KR100351495B1 - α-인터페론BDBB를포함하는수성액상제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 pH 3.0 내지 5.0의 완충액을 안정화제로서 함유하는 안정한 하이브리드 α-인터페론 수용액을 제공한다.

Description

α-인터페론 BDBB를 포함하는 수성 액상 제제

본 발명은 α-인터페론 하이브리드를 함유하는 안정한 수성 조성물에 관한 것이다.

인터페론은 바이러스 및 다른 자극원에 대한 반응에서 생산된 유도 가능한 분비 단백질 군이다. α-인터페론은 예를 들면, 유모상 세포성 백혈병(Hairy-cell leukaemia), AIDS 중의 카포시 육종, 만성 비-A, 비-B형 간염 및 기저 세포 암종을 비롯한 많은 다른 질병의 치료를 위해 임상적으로 통용되고 있다.

재조합 인체 α-인터페론 B/D 하이브리드 성분은 유익한 특성을 가진 분자를 생산하기 위해 모 α-인터페론 B 및 D종 서열의 여러 부분으로 형성되었다 [A. Meister, G. Uz, K. E. Mogensen, J. Gen. Virol.67. 1633, (1986) 참조]. 모 분자는 분해되어 펩타이드 서열 1-60, 61-92, 93-150 및 151-166을 코딩하는 DNA 세그먼트를 교환한다. BDBB 하이브리드는 특별히 목적하는 잠복기의 항바이러스 및 항증식 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다 [H.K. Hochkeppel, M. Gruetter, M.A. Horisberger, J.K. Lazdins, Drugs of the Future,17(10), 899, (1992) 참조]. α-인터페론 BDBB와 같은 단백질은 정제, 분리, 저장 및 이러한 종들의 전달에서문제점을 야기시키는 복잡한 화학적 및 물리적 특성을 갖는다. 그러므로, 단백질 약제의 제형은 단단한 작은 유기 분자의 그것과는 전혀 다르다. 몇몇 종류의 부형제가 단백질 및 펩타이드의 비경구 제형화에 이용되었다. 단백질은 경구 생체이용능이 불량하기 때문에, 약물을 효과적으로 전달하기 위한 가장 통상적인 취급법은 그것들을 주사용 제품으로 제공하는 것이다. 용액에서의 불안정성 때문에, 단백질은 일반적으로 피하, 근육내 또는 정맥내 경로로 주사하기 직전에 재형성하기 위한 동결 건조된(freeze-dried) 분말로서 제형화된다.

단백질 분해는 2가지 카테고리, 즉 화학적 안정성 및 물리적 안정성으로 분리될 수 있다. 화학적 안정성은 단백질이 결합 분해 또는 결합 형성에 의해 화학적으로 변형되는 모든 방법을 의미한다. 물리적 안정성이란 공유 변형을 포함하는 것이 아니라, 예를 들면 변성, 응집 또는 침전을 통한 단백질의 고차원적 구조의 변화를 포함하는 것이다. 치료 중의 임의의 가능한 면역원성의 역효과 및(또는) 일정하지 않은 복용을 해결하기 위해 하이브리드 α-인터페론 BDBB를 응집되지 않은 상태로 유지하는 것이 바람직하다.

주사용 치료제로서 사용하기에 바람직한 농도의 하이브리드 α-인터페론 BDBB는 물에서 물리적으로 불안정하다. 그의 용해성은 떨어지고 그것은 응집된 상태로 존재한다. 그러므로, 안정화 부형제가 이용되어야 한다.

본 발명자는 하이브리드 α-인터페론이 (인산염 완충된) 중성 pH의 용액으로 제형화될 때 응집된 상태로 존재한다는 것을 발견하였다. 또한, 단백질의 용해도는 그러한 상태하에서 떨어지는 것으로 나타나며 실질적으로 거의 용해되지 않는다.

본 발명자는 낮은 pH의 수용액 상태로 하이브리드 α-인터페론을 제형화하는 것이 단백질을 안정화시키며, 바람직한 단량체 상태로 유지할 수 있으며 용액에 용해되는 것을 더욱 용이하게 한다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 pH 3.0 내지 5.0의 완충액을 안정화제로서 함유하는 안정한 하이브리드 α-인터페론 수용액을 제공한다.

이 용액의 pH는 4.0 내지 4.5가 바람직하다. 하이브리드 α-인터페론은 바람직하게는 α-인터페론 BDBB (서열 번호 1)이다.

선택된 완충염은 제약학상 허용되는 것, 예를 들면 글리신/HCl 또는 시트르산 나트륨이어야 하며, 20 내지 400 mM의 농도로 존재하는 것이 바람직하다. 바람직한 완충염은 50 내지 150 mM 농도의 글리신/HCl이다.

제약학상 허용되는 폴리올, 예를 들면 만니톨, 글루코스 또는 수크로스는 바람직하게는 20 내지 500 mM의 농도로 이용될 수도 있다. 바람직한 폴리올은 100 내지 250 mM 농도의 만니톨이다. 폴리올은 용액의 긴장성을 생리학적 수치로 조절하는데 주로 사용된다.

하이브리드 α-인터페론은 0.1 내지 1.5 mg/ml의 농도로 존재하는 것이 바람직하며, 가장 바람직한 범위는 0.2 내지 0.4 mg/ml이다.

하이브리드 α-인터페론은 정상적으로 단리되며, 다단계 절차에 의해 정제되고 제약학상 허용되지 않는 pH 7.0의 완충계에서 동결된 벌크 용액으로서 저장된다. 본 발명의 안정한 용액을 제조하기 위하여 이러한 완충계를 소정의 pH를 가진 제약학상 허용되는 것으로 교환할 필요가 있다. 이것은 소정의 완충액을 첨가하고,이 용액을 한외 여과시키고, 완충액을 첨가하고 이 사이클을 수회 반복함으로써 수행될 수 있다. 다른 방법은 겔 여과 크로마토그래피에서와 같이 이용될 수 있다.

본 발명의 제제는 상기 지시한 약제로서 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 의해 사용하기에 적합하다.

본 발명을 하기 실시예에 의해 구체적으로 예시한다.

실시예 1

pH 4.0의 안정한 0.3 mg/ml 하이브리드 α-인터페론 BDBB 시트레이트 용액 제제의 제조:

하이브리드 α-인터페론 BDBB의 원료 벌크 용액 (pH 7.0의 200 mM 암모늄 클로라이드/20 mM 트리스(히드록시메틸)메틸아민 중의 2.6 mg/ml)은, 10 KDa 분자량의 절단 막(Amicon YM 10)이 장착된 한외여과 셀(Amicon사 제품) 중에서 pH 4.0의 40 mM 시트르산 나트륨/시트르산 완충액을 사용하여 50 ml로 만들었다. 이 셀을 산소가 없는 질소를 이용하여 50 내지 60 psi로 가압하였다. 막의 표면에서 단백질 농도를 최소화하기 위해 연속 교반시키며 단백질이 침전되지 않을 정도로 체적을 감소시키고 pH 4.0의 40 mM 시트르산 나트륨/시트르산 완충액으로 다시 50 ml가 되도록 희석시켰다. 이 사이클을 5회 반복하였다. 최종 용액의 pH는 4.0으로 확인되었다. 최종 용액의 단백질 함유량은 표준 방법 (Bradford assay, Bio-Rad 사 제품)을 사용한 결과 0.3 mg/ml로 확인되었다.

상기 제제를 멸균 여과시키고, 2 ml 약제 등급 타입 1 유리 바이알에 무균 충전시키고 테플론 코팅된 고무 격막/알루미늄 주름 캡으로 밀봉시켰다. 이 바이알을 어둠 속에서 4 ℃로 저장하였다. 일정한 시간 간격으로, 시료를 역상 HPLC (화학적 안정성의 지표) 및 사이즈 배제 크로마토그래피(용액 중의 단백질의 응집 상태의 척도)에 의해 분석하였다. 하이브리드 α-인터페론의 총 피크 면적 %로서 표현된 역상 HPLC 결과는 다음과 같다.

이 결과는 반복(일반적으로 3 내지 5회) 주사의 방법으로서 표시되었다. 이러한 측정을 위한 편차 계수(cv)는 <0.3%였다.

분해는 유사 1차 역학을 따르는 것으로 나타났다. 데이타를 통한 가장 잘맞는 직선의 연장에 의해 하이브리드 α-인터페론 BDBB의 초기 함량의 95%로 분해되는 데 걸리는 시간 (t95)으로 정의된 저장 안정성의 평가가 이루어질 수 있다. 이제제는 4 ℃에서 8개월 이상의 예측된 저장 수명을 가졌다.

크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 4 ℃에서 136일 동안 저장한 후에 검출 가능한 응집물의 형성이 이루어지지 않았음을 나타냈다.

실시예 2

용액에 200 mM 만니톨을 더 함유시킨 것을 제외하고는 실시예 1을 반복하였다. 안정성 시험은 실시예 1에서와 같이 수행하였지만, 속성 시험을 위해 하기한 바와 같이 다른 온도에서 저장하며 실시하였다.

분해는 유사 1차 역학을 따르는 것으로 나타났다. 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 측정한 결과, 제제는 25 ℃에서 6주 이상의 예측된 저장 수명을 가진 것으로 나타났다.

실시예 3

pH 4.0의 안정한 0.3 mg/ml 하이브리드 α-인터페론 BDBB 글리신 용액 제제의 제조:

실시예 1에 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여 하이브리드 α-인티페론 BDBB의 원료 벌크 용액 (pH 7.0의 200 mM 암모늄 클로라이드/20 mM 트리스(히드록시메틸)메틸아민 중의 2.6 mg/ml)을 pH 4.0의 80 mM 글리신/HCl 완충액 중의 단백질 0.3 mg/ml 용액으로 전환시켰다.

pH 4.0의 안정한 하이브리드 α-인터페론 BDBB 글리신 용액 제제의 안정성 시험은 실시예 1에 기재된 방법에 따라서 수행하였다. 그 결과는 다음과 같다.

분해는 유사 1차 역학을 따르는 것으로 나타났다. 실시예 1에 기재된 방법을사용하여 측정한 결과, 제제는 4 ℃에서 18 개월 이상의 예측된 저장 수명을 가진 것으로 나타났다.

SEC는 4 ℃에서 136일 동안 저장한 후에 응집된 종이 확실히 형성되지 않았음을 나타냈다.

실시예 4

용액에 200 mM 만니톨을 더 함유시킨 것을 제외하고는 실시예 3을 반복하였다. 안정성 시험은 실시예 3에서와 같이 수행하였지만, 하기한 바와 같이 다른 온도에서 저장하며 실시하였다.

분해는 유사 1차 역학을 따르는 것으로 나타났다. 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 측정한 결과, 제제는 4 ℃에서 5년 이상의 예측된 저장 수명을 가진 것으로 나타났다.

SEC는 4 ℃에서 20주 동안 또는 40 ℃에서 4주 동안 저장한 후에 응집된 종이 확실히 형성되지 않았음을 나타냈다.

실시예 5

글리신/HCl 완충액의 농도를 318 mM로 한 것을 제외하고는 실시예 3을 반복하였다. 안정성 시험은 실시예 3에서와 같이 수행하였지만, 하기한 바와 같이 다른 온도에서 저장하며 실시하였다.

분해는 유사 1차 역학을 따르는 것으로 나타났다. 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 측정한 결과, 제제는 4 ℃에서 6개월 이상의 예측된 저장 수명을 가진 것으로 나타났다.

서열 표

일반적인 정보:

(i) 출원인:

(A) 성명: 시바-가이기 아게

(B) 주소: 클라이벡스트라세 141

(C) 도시: 바젤

(E) 국가: 스위스연방

(F) 우편번호: 4002

(G) 전화 번호: 061 969 1111

(H) 팩스 번호: 061 969 7976

(l) 텔렉스 번호: 962991

(ii) 발명의 명칭: 제약 조성물

(iii) 서열 수: 1

(iv) 컴퓨터 해독 형태:

(A) 전달 매체: 플로피 디스크

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환성

(C) 운영 체계: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: Chemtext Version 1.50

서열 번호: 1

(i) 서열 특징

(A) 길이: 166 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥의 수: 단일쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 유형: 단백질

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티-센스: 없음

(v) 명칭: 재조합 하이브리드 인터페론 알파 BDBB

(ix) 특징:

(A) 네임/키: 이황화 결합

(B) 위치: 아미노산 1 내지 99

(ix) 특징:

(A) 네임/키: 이황화 결합

(B) 위치: 아미노산 29 내지 139

Claims (6)

1. pH 3.0 내지 5.0의 완충액을 안정화제로서 함유하는 α-인터페론 BDBB(서열 번호 1)의 안정한 수성 액상 제제.
2. 제1항에 있어서, 완충액이 글리신/HCl 또는 시트르산 나트륨인 안정한 수성 액상 제제.
3. 제1항에 있어서, 완충액이 20 내지 400 mM의 농도로 존재하는 안정한 수성 액상 제제.
4. 제1항에 있어서, α-인터페론 BDBB의 농도가 0.1 내지 1.5 mg/ml 인 안정한 수성 액상 제제.
5. 제4항에 있어서, 제약학상 허용되는 폴리올을 더 함유하는 안정한 수성 액상 제제.
6. 제5항에 있어서, 폴리올이 20 내지 500 mM의 농도로 존재하는 안정한 수성 액상 제제.