KR19990075253A - 약학적으로 안정한 인터페론 제 - Google Patents

약학적으로 안정한 인터페론 제 Download PDF

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박선희
이영필
박순재
강영철
정희선
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성재갑
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Abstract

본 발명은 인터페론이 유효 성분으로 함유된 인터페론 제에 관한 것으로서, 유전자 재조합에 의해 제조된 인터페론에 각종 첨가제가 포함된 약학적으로 안정한 본 발명의 인터페론 제는 장기간 동안 안정하고, 성상이 우수하며, 용해도가 큰 인터페론 제로서, 피부암(skin cancer), 뇌종양(brain tumor), 다발성 경화증(multiple sclerosis) 및 바이러스성 B 형 간염(viral hepatitis B) 등의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

약학적으로 안정한 인터페론 제
본 발명은 유전자 재조합에 의해 제조된 인터페론(interferon)에 완충용액, 인체 혈청 알부민(human serum albumin; 이하, "HSA"라 약칭한다) 및 부형제 등이 첨가된 약학적으로 안정한 인터페론 제에 관한 것이다.
인터페론은 세포의 여러 기능을 조절하는 작용을 갖는 단백질의 일종으로서 그 기능이 매우 다양하다. 즉, 바이러스로부터 세포를 보호하며, 조직 배양에서 또는 골수에서의 세포분열을 억제하고, T 세포(T-cell)의 작용을 조절하며, 자연면역 세포(NK 세포)의 기능항진을 유도하여 식균작용을 상승시키거나 특수 암세포의 분열을 억제하는 기능이 있는 것으로 알려져 있으며, 특히 항바이러스제와 항암제로 유용하게 사용되고 있다. 이들 인터페론은 α, β 및 γ-인터페론 및 그 밖의 다양한 종류의 인터페론이 알려져 있으며, 이중 β-인터페론은 분자량이 약 23,000인 당단백질로서, 피부암, 뇌종양, 다발성 경화증 및 바이러스성 B 형 간염 치료제로 효과가 있다.
천연의 인체 β-인터페론은 일반적으로 인체 섬유 아세포(human fibrous blast cell)에 폴리-IC(poly-riboinosinic acid and polyribocytidylic acid) 처리에 의해 생산된다. 또한, 유전자 재조합 방법에 의하여 미생물로부터 β-인터페론이 생산된다.
천연형 β-인터페론은 일반적으로 당이 결합되어 있는 당단백질이기 때문에 지질 친화성 단백질이 아니다. 그러나, 재조합 방법에 의해 대장균과 같은 미생물에서 생산되는 β-인터페론은 당 성분이 없기 때문에 지질 친화성을 지니게 되어 중성 pH 부근에서는 용해되지 않는다. 따라서, 지질 친화성이 강한 β-인터페론을 이용하여 인터페론 제를 제조하기 위해서는 β-인터페론을 안정화시켜야 한다.
심발리스토 등(Cymbalisto et al.)은 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone)을 사용하여 인체 섬유 아세포로부터 제조된 β-인터페론을 안정화하였다 (미국특허 USP 제 4647454호, 유럽특허 EP 제 0089245호).
하니쉬 등(Hanisch et al.)은 β-인터페론을 염기성 pH의 조건에서 혈청 알부민(serum albumin)과 같은 단백질 안정화제와 섞은 후 이 용액의 pH를 중성이 되도록 조절하여 β-인터페론을 용해시켰다. (미국특허 USP 제 4462940호)
유럽특허 EP 제 215658호 에는 지질 친화성을 갖는 재조합 단백질을 중성 pH에서 비독성 및 비활성의 담체(carrier)에 용해시키고, 안정화제로 알부민, 알부민/덱스트로오스(dextrose) 또는 인체 혈장 단백질(human plasma protein)을 포함하는 약학적 조성물이 보고되어 있다.
유럽특허 EP 제 217645호 에는 β-인터페론 또는 인터루킨-2를 pH 7.0∼8.0에서 소듐 로레이트(sodium laurate)를 안정화제로 사용하여 안정한 담체에 용해시키는 방법이 보고되어 있다.
미국특허 USP 제 4766106호 에는 재조합 방법에 의해 제조된 β-인터페론을 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 또는 폴리옥시에틸화된 폴리올(polyoxyethylated polyol)과 같은 수용성 고분자(water-soluble polymer)에 결합시킴으로써 용해제 없이 중성 pH에서 β-인터페론을 용해시키는 방법이 보고되어 있다.
국제출원 WO 제 89/02750호(유럽특허 EP 제 0270799호)에는 비이온성 중합체 세제(non-ionic polymeric detergents)와 같은 비활성 담체에 재조합 방법에 의해 제조된 β-인터페론을 용해시켜 제조된 제형이 보고되어 있다.
국제출원 WO 제 89/09624호 에는 용해제 없이 수용성 담체 매질에서 β-인터페론 또는 인터루킨 등의 단백질을 헤파린(heparin)에 결합시킨 뒤 용해시켜 얻은 조성물이 보고되었다.
국제출원 WO 제 89/05158호 에는 pH 2∼4의 산성조건에서 안정화제로 글리세롤(glycerol) 또는 폴리에틸렌 글리세롤(polyethylene glycol)을 사용하여 β-인터페론을 용해시키는 방법이 보고되었다.
국제출원 WO 제 89/10756호 에는 65∼90 중량%의 폴리올(polyol)과 p-히드록시벤조에이트(p-hydroxybenzoate)를 함유하는, 상온에서도 장기간 안정한 β-인터페론의 제형이 보고되었다.
국제출원 WO 제 95/31213호 에는 폴리올, 비환원성 당 또는 아미노산으로 안정화되고, 제형성분으로 pH 3∼4인 아세테이트 완충용액(acetate buffer solution)과 인체 혈청 단백질(human serum protein)이 함유된 β-인터페론의 용액 제형이 보고된 바 있다.
이에 본 발명자들은 약학적으로 안정한 β-인터페론 제를 제조하고자 연구를 계속하여 오던 중, 동결건조 후에도 재용해성 및 제품의 성상이 우수한 β-인터페론 제를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 장기간 동안 생물학적 활성이 지속적으로 유지되어 안정하며, 제품의 성상이 우수한 β-인터페론 제를 제공하는 것이다.
도 1 은 동결 건조된 β-인터페론(β-interferon) 제를 4℃에서 15개월 동안 장기 보존하였을 때의 안정성(활성을 초기 활성에 대한 백분율로 표시)을 나타낸 그래프도이며,
도 2 는 동결 건조된 β-인터페론 제를 30℃에서 16주 동안 보존하였을 때의 안정성(활성을 초기 활성에 대한 백분율로 표시)을 나타낸 그래프도이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유전자 재조합에 의해 제조된 인터페론(interferon)에 완충용액, 인체 혈청 알부민(HSA) 및 부형제 등이 첨가된 약학적으로 안정한 인터페론 제를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 β-인터페론 제는 유효성분인 유전자 재조합 방법에 의해 대장균에서 생산된 β-인터페론에 완충용액 및 안정화제가 포함된다.
먼저, 본 발명의 β-인터페론 제에는 유효성분으로서, 유전자 재조합 방법에 의해 제조되며, 분자량이 약 23,000이고 당단백질인 β-인터페론이 포함되는데, 0.8∼3.5×106IU/㎖이 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명에서는 pH의 조절을 위하여 완충용액이 첨가되는데, 농도가 2∼50mM인 아세테이트 완충용액(NaOAc buffer solution)이 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명의 동결 건조된 β-인터페론 제에는 인터페론의 용해도를 향상시키고 안정화시키기 위하여 HSA, 가열 혈장 단백질(plasma protein fraction; 이하, "PPF"라 약칭한다), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrollidone; 이하, "PVP"라 약칭한다) 또는 트윈 20(Tween 20)이 첨가되는데, HSA 0.5∼5 %(중량/부피), PPF 1∼3 %(중량/부피), PVP 1.0∼3.0 %(중량/부피) 및 트윈 20 0.05∼0.1 %(부피/중량)이 사용되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 동결 건조된 β-인터페론 제에는 다른 부형제로서 만니톨(mannitol), 덱스트로오스(dextrose) 또는 글리신(glycine) 중에서 1종 이상이 선택적으로 포함될 수 있는데, 만니톨 0∼5 %(중량/부피), 덱스트로오스 0∼5 %(중량/부피) 및 글리신 0∼2 %(중량/부피)이 사용되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 β-인터페론 제에는 상기 성분에 더하여 염화 나트륨(NaCl) 등의 중성염이 선택적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 β-인터페론 제의 pH는 4∼7인 것이 바람직하며, pH 5.0∼6.0인 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명의 β-인터페론 제는 등장액(isotonic solution)이며, 멸균 상태(sterilized condition)로 제조되는 것이 바람직하다.
본 발명의 β-인터페론 제는 하기의 조성으로 구성된 것이 가장 바람직하다.
즉, 1) β-인터페론 1.0×106IU/㎖에 아세테이트 완충용액(20mM), HSA 0.9 %(중량/부피), 만니톨 2.0 %(중량/부피) 및 덱스트로오스 0.03 %(중량/부피)가 함유된 β-인터페론 제와 2) β-인터페론 3.0×106IU/㎖에 아세테이트 완충용액(20mM), HSA 1.25 %(중량/부피), 글리신 2.0 %(중량/부피) 및 덱스트로오스 1.25 %(중량/부피)가 함유된 β-인터페론 제가 가장 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 β-인터페론 제를 상세히 설명하기로 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
〈실시예 1〉 β-인터페론이 첨가되지 않은 동결 건조된 제제에서 그 성상에 미 치는 부형제 및 안정화제의 비교
동결 건조시 성상이 우수한 β-인터페론 제를 제조하기 위해서, β-인터페론을 첨가하지 않은 상태에서 만니톨, 덱스트로오스, HSA, PPF 및 PVP의 조성과 혼합비율을 각기 다르게 하여 하기 표 1 및 표 2의 조성으로 구성된 제제를 5㎖씩 제조하여 1㎖를 각각의 유리 바이얼(vial)에 충진하였다. 그런 다음 -30℃, 100mTorr의 조건에서 480분 동안 동결시키고, -10℃, 70mTorr의 조건에서 480분 동안 1차 건조시킨 뒤 -5℃, 40mTorr의 조건에서 480분 동안, 그리고 20℃, 20mTorr의 조건에서 480분 동안 재건조시킨 뒤 자동으로 바이얼 마개를 진공밀봉하고 육안으로 고형화된 제제의 성상을 비교하였다.
실시예 1-1 실시예 1-2 실시예 1-3 실시예 1-4 실시예 1-5 실시예 1-6
HSA 5.0 2.5 1.25 - - 2.0
PPF - - - 2.5 - -
PVP - - - - 2.0* 2.0#
만니톨 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 -
텍스트로오스 1.25 1.25 1.25 1.25 1.25 1.25
아세테이트 완충용액(mM) 10 10 10 10 10 10
단위: %(중량/부피)* 분자량: 10,000# 분자량: 40,000
실시예 1-a 실시예 1-b 실시예 1-c 실시예 1-d 실시예 1-e 실시예 1-f
만니톨 1.0 2.0 2.5 5.0 2.5 -
덱스트로오스 - - - - 1.25 2.5
단위: %(중량/부피)
상기 표 1 및 2의 조성으로 제조된 동결 건조된 제제의 성상을 비교한 결과, PPF 또는 PVP가 포함된 제제는 동결 건조시 그 성상이 불량하였다. 만니톨은 1∼5 % 의 범위내에서 사용이 가능하였으며, 성상에 있어서 큰 차이는 없었으나, 첨가되는 덱스트로오스의 양에 따라 성상이 달라졌다. 즉, 0∼1.25 %(중량/부피)의 덱스트로오스가 사용된 제제는 그 성상이 양호하지만 2.5 % 사용된 제제는 동결 건조후 괴상(collapse)이 발생되었다. 또한, PPF 또는 PVP가 포함되지 않은 제제에서는 그 성상이 불량하였다.
〈실시예 2〉 β-인터페론이 첨가되지 않은 동결 건조된 제제에서 그 성상에 미 치는 부형제 및 안정화제의 비교
글리신 2 %, 만니톨 2 %, 만니톨 5 % 및 PPF 2.5 %를 각각 고정하고, 다른 성분들의 조성과 함량을 변화시켜 하기 표 3과 같은 조성의 동결 건조된 제제를 상기 실시예 1과 같은 방법으로 제조하였다.
글리신 2.0 %(중량/부피)를 공통적으로 함유하는 제제
HSA* 덱스트로오스 글리신
실시예 2-1 - - 2.0
실시예 2-2 0.25 - 2.0
실시예 2-3 0.5 - 2.0
실시예 2-4 1.0 - 2.0
실시예 2-5 2.0 - 2.0
실시예 2-6 - 0.5 2.0
실시예 2-7 - 1.0 2.0
실시예 2-8 - 2.0 2.0
실시예 2-9 2.0 0.5 2.0
실시예 2-10 2.0 1.0 2.0
실시예 2-11 2.0 2.0 2.0
실시예 2-12 1.0 0.5 2.0
실시예 2-13 1.0 1.0 2.0
실시예 2-14 1.0 2.0 2.0
실시예 2-15 0.5 0.5 2.0
실시예 2-16 0.5 1.0 2.0
실시예 2-17 0.5 2.0 2.0
실시예 2-18 0.25 0.5 2.0
실시예 2-19 0.25 1.0 2.0
실시예 2-20 0.25 2.0 2.0
단위 : %(중량/부피)* HSA : 인체 혈청 알부민
만니톨 2.0 %(중량/부피)를 공통적으로 함유하는 제제
HSA* 덱스트로오스 만니톨
실시예 2-21 0.25 - 2.0
실시예 2-22 0.5 - 2.0
실시예 2-23 1.0 - 2.0
실시예 2-24 2.0 - 2.0
실시예 2-25 - 0.5 2.0
실시예 2-26 - 1.0 2.0
실시예 2-27 - 2.0 2.0
실시예 2-28 2.0 0.5 2.0
실시예 2-29 2.0 1.0 2.0
실시예 2-30 2.0 2.0 2.0
실시예 2-31 1.0 0.5 2.0
실시예 2-32 1.0 1.0 2.0
실시예 2-33 1.0 2.0 2.0
실시예 2-34 0.5 0.5 2.0
실시예 2-35 0.5 1.0 2.0
실시예 2-36 0.5 2.0 2.0
실시예 2-37 0.25 0.5 2.0
실시예 2-38 0.25 1.0 2.0
실시예 2-39 0.25 2.0 2.0
단위 : %(중량/부피)* HSA : 인체 혈청 알부민
만니톨 5.0 %(중량/부피)를 공통적으로 함유하는 제제
HSA* 덱스트로오스 만니톨
실시예 2-40 0.25 - 5.0
실시예 2-41 0.5 - 5.0
실시예 2-42 1.0 - 5.0
실시예 2-43 2.0 - 5.0
실시예 2-44 - 0.5 5.0
실시예 2-45 - 1.0 5.0
실시예 2-46 - 2.0 5.0
실시예 2-47 2.0 0.5 5.0
실시예 2-48 2.0 1.0 5.0
실시예 2-49 2.0 2.0 5.0
실시예 2-50 1.0 0.5 5.0
실시예 2-51 1.0 1.0 5.0
실시예 2-52 1.0 2.0 5.0
실시예 2-53 0.5 0.5 5.0
실시예 2-54 0.5 1.0 5.0
실시예 2-55 0.5 2.0 5.0
실시예 2-56 0.25 0.5 5.0
실시예 2-57 0.25 1.0 5.0
실시예 2-58 0.25 2.0 5.0
단위 : %(중량/부피)* HSA : 인체 혈청 알부민
PPF 2.5 %(중량/부피)를 공통적으로 함유하는 제제
PPF* 덱스트로오스 만니톨 글리신
실시예 2-59 2.5 0.75 2.0 0.25
실시예 2-60 2.5 0.5 2.0 0.5
실시예 2-61 2.5 2.0 2.0 1.0
실시예 2-62 2.5 - 5.0 2.0
실시예 2-63 2.5 0.5 5.0 -
실시예 2-64 2.5 1.0 5.0 -
실시예 2-65 2.5 2.0 5.0 -
단위 : %(중량/부피)* HSA : 인체 혈청 알부민
상기 표 3의 조성을 갖는 제제의 외형을 육안으로 관찰한 결과, 글리신(2.0%)이 첨가된 제제가 만니톨(2.0%)이 첨가된 제제보다 상대적으로 성상이 불량하였으며, 글리신(2.0%)과 덱스트로오스(2.0%)가 함께 사용된 제제에서는 괴상이 발생되었다. 또한, 2.0%의 만니톨이 첨가된 제제에서는 HSA의 농도가 증가할수록 성상은 양호해지나, 2.0%의 덱스트로오스가 더 첨가된 제제에서는 괴상이 발생되었고, 5.0%의 만니톨이 첨가된 제제에서는 2.0%의 덱스트로오스를더 첨가하여도 괴상이 발생되지 않았다. 즉, 5.0%의 만니톨이 첨가된 제제를 제외하고는 덱스트로오스의 양은 1.0% 이하로 사용되는 것이 바람직한 것을 알 수 있다.
〈실시예 3〉 β-인터페론이 첨가되지 않은 동결 건조된 제제에서 그 성상에 미 치는 부형제 및 안정화제의 비교
1.25% 또는 2.5%의 HSA가 함유된 제제에 글리신, 만니톨 및 덱스트로오스의 함량을 변화시켜 하기 표 4와 같은 동결 건조된 제제를 상기 실시예 1과 같은 방법으로 제조하였다.
HSA* 덱스트로오스 글리신 만니톨
실시예 3-1 1.25 1.25 2.0 -
실시예 3-2 1.25 1.25 - 2.0
실시예 3-3 1.25 1.25 - 5.0
실시예 3-4 1.25 1.25 2.0 0.5
실시예 3-5 1.25 1.25 2.0 1.0
실시예 3-6 2.5 0 2.0 -
실시예 3-7 2.5 1.25 2.0 -
실시예 3-8 2.5 2.5 2.0 -
실시예 3-9 2.5 5.0 2.0 -
실시예 3-10 2.5 0 - 2.0
실시예 3-11 2.5 1.25 - 2.0
실시예 3-12 2.5 2.5 - 2.0
실시예 3-13 2.5 5.0 - 2.0
실시예 3-14 2.5 0 - 5.0
실시예 3-15 2.5 1.25 - 5.0
실시예 3-16 2.5 2.5 - 5.0
실시예 3-17 2.5 5.0 - 5.0
실시예 3-18 2.5 0 2.0 0.5
실시예 3-19 2.5 1.25 2.0 0.5
실시예 3-20 2.5 2.5 2.0 0.5
실시예 3-21 2.5 5.0 2.0 0.5
실시예 3-22 2.5 0 2.0 1.0
실시예 3-23 2.5 1.25 2.0 1.0
실시예 3-24 2.5 2.5 2.0 1.0
실시예 3-25 2.5 5.0 2.0 1.0
실시예 3-26 2.5 5.0 2.0 -
실시예 3-27 2.5 5.0 - 2.0
실시예 3-28 2.5 5.0 - 5.0
* HSA : 인체 혈청 알부민단위: %(중량/부피)
상기 표 4의 조성을 갖는 제제의 외형을 육안으로 관찰한 결과, 1.25%의 HSA가 첨가된 제제에서는 글리신(2.0%)과 덱스트로오스(1.25%)를 함유하는 제제의 성상이 우수하였고, 글리신 대신 만니톨이 첨가되었거나, 글리신과 만니톨이 함께 첨가된 제제에서는 제제의 성상이 불량하였다. 또한, 2.5%의 HSA가 첨가된 제제에서는 글리신(2.0%) 또는 만니톨(2.0∼5.0%)이 첨가된 제제의 성상이 우수하였으며, 덱스트로오스(0∼1.25%)가 더 첨가되었을 경우에는 그 성상이 우수하였으나 이보다 많은 양의 덱스트로오스가 첨가되었을 경우에는 그 성상이 불량하였다.
즉, 동결 건조 제제에서는 HSA가 첨가되는 것이 바람직하며, 여기에 글리신 또는 만니톨이 더 첨가된 제제의 성상이 우수하였으며, 여기에 덱스트로오스가 더 첨가되었을 경우에는 최소량의 덱스트로오스가 사용되는 것이 바람직하다.
〈실시예 4〉 β-인터페론이 함유된 동결 건조된 제제에서의 β-인터페론의 안 정성 비교
HSA, PPF 및 폴리소르베이트 20(polysorbate 20)이 β-인터페론의 안정성에 미치는 영향을 비교하기 위하여 하기 표 5의 조성으로 구성된 β-인터페론 제를 제조하였다.
먼저, 1.0×106IU/㎖ 및 3.0×106IU/㎖의 β-인터페론과 20mM의 아세테이트 완충용액을 사용하고, 1.25%(중량/부피)의 덱스트로오스를 첨가한 뒤 0.2㎛의 메쉬로 여과하여 무균상태로 1㎖씩 바이얼에 충진한 뒤 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하여 β-인터페론 제를 제조하였다. 그런 다음 4, 25 및 35℃에서 제조된 β-인터페론 제를 보관하였을 때의 활성 변화를 통하여 안정성을 확인하였다. (표 6 참조)
한편, 인터페론의 역가는 세포에 대한 항바이러스 활성을 시험하여 결정하였다. 즉, 시험용 세포에 인터페론을 처리한 후 바이러스를 가하여 인터페론이 세포병볍을 억제하는 정도를 결정하는 세포 병변법(cytopathic effect inhibition test)을 사용하여 역가를 측정하였다.
시험용 세포로 인체 양막 세포인 FL (ATCC CCL52)를 사용하고, 시험용 바이러스로 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus; ATCC VR 158)을 사용하였다. 인체 β-인터페론 표준품(미국 NIH Gxb 02-901-535; 6,000 Unit/㎖)으로 보정된 내부 표준품을 역가측정의 적정농도가 되도록 희석하여 상용 표준액으로 사용하였으며, 검액 또한 동일한 조건으로 희석하여 사용하였다. 바이러스 처리 후 세포의 병변 정도를 측정하기 위하여 5% 포르말린을 넣어 고정시킨 세포를 크리스탈 바이올렛(5%)으로 염색하여 마이크로 엘리자 검색기(micro ELISA reader)로 600㎚에서 그 흡광도를 측정하였다.
β-인터페론(106IU/㎖) HSA* PPF# 폴리 소르베이트20 덱스트로오스 아세테이트 완충용액(mM)
실시예 4-1 3.0 4.5 - - 1.25 20
실시예 4-2 3.0 2.5 - - 1.25 20
실시예 4-3 3.0 1.25 - - 1.25 20
실시예 4-4 3.0 0.9 - - 1.25 20
실시예 4-5 3.0 - 1.25 - 1.25 20
실시예 4-6 3.0 1.0 1.0 - 1.25 20
실시예 4-7 3.0 - - 0.08 1.25 20
실시예 4-8 1.0 2.5 - - 1.25 20
실시예 4-9 1.0 1.25 - - 1.25 20
실시예 4-10 1.0 0.9 - - 1.25 20
실시예 4-11 1.0 - 1.25 - 1.25 20
실시예 4-12 1.0 - - - 1.25 20
실시예 4-13 4.4 - - - - -
단위 : % (중량/부피)* HSA: 인체 혈청 알부민# PPF: 가열 혈장 단백질
4℃에서 보존하였을 경우
0주 역가(106IU/㎖) 6주 역가(106IU/㎖) 6주 (초기 역가대비%)
실시예 4-1 5.02 2.60 51.8
실시예 4-2 3.55 3.31 93.2
실시예 4-3 2.80 1.85 66.1
실시예 4-4 3.23 2.68 83.0
실시예 4-5 3.93 3.57 90.8
실시예 4-6 4.33 3.23 74.6
실시예 4-7 4.21 1.71 40.6
실시예 4-8 1.07 1.15 107
실시예 4-9 1.26 1.59 126
실시예 4-10 0.79 0.85 107
실시예 4-11 1.41
실시예 4-12 1.12 0.89 79.5
실시예 4-13 4.03 2.25 55.8
25℃에서 보존하였을 경우
0주역가 (106IU/㎖) 2주 역가 (106IU/㎖)[초기 역가대비%] 4주 역가 (106IU/㎖) [초기 역가대비%] 10주 역가 (106IU/㎖) [초기 역가대비%]
실시예 4-1 5.02 2.14 [42.6%] 3.37 [67.1%] 2.67 [53.2%]
실시예 4-2 3.55 2.13[60%] 2.30 [64.8%] 2.27 [63.9%]
실시예 4-3 2.80 1.26 [45.0%] 1.10 [39.3%] 0.90 [32.1%]
실시예 4-4 3.23 0.92 [28.5%] 0.93 [28.8%] 0.59 [18.3%]
실시예 4-5 3.93 2.59 [65.9%] 2.44 [62.1%] 1.14 [29.0%]
실시예 4-6 4.33 3.02 [69.7%] 2.29 [52.9%] 0.99 [22.9%]
실시예 4-7 4.21 0.16 [3.8%] - -
실시예 4-8 1.07 0.52 [48.6%] 1.33 [124.3%] 0.50 [46.7%]
실시예 4-9 1.26 0.40 [31.7%] 0.74 [58.7%] 0.34 [27.0%]
실시예 4-10 0.79 0.17 [21.5%] 0.46 [58.2%] 0.27 [34.2%]
실시예 4-11 1.41 0.13 [9.2%] 0.02 [1.4%] 0.05 [3.5%]
실시예 4-12 1.12 0.09 [8.0%] 0.02 [1.8%] 0.015 [1.3%]
실시예 4-13 4.03 0.30 [7.4%] - 0.43 [10.7%]
37℃에서 보존하였을 경우
0주역가 (106IU/㎖) 2주 역가 (106IU/㎖) 6주 (초기 역가대비%)
실시예 4-1 5.02 0.74 14.7
실시예 4-2 3.55 0.74 20.8
실시예 4-3 2.80 0.40 14.3
실시예 4-4 3.23 0.37 11.5
실시예 4-5 3.93 0.41 10.4
실시예 4-6 4.33 0.54 12.5
실시예 4-7 4.21 0.02 0.5
실시예 4-8 1.07 0.92 86.0
실시예 4-9 1.26 0.37 29.4
실시예 4-10 0.79 0.11 13.9
실시예 4-11 1.41 0.008 0.6
실시예 4-12 1.12 - -
실시예 4-13 4.03 0.22 5.5
상기 표 5의 조성을 갖는 제제의 외형을 육안으로 관찰한 결과, 비이온성 계면활성제인 폴리소르베이트 20이 함유된 제제에서는 β-인터페론의 활성이 가장 빨리 소실되어 제제의 안정성이 불량한 것으로 판명되었다. 또한, 3.0×106IU/㎖의 β-인터페론이 함유된 제제에서는 HSA와 PPF의 안정화 기여도를 비교하였을 때(실시예 4-3, 4-5), HSA와 PPF의 효과가 서로 비슷하였으나, 1.0×106IU/㎖의 β-인터페론이 함유된 제제에서는 HSA와 PPF의 안정화 기여도를 비교하였을 때(실시예 4-9, 4-11), HSA의 효과가 더 우수한 것으로 나타났다.
〈실시예 5〉 동결 건조된 β-인터페론 제에서의 β-인터페론의 성상 및 안정성 비교
안정화제로 HSA 또는 PPF, 다른 부형제로 만니톨, 글리신 또는 덱스트로오스를 사용하여 하기 표 7의 조성으로 구성된 β-인터페론 제를 제조하였다. 이때 공통적으로 20mM의 아세테이트 완충용액을 첨가하여 β-인터페론 제의 pH를 5∼6이 되도록 조절하였다. 또한, 제제내에 포함되는 β-인터페론의 양은 1.0×106IU/㎖ 및 3.0×106IU/㎖이 되도록 하였는데, 실제로는 약 10%를 더 포함하여 1.1×106IU/㎖ 및 3.3×106IU/㎖이 되게 하였다. 각 제제마다 50㎖씩을 제조하여 0.2㎛ 필터로 여과한 뒤 여과액을 무균상태로 바이얼에 1㎖씩 충진한 뒤 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 동결건조시킨 뒤 β-인터페론 제의 성상을 육안으로 확인하였고, 칼핏셔 방법으로 함습도를 측정하였다. 또한, 각각의 제제에 1㎖의 증류수를 가하여 재용해시켜 그때의 용해도 및 pH를 측정하여 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다,
β-인터페론의 실제 함유량 : 1.1×106IU/㎖
β-인터페론(106IU/㎖) HSA* PPF# 만니톨 글리신 덱스트로오스 아세테이트 완충용액(mM)
실시예 5-1 1.0 0.9 - - 2.0 0.5 20
실시예 5-2 1.0 0.9 - 2.0 - 0.03 20
실시예 5-3 1.0 0.9 - 5.0 - 0.03 20
실시예 5-4 1.0 1.25 - - 2.0 1.25 20
실시예 5-5 1.0 2.5 - 2.0 - 0.088 20
실시예 5-6 1.0 2.5 - 5.0 - 0.088 20
실시예 5-7 1.0 - 1.25 - 2.0 1.25 20
* HSA : 인체 혈청 알부민# PPF : 가열 혈장 단백질단위: %(중량/부피)
β-인터페론의 실제 함유량 : 3.3×106IU/㎖
β-인터페론(106IU/㎖) HSA* PPF# 만니톨 글리신 덱스트로오스 아세테이트 완충용액(mM)
실시예 5-8 3.0 1.25 - - 2.0 1.25 20
실시예 5-9 3.0 2.5 - 2.0 - 0.088 20
실시예 5-10 3.0 2.5 - 5.0 - 0.088 20
실시예 5-11 3.0 2.5 - 0.5 2.0 0.088 20
실시예 5-12 3.0 5.0 - 2.0 - 0.175 20
실시예 5-13 3.0 5.0 - - 2.0 2.0 20
실시예 5-14 3.0 - 1.25 - 2.0 - 20
실시예 5-15 3.0 - 2.0 - 0.75 20
실시예 5-16 3.0 - - 2.0 0.75 20
* HSA : 인체 혈청 알부민# PPF : 가열 혈장 단백질단위: %(중량/부피)
성상 함습도(%) pH 재용해도
실시예 5-1 양호 1.55 6.0 우수
실시예 5-2 우수 1.34 5.8 우수
실시예 5-3 우수 0.92 5.8 보통
실시예 5-4 양호 1.53 5.9 양호
실시예 5-5 보통 1.99 5.4 양호
실시예 5-6 보통 1.01 5.4 불량
실시예 5-7 양호 1.52 5.8 우수
성상 함습도(%) pH 재용해도
실시예 5-8 우수 2.18 5.9 우수
실시예 5-9 보통 1.46 5.4 우수
실시예 5-10 보통 0.80 5.4 보통
실시예 5-11 보통 1.68 5.7 양호
실시예 5-12 불량 1.82 5.5 불량
실시예 5-13 불량 0.79 5.6 양호
실시예 5-14 양호 1.44 5.5 양호
실시예 5-15 보통 1.76 5.5 양호
실시예 5-16 보통 0.95 5.5 보통
한편, 상기 β-인터페론 제를 4℃에서 15개월 동안 보존하였을 때의 활성변화와 30℃에서 가속 조건으로 16주 동안 보존하였을때의 활성변화를 관찰하여 안정성을 판단하였으며, 그 결과를 하기 표 9에 나타내었으며, 이를 도 1 및 도 2 에 나타내었다.
4℃에서 장기간 보존하였을 경우
6 개월 12 개월 15 개월
실시예 5-1 118 99 87
실시예 5-2 131 75 97
실시예 5-3 110 88 95
실시예 5-4 98 84 97
실시예 5-5 108 74 109
실시예 5-6 97 64 86
실시예 5-7 83 89 75
실시예 5-8 69 78
실시예 5-9 105 73 90
실시예 5-10 94 58 72
실시예 5-11 52 63 46
실시예 5-12 78 47 52
실시예 5-13 63 32 47
실시예 5-14 64 48 50
실시예 5-15 120 62 88
실시예 5-16 94 58 72
단위: 초기역가 대비 %
30℃에서 가속조건으로 16 주 동안 보존하였을 경우
2 주 4 주 12 주 14 주 16 주
실시예 5-1 84 93 67 67 25
실시예 5-2 104 86 129 88 106
실시예 5-3 107 91 141 82 118
실시예 5-4 125 83 67 66 54
실시예 5-5 97 68 79 87 133
실시예 5-6 92 72 71 105 121
실시예 5-7 129 112 100 123 58
실시예 5-8 101 95 85 51 47
실시예 5-9 111 113 110 58 79
실시예 5-10 93 106 101 57 61
실시예 5-11 108 144 52 50 41
실시예 5-12 80 91 102 50 40
실시예 5-13 85 76 87 49 35
실시예 5-14 114 128 69 20 31
실시예 5-15 170 128 52
실시예 5-16 133 168 54
단위: 초기역가 대비 %
상기 표 8 및 9에서 볼 수 있듯이, β-인터페론(1.0×106IU/㎖)에 0.9 %(중량/부피)의 HSA, 0.03 %(중량/부피)의 덱스트로오스 및 2.0 %(중량/부피)의 만니톨이 첨가된 β-인터페론 제에서 성상, 재용해도, 함습도 및 안정성이 우수한 것으로 나타났다. 그리고, 3.0×106IU/㎖의 β-인터페론에 1.25 %(중량/부피)의 HSA, 1.25 %(중량/부피)의 덱스트로오스 및 2.0 %(중량/부피)의 글리신이 첨가된 β-인터페론 제에서 성상, 재용해도, 함습도 및 안정성이 우수한 것으로 나타났다. 또한, 글리신 대신 만니톨 또는 만니톨 대신 글리신이 각각 대체되어 사용될 수 있었으며, 대체적으로 성상이 우수한 제제가 안정성도 우수하였다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 제제는 제제의 안정성이 유지되며, 성상이 우수하고, 지질 친화성 단백질의 용해도 등이 우수한 β-인터페론 제로서, β-인터페론 이외에 다른 지질 친화성 단백질에도 적용할 수 있는 우수한 제제이다.

Claims (8)

1) 인터페론, 2) 완충용액, 3) 인체 혈청 알부민(HSA), 4) 만니톨(mannitol) 또는 글리신(glycine), 5) 선택적으로 덱스트로오스(dextrose), 6) 선택적으로 중성염으로 구성되는 인터페론 제
제 1항에 있어서, 인터페론은 β-인터페론(β-interferon)인 것을 특징으로 하는 인터페론 제
제 1항에 있어서, 완충용액은 농도가 2∼50mM인 아세트산 완충용액(NaOAc buffer solution)을 사용하는 것을 특징으로 하는 인터페론 제
제 1항에 있어서, 인체 혈청 알부민(HSA)이 0.5∼5 %(중량/부피) 첨가되는 것을 특징으로 하는 인터페론 제
제 1항에 있어서, 글리신 또는 만니톨이 0∼5 %(중량/부피) 첨가되는 것을 특징으로 하는 인터페론 제
제 1항에 있어서, 덱스트로오스가 0∼5 %(중량/부피) 첨가되는 것을 특징으로 하는 인터페론 제
제 1항에 있어서, 1.0×106IU/㎖의 β-인터페론에 아세테이트 완충용액(20mM), 0.9 %(중량/부피)의 HSA, 2.0 %(중량/부피)의 만니톨 및 0.03 %(중량/부피)의 덱스트로오스가 함유되는 것을 특징으로 하는 인터페론 제
제 1항에 있어서, 3.0×106IU/㎖의 β-인터페론에 아세테이트 완충용액(20mM), 1.25 %(중량/부피)의 HSA, 2.0 %(중량/부피)의 글리신 및 1.25 %(중량/부피)의 덱스트로오스가 함유되는 것을 특징으로 하는 인터페론 제
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