에스테르 등으로 보호기가 결합되어 있을 수 있다)를 나타내며;
R3은 -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar 또는 천연 아미노산의 잔기(잔기가 카복실산 또는 염기인 경우 단순 에스테르 등으로 보호기가 결합되어 있을 수 있다)를 나타내거나, -CH(CH3)2, -CH2COOH, -(CH2)2CO2H, -CH2C(=O)NH2또는 -(CH2)2C(=O)NH2를 나타내고;
R2는 -H, -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar 또는 천연 아미노산의 잔기(잔기가 카복실산 또는 염기인 경우 단순 에스테르 등으로 보호기가 결합되어 있을 수 있다)를 나타내거나, -(CH2)n(O)mR5(여기서 R5= -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar; n = 0, 1, 2; m = 0, 1), -(CH2)nOC(=O)R6(여기서 R6= -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar; n = 1, 2), 또는 (CH2)n(O)mAr' (여기서 n = 0, 1, 2; m = 0, 1; Ar'=치환되거나 비치환된 페닐 또는 이미다졸)을 나타내며;
R4는 모든 천연 아미노산의 유기산 아실그룹을 나타내거나, -C(=O)R7(여기서 R7= -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar), -C(=O)OR8(여기서 R8= -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar), -C(=O)NR9R10(여기서 R9, R10= -H, -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar), -SOR11(여기서 R11= -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar), 또는 -SO2R12(여기서 R12= -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar)를 나타내고;
R1및 인접한 R', R3및 인접한 R 은 각각 함께 연결되어 (CH2)n, (CH2)n-O-(CH2)m, 또는 (CH2)n-NR13-(CH2)m[여기서 n+m <9, R13= -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar, -C(=O)-SAC, -C(=O)-SCAC, -C(=O)-Ar, 또는 -C(=O)-SAC-Ar]의 사이클릭 화합물을형성할 수 있고;
X 는 -CN, -CHO, -C(=O)R14[여기서 R14= -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar], -C(=O)OR15[여기서 R15= -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar], -CONR16R17[여기서 R16및 R17은 각각 -H, -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar], -C(=O)CH2OR18[여기서 R18은 -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar], 또는 -C(=O)CH2OC(=O)R19[여기서 R19= -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar]을 나타내며, X 가 -COCH2-W 인 경우, W 는 -N2, -F, -Cl, -Br, -I, -NR20R21또는 -SR22[여기서 R20, R21및 R22는 각각 독립적으로 -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar 이거나 R20및 R21이 함께 결합하여 사이클릭 화합물을 형성할 수 있다]를 나타내거나; W 는 또한 하기 구조식을 나타낼 수 있고:
상기식에서 Y 는 -OH, OR23(여기서 R23= -SAC, 또는 -SCAC), -C(=O)R24(여기서 R24= -H, -SAC, 또는 -SCAC), -F, -Cl, -Br, -I, -CN, -NC, -N3, -CO2H, CF3, -CO2R25(여기서 R25= -SAC, 또는 -SCAC), -C(=O)NHR26(여기서 R26= -SAC, 또는 -SCAC), 또는 -C(=O)NR27R28(여기서 R27, R28= -SAC, 또는 -SCAC) 를 나타낼 수 있고, 차수(order) 및 종류에 무관하게 최대한도로 모노- 또는 폴리-치환될 수 있다.
도 1은 재조합 캐스파제(caspase) 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8 및 9에 대한 LB84033의 억제활성을 나타낸 것이고;
도 2는 TNFα및 악티노마이신(actinomycin) D로 처리하여 세포의 고사가 유도된 랫트 간세포에서 LB84033의 캐스파제 활성 억제효과를 나타낸 것이며;
도 3은 TNFα및 악티노마이신 D로 처리하여 세포의 고사가 유도된 랫트 간세포에서 LB84033의 세포고사 차단효과를 나타낸 것이고;
도 4는 ConA에 의해 상승된 혈청내 AST 및 ALT 활성에 대한 LB84033의 용량-의존적인 억제활성을 나타낸 것이며(여기에서, 크로스바는 평균치를 나타내며 p값은 student's t-test에 의해 계산한 것이다);
도 5는 ConA에 의해 상승된 세포내 사이토킨류에 대한 LB84033의 용량-의존적인 억제활성을 나타낸 것이고(여기에서, 크로스바는 평균치를 나타내며 p값은 student's t-test에 의해 계산한 것이다);
도 6은 ConA-처리된 마우스 간세포의 형태학적 및 조직학적 변화와 고사성 병변에 대한 LB84033의 억제활성을 나타낸 것이며(여기에서, A 및 G: ConA 및 담체처리, B 및 H: ConA 및 LB84033 4㎎/㎏ 처리, C 및 I: ConA 및 LB84033 20㎎/㎏ 처리, D 및 J: ConA 및 LB84033 100㎎/㎏ 처리, E 및 K: PBS 및 담체로 처리, F 및 L: PBS 및 LB84033 100㎎/㎏ 으로 처리한 것이고, 각 사진은 그룹당 10마리의 마우스로부터 얻어진 것중 대표적인 것이다);
도 7은 ConA에 의해 유발된 간세포의 고사성 사망으로 인한 PARP 분해에 대한 LB84033의 억제활성을 나타낸 것이고(각 레인은 그룹당 10마리의 마우스에 대해 실험한 결과중 대표적인 것을 나타낸 것이다);
도 8은 감마 인터페론과 항 Fas 항체에 의해 처리되어 고사가 유도된 세포에 대한 본 발명에 따른 화학식 1 화합물의 세포고사 저해효과를 나타낸 것이다.
따라서, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 유효성분으로서 캐스파제 억제제를 함유함을 특징으로 하는 소염 및 세포고사 방지용 치료제 조성물을 제공함을 목적으로 한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 상기와 같은 소염 또는 세포고사의 방지 효과에 의거하여 치매, 뇌졸중, AIDS로 인한 뇌손상, 당뇨, 위궤양, 간염바이러스에 의한 뇌손상, 인간 돌발성 간부전증(Fulminant hepatic failure; FHF), 패혈증(septic shock), 장기이식거부반응, 류마티스성 관절염, 허혈성 심장질환에 의한 심장세포괴사의 치료 효과를 갖는 치료제 조성물을 제공한다.
특히, 본 발명에 따른 조성물은 인간 돌발성 간부전증의 치료제로서 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 캐스파제 억제제를 사용함을 특징으로 하여 소염 및 세포고사 방지용 치료제 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 태양은 유효성분인 캐스파제 억제제로서 상기 화학식 1의 이속사졸린 유도체, 그의 약제학적으로 허용되는 염, 에스테르 또는 입체이성체를 사용하는 치료제 조성물이다.
상기 화학식 1의 이속사졸린 유도체는 경우에 따라 그의 약제학적으로 허용되는 염, 에스테르 또는 입체이성체 형태로 사용될 수 있다.
화학식 1의 화합물 중에서도 본 발명에 따른 용도에 특히 적합한 화합물은 R및 R' 이 수소를 나타내고; R1이 -CH2COOH 또는 -CH2COOCH3를 나타내며; R2가 수소, 메틸 또는 (CH2)n(O)mAr'[n=1, 2; m=0, 1; Ar' = 치환되거나 비치환된 페닐 또는 이미다졸]을 나타내고; R3가 -CH(CH3)2, -CH2COOH, -(CH2)2CO2H, -CH2C(O)NH2또는 -(CH2)2C(O)NH2를 나타내며; R4가 -C(=O)(O)nR29[n=0, 1; R29= -Ar 또는 -SAC-Ar], -SO2R30[R30= -Ar 또는 -SAC-Ar], 또는 -C(=O)NHR31[R31= -Ar 또는 -SAC-Ar]을 나타내고; X 는 -C(=O)CH2N2, -C(=O)CH2Br, -C(=O)CH2Cl, -C(=O)CH2OAr"[Ar" = 페닐] 또는 -C(=O)CH2OC(=O)Ar'"[Ar'" = 2,6-디클로로페닐 또는 2,6-디메틸페닐]을 나타내는 화합물이다.
보다 특히 적합한 화합물은
(3S)-3-{3-[(1S)-1-페닐메틸옥시카보닐아미노-2-메틸-프로필]-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-펜타노산;
(3S)-3-{3-[(1S)-1-페닐메틸옥시카보닐아미노-2-메틸-프로필]-5-페녹시메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐-아미노}-4-케토-펜타노산;
(2S)-2-{3-[(1S)-1-페닐메틸옥시카보닐아미노-2-메틸-프로필]-5-페녹시메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐-아미노}-숙신산 1-(N-메틸-N-메톡시)-아미드;
(3S)-3-{3-[(1S)-1-페닐메틸옥시카보닐아미노-2-메틸-프로필]-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-디아조-펜타노산;
(3S)-3-{3-[(1S)-1-페닐메틸옥시카보닐아미노-2-메틸-프로필]-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-브로모-펜타노산;
(3S)-3-{3-[(1S)-1-페닐메틸옥시카보닐아미노-2-메틸-프로필]-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-(2,6-디클로로벤조일옥시)-펜타노산;
(3S)-3-{3-[(1S)-1-(나프탈렌-1-카보닐아미노)-2-메틸-프로필]-5-페녹시-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-페녹시-펜타노산;
(3S)-3-{3-[(1S)-1-(나프탈렌-2-카보닐아미노)-2-메틸-프로필]-5-페녹시-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-페녹시-펜타노산;
(3S)-3-{3-[(1S)-1-(나프탈렌-2-카보닐아미노)-2-메틸-프로필]-5-페녹시-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-디아조-펜타노산;
(3S)-3-{3-[(1S)-1-(나프탈렌-2-카보닐아미노)-2-메틸-프로필]-5-페녹시-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-브로모-펜타노산;
(3S)-3-{3-[(1S)-1-(나프탈렌-2-카보닐아미노)-2-메틸-프로필]-5-페녹시-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-(2,6-디클로로벤조일옥시)-펜타노산;
(3S)-3-{3-[(1S)-1-(나프탈렌-2-카보닐아미노)-2-메틸-프로필]-5-페닐-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-디아조-펜타노산;
(3S)-3-{3-[(1S)-1-(나프탈렌-2-카보닐아미노)-2-메틸-프로필]-5-페닐-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-브로모-펜타노산;
(3S)-3-{3-[(1S)-1-(나프탈렌-2-카보닐아미노)-2-메틸-프로필]-5-페닐-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-(2,6-디클로로벤조일옥시)-펜타노산;
(3S)-3-{3-[(1S)-1-(나프탈렌-2-카보닐아미노)-2-메틸-프로필]-5-페닐-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-디아조-펜타노산;
(3S)-3-{3-[(1S)-1-(나프탈렌-2-카보닐아미노)-2-메틸-프로필]-5-페닐-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-브로모-펜타노산;
(3S)-3-{3-[(1S)-1-(나프탈렌-2-카보닐아미노)-2-메틸-프로필]-5-페닐-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-(2,6-디클로로벤조일옥시)-펜타노산;
(3S)-3-{3-[(1S)-1-(나프탈렌-2-카보닐아미노)-3-카복시-프로필]-5-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-페녹시-펜타노산;
(3S)-3-{3-[(1S)-1-(퀴놀린-2-일-카보닐아미노)-2-메틸-프로필]-5-페녹시메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-펜타노산;
(3S)-3-{3-[(1S)-1-(나프탈렌-2-설포닐아미노)-2-메틸-프로필]-5-페녹시-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-페녹시-펜타노산;
(3S)-3-{3-[(1S)-1-(나프탈렌-2-카보닐아미노)-2-메틸-프로필]-5-페녹시-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-(2-나프틸옥시)-펜타노산;
(3S)-3-{3-[(1S)-1-(나프탈렌-2-카보닐아미노)-2-메틸-프로필]-5-페녹시-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-(1-나프틸옥시)-펜타노산;
(3S)-3-{3-[(1S)-1-(2S)-2-아세틸아미노-숙시노일아미노)-3-카복시-프로필]-5-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-페녹시-펜타노산;
(3S)-3-{3-[(1S)-1-(나프탈렌-2-카보닐아미노)-2-메틸-프로필]-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-(2-나프틸옥시)-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(2-나프탈렌카보닐아미노)-프로필]-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-페녹시-펜타노산 (부분입체이성체 혼합물);
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(페닐메틸옥시카보닐아미노)-프로필]-5-페닐-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-디아조-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(페닐메틸옥시카보닐아미노)-프로필]-5-페닐-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-브로모-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(페닐메틸옥시카보닐아미노)-프로필]-5-페닐-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-(2,6-디클로로벤조일옥시)-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(페닐에틸카보닐아미노)-프로필]-5-페닐-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-디아조-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(페닐에틸카보닐아미노)-프로필]-5-페닐메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-브로모-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(페닐에틸카보닐아미노)-프로필]-5-페닐-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-(2,6-디클로로벤조일옥시)-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(1-나프탈렌카보닐아미노)-프로필]-5-페닐-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-디아조-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(1-나프탈렌카보닐아미노)-프로필]-5-페닐-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-브로모-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(1-나프탈렌카보닐아미노)-프로필]-5-페닐-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-(2,6-디클로로벤조일옥시)-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(1-나프탈렌설포닐아미노)-프로필]-5-페닐-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-디아조-펜타노산 (부분입체이성체 혼합물);
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(1-나프탈렌설포닐아미노)-프로필]-5-페닐-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-브로모-펜타노산 (부분입체이성체 혼합물);
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(1-나프탈렌설포닐아미노)-프로필]-5-페닐-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-(2,6-디클로로벤조일옥시)-펜타노산 (부분입체이성체 혼합물);
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-((3-인돌릴)에틸카보닐아미노)-프로필]-5-페닐- 메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-디아조-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-((3-인돌릴)에틸카보닐아미노)-프로필]-5-페닐- 메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-브로모-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-((3-인돌릴)에틸카보닐아미노)-프로필]-5-페닐- 메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-(2,6-디클로로벤조일옥시)-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-((3-인돌릴)메틸카보닐아미노)-프로필]-5-페닐-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-디아조-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-((3-인돌릴)메틸카보닐아미노)-프로필]-5-페닐-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-브로모-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-((3-인돌릴)메틸카보닐아미노)-프로필]-5-페닐-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-(2,6-디클로로벤조일옥시)-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(신나모일아미노)-프로필]-5-페닐메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-디아조-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(신나모일아미노)-프로필]-5-페닐메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-브로모-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(신나모일아미노)-프로필]-5-페닐메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-(2,6-디클로로벤조일옥시)-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(페닐메틸설포닐아미노)-프로필]-5-페닐-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-디아조-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(페닐메틸설포닐아미노)-프로필]-5-페닐-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-브로모-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(페닐메틸설포닐아미노)-프로필]-5-페닐-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-(2,6-디클로로벤조일옥시)-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(퀴놀린-2-일-카보닐아미노)-프로필]-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-디아조-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(퀴놀린-2-일-카보닐아미노)-프로필]-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-브로모-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(퀴놀린-2-일-카보닐아미노)-프로필]-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-(2,6-디클로로벤조일옥시)-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(퀴놀린-2-일-카보닐아미노)-프로필]-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-페녹시-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(퀴놀린-2-일-카보닐아미노)-프로필]-5-페닐-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-디아조-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(퀴놀린-2-일-카보닐아미노)-프로필]-5-페닐-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-브로모-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(퀴놀린-2-일-카보닐아미노)-프로필]-5-페닐-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-(2,6-디클로로벤조일옥시)-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(퀴놀린-2-일-카보닐아미노)-프로필]-5-페닐-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-페녹시-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(퀴놀린-2-일-카보닐아미노)-프로필]-5-(1-이미다졸릴-메틸)-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-페녹시-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(2-나프탈렌카보닐아미노)-프로필]-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-펜타노산;
(3S)-3-{3-[(1S)-1-(숙시노일아미노)-3-카복시-프로필]-5-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-페녹시-펜타노산;
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(숙시노일아미노)-프로필]-5-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-페녹시펜타노산; 또는
(3S)-3-{3-[2-메틸-(1S)-1-(1-나프탈레닐카보닐아미노)-프로필]-5-페닐-메틸-4,5-디하이드로-이속사졸-5-카보닐아미노}-4-케토-5-(1-피페리디닐)-펜타노산이다.
화학식 1의 비펩타이드성 이속사졸린 유도체는 본 발명자들에 의해 개발이 완료된 것으로서, 그 화합물의 제조방법은 대한민국 특허출원 제98-11787호 및 이 출원을 우선권 주장하여 국제출원된 PCT/KR99/00561호에 구체적으로 기재되어 있다.
본 발명자들은, 하기 설명하는 바와 같이, 화학식 1 화합물의 시험관내 및 생체내 캐스파제 억제활성을 측정하였으며, ConA 또는 TNFα/악티노마이신 D에 의해 간질환이 유발된 경우 간세포의 세포생존율, 간염의 치료효과, 간세포 고사의 감소 및 PARP 분해의 억제 등에 대한 화학식 1 화합물의 활성을 조사하였다. 본 발명자들은 또한, 감마 인터페론 및 항 Fas 항체에 의해 세포고사가 유도된 경우 세포의 생존율에 대한 화학식 1 화합물의 효과를 공지의 캐스파제 억제제 Ac-DEVD-CHO또는 z-DEVD-cmk와 비교하여 실험하였다. 좀더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
먼저, 마우스에서 ConA에 의해 유발된 급성 간질환에 대한 화학식 1의 화합물의 억제활성을 조사하였다. 그 결과, 화학식 1의 비펩타이드성 억제제는 캐스파제 억제활성 뿐아니라 시험관내 및 생체내 간세포의 고사성 사망에 대한 억제활성을 나타내었는데, 이는 간세포의 대량고사에 의해 유발된 인간 FHF에 대해 화학식 1의 화합물이 치료제로서 사용될 수 있음을 시사한다.
광범위한 캐스파제 억제활성을 보유하고 있는 화학식 1의 화합물은 애초에 캐스파제 패밀리 효소의 특이적인 억제제로서 고안되었다는 점에서 BCNU(1,3-비스 (2-클로로에틸)-1-니트로소우레아) 또는 COX-2(사이클로옥시게나아제-2)와는 다르다. 고사과정은 매우 복잡하게 진행되며, 이 과정의 여러단계에 캐스파제가 관여한다. 또한, 많은 공지의 기질들이 우연히 발견되었기 때문에 캐스파제의 조절에 대해서는 알려진 것이 거의 없다. 따라서, 급성 FHF 중에 간세포의 대량고사를 단기간에 차단하기 위해서는 특이적 캐스파제 억제제에 비해 광범위한 캐스파제 억제활성을 갖는 물질이 보다 효과적으로 작용할 수 있다. 이점에서 화학식 1의 화합물은 치료제 후보물질로서 이상적이다.
본 발명자들은 캐스파제 억제제인 화학식 1의 화합물의 고사-차단효과를 확인하기에 적합한 실험모델로서 ConA-유발성 간염모델을 이용하였다. ConA-유발성 간염에는 여러 사이토킨류, 예를들어 IL-2, IFNν, TNFα, IL-6, IL-4 및 IL-10이 관여한다. 본 발명에서는 ConA에 의해 증가된 혈청중의 IL-1β, IL-2, IL-4 및 IFNν의 농도에 대한 화학식 1의 화합물의 효과를 테스트하였으며, 그 결과 이 화합물이 도 1 및 2에 나타낸 바와 같은 그의 캐스파제-1-억제활성으로 인하여 용량-의존적인 방식으로 IL-1β수준을 상당히 억제하는 것으로 확인되었다(도 5A 참조). 그러나, 화학식 1의 화합물은 IL-2, IL-4 및 IFNν에 대해서는 별다른 영향을 미치지 못하였는데(도 5B, C, D 참조), 이는 화학식 1의 화합물이 캐스파제 억제제로서 활성을 발휘하는 주요 대상이 Fas를 발현하는 간세포라는 사실에 기인한다. 즉, 화학식 1의 화합물은 캐스파제와 관련된 고사로부터 간세포를 보호하지만, 활성화된 T 세포를 직접적으로 억제하지는 못한다.
세포에서 캐스파제-3-유사 프로테아제에 대한 생기질(biosubstrate)중의 하나는 PARP(116kDa)이며, 이것은 고사중의 세포에서 85kDa 및 31kDa 단편으로 분해된다. 따라서, PARP의 85kDa 분해물은 고사의 초기지표로서 이용되어 왔다 (Lazebnik, Y. A. et al., 1994,Nature371: 346-347; Kaufmann, S. H. et al., 1993,Cancer Res. 53: 3976-3985). 화학식 1의 화합물은 ConA에 의해 유발된 간세포의 고사로 인한 PAPR의 분해를 용량-의존적인 방식으로 억제하였다(도 7 참조). 웨스턴 블롯 분석에서, 85kDa 분해산물의 양은 화학식 1의 화합물 투입량이 증가함에 따라 점차 감소하였고, 온전한 116kDa PARP는 상대적으로 일정한 것으로 나타났다.
도 6으로부터 알 수 있듯이, ConA는 간세포에 심각한 형태학적 및 조직학적 변화를 일으키며, 고사성 병변도 명확히 관찰된다. 그러나, 간세포의 대부분은여전히 생존하며 고사세포는 일부에 불과하다. 이러한 현상에 의해 온전한 116kDa PARP가 ConA/비히클 마우스의 간에서도 나타나는 이유를 이해할 수 있다.
한편, 본 발명자들은 감마 인터페론 및 항 Fas 항체로 처리함으로써 인간유래의 세포주(Fas responsive cell)에 세포고사를 유도한 후, 이 세포에 대한 화학식 1의 화합물의 세포고사 저해효과를 확인하기 위한 실험을 수행하였으며, 그 결과, 화학식 1의 화합물이 공지의 캐스파제-3 저해제인 Ac-DEVD-CHO 또는 z-DEVD-cmk에 비해서도 2배 이상 우수한 세포고사 저해효과를 나타냄을 확인할 수 있었다(동일농도에서의 세포생존율이 Ac-DEVD-CHO : 35.1%, z-DEVD-cmk : 47.3%, LB84033 : 100%, 표 1 및 도 8 참조).
이상의 실험결과를 통해, 화학식 1의 비펩타이드성 화합물은 폭넓은 캐스파제 억제활성을 지니고 있고, 이에 따라 소염 및 세포고사의 차단효과를 지니고 있으며, 특히 인간 FHF에서 간세포의 대량고사를 차단하는 치료제로서 효과적으로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
캐스파제 억제제, 특히 화학식 1의 화합물은 목적하는 바에 따라 다양한 약제학적 투여형태로 제형화될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 제조함에 있어서는, 유효량의 캐스파제 억제제, 특히 화학식 1의 화합물 또는 그의 염을 제조하고자 하는 제형에 따라 선택될 수 있는 다양한 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합한다.
캐스파제 억제제 물질은 목적하는 바에 따라 주사용 제제, 경피용 제제 또는 경구용 제제로 제형화될 수 있으며, 투여의 용이성 및 용량의 균일성 측면에서 바람직하게는 단일투여형으로 제조된다.
경구용 제제를 제조하는 경우에는 통상의 약제학적 담체를 사용할 수 있다. 예를들어, 현탁액, 시럽제, 엘릭시르 및 용액제와 같은 경구용 액체 제제의 경우 물, 글리콜, 오일, 알콜 등을 담체로 사용할 수 있고; 산제, 환제, 캅셀제 및 정제와 같은 고체 제제의 경우에는 전분, 설탕, 카올린, 윤활제, 결합제, 붕해제 등을 사용할 수 있다. 투여의 용이성으로 인하여 정제 및 캅셀제가 가장 편리한 복용형태이며, 정제 및 환제는 장피제로 제조하는 것이 바람직하다.
비경구 제제의 경우 담체로는 통상 멸균수를 사용하며, 용해보조제와 같은 다른 성분도 포함시킬 수 있다. 주사용 제제, 예를들면 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 공지된 기술에 따라 적합한 분산제, 습윤제, 또는 현탁제를 사용하여 제조할 수 있다. 이를 위해 사용될 수 있는 용매에는 물, 링거액 및 등장성 NaCl 용액이 있으며, 멸균 고정오일도 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용한다. 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있으며, 또한 올레산과 같은 지방산도 주사용 제제에 사용할 수 있다.
경피 제제의 경우에는 담체로서 침투촉진제 및/또는 적당한 습윤제를 임의로 피부에 대한 자극성이 없는 적당한 첨가제와 함께 사용할 수 있다. 첨가제로는 피부를 통한 투여를 촉진시키고/시키거나 목적하는 조성물을 제조하는데 도움이 되는 것을 선택한다. 경피 제제는 경피용 패취, 점적제 또는 연고와 같은 다양한 방식으로 투여된다.
캐스파제 억제제, 특히 화학식 1의 화합물을 임상적인 목적으로 투여시에 단일용량 또는 분리용량으로 숙주에게 투여될 총 일일용량은 체중 1㎏ 당 0.1 내지 100㎎의 범위가 바람직하나, 특정 환자에 대한 특이 용량 수준은 사용될 특정 화합물, 환자의 체중, 성, 건강상태, 식이, 약제의 투여시간, 투여방법, 배설률, 약제혼합 및 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
이하, 본 발명의 효과를 하기 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기위한 것일 뿐, 어떤 의미로도 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
하기 실시예에서 사용된 ConA는 베링거 만하임 게엠베하(Germany)에서 구입하였고; 캐스파제의 펩타이드계 기질 Ac-YVAD-pNA(캐스파제-1), Ac-VDVAD-pNA (캐스파제-2), Ac-DEVD-pNA(캐스파제-3, 7, 8 및 9), Ac-LEVD-pNA(캐스파제-4) 및 Ac-VEID-pNA(캐스파제-6), 그리고 펩타이드계 캐스파제 억제제 Ac-DEVD-fmk 및 z-VAD-CHO 는 알렉시스 컴파니(Alexis Co., San Diego, CA)에서 구입하였으며; Ac-DEVD-CHO 및 z-DEVD-cmk는 Bachem 사에서 구입하였고; 항 Fas 항체는 온코르(Oncor)사 (Cat#A8050)에서 구입하였으며; WI38 세포는 ATCC에서 구입하였고; IFN-gamma는 LG Pharmaceuticals에서 구입하였으며; 그밖에 모든 세포 배양 매질 및 첨가물들은 Gibco BRL(Tsuen Wan, Hong Kong)에서 구입하였다. 재조합 인간 캐스파제는 논문(Garcia-Calvo M et al., "Purification and catalytic properties of human caspase family members",Cell Death Differ,1999, Apr; 6(4): 362-9)에 기재된방법을 참고하여 제조할 수 있으며, 특히 캐스파제-3, 6, 7 및 8은 시판되고 있다(Pharmingen, SanDiego, CA, USA, 캐스파제-3: 66281T, 캐스파제-6: 66291T, 캐스파제-7: 66301T, 캐스파제-8: 66311T).
하기 실시예에서 LB84033, LB84022 및 LB84028은 각각 화학식 1의 화합물에 속하는 하기 구조식의 화합물을 나타낸다.
(LB84033)
(LB84022)
(LB84028)
실시예 1: 간세포의 분리 및 배양
수컷 스프라그-도울리(Hanlan Sprague-Dawley) 랫트를 문헌(참조: MacMicking et al., 1995,Cell81: 641-650)에 기재된 방법에 따라 사육하였다. 랫트의 간세포를 문헌(Stadler et al.,Arch. Biochem. Biophys.302: 4-11) 기재의 방법에 따라 분리, 정제 및 배양하였다. 고도로 정제된 간세포(순도 98% 이상, 트리판 블루(trypan blue) 제거법에 의한 생존율 98% 이상)를 10% 소혈청을 함유하며 HEPES 15mM(pH 7.4), 인슐린 1μM , L-글루타민 2mM, 페니실린 100단위/㎖ 및 스트렙토마이신 100㎍/㎖가 보충된 윌리암스 배지 E(Williams medium E)에 현탁시켰다. 세포 생존율 시험을 수행하기 위해서는 콜라겐에 의해 코팅된 12-웰 플레이트에 세포를 웰당 2×105세포 밀도로 가하였고, 효소활성 측정을 위해서는 100㎖ 디쉬당 5×106세포의 밀도로 세포를 가하였다.
실시예 2: 무세포 시스템에서 LB84033의 캐스파제 억제활성(시험관내 실험)
테트라펩타이드계 발색성 기질에 대한 각 효소의 가수분해 정도를 측정함으로써 재조합 캐스파제 활성을 분석하였다. 재조합 인간 캐스파제를 에세이 완충액 (글리세롤 20%(v/v)를 함유하는 HEPES 100mM, pH 7.4)중에서 DTT 5mM과 함께 실온에서 20분간 예비배양하였다. 효소분획(405nm/h에서의 흡광도가 0.2에 해당하는 효소활성을 함유, 2㎕)을 96-웰 플레이트에서 LB84033 100μM의 존재 또는 부재하에 200μM의 발색성 기질 150㎕와 혼합하였다. 이 혼합물을 37℃에서 방치하였다. 마이크로플레이트 리더(reader)에서 1시간동안 효소적으로 유리된 pNA의 흡광도를 405nm에서 불연속적으로 측정하였다. 초기속도(n=3)로부터 캐스파제 활성을 계산하였다(평균치±SE)(n=4, 여기서 n은 실험의 반복횟수를 나타낸다).
그 결과, LB84033은 캐스파제 2만을 제외하고는 모든 시험된 캐스파제의 활성을 거의 완전히 억제하는 것으로 확인되었으며(도 1 참조), 이는 화학식 1의 화합물이 광범위한 캐스파제 억제활성을 보유하고 있음을 나타낸다.
실시예 3: 랫트 간세포에서 LB84033의 캐스파제 억제활성(생체내 실험)
방금 분리된 랫트 간세포를 TNFα2,000단위/㎖ 및 악티노마이신 D 100ng/㎖로 처리하여 세포의 고사를 유도하였다. 10시간 후에 세포를 회수하였다. 냉동 및 해동을 3회 반복함으로써 세포를 용해(lysis)시키고, 4℃, 12,000xg에서 20분간 원심분리함으로써 세포질 용액을 회수하였다. 세포질(단백질 ∼2㎍)을 LB84033, Ac-DEVD-fmk 또는 z-VAD-CHO 100μM의 존재 또는 부재하에 글리세롤 20% 및 DTT 5mM을 함유하는 HEPES 완충액(100mM, pH 7.4)중의 특이 발색성 기질 200μM과 혼합하고 37℃에서 방치하였다. 405nm에서의 증가된 흡광도를 측정함으로써 캐스파제 활성을 에세이하였다(평균치±SE)(n=4).
그 결과, Ac-DEVD-pNA(캐스파제-3, 7, 8 및 9), Ac-LEVD-pNA(캐스파제-4) 및 Ac-VEID-pNA(캐스파제-6)에 대해서는 강한 효소활성이 검출되었고; Ac-VDVAD-pNA(캐스파제-2)에 대해서는 보통 정도의 효소활성이 검출되었다(도 2 참조). 화학식 1의 화합물은 이들 증폭된 캐스파제 활성을 거의 완전히 억제하였으며, 그 억제활성은 펩타이드계 캐스파제 억제제인 Ac-DEVD-fmk 및 z-VAD-CHO에 필적하는 것이었다(도 2 참조). Ac-YVAD-pNA(캐스파제-1)에 대한 효소의 활성은 상대적으로 약했으나, 화학식 1의 화합물은 캐스파제-1 유사 활성의 74.1%를 억제하였다.
실시예 4: 분리된 랫트 간세포의 세포생존율 증가에 대한 LB84033의효과(시험관내 실험)
캐스파제 억제제인 LB84033 100μM의 존재 또는 부재하에 방금 분리된 랫트 간세포를 TNFα2,000단위/㎖ 및 악티노마이신 D 100ng/㎖로 12시간동안 처리하였다. 그 후, 크리스탈 바이올렛 염색법(n=4)으로 세포생존율을 측정하였으며, 그 결과 LB84033은 랫트의 간세포 사망을 억제하는 것으로 나타났다(평균±SE)(도 3 참조). 따라서, 이로부터 LB84033이 TNFα및 악티노마이신 D에 의해 유도된 간세포의 고사성 사망(apoptotic death)을 방지함을 확인할 수 있다.
실시예 5: 마우스에서 ConA-유발성 급성간염의 치료효과
단계 1) 혈액샘플의 제조
암컷 Balb/c 마우스(6주령, Charles River Laboratory, Osaka, Japan)를 22℃ 및 55%의 상대습도하에 12시간씩 밤/낮을 바꿔주면서 사육하였다. 이때, 사료와 물은 마음껏 공급하였다. 발열물질(pyrogen)이 제거된 식염수에 ConA를 2.5㎎/㎖의 농도로 용해시키고 이를 꼬리정맥을 통해 상기 마우스에 ConA를 기준으로 하여 20㎎/㎏의 양으로 주사하였다. LB84033이 용해되어 있는 비히클(올리브오일과 10% DMSO로 구성됨) 또는 비히클 단독을 ConA 주사하기 1시간 전 및 주사한 지 4시간 후에 실험동물로 2회 복강내 주사하였다. ConA를 주사한 지 6시간 후 안와에서 혈액샘플을 얻었고, 24시간 후에 실험동물의 경부를 탈구시켜 간 및 혈액샘플을 얻었다.
단계 2: 플라스마 아미노트랜스퍼라제 활성 에세이
단계 1에서 ConA로 처리한 지 24시간 후에 회수한 혈액샘플에 대해 플라스마 AST 및 ALT 활성을 제조자의 안내서에 따라 Autokit(Youngdong Pharmaceutical Co, Seoul, Korea)를 사용하여 측정하였다. 독립된 2회의 실험을 수행하였으며, 그 결과 양실험에서 ConA가 혈청내 AST 및 ALT 활성을 급격히 상승시키며, LB84033은 용량-의존적인 방식으로 상기 상승된 효소활성을 억제하는 것으로 확인되었다(도 4A, B 참조). 두번째 실험(도 4B 참조)에서는 ConA/비히클 그룹과 ConA/LB84033 4㎎/㎏ 그룹사이에 통계적으로 유의한 차이가 나타나지 않았는데 (AST : p=0.2972, ALT : p=0.1378), 이는 각 마우스의 효소활성이 약간씩 변화하기 때문이다. 그러나, LB84033이 20㎎/㎏ 용량으로 투여된 경우, AST 및 ALT 활성은 ConA/비히클 그룹에 비해 명백히 감소되었다(AST : p=0.0174, ALT : p=0.0011). 첫번째 실험(도 4A 참조)에서는 LB84033이 AST 활성을 약간 증가시키는 것으로 나타났다(p=0.1033). 이러한 결과는 화학식 1의 화합물이 생체내에서 ConA에 의해 유발된 AST 및 ALT 활성의 상승을 억제하지만, 그 자신이 심각한 간독성을 일으키지는 않음을 나타낸다.
단계 3: 사이토킨 에세이
비록 대부분의 간질환 병인이 불명확하지만, 사이토킨류가 간질환에 직접적으로 관여되어 있거나 면역시스템의 활성화를 통하여 관여하는 것으로 생각되고 있다. 또한, TNFα, IL-1, IL-2, IL-4 및 IFN을 포함한 사이토킨류가 간질환을 증가시키는 것으로 보고되었다(참조: Chisari, F. V., 1992,Mol. Genet. Med. 2: 67-104; Fukuda, R. et al.,Clin. Exp. Immunolol. 100: 446-451; Yoshioka, K. etal.,Hepatology10: 769-773). 따라서, 본 발명자들은 ConA에 의해 증가된 혈청 사이토킨 농도에 대한 화학식 1 화합물의 효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험하였다.
단계 1에서 ConA로 처리한지 6시간 후에 회수한 혈액샘플에 대해 플라스마내의 뮤린 IL-1β(Endogen, Inc., Boston, MA), IL-2, IL-4, IFNν(Pharmingen, San Diego, CA) 양을 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다. 에세이는 제조자의 안내서에 기술된 바와 동일하게 수행하였다. 각 샘플에 대해 2회 실험을 수행하였다.
실험결과, LB84033이 ConA에 의해 유발된 IL-1β의 증가를 용량 의존적인 방식으로 억제하는 것으로 확인되었다(도 5A 참조). 한편, LB84033은 용량 의존적으로 IL-4 농도를 어느정도 감소시켰으나, 실험된 농도에서 IL-2 및 IFNν에는 심각한 영향을 미치지 않았다(도 5B, D 참조). LB84033은 비히클을 단독으로 사용하는 경우에 비해 4가지 사이토킨 전부를 감소시켰다.
실시예 6: 조직검사 및 고사(apoptosis)의 검출
화학식 1의 화합물이 특히 간세포에서 고사-차단 효과를 나타내는지 확인하기 위하여 ConA-처리된 마우스 간에서의 고사세포의 우세정도를 하기 방법에 따라 관찰하였다.
마우스를 다양한 용량의 LB84033 존재 또는 부재하에 ConA로 처리하여[A 및 G: ConA 및 담체 처리, B 및 H: ConA 및 LB84033 4㎎/㎏ 처리, C 및 I: ConA 및 LB84033 20㎎/㎏ 처리, D 및 J: ConA 및 LB84033 100㎎/㎏ 처리] 냉동된 간 절편을 수득하였다. 마우스를 PBS 및 담체로 처리(E 및 K)하거나, PBS 및 LB84033 100㎎/㎏ 으로 처리(F 및 L)한 후, 역시 간 절편을 수득하였다. 절제된 마우스 간을 바로 25% 수크로오스 용액에 담그고 4℃에서 하룻밤 방치하였다. 액화질소하에서 냉동시킨 후 4㎛ 두께로 냉동절개하였다. 조직검사를 위하여 1% 파라포름알데히드 완충액으로 간 절편을 고정시키고 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다(A 내지 F). 간에서의 고사세포를 관찰하기 위하여 냉동된 간 절편을 ApopTag 인사이투 고사 퍼옥시다제 검출키트(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling : TUNEL 에세이)(Oncor, Gaithersburg, MD) 및 DAKO liquid DAB(DAKO, Carpinteria, CA)을 사용하여 염색하였다(G 내지 L). 염색은 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 염색이 완료된 후 광학현미경을 사용하여 관찰하였다.각 사진은 그룹당 10마리의 마우스로부터 얻은 결과중 대표적인 것이다.
실험결과, ConA는 간세포에 심각한 형태학적 및 조직학적 변화를 유발시키는 것으로 관찰되었고(도 6A 참조), 고사성 병변이 명확히 관찰되었다(도 6G 참조). 그러나, LB84033로 처리한 경우 마우스 간에서의 고사성 병변은 용량 의존적으로 감소되었고(도 6B-D 참조), LB84033의 용량을 증가시킴에 따라 세포조직이 점차로 회복되었다(도 6H-J 참조). 이러한 관찰결과는 LB84033이 치명적인 고사로부터 간세포를 보호하고 있음을 나타낸다.
실시예 7: 웨스턴 블롯팅
본 실험에서는 ConA 및 다양한 용량의 화학식 1의 화합물로 처리된 마우스로부터의 간세포 용해물중에 PARP의 분해결과 생성된 85kDa 크기의 분해물이 존재하는지를 다음과 같이 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인함으로써 화학식 1 화합물의 고사-차단 효과를 조사하였다.
ConA 또는 PBS를 다양한 용량의 LB84033과 함께 처리한 마우스로부터 회수된 간을 바로 차가운 PBS로 세척한 다음, 1% Nonidet P-40, 0.1% SDS, 1mM PMSF 및 프로테아제 억제제 칵테일 정제 CompleteTM(베링거 만하임, 제조자의 지시에 따라 사용)을 함유하는 차가운 3부피배량의 PBS내에 균질화시켰다. 균질화물을 얼음위에서 30분간 배양하였다. 그 후, 샘플을 16,000xg, 4℃에서 30분간 원심분리하였다. 상등액을 새 튜브에 옮기고 추가로 30분간 원심분리하였다. 회수된 용해물을 4℃에서 하룻밤동안 프로테인 G-세파로오스(Pharmacia, Uppsala, Sweden)와 함께 천천히 진탕배양하여 미리 맑은 용액으로 만들었다. 4℃, 1000xg에서 30초간 원심분리하여 상등액을 회수하고, 7% SDS-폴리아크릴아미드겔상에서 분리한 다음 니트로셀룰로오스막으로 옮겼다. 실온의 5% 탈지 건조우유 및 0.1% 트윈20을 함유하는 PBS 중에서 천천히 진탕하면서 1시간에 걸쳐 막을 블로킹하였다. 천천히 진탕하면서 1:1000으로 희석된 모노클로날 항-PARP 항체(Pharmingen)와 함께 막을 하룻밤동안 배양하였다. PBS-트윈으로 3회 세척한 후, 블롯을 고트 항-마우스 IgG-호울스래디쉬 퍼옥시다제(1:1000 희석)와 혼성화하였다. PBS-트윈으로 3회 세척한 후 ECL 웨스턴 블롯팅 키트(Amersham-Pharmacia Biotech, San Francisco, CA)를 사용하여 시그널을 전개시킨 후 자동방사선사진 (autoradiography)로 확인하였다.
실험 결과, LB84033이 ConA에 의해 유발된 간세포의 고사성 사망에 의해 야기된 PARP 분해를 억제하는 것으로 나타났다(도 7 참조). 또한, LB84033의 고사-차단 효과는 용량 의존적인 것으로 확인되었다(도 7 참조).
실시예 8: 세포고사의 저해활성
본 발명에 따른 화학식 1 화합물의 세포고사 저해활성을 확인하기 위하여 다음과 같이 실험하였다.
WI38 세포(human embryonal lung fibroblast)를 10㎝ 직경의 디쉬에서 전면(confluent)배양하였다(배지: DMEM-10% FBS). 1일째에 세포를 24웰 플레이트에 접종하였으며, 이때 배지 부피는 400㎕로 하고 밤새 배양하였다. 2일째에 감마 인터페론 200유닛/㎖로 세포를 처리한 후, 12시간이상 배양하였다. 3일째에 DMSO중의 10mM 스톡인 시험화합물을 각각 희석하여 100㎕씩 세포에 첨가함으로써 최종농도 50, 10, 2, 0.4 μM이 되도록 하였다. 이 상태로 2시간동안 배양하여 화합물이 세포내로 들어갈 시간을 준 다음, 항-Fas 항체를 40ng/웰의 농도로 처리하였다(항체를 처리한지 2시간 후 고사가 유도되며, 밤새 배양하였다). 여기에서 대조군은 Fas 항체를 처리하지 않은 경우이다. 4일째에 세포를 현미경으로 관찰한 다음, 웰당 300㎕씩 배지를 가하고 XTT working 용액 150㎕를 가한다음 2시간동안 배양하였다. 발색이 되면 상층액을 100-200㎕씩 96웰 플레이트에 옮겨서 ELISA 플레이트 리더로 A490을 측정하였다. 여기서 블랭크는 세포없이 배지만 넣은 웰에 XTT 용액을 가한 경우이다. Fas 항체로 처리하지 않은 군을 100%로 보고 나머지를 상대적으로 비교하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
농도(μM) IFN IFN+Fas Ab Ac-DEVD-CHO z-DEVD-cmk LB84022 LB84028 LB84033
0 100 15.37
0.4 12.16 15.13 14.44 14.67 15.51
2 14.75 16.27 18.32 17.33 64.44
10 19.16 27.38 35.37 82.40 92.68
50 35.14 47.32 78.29 90.39 100.21
상기 표 1의 결과로부터 알 수 있듯이, 감마 인터페론과 항 Fas 항체를 동시에 처리한 경우에는 15%의 세포만이 생존한 반면, 기존의 캐스파제 억제제 Ac-DEVD-CHO(reversible inhibitor) 또는 z-DEVD-cmk(irreversible inhibitor) 50μM로 처리한 경우에는 각각 35.1%, 47.3%의 세포가 생존하였고, 동일 농도의 LB84022, LB84028, LB84033으로 처리한 경우에는 각각 78%, 90%, 100%의 세포가 생존하였다. 따라서, 본 발명에 따른 캐스파제 억제제가 기존의 캐스파제 억제제에 비해 훨씬 더 강력하고 효과적인 세포고사 저해활성을 지님을 알 수 있다(도 8 참조).

Claims (8)

  1. 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 유효성분으로서 하기 화학식 1의 화합물, 그의 약제학적으로 허용되는 염, 에스테르 또는 입체이성체를 함유함을 특징으로 하는 소염 및 세포고사 방지용 치료제 조성물:
    [화학식 1]
    상기 식에서
    R 및 R' 는 각각 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 8의 직쇄 또는 측쇄 알킬(-SAC), 탄소수 3 내지 10의 사이클로알킬(-SCAC), 벤젠, 나프탈렌, 피리딘, 인돌, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 푸란, 티오펜, 피롤, 피리미딘 및 이미다졸로 구성된 그룹 중에서 선택된 방향족(-Ar), 또는 벤젠, 나프탈렌, 피리딘, 인돌, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 푸란, 티오펜, 피롤, 피리미딘 및 이미다졸로 구성된 그룹 중에서 선택된 방향족에 의해 치환된 탄수소 1 내지 8의 직쇄 또는 측쇄 알킬(-SAC-Ar)을 나타내고;
    R1은 -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar, 또는 -CH2COOH를 나타내거나, 천연 아미노산의 잔기(잔기가 카복실산 또는 염기인 경우 보호기가 결합되어 있을 수 있다)를 나타내며;
    R3은 -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar 또는 천연 아미노산의 잔기(잔기가 카복실산 또는 염기인 경우 보호기가 결합되어 있을 수 있다)를 나타내거나, -CH(CH3)2, -CH2COOH, -(CH2)2CO2H, -CH2C(=O)NH2또는 -(CH2)2C(=O)NH2를 나타내고;
    R2는 -H, -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar 또는 천연 아미노산의 잔기(잔기가 카복실산 또는 염기인 경우 보호기가 결합되어 있을 수 있다)를 나타내거나, -(CH2)n(O)mR5(여기서 R5= -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar; n = 0, 1, 2; m = 0, 1), -(CH2)nOC(=O)R6(여기서 R6= -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar; n = 1, 2), 또는 (CH2)n(O)mAr' (여기서 n = 0, 1, 2; m = 0, 1; Ar'=페닐 또는 이미다졸)을 나타내며;
    R4는 모든 천연 아미노산의 유기산 아실그룹을 나타내거나, -C(=O)R7(여기서 R7= -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar), -C(=O)OR8(여기서 R8= -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar), -C(=O)NR9R10(여기서 R9, R10= -H, -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar), -SOR11(여기서 R11= -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar), 또는 -SO2R12(여기서 R12= -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar)를 나타내고;
    R1및 인접한 R', R3및 인접한 R 은 각각 함께 연결되어 (CH2)n, (CH2)n-O-(CH2)m, 또는 (CH2)n-NR13-(CH2)m[여기서 n+m <9, R13= -SAC, -SCAC, -Ar, -SAC-Ar, -C(=O)-SAC, -C(=O)-SCAC, -C(=O)-Ar, 또는 -C(=O)-SAC-Ar]의 사이클릭 화합물을 형성할 수 있고;
    X 는 -CN, -CHO, -C(=O)R14[여기서 R14= -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar], -C(=O)OR15[여기서 R15= -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar], -CONR16R17[여기서 R16및 R17은 각각 -H, -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar], -C(=O)CH2OR18[여기서 R18은 -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar], 또는 -C(=O)CH2OC(=O)R19[여기서 R19= -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar]을 나타내며, X 가 -COCH2-W 인 경우, W 는 -N2, -F, -Cl, -Br, -I, -NR20R21또는 -SR22[여기서 R20, R21및 R22는 각각 독립적으로 -SAC, -SCAC, -Ar, 또는 -SAC-Ar 이거나 R20및 R21이 함께 결합하여 사이클릭 화합물을 형성할 수 있다]를 나타내거나; W 는 또한 하기 구조식을 나타낼 수 있고:
    상기 식에서 Y 는 -OH, OR23(여기서 R23= -SAC, 또는 -SCAC), -C(=O)R24(여기서 R24= -H, -SAC, 또는 -SCAC), -F, -Cl, -Br, -I, -CN, -NC, -N3, -CO2H, CF3, -CO2R25(여기서 R25= -SAC, 또는 -SCAC), -C(=O)NHR26(여기서 R26= -SAC, 또는 -SCAC), 또는 -C(=O)NR27R28(여기서 R27, R28= -SAC, 또는 -SCAC) 를 나타낼 수 있고, 차수(order) 및 종류에 무관하게 최대한도로 모노- 또는 폴리-치환될 수 있다.
  2. 제1항에 있어서, 치매, 뇌졸중, AIDS로 인한 뇌손상, 당뇨, 위궤양, 간염바이러스에 의한 뇌손상, 인간 돌발성 간부전증(Fulminant hepatic failure; FHF), 패혈증(septic shock), 장기이식거부반응, 류마티스성 관절염, 또는 허혈성 심장질환에 의한 심장세포괴사에 대한 치료제 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 인간 돌발성 간부전증에 대한 치료제 조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 화학식 1의 화합물이 R 및 R' 은 수소를 나타내고; R1은 -CH2COOH 또는 -CH2COOCH3를 나타내며; R2는 수소, 메틸 또는 (CH2)n(O)mAr'[n=1, 2; m=0, 1; Ar' = 페닐 또는 이미다졸]을 나타내고; R3는 -CH(CH3)2, -CH2COOH, -(CH2)2CO2H, -CH2C(O)NH2또는 -(CH2)2C(O)NH2를 나타내며; R4는 -C(=O)(O)nR29[n=0, 1; R29= -Ar 또는 -SAC-Ar], -SO2R30[R30= -Ar 또는 -SAC-Ar], 또는 -C(=O)NHR31[R31= -Ar 또는 -SAC-Ar]을 나타내고; X 는 -C(=O)CH2N2, -C(=O)CH2Br, -C(=O)CH2Cl, -C(=O)CH2OAr"[Ar" = 페닐] 또는 -C(=O)CH2OC(=O)Ar'" [Ar'" = 2,6-디클로로페닐 또는 2,6-디메틸페닐]을 나타내는 화합물인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 화학식 1의 화합물이 하기 구조식의 화합물, 그의 약제학적으로 허용되는 염, 에스테르 또는 입체이성체인 조성물.
  7. 제1항에 정의된 화학식 1의 화합물, 그의 약제학적으로 허용되는 염, 에스테르 또는 입체이성체를 사용함을 특징으로 하여 제1항에 따른 소염 및 세포고사 방지용 치료제 조성물을 제조하는 방법.
  8. 삭제
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