KR20070036450A

KR20070036450A - 리포산을 함유하는 염증 질환 치료용 약제조성물

Info

Publication number: KR20070036450A
Application number: KR1020050091476A
Authority: KR
Inventors: 박성광; 김원; 이식; 문상옥
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2005-09-29
Filing date: 2005-09-29
Publication date: 2007-04-03
Also published as: US20070072937A1; US20080146650A1

Abstract

본 발명은 알파-리포산을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것으로,알파-리포산은 프랙트알킨 발현의 저해제로서, LPS의 유도로 인한 내독소혈증 모델의 내피 세포에서 프랙트알킨의 발현과 단핵세포에 대한 내피세포의 부착을 감소시키므로 내독소혈증으로 인한 염증을 경감시키는 효과를 갖는다.

리포산, 프랙트알킨, 내피세포, 염증

Description

리포산을 함유하는 염증 질환 치료용 약제조성물{Pharmaceutical Composition Comprising α-lipoic acid for inflammatory diseases.}

도 1a는 LA를 전 처치한 래트와 그렇지 않은 래트에 LPS를 정맥 주입한 후 혈중 TNF-α의 농도를 측정한 그림이다.

도 1b는 LA를 전 처치한 래트와 그렇지 않은 래트에 LPS를 정맥 주입한 후 혈중 IL-1β의 농도를 측정한 그림이다.

도 2a는 인간 혈관내피세포(HUVECs)에서 TNF-α의 자극으로 인한 프랙트알킨의 발현을 시간에 따라, RNase 보호 분석법으로 나타낸 그림이다.

도 2b는 인간 혈관내피세포(HUVECs)에서 TNF-α의 자극으로 인한 프랙트알킨의 발현을 농도에 따라, RNase 보호 분석법으로 나타낸 그림이다.

도 2c는 인간 혈관내피세포(HUVECs)에서 TNF-α의 자극으로 인한 프랙트알킨의 발현을 시간에 따라, 웨스턴 블롯에 의한 분석으로 나타낸 그림이다.

도 3a는 인간 혈관내피세포(HUVECs)에서 IL-1β의 자극으로 인한 프랙트알킨의 발현을 시간에 따라, RNase 보호 분석법으로 나타낸 그림이다.

도 3b는 인간 혈관내피세포(HUVECs)에서 IL-1β의 자극으로 인한 프랙트알킨의 발현을 농도에 따라, RNase 보호 분석법으로 나타낸 그림이다.

도 3c는 인간 혈관내피세포(HUVECs)에서 IL-1β의 자극으로 인한 프랙트알킨의 발현을 시간에 따라, 웨스턴 블롯에 의한 분석으로 나타낸 그림이다.

도 4a는 인간 혈관내피세포(HUVECs)에서 LA와 TNF-α를 함께 처리했을 때 프랙트알킨의 발현을 RNase 보호 분석법으로 나타낸 그림이다.

도 4b는 인간 혈관내피세포(HUVECs)에서 LA와 IL-1β를 함께 처리했을 때 프랙트알킨의 발현을 RNase 보호 분석법으로 나타낸 그림이다.

도 4c는 인간 혈관내피세포(HUVECs)에서 LA, TNF-α와 IL-1β를 함께 처리했을 때 프랙트알킨의 발현을 RNase 보호 분석법으로 나타낸 그림이다.

도 4d는 인간 혈관내피세포(HUVECs)에서 LA, TNF-α와 IL-1β를 함께 처리하거나 또는, 따로 처리했을 때 프랙트알킨의 발현을 웨스턴 블롯에 의한 분석으로 나타낸 그림이다.

도 5a는 인간 혈관내피세포(HUVECs)에서 TNF-α와 IL-1β의 자극으로 인한 NF-κB의 결합 활성화에 대한 LA의 영향을 나타낸 그림이다.

도 5b는 인간 혈관내피세포(HUVECs)에서 TNF-α와 IL-1β의 자극으로 인한 SP-1의 결합 활성화에 대한 LA의 영향을 나타낸 그림이다.

도 6a는 인간 혈관내피세포에서 LA, TNF-α, 프랙트알킨 항체를 처리했을 때 단핵세포의 부착을 면역형광염색으로 나타낸 그림이다.

도 6b는 인간 혈관내피세포에서 LA, TNF-α, IL-1β, 프랙트알킨 항체를 처리했을 때 단핵세포의 부착에 대한 면역형광염색의 결과를 양적으로 계산하여 나타낸 그림이다.

도 7a는 생체내에서 LPS의 유도로 인한 단핵세포의 부착을 면역화학염색으로 나타낸 그림이다.

도 7b는 생체내에서 LPS의 유도로 인한 단핵세포의 부착에 대한 면역화학염색의 결과를 양적으로 계산하여 나타낸 그림이다.

본 발명은 내독소혈증 치료용 약제조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 LPS의 유도로 인하 프랙트알킨(Fractalkine)의 발현으로 인한 내독소혈증을 감소시키는데 효과적인 화합물인 알파-리포산(α-lipoic acid)을 포함하는 내독소혈증 치료제 조성물에 관한 것이다.

패혈증은 감염에 대한 전신적인 반응을 나타내는 임상 증후군으로, 전신의 염증과 광범위한 조직손상을 특징으로 한다. 손상부위에서 내피조직은 백혈구를 유인하는 다양한 부착 분자들을 발현한다(Cines DB et al, Blood 1998 91: 3527-3561Cines DB et al, Blood 1998 91: 3527-3561). 동시에 염증성 세포가 활성화되고 부착 분자들을 발현하여 집단을 형성하고 혈관 내피조직으로 이동한다(Taub DD et al., Ther Immunol 1994 4: 229-246). 염증반응이 시작될 때, 폭넓게 다양한 화학적 매개체들이 순환적으로 방출된다. 이들 화학적 매체들은 TNF-α와 IL-1β를 포함하는데, 이들은 염증반응의 지속과 관련이 있다(Mantovani A et al., Immunol Today 1997 18: 231-240).

그람음성 세균에 의한 패혈증은 심폐, 신장, 혈액과 신진대사의 기능 장애로 인한 혈관의 쇠약함을 유도하는 병리생리학적 변화의 양성을 일으킨다(Levi M. et al., JAMA 1993 270: 975-979). 패혈증은 전염증성과 항염증 매개체인 여러 가지 사이토카인의 유도와 관련이 있다.

전염증성 사이토카인의 과다생성은 치명성에 상당하게 기여한다고 생각된다. 전염증성 TNF-α와 IL-1β는 내인성 매개체의 기폭제로서 기능을 하여, 염증 및 대사 반응을 일으켜 결국에는 심각한 열과 조직의 손상을 유도한다(Campanile F. et al., Eur J Pharmacol 1996 307: 191-199).

패혈증은 그람 음성 세균과 세포벽 성분의 구성 성분의 특징인 LPS(lipopolysaccharide)로 인한 내독소혈증(endotoxemia)에 대한 전신 반응의 악화로 일어난다(Glauser MP et al., Lancet 1991 338: 732-736). 마우스에서, LPS를 고농도로 투여하면 인간의 패혈증 쇼크와 유사한 결과가 나타난다(Gutierrez-Ramos JC et al., Immunol Today 1997 18: 329-334). 프랙트알킨은 구조적으로 새로운 단백질로서, 가용성 키모카인-유사 도메인은 뮤신 줄기에 융합되어 있고, 이는 세포막을 가로질러 세포질까지 뻗어있다(Bazan JF et al., Nature 1997 385: 640-644). 프랙트알킨은 내피세포에서 활성화되어 발현되며, TNF-α, IL-1β와 LPS에 의해 발현이 조절된다(Harrison JK et al., J Leukoc Biol 1999 66: 937-944, Garcia GE et al., J Leukoc Biol 2000 67: 577-5847). 프랙트알킨은 막단백질이자 부착물질로서 생리적인 흐름 상태에서 세포를 효과적으로 잡아둔다(Haskell CA et al., J Biol Chem 2000 275: 34183-34189, Fong AM et al., J Exp Med 1998 188: 1413-1419).

그러나, 프랙트알킨에서 막단백질 도메인의 결합부분에 근접한 뮤신 줄기의 분리는 프랙트알킨을 가용성 형태로 만들어서 G 단백질 연결 수용체인 CX3CR1의 리간드로서 기능을 한다. 사람에서 CX3CR1은 단핵세포, T 세포와 자연살해세포에서 주로 발현된다( Imai T et al., Cell 1997 91: 521-530). 따라서 프랙트알킨과 CX3CR1은 프랙트알킨을 발현하는 내피조직에서 CX3CR1을 발현하는 백혈구의 내피세포간의 이동과 백혈구를 잡아두고 회전시키고 정지시켜 안정한 부착을 하게 하는 특유의 역할을 한다.

혈관 내피세포는 혈액 조직의 경계면에서 장벽을 형성하며, 내피세포에 의해 생성되는 요인들은 패혈증과 같은 염증성 질병에서 중요한 병인이 될 수 있다. 프랙트알킨은 세포 표면에 박혀있는 키모카인으로 강하게 부착되어 있고 CX3CR1 양성 세포에 대해 화학주화성 특성을 가지고 있다.

내피세포의 염증과 손상에 있어서, 프랙트알킨의 중요한 생물학적 역할은 최근에 보고된 바에 따르면: CX3CR1 양성 세포에 대한 견고한 부착, 자연 살해 세포; CD8+ T 세포와 γδ T 세포를 포함하여 CX3CR1을 발현하는 세포 독성 작용 세포에 의한 세포독성; CX3CR1을 발현하는 세포에서 조직으로 이동하는 다른 키모카인들의 영향을 증대시킨다(Yoneda O et al., J Immunol 2000 164: 4055-4062, Umehara H. et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004 24: 34-40).

NF-κB의 활성화는 염증성 사이토카인이 유도하는 프랙트알킨의 발현에 있어 서, 전사 단계에서 중심적인 역할을 한다(Ahn SY et al., Am J Pathol 2004 164: 1663-1672, Garcia GE et al., J Leukoc Biol 2000 67: 577-584). 약리학적 분석에 따르면 TNF-α의 자극으로 인한 프랙트알킨의 발현은 NF-κB 경로에 의존한 활성화를 통해 일어난다고 밝혀졌다(Ahn S.Y. et al., Am J Pathol 2004 164: 1663-1672). 또한, SP-1 핵 활성화 단백질은 혈관의 손상과 염증에 관여한다고 보고되었다( Silverman ES, Collins T. Am J Pathol 1999 154: 665-667).

또한, 프랙트알킨의 발현은 배양된 내피세포에서 IL-1β와 IFN-γ와 같은 염증성 사이토카인에 의해 현저하게 유도된다 (Fraticelli P. et al., J Clin Invest 2001 107: 173-1181, Garcia GE et al., J Leukoc Biol 2000 67: 577-584).

우리는 이전에 프랙트알킨이 HUVECS에서 TNF-α의 자극으로 상향 조절된다고 보고하였다(Ahn SY et al., Am J Pathol 2004 164: 1663-1672). 프랙트알킨이 염증에 있어서 중요한 역할을 하기 때문에, 내피세포의 발현에 영향을 주는 요인은 혈관에서 염증 진행의 조절에 있어서 중요하다.

내피세포는 패혈증에서 면역학적인 공격의 첫 번째 표적이며, 내피세포의 손상은 혈관병증과 장기 기능장애를 일으킨다(Yoneda O et al., J Immunol 2000 164: 4055-4062). 패혈증에서 염증이 만연됨에 따라 LPS는 그람 음성 균혈증이 일어나는 동안 염증반응에서 주 병원성 요인이다. 이는 내독소혈증의 초기의 방어와 치료에 있어서 내피세포에서 프랙트알킨 발현의 조절을 하는 것을 밝히는데 중요하다.

알파 리포산(1,2-dithiolane-3-pentanoic acid, LA)은 옥탄산(octanoic acid)의 이황화물 유도체(disulphide derivative)이고, 미토콘드리아에 존재하는 케토산 탈수소효소 복합체에서 천연 보조군이다.

LA는 항산화 효과와 금속킬레이트 화합물 작용제로 알려져 있다(Suzuki YJ et al., Free Radic Res Commun 1991 15: 255-263, Ou P et al., Biochem Pharmacol 1995 50: 123-126). LA는 당뇨 합병증과 다발신경병증을 치료하는데 사용되어왔다(Packer L et al., Nutrition 2001 17: 888-895, Ametov AS et al., Diabetes Care 2003 26: 770-776). 또한 LA는 신경퇴화, 허혈성재관류, 간장질환과 같은 산화-환원 상태의 불균형과 관련된 병상의 예방과 치료를 위한 후보물질로 여겨져 왔다(Gonzalez-Perez O et al., Neurosci Lett 2002 321: 100-104, Freisleben HJ Toxicology 2000 148: 159-571, Pari L, Murugavel P J Appl Toxicol 2004 24: 21-26). 지금까지 패혈증 환자에 있어서 치료가 충분하지 않으므로, 염증 반응을 조절하여 경과를 개선하기 위한 새로운 효과적인 방법을 찾아왔다. 그러나, 내독소혈증에서 프랙트알킨의 발현에 대한 알파-리포산의 조절 기능은 아직까지 보고된 바가 없다.

본 발명은 상기한 바와 같은 종래 기술의 문제를 해결하기 위해 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 LPS가 유발하는 내독소혈증의 치료에 유용한 알파-리포산을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 제공함에 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 혈관 내피세포에서 염증반응을 억제하기 위한 유효성분으로 알파-리포산을 포함하는 염증 질환 억제용 약제조성물, 약제학적으로 허용되는 염 또는 이들의 유도체를 포함한다.

본 발명은 알파-리포산(LA)을 포함하는 약제조성물의 경구용 제제로서 정제, 환제, 산제, 과립제, 시럽제, 액제, 현탁제, 에멀션, 또는 캅셀제 등을 포함한다.

본 발명은 LA을 포함하는 약제조성물의 비경구용의 제제로서 주사제, 경직장용제제, 경피용제제 등을 포함한다.

본 발명은 LPS가 유도하는 내독소혈증 질환을 치료하는 방법에 있어서, 내독소혈증 치료를 필요로 하는 숙주에 상기 화합물의 치료요법적 유효량을 투여하는 것을 특징으로 하는 방법을 포함한다.

이하, 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 혈관 내피세포에서 염증반응을 억제하기 위한 하기 화학식(1) 또는 화학식(2)로 표시되는 알파-리포산을 유효성분으로 포함하는 염증 질환 억제용 약제조성물, 약제학적으로 허용되는 염 또는 이들의 유도체를 포함한다.

(1)

(2)

상기 본 발명에 의한 화합물에 있어서 "약제학적으로 허용되는 염"은 무기 또는 유기 염기 및 무기 또는 유기산을 포함하며 약제학적으로 허용되는 무독성 염기 또는 산으로부터 제조된 염을 포함한다.

또한 상기 화합물에 있어서 "화합물의 유도체"는 유리 하이드록시, 에틸기, 또는 메틸기를 포함한다.

본 발명의 약제조성물은 혈관 내피세포에서 염증반응을 예방 또는 치료하는데 유효한 양의 알파-리포산, 이의 염 또는 유도체를 유효성분으로 유효량 함유하며, 이들 화합물은 염증반응에 관여하는 프랙트알킨의 발현을 억제하고 단핵세포의 부착을 감소시켜 염증을 경감시킨다.

본 발명의 약제 조성물은, 경구 또는 비경구 어느 수단으로라도 투여할 수 있다. 투여 제형에는 특별한 제한은 없지만, 환자의 연령, 성별 또는 다른 상태 및 질환의 경중뿐만 아니라 제형에 따라 결정될 것이다. 경구용의 제제로는 예를 들면, 정제, 환제, 산제, 과립제, 시럽제, 액제, 현탁제, 에멀션, 또는 캅셀제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구용의 제제로는, 주사제, 경직장용제제, 경피용제제 등을 들 수 있고, 정맥내, 피하근육내, 복강내 등의 투여경로로 투여될 수 있다. 경구투여가 일반적으로 바람직하다.

또한, 본 발명의 약제조성물은 상기 유효성분에 통상적으로 사용되는 약학적으로 허용되는 부형제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 용해제, 보존제, 안정제, 완충제, 코팅제 등과 혼합함으로써 원하는 투여형태로 만들 수 있다.

상기에서 정제 제형을 위해서 당 업계에서 공지된 다양한 담체를 사용할 수 있다. 전형적인 담체의 예로는 : 락토오스, 사카로오스, 염화 나트륨, 글루코오스, 우레아, 스타치, 칼슘 카르보네이트, 카올린, 결정 셀룰로오스 및 규산과 같은 부형제 ; 물, 에탄올, 프로판올, 단미시럽, 글루코오스 용액, 스타치 용액, 젤라틴 용액, 카르복시메틸셀룰로오스, 쉘락, 메틸 셀룰로오스, 포타슘 포스페이트 및 폴리비닐 피롤리돈 슈거 등과 같은 결합제 ; 드라이 스타치, 소듐 알기네이트, 아거 파우더, 나미나란 파우더, 소듐 바이카르보네이트, 칼슘 카르보네이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 소듐 라우릴 술페이트, 스테아르산 모노글리세라이드, 스타치 및 락토오스와 같은 붕해제 ; 사카로오스, 스테아린, 카카오 버터 및 수소화 오일과 같은 붕해보조제 ; 4 급 암모늄염 및 소듐 라우릴 술페이트와 같은 흡수 촉진제 ; 글리세린 및 전분과 같은 습윤제 ; 전분, 락토오스, 카올린, 벤토나이트 및 콜로이드 규산과 같은 흡수제 ; 정제 탈크, 스테아레이트, 붕산 파우더 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제를 포함한다. 필요하다면, 정제를 코팅(예컨대, 슈거코팅, 젤라틴코팅, 장용코팅 또는 필름코팅)할 수 있고, 정제를 이층정 또는 다층정으로 형성할 수 있다.

환제 제형을 위해서, 당 업계에서 공지된 다양한 담체를 사용할 수 있다. 그 예로는, 글루코오스, 락토오스, 스타치, 카카오 오일, 수소화 식물유, 카올린 및 탈크와 같은 부형제 ; 아라비아 검 분말, 트라가칸트 파우더, 젤라틴 및 에탄올과 같은 결합제 ; 및 라미나란 아거와 같은 붕해제를 포함한다.

주사제로 제형화할 경우에는, 혈액과 등장인 멸균액 또는 현탁액이 바람직하다. 액제, 에멀션 또는 현탁액 제형을 위해서, 당 업계에서 통상적으로 사용되는 임의의 희석제를 사용할 수 있다. 그 예로는, 물, 에틸 알콜, 프로필렌 글리콜, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 프로폭실화 이소스테아릴 알콜 및 폴리옥시에틸렌 솔비탄 지방산 에스테르를 포함한다. 이러한 경우에, 염화 나트륨, 글루코오스 또는 글리세린을 등장액으로 제조하기에 충분한 양 또는 통상의 용해 보조제, 완충제, 스무딩제 등을 가하기에 충분한 양으로 포함할 수 있다. 또한, 발색제, 보존제, 아로마 화학제, 향미제, 감미제 또는 그 외의 약제를 필요하다면 가할 수 있다.

본 발명의 약제조성물의 유효성분의 용량은 패혈증으로 인한 염증 질환을 예방 또는 치료하는데 사용되는 경우, 환자의 증상, 연령, 체중 및 다른 질환의 유무와 투여 경로 등에 따라 다양하다. 몸무게 70㎏의 성인에게 경구 투여하는 경우, 하루에 300~800 ㎎, 바람직하게는 약 500~600 ㎎ 범위의 투여량으로 일회 또는 수회에 나누어 투여할 수 있다.

상기한 바와 같은 본 발명에 따른 약제조성물은 다양한 제형으로 제조되어질 수 있으며, 염증질환 환자에게 투여시 염증을 효과적으로 방지할 수 있다.

본 발명을 위하여 래트에 LPS (10 ㎎/㎏)를 정맥 투여한 후 TNF-α와 IL-1β의 농도 변화를 조사하였다. 대조군과 비교하였을 때, TNF-α의 혈청내 농도가 증가한다(0 pg/㎖:0, 1,250±213 pg/㎖:1 시간, 1,450±380 pg/㎖:2시간, 975±121 pg/㎖:3시간, 0 pg/㎖:4시간)는 것을 밝혔다. 또한, IL-1β의 혈청내 농도가 대조군에 비하여 증가하였다(0 pg/㎖:0, 104±20 pg/㎖:1시간, 232±45 pg/㎖:2시간, 212±19 pg/㎖:3시간, 127±12 pg/㎖:4시간). 이러한 결과들은 LPS가 유도하는 내독소혈증이 일어나는 동안 TNF-α와 IL-1β의 혈청내 농도가 증가한다는 것을 제시한다. 따라서 본 발명에서는 TNF-α와 IL-1β를 사용하였다. TNF-α와 IL-1β의 혈청내 농도는 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Kits(Endogen, Woburn, MA)를 이용하여 측정하였다. 또한, 본 발명에서 LA를 전처리한 래트에서, LPS의 투여로 인해 증가하는 TNF-α와 IL-1β를 의의 있게 억제하였다. 이러한 결과들은 LA의 전처리가 LPS의 투여로 인한 TNF-α와 IL-1β의 혈청 농도의 증가를 억제키므로 항염증 효과와 관련이 있다는 것을 시사한다.

본 발명에 의하면 HUVECs에서 TNF-α(10ng/ml)의 처리는 프랙트알킨 mRNA의 발현을 시간에 따라 증가시키고, 4시간째에 가장 증가하였다. 또한, 프랙트알킨 mRNA의 발현은 이 4시간대에서 TNF-α의 농도에 의존하여 증가하였다. 프래트알킨의 mRNA의 발현이 증가하는 것과 일치하게, TNF-α의 처리는 프랙트알킨 단백질의 발현은 24시간까지 대조군에서보다 높게 유지되었다.

또한, HUVECs에서 IL-1β(15 ng/ml)의 처리는 프랙트알킨 mRNA의 발현을 4시간까지 점차 증가되었으나, 8시간에서는 프랙트알킨 mRNA의 발현이 현저하게 감소하였다. 이 4시간대에서 프랙트알킨 mRAN의 발현은 IL-1β의 농도에 의존하여 증가되었다. 프랙트알킨 단백질의 최대 증가는 4-6시간대에서 관찰되었고, 24시간까지 대조군에서보다 높게 유지되었다.

본 발명에 의하면 LA는 내피세포에서 TNF-α와 IL-1β가 유도하는 프랙트알킨의 mRNA와 단백질 발현에 대한 강한 저해제이다. 이러한 결과는 LA가 프랙트알킨이 매개하는 혈관의 염증을 억제하는데 유용하다는 것을 제시한다.

본 발명에서 EMSA 분석에 의하면, LA는 TNF-α와 IL-1β의 자극으로 의한, DNA에 대한 NF-κB의 결합과 SP-1의 결합을 억제하였다. 따라서, LA가 NF-κB와 SP-1의 저해를 통해 TNF-α와 IL-1β가 유도하는 프랙트알킨의 mRNA의 발현을 억제할 수 있다. 또한, 본 발명에 의하면 HUVECs에서 TNF-α와 IL-1β는 대조군과 비교하여 볼 때 단핵세포의 부착을 4-5까지 증가시킨다. 이러한 단핵 세포의 부착은 LA의 처리로 감소된다. LA는 NF-κB와 SP-1의 저해를 통해 프랙트알킨이 매개하는 단핵세포의 부착을 조절한다.

래트에 LPS를 고농도로 투여하면 사람의 패혈증과 유사한 증후군을 초래하므로(Croner RS et al., Microvasc Res 2004 67: 182-191), 래트에 LPS 유도로 인한 내독소혈증 모델을 본 발명에 이용하였다. 본 발명에서 심장과 소장의 면역화학염색 분석에 의하면 정상 조건의 동맥내피세포에서는 프랙트알킨이 약하게 발현되었다.

LPS는 동맥과 모세관의 내피세포에서 프랙트알킨의 발현을 현저하게 증가시켰으나, 정맥 내피세포에서는 거의 증가시키지 않았다. 또한 LPS는 심벽의 심장내막, 심장판막에서 심장내막 표면과 소장 융모의 내피조직에서 프랙트알킨을 현저하게 증가시킨다. 이러한 결과들은 내독소혈증에서 소장의 프랙트알킨 발현이 내피세포에 특이적이라는 것을 제시한다. 생체내 프랙트알킨을 발현하는 내피세포와 CX3CR1을 발현하는 백혈구의 상호작용을 고려해 보면, 프랙트알킨은 내독소혈증에 있어서 정맥에서의 염증보다는 소장에서의 염증에 관여한다. LA의 전처리는 심장의 동맥내피세포, 심장내막과 심장 판막의 심장내막 표면에서 LPS가 유도하는 프랙트알킨의 발현을 현저하게 억제한다. 또한, LA는 소장의 동맥 내피세포와 융모 내피조직에서 LPS가 유도하는 프랙트알킨의 발현을 감소시킨다. 이러한 결과들은 LA가 내독소혈증에 있어서 동맥내피세포, 심장내막과 심장 판막의 심장내막 표면에서 프랙트알킨의 발현을 조절한다는 것을 제시한다.

본 발명에서는 LA의 전처리가 NF-κB와 SP-1의 저해를 통해 내피세포에서 TNF-α와 IL-1β가 유도하는 프랙트알킨의 발현을 억제한다는 것을 밝혔다. 또한 LA는 프랙트알킨 발현의 저해를 통해 사이토카인이 유도하는 CX3CR1 양성 백혈구와 내피세포 간의 부착을 감소시킨다.

본 발명에서 생체내 결과에 의하면 LA는 동맥 내피세포, 심장 내막, 융모 내막에서 LPS가 유도하는 프랙트알킨의 발현을 감소시켰다. 따라서, LA는 내독소혈증에 대한 항염증 약제로 평가되는 근거가 된다.

본 발명에서, 우리는 TNF-α나 IL-1β의 자극을 받은 사람의 제대정맥 내피 세포에서, 또는 래트의 LPS로 인한 내독소혈증(endotoxemia) 모델의 동맥 내피세포에서 프랙트알킨이 발현되는지 조사하였다. 또한, HUVECs에서 TNF-α나 IL-1β가 유도하는 프랙트알킨의 발현과 LPS로 인한 내독소혈증 모델에서 리포산의 기능을 조사하였다.

본 발명에 의하면, 알파-리포산이 HUVECs에서 NF-κB와 SP-1의 억제시켜 TNF-α와 IL-1β가 유도하는 프랙트알킨의 발현을 감소시켰다. 또한, 알파-리포산은 TNF-α나 IL-1β가 유도하는 단핵세포에 대한 내피세포의 부착을 억제하였다.

본 발명에 의하면 알파-리포산은 래트의 내독소혈증 모델의 소장과 심근 동맥 내피세포에서 프랙트알킨의 발현을 감소시켰다. 이러한 결과는 알파-리포산이 내독소혈증 모델에서 프랙트알킨이 매개하는 염증의 진행을 감소시키는 효과적인 작용제라는 것을 제시한다.

이하 실시예를 통해 발명의 구성 및 효과를 보다 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예1] LPS로 인한 혈청 TNF-α와 IL-1β의 농도 변화 및 LA의 영향

본 발명에서 래트에 LPS (10 ㎎/㎏)를 정맥 투여한 후 TNF-α와 IL-1β의 농도 변화를 조사하였다. 대조군과 비교하였을 때, TNF-α의 혈청내 농도가 증가한다(0 pg/㎖:0, 1,250±213 pg/㎖:1 시간, 1,450±380 pg/㎖:2시간, 975±121 pg/㎖:3시간, 0 pg/㎖:4시간)는 것을 밝혔다(도 1a). 또한, IL-1β의 혈청내 농도가 대조 군에 비하여 증가되었다(0 pg/㎖:0, 104±20 pg/㎖:1시간, 232±45 pg/㎖:2시간, 212±19 pg/㎖:3시간, 127±12 pg/㎖:4시간)(도 1b). 이러한 결과들은 LPS가 유도하는 내독소혈증이 일어나는 동안 TNF-α와 IL-1β의 혈청내 농도가 증가한다는 것을 제시한다. 따라서 본 발명에서는 TNF-α와 IL-1β를 사용하였다. TNF-α와 IL-1β의 혈청내 농도는 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Kits(Endogen, Woburn, MA)를 이용하여 측정하였다. 또한, 본 발명에서 LA를 전처리한 래트에서 LPS의 투여로 인해 증가하는 TNF-α와 IL-1β를 의의 있게 억제하였다(도 1a, b). 이러한 결과들은 LA의 전처리가 LPS의 투여로 인한 TNF-α와 IL-1β의 혈청 농도의 증가를 억제시키므로 항염증 효과와 관련이 있다는 것을 시사한다.

[실시예2] HUVECs에서 프랙트알킨의 mRNA와 단백질의 발현에 대한 TNF-α나 IL-1β의 영향

1) HUVECs의 배양과 시약

HUVECs은 사람의 탯줄로부터 콜라겐 분해효소 처리 방법에 의해 준비하였다[Kim W et al., FASEB J. 2003 17: 1937-1939]. 배양한 내피세포의 검증을 위해 면역 형광 염색에 의한 factor VIII의 존재를 확인하였다. HUVECs은 가습된 5% CO₂, 95% air, 37℃에서 20% (vol/vol) 혈청(FBS : fetal bovine serum)이 부가된 M-199 배지로 배양하였다. HUVECs은 2-4 계대 배양 세포를 본 실험에 사용하였다.

재조합 휴먼 TNF-α는 R&D Systems (Minneapolis, MN) 회사에서 구입하고, 항-프랙트알킨(fractalkine) 항체는 Torrey Pines BioLabs(Houston, TX) 사에서 구입하였다. LPS는 Sigma- Aldrich(St. Louis, MO) 사에서 구입하고, LA(Thioctacid 600ㄾ)는 VIATRIS GmbH & Co. KG (Frankfurt, Germany)에서 구입하였다. 배지, 혈청, 그리고 대부분의 생화학 시료들은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.

2) RNase 프로텍션(protection) 분석(RPA)

휴먼 프랙트알킨의 부분 cDNA(nucleotides 482-893, GenBank accession NM002996)를 PCR에 의해 증폭하여 pBluescript II KS+ (Stratagene, La Jolla, CA) 벡터에 클로닝하였다.

EcoRI으로 선형화시킨 후, T7 폴리머라아제(Ambion Maxiscript kit)를 이용하여 ³²P로 표지한 안티센스(antisense) RNA probes를 합성하여 젤을 통해 정제하였다. RNase 프로텍션 분석은 Ambion RPA kit (Austin, TX)를 이용하여 전체 RNAs에서 실시하였다. 사이클로필린(cyclophilin)의 안티센스 RNA 프로브(nucleotides 135-239, GenBank accession X52856)를 RNA 정량에 대한 내재된 대조군으로 사용하였다.

3) 웨스턴블럿

웨스턴 블럿에 의한 분석은 참고문헌(Ahn SY et al., Am J Pathol 2004 164: 1663-1672)에 따른 방법으로 시행하였다. 시료를 샘플버퍼와 섞어 10분간 끓인 후, 에스디에스 페이지 (SDS-PAGE) 시스템에서 전기영동을 통해 분리하여, 나이트로셀룰로오스 막에 전기전이 시켰다. 나이트로셀룰로오즈 막을 블로킹 버퍼와 반응시킨 다음 항-프랙트알킨 단일클론 항체를 반응시키고 수세한 후에 호오스래디쉬 퍼옥시다제에 접합된 이차 항체(secondary antibody)를 반응시켰다. 발색은 화학발광 검출(chemiluminescent detection, Amersham, Buckingham- shire, UK ) 방법에 따라 확인하였다. 상기의 막을 항 액틴(actin) 항체로 재블럿하여 각 시료 단백질의 동일량 사용을 확인하였다.

우리는 먼저 HUVECs에서 프랙트알킨의 발현에 대한 TNF-α와 IL-1β의 영향을 조사하였다. TNF-α(10ng/ml)는 프랙트알킨 mRNA의 발현을 시간에 따라 증가시키고, 4시간째에 가장 증가하였다.(도 2a). 또한, 프랙트알킨 mRNA의 발현은 이 4시간대에서 TNF-α의 농도에 의존하여 증가하였다(도 2b). 프래트알킨의 mRNA의 발현이 증가하는 것과 일치하게, TNF-α의 처리는 프랙트알킨 단백질의 발현은 24시간까지 대조군에서보다 높게 유지되었다(도 2c).

HUVECs에서 IL-1β(15 ng/ml)의 처리는 프랙트알킨 mRNA의 발현을 4시간까지 점차 증가되었으나, 8시간에서는 프랙트알킨 mRNA의 발현이 현저하게 감소하였다(도 3a). 이 4시간대에서 프랙트알킨 mRAN의 발현은 IL-1β의 농도에 의존하여 증가되었다(도 3b). 프랙트알킨 단백질의 최대 증가는 4-6시간대에서 관찰되었고, 24시간까지 대조군에서보다 높게 유지되었다(도 3c).

[실시예3] TNF-α와 IL-1β가 유도하는 프랙트알킨 mRNA와 TNF-α의 발현에 대한 LA의 영향

우리는 HUVECs에서 TNF-α와 IL-1β가 유도하는 프랙트알킨 mRNA와 TNF-α의 발현에 대한 LA의 영향을 조사하였다. LA(4mmol/L)의 처리는 TNF-α(10 ng/ml)나 IL-1β(15 ng/ml)가 유도하는 프랙트알킨 mRNA의 발현을 농도 의존적으로 억제하였다(도 4a, 4b). LA는 TNF-α나 IL-1β가 유도하는 프랙트알킨 mRNA의 발현을 약 70-80%까지 억제하였다. TNF-α(10 ng/ml)와 IL-1β(15 ng/ml)를 동시에 처리했을 때에도, LA는 프랙트알킨 mRNA의 발현을 억제하였다(도 4c). 또한 LA는 HUVECs에서 TNF-α나 IL-1β가 유도하는 프랙트알킨 단백질의 발현을 감소시켰다(도 4d). 이러한 결과는 LA가 HUVECs에서 TNF-α나 IL-1β가 유도하는 프랙트알킨의 발현의 저해제라는 것을 제시한다.

[실시예 4] TNF-α나 IL-1β가 유도하는 NF-κB와 SP-1의 결합 활성화에 대한 LA의 효과

EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay):

NF-κB 단백질에 대한 EMSA는 참고문헌에 기재된 방법에 따랐다(Kim I et al., J Biol Chem 2001 276: 7614-7620). 간단히 기술하면, 0.6% NP-40가 포함된 저삽투압 버퍼(10 mmol/L HEPES, pH 7.9, 1.5 mmol/L MgCl2, 10 mmol/L KCl, 0.5 mmol/L DTT, 0.5 mmol/L PMSF)에 세포를 용해시켜 4000 rpm으로 15분간 원심분리한다. 그 펠렛을 15ul의 고삼투압 버퍼(20 mmol/L HEPES, pH 7.9, 420 mmol/L NaCl, 25% glycerol, 1.5 mmol/L MgCl2, 0.2 mmol/L EDTA, 0.5 mmol/L PMSF, 0.5 mmol/L DTT)에 얼음 속에 20분간 놓아두어 용해시켰다. 25ul의 저장 버퍼(20 mmol/L HEPES, pH 7.9, 100 mmol/L NaCl, 20% glycerol, 0.2 mmol/L EDTA, 0.5 mmol/L PMSF, 0.5 mmol/L DTT)를 첨가하여 섞은 후 14,000 rpm에서 20분간 원심분리하였다.

핵 추출물 (10ug)을 ³²P로 표지한 NF-κB가 결합하는 위치의 올리고머 5'-AGTTGAGG GGACTTTCCCAGGC-3' (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 약 20,000cpm과 20℃에서 30분간 반응시켰다.

SP-1 단백질에 대한 EMSA는 바이오틴으로 표지한 SP-1이 결합하는 위치의 올리고머 5'-GATCCGGTCCCCCACCATCCCCCGCCATTTCCA를 사용하였고, 결과는 EMSA Gel-Shift Kit( Panomics, Redwood City, CA)의 방법에 따라 화학발광 방법으로 분석하였다.

우리는 HUVECs에서 NF-κB가 TNF-α가 유도하는 프랙트알킨의 발현에 관여한다는 것을 보고하였다(Ahn SY et al., Am J Pathol 2004 164: 1663-1672). 본 발명에서는 LA가 TNF-α(10 ng/ml)나 IL-1β(15 ng/ml)를 처리한 HUVECs의 핵추출물을 이용하여 NF-κB 활성에 대한 LA의 효과를 EMSA(electrophoretic mobility shift assay)방법으로 조사하였다. 도 5a에서 보여주는 바와 같이, EMSA 분석은 NF-κ B(p65/p50)가 결합하는 활성화가 TNF-α나 IL-1β의 처리로 증가한다는 것과 LA가 TNF-α나 IL-1β가 유도하는 NF-κB(p65/p50) 가 결합하는 활성화를 억제한다는 것을 밝혔다. LA의 단독 처리는 NF-κB(p65/p50)가 결합하는 활성화에 영향을 주지 않는다.

이러한 결과는 LA가 HUVECs에서 NF-κB 활성화의 억제를 통해, TNF-α나 IL-1β가 유도하는 프랙트알킨의 발현을 억제한다는 것을 제시한다.

TNF-α는 HUVECs에서 SP-1이 결합하는 활성화를 증가시키고, 미트라마이신은 SP-1의 저해제로서 HUVECs에서 TNF-α가 유도하는 프랙트알킨의 발현을 감소시킨다(Shi J et al., J Cardiovasc Pharmacol 2004 44: 26-34, Levi M. et al., JAMA 1993 270: 975-979). 본 발명에서는 LA가 HUVECs에서 TNF-α나 IL-1β의 유도로 인한 SP-1 결합 활성화를 조절할 수 있는지 조사하였다.

EMSA 분석을 통하여 HUVECs에서 TNF-α나 IL-1β의 처리가 SP-1 결합 활성화를 증가시킨다는 것을 밝혔다. 또한 LA는 TNF-α나 IL-1β의 유도로 인한 SP-1 결합 활성화를 감소시켰다. LA의 단독 처리는 기본적인 SP-1 결합 활성화에 영향을 주지 않았다(도 5b). 이러한 결과들을 종합해 보면, LA는 HUVECs에서 NF-κB와 SP-1이 결합하는 활성화에 의한 프랙트알킨의 발현을 억제한다는 것을 제시한다.

[실시예 5]HUVECs에서 TNF-α나 IL-1β가 유도하는 단핵세포의 부착에 대한 LA의 효과

단핵세포(Monocyte) 분리와 부착(adhesion) 분석:

사람의 말초 혈액 단핵세포(Human peripheral blood monocytes)는 건강한 지원자의 혈액으로부터 Ficoll-Paque gradient 원심분리 방법으로 분리하였다. 본 실험 방법은 전북대학병원의 리뷰에 실린 공인된 방법 따랐다. 단핵세포는 마그네틱 비드(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 이용한 음성 선택(negative selection)으로 분리하였다(Ancuta P et al., J Exp Med 2003 197: 1701-1707). 단핵세포 분리의 순도는 항-CD14, 항-CD33, 항-CD16b, 그리고 항-CD56 모노클로날 항체로 염색하여 실시한 FACScan 분석(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)에 따르면 93-95%로 확인되었다. 단핵세포-내피의 부착은 알려진 방법에 따라 단핵세포에 형광 표지를 하여 관찰하였다(Kim W. et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003 23: 1377-1383). HUVECs에 부착된 단핵세포의 수는 전체 신호에 대한 부착세포의 비율로 계산하였다.

내피세포에서 프랙트알킨의 발현은 단핵세포와 같은 CX3CR1 양성 세포의 부착을 유도한다(Imai T et al., Cell 1997 91: 521-530). 우리는 LA가 HUVECs에서 TNF-α나 IL-1β의 자극으로 인한 단핵세포의 부착을 감소시키는지 조사하였다. TNF-α나 IL-1β는 HUVECs에서 단핵세포의 부착을 현저하게 증가시켰다. HUVECs에서 TNF-α(10 ng/ml)나 IL-1β(15 ng/ml)의 처리는 6시간에서 단핵세포의 부착을 대조군보다 4-5배까지 현저하게 증가시켰다. 그러나, TNF-α를 LA와 동시에 처리했을 때 단핵세포의 부착을 63%까지, IL-1β와 LA를 동시에 처리했을 때 단핵세포의 부착을 76%까지 감소시켰다. L,의 단독 처리는 단핵세포의 부착에 영향을 주지 않았다(도 6a, 6b).

또한, 프랙트알킨 항체의 처리는 TNF-α나 IL-1β의 자극으로 인한 단핵세포의 부착을 각각 50%와 47%까지 감소시켰다. 프랙트알킨 항체의 단독 처리는 HUVECs에서 단핵세포의 부착에 영향을 주지 않았다. 이러한 결과는 LA가 프랙트알킨의 발현을 통해 HUVECs에서 TNF-α나 IL-1β의 자극으로 인한 단핵세포의 부착을 감소시킨다는 것을 제시한다.

[실시예 6] 심장 내피세포와 소장 내피세포에서 LPS가 유도하는 프랙트알킨의 발현에 대한 LA의 효과

1) 동물 실험

Sprague-Dawley 래트(150-200 g)는 오리엔트사(Charles River Korea, Seoul, Korea)에서 구입하였고, 표준 먹이와 물을 통제하여 공급하였다. 모든 동물 실험은 전북대학교 의과대학의 동물관리 위원회의 동의와 지침에 따랐다. 래트(180-220 g)는 3 그룹으로 나누어 실험을 하였다 ; 대조군(n=6), LPS (10 mg/kg) (n=6), LPS (10 mg/kg) plus LA (10 mg/kg/day) (n=6). 대조군 버퍼와 LPS는 꼬리 정맥을 통하여 정맥주사로 투여하였다. LA는 LPS를 투여하기 전에 3일 동안 하루에 한 번씩 복강내 투여하였다. LPS나 대조군 버퍼를 투여하고 12시간 후에 케타민(100 mg/kg)과 럼푼(10 mg/kg)으로 마취시키고 경추를 탈골 시켰다. 심장(heart)과 공장(jejunum)을 취하여 RNase 보호 분석, 웨스턴 블럿과 면역화학염색을 하였다.

2) 면역조직화학염색(immunohistochemistry) 분석

심장(heart)과 공장(jejunum)을 빠르게 절개하여, 인산완충생리식염수 (PBS)로 수세하여 액체질소로 미리 냉각시킨 이소부탄(2-methyl butane)이 든 OCT에 넣어 급속냉동 시켰다. 각 마우스로부터 얻은 각각의 동결된 조직(heart or jejunum)을 10 ㎛로 자른 절편 8-12개를 항-프랙트알킨 항체와 4℃에서 밤샘 반응시켰다. 발색은 "세포와 조직 염색 키트"(Cell and Tissue Staining Kit, R&D Systems, Minneapolis, MN)로 확인하였다. 조직절편은 핵염색(Meyer's hematoxylin)으로 대조염색을 실시하였고, 칼라 CCD카메라(ProgResC14; Jenoptik, Jena, Germany)와 모니터가 장착된 Axioskope2 plus 현미경 (Carl Zeiss, Germany)으로 관찰하여 사진을 찍었다.

우리는 래트의 심장에서 프랙트알킨의 발현에 대한 LPS의 영향을 면역화학염색으로 조사하였다. 정상적인 래트의 내재된 프랙트알킨의 발현은 동맥 내피세포에서 약하게 관찰되지만, 모세혈관의 내피세포, 정맥 내피세포, 심장내막, 심근, 심막 그리고, 심장 판막에서는 프랙트알킨이 거의 발현되지 않는다. LPS(10 mg/kg)의 정맥내 투여는 동맥내피세포, 심장내막, 심장판막의 심장내막표면에서는 프랙트알킨의 발현이 현저하게 증가하였고, 정맥내피세포에서는 발현이 증가하지 않았다. LA (10 mg/kg/일, 3일)의 전처리는 동맥내피세포, 심장내막, 심장판막의 심장내막표면에서 LPS가 유도하는 프랙트알킨의 발현을 현저하게 억제한다.

래트의 소장에서 프랙트알킨의 발현에 대한 LPS의 영향을 면역화학염색을 통해 조사하였다. 동맥내피세포에서 내재된 프랙트알킨의 발현이 약하게 관찰되었지 만, 융모내막세포, 정맥과 림프 내피세포나 상피세포에서는 거의 발현되지 않았다(도 7a, 7b).

LPS의 정맥내 투여는 동맥과 소동맥의 내피세포와 융모 내피조직에서 프랙트알킨의 발현을 현저하게 증가시키고, 림프 내피세포나 상피세포에서는 증가되지 않았다. 이러한 결과들은 LPS가 소장의 내피세포에서 프랙트알킨의 발현을 유도한다는 것을 제시한다. 또한, LA의 전처리는 동맥 내피세포와 융모 내피조직에서 LPS가 유도하는 프랙트알킨의 발현을 억제한다. 이러한 결과는 LA의 전처리가 심장 내피세포와 소장 내피세포에서 LPS가 유도하는 프랙트알킨의 발현을 억제한다는 것을 시사한다.

이상에서 살펴본 바와 같이 알파-리포산의 전처리가 LPS가 유도하는 내독소혈증(endotoxemia) 모델의 동맥 내피세포에서 프랙트알킨의 발현을 억제하여 내피세포에 대한 단핵세포의 부착을 현저하게 억제하였다. 알파-리포산의 이러한 효과는 NF-κB의 신호 전달 경로를 통해 전달되며, 동맥내피세포, 심장내막, 심장판막의 심장내막표면에서 프랙트알킨의 발현을 억제한다. 따라서, 내독소혈증의 프랙트알킨이 매개하는 염증을 억제하여 병증을 감소시키는데 효과적인 치료제 개발에 유용한 물질이 될 것이다.

Claims

혈관 내피세포에서 염증반응을 억제하기 위한 유효성분으로 알파-리포산, 약제학적으로 허용되는 염 또는 이들의 유도체를 포함하는 염증 질환 치료용 약제조성물.
제 1항에 있어서 하기 화합물(1) 또는 화합물(2)를 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 약제조성물.

(1)

(2)
제 1항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 염은 무기 또는 유기 염기 및 무기 또는 유기산에서 선택되어지는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약제조성물.
제 1항에 있어서, 화합물의 유도체가 유리 하이드록시, 에틸기, 또는 메틸기에서 선택되어지는 어느 하나임을 특징으로 하는 약제조성물.
제 1항의 알파-리포산(LA)을 포함하며 정제, 환제, 산제, 과립제, 시럽제, 액제, 현탁제, 에멀션, 또는 캅셀제인 약제조성물의 경구용 제제.
제 1항의 알파-리포산(LA)을 포함하며 주사제, 경직장용제제, 경피용제제인 약제조성물의 비경구용 제제.
LPS가 유발하는 내독소혈증을 치료하는 방법에 있어서, 내독소혈증 치료를 필요로 하는 숙주에 청구항 1항의 치료요법적 유효량을 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.