KR100217186B1

KR100217186B1 - 효소와 빛에 의해 활성화되는 약물수송을 위한 약물수송 시스템

Info

Publication number: KR100217186B1
Application number: KR1019940702485A
Authority: KR
Inventors: 진드리히 코펙크; 낸시 크리니크
Original assignee: 톰 메이져; 유니버시티 오브 유타
Priority date: 1992-01-21
Filing date: 1993-01-21
Publication date: 1999-09-01
Also published as: AU3593093A; FI943430A0; DE69326322T2; ATE184201T1; US5258453A; AU663167B2; FI943430A; WO1993014142A1; DK0621880T3; EP0621880A1; JPH08500327A; HU9402142D0; EP0621880B1; HUT68082A; CA2128330A1; DE69326322D1; RU94038047A; PL172184B1; EP0621880A4

Abstract

공중합물 운반체에 부착된 항암제와 광활성 양묵을 모두 포함하는 온혈동물의 암조직 치료용 조성물에 있어서 (a)항암제와 광활성 양물이 포함된 공중합물 운반체, (b)항암제 부착된 하나의 공중합물 운반체와 광활성 약물이 부착된 또다른 하나의 공중합물로된 공중합물 운반체 혼합물 그리고, (c)(a)와 (b)의 복합경우에서 선택된 것으로 구성된다. 항암제는 곁사슬에 의해 중합물 운반체에 부착되고 이는 온혈동물의 혈류내에서 안정되나 세포내 라이소좀 효소에 의해 가수분해될 수 있으며, 광활성 약물도 동일한 분해성 곁사슬 또는 비분해성 부착에 의해 부착된다. 중합물 운반체는 선택적으로 표적물질을 가진다. 세포흡수에 의해 표적암세포에 중합성 거대분자의 주입시 일반약물에 의한 부작용을 감소시킬 수 있다. 항암제가 효과를 나타내기 위해 암조직에서 선택적인 공중합물의 흡수를 위해 주입에 시간적 지체를 허용한다. 적정 파장과 에너지의 광소스는 광활성 약물을 활성화시킨다. 항암제와 광활성 약물의 복합효과는 감소된 양과 부작용의 감소로 세포파괴를 다 잘할 수 있다.

Description

[발명의 명칭]

효소의 빛에 의해 활성화되는 약물수송을 위한 약물수송시스템

[발명의 상세한 설명]

[발명의 분야]

본 발명은 치료요법적 효과가 증가된 중합성 약물을 이용하여 신조직 형성질환의 치료에 관계한다. 이 약물은 두개 이상의 상이한 약물의 중합성 물질로 이중 하나는 광활성이 있다. 감광성(광활성 약물)을 포함하는 조성물과 항-선조직 형성약물을 포함하는 조성물의 복합은 항신조직 형성 약물을 동일 중합체에 부착시키는 것이다. 이와같은 복합은 신-조직형성 질환의 치료에 유용하다. 중합물에는 적절한 표적부분을 포함할 수 있다. 감광성 약물은 비분해성 또는 효소적으로 분해가능한 결합에 의해 중합체 운반체에 결합된다. 항-신조직 형성 약물은 혈류에서 결합을 통하여 안정하게 중합수용체에 결합되나 라이소조말 효소에 의해 분해되기 쉽다. 제조된 경우, 이를 약물의 체내분포가 일반적으로 동일하기 때문에 두약물은 거의 동시에 동일세포로 들어간다. 이것은 각 약물의 체내분포가 상이한 경우에 두개 저분자량 약물의 요법은 복합시킨 경우와 비교하면 근본적으로 상이하다. 또한 세포의 라이소좀 부분에 도달한뒤에는 효소에 의해 결합된 약물이 효소작용으로 운반체에서 해리되어 라이소좀막을 통하여 혈장으로 확산된다. 감광성 약물은 세포에서 비활성 인채로 남게 된다. 적절한 파장으로 제공된 경우에만(광소스로는 레이져, 또는 화학적 발광작용 또는 다른 적절한 원이 사용될 수 있다)활성화 된다. 이와 같은 방법의 주요장점중에 하나는 두 약물의 작용을 적정화시킨 것이다. 라이소조말 효소절단에 의한 제1항암제(아드리아마이신)의 유리속도는 곁사슬 구조 가령 올리고펩티드 서열에 의해 조절될 수 있다(P. Rejmanova et al., Makromol. Chem., 184, 2009(1983). 적정시간이 경과한뒤에 빛을 공급한 경우 감광성 약물의 활성이 일어나게 된다. 이것은 제1항암제에 의해 파괴되지 않는 세포의 죽음을 유도한다.

본 발명은 화학적 치료요법에 저항성이 있는 암세포수를 최소화하여, 종양재발의 자능성을 감소시킨다. 이것은 현재 이용되는 치료요법보다 다중약물 저항세포(MDR)의 성공적인 치료에 크게 효과가 있다. 이 방법을 사용하는 경우에 세포에서 약물의 농도는 약물이 세포내부 또는 MDR 세포로 이동이 손상되는 경우에도 증가하게 된다. 적절한 표적물을 부착시키는 경우에(세포 표면 항원 또는 수용기에 상응하는 구조)복합된 세포내와 세포의 작용이 증가하고(세포내작용은 전술한 기작에 의해 진행되고, 세포와 자용은 혈장막에서 있다)중합성 약물은 MDR세포의 세포면(수용체/항원)에 결합하고 중화되지 않는다. 자극후에 감광성 약물은 이중 산소를 발생시켜 세포막을 손상시키고, 중국에서는 세포를 죽게한다.

[발경의 배경]

화학적 치료요법에 사용되는 저분자량 약물의 대부분은 세포막을 통해 무작위 확산에 의해 모든 종류의 세포에 신속히 들어간다. 이와 같은 선택성의 부족으로 소요의 표적조직에 이들의 이용성이 감소되며 때때로 바람직하지 못한 부작용이 일어난다. 세포의 흡수가 신속하여 치료요법적 효과가 상당기간 지속되지 않는다. 또한 혈류에서 사구체여과로 신속히 약물이 사라진다.

가용성 중합체 운반체에 저분자량 생체활성분자의 공유결합은 단순한 확산에 의해 세포흡수와 사구체 여파를 예방한다. 흡수는 세포흡수와 같은 공지의 기질 선택성 기작에 의해 세포에서 일어나며, 거대분자는 세포의 특수부분에 의해 일어나며 이는 포획된 물질을 포함하는 세포내소포형으로 내측으로 제공된다.

흡수기작의 상이성이 치료효과를 요구하는 세포에 특이적으로 약물을 공급하는 방법에 영향을 준다.

중합체 결합된 또는 유리약물의 운영이 상이하게 된는 것이다. 확산에 의해 들어간 소분자는 세포의 모든 부분에 통로를 찾는 경향이 있으나 거대분자는 세포흡수에 의해 세포내 소포에 의해 세포의 라이소좀 구획으로 이동되고, 여기에서 가수분해성 효소를 이용할 수 있다.

라이좀성 가수분해되기 쉬운 약물-운반체 연결된 중합성 약물의 세포흡수는 표적세포의 세포질내에 이들의 존재를 유도하는 생활성 분자의 세포내 유리를 조절하는 기작에 영향을 준다. 이와 같은 약물 시스템과 연관된 이론적인 고찰이 최근에 검증되었다(J.Kopocek enitied Synthesis of Tailor-made Soluble Polymeric Carriersin Recent Advances in Drug Delivery Systems(Plenum Press, 1984).

이와같은 시스템을 고안하기 위해, 두가지 기준이 만족되어야 한다. 첫째, 약물-운반체 연결은 조절된 라이좀 가수분해에 의해 이루어지도록 되어야하나 혈류에서 효소의 작용을 이겨낼 수 있어야 한다. 둘째, 약물 수송시스템은 치료효과가 필요한 소요의 표적세포에 특이적으로 흡수되어야 하고 동시에 다른 세포에 의한 흡수를 최소화시켜야 한다.

기본적으로 세포흡수에는 세가지 유형이 있다. 유체상태, 흡착과 수용체-매개 등이 있다. 유체상 세포흡수는 가용성 대식 세포와 용매가 액체상으로 세포에 들어가는 가장 일반적인 형이 된다. 대부분의 유핵세포는 세포의 공간으로부터 물질을 내화시키기 위한 유체상 세포흡수를 이용한다. 세포는 혈장막의 일부를 섭취하는 연속성이 있기 때문에 본질적 공정이 된다.

흡착 세포흡수는 상대적으로 무분별한 공정이 된다. 그러나, 이 경우 거대세포는 세포막의 일부에 물리적으로 흡착(비특이적)되고, 그 다음은 세포에 의해 함입공정에 의해 일어난다.

수용체 매개형 세포흡수는 가장 특이적인 세포흡수형으로 세포 표면 수용체에 상응하는 거대분자는 이 수용체에 결합되어 세포 내부로 들어간다. 이 경우에, 호르몬, 수송단백질, 분해에 대해 변형된 단백질, 성장인자, 항체등의 거대분자가 세포외액으로부터 세포에 의해 취하여진다. 수용체-매개형 세포흡수의 장점은 다른 기작보다 특정세포에서 높은 농도의 리간드가 내화된다는 것이다.

형식에 관계없이, 세포흡수에 의해 일단 내화된 경우에, 용질의 궁극적인 운명은 제2차 라디소좀에 의해 이동되고, 분해되어 다양한 경로에 의해 세포에 분산된다. 액체상 세포흡수 공정 동안에, 세포표면 표석의 무분별한 흡수가 있어 세포는 세포막뒤에 필수적인 지질과 단백질을 회수할 수 있는 기작을 갖추어야 한다.

세포흡수의 과정은 거대세포의 선택성 정도에 영향을 주는데, 선택성은 분자량을 다양하게 하여 조절할 수 있는데 선태성을 높이는 것은 특정표적물을 거대세포내에 결합시켜 얻을 수 있다.

세포는 특정 수용체를 가지고 이들 세포표면의 항원은 특정 결정인자로 공지된 특정형의 분자를 인지하고 상호 작용한다. 높은 세포 선택성은 치료효과를 요하는 소요의 세포에 의해 인지될 수 있는 결정인자를 중합 약물에 결합시켜 얻을 수 있다.

따라서, 특정 표적에 의해 세포내 약물 유리가 되는 약물 수송 시스템은 하기와 같은 특징을 요한다.

(a) 비활성 중합성 운반체: 체내에서 중합체를 제거하이 위해 라이좀성 가수분해에 용이해야 하며,

(b)세포의 가수분해에 저항성이 있는 분해가능성 약물-운반체 연결, 단 제어된 라이좀성 가수분해가 되고, 그리고

(c)원하는 경우 선택적인 표적물.

자연성 거대세포는 운반체로 사용되어 왔으나, 합성중합물의 분자량이 많은 자연성 거대분자와는 달리 선택적인 세포 선택성으로 조절될 수는 있으나 이는 이뮤노겐성이 아니다.

N-(2-하디드록시프로필)메타아크릴아미드(HPMA)에 기초한 합성중합물이 잠재적인 약물운반체로 제공되어 왔다(미국특허 4,062,831과 4,097.470). 이와 같은 중합물질은 수용성액에 가용성이고 생체 적응성이 우수하다. 또한 N-메타아크릴 올리고펩티드의 p-니트로페닐에스테르의 결합에 의해 1가 아미노기를 포함하는 많은 약물에 결합될 수 있다. 중합체 사슬에는 적절한 분자량을 제공하고, 생체분해성 교차연결을 이용하여 체내에서 제거를 실행할 수 있도록 중합체를 분해하는 수단을 제공하기 위해 겔점이하에 수준으로 교차-결합될 수 있다.

라이좀성 효소는 펩티드 결합을 가수분해할 수 있는 다수의 단백질 분해효소를 포함하고 있기 때문에 아미드 결합에 의해 중합체 사슬에 생체활성분자의 직접적인 연결된 결합을 가수분해할 수 있다. 사실, 이와 같은 경우는 발견되지 않았으나 약물과 운반체 사이에 스페이스펩티드는 다양한 속도범위내에 라이소좀 효소에 의해 분해를 겪는 것으로 나타났다. 실제로 절단되는 결합은 약물과 인접한 아미노산 사이가 된다. 가수분해속도, 즉 약물의 유리속도는 펩티드 스페이스에 있는 아미노산의 수와 그 특징에 따라 달라진다. 2개 이하의 아미노산으로 구성된 스페이스는 일반적으로 라이소좀 가수분해되지 않는다. 라이소좀에 공지된 티을-단백질분해효소의 공지된 특이적 기질에 일치되는 스페이스는 특히 효과적으로 분해될 수 있다.

갈라토스로 종료되는 올리고사카라이드 곁사슬을 주는 당단백질의 변형은 간의 실질세포내에 당 단백질의 침착이 급격히 증가하게 된다. 갈락토스 부분은 간세포의 혈장막에 있는 수용체와 상호작용하는 특이적 결정인자로 작용한다. 이는 특히 치료하기가 어려운 암인 간암에 표적약물의 공급기작을 제공한다. 또는 아미드 결합에 의한 HPMA공중합체에 결합된 갈락토사민은 유사한 결과를 나타내는데, 간세포막에 있는 수용체는 글리코사이드에 있는 갈락토즈와 N-아실갈락토사민에 있는 갈락토즈로 인지한다. 다른 다수의 인지시스템이 공지되어 있는데, 쿠퍼세포의 N-이세틸 글루코사민/만노스 인지 시스템과 대식세포와 섬유아세포의 포스포헥소스 인지시스템 등이 된다.

또다른 가능한 표적기작은 적절한 항원 수용체를 가지는 세포에 의해 특이적으로 인지되는 항체에 중합성 약물을 결합시키는 것이다. 약물분자는 이뮤노글로블린에 직접적으로 결합되는데 이는 약물활성의 손상, 항체활성의 손상 그리고 결합의 가용성 등을 유도하게 된다.

또한, 표적시스템은 호르몬 또는 단백질을 포함하는데 가령 트란스페린과 멜라노사이트 자극 호르몬 등이 되며, 이는 표적 세포형에 특이적으로 결합할 수 있다.

가수분해가능한 펩티드 스테이스와 표적 중합성 약물의 합성은 기존기술로 참고하며(Kopecek, supra), 제어된 방식으로 소요속도로 약물을 유리시킬 수 있는 펩티드 스페이스의 인지와 소요의 세포 수용체에 훌륭한 표적이 되는 연결기/결정인자 복합의 확인은 지속적인 연구대상이 된다.

초기에 언급한 바와 같이, 펩티드 스페이스의 라이소좀 가수분해 속도는 아미노산 잔기의 수와 그 특징에 따라 달라진다. 이것은 공간적 그리고 구조적 인자를 반영하는 것이다. 2내지 4개 아미노산 잔기를 가지는 스페이스의 단부 가수분해 속도는 일반적으로 잔기수에 따라 달라지고, 중합체 사슬과 효소사이의 공간적 상호작용에 영향을 받는다.

주어진 길이의 펩티드에서, 가수분해 속도는 아미노산 잔기의 특징(그리고 서열)에 따라 달라진다. 이와 같은 경향은 펩티드 스페이서의 절단시키는 라이소좀 효소의 기질 특이적 특징으로부터 유래된다. 기질과 상호작용이 일어나는 효소부위는 효소의 활성부위로 공지되어 있다. 활성부위는 반응을 촉진시키면서, 가령 절단에 의해, 기질에 결합되는 이중역할을 실행한다. 펩티드와 단백질분해성 효소의 복합 구조연구에서 효소의 활성부위는 펩티드내에서 상대적으로 크고 몇개의 아미노산 잔기가 결합되어 있다.

따라서, 펩티드 사슬에 특정결합의 분해는 절단된 결합부근 구조의 특징과 절단된 결합에서 상대적으로 떨어져 있는 아미노산 잔기의 특징에도 영향을 받지만, 가수분해동안에 효소를 보지하는 위치가 중요하다. 라이소좀 효소의 활성부위의 자세한 구조는 결정되지 않았으며 이는 중합성 약물의 사용시 적정속도에서 라이소좀 가수분해를 하는 펩티드 스페이스의 준비에 강애요인이 된다.

[공지기술의 설명]

1991년 8월 6일자 특허된 미국특허 5,037,883는 생체활성 분자에 펩티드 결합에 의한 비활성 중합성 운반체와 연결된 약물에 대해 상술한다. 결합체에는 항체, 모노사카라이드, 디사카라이드, 또는 단백질과 같은 표적기작이 포함된다. 이 특허에서는 항암제(가령, 아미드리이마이신, 도우노마이신, 멜프알린)에 종료되는 올리고펩티드 서열을 가지는 N-(2-하이드록시프로필)메타아크릴아미드의 공중합물이 표적부분(가령, 갈락토사민, 푸코실아민, 안티-티 1.2항체, 항-1a항체)에 결합된 공중합물이 중합물을 포함하지 않은 저분자량 약물과 비교할때 높은 치료효과를 가지는 것으로 나타났다. 특히 약물로는 아드리아마이신(Gly-Phe-Leu-Gly 서열)을 포함하는 결합체와 표적물로는 갈락토사민이 상술되어 있다. 이 특허는 하나의 생체활성물질과 표적물질을 포함하는 중합체 범위에 한정된다.

J. D. Spikes, The Science of Photobiology, 2nd Edition, K. C. Smith, ed., Plenum Press, NY, 1988, pp79-100에서는 높은 반응성이 있는 단일 산소의 형성을 유도하는 특정 파장의 광에 의해 활성화되는 감광성 물질에 대해 상술하고 있다. 감광된 반응기작은 암치료요법에 이용되어 왔다. 광역학적 치료법(PDT)는 암세포파괴에 있어서 광과 감광성 물질의 복합이용을 말한다. 이와 같은 형태의 치료법을 이용하는 장점은 빛에 의해 활성화 될때까지 감광성 물질이 비활성을 유지한다는 것이다. 광감성물질, 해마토포르피린 유도체(HPD), 포르피린, 이 종양조직에 있기 때문에 광범위하게 연구되어 왔다(J. Moan, Photochem. photobiol., 43, 681(1986)). 그러나, 정상세포에서 비특이적인 흡수의 가능성도 가진다. 환자가 30일간 매일 감광받는 경우 한외감광성을 가지는 문제점이 남아 있게 된다(T. J. Dougherty, J. Invest. Derm., 77, 122(1981)). 그러므로, 단클론 항체로 광감물질을 표적하는 것이 된다. DDBA/2J 마이오사르코마 M-1 세포에 대해 단클론 항체에 HPD를 결합시킴으로써 설명할 수 있다(D. Mew et al., J.Immuno1.,130, 1473(1983)). 그러나 많은 감광성물질은 결합시에 항체의 가용성을 변화시키고(R. Arnon et al., Cancer Surv., 1, 429(1982)항체의 활성을 감소시키는 매우 소수성이 큰 물질이다(B. Rihova et al., Makromol. Chem. Suppl., 9, 13(1985)). 수용성 중합성 운반체(덱스트란)은 단클론 항-T 세포(항-Leu-1) 항체에 결합하여 감광성 물질이(chiorine6)시험관내에 HPB-ALL 사람 T 임파세포를 표적시킨다(A. Oseroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 8744(1986)). 감광성 물질은 중합체에 부착되어 다양한 세포의 파괴를 위한 약물치료에 이용될 수 있다(J. Kpoecek et al., Journal of Controlled Release, 16, 137-144(1991); N.L. Krinick et al., SPIE Advances in Photochemotherapy, 997, 70-83(1988); and N.L. Krinick et al., Makromol. Chem., 191, 839-856(1990).

참고문헌에는 본 발명에서 사용하는 항암제와 중합성 운반체에 부착된 감광성 물질의 북합물의 동시 주입에 대해서는 언급되지 않았다.

[발명의 목적과 요약]

본 발명의 목적은 화학적 치료요법제와 효소에 의해 분해가능한 결합을 통하여 부착된 감광성 물질을 포함하는 가용성 생체활성 공중합물을 제공한다.

본 발명의 목적은 화학적 치료요법제와 효소에 의해 분해가능한 결합을 통하여 부착된 감광성 물질을 포함하는 가용성 생체 활성공중합물을 제공한다.

또한 본 발명의 목적은 비분해성 또는 효소 분해가능성 결합에 의해 부착된 감광성물질과 분해가능한 결합에 의해 부착된 화학적 치료요법제와 감광성 물을 포함하는 가용성 생체활성 공중합물의 주입에 의한 치료방법을 제공한다.

본 발명의 목적은 복합 공중합물(하나는 화학적 치료요법제를 포함하고, 나머지 하나는 감광성 물질을 포함하는데 각 공중합물은 동일한 표적을 가지는)의 주입에 의해 신조직 형성질환의 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적은 비분해성 또는 효소적으로 분해가능한 결합에 의해 부착된 감광성물질분자와 분해가능한 결합에 의해 부착된 화학적 치료요법제를 포함하는 공중합물의 주입에 의한 신조직 형성질환의 치료방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적은 암세포의 종양표적에 특이적인 타겟이 효소적으로 분해가능한 결합에 의해 부착된 화학적 요법제와 감광성 물질을 포함하는 가용성 생체활성 공중합물을 제공한다.

또다른 목적은 암세포의 종양에 특이적인 표면이 분해가능한 결합에 의해 부착된 화학적 요법제와 또는 비분해성 또는 효소적으로 분해가능한 결합에 의해 부착된 감광성 물질을 포함하는 가용성 생활성 공중합물을 제공한다.

또다른 목적은 암세포의 종양에 특이적인 표적이 분해가능한 결합에 의해 부착된 화학적 요법제와 또는 비분해성 또는 효소적으로 분해가능한 결합에 의해 부착된 감광성 물질을 포함하는 가용성 생활성 공중합물을 제공에 의해 신조직 형성 질병의 치료방법을 제공한다.

또다른 목적은 암세포의 종양에 특이적인 표적이 분해가능한 결합에 의해 부착된 화학적 요법제와 또는 비분해성 또는 효소적으로 분해가능한 결합에 의해 부착된 감광성 물질을 포함하는 가용성 생활성 공중합물을 제공하여 신조직 형성 질환의 치료방법을 제공한다.

이와 같은 목적은 종양의 치료를 위해 화학적 업제와 감광성 물질을 포함하는 복합공중합물의 주입에 의해 얻을 수 있다. 하나는 화학적 요법제를 포함하고, 나머지 하나는 감광성 물질을 포함하는 두개의 별도 공중합물을 동시에 주입하는 경우에 신조직 형성 질환의 치료에 있어 별도로 주입하는 것보다 우수한 결과를 나타낸다. 또한 화학적 요법제와 감광성 물질을 포함하는 하나의 공중합물은 공중합물의 혼합물 대신에 이용한다. 이와 같은 공중합물의 특이성은 각 공중합물 분자에 표적물질을 부착시켜 개선시킬 수 있다. 그러나, 항암제와 감광성물질을 포함하는 공중합물 운반체의 이용은 표적물질의 결합없이 유리약물보다는 종양에 중합체 결합된 약물의 양이 증가하게 된다.

이와 같은 중합체 거대분자는 세포흡수에 의해 표적세포에 들어간다, 공중합물에 저분자량 약물의 결합은 자유로운 약물에 의해 생기는 부작용을 경감시킬 수도 있는 확산에서 세포흡수로 방식을 변경시킨다. 이와 같은 이유에서 복합 공중합물에 부착되는 경우에 두약물의 양이 훨씬 적게 사용될 수도 있다. 각각 별도의 공중합물을 사용하는 경우에, 하나는 감광성 물질을 포함하고, 다른 하나는 항암제를 포함하거나 항암제와 감광성 물질 모두를 포함하는 공중합물이 소량으로 이용되는 경우에 항암제 또는 감광물질만을 포함하는 단일 공중합물의 사용에 의한 신-조직 형성 질환의 치료보다 우세하다. 또한, 두 개의 약물이 공조성 항암효과를 가지는 경우에 더 적은양을 사용할 수도 있다. 암세포에 종양표식에특이적인 표적물은 복합 공중합물의 곁사슬에 결합되는 경우에 표적 암세포에 특이적인 두약물을 포함하는 공중합물의 주입을 강화하거나 또는 실행될 수 있다.

주입후에 효과가 개선되기 위한 항암제에서 주변 정상조직 주변과 비교하여 종양조직에 공중합물의 적절한 흡수를 허용하는 시간지체가 허용된다. 그다음 적절한 과장과 에너지원으로 광을 제공하는 경우 감광성 물질이 여기되어 제1여기 상태가 된다. 시스템내에 교차는 1중항 상태에서 3중항 상태로 전환시킨다. 3중항 상태에서 에너지가 바닥상태 분자산소로 전달되어 1중앙 여기상태 산소를 생산하게 된다. 생성된 1중항 산소는 세포의 리소좀막을 공격하여 사이토졸로 라이소좀 효소를 유리시켜 결국에는 세포를 죽이게 된다. 항암제 효과는 감광성 물질에 의해 파괴되지 않는 세포를 제거하는 것이다. 전술한 치료요법을 사용하여 종양재발을 막는다.

생체내에서 항암제(아드리아마이신)을 포함하고, 감광성물질(메조-클로린e6 모노에틸렌 디아민 디소듐염(ce6))을 포함하는 복합 공중합물(HPMA 공중합물)의 항암효과는 항암제만을 포함하는 중합물과 감광물질을 포함하는 공중합물을 사용하는 경우보다 우수한 것으로 나타났다. 아드리아마이신은 공중합물로부터 효소적 분해가 있고, ce6이 빛에 의해 활성화되는 경우에만 활성이 있고, 이는 공중합물에 남아있건없건간에 광역학적 효과를 밝힐 수 있다. 항암제는 PDT 에 의해 장시간 종양의 치료가 어렵기 때문에 PDT치료를 보강시킬 수 있다. 한편, 화학적 요법제는 다중약물 저항성과 다른 부작용을 포함한 문제를 공유한다. 본 발명은 공중합물의 소량을 요구하므로 부작용을 감소시킨다.

[발명의 상술]

주요 공단량체 유닛은 중합체 운반물의 특징을 결정한다. 몇개의 공단량체 유닛은 수용성 공중합물로 사용될 수도 있다. 기능적으로 생체활성/표적물에 결합을 위한 적절한 스페이서에 비활성 공중합물이 이용될 수 있다. 공중합물은 적절한 부착기 또는 스페이서를 포함하는 공단량체 유닛의 소요의 몰비와 유도안된 공중합물의 소요의 몰비에 의해 공중합시켜 만들 수 있다. 다시말하면, 생체활성물질 또는 표적물질에 포함된 활성기가 부착될 수도 있다. 일반적인 공단량체 유닛은 N-(2-하이드록시프로필)메타아크릴아미드(HPMA), N-메틸아크릴아미드와 N, N-디알킬아크릴아미드로 만들어진다. 또다른 적절한 운반체는 폴리아미노산, 폴리사카라이드, 폴리에틸렌옥시드 서열을 포함하는 공중합체, 폴리비닐 피놀리돈-말레인 무수 공중합체 등이 포함될 수도 있다.

일반적으로, 초기 단계는 중합물 전구체의 제조에 관계한다. 합성 공중합물의 경우에, 초기단계는 공중합물 전구체를 제공하기 위해 유도된 그리고 유도안된 공단량체 유닛을 공중합시키고, 유도된 공단량체 유닛에는 생체활성 약물 또는 표적물질의 추가를 위해 이탈기(가령 p-니트로페녹시기)를 가지는 스페이서가 또는 부착기를 포함한다. 폴리사카라이드(가령 텍스트란과 그 유사물)과 폴리아민과 같은 다른 중합물의 경우에 이단계는 활성단계로 활성물질(가령 p-니트로페녹시기)는 중합물 사슬에 부착시킨다. 제2단계는 전구체 중합물 또는 공중합물에 생체활성물 또는 표적물질의 추가와 관계된다.

전술한 것에서, 공중합물은 적절한 중합물로 광의 해석할 수 있으며, 이 때 사슬을 만드는 반복적인 단량체 유닛은 동일하나 스페이서를 통하여 단량체 유닛에 부착되는 상이한 기를 가질 수 있다. 따라서 HPMA 공중합물은 유도화 안된 HPMA 와 활성 p-니트로페녹시기를 가지는 N-페트아크릴화된 펩티드로부터 합성될 수 있다. 한편, 폴리사카라이드는 공중합물은 p-니트로페녹시기와 같은 반응기의 부착에 의해 활성화된 유도체와 다른 사카라이드 유닛으로 치환되지 않는 사카라이드 유닛을 포함할 수도 있다. 공중합물은 수융성이고, 100,000 내지 50,000 범위 내에 항암제, 광활성 약물과 결정인자를 포함하는 분자량을 가지게 된다.

언급된 미국특허 5,037,883에서 중합체 유닛의 5.0 내지 99.7mol%는 적절한 공단량체인 HPMA와 유도화안된 공단량체 유닛이 된다.

공단량체유닛의 특정량(%)에는 항암제에서 효소절단될 수 있는 곁사슬을 포함한다. 이와 같은 곁사슬은 세포의 라이소좀 구획내에 항암제의 부위-특이적 유리를 허용한다. 이와 같은 단량체 유닛은 공중합물을 이루는데 0.2내지 20.0mol%로 다양해질 수 있다. 곁사슬의 구조는 혈류에서 안정화되고, 그러면서도 세포내 라이소좀 효소에 의해 가수분해될 수 있도록 꼬리가 있도록 만들어진다. 약물의 부착부위로써는 올리고펩티드 서열, 올리고사카라이드 서열 또는 핵산과 유사한 구조가 사용될 수도 있다. 적절한 공중합물은 HPMA이나 약물에 부착되기 위해서는 N-메트아크릴화된 펩티드가 적절하다. 연결 또는 펩티드 스페이서는 미국특허 5,037,883에 언급한 것이 될 수 있으나 Gly-Gly, Gly-Phe-Gly, Gly-Phe-Phe, Gly_Leu_Gly, Gly-Val-Ala, Gly-Phe-Ala, Gly-Leu-Phe, Gly-Leu-Ala, Ala-Val-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO:1), Gly-Phe-Phe-Leu(SEQ ID NO:2), Gly-Leu-Leu-Gly(SEQ ID NO:3), Gly-Phe-Tyr-Ala(SEQ ID NO:4), Gly-Phe-Gly-Phe(SEQ ID NO:5), Ala-Gly-Val-Phe(SEQ ID NO:6), Gly-Phe-Phe-Gly(SEQ ID NO:7), Gly-Phe-Leu-Gly-Phe(SEQ ID NO:8), or Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-Phe(SEQ ID NO:9 에서 선택된 것으로 구성될 수도 있다. 펩티드 스페이서로 특별히 적절한 것은 Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO:1)이다. 이 스페이서는 명세서와 청구범위에 언급되며 Gly-Phe-Leu-Gly or(SEQ ID NO:1)로 언급될 수도 있으며 이는 상호 호환성이 있다.

펩티드 연결을 위해 부착된 적절한 항암제는 아드리아마이신, 도우노마이신, 멜팔란과 블레오마이신이 포함되나 이에 한정하지는 않는다.

광활성화되는 약물에 있는 분해가능한 곁사슬을 포함하는 동일한 공단량체 유닛이 사용될 수도 있다. 중합체에 있는 공단량체 유닛의 농도범위는 항암제의 것과 동일하다. 그러나, 항암제와 광활성 약물은 1:1몰비로 존재한다는 의미는 아니다. 복합 공중합물내에 이들 약물의 비는 환자 치유될 암의 유형, 조작위치 또는 생체활성제의 존재하에 영향을 받을 수 있는 다른 가변요소에 따라 다양한다. 또한, 공단량체 유닛에는 광활성 약물에서 단부의 비분해성 사슬을 포함할 수도 있다. 이와 같은 비-분해성 사슬은 글리신, ε-아미노카프론산이 포함될 수도 있다.

광활성 약물 또는 감광성 물질은 포르피린, 프탈로시아닌, 푸르푸린, 클로린, 나프탈로시아닌, 양성염료, 테트라사이클린 등으로 만들어질 수 있다.

각 공중합물에는 표적물질이 포함될 수 있다. 비분해성과 효소적으로 분해가능한 곁사슬이 표적물질이 사용될 수도 있다. 이와 같은 공중합물에는 표적물질이 0내지 94.8mol%로 다양하게 포함될 수 있다. 미국특허 5,037,883을 참고하면 표적물질이 존재하는 경우에 공중합물에는 표적물질에 결합할 수 있는 0.1내지 94.mol%로 포함할 수 있다. 적절한 공중합물이 HPMA인 경우 공중합물은 N-메트아크릴아미드, N-메타아크릴산 또는 메트아크릴화된 아미노산 또는 펩티드가 포함될 수 있다. 이것이 존재할때 효소적으로 분해가능한 곁사슬은

으로 구성된 아미노산, 펩티드 등이 적절한데 이중 Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO:1)이 가장 적절하다.

표적물질로, 세포표면 항원 또는 수용체에 상보적인 구조를 사용할 수도 있다. 여기에는 갈락토사민, 푸코실아민, 락토스와 같은 사카라이드, MSH, 세크라틴과 같은 호르몬, 오피에이트, 단클론성과 다클론성 항체 등이 포함된다.

광활성 약물은 레이져와 같은 광소스, 그리고 PDT에 사용된 광섬유 시스템, 화학적 발광물질에 의해 활성화될 수 있다. 화학적, 발광 활성물질이 종양위치에 직접적으로 주입되거나 또는 전술한 것과 유사한 중합성 수송시스템을 이용하여 종양부위에 표적이 되도록 한다. 화학적 발광물질을 황성화시키는데 필요한 퍼옥시드 형성은 효소반응의 결과(글루코스와 반응하는 세포막에 있는 글루코스 옥시다제와 같은 효소의 수송으로 과산화수소의 형성) 또는 펄스광에 의해 자체 개시되는 감광물질에 의해 형성된다. 후자의 경우에, 사이클 반응은 공조기작의 결과가 된다.

본 발명은 상기와 같이 광범위하게 설명하였으나 다음에는 구체예로 설명하며, 이 때 공중합물 유닛은 HPMA에 기초한다. 그러나 본 기술분야에 숙지된자는 항암제에 동일 곁사슬을 포함하는 다른 공중합성 분자, 광활성 약물 그리고 표적물질을 제공하기 위해 다른 공중합 유닛을 이용할 수도 있다.

본 발명에 이용되는 공중합물은 통상의 방법에 의해 합성되며 다음과 같이 표시된다.

P-Gly-Phe-Gly-adria (공중합체 I)

이때 P는 공중합성 운반체로서 후에 더 상술하며 항암제 아드리아 마이신은 아드리아로 나타낸다.

P-Gly-Phe-Gly-ce6 (공중합체 II)

이때 P는 전술한 것과 같으며, ce6은 광활성화되는 약물 메조-클로린 e6이다.

P-Gly-ce6 (공중합체 III)

이때 P는 전술한 것과 같고, ce6은 메조 클로린 e6이다.

이때 P, ce6, 아드리아는 전술한 것과 같다.

이때 P와 ce6은 전술한 것과 같고, 시크리턴은 27개 아미노산을 가지는 폴리펩티드 결정인자이다.

이때 P, ce6, 아드리아, 시크리턴은 전술한 것과 같다.

전술한 것과 같이, HPMA는 적절한 단량체 유닛이다. 공단량체를 사용하면, 각 공중합물 I-VI의 구조는 다음과 같고, 이때 x, y, z, w는 공중합물에서 각 유닛의 몰%를 나타낸다. 따라서, x는 5.0내지 99.7몰%의 정수이고, y는 0.3내지 20.0몰%의 정수이고, z는 0.2내지 20.0몰%의 정수이고, w는 0.1 내지 25.0몰%의 정수이다.

공중합물 I-VI의 합성을 위한 공중합물 전구체의 제조에 사용되는 단량체의 합성은 다음의 실시예 1-4에 주어진다.

[실시예 1]

전술한 반응에 의해 HPMA단량체(J. Strohalm et al., Angew. Makromol. Chem., 70, 109(1978))는 550㎖ 아세토니트릴에 1-아미노-2-프로판을 229.7㎖(223.5g, 2.98몰)을 용해시켜 만들 수 있다. 옥틸피로카테친 저해물질을 첨가하고, 용액은 20℃로 냉각시킨다. 그다음 153㎖메타아크릴로일 클로라이드(163,7g, 1.57몰)을 350㎖ 아크릴로니트릴에 용해시킨다. 메타아크릴로일 클로라이드 용액은 -15℃의 온도로 유지시키면서 왕성하게 교반시켜 1-아미노-2-프로판을 용액에 서서히 적하시킨다. 첨가한후, 혼합물의 온도는 20℃로 상승시키도록 한다. 1-아미노-2-프로판올-HCl 부산물은 성긴 필터를 통하여 신속히 여과시킨다. 플라스크는 제1결정이 형성된 후에 긁어내고 -30내지 -45℃에서 연속하여 결정화시킨다. 결정은 신속히 여과시킨다. HPMA는 MeOH/에테르=1:3혼합물(온수에 용해)에서 재결정시키고 그 다음 형성된 중합물질을 제거하기 위해 재결정시킨다. 주요산물(64.4g)은 70-71℃에서 용해시킨다.

[실시예 2]

메타아크릴로글리신-p-니트로페닐에스테르(MA-Gly-ONp or MA-G-ONp)중간물질 MA-Gly제조

MA-Gly-ONp의 전구체인 메트아크릴로글리신(MA-Gly or MA-G)는 다음과 같은 반응단계에 의해 합성된다.

글리신(0.3996몰) 30g을 4N NaOH 100㎖에 용해시키고, 하이드로퀴논 저해물질을 첨가한다. 혼합물은 0℃로 냉각시킨다. 메타아크릴로클로라이드(38.7㎖, 0.3996몰)나 4N NaOH 99.8㎖을 동시에 글리신 용액에 서서히 적하시킨다. pH는 4N NaOH로 9.5로 조절한다. 반응은 실온에서 1시간 지속시키고, 20℃욕조에서 30분간 지속시킨다. 반응혼합물은 0℃로 냉각시키고, 약65㎖ 1:1 HCl:H2O를 서서히 적하시켜서 pH가 2~3이 되게 한다. 혼합물은 에틸아세테이트로 2회 추출한다(형성된 염을 용해시키기 위해 물층에 더많은 물을 첨가한다). 용액은 1시간 동안 나트륨 설페이트로 건조시키고, 여과시킨다. 용적은 450-500㎖로 감소시키고, 약 10㎖헥산을 첨가한다. 혼합물을 24시간 냉동시키고, 메타아크릴로글리신 결정을 분리시킨다. 모액은 EtOH/헥산에 재결정시킨다. 이 두물질의 수득율은 13.2와 6.5g이 되고, 두물질의 융점은 108-109℃가 된다.

메트아크릴로글리신 p-니트로페닐에스테르(MA-Gly-ONp)제조

상기 준비된 MA-Gly를 이용하여 MA-Gly-ONp(NM-G-ONp)는 다음과 같이 합성된다.

MA-Gly-ONp(Rejmanova et al., Makromol. Chem., 178, 2159(1977) 방법에 의해 준비된)는 약 500㎖ THP에서 6.5g MA-Gly(0.045몰)와 6.95g p-니트로페놀(0.050몰)을 용해시켜 준비한다. 이 혼합물은 -20℃로 냉각시키고 9.7㎖ THP 에 용해된 DCC 10.31(0.05몰)은 -20℃를 유지시키면서 서서히 적하시킨다. 반응은 24시간 동안 4℃에서 지속한다. 다음날 오전에 혼합물은 실온에서 3시간 교반시킨다. 반응을 종료시키기 위해 아세트산 몇방울을 적하시키고 실온에서 30분 더 교반시킨다. 형성된 디사이클로헥신 우레아(DCU)는 여과시켜 THF로 세척한다. 여과물을 기화시켜 건조시키고 에틸아세테이트에 용해시킨다. 나머지 DCU는 여과시킨다. 마지막 단계를 반복한다. 산물은 다시 에틸아세테이트에 용해시키고 24시간 냉각시킨다. 혼합물은 1회이상 여과시키고 건조시킨다. EtOH/에테르에서 냉동시켜 결정화시킨다. 결정은 여과시키고 냉각 에테르로 세척한 다음 건조시킨다. 주요산물의 수득률은 4.69g이 되고, 용융점은 103-104℃가 된다. 분자 상계 계수는 분광계로 결정한다: ε272=10.4/mole.cm(메탄올).

[실시예 3]

메타아크릴로글리실페닐알라닌-p-니트로페닐에스테르(MA-Gly-Phe-ONp or MA-G-F-ONp) 중간물질 MA-Gly-Phe(MA-G-F)제조 MA-Gly-Phe-ONp의 전구물질인 메트아크릴로글리실페닐알라닌(MA-Gly-Pe or MA-G-F)은 다음과 같이 합성된다.

글리실페닐알라닌(Gly-Phe)(0.668몰) 15g을 60㎖ H2O에 2.72g NaOH(0.068몰) 용액에 용해시킨다. 옥틸피로카테친 저해물질을 첨가하고 혼합물을 0℃로 냉각시킨다. 첨가된 저해물질과 25㎖메틸렌 클로라이드에 7.76g(7.2㎖, 0.074몰)메타아크릴로클로라이드와 60㎖ H2O에 용해된 2.98g(0.024몰) NaOH 용액의 혼합물을 교반시키면서 Gly-Phe용액에 서서히 적하시킨다. pH는 30분에 검사하고(pH 6) pH가 8~9이 될때까지 0.3gNaOH를 첨가한다. 반응은 물층이 혼합물을 추가 30분동안 교반시킨후에 일정한 pH(중알칼리)가 될때에 종료된다. 상층을 수득하고, 메틸렌 클로라이드층을 몰(10㎖)로 추출한다. 수용액은 복합시켜 저해제와 100㎖에틸 아세테이트를 첨가하여 혼합물은 20℃이하로 유지시킨다. HCl:1=1:1 36%를 pH가 2-3에 도달할때까지 첨가한다(약 6-7㎖). 용액은 에틸아세테이트로 신속하게 추출시킨 다음 에틸아세테이트층을 수득하고, 물층은 에틸아세테이트로 3회 세척하고 결정은 에틸아세테이트로 세척한다. 용액은 약 100㎖ 감소되고 24시간 냉동시킨다. 결정은 여과시키고 냉각 에테르로 세척후에 건조시킨다. 수득률은 7.63g이 되고 모액으로부터의 산물은 융점이 141-142.5℃인 7.26g MA-Gly-Phe이다.

메타아크릴로글리실페닐알라닌 p-니트로페놀에스테르

(MA-Gly-Phe-ONp)제조

준비된 MA-Gly-Phe을 이용하여 MA-Gly-Phe-ONp(NM-G-F-ONp)는 다음과 같이 MA-Gly-ONp와 유사한 방식으로 합성된다.

MA-Gly-Phe(7.63g, 0.026몰)와 4.02g(0.029몰) p-니트로페놀은 실온에서 105㎖ THF에 용해시킨다. 교반시에, 15㎖ THF에 5.96g(0.029몰) 용액을 서서히 적하시킨다. 반응은 6시간동안 -20℃에서 진행시키고 4℃에서 24시간 진행시킨다. 다음날 용액은 실온에서 1시간 교반시킨다. 아세트산 소량을 적하시키고, 30분 더 교반시킨다. DCU를 여과시키고, THF로 세척한다. 나머지 용액은 기화시키고, 냉동기에서 24시간 동안 EtOH/H2O로 결정화시킨다. 주요산물은 1.48g이 된다. 경제된 산물은 물상극 계수를 가진다. ε271=10.4/mole.cm(DMSO)

[실시예 4]

메타아크릴로글리실페닐알라닐루이실글리신 p-니트로페닐에스테르(MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp or MA-G-F-L-G-ONp) 중간물질 MA-Gly-Phe-Leu-Gly(MA-G-F-L-G)제조

MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp의 전구물질인 메타아크릴로글리실 메닐알라닌루이실글리신(MA-Gly-Phe-Leu-Gly or MA-G-FL-G)은 다음과 같이 합성된다.

MA-Gly-Phe-ONp(0.5g, 1.22 x 10. -3 몰)은 온수에서 옥틸피로카테친 저해물질과 7.35㎖ 디옥산에 용해시킨다. Leu-Gly(0.25g, 1.34 x 10. -3 몰)와 0.225g(2.68 x 10.-3 몰) NaHCO3는 6㎖ 물에 용해시킨다. 하이드로퀴논 저해물질을 혼합물에 첨가시킨다. 수용성 혼합물을 유기혼합물에 첨가하고 반응은 실온에서 24시간 진행시킨다. 회전기화(40℃)에 의해 디옥산을 제거한다. 나머지 산물은 0℃로 냉각시키고 5㎖ 냉각 에틸아세테이트와 옥틸피로카테친 저해물질을 첨가한다. 물에 HCl 1:1 희석액 0.505㎖ 을 pH가 2~3이 될때까지 서서히 적하시킨다. 에틸아세테이트층을 제거하고 물층은 에틸아세테이트로 3회 추출한다(각 4㎖씩). 에틸아세테이트 부분은 복합되고, 물과 함께 3배 추출하고(5㎖), 반응안된 Leu-Gly를 제거하고, 나트륨 설페이트로 건조시킨다. 용액은 여과시키고 건조시키기 위해 기화시킨다. 옥틸피로카테친 저해물질과 건조 에테르를 건조 혼합물에 첨가하고, 24시간 냉각시켜 여과시킨다. 결정은 에테르로 세척하고 건조시킨다. 순수산물의 수득률은 150-154℃융점의 320㎎이 된다. 분석(10:2:0.5 아세톤:에테르:아세트산)에서 반응 혼합물에서 반응물이 사라지게 된다.

메트아크릴로글리실페닐알라닌루이실글리실 p-니트로페닐에스테르(MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp)제조

상이한 반응으로부터의 MA-Gly-Phe-Leu-Gly은 다음과 같이 MA-Gly-Phe-Gly-ONp의 합성을 위해 복합된다.

MA-Gly-Phe-Leu-Gly(0.5g, 1.09x10.-3몰)와 0.166g(1.19x10.-3몰) p-니트로페놀은 온수하에서 8.1㎖ 건조 THF에 용해시킨다. 혼합물은 -20℃에 냉각시킨다. DCC(0.269g, 1.3x10.-3몰)은 약 1.1㎖ THF 에 용해시켜 혼합물로 서서히 적하시킨다. 반응은 -20℃에서 0.5시간, -10℃에서 5시간, 4℃에서 24시간 진행시킨다. 옥탈피로카테친 저해제를 첨가하여 혼합물은 24시간동안 실온에서 교반시킨다. 아세트산(12.5㎕)를 혼합물에 적하시키고 30분간 연속 교반시킨다. DCU는 여과시킨다. 생성물은 에틸아세테이트에 용해시키고 1시간 동안 냉각시킨다. DCU는 여과시키고 에틸아세테이트는 기화시킨다. 생성물은 에틸아세테이트에 용해시키고, 여과시키고 추가시간동안 기화시킨다. 생성물은 에테르에서 24시간 흡수시키고, 여과 시킨 후에 건조시킨다. 물질은 아세톤에테르 3:1에서 결정화시키고 생성물은 287㎎이고 융점은 122-126℃이다. 삼각계수는 ε269=10.4 1/mole.cm(DMSO)이다. 아미노산 분석으로 구조를 확인하고, Gly:Phe:Leu의 비는 2:1:1이다.

공중합물 I-V를 준비하기 위해 실시예 1-4에서 단량체를 이용하여 공중합물 전구체의 합성은 실시예 5 내지 6과 같다.

[실시예 5]

중합체-Gly-ONp 제조

전구체 1a 또는 1b로 확인된 HPMA(실시예 1)와 MA-Gly-ONp(실시예 1)와 MA-Gly-ONp(실시예 2)의 공중합물은 다음에 따라 준비된다.

중합체-Gly-ONp(전구체1a)는 12.5% 단량체, 86.9% 아세톤, 0.6% AIBN의 중량비로 0.144g아조이소부틸니트릴(AIBN)을 이용하여 HPMA(2.65g, 85몰%)와 MA-Gly-ONp(0.74g 15몰%)의 아세톤으로 라디칼 침전 공중합물에 의해 준비된다. 단량체와 AIBN은 아세톤에 용해시키고, 여과시켜 앰플에 옮기고 N2로 충전시킨다. 앰플은 밀봉하고, 혼합물은 48시간 동안 50℃에서 중합시킨다. 중합물은 여과시키고, 아세톤으로 세척하여 에테르로 건조시킨다. 중합물은 MeOH에 용해시키고, 아세톤은 재침전시키고, 아세톤과 에테르로 세척하고 건조시킨다. 정제된 산물의 수득률은 1.52g이다. 스펙트로스코피에 의해 결정된 ONp의 함량은 10.6몰%이다. 평균분자량(17,000)과 폴리디스퍼라스티(1.5)는 폴리HPMA(완충액 0.5M NaCl +0.05M Tris:pH8)로 계산하는 경우 슈퍼로스 12칼럼(10x30㎝)에서 FPLC분석에 의해 1-아미노-2-프로판올로 아미노용해후에 분석한다.

전구체(1b)는 유사하게 합성되어 평균분자량 23,000과 복합분산도가 1.5인 5.1몰% ONp를 가진다.

[실시예 6]

중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp 제조

전구물 2a 또는 2b로 확인되는 HPMA(실시예 1)와 MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp(실시예 4)의 공중합물은 다음과 같이 준비된다.

Gly-Phe-Leu-Gly-ONp의 두가지 상이한 양을 포함하는 공중합물을 합성하였다. 하나는 개별 공중합물[중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6(공중합물 III)의 합성에 소량(전구물 2a)을 이용하고 나머지 하나는 복합 공중합물의 다량(전구물 2b)를 이용하였다.

전구물질 2a의 경우 726.97㎎(96몰%) HPMA, 123.02㎎(4몰%) MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp와 41㎎ AIBN을 7.5㎖ 아세톤에 용해시킨다. 용액을 여과시키고, 앰플에 옮긴 후 N2로 충전시킨다. 앰플은 밀봉하고, 단량체는 30시간 동안 50℃에서 공중합시킨다. 침전된 공중합물은 여과시키고, 아세톤과 에테르로 세척하고 건조시킨다. 그다음 MeOH(18wt%)에 용해시키고 100㎖ 아세톤:에테르 3:1 에 재침전시킨다. 최종 수득률은 3.7몰% ONp와 570.5㎎의 공중합물로 UV스펙트로스코피에 의해 결정한다(ε274=0.95x10.4 1/mole.cm DMSO). 평균분자량(21,000)와 다분산성(1.6)은 폴리 HPMA의 단편으로 계산된(완충액 0.5M NaCl+0.05M TRIS; pH8) 슈퍼로스 12칼럼(10x30㎝)에서 FPLC분석에 의해 1-아미노-2-프로판올로 아미노용해에 의해 결정한다.

전구물질 2b는 동일한 방법에 의해 라디칼 침전 공중합방법에 의해 준비하였다. HPMA(206.7㎎, 90몰%), MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp(93.3㎎, 10몰%)와 AIBN(14.4㎎)은 2.65㎖ 아세톤에 용해시킨다. 공중합물의 최종 수득률은 197.5㎎이고 분광광도계에 의해 결정된 7.8몰%ONp(ε272=0.95x10.4 1/mole.cm DMSO)가 된다. 평균분자량(18,000)와 다분산성(1.6)은 폴리 HPMA(완충액 0.5M NaCl+0.05M TRIS; pH8)로 계산된 슈퍼로스 12컬럼(10x30㎝)에서 FPLC분석에 의해 1-아미노-2-프로판올로 아미노분석에 의해 결정된다. 전구물질 2b내에 분해성 곁사슬의 7.5몰%는 상한성이 되고, 중합물은 생리적 용액에서 중합물의 곁사슬에 소수성 약물을 부착시킨 경우에도 용해성을 보유한다.

공중합물 I-VI의 합성은 실시예 5와 6의 전구물질 중합물을 이용하여 하기 실시예 7-12에 상술한다.

다음의 실시예에 사용되는 항암제는 아드리아마이신 하이드로클로라이드(아드리아)로 그 구조는 다음과 같다.

다음의 실시예에 사용된 광활성 약물은 메조-클로린 e6모노에틸렌디아민 디소듐염(ce6)으로 그 구조는 다음과 같다.

[실시예 7]

중합물질-Gly-ce6(공중합물III) 제조

비분해성 곁사슬을 포함하는 공중합물 III은 ce6(11.2wt%)(공중합물IIIa), 7.9(공중합물IIIb)와 8.3(공중합물 IIIc)를 각각 이용하여 다음과 같은 반응순서에 의해 준비한다.

공중합물 IIIa는 다음과 같이 합성된다. 중합물-Gly-ONp(분자량이 17,000이고 다분산성이 1.5인 전구체 1a)(225㎎, 106몰% ONp)를 0.8㎖ DMSO 에 용해시킨다. 메조-클로린 e6 모노에틸렌디아민 디소듐염(ce6)(39.4㎎, 57.5μ몰)(포르피린산물, Logan, UT)는 0.4㎖ DMSO에 용해시킨다. ce6 용액은 P-ONp용액(0.3㎖ 이상의 DMSO가 세척을 위해 첨가된다)에 첨가하고 실온에서 5시간 교반시킨다. 그 다음 25.7㎕ 1-아미노-2-프로판올은 첨가하고 혼합물은 실온에서 15분간 교반시킨다. 용액은 아세톤에 침전시키고, 24시간 냉동시킨다. 중합물질은 여과시키고, 아세톤과 에테르로 세척시키고 LH-20 컬럼(55 x 3㎝)에 제공한다. 주요 중합물을 수득하고, 건조를 위해 재기화시키고, 증류수에 용해시키고, 냉각시켜 건조시킨다. 주요피크에는 142.3㎎이 포함되고, 수득된 총 중합물질은 217㎎이 된다. 클로린 함량은 광학적 분광계에 의해 측정하면 11.2wt%(ε394-1.58x10.5 1/mole.cm 메탄올)(2.6몰%)이다.

공중합물 IIIb와 IIIc는 전구물질 공중합물 1b(분자량 23,000와 다분산성 1.5)와 1a(분자량 17,000와 다분산성 1.5)각각 7.9와 8.3wt% ce6을 포함하는 유사하게 합성될 수 있다.

실시예 8

중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6(공중합물II) 제조

분해성 결사슬을 포함하는 공중합물II는 다음의 반응과정에 따라 11.2wt% ce6으로 준비될 수 있다.

중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp(전구물질 2a는 분자량이 21,000이고 다분산성이 1.6이다)(200㎎, 3.7몰%ONp)는 0.75㎖ DMSO에 용해시킨다. 1.25배 몰초과량의 ce6(32.9㎎)을 0.15㎖ DMSO에 용해시킨다. ce6혼합물을 중합체 혼합물에 첨가하고(추가로 세척을 위해 0.2㎖ DMSO를 첨가한다) 실온에서 4시간 동안 교반시킨다. 이론적으로 ONp기를 가지는 3배 초과량에 1-아미노-2-프로판올(6.4㎖)을 첨가하고, 혼합물은 추가 5분간 더 교반시킨다. 공중합물은 3:1 아세톤:에테르 혼합물로 침전시키고, 여과시켜 아세톤과 에테르로 세척한후 건조시킨다. 공중합물은 5㎖ MeOH에 용해시키고 LH-20컬럼(55x3㎝)에 얹는다. 공중합물 띄를 수집하고, 건조를 위해 기화시키고, 증류수에 용해시켜 냉동 건조시킨다. 순수 산물 수득률은 168㎎이고 광학적 분광 광도계에 의해 결정된 11.2 wt% ce6를 가진다.

[실시예 9]

중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-adria(공중합물1)의 제조

분해되는 곁사슬을 가지는 공중합물 I은 7.4wt%의 아드리아마이신과 함께 다음의 반응순서에 의해 준비한다.

중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp(전구물질 2a는 분자량이 21,000이고 다분산성이 1.6이다)(200㎎, 37몰%ONp)를 0.76㎖ DMSO에 용해시킨다. 아드리아마이신.HCl(27.8㎎, 4.8x10.-5몰)을 0.18㎖ DMSO에 용해시키고 용해된 중합물질에 첨가시킨다. 트리에틸아민(5.35㎕, 3.84x10.-5몰)을 첨가한다. 반응 혼합물은 실온에서 1시간 동안 교반시키고 이때 20% 이상의 트리에틸아민(2.7㎖ 9.6x10.-6 몰)을 첨가한다. 반응은 실온에서 3시간 진행시킨다. 이론적으로 ONp기를 3배가지는 1-아미노-2-프로판올(6.4㎕)을 첨가하고 추가로 5분 더 교반시킨다. 산물은 4.75㎖ 아세톤:에테르 4:1에 참전시키고 1시간 냉동시켜 여과시키고, 아세톤:에테르로 세척후 건조시킨다. 산물은 5㎖ MeOH에 용해시키고 LH-20컬럼(55x3㎝)에 얹는다. 주요 중합물 피크를 수득하고 건조를 위해 기화시킨후 냉동건조시킨다. 아드리아마이신 함량은 (ε488=1.19x10.-4 1/mole/cm몰)9.0wt%이고, 최종산물은 183㎎이 된다.

[실시예 10]

중합물(Gly-Phe-Leu-Gly-adria)Gly-Phe-Leu-Gly-ce6(공중합체IV) 제조

분해되는 곁사슬을 포함하는 복합 공중합물 IV는 4.2wt% ce6와 아드리아마이신 7.25 wt%로 다음의 반응서열에 따라 제조한다.

40㎎중합물 Gly-Phe-Leu-Gly-ONp(전구물질 2b는 분자량이 18,000이고 다분산성이 1.6인)(7.8몰% ONp)를 0.10㎖ DMSO에 용해시킨다. 아드리아마이신-HCl(4.6㎎, 7.9μ몰)을 0.12㎖DMSO에 용해시키고, 중합물 용액에 첨가시킨다. 트리에틸아민(0.88㎕, 6.3μ몰)을 첨가한다. 반응은 실온에서 1시간 지속한다. 40%(0.44㎕, 32μ몰)이상의 트리에틸아민을 첨가하고 반응을 1시간 더 지속시킨다. 용액의 일부(0.06㎖)을 아드리아마이신 분석을 위해 뽑아낸다. 아드리아마이신 함량은 스팩트로스코피에 의해 7.25wt%(ε450=1.19x10.4 물)으로 측정 되었다. 용액에서 0.03㎖ DMSO에 용해된 1.75㎎(0.26μ몰)ce6을 첨가하였다. 트리에틸아민(0.44㎕)을 첨가하였다. 반응 혼합물은 3시간 교반시켰다. 1-아미노-2-프로판올(2.1㎕, 27μ몰)을 첨가하고 혼합물은 5시간 더 교반시킨다. 용액은 아세톤:에테르 3:1(400㎖)로 침전시키고 3시간 냉동시킨다. 중합물은 여과시키고, 아세톤 에테르로 세척후에 건조시킨다. 중합물은 5㎖ MeOH용해시키고 MeOH로 충전시킨 LH-20 컬럼(55x3㎝)에 얹는다. 순수산물 수득률은 27.1㎎이고 이에는 분광광도계에 의해 결정된(ε394=1.58x10.5 1/mole.cm MeOH) 4.2wt% ce6를 포함한다.

[실시예 11]

중합물(Gly-시크리틴)Gly-ce6(공중합물V) 제조

분해되지 않는 곁사슬을 가지는 공중합물 V는 다음과 같이 준비된다.

15㎎중합물-Gly-ONp(전구물질 1a는 분자량이 17,000이고 다분산성이 1.5인)를 50㎕ DMSO 에 용해시킨다. 2㎎ ce6(2.9μ몰)을 30㎕ DMSO에 용해시키고 중합물 용액에 첨가시킨다. 그 다음 110㎕ DMSO에 용해된 19㎎(6.2μ몰)시크리틴를 혼합물에 첨가한다. 10㎕(7.5μ몰)트리에틸아민(DMSO 에 10배 희석)을 반응혼합물에 첨가한다. 실온에서 1시간 혼합후에 5㎕(3.7μ몰)의 트리에틸아민을 첨가하였다. 5㎕(3.7μ몰)트리에틸아민을 1시간 뒤에 첨가시킨다. 혼합물은 실온에서 30시간 교반시킨다. 반응혼합물은 2.5㎖ 물로 희석시키고 8시간 동안 20%에탄올/물에 투석시킨 다음 40시간 추가로 물에서 투석시킨다. 그 다음 24시간 물에서 투석시켜[12,000-14,000분자량 제거] 반응안된 시크리턴을 제거한다(FPLC 컬럼(HR10/30 컬럼:슈퍼로스 12:0.05M 트리스+0.5M NaCl pH8)에서 프리 스크리틴의 부재를 증명한다.) 약물은 물로 충전된 PD-10 컬럼에서 분리시킨다. 시료는 냉동건조시킨다. UV스펙트로스코피에 의해 ce6 함량을 결정하여 55.9wt%로 나타내고 시크리틴 함량은 6N 염산으로 가수분해시킨 후 아미노산 분석에 의해 300㎍/㎎으로 결정된다.

[실시예 12]

중합물(Gly-Phe-Leu-Gly-아드리아)(Gly-Phe-Leu-Gly-ce6)Gly-Phe-Leu-Gly-시크리틴)(공중합물VI) 제조

400㎎ P-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp(전구물 2b; 7.8% ONp;MW=18,000;다분산성 1.6)을 1㎖ DMSO 에 용해시킨다. 0.6㎖ DMSO에 용해된 아드리아마이신 HCl(23㎎; 40μ몰)을 공중합물 용액에 첨가시켜 트리에틸아민 4.4㎕(32μ몰) 용액에 의해 첨가한다. 실온에서 2.2㎕(16μ몰) 트리에틸아민을 첨가시키고 0.15㎖ DMSO에 융해된 8.75㎎(12μ몰) ce6 용액을 1시간 뒤에 첨가시킨다. 반응혼합물은 3시간을 교반시킨다. 400㎎시크리틴(13m몰)을 첨가시키고 반응은 실온에서 24시간 지속시킨다. 반응 혼합물은 5시간 동안 10% 에탄올/물에서 투석시키고, 48시간동안 순수물에서 투석시키고, 냉동건조시킨다.

복합공중합물을 제조하기 위해 사용되는 다른 공중합물은 항암제와 중합물 사슬에 부착된 광활성 약물을 가진다. 다음의 실시예는 이와 같은 중합물질을 어떻게 준비하는지를 설명한다.

[실시예 13]

1g덱스트란(MW 40,000)와 35㎎ 4(N,N-디메틸아미노)파라딘을 20㎖ 디메틸설폭시드/피리딘(v/v=1:1)에 용해시킨다. 용액에 500㎎ p-니트로페닐 클로로포르메이트를 첨가한다. 20분뒤에 반응 혼합물은 초과량의 에탄올에서 침전시키고, 세척후 진공하에서 건조시킨다. UV스펙트로스코피에 의해 결정한 p-니트로페닐기의 함량은 5.1몰%이다.

[실시예 14]

8㎖ DMSO에 500㎎활성 덱스트린(실시예 13에 따라 준비된 그리고 1.5x10.-4몰 활성기를 가지는)을 용해시키 용액을 준비한다. 2㎖ DMSO 에 용해된 1x10.-4몰 아드리아마이신 HCl와 1x10.-4몰 N-(2-아미노에틸)클로린 e6-아미드를 첨가하고, 1x10.-4몰 트리에틸아민을 첨가한다. 반응 5시간 뒤에 2x10.-4몰 1-아미노-2-프로판을 첨가한다. 10분 뒤에 아드리아마이신과 ec6를 포함하는 중합물을 침전에 의해 분리시키고 세척후 진공하에서 건조시킨다.

[실시예 15]

폴리(1-비닐-2-피롤리돈-코-말레인안하이드리드(NW 20,000)은 J.Pato et al., Makromol. Chem. Rapid Commun., 3, 643(1982)에 의한 방법에 따라 준비한다. 용액은 건조 디메틸포름아미드내 중합물질 200㎎을 용해시켜 준비한다. 1㎖ DMSO 에 용해된 1x10.-4몰 퓨로마이신과 1x10.-4몰 N-(2-아미노에틸)메조클로린 e6-아미드를 공중합물 용액에 첨가하고 40℃에서 3시간 반응 시칸다. 반응산물은 침전에 의해 디에틸에테르에서 분리시키고 진공하에 건조시킨다. 중합물-약물 결합은 온수에서 용해시켜 반응안된 무수기를 가수분해시킨다. 용액을 냉각시켜 물에 대해 비스킹 투석 튜브에서 72시간 투석시키고 냉동건조시킨다.

[실시예 16]

광물리적 분석

여기상태결정의 직간접 방법은 프리 ce6와 비분해성 중합물-Gly-ce6(공중합물 IIIb)의 광물리적 특징을 비교하여 실시한다. 시간에 대한 형광 측정은 CFKR에서 실시되었다(University of Texas at Austin using a single photon counting technique(Atherton et al., J. Phys. Chem., 93, 6809(1989)) 삼중항-일중항 차이 스펙트럼과 3중항 시간을 결정하기 위해 온라인-섬광 역학 스펙트로포토매트를 이용하였다. 여기는 Quantel YG 481 Q-switched NdiYAG 레이져를 이용하였다. 1중항 산소발생의 양자량은 이중산소가 있는 대기에서 감광성 물질의 355㎚펄스 레이져 여기에 의해 이동안 1중항 산소(1270㎚)의 발생에 의해 결정한다.

간접적인 방법에서 산소 흡수 양자량은 기록 산소전극 시스템에서 산소의 농도가(초기산소분자의 흡수률)/(초기 양자의 흡수률)의 비로써 감소되는 것을 측정한다. 반응혼합물에는 기질로써 감광성 물질과 푸르푸릴 알코올이 포함된다. 푸르푸릴 알코올은 화학적으로 일중항 산소와 효과적으로 반응하기 때문에 선택된다(속도상수 1.2x10.8) 또한 과산화수소와 과산화물과는 반응하지 않는다. 그리고 초기에 라디칼 자기산화를 하지 않는다(Maurette et al., Helv. Chim. Acta, 66, 722(1983) and Haag et al., Chemosphere, 13, 631(1984)). 반응 혼합물은 407㎚간접필터(50% 피크 전도에서 밴드폭이 10±2㎚)가 있는 500w 슬라이드 영상기에 의해 조도하여 시간에 따라 감소되는 산소의 농도를 기록한다. 입사광 에너지는 표준 램프로 계산되는 진공 온도계 밀리마이크로볼트메터에 의해 측정한다. 입사광은 2nW/cm.2이다. 흡수한 광의 분절은 실리콘 광전극 포토메터에 의해 결정한다. 표준 로즈 벵갈을 이용하여 푸르푸릴 알코올 농도에서 산소 흡수치의 양에서 일중항 산소발생량을 측정할 수 있다. 이 과정은 곁사슬에 글리신만을 가지는 중합물-Gly-ce6의 것과 산소발생양의 차이를 비교하기 위해 중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6(공중합물II)를 이용하여 반복한다.

일중항 산소발생

1g 일중항 산소발생의 직접적인 증거는 이중수에서 인산나트륨 완충액(pH 7.4)에서 30μ몰 ce6 또는 중합물-Gly-ce6의 355㎚에서의 여기와 1270㎚에서의 발생에 의해 측정된다. IR발생은 ce6와 중합물-Gly-ce6의 수명이 54.4±1.5㎲로 1차 진행에 의해 붕괴된다. 이값은 중수에서 일중항 산소 붕괴의 55㎲의 값의 범위내에 있다. ce6, 중합물-Gly-ce6(공중합물IIIb)와 푸르푸릴 알코올 농도에 대해 로스벵갈 감광된 푸르푸릴 알코올의 광산화 동안에 산소의 양이 최대에 도달하게 되고, 500mM푸르푸릴 알코올에서 벗어나게 된다. 생성된 모든 일중항 산소는 이범위에서 푸르푸릴 알코올에 의해 억제된다. 이 범위에서 산소의 흡수량과 로스뱅갈에서 발생된 일중항 산소의 양의 비는 중합물-Gly-ce6의 일중항 산소발생의 양의 계산에 의해 가능하다(표1).

100mM푸르푸릴 알코올 농도에서 PBS에서 중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6(공중합몰 II) 산소흡수량은 중합물-Gly-ce6(공중합몰 IIIb)(산소흡수량 0.1)보다 약간 낮은 0.06으로 나타났다. 그러나 GAB를 첨가하는 경우에 GAB가 첨가되어 측정된 ce6와 중합물-Gly-ce6의 값과 비교하여 0.39로 증가된다.

이 데이타에서 광역학 효과를 가지기 위해 공중합물로부터 절단될 필요가 없다. 그러나 ce6에 결합된 공중합물의 용액 특징은 일중항 산소발생양에 크게 영향을 준다. 중합물-Gly-ce6은 약물만 있는 경우보다 인산나트륨 완충액에서의 일중항 산소발생량이 훨씬 낮다. 양쪽 모두에 계면활성제(CTAB)의 첨가는 소량으로 ce6의 양을 증가시켜 중합물-Gly-ce6의 일중항 산소의 양을 증가시킨다. 이는 중합물-Gly-ce6이 이 계면활성제가 첨가될때 단량제 반응이 약간 일어나기는 하나 약물만의 경우보다는 완충액에서 응집이 더 잘 일어난다. 응집의 증거는 ce6과 비교하여 완충액에서 중합물-Gly-ce6의 형광 스펙트럼의 흡수 스팩트럼과 소멸의 피크에서 볼 수 있다(더 적고, 더 넓은 피크), 소수성 ce6으로 수용액에서 소량의 응집이 형성된다.

3중항 특성

통상적으로 생물학적 시스템에서 산소를 요구하는 감광성 반응은 수명이 긴 감광성물질의 삼중항 상태로 인하여 가능하다. 3중항-1중항 차이 스펙트럼은 인산완충액(pH 7.4)에서의 ce6또는 중합물질-Gly-ce6의 흡수도를 1.2㎲ 동안 측정하고, 이어서 공기에서의 355㎚를 측정한다. 가장 유용한 3중항 흡수피크는 430㎚이다. 감광물질의 3중항 수명은 아르곤에서 이 파장으로 측정한다. ce6의 경우 400㎲이고 중합물-Gly-ce6의 경우 450㎲이다.

광표백

ce6와 중합물-Gly-ce6(공중합물 IIIb)의 광표백량은(초기감광물질의 사라지는 속도)/(초기 광자의 흡수속도)로 측정한다. 분자의 소멸은 다양한 시간간격으로 광산화실험에서 사용되는 407㎚밴드패스 필터와 동일한 500㎽램프로 조도하여 모니터한다. 에러범위는 5-10%이다.

표2에서는 다양한 반응조건에서 ce6의 중합물-Gly-ce6(공중합물 IIIb)의 양을 나타낸다.반응혼합물은 공기에서 감광물 5㎛(0.22mM 산소)와 100mM 인산나트륨 완충액(pH 2.4)이 된다. 감광물 60% 이상이 표백될때까지 1차 역학이 된다. 광표백 동안에 가스 스펙트럼에는 새로운 피크가 나타나지 않았다. 거대사이클이 파괴된다. 푸르푸릴 알코올은 콘트롤의 약 50%의 양으로 감소되는 동안 별영향을 가지지 않는다. 그러나 CTAB는 ce6의 광표백을 저해한다.

한편, 중합물-Gly-ce6 의 광표백은 1차 역학을 허용하지 않고 ce6의 20%만 생산한다. 유사하게 가시 스펙트럼내에 새로운 피크도 나타나지 않는다. ce6의 결과와 비교할때 중합물-Gly-ce6의 생성량은 다소 증가하고 계면활성제(CTAB)는 약간 광표백을 저해시킨다.

광표백은 PDT에서 사용되고 광은 PDT가 효과를 발휘하는 후에 성분물이 광분해되는 것과 같이 종양조직에 깊이깊이 침투한다. 종양에서 감광성 물질이 활성화된다. 상층에 다량의 감광성 물질이 많을 경우 광을 흡수하고 종양으로 빛의 침투를 저해시킨다.

[실시예 17]

중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6와 카테프신B로부터 ce6의 분리 소지라에서 분리한 리소좀 시스테인, 카테프신 B의 활성을 특징화시키기 위해 예비실험을 실사하였다. 물과 상각 상수 ε281=5.15) x 10.4 1/mole.cm(0.09M 인산완충액, pH 6)은 분광광도계로 결정한다(MW=28,000(Pohl et al. PEBS Lett., 23, 142(1982)). 다양한 농도의 효소는 충분한 활성이 있는지를 검사하였다. 기질로써 0.53㎎ 카테프신 B(19μ몰)와 1.54㎎(5μ몰) 글루타티온과 1.0㎎(0.025㎖ 40㎎/㎖ DMF)(2.3m몰)0Nα-벤조일-L-아르기닌-p-니트로아닐리드(BAPNA) 농도의 반응 혼합물을 사용하였다. 인산완충액(0.09M pH6)은 N2로 초기에 충전시킨다. 용액을 준비하고 얼음에 유지시킨다. 효소, 글루타티온, 완충액 혼합물을 5분간 N2로 충전시킨다. 용액은 효소결합부위를 활성화시키기 위해 글루타티온으로 5분간 37℃에서 미리 침전시킨다. 기질(BAPNA)는 신속히 첨가하고 410㎚에서 흡수도를 기록한다. 이 농도는 효소활성 A410/10분=1.76이 된다. 중합물에 사용될 수 있는 반응조건을 모방하는 활성을 검사하기 위해 완충액에서 효소와 글루타티온은 120시간(37℃)에서 배향시키고, 기질은 첨가시키고 410㎚에서 흡수도를 감지한다. 효소는 68%활성을 가진다.

중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6(공중합물 II)의 절단특징을 조사하기 위해 우선 상이한 효소의 중합물 농도를 비교하여 최상을 선택한다. 중합물(1.9㎎/㎖ 인산완충액) 효소(2.12㎎/㎖ 인산완축액)와 글루타티온(15.36㎎/㎖)의 원액을 준비한다. 다시 완충액은 N2로 충전시킨다. 원액효소(0.25㎖)와 0.4㎖ 완충액은 5분간 얼음에서 N2로 충전시킨다. 글루타티온(0.1㎖)을 첨가하고 37℃에서 5분간 침전시킨다. 원 중합물(0.25㎖)은 첨가하고 시료는 N2로 충전시키고, 밀봉한다. 이와 같은 방식으로 5가지 시료를 준비하고, 4, 8, 12, 24, 49 시간동안 암시에서 37℃에서 배양시킨다. 각시간별로 반응혼합물(0.95㎖ + 1.55㎖ 물)을 물로 충전시킨 PD-컬럼에 얹고 1㎚씩 수득한다(컬럼은 중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6와 ce6으로 충전시킨다). 중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6은 분류 1-3에서 용출시키고 약물은 분류 1-10에서 용출시킨다. 분류 10 이후에 컬럼에 비특이적으로 결합된 ce6를 유리시킨후에 1N수산화나트륨 1㎖를 첨가한다. 각 분류의 1/2㎖를 큐벳에 넣고, 50㎕ 10% 트리톤 x-100을 첨가한다. 398㎚에서 흡수도를 기록하고, 각 샘플에서 ce6의 절단% 를 기록한다(콘트롤, 중합물-Gly-ce6, 공중합물은 절단이 일어나지 않는 동일한 조건에서 연구한다).

절단실험의 결과에서 ce6은 중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6으로부터 절단된다. 120시간에서 87.5%가 절단된다. 분류7-10(ce6에 상응)의 흡수는 분류1-4의 흡수(중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6에서 감소량에 상응)의 동시 감소와 함께 증가된다. 중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6의 농도감소와 ce6의 증가와 정확한 값은 계산된다. 회수물은 각 시료에서 계산되고, 모든 샘플에서 100%내에 있다.

카테프신B의 절단후에 중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6의 산소흡수량

ce6이 결합된 중합물과 생체내에서 분해되는(공중합물II)와 분해되지 않은(공중합물 IIIb) 공중합물을 비교하는 광물리학적 분석결과는 카테프신B에 의한 효소적 ce6의 유출 전후에 분해되는 공중합물(공중합물 II)의 광물리적 특징을 비교하는 연구에 선행된다. 이 실험을 위해 세가지 시료를 준비한다. 이 실험에서 전술한 실험과 동일한 방식으로 원액농도와 반응혼합물을 준비한다. 두 샘플에서 원액을 혼합하고 반응은 암실에서 2일과 1주일 동안 진행시킨다. 나머지 시료는 콘트롤로 사용한다. 부분적으로 배양하는데, 효소와 기질은 2일간 별도로 배양한다. 광물리적 분석전에 혼합된다. 산소 흡수 측정은 실시예 16에서 전술한 방법에 따라 푸르푸릴 알코올 광산화를 이용하여 만든다. 시료 250㎕를 3,75㎖인산완충액(pH6)으로 희석시키고 100mM푸르푸릴 알코올을 첨가한다. 용액은 공기로 포화시키고, 산소전극을 준비한다. 산소농도의 감소는 시료에 빛(470㎚)을 조도하는 시간에 비례하여 측정한다. 시료의 산소흡수양은 표준으로 로스벵갈의 값; 0.375(산소흡수량)과 0.75(중항산소발생량)을 이용하여 계산된 1중항 산소의 양에서 계산될 수 있다.

절단후에 광물리적 특징

시험관 절단연구에서 ce6 절단과 중합물-Gly-ce6(표1)과 비교하여 ce6으로부터 일중항 산소발생의 다량을 만드는 광물리적 연구결과에 따라 48시간 카테프신B로 배양된 중합물(공중합물II)에서 측정바로전에 효소와 중합물을 혼합한 경우의 용액에서 보다 약 5배 많은 일중항 산소발생을 나타내었다. 1주일 배양뒤에 생성량은 ce6의 경우와 비슷하다. 산소흡수량을 나타내었다.

산소흡수량은 48시간과 1주일간 동안 카테프산B로 배양한후 중합물-Gly-ce6 반응혼합물에서 측정하는 연구에서 절단시간에 대해 그 량이 증가하는 것을 볼 수 있다. ce6이 중합성 운반체로부터 분리시킬때 광물리적 특징은 용핵내에 약물만 있는 경우와 유사하다. 이는 생체내에서 분해성과 비분해성 공중합물에서 나타내는 PDT의 증가된 항암효과를 설명한다. 공중합물은 라이소좀의 낮은 pH에 대한 함수로써 응집하는데, 이는 약물보다 다소 그 정도가 크고 이때 약물은 다소 응집된 상태가 된다. 한편, 응집보다는 구조적 변화가 약물과 공중합에 결합된 약물의 일중항 산소발생의 상이한 값의 책임이 있다. 그러나 이와 같은 차이는 광분산 실험과는 다소 구별된다. 이는 비분해성 중합물-Gly-ce6이 공중합물의 강화된 분포 보유특징에 기초하여 ce6의 것과 비교하면 다소 종양억제효과가 왜 적은지를 설명한다. 그러나, 효과적인 PDT에서 소요의 농도로 ce6의 불용성으로 인하여 중합물-Gly-ce6과 약물의 PDT효과의 비교는 부적절하다. 또한 종양에서 ce6과 중합물-Gly-ce6의 최대농도에서 상이한 흡수시간을 나타내는 흡수특징의 차이는 종양 자극 이전에 상이한 지체시간의 사용이 필요하다.

생체내 연구

신경아세포종은 15세 이하의 아동에서 전단되는 암의 약 8%에 해당된다. 대부분이 5세 이하여 아동이며 대부분은 진단시에 전이성질환(50%는 유아이고, 75%는 어린이)이다. 예후는 환자의 나이, 전단시의 질병상태, 나이가 든 환자, 임파구연관여부등을 포함한 다양한 요소에 의해 달라진다. 신경아세포종은 초기 발생시에 신경관에서 이동되는 교감신경 산성세포에서 형성된 교감신경에서 발생된다. 이것의 기원으로 인하여 많은 위치에서 다양하게 발생될 수 있다. 교감신경계를 따라 어떠한 위치도 신경아세포종의 발생부위가 될 수 있다. 이와 같은 종양의 통상위치는 복부의 부신(40%) 또는 경척수 신경절(40%)이 된다. 또한 흉부(15%)와 골반(5%)에도 나타난다. 종종 신경아세포종이 안와골 전이를 나타내는 경우도 있다(DeVita et al., Cancer Principles and Practice, Vol. 2, 3rd ed., pp. 1624-1631(1987) 종양치료요법에서 신경아세포종은 나쁜 여부를 가진다. 종종 고수로 전이되어 감지하기가 어렵다(Chadwick et al., in Receptors in Tumor Biology, pp. 169-188(1986)).

신경아세포종은 종양절개로 처리한다. 신경아세포종의 독특한 특징은 자발적으로 퇴행하는 능력이 있다는 것이다. 종양절개후 남아있는 종양에서 재발은 거의 드문현상이다.(Devita et al., supra). 신경아세포종을 절개할 수 없는 위치, 부분적인 신경아세포종의 경우 종양절개와 화학요법을 복합해서 사용한다. 화학요법(약물의 복합물)은 질병이 파급된 경우에 사용한다. 화학치료요법제로는 사이클로포스파미드, 독소루비신(아드리아마이신), 시스플라틴, 테니포시드, 에토포시드, 빈크리스틴과 다카르바진이 사용된다. 방사선 요법이 이용될 수도 있다.

신경아세포종의 분자유전학은 다른 사람의 암보다 덜 알려져 있고(DeVita et al., supra), 암세포표면에 대해서도 공지된 바가 없다. 단클론 항체는 진단과 치료를 목적으로 사람 신경아세포종 세포의 표면에 항원에 대해 나타난다. 1311-결합된 단클론 항체는 확산된 질환에 효과가 있는데 종양이 큰 환자의 경우에는 효과가 없다(DeVita).

Roth et al., J. Neurochem., 42, 1145(1984)에서 쥐C1300 종양(N18TG2)에서 유도한 신경아세포종의 클론은 아데닐레이트 사이클리제에 결합된 특이적 시크리틴 수용체를 가진다. 시크리틴은 위장에서 발견되는 27아미노산 호르몬으로 취장액 분비를 조절하고 다음과 같은 서열을 가진다.

그러나, 신경조직에서 시크리틴의 중요성은 공지되어 있지는 않지만, 신경아세포종 세포는 뉴우런에서 아데닐레이트 사이클 과제와 연관된 펩티드 수용체의 특이성 연구의 모델로 사용된다. 시크리틴의 크기는 항체 표적물과 비교할때 고형종양에 침투를 허용하는 것으로 나타났다.

뉴로 2A 신경아세포종 세포주는 이것이 고형으로 A/J 쥐에서 종양치료가 어렵기 때문에 설명한 목적으로 사용된다. A/J쥐(5-6주 쥐)는 우측 늑골에 1.5 x10.6 C1300, 신경아세포종 종양세포에 지속적으로 주입한다. 종양이 뚜렷해지면 치료를 시작한다. 치료와 콘트롤 집단은 집단당 5마리쥐로 구성된다. 약물은 PBS에 용해시켜 IV로 쥐의 꼬리정맥에 주사한다. ㎎/㎏ 약물양으로 표시되는 약량은 공중합물에 결합된 약물의 중량%에 기초하여 계산된다. 화학적 치료요법제로 콘트롤과 치료의 경우에 종용용적, 길이, 높이, 폭을 계산한다.

광역학적 치료에서 약물주입후 지연시간은 60㎚(아르곤 레이져)를 제공한 후 위치/보유실험으로 결정한다. 몇종의 실험에서 적절한 빛과 약의 양을 결정할 수 있다. 항암효과는 종양 크기를 측정하여 평가한다. 아드리아마이신의 효과를 나타내고, 광을 제공하기전에 감광성물질에 대해 효과를 가지도록 시간을 지연시킨다.

[실시예 18]

화학요법

중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-아드리아(7.4wt% 아드리아 마이신, HCl)(공중합물I)은 종양 감소효과를 설명하는데 이용된다. 모든 실험은 4.1㎎/㎏, 8.2㎎/㎏, 16.4㎎/㎏의 아드리아마이신 농도에서 콘트롤과 공중합물I으로 구성된다. 약물은 제균성 염에 용해시키고 꼬리정맥으로 IV주입시킨다. 종양성장은 종양용적을 기록하여 실시한다. 치료일은 0에서부터 시작하여 종양이 콘트롤과 구분할 수 없을때까지 종양 용적을 계산한다. 치료후 55일 까지 지속된다.

다양한 약량범위에서 종양용적/시간에 대해 결과를 표4-6에 나타 내었다.

표6에서 보는 것과 같이 16.4㎎/㎏의 양은 종양의 치료에 100%효과가 있었다. 이 집단의 모든 쥐는 종양이 제거되고, 희생 시킬때까지 약 55일간 건강을 유지하였다(동시에 이 약은 쥐에 독성이 된다), 4.1㎎/㎏ 양의 집단은 콘트롤과 비교하여 실제적인 효과가 없었다. 8.2㎎/㎏양은 종양억제에도 다소 효과가 있으나 완치는 되지않았다. 종양성장은 약 5일경에 억제되었고, 10일경, 종양은 콘트롤과 동일한 속도로 성장하였다. 8.2㎎/㎏ 농도는 혼합실험에서 이용된다.

아드리아마이신(독소루비신, NSC 123127)에서 약량 제한 부작용인 축적된 약량의존성 심장병을 나타내었다. 이는 자유로운 상태에서 장시간 사용을 제안하는 것이다. 독성은 아드리아마이신 16.4㎎/㎏ 사용시에 나타났으나, 이양의 중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-아드리아에서는 종양이 감소되었다. 더높은 양에서도(20㎎/㎏) 약물은 100% 치사율을 나타내었다. 에양은 처음 몇일간 쥐의 체중감소를 유도했으나, 중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-아드리아 주입후 다시 증가하였다.

[실시예 19]

집적/보유실험

집적/보유실험은 비분해성 중합물-Gly-ce6(11.2wt% ce6)(공중합물 IIIa)와 분해성 중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ceo6

(공중합물II)의 흡수율에 비해 메조-클로린 ce6모노에틸렌 디아민디소듐염(ce6)의 흡수를 비교하기 위해 실행한다. 각 약물 5㎎/㎏을 C1300 신경아세포종 종양을 가지는 A/J 쥐의 꼬리정맥에 주사하였다. 약물은 pH7.4 에서 PBS에 우선 용해시킨다. 중합성 약물은 일반 약물보다 PBS에 용해성이 크다. 일반 약물을 용액에 넣기 위해 pH를 상승시키거나 또는 용액을 암실에서 가열시키고, 주입전에 실온으로 냉각시켜 즉시 주입시킨다.

중합물-Gly-ce6(공중합물 IIIa)/ce6집적/보유결과

언급한 바와 같이, 종양이 커지면 쥐에 5㎎/㎏ ce6 또는 중합물-Gly-ce6을 주입한다. 동물을 죽이고 조직시료(종양, 피부, 지라, 다리근육, 신장, 복부근육, 간)을 주입후 다양한 시간간격으로 떼어낸다. 샘플은 2일간 냉동건조시키고, 건조된 시료의 무게를 잰다. 조직은 기계적으로 균질화시키고, 100㎕균질화액을 가수분해 튜브에 넣는다. 메탄올에 5%메틸벤제토니움 하이드록시는 각 튜브에 넣고 튜브는 비운다. 시료는 55℃에서 1시간 동안 히팅블럭에서 가수분해시키고, 냉각후에 2㎖ 50% THF/물을 첨가한다. 혼합후에 형광을 읽고(EX 397, EM654)시료에서의 ce6 농도의 계산을 위해 표준곡선과 비교한다. 일반약물은 48시간뒤에 중합물은 높은 농도로 남아있는데 비해 1시간 뒤 종양조직에서 최대농도가 된다. 그 결과는 표7~13에 나타낸다:

또다른 실험에서 조직시료를 5일 뒤에 중합체와 함께 취하였다. 종양에서 ce6의 농도는 28㎎/㎏조직이었다.

중합물 Gly-Phe-Leu-Gly-ce6(공중합물II)/일반 ce6 집적/보유결과

중합물-Gly-ce6(공중합물IIIa)의 동일한 과정으로 집적/보유 과정을 중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6(11.2wt% ce6)(공중합물II)를 사용한다. 비분해성 연구결과와는 대조적으로, 분해성 중합물은 48시간에 종양에서 ce6함량이 급격히 감소되고 120시간에 완전히 제거된다. 이 연구에서 종양세포에서 중합물로부터 ce6 절단증거를 보여주고 몸이 ce6을 제거하는 능력을 보여준다.

결과는 표14내지 표20에 나타내었다.

생체내에서 분해성 중합물(표4)와 집적/보유실험은 미분해성 중합물과 비교하여 종양조직으로부터 ce6의 신속한 제거를 보여준다(표7). 이와같은 동일한 경향은 복근, 신장, 자라, 간, 다리근육과 피부조직에서 볼 수 있다(표15~20과 표8~13 비교). 생체내에서 제거속도는 상이한 올리고펩티드 스페이스의 이용에 의해 조절할 수 있다. 분해속도가 느린 것을 원하는 경우(3~4일), 종양에 의한 공중합물 흡수가 일어나지 않고, 종양자극전에 신체에서 제거된다. 또한 주사와 자극 사이의 긴 지연시간은 아드리아에서 일어난다.

감광물질에 대한 중합체 운반체의 사용은 치료후 광에 대한 과민성 같은 부작용이 감소되고, 이는 표적물질의 사용없이 일반약물 보다 종양에 약물 결합된 중합물의 양이 더 크다는 것을 나타낸다. 여기에서 더 적은

양을 치료에 사용할 수 있고, 그리고 여전히 필요한 수준을 가진다.

[실시예 20]

광역학적 요법

몇가지 PDT실험이 실행되었다. 상이한 약량과 빛의 양이 적절한 치료섭생을 얻기 위해 연구되었다. 다양한 농도의 약물을 PBS에 용해시키고, 쥐의 꼬리 정맥에 주사한다. 흡수를 위한 특정시간뒤에 빛(650㎚)(아르곤 레이져)를 다양한 시간대에 종양에 제공한다(쥐는 나트륨 펜토바르비탈로 마취시킨다:원액 6.48㎎/mi; 0.013㎖원액/g 체내에 주입한다). 중합물-Gly-ce6 효과(공중합물IIIa)는 보통약물의 것과 비교한다. 그다음 중합물-Gly-ce6의 항암효과는 중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6(공중합물 II)의 항암 효과와 비교한다(일반 약물은 중합성 약물이 용해성이 없기 때문에 얻을 수 없는 동일농도에서 더이상 사용할 수 없다). 치료일은 0으로 한다.

중합물-Gly-ce6(공중합물 IIIa)와 ce6

ce6와 중합물-Gly-cet(11.2st%, ce6(4㎎/㎏)(공중합물 IIIa)의 광역학적 효과를 비교하기 위한 PDT 실험을 실시한다. 자극(500㎽/㎝2;5분)은 조직흡수를 위한 1 또는 24시간 뒤에 제공한다. 1시간 흡수를 위한 두 집단에 독성이 된다. 두 집단의 모든 동물은 빛의 제공에 의해 죽게된다. 그 결과는 표21에 나타내었다.

일반약물은 콘트롤과 동일한 특징을 가지나 공중합물IIIa는 약 3일간 종양억제력을 나타낸다. ce6와 중합물-Gly-ce6와 중합물-Gly-ce6의 소요의 농도에서 ce6불용성 사이에 적절한 종양 흡수력의 차이로 인하여 일반약물에 대해서는 더이상 연구하지 않는다.

중합물-Gly-ce6의 48시간 흡수와 자극(500㎽/㎝2;5분) 효과는 표22에 나타내었다.

중합물-Gly-cet(공중합물 IIIa)와 중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6; (공중합물II)

중합물-Gly-ce6(공중합물 IIIa)와 중합물-Gly-Phe-Leu-Glu-ce6(공중합물II)의 광역학적 효과를 비교하는 몇가지 실험에서 PDT가 실행되었다. 분해가능한 중합물(공중합물 II)가 가장 강력하다. 4㎎/㎏ ce6(24시간) 농도와 5분간 500㎽/㎠의 방사에서 분해가능한 집단에 60% 사망율이 나타났다(생검에서 간과 다른 내적 광역학적 손상이 나타났다). 비분해성 집단의 모든 쥐는 생존해 있다. 분백, 부종, 흑색 딱지 형성과 같은 효과는 비분해성 공중합물에 비교하여 분해성 공중합물을 이용하여 모든 실험에서 나타났다. 최상의 결과는 흑색딱지의 형성시에 나타났다. 이것이 발생되는 경우 대부분의 종양이 통상적으로 수일내에 사라진다.

분해성 공중합물(공중합물II)의 분명한 광역학적 효과로 인하여 모든 PDT 실험에서 중합물-Gly-ce6(공중합물 IIIa) 대신에 사용되었다. 다음단계는 최대효과와 쥐의 생존성을 최대로 하기 위한 변수에 도달하기 위해 적절한 약물(공중합물II)와 빛의 양을 조절한다. 빛의 양을 증가시키면서 최소의 약량으로 효과가 나타남을 볼 수 있다. 중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6(11.2wt% ce6)(공중합물 II): 4, 3.25, 2.5, 2와 1㎎/㎏ ce6(24시간 흡수)와 10분간 500㎽/㎠의 양을 비교할 수 있다. 2.5내지 4㎎/㎏ ce6의 양에서 20내지 100%의 다양한 생존율이 나타났다. 1㎎/㎏집단약량은 콘트롤과 비교하며 이빛의 량에서 실제효과가 없는 것으로 나타났다.

연구를 위해 중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6(공중합물II)(24시간흡수)의 2㎎/㎏ ce6의 량을 선택하였다. 20분후 집단에서는 60% 치사율이 나타나고, 5분후에는 별로 효과가 없었다. 그러나 실제적인 효과는 8분 20초, 10분, 13분 20초의 자극시간에서 얻을 수 있다.

치사율의 최상의 효과는 약량이 2㎎/㎏ 중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6(11.2wt% ce6)(공중합물 II)와 10분간 빛의 량이 500㎽/㎠인 것으로 나타났다. C1300 신경아세포종 종양을 가지는 A/J쥐 꼬리정맥에 공중합몰 II 2㎎/㎏으로 주입후 650㎚광으로 24시간 방사하는 경우에 시험결과를 콘트롤과 비교하여 표23에 나타내었다. 검은 반점 또는 표백은 모든 처리집단에서 나타났다. 3일 뒤에는 종양이 감지되지 않았다.

[실시예 21]

혼합형 화학요법의 PDT

이 실험에서 (1) 중합물-Gly-ce6(공중합몰 IIIa)와 중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-아드리아(공중합물I) 또는 (2)중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6(공중합물 II)와 중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-아드리아(공중합물 I)을 PBS에 용해시켜 종양이 있는 쥐의 꼬리정맥에 IV로 주사한다. 2일 뒤에 마취후에 중합물-Gly-ce6처방에 따른 빛을 제공하고(아르곤 레이져)(500㎽/㎠;5분) 하루는 이들의 집적/보유특정으로 인하여 중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6(500㎽/㎠; 10분)을 이용하여 허용한다. 약물 주입일은 0으로 하고, 치료일이 된다.

중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-아드리아(공중합물 I)와 중합물-Gly-ce6(공중합물 IIIa)의 혼합물

중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-아드리아(7.4wt% 아드리아마이신 HCl; HCl; 8.2㎎/㎏ 아드리아마이신, HCl)(공중합물 I)와 중합물-Gly-ce6(11.2wt% ce6; 4㎎/㎏)(공중합물 III)을 혼합하여 종양이 만져질때 IV주사한다. 종양에 방사한다(500㎽/㎠; 5분). ce6가 높은 정도로 있는 공지된 집적/보유실험으로 인해 아드리아마이신의 효과를 위해 최대의 지연시간을 허용한다. 60%치료률을 얻고, 치료는 실험이 종료되는 시점에서 54일까지 지속된다. 이 실험은 40% 평균 치료율을 가진다. 화학적 요법과 PDI 복합은 약물만을 사용하는 것보다 효과적이다.

중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-아드리아(공중합물 I)와 중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6(공중합물 II)의 혼합물

기존의 PDT 실험에서 2㎎/㎏ 의 중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6(공중합물 II)이 효과가 있으나 8.2㎎/㎏, 중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-아드리아(공중합물I)을 복합 사용하는 경우에는 독성이 있는 것을 알 수 있다. 그러므로 중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6 양을 1.5㎎/㎏ 으로 감소시킨다. 복합 실험은 1.5㎎/㎏ 중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6와 8.2㎎/㎏중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-아드리아를 사용하여 실시하였다. 2의 흡수시간(24와 48시간) 방사(500㎽/㎠/10분)를 조사하였다. 48시간 흡수집단은 최소의 효과를 나타내고, 24시간 흡수집단은 실제효과를 나타낸다. 80% 치료들을 이집단에서 얻는다(48일경에 희생시킨다).

중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-아드리아를 혼합하여 48시간 흡수시킨 결과에서 24시간 흡수시킨 것과 비교하여 상당한 차이가 있음이 나타났다. 종양파괴의 감소는 종양의 절단의 간접적인 증거이다. 절단은 내피세포 종양 모세혈관에서 일어나고, 이와 같은 모세혈관의 파괴는 종양이 영양물을 섭취하는 것을 방해하여 종양의 파괴를 유도한다. 그러나 내피세포에서 트랜스 사이토시스의 발생은 종양세포에서 실제 절단이 일어나고, 이와 같은 파괴가 종양의 죽음의 원인이 된다. 몇몇 중합체 물질은 내피세포에서 라이소좀 루트를 피하지 못하고, 종양 파괴에 공헌한다.

분해성(중합물-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6)와 비분해성(중합물-Gly-ce6)공중합물의 경우에 동일량으로 PDT 또는 화학요법의 단독 사용한 경우보다 중합물-Gly-Phe-Leu-Glu-아드리아 혼합물의 복합요법이 더 효과적으로 나타났다. 복합요법에서 이 두약물의 부작용을 해결할 수 있다.

[실시예 22]

복합 공중합물

복합 공중합물(공중합물 IV)는 PBS에 용해되고, 종양이 있는 쥐의 꼬리 정맥으로 IV주입한다(3.5㎎/㎏ 아드리아 마이신; 1.7㎎/㎏ ce6) 650㎚광을 주입후 (아르곤 레이져)(500㎽/㎠;10분)24시간 지연시킨다. 종양 용적은 치료일(약물 주입일을 기초하여 모니터 한다. 이 실험에서 복합 공중합물은 실제 광역학적 효과를 보여주지는 않는다. 그러나 이는 복합공중합물(공중합물IV)가 활성 에스테르가 7.8몰%를 포함하는 전구물질에서 합성되는 것을 기초로하여 설명된다. 이 공중합물에는 약 0.9몰%(4.2wt%)ce6 와 2.0몰%(7.25wt%) 아드리아 마이신이 포함된다. 본 공중합물과 과정을 이용하여 공중합물 혼합물과 공중합물의 용해도를 보유하는 것을 이용한 실험을 기초하여(이는 중합물 사슬당 ce6 1분자를 가지기 위해 30wt% 아드리아마이신에 상응한다). 아드리아마이신 대 ce6의 비가(5.5:1wt비)로 단일 공중합물에 사용될 수가 없다. 이 비는 PBS에 용해도 보유된 곁사슬 함량이 불가능하다. 그러나 효과는 중합물의 용해도를 증가시키고 이는 중합물의 부하를 허용하여 다른 물질과 아드리아마이신에 대한 ce6의 비를 얻을 수 있다.

공중합물IV가 소요의 아드리아마이신;cd6의 비를 가지지 못하나 생체내에서 치료요법 효과는 ce6가 약 1.7㎎/㎏으로 주입되는 경우 아드리아마이신이 (소량) ce6의 치료효과를 증가시키는지를 검사하였다. 2㎎/㎏ ce6의 양이 초과하지 않았기 때문에(콘트롤 연구에 따라) 실제 아드리아마이신의 양은 3.5㎎/㎏이 된다. 또한 이 공중합물은 중합물 사슬당 평균 1분자 이하의 ce6을 보유하기 때문에(특정 사슬에는 하나 이상의 ce6분자보유). 중합물 사슬당 한분자 이상의 아드리아마이신을 보유한다(이와 같은 계산은 중합물의 분자량의 분포에 기초한 것으로, 이값이 반드시 정확한 것은 아니다). 이와 같은 반응은 소량의 아드리아 마이신의 결과이고, 모든 중합물 사슬에 ce6가 결합되어 있지는 않고 이 두 약물의 활성은 상이한 공중합물에 결합된 약물과 간접적으로 비교할 수 없다(추가연구에서 약물이 다른 것에 절단을 보여주지는 않는다). 또한 이와 같은 공중합물은 라이소좀 효소에 의해 공중합물로부터 약물의 절단속도에 효과를 가지는데 사용되는 콘트롤 공중합물 보다는 비분해가 잘되는 곁사슬을 포함한다.

소요의 아드리아:ce6 분자량 비와 공중합물을 부하할 수 있는 가능성이 있기 때문에 단일 사슬내에 결합된 두 약물과 단일 공중물을 가지는 목적에 위배되는 중합물 사슬당 1분자 이하의 ce6의 분자가 된다. 그러나 큰 동물모델의 경우에 동일 중합물에 결합된 두 개의 약물비를 좁히고, ce6의 %를 증가시킬 수 있다. 이 문제의 또다른 해결방식은 하나의 공중합물에 두가지 항암제의 광활성 약물(가령 아드리아마이신과 ce6을 포함하는 것과 하나의 항암제를 포함하는 또다른 공중합물의 혼합물을 이용하는 것이다. 가령 공중합물 I와 공중합물 IV의 혼합물, 각각은 동일한 표적물질을 선택적으로 포함하고 있고, 동시에 주입되어 소요의 아드리아와 ce6의 비를 제공한다. 유사하게, 항암제 또는 광활성 약물을 포함하는 공중합물 IV와 또다른 공중합물을 복합하여 공동주입되어 하나의 생활성 물질과 다른 것의 소요의 비를 제공한다. 두 가지 생체활성 물질을 포함하는 복합 공중합물은 소요의 항암효과를 제공하기 위해 제조될 때 이용될 수 있다.

[실시예 23]

시크리턴과 중합물-Gly-ce6의 수용체 중개형 표적

시험관에서 C1300(Neuro 2A) 신경아세포종에 대해 타겟형 공중합물V[중합물(시크리틴)Gly-ce6]와 비타겟형 공중합물 IIIa(p-Gly-ce6)의 PDT특징을 비교하는 연구가 실행되었다. 뉴론 2A세포(2x105 세포/웰)을 200㎕ DMEM(12% 태아소혈청)(MEM)에 플레이트하여 24시간 96웰 배양시키고, 단층을 형성시켜 세포에 대한 이들 수용체를 발생시킨다. MEM 100㎕를 뽑아내고, 100㎕시료(타겟과 넌타겟)을 최종농도 25㎕ ce6/㎖ MEM이 되도록 첨가한다. 세포는 1.5시간(37℃, 5% CO2)에서는 시킨다. MEM을 제거하고 세포는 200㎕ HBSS로 1회 세척한다. 상층액은 제거하고 200㎕ MEM을 첨가한다. 세포는 적필터가 갖추어진 램프로 15,30,45분(650㎚; 15㎽/㎠)에서 방사시킨다. 방사후에 플래이트는 18시간(37℃, 5% CO2)에서 배양시켜 비가역적 처리한다. 10㎕(5㎎/㎏) MTT(3-4, 5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디테닐 테트라졸리움 브로마이드)(Sigma)[Mosmann, J. Immunol. Methods, 65, 55(1983) and Twentyman et al., Br. Cancer, 56, 279 (1987)]을 첨가한다. 플레이트는 4시간 배양시킨다(3℃, 5% CO2) 그 다음 175㎕상층액을 빼내고, 정체 포르마진 결정이 흔들리지 않도록 유의한다. 200㎕ DMSO를 각 웰에 첨가시키고, 용액은 1x 재현탁시킨다. 흡수도는 ELISA 플레이트 리더(5700㎚ 필터)에서 읽는다. 콘트롤 플레이트는 암실에 유지시킨다.

시크리턴 타겟형 공중합물

상이한 방사시간(15, 30, 45분) 신경아세포종에서 중합물-Gly-ce6(공중합물(IIIc)와 중합물(시크리틴)-Gly-ce6(공중합물V)(25㎍ ce6/㎖ 배양농도 1.5시간)의 PDT효과를 비교하는 결과를 계산하였다. 570㎚에서의 흡수는 간세포의 미토콘드리아 디하이드로게나제가 MTT가 청색 포로마잔 산물로 환원되기 때문에 간세포의 수와 비례한다. 그 결과는 표24에 나타낸다.

중합물-Gly-ce6(공중합물 IIIc)은 이 농도에서 효과가 없었고, 타겟형 공중합물(공중합물V)는 방사시간이 세포독성 효과와 비례하는 것으로 나타났다.

두번째 연구는 RIF(방사 유도된 섬유아육종)을 콘트롤로 사용하였다(시크리틴 수용체의 존재의 증거는 나타나지 않는다). 두개의 상이한 배양시간(15분, 45분)의 각 세포주의 상이한 세포수를 조사하였다. RIF 콘트롤에서 5x104세포/웰와 1x104세포/웰의 뉴로 2A 세포주에서 높은 밀도와 2x105 세포/웰과 낮은 밀도의 5x104 세포/웰을 연구하였다. MTT 배양기간은 2시간으로 짧게하여 ELISA 리더에서 오프스케일의 흡수도를 제거하였다. 570㎚에 반하여 560㎚에서 흡수도만 읽는 상이한 ELISA플레이트를 사용한다. 그러나 이 콘트롤과 비교할만한 시료는 가지지 않는다.

콘트롤로 사용된 비특이적 세포주(RIF)(시크리틴 수용체 없음)의 결과를 하기의 표25, 26에 나타낸다.

공중합물 V와 공중합물 IIIc(25㎍ ce6/㎖ 배양농도) 모두 다 15분 방사하여 세포독성을 가지지 않는다. 이들 두 공중합물의 45분 방사경우 약간의 독성을 가진다. 타겟 공중합물은 세포면의 호르몬과 비특이적 상호작용 결과로 성능이 약간 떨어진다. 한편, 타겟형 공중합물은 낮은 세포밀도에서 특히 뉴로 2A 세포에 뚜렷한 시간에 비례하는 세포독성 효과를 가진다. 비타겟형 공중합물-Gly-ce6(동일 배양농도)는 방사시간에 대해 세포에 효과가 없었다. 이 결과는 표27와 28에 나타내었다.

공중합물 V와 공중합물 IIIc의 PDT효과를 비교하는 세포독성 검사 결과에서 이 연구에 사용된 뉴로 2A 종양세포주에 시크리틴 수용체가 있음을 나타낸다. 시험관내에서 선택적인 PDT 가 일어난다. PDT는 뉴로 세포주에 간세포에 급격한 감소와 비교하여 최장 방사시간(45분)에만 RIF세포주가 최소의 효과를 나타낸다.

전술한 타겟기작과 미국특허 5,037,883와 함께 시크리틴은 본 발명의 공중합물 복합에 대한 표적부분의 기능을 하게 하는 것으로 나타낸다.

본 발명은 실시예에 따라 상술되었다. 이는 본 발명의 설명을 위함이며 본 발명은 다음의 청구항과 이의 기능적 등가체에 의해서만 한정된다. 본 발명의 조성물은 사람을 포함한 온혈동물의 암조직 치료에 사용할 수 있다. 항암제 또는 광활성제 이건간에 활성물질은 본 기술분야에 숙지된 자에게 공지되어 있다. 가령 광활성 물질도 포르피린, 프탈로시아닌, 푸르푸린, 클로린, 나프탈로 시아닌, 양이온 염료와 테트라사이클린 등이 포함될 수 있다. 특히 광활성 물질은 클로린 유도체인 메조-클로린에 대해 설명한다. 본 발명은 신규한 치료요법적 약물을 제공하는 것은 아니다. 최대의 효과를 얻을 수 있는 세포 특정부위에서 이와 같은 약물을 최대로 이용할 수 있는 운반시스템을 제공하고, 다른 활성물질, 치환, 모방, 유도물질도 이용될 수 있으며 이는 본 발명의 영역내에 속한다.

Claims

공중합물 운반체에 부착된 항암제와 광활성 약물을 모두 포함하는 온혈동물의 암조직 치료용 조성물에 있어서;

(a) 항암제와 광활성 약물이 포함된 공중합물 운반체,

(b) 항암제 부착된 하나의 공중합물 운반체와 광활성 약물이 부착된 또다른 하나의 공중합물로된 공중합물 운반체 혼합물; 그리고

(c) 항암제와 광활성 약물이 모두 부착된 공중합물 운반체와 항암제의 광활성 약물 중 선택된 것이 부착된 또다른 하나의 공중합물 운반체의 혼합물로 구성되고 이때 항암제는 곁사슬에 의해 중합물 운반체에 부착되고, 이는 온혈동물에서 혈류내에서 안정되나 세포내의 라이소좀 효소에 의해 가수분해될 수 있으며, 중합물 운반체에는 표적물질이 선택적으로 포함될 수 있으며; 이때 중합물 운반체는 (i)50 내지 99.7몰% 유도안된 단량체 유닛, (ii) 2.0 내지 20.0몰%의 유도된 단량체 유닛으로 항암제와 광활성약물로 구성된 집단에서 선택된 것이 부착되어 있고; (iii) 0내지 94.8몰%의 표적물을 가지는 유도된 단량체 유닛으로 구성된 공중합된 단량체 유닛으로 구성되고; 이와 같은 중합물 운반체는 N-(2-하이드록시프로필)메트아크릴아미드(HPMA), N-메틸아크릴 아미드, N, N-디알킬아크릴아미드, 아크릴산, 메타아크릴산, 폴리아미노산, 폴리사카라이드, 폴리에틸렌옥시드서열을 가지는 공중합물과 폴리비닐피롤리돈 말레인 무수 공중합물로 구성된 집단에서 선택된 유도된 그리고 유도안된 공단량체 유닛을 포함하는 공중합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 항암제는 올리고 펩티드 서열 올리고 사카라이드 서열과 헥산과 유사한 구조에서 선택된 효소 분해성 곁사슬에 의해 중합물 운반체에 부착되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 중합물 운반체는 N-(2-하이드록시프트로필) 메타아크릴아미드(HPMA)의 유도된 그리고 유도안된 공단량체 유닛에서 만들어진 공중합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항에 있어서, 광활성 약물은 비분해성 스페이스에 의해 중합체 사슬에 부착되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항에 있어서, 광활성 약물은 올리고펩티드서열, 올리고사카라이드서열, 헥산과 유사한 구조의 집단에서 선택된 효소분해성 곁사슬에 의해 중합물 운반체에 부착된 것을 특징으로 하는 조성물.
제5항에 있어서, 항암제와 광활성 약물은

에서 선택된 올리고펩티드 곁사슬에 의해 중합물에 부착되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제6항에 있어서, 항암제는 아드리아마이신, 듀노마이신, 멜팔린, 불레오 마이신과 이 유도체에서 선택되고, 광활성 약물은 포르피린, 프탈로시아닌, 푸르푸린, 클로린나프탈로시아닌, 양이온염과 테트라사이클린과 이의 유도체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제7항에 있어서, 클로린 유도체는 메조-클로린 e6인 것을 특징으로 하는 조성물.