HUT68082A - Pharmaceutical composition for treating tumors - Google Patents

Pharmaceutical composition for treating tumors Download PDF

Info

Publication number
HUT68082A
HUT68082A HU9402142A HU9402142A HUT68082A HU T68082 A HUT68082 A HU T68082A HU 9402142 A HU9402142 A HU 9402142A HU 9402142 A HU9402142 A HU 9402142A HU T68082 A HUT68082 A HU T68082A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
gly
copolymer
polymer
phe
ceg
Prior art date
Application number
HU9402142A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9402142D0 (en
Inventor
Jindrich Kopecek
Nancy Krinick
Original Assignee
Univ Utah
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Utah filed Critical Univ Utah
Publication of HU9402142D0 publication Critical patent/HU9402142D0/hu
Publication of HUT68082A publication Critical patent/HUT68082A/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0071—PDT with porphyrins having exactly 20 ring atoms, i.e. based on the non-expanded tetrapyrrolic ring system, e.g. bacteriochlorin, chlorin-e6, or phthalocyanines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/811—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an inorganic carrier
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
    • Y10S530/816—Attached to the carrier via a bridging agent

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Processing Of Solid Wastes (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány tárgya neoplasztikus megbetegedések kezelése megnövelt gyógyászati hatékonyságú polimer gyógyszerkészítmények alkalmazásával. Ezek a gyógyszerkészítmények egy polimer kombinációból és a hozzá kapcsolt két vagy több különböző hatóanyagból állnak, amelyek közül egy fénnyel aktiválható. Kombináció alatt vagy két olyan kopolimer keverékét értjük, amelyek egyike egy fotokémiai szenzibilizátort (fénnyel aktiválható hatóanyag), másika egy antineoplasztikus hatóanyagot tartalmaz; vagy a kombináció alatt egyetlen kopolimert értünk, amelyben a fotokémiai szenzibilizátor és az antineoplasztikus hatóanyag ugyanahhoz a polimer molekulához kapcsolódik. Az ilyen kombinációk hasznosak neoplasztikus megbetegedések kezelésére. A polimerek tartalmazhatnak egy megfelelő, a megtalálást (célbajutást) elősegítő oldalláncot is. A fénnyel aktiválható hatóanyag akár nem bontható, akár enzimesen bontható kötéssel kapcsolódhat a polimer hordozóhoz. Az antineoplasztikus hatóanyag mindig olyan kötésekkel kapcsolódik a polimer hordozóhoz, amelyek stabilak a véráramban, de könnyen hasíthatok lizoszomális enzimekkel. Amennyiben a gyógyszerkészítményt így formulázzuk, mindkét hatóanyag majdnem egyidejűleg hatol be ugyanazokba a sejtekbe, mert mindkét hatóanyag eloszlása a testben általában azonos lesz. Ez alapvetően különbözik az olyan kombinációs terápiától, amelyben két kis molekulatömegű, polimer láncokhoz nem kapcsolt hatóanyagot alkalmaznak, mert ekkor mindegyik hatóanyag eloszlása más a testben. A sejt lizoszomális részének elérése után továbbá az enzimesen bontható kötéssel kapcsolódó hatóanyag a lizoszomális enzimek hatására felszabadul a hordozóról, és a lizoszomális membránon keresztül a citoplazmába diffundál. A fénnyel aktiválható hatóanyag inaktív marad a sejtben. Csak akkor aktiválódik, ha a megfelelő hullámhosszú fény éri (lézer vagy kemilumineszcenciás reakció vagy bármilyen más megfelelő fényforrás alkalmazható). Ennek a megközelítésnek az egyik fő előnye mindkét hatóanyag hatásának optimalizálása. Az első rákellenes szer (például adriamycin) felszabadulási sebessége lizoszomális enzimekkel való hasításnál az oldallánc szerkezetével, például az oligopeptid szekvencia megválasztásával szabályozható [Rejmanova, P. és munkatársai: Makromol. Chem., 184, 2009, (1983)]. Egy optimális időszak eltelte után fényt lehet alkalmazni, ami a fénnyel aktiválható hatóanyag aktiválódását váltja ki. Ez azoknak a sejteknek a pusztulásához vezet, amelyeket az első rákellenes hatóanyag nem pusztított el.
A találmányunk szerinti megoldás a lehető legkisebbre csökkenti a kemoterápiával szemben ellenálló ráksejtek mennyiségét, így lényegesen csökkenti a daganat kiújulásának lehetőségét. Ezzel a módszerrel növelhetjük a hatékonyságot a több hatóanyagnak ellenálló sejtek (multidrug resistant cells, rövidítése a továbbiakban MDR) kezelésében a jelenleg rendelkezésre álló terápiákhoz képest. Ennek a módszernek az alkalmazása esetén a hatóanyagok koncentrációja a sejtekben megnövekszik, még akkor is, ha a hatóanyagok bevitele a sejt belsejébe vagy az MDR sejtekbe romlik. Ha egy megfelelő, a megtalálást (célbajutást) elősegítő láncot (például a sejtfelszíni antigénekkel vagy receptorokkal komplementer szerkezetűt) is hozzákapcsolunk, akkor egy kombinált sejten belüli és sejten kívüli hatás növeli a hatékonyságot (a sejten belüli hatás a fent leírt mechanizmussal megy végbe, a sejten kívüli hatás a plazmamembránon zajlik le). A polimer hatóanyag az MDR-sejtek sejtfelszíni receptoraihoz/antigénjeihez kö• · · ·-· · · a · « ·« · «··· · • ··· ♦ · « ·«· ·· · · ·· · · · · * tődik és nem juttatható a sejt belsejébe. Besugárzás után azonban a fénnyel aktiválható hatóanyag naszcens oxigént fejleszt, ami roncsolja a membránt és végül a sejt pusztulásához vezet.
Számos, a kemoterápiában alkalmazott kis molekulatömegű hatóanyag gyorsan belép valamennyi sejtfajtába a sejtmembránon keresztül, véletlenszerű diffúzióval. A szelektivitásnak ez a hiánya csökkenti mennyiségüket a kívánt célszövetekben, és néha nem kívánt mellékhatásokat okoz. A sejtek gyorsan felveszik ezeket a hatóanyagokat, így a gyógyhatás nem terjed ki hosszabb időszakra. A vese glomerulusaiban fellépő szűrés továbbá gyorsan eltávolíthatja a hatóanyagokat a véráramból.
A kis molekulatömegű, biológiailag aktív molekulák kovalens hozzákötése oldható polimer hordozókhoz meggátolja mind a glomerulusokon végbemenő kiszűrést, mind a sejtekben egyszerű diffúzióval végbemenő abszorpciót. A sejtekben lezajló felvétel azokra a sejtekre korlátozódik, amelyek rendelkeznek egy pinocitózisnak nevezett szubsztrátszelektív mechanizmussal, amelynek során a sejtet határoló membrán egy régiója körbefogja a makromolekulát és befelé továbbítja, a körbefogott anyagot tartalmazó, sejten belüli szabad vezikulumot képezve.
Ez az eltérés a sejtek általi felvétel mechanizmusában lehetőséget nyújt egy módszerre, amely szerint a hatóanyagokat specifikusan azokhoz a sejtekhez lehet irányítani, ahol gyógyhatásúk kifejtése kívánt.
Egy további különbség okozója a kétfajta molekula, azaz a polimerhez kötött illetve a szabad hatóanyag további sorsa. A kis molekulák, amelyek diffúzióval lépnek be, hajlamosak megtalálni az utat a sejt mindegyik részébe, a makromolekulák pedig a pino-
citózist követően sejten belüli vezikulumaikban közvetlenül a sejt lizoszomális részéhez szállítódnak, ahol számos hidrolítikus enzim van jelen.
Ezért egy olyan polimer hatóanyag pinocitikus felvétele, amelyben a hatóanyag - hordozó kötés érzékeny a lizoszomális hidrolízisre, teret nyit egy olyan mechanizmusnak, amely biológiailag aktív molekulák sejten belüli szabályozott felszabadulását eredményezi, aminek eredményeképpen ezek a molekulák megjelennek a célsejt citoplazmáján belül. Egy ilyen hatóanyagrendszer megtervezésénél fellépő elméleti megfontolásokat a közelmúltban tett közzé Synthesis of Tailor-made Soluble Polymeric Carriers című cikkében J. Kopecek [Recent Advances in Drug Delivery Systems, Plenum Press, 1984].
Egy ilyen rendszer megtervezéséhez két kritériumot kell kielégíteni. Először is egy olyan hatóanyag - hordozó kötést kell létrehozni, ami szabályozott lizoszomális hidrolízisen megy át, de ellen tud állni az enzimek hatásának a véráramban. Másodszor a hatóanyagszállító rendszernek biztosítania kell a hatóanyag specifikus felvételét azokban a célsejtekben, amelyekben a gyógyhatás kívánt, úgy, hogy más sejtekben a hatóanyagfelvétel a lehető legkisebb legyen.
A pinocitózisnak alapvetően három formája van: folyadékfázisú, adszorpciós és receptorok által közvetített. A legáltalánosabb a folyadékfázisú pinocitózis, amelynek során az oldható makromolekulák és az oldott anyagok folyékony csöppecskék formájában lépnek be a sejtbe. A sejtmaggal rendelkező sejtek többsége, sőt lehetséges, hogy mindegyike a folyadékfázisú pinocitózist alkalmazza az anyagok bevitelére a sejt belsejébe a sejten kívüli tér bői. Ez a folyamatot konstitutív-nak nevezik, mivel folytonos (szemben a meg-megszakított folyamatokkal, mint amilyen a fagocitózis) abban a tekintetben, hogy a sejtbe mindig bejutnak plazmamembránja darabjai.
Az adszorptív pinocitózis szintén egy megkülönböztetésre viszonylag kevéssé alkalmas folyamat. Ebben az esetben azonban egy makromolekula fizikailag (nem specifikusan) adszorbeálódhat a sejtmembrán egy helyéhez, és azután a bekebelezési folyamat beviszi a sejtbe.
A pinocitózis messze legspecifikusabb formája a receptorok által közvetített pinocitózis, amelynek során egy makromolekula, amely egy sejtfelszíni receptorral komplementer markerrel van ellátva, hozzákapcsolódik ehhez a receptorhoz és ezt követően beszállítják a sejt belsejébe. A sejtek ezen a módon veszik fel a sejtközötti folyadékból az olyan makromolekulákat, mint a hormonok, szállító proteinek, lebontásra módosított proteinek, növekedési faktorok és némely antitestek. A receptorok által közvetített pinocitózis előnye abban a tényben rejlik, hogy nagyobb ligandumkoncentrációt lehet specifikus sejtekbe bejuttatni, mint a többi mechanizmusokkal.
Függetlenül a bejutás módjától, ha egy oldott anyag egyszer pinocitózissal bejutott a sejt belsejébe, végső sorsa az, hogy a szekunder lizoszómákhoz szállítják, ahol lebomolhat és a sejt különböző módokon szétoszlathatja. Mivel a folyadékfázisú pinocitózis folyamata során a sejtfelszíni markerek felvétele nem megkülönböztető módon megy végbe, a sejt természetesen rendelkezik egy olyan mechanizmussal, ami az esszenciális lipideket és proteineket visszajuttatja a sejtmembránhoz.
• ·· · ·« ·« · ·· • · · ♦ «· · · • · · · · · · · · · ······ 4 ·
Bár a pinocitózis folyamata lehetővé tesz egy bizonyos fokú szelektivitást a makromolekulákkal szemben - amely szelektivitás optimalizálható, például a molekulatömeg változtatásával - nagyobb célszelektivitást lehet elérni a makromolekulába egy specifikus, a megtalálást (célbajutást) elősegítő (targeting) láncot beépítve. A sejteknek specifikus receptoraik vannak és felszínükön sejt-antigének találhatók, amelyek felismernek bizonyos típusú, specifikus determinánsoknak nevezett molekulaegységeket, és kölcsönhatásba lépnek velük. Nagy sejtspecifitást lehet elérni a polimer hatóanyagba egy olyan determinánst beépítve, amit azok a sejttípusok ismernek fel, amelyekben a gyógyhatás kívánt.
így tehát, egy olyan hatóanyagszállító rendszer, ami lehetővé teszi egy specifikus cél megtalálását, és az ezt követő sejten belüli hatóanyagfelszabadítást, a következő jellemzőkkel kell rendelkezzen:
a) egy közömbös polimer hordozó, ami előnyösen jól bontható lizoszomális hidrolízissel, a polimer a testből való eltávolításának megkönnyítésére,
b) egy bontható hatóanyag - hordozó kötés, ami ellenáll a sejten kívüli hidrolízisnek, de szabályozott lizoszomális hidrolízissel jól bontható, és
c) kívánt esetben egy a megtalálást (célbajutást) megkönnyítő lánc.
Bár természetes makromolekulákat szokás alkalmazni hordozóként, a szintetikus polimerek rendelkeznek azzal az előnnyel, hogy molekulatömegük könnyebben beállítható az optimális sejtszelektivitás érdekében, továbbá hogy számos természetes makromolekulától eltérően nem immunogének. Kereskedelmi célokra való elő···· ·· · * · »· ·· · ···· · • · · · · · « · ·» · ······ « 4 állításuk is könnyebb.
N-(2-hidroxi-propil)-metakril-amid (HPMA) alapú szintetikus polimereket ajánlottak már lehetséges hatóanyag hordozókként [4 062 831. és 7 097 470. számú USA-beli szabadalmi leírások]; az ilyen polimerek vizes közegben oldhatók és biokompatibilitásuk jó. N-metakriloil-oligopeptidek p-nitro-fenil-észtereinek beépítésével továbbá számos olyan hatóanyaggal kombinálhatok, amelyek primer aminocsoportot tartalmaznak. A polimerlánc térhálósított lehet a gélesedési pont alatti szintig az optimális molekulatömeg elérésére, és a biológiailag lebontható térhálós kötések alkalmazásával egy olyan lebontási módszer biztosítására, ami megkönynyíti a polimer eltávolítását a testből.
Mivel a lizoszomális enzimek közé tartozik számos olyan proteináz, amely képes peptidkötések hidrolizálására, azt lehet hinni, hogy a biológiailag aktív molekula közvetlen hozzákapcsolása a polimerlánchoz egy amidkötéssel lehetővé tenné a lizoszomális hidrolízist. A gyakorlatban azt találták, hogy nem ez a helyzet. A hatóanyag és a hordozó közé beépített peptid spacer-ekről azonban bebizonyosodott, hogy a lizoszomális enzimek tág sebességhatárok között bontják őket. A ténylegesen elhasadó kötés általában a hatóanyag és a szomszédos aminosav közötti kötés, bár ez nincs mindig így. Úgy találták, hogy a hidrolízis sebessége, azaz a hatóanyagfelszabadulás sebessége nagy mértékben függ a peptid spacerben levő aminosavgyökök számától és természetétől. A két aminosavnál kevesebből álló spacerek általában nem hajlamosak lizoszomális hidrolízisre. Különösen hatékonyan hasíthatok azok a peptid spacerek, amelyeket a lizoszómákban tudottan jelenlevő tiol-proteinázok ismert szubsztrátspecifitásához illően ala• ··· ·4 ·· 44 4 • 4 4 4«··« • 444 · 4 4444 ····«· 4« ·· 44 44 ·4·44
- 9 kítottak ki.
Kimutatták, hogy a glikoproteinek olyan módosítása, ami galaktózban végződő oligoszacharid oldalláncokat eredményez, drámai módon megnöveli a glikoproteinek lerakódását a máj parenchymalis sejtjeiben. A galaktózlánc specifikus determinánsként működik, ami a máj sejtek plazmamembránján elhelyezkedő receptorokkal lép kölcsönhatásba. Ez egy olyan mechanizmus lehetőségét csillantja fel, amellyel a hepatóma - ami egy különösen nehezen kezelhető rákfajta - elleni hatóanyagok célzottan bejuttathatok. A HPMA kopolimerekhez egy amidkötéssel kapcsolt galaktóz-amin továbbá hasonló eredményt ad, ami azt jelzi, hogy a hepatokrit membránokon levő receptorok a galaktózláncot nemcsak a glikozidokban ismerik fel, hanem akkor is, ha N-acil-galaktóz-amin formájában vannak jelen. Számos más felismerő rendszer is ismeretes, így például a Kupffer-sejtek és makrofágok N-acetil-glükóz-amin/mannóz felismerő rendszere és a fibroblasztok foszfohexóz felismerő rendszere.
Egy másik lehetséges célzott bejuttatás! mechanizmus a polimer hatóanyag hozzákötése egy olyan antitesthez, amit specifikusan a megfelelő antigén receptorokkal rendelkező sejtek ismernek fel. Hatóanyagmolekulákat kötöttek már közvetlenül immunoglobulinokhoz is, de ez a hatóanyag aktivitásának elvesztéséhez, az antitest aktivitás elvesztéséhez és/vagy a konjugátum feloldódásához vezethet.
Egy további célzott bejuttatás! mechanizmus egy olyan protein vagy hormon - például transzferrin vagy melanocita-stimuláló hormon - alkalmazása, ami specifikusan a cél sejttípushoz kötő dik.
···· 4 4 · ♦ 4 *· • · « ···· · • · ·♦ * · ·4»* ······ 4·
Míg az ismert szakirodalomban utaltak a hidrolizálható peptid spacerekkel rendelkező célzott bejuttathatóságú polimer hatóanyagok szintetizálásának előnyös voltára [Kopecek fent hivatkozott cikke], folyamatos kutatás tárgyát képezi az olyan peptid spacerek azonosítása, amelyek képesek kielégítő sebességű szabályozott sejten belüli hatóanyagfelszabadításra, és olyan kapcsoló csoport/determináns kombinációk azonosítása, amelyek a kívánt sejtreceptorokhoz való jó eljuttathatóságot biztosítanak.
Mint azt már kifejtettük, egy peptid spacer lizoszomális hidrolízisének sebessége egyaránt függ az aminosavgyökök számától és természetétől. Ez szférikus és szerkezeti tényezők eredménye. így egy 2-4 aminosavgyököt tartalmazó spacer terminális hidrolízisének sebessége általában a jelenlevő gyökök számától függ, mely hatást a polimerlánc és az enzim közötti szférikus kölcsönhatásnak tulajdonítják.
Egy megadott peptidhosszúságra a hidrolízis sebessége az aminosavgyökök természetétől (és sorrendjétől) függ. Ennek oka a peptid spacer hasításáért felelős lizoszomális enzimek szubsztrátspecifikus természete. Az enzimnek azt a régióját, ahol a szubsztráttal való kölcsönhatás végbemegy, az enzim aktív hely-ének nevezik. Az aktív hely kettős szerepet tölt be; megköti a szubsztrátot, és ezalatt katalizálja a reakciót, például a hasítást. A proteolítikus enzimek peptidekkel képzett komplexeinek szerkezetére vonatkozó vizsgálatok azt mutatják, hogy ezeknek az enzimeknek az aktív helye viszonylag nagy, és a peptid több aminosavgyökéhez kötődik.
így egy peptidlánc egy bizonyos kötésének elbonthatósága nemcsak az elhasított kötés közelében levő szerkezeti rész tér···· · · ·« · · I ·« ·«·«·· • · ·· · · · ··« ······ · · mészetétől függ, hanem olyan, az elhasított kötéstől viszonylag távoli aminosavgyökök természetétől is, amelyek azonban fontos szerepet játszanak az enzim helyzetének megtartásában a hidrolízis során. Ezidáig nem határozták meg a lizoszomális enzimek aktív helyeinek részletes szerkezetét, és ez akadálynak bizonyult az olyan peptid spacerek előállításánál, amelyek megfelelő sebességgel képesek lizoszomális hidrolízisre ahhoz, hogy polimertartalmú gyógyszerkészítményekben alkalmazhatók legyenek.
Az 5 037 883. számú USA-beli szabadalmi leírás [Kopecek és munkatársai] egy hatóanyag-konjugátumot ír le, amelyben egy közömbös polimer hordozó egy peptidkötésen keresztül van biológiailag aktív molekulákhoz kapcsolva. A konjugátumok a célzott bejuttatást megkönnyítő alkotórészeket, úgymint egy antitestet, monoszacharidot, diszacharidot vagy egy proteint is tartalmaznak. Eszerint a leírás szerint az N-(2-hidroxi-propil)-metakril-amid kopolimerjei, amelyek olyan oligopeptid szekvenciákat tartalmaznak, melyek végéhez rákellenes hatóanyagok (például adriamycin, daunomycin, melphalan) kapcsolódnak, és amelyek a megtalálást elősegítő láncokkal (például galaktóz-amin, fukozil-amin, anti-Thy 1.2 antitestek, anti-Ia antitestek) vannak összekapcsolva, nagyobb gyógyászati hatékonysággal rendelkeznek, mint a polimereket nem tartalmazó, kis molekulatömegu hatóanyagok. Közelebbről egy hatóanyagként adriamycint (egy Gly-Phe-Leu-Gly oligopeptid szekvencián keresztül kapcsolva), és a megtalálást elősegítő láncként galaktóz-amint tartalmazó konjugátumot írnak le. Ennek a szabadalomnak az oltalmi köre csak olyan polimerekre terjed ki, amelyek egyetlen biológiailag aktív láncot és egy megtalálást segítő láncot tartalmaznak.
• · »4 ···
J.D. Spikes [The Science of Photobiology, második kiadás,
K.C. Smith, ed., Plenum Press, New York, 79-110. oldal (1988)] olyan fotokémiai szenzibilizátorokat ír le, amelyeket egy jellegzetes hullámhosszúságú fény aktivál, ami végül igen reaktív típusú naszcens oxigén képződéséhez vezet. A fénnyel kiváltott reakciók mechanizmusát már eddig is kihasználták a rákterápiában. A fotodinamikus terápia (PDT) egy fotokémiai szenzibilizátor és fény együttes alkalmazását jelöli a rákos sejtek roncsolására. Az ilyen típusú terápia alkalmazásának egyik előnye az, hogy a fotokémiai szenzibilizátor semleges marad, amíg fénnyel nem aktiválják. Egy ilyen fotokémiai szenzibilizátort, egy hematoporfirinszármazékot (HPD), ami egy porfirinvázas anyag, részletesen tanulmányoztak amiatt az eredendő tulajdonsága miatt, hogy daganatszövetben helyileg fel tud halmozódni [J. Moan: Photochem. Photobiol·., 43, 681. oldal, (1986)]. Megvan azonban a lehetősége a normál sejtek által való nem-specifikus felvételnek is. Ez felveti az ultraszenzitivitás kérdését, amely miatt a betegek még a nappali fénnyel szemben is érzékenyek maradhatnak a PDT-kezelést követően egészen 30 napig [T.J. Dougherty: J. Invest. Derm., 77, 122. oldal, (1981)]. Kívánatos ezért a fotokémiai szenzibilizátorokhoz monoklonális antitesteket alkalmazni megtalálást elősegítő anyagként. Ezt úgy szemléltették, hogy HPD-t DDBA/2J mioszarkóma M-l sejtekkel szembeni monoklonális antitestekhez kapcsoltak [D. Mew és munkatársai: J. Immunoi., 130, 1743. oldal, (1983)]. Számos fotokémiai szenzibilizátor azonban különösen hidrofób molekula, ami a hozzákötés után megváltoztathatja az antitest oldhatóságát [R. Arnon és munkatársai: Cancer Surv. , 1., 429. oldal, (1982)] és csökkentheti az antitest aktivitását [B. Rihova és ·♦·· 4 · W« t 4· • ♦ «»*<*· • ··4 · · « »4« • · 4 4 · 4 « *
- 13 munkatársai: Makromol. Chem. Suppl., 9, 13. oldal, (1985)]. Egy vízoldható polimer hordozót (Dextran) monoklonális anti-T-sejt (anti-Leu-1) antitestekhez kapcsoltak, egy fotokémiai szenzibilizátor (chlorin eg) célzott bejuttatására HPB-ALL emberi T leukémia sejtekbe in vitro [A. Oseroff és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, .83, 8744. oldal, (1986)]. Fotokémiai szenzibilizátorokat polimerekhez kapcsoltak és gyógyszeres kezelésben különböző rákos sejtek elpusztítására alkalmazták őket [J. Kopecek és munkatársai: Journal of Controlled Release, _1_6, 137-144. oldal, (1991); N.L. Krinick és munkatársai: SPIE Advances in Photochemotherapy, 997, 70-83. oldal, (1988); N.L. Krinick és munkatársai: Makromol. Chem., 191, 839-856, (1990)].
Ezek közül az irodalmi helyek közül egyiken sem javasolják rákellenes hatóanyagok és fotokémiai szenzibilizátorok kombinációjának alkalmazását polimer hordozókhoz kapcsolva, amint azt találmányunk értelmében alkalmazzuk.
Találmányunk tárgya olyan oldható, biológiailag aktív kopolimerek, amelyek egy hozzájuk kötött kemoterápiás szert és egy hozzájuk kötött fotokémiai szenzibilizátort tartalmaznak enzimesen bontható kötésekkel kapcsolva.
Találmányunk további tárgya olyan oldható, biológiailag aktív kopolimerek, amelyek egy hozzájuk kötött kemoterápiás szert és egy hozzájuk kötött fotokémiai szenzibilizátort, továbbá egy hozzájuk kötött determinánst tartalmaznak enzimesen bontható kötésekkel kapcsolva.
Találmányunk további tárgya olyan oldható, biológiailag aktív kopolimerek, amelyek hozzájuk kötött fotokémiai szenzibilizátor molekulákat tartalmaznak enzimesen nem bontható vagy enzimeV» • ··· * * 4 * ·* «··«· · t
- 14 sen bontható kötésekkel kapcsolva, és egy bontható kötésekkel kapcsolódó kemoterápiás szert is tartalmaznak.
Találmányunk további tárgya egy neoplasztikus megbetegedések kezelésére szolgáló eljárás olyan oldható, biológiailag aktív kopolimerek beadásával, amelyek egy hozzájuk kötött kemoterápiás szert és hozzájuk kötött fotokémiai szenzibilizátorokat tartalmaznak enzimesen bontható kötésekkel kapcsolva. A kopolimer tartalmazhat egy determinánst vagy megtalálást elősegítő láncot is.
Találmányunk még további tárgya egy neoplasztikus megbetegedések kezelésére szolgáló eljárás egy kopolimerkombináció beadásával, amely kopolimerek egyike egy hozzákötött kemoterápiás szert, másika egy hozzákötött fotokémiai szenzibilizátort tartalmaz, és mindegyik kopolimer ugyanazt a megtalálást elősegítő láncot tartalmazza.
Találmányunk további tárgya egy neoplasztikus megbetegedések kezelésére szolgáló eljárás olyan kopolimerek beadásával, amelyek hozzájuk kötött fotokémiai szenzibilizátor molekulákat tartalmaznem bontható vagy enzimesen bontható kötésekkel kapcsolva, és bontható kötésekkel kapcsolódó kemoterápiás szereket is tartalmaznak .
Találmányunk még további tárgya oldható, biológiailag aktív kopolimerek, amelyek egy hozzájuk kötött kemoterápiás szert és hozzájuk kötött fotokémiai szenzibilizátorokat tartalmaznak enzimesen bontható kötésekkel kapcsolva, és egy megtalálást elősegítő láncot is tartalmaznak, ami a rákos sejten levő daganat markerre specifikus.
Találmányunk további tárgya oldható, biológiailag aktív kopolimerek, amelyek hozzájuk kötött fotokémiai szenzibilizátor mo-
lekulákat tartalmaznak nem bontható vagy enzimesen bontható kötésekkel kapcsolva, és bontható kötésekkel kapcsolt kemoterápiás szereket, valamint a rákos sejten levő daganat markerre specifikus, megtalálást elősegítő láncot is tartalmaznak.
Találmányunk további tárgya egy neoplasztikus megbetegedések kezelésére szolgáló eljárás olyan oldható kopolimerek beadásával, amelyek egy hozzájuk kötött kemoterápiás szert és hozzájuk kötött fotokémiai szenzibilizátorokat tartalmaznak enzimesen bontható kötésekkel kapcsolva, és tartalmaznak egy a rákos sejten levő daganat markerre specifikus, megtalálást elősegítő láncot is.
Találmányunk még további tárgya egy neoplasztikus megbetegedések kezelésére szolgáló eljárás olyan kopolimerek beadásával, amelyek hozzájuk kötött fotokémiai szenzibilizátor molekulákat tartalmaznak nem bontható vagy enzimesen bontható kötésekkel kapcsolva, és bontható kötésekkel kapcsolódó kemoterápiás szereket, valamint egy a rákos sejten levő daganat markerre specifikus, megtalálást elősegítő láncot is tartalmaznak.
Ezeket és még további célkitűzéseket is elérhetünk daganatok kezelésére olyan kombinációs kopolimereket alkalmazva, amelyek egy kemoterápiás szert és egy fotokémiai szenzibilizátort tartalmaznak. Két külön kopolimer egyidejű beadását, amelyek közül az egyik egy kemoterápiás szert és a másik egy fotokémiai szenzibilizátort tartalmaz, jobbnak találtuk daganatos megbetegedések kezelésére, mint az egyes polimerek külön-külön beadását. A kopolimerek keveréke helyett alkalmazhatunk egyetlen kopolimert is, amely mind a kemoterápiás szert, mind a fotokémiai szenzibilizátort tartalmazza. Ezeknek a kopolimereknek a specifitását javíthatjuk úgy, hogy minden egyes polimer molekulához egy megtalálást elősegítő láncot kapcsolunk. A találmány szerinti megoldás alapján végzett kísérletek azonban azt mutatják, hogy a mind egy rákellenes szert, mind pedig egy fotokémiai szenzibilizátort tartalmazó polimer hordozók alkalmazása még egy megtalálást elősegítő lánc beépítése nélkül is nagyobb mennyiségű polimerhez kötött hatóanyag felhalmozódását eredményezi a daganatban, mint ami a szabad hatóanyaggal elérhető.
Ezek a polimer makromolekulák a megcélzott sejtekbe pinocitózissal jutnak be; a kis molekulatömegű hatóanyagok kopolimerekhez kötése hatására azokat a sejt diffúzió helyett pinocitózissal veszi fel, ami csökkentheti a szabad hatóanyagok által szokásosan kifejtett mellékhatásokat. Emiatt mindkét hatóanyagból jóval kisebb dózisokat lehet alkalmazni, ha azok a kombinációs kopolimerhez vannak kapcsolva. Akár két külön kopolimer egyidejű alkalmazását, amelyek közül az egyik egy fotokémiai szenzibilizátort és a másik egy rákellenes hatóanyagot tartalmaz, akár pedig egy, hozzákapcsolva mind egy rákellenes szert, mind egy fotokémiai szenzibilizátort tartalmazó kopolimer alkalmazását jobbnak találtuk neoplasztikus megbetegedések kezelésére, mint egyetlen kopolimer felhasználását, amely csak egy rákellenes szert vagy egy fotokémiai szenzibilizátort tartalmaz hozzákapcsoltán, mivel az előbbi esetekben kisebb dózisokat lehet alkalmazni. Még kisebb dózisokat is lehet alkalmazni továbbá, ha a két hatóanyagnak szinergetikus rákellenes hatása van. Az, hogy mindkét hatóanyagot ugyanahhoz a kopolimerhez kapcsoljuk, biztosítja, hogy mindkét hatóanyag ugyanakkor lépjen be ugyanabba a sejtbe. A mindkét hatóanyagot tartalmazó kopolimernek specifikusan a megcélzott rákos sejthez való irányítását megkönnyíti vagy elősegíti egy olyan
megtalálást elősegítő láncnak a kombinációs kopolimer oldalláncaihoz kapcsolása, amely specifikus egy a rákos sejten levő daganat markerre.
Beadás után és a rákellenes hatás beindítása előtt egy késleltetési időszakot kell hagyni ezeknek a kopolimereknek az optimális felvételére a daganatszövetben a környező normális szövethez viszonyítva. Ezután lézerfényt vagy más, megfelelő hullámhosszú és energiájú sugárzást kibocsájtó fényforrást alkalmazunk, és a fotokémiai szenzibilizátort első gerjesztett szingulett állapotba visszük át. A rendszerközi kölcsönhatás következtében a szingulett állapotú szenzibilizátor megfelelő triplett állapotába alakul át. Az energiaátadás a triplett állapotú szenzibilizátortól az alapállapotú molekuláris oxigénhez gerjesztett szingulett oxigén képződéséhez vezet. A képződött szingulett oxigén megtámadja a sejt lizoszomális membránját, ezáltal lizoszomális enzimeket enged ki a citoszolba, aminek következtében a sejt elpusztul. A rákellenes szer hatása eltünteti azokat a sejteket, amelyeket a fotokémiai szenzibilizátor nem pusztított el. A daganat kiújulását nagy mértékben csökkenti a fent leírt gyógykezelés.
Az in vivő daganatellenes hatékonyságot jobbnak találtuk olyan kombinációs kopolimerek (úgymint a HPMA kopolimerek) esetében, amelyek egy rákellenes hatóanyagot (úgymint adriamycint) és egy fotokémiai szenzibilizátort (úgymint mezo-chlorin-eg monoetilén-diamin-dinátriumsót /cég/) tartalmaznak, mint azokban az esetekben, amikor fotokémiai szenzibilizátort tartalmazó kopolimereket alkalmaztunk és a rákellenes hatóanyagot tartalmazó polimereket egymagukban adtuk be. Az adriamycin csak, akkor hatásos, ha enzimesen felszabadult a kopolimerből és a ceg-ot fény aktiválja, és in vivő fotodinamikus hatást fejt ki, akár a kopolimerhez kötve marad, akár nem. Egy rákellenes hatóanyag javítja a PDT kezelést (és megfordítva), mivel a kemény daganatokat nehéz hosszú távon PDT-vel kezelni. Másrészt a kemoterápiás szerek alkalmazásának is megvannak a külön nehézségei, beleértve a több hatóanyaggal szembeni rezisztenciát (multidrug resistance), és más mérgező mellékhatásokat. A találmányunk szerinti megoldás csökkenti a mellékhatásokat, mert a kopolimerek kisebb dózisaira van szükség.
A fő komonomer egység meghatározza a polimer hordozók tulajdonságait. Sokfajta komonomer egység alkalmazható, ami vízoldható kopolimerek képződését eredményezi. Funkcionálisan bármilyen közömbös kopolimer alkalmazható a biológiailag aktív és/vagy a megtalálást elősegítő lánc hozzákötésére, amelyhez megfelelő spacerek kapcsolható. A kopolimert általában úgy állítjuk elő, hogy a nem derivatizált komonomer egységeket a kívánt mólarányban kopolimerizáljuk az olyan komonomer egységek kívánt mennyiségével, melyeket derivatizáltunk (származékaikká alakítottunk), hogy megfelelő kapcsoló csoportokat vagy spacereket tartalmazzanak, amelyek olyan reaktív csoportokkal rendelkeznek, melyekhez azután biológiailag aktív szereket vagy megtalálást elősegítő láncokat lehet kapcsolni. A jellegzetes komonomer egységeket készíthetjük N-(2-hidroxi-propil)-metakril-amidből (HPMA), N-metil-akril-amidből vagy N,N-dialkil-akril-amidokból. Más alkalmas hordozók például a poliaminosavak, poliszacharidok, poli(etilén-oxid) szekvenciákat tartalmazó kopolimerek, poli(vinil-pirrolidon) - maleinsavanhidrid kopolimerek és más hasonlók.
A kezdeti lépés jellemzően egy polimer prekurzor előállító19 sa. Szintetikus kopolimerek esetében a kezdeti lépés általában a nem derivatizált és a derivatizált komonomer egységek kopolimerizálása egy olyan kopolimer prekurzor kialakítására, amelyben a derivatizált komonomer egységek tartalmaznak olyan kapcsolódó vagy spacer csoportokat, amelyeken lehasadó csoportok (például p-nitro-fenoxi-csoportok) helyezkednek el, a biológiailag aktív hatóanyagok vagy megtalálást elősegítő láncok későbbi hozzákapcsolásához. Más polimerek, úgymint poliszacharidok (például dextrán és más hasonlók) és poliaminok esetében ez a lépés egy aktiválás, amelynek során aktiváló szereket (például p-nitro-fenoxi-csoportokat) kapcsolunk a polimerlánchoz. A második lépés során a biológiailag aktív szereket és/vagy megtalálást elősegítő láncokat hozzáadjuk a prekurzor polimerhez vagy kopolimerhez.
A fentiekből világos, hogy a kopolimer kifejezést leírásunkban tágan értelmezzük, és beleértünk bármilyen alkalmazható polimerláncot, amelyben a láncot felépítő ismétlődő monomer egységek azonosak lehetnek, de a monomer egységekhez egy spaceren keresztül hozzákapcsolva különböző helyettesítő csoportokat tartalmazhatnak. így egy HPMA kopolimert nem derivatizált HPMA-ból és aktív p-nitro-fenoxi-csoportokat tartalmazó N-metakriloilezett peptidekből szintetizálunk. Egy poliszacharid kopolimer ezzel szemben egyrészt olyan szacharid egységeket tartalmaz, amelyeken semmilyen helyettesítő csoport nincs, másrészt olyan szacharid egységeket tartalmaz, amelyeket egy reaktív csoport, úgymint egy p-nitro-fenoxi-csoport hozzákapcsolásával aktiváltunk. A kopolimerek vízben oldhatók, és molekulatömegük általában - beleértve a rákellenes hatóanyag, a fénnyel aktiválható hatóanyag és a determináns tömegét - körülbelül 10 000 és 50 000 között van.
Az 5 037 883. számú USA-beli szabadalmi leírásban ismertetettek szerint a polimer egységek körülbelül 5,0-99,7 mól%-a nem derivatizált komonomer egység, és az előnyösen alkalmazott komonomer a HPMA.
A komonomer egységek egy bizonyos mennyisége (százalékban) szükségszerűen tartalmaz olyan enzimesen hasítható oldalláncokat, amelyek végéhez egy rákellenes hatóanyag kapcsolódik. Ezek az oldalláncok lehetővé teszik a rákellenes hatóanyag hely-specifikus felszabadítását a sejt lizoszomális részében. Ezek a komonomer egységek körülbelül 0,2-20,0 mól%-át tehetik ki a kopolimert alkotó egységeknek. Az oldalláncok szerkezetének pontosan megtervezettnek kell lennie, hogy stabilak legyenek a véráramban, de a lizoszomális enzimekkel sejten belül hidrolizálhatóaknak kell lenniük. A hatóanyag kapcsolódási pontjaiként oligopeptid szekvenciákat, oligoszacharid szekvenciákat vagy ezekhez hasonló nukleinsav szerkezeteket is alkalmazhatunk. Mivel az előnyösen alkalmazható kopolimer a HPMA, ezek az egységek előnyösen N-metakriloilezett peptidek, amelyekhez a hatóanyag hozzá van kapcsolva. Az összekötő molekulák vagy peptid spacerek az 5 037 883. számú USA-beli szabadalmi leírásban említettek közül bármelyikek lehetnek, és a következő csoportból kerülnek ki: Gly-Gly, Gly-Phe-Gly, Gly-Phe-Phe, Gly-Leu-Gly, Gly-Val-Ala, Gly-Phe-Ala, Gly-Leu-Phe, Gly-Leu-Ala, Ala-Val-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly (szekvencia azonosítási szám /SEQ ID NO/ : 1), Gly-Phe-Phe-Leu (szekvencia azonosítási szám: 2), Gly-Leu-Leu-Gly (szekvencia azonosítási szám: 3), Gly-Phe-Tyr-Ala (szekvencia azonosítási szám : 4), Gly-Phe-Gly-Phe (szekvencia azonosítási szám: 5), Ala-Gly-Val-Phe (szekvencia azonosítási szám: 6), Gly-Phe-Phe-Gly (szekvencia
.... .. .. . ., • · ······ .····<· · ··· • · · ·· · · · azonosítási szám: 7), Gly-Phe-Leu-Gly-Phe (szekvencia azonosítási szám: 8), vagy Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-Phe (szekvencia azonosítási szám : 9) . Peptid spacerként különösen előnyös a Gly-Phe-Leu-Gly (szekvencia azonosítási szám : 1). Erre a spacerre ismételten hivatkozunk leírásunkban és igénypontjainkban vagy Gly-Phe-Leu-Gly vagy (szekvencia azonosítási szám : 1) megjelöléssel, amely megnevezéseket felcserélhető módon alkalmazhatjuk.
A peptid összekötőkhöz kapcsolható megfelelő rákellenes hatóanyag lehet például, de nem kizárólag, az adriamycin, daunomycin, melphalan vagy a bleomycin.
Alkalmazhatók ugyanezek a komonomer egységek, amelyek lebontható oldalláncokat tartalmaznak, melyek végéhez egy fénnyel aktiválható hatóanyag kapcsolódik. Ezeknek a komonomer egységeknek a koncentrációtartománya a polimerben azonos a rákellenes hatóanyagével. Ez azonban nem jelenti azt, hogy a rákellenes hatóanyag és a fénnyel aktiválható hatóanyag mindig 1:1 mólarányban lesz jelen. Lehetséges, hogy ezeknek a hatóanyagoknak az aránya a kombinációs polimeren belül a betegtől, a kezelt rákfajtától, a szöveti helyektől vagy bármely más olyan változótól függően változhat, amit ezeknek a biológiailag aktív szereknek a jelenléte befolyásolhat. A komonomer egységek tartalmazhatnak olyan nem bontható oldalláncokat is, amelyek végéhez egy fénnyel aktiválható hatóanyag kapcsolódik. Az ilyen nem bontható oldallánc alakjában levő spacerek tartalmazhatnak aminosavakat, úgymint glicint vagy e-amino-kapronsavat.
A fénnyel aktiválható hatóanyag vagy fotokémiai szenzibilizátor lehet egy porfirin, ftalocianin, purpurin, klorin, naftalocianin, kationos festékanyag, tetraciklin és más hasonló.
·· · «
•··· ·« • · · • · · · · • · · * ·
Mindegyik kopolimer tartalmazhat egy megtalálást elősegítő láncot is. Mind a nem bontható, mind az enzimesen bontható oldalláncok alkalmazhatók a megtalálást elősegítő lánccal együtt. Azoknak a komonomereknek az aránya, amelyekhez a megtalálást elősegítő láncok hozzákapcsolhatók, 0 és 94,8 mól% között változhat. Ismét az 5 037 883. számú USA-beli szabadalmi leírásra utalva, ha jelen van egy a megtalálást elősegítő lánc, a kopolimer körülbelül 0,1-94,8 mól% olyan egységet tartalmaz, amihez egy a megtalálást elősegítő lánc kötődhet. Mivel az előnyösen alkalmazható kopolimer a HPMA, a komonomer a következő csoportba tartozó vegyületek valamelyikéből származik: N-metakril-amid, N-metakrilsav, vagy egy N-metakriloilezett aminosav vagy peptid. Ha vannak jelen enzimesen bontható oldalláncok, azok előnyösen aminosav vagy peptid láncok a következők közül: Leu, Phe, Gly-Gly, Gly-Leu-Gly, Gly-Val-Ala, Gly-Phe-Ala, Gly-Leu-Phe, Gly-Leu-Ala, Ala-Val-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly (szekvencia azonosítási szám /SEQ ID NO/ : 1), Gly-Phe-Phe-Leu (szekvencia azonosítási szám : 2), Gly-Leu-Leu-Gly (szekvencia azonosítási szám: 3), Gly-Phe-Tyr-Ala (szekvencia azonosítási szám
4), Gly-Phe-Gly-Phe (szekvencia azonosítási szám : 5),
Alá-Gly-Val-Phe (szekvencia azonosítási szám: 6), Gly-Phe-Phe-Gly (szekvencia azonosítási szám : 7),
Gly-Phe-Leu-Gly-Phe (szekvencia azonosítási szám : 8), vagy
Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-Phe (szekvencia azonosítási szám : 9), me lyek közül ebben az esetben is a legelőnyösebb a Gly-Phe-Leu-Gly (szekvencia azonosítási szám : 1).
A megtalálást elősegítő láncként a sejtfelszíni antigénekkel vagy receptorokkal komplementer szerkezetű anyagok alkalmazhatók. Ilyenek például a szacharidok, úgymint galaktóz-amin, fukozil··♦· ·« ·« • · ♦ · • ··« 4 « • · · · · «
-amin, laktóz; hormonok, például MSH, szekretin; opiátok; monoklonális vagy poliklonális antitestek.
A fénnyel aktiválható hatóanyagok olyan fényforrásokkal aktiválhatok, mint a lézerek vagy száloptikai rendszerek, amelyeket jelenleg alkalmaznak a PDT kezelésben, kemilumineszcenciás rendszerekben és más hasonlókban. A kemilumineszcenciás aktivátort alkalmazhatjuk közvetlenül a daganat környékén, vagy - legalább részben - célzottan a daganat helyére irányíthatjuk egy a fent leírthoz hasonló polimer hordozó rendszer alkalmazásával. A kemilumineszcenciás rendszerek aktiválásához szükséges peroxidképzést létrehozhatjuk egy enzimes reakcióval (például egy sejtmembránhoz egy enzim, úgymint glükóz-oxidáz odaszállítása, ami reakcióba lép a glükózzal hidrogén-peroxid keletkezése közben), vagy magának a fotokémiai szenzibilizátornak pulzáló fénnyel kiváltott autooxidációs láncreakciójával. Ez utóbbi esetben egy ciklikus reakció egy bizonyos fajta szinergetikus mechanizmust eredményezhet .
Míg a találmányt a fentiekben általános formájában ismertettük, az alábbiakban egy előnyös megvalósítási módot írunk le, amelynél a kopolimer egységek HPMA-alapúak. Egy szakember tudásába azonban beletartozik más kopolimer egységek alkalmazása is más kopolimer molekulák előállítására, amelyek ugyanazokat a végükhöz kapcsolva rákellenes hatóanyagokat, fénnyel aktiválható hatóanyagokat és megtalálást elősegítő láncokat hordozó helyettesítő oldalláncokat tartalmazzák.
A találmány értelmében alkalmazott kopolimereket szokásos módszerekkel állítjuk elő és azok a következő rövidített képletekkel jellemezhetők:
P-Gly-Phe-Leu-Gly-adria
(I kopolimer), ahol P jelentése egy az alábbiakban részletesebben meghatározott kopolimer hordozó és adria jelentése az adriamycin nemzetközi szabad nevű rákellenes hatóanyag, amint azt a továbbiakban szintén részletesebben leírjuk.
P-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg (II kopolimer), ahol P jelentése a fenti és cég nyel aktiválható hatóanyag.
jelentése a meso-chlorin e6 fény
P-Gly-ceg (III kopolimer), ahol P jelentése a fenti és cég jelentése meso-chlorin eg.
/ Gly-Phe-Leu-Gly-ceg
P \ Gly-Phe-Leu-Gly-adria (IV kopolimer) , ahol P, cég és adria jelentése a fenti.
/ Gly-ceg (V kopolimer), \ Gly-szekretin ahol P és cég jelentése a fenti és szekretin jelentése egy polipeptid determináns, amelynek lánchosszúsága 27 aminosav.
··· ·· «· • ♦ · · • · · · · « • · · · · • · ··· (VI kopolimer), / Gly-Phe-Leu-Gly-ceg
P - Gly-Phe-Leu-Gly-adria \ Gly-Phe-Leu-Gly-szekretin ahol P, cég, adria és szekretin jelentése a fenti.
Amint azt már említettük, az előnyösen alkalmazható komonomer egység a HPMA. Ezt a komonomert alkalmazva derivatizált és nem derivatizált formájában felvázolhatjuk az I-VI kopolimerek egy lehetséges részletesebb szerkezetét, ahol x, y, z és w az egyes kopolimer egységek mol%-ban megadott mennyisége. így x egy körülbelül 5,0 és 99,7 mól% közötti érték; y egy körülbelül 0,3 és 20,0 mól% közötti érték; z egy körülbelül 0,2 és 20,0 mól% közötti érték; és w egy körülbelül 0,1 és 25,0 mól% közötti érték.
Egyedi kopolimerek • · • · *««
NH
I ch2
CHOH
I ch3 / n
-ch2-c--1y--\ / x c=o
I
NH
I ch9 í
c=o
NH
I ch9 (
CHOH
I ch3
P-G-F-L-G-adria / H ( CH2 f ) ' c=o
I
NH
I ch2
CHOH
I ch3
NH
C=0
NH /CH3 i
CH-CH
I c=o \ch3
NH
I ch2
I c=o
I
NH adria (I kopolimer)
P-G-F-L-G-ce6
NH
I ch9
I c=o
I
NH ch-cH2-0 c=o
I
NH /CHo
I
CH-CH
I c=o \ch9
NH
I ch9
I c=o
I
NH
I ce6 (II kopolimer)
P-G-ceg (III kopolimer)
Kombinációs kopolimer
™3\ 1 iHh 1 IH3
1 -οι X-- -CH2-C-- y--- ---- ch2-c--
1 c=o 1 I \ 1 ' c=o 1
1 NH I 1 NH I NH |
1 CH2 1 2 1 ch2 i 2 CHn 1
CHOH C=0 1 f OO I
1 ch3 NH 1 NH
/G-F-L-G-adria
P (IV kopolimer) \G-F-L-G-ce6
Megtalálást elős gítő lánccal összekapcsolt kopolimerek
NH
CH?
I
CHOH
I ch3
C=0
NH
I ch9 c=o
I
NH szekretin /G-szekretin (V kopolimer) \G-ce6 • · · • · ·· · • · · · ·· (-Ch2-C--)x c=o
I
NH
I
CH9
I
CHOH
I ch3
í^3 ] [ ™3 1 /
ch2-c--/z---' C2T_.
c=o I c=o I c=o I
1 NH I 1 NH I 1 NH I
1 CH, ! l CHn ι 2 1 CHn 1
c=o I c=o 1 c=o 1
1 NH 1 NH 1 NH
/G-F-L-G-adria
P-G-F L G cég (VI kopolimer) \G-F-L-G-szekretin
Az I-VI kopolimerek szintéziséhez alkalmazott kopolimer prekurzorok előállításához alkalmazott monomerek szintetizálását az alábbi 1-4. példákkal szemléltetjük.
···· • · • » • · · « • ♦ ♦ ·
1, példa
N-(2-hidroxi-propil)-metakril-amid (HPMA) előállítása
A HPMA szintézise
CHo 1 J ch7 1 acetonitril CH-, 1 J
1 ch9=c 1 + CHOH 1 1 CH9=C 1
1 c=o I l ch9 1 -15°C 1 c=o I
1 Cl nh2 1 NH
CH9
I metakriloil-klorid l-amino-2-propanol CHOH
I ch3
Amint az a reakcióvázlatból látható, a HPMA monomert úgy készítjük [J. Strohalm és munkatársai módszerével, Angew. Makromol. Chem., 70, 109. (1978)], hogy 229,7 ml (223,5 g, 2,98 mól) l-amino-2-propanolt feloldunk 550 ml acetonitrilben, majd oktil-pirokatekin inhibitort adunk az oldathoz és azt -20°C-ra hűtjük.
Ezután 153 ml (163,7 g, 1,57 mól) metakriloil-kloridot feloldunk 350 ml acetonitrilben. A metakriloil-klorid oldatot élénk keverés közben lassan hozzácsöpögtetjük az l-amino-2-propanol oldathoz, vigyázva, hogy a hőmérsékletet -15°C körül tartsuk. A beadagolás után a keveréket engedjük 20°C-ra felmelegedni. Az l-amino-2-propanol · HC1 mellékterméket egy durva szűrővel gyorsan kiszűrjük. A lombikot megkaparjuk az első kristályok képződése után és a szűrlet kristályosodása -30 és -45°C közötti hőmérsékleten folytatódik. A kristályokat gyorsan kiszűrjük. A HPMA-t metil-alkohol és éter 1:3 arányú keverékéből átkristályosítjuk (meleg ···· ·· csapvíz alatt feloldva), majd átkristályosítjuk acetonból a képződött polimerek eltávolítására. A főtermék (64,4 g) olvadáspontja 70-71°C.
2. példa Metakriloil-qlicin-p-nitro-fenil-észter (MA-Gly-ONp vagy MA-GONp)
A ΜΑ-Gly köztitermék előállítása
A metakriloil-glicint (ΜΑ-Gly vagy MA-G), a MA-Gly-ONp prekurzorát a következő reakcióvázlat szerint állítjuk elő.
MA-G szintézise
CH-, I J NH, 1 1. 2n NaOH ch7 I J
1 ch7=c 1 + CH9 1 1 h 10°C; 1 h szobahő- ch9=c z I
1 C=O 1 1 c=o I mérséklet; 30 perc 20°C 1 C=0 I
1 Cl 1 OH ---------> NH I
2. HC1; 0°C 1 CH9
1 C=0 I
metakriloil-klorid glicin 1 OH
g (0,3996 mól) glicint feloldunk 100 ml 4 n nátrium-hidroxid oldatban és hidrokinon inhibitort adunk hozzá. A keveréket 0°C-ra hűtjük. A glicines oldatba egyszerre lassan belecsöpögtetünk 38,7 ml (0,3996 mól) metakriloil-kloridot és 99,8 ml 4 n nátrium-hidroxid oldatot. A reakciót 1 órát folytatjuk 10°C hőmérsékleten. A pH-t 4 n nátrium-hidroxid oldattal 9,5-re állítjuk be. A reakciót 1 órát folytatjuk szobahőmérsékleten, majd 30 percig ·»· ···· «· •· • »·
20°C-os vízfürdőn. A reakciókeveréket O°C-ta hűtjük, és lassan hozzácsöpőgtetünk körülbelül 65 ml 1:1 arányú vizes sósavoldatot, amíg a pH 2-3 lesz. A keveréket kétszer extraháljuk etil-acetáttal (a vizes réteghez még vizet adunk a képződött sók feloldására) . Az oldatot 1 órát szárítjuk nátrium-szulfáttal, és szűrjük. Térfogatát körülbelül 450-500 ml-re csökkentjük és hozzáadunk körülbelül 10 ml hexánt. A keveréket egy éjszakán át hűtőszekrényben tartjuk, és a metakriloil-glicin kristályokat elkülönítjük. Az anyalúgot etil-alkohol és hexán keverékéből átkristályosítjuk. A két rész kitermelése 13,2 g illetve 6,5 g, és mindkettő olvadáspontja 108-109°C.
Metakriloil-qlicin-p-nitro-fenil-észter (MA-Gly-ONp) előállítása
A fenti módon előállított ΜΑ-Gly felhasználásával MA-Gly-ONp-t állítunk elő a következő reakcióvázlat szerint.
MA-G-ONp szintézise
CH?
I
CH? = C
I c=o
I
NH ch9
I c=o
I
OH
MA-G
p-nitro-fenol
DCC/THF
---------->
h, -20°C
MA-Gly-ONp-t állítunk elő Rejmanová és munkatársai módszere szerint [Makromol. Chem., 178, 2159, (1977)], úgy, hogy 6,5 g (0,045 mól) MA-Gly-t és 6,95 g (0,050 mól) p-nitro-fenolt feloldunk körülbelül 50 ml tetrahidrofuránban. Ezt a keveréket -20°C-ra hűtjük, majd a hőmérsékletet -2θ9ζ-οη tartva lassan hozzácsöpögtetjük 10,31 g (0,05 mól) diciklohexil-karbodiimid (DCC) 9,7 ml tetrahidrofuránnal készített oldatát. A reakció egy éjszakán át folytatódik 4°C-on. Másnap reggel a keveréket 3 órát keverjük szobahőmérsékleten, a reakció leállítására néhány csepp ecetsavat adunk hozzá, és további 30 percig keverjük szobahőmérsékleten. A képződött diciklohexil-karbamid (DCU) mellékterméket kiszűrjük és tetrahidrofuránnal mossuk. A szűrletet szárazra pároljuk, majd feloldjuk etil-acetátban. A visszamaradó DCU-t kiszűrjük. Ezt az utolsó lépést megismételjük. A terméket újra feloldjuk etil-acetátban és egy éjszakán át hűtőszekrényben tartjuk. A keveréket még egyszer szűrjük és szárazra pároljuk, majd egy éjszakán át kristályosítjuk hűtőszekrényben etil-alkohol és éter elegyéből. A kristályokat szűrjük, hideg éterrel mossuk, majd deszikkátorba tesszük. A főtermék kitermelése 4,69 g és olvadáspontja 103-104°C. A moláris extinkciós koefficienst spektrofotometriásán határozzuk meg: £272 = 1^ 1/mól · cm (metanol) .
3. példa
Metakriloil-qlicil-fenil-alanin-p-nitro-fenil-észtér (MA-Gly-Phe-ONp vagy MA-G-F-ONp) MA-Gly-Phe (MA-G-F) köztitermék előállítása
A metakriloil-glicil-fenil-alanint (MA-Gly-Phe vagy MA-G-F),
ami az MA-Gly-Phe-ONp prekurzora, a következő reakcióvázlat szerint állítjuk elő.
MA-G-F szintézise
NH9 1 z ch3
ch9 1 ch9=c . z I NaOH/víz
1 c=o c=o I ch2ci2
1 NH r + 1 Cl -------_>
0Η-0Η2-θ o°c
OO
OH
CHo
I c
I c=o
I
NH
I ch9
I c=o
I
NH ch-ch2-<Q c=o
I
OH
G-F metakriloil-klorid g (0,068 mól) glicil-fenil-alanint (Gly-Phe) feloldunk
2,72 g (0,068 mól) nátrium-hidroxid 60 ml vízzel készített oldatában. Oktil-pirokatekin inhibitort adunk hozzá és a keveréket 0°C-ra hűtjük. A Gly-Phe oldatba élénk keverés közben lassan belecsöpögtetjük 7,76 g (7,2 ml, 0,074 mól) metakriloil-klorid ml metilén-kloriddal készített és hozzáadott inhibitort is tartalmazó keverékét, és egyidejűleg lassan hozzácsöpögtetjük 2,98 g (0,024 mól) nátrium-hidroxid 60 ml vízzel készített oldatát. A hozzáadás kezdetén több metakriloil-klorid oldatot adagolünk, majd a két oldatot azonos sebességgel adagoljuk. A pH-t 30 perc után ellenőrizzük (pH=6), és g nátrium-hidroxidot adunk a keverékhez, amíg elérjük a 8-9-es értéket. A reakció akkor teljes, amikor a vizes réteg pH-ja állandó (enyhén lúgos), és ekkor a keveréket még 30 percig keverjük. A felső réteget összegyűjtjük, és a metilén-kloridos réteget 10 ml vízzel extraháljuk. A vizes oldatokat egyesítjük, 100 ml, inhibitort tartalmazó etil-acetátot adunk hozzá és a keveréket 20°C alatti hőmérsékletre hűtjük. Vízzel 1:1 arányban hígított 36 %-os sósavoldatot adunk hozzá, amíg a pH 2-3-ra csökken (6-7 ml). Az oldatot gyorsan extraháljuk etil-acetáttal. Az etil-acetátos réteget összegyűjtjük, és a vizes réteget háromszor mossuk etil-acetáttal. Az oldatot nátrium-szulfáttal szárítjuk, szűrjük, és a kristályokat etil-acetáttal mossuk. Az oldatot körülbelül 100 ml-re besűrítjük, és egy éjszakán át hűtőszekrényben tartjuk. A kristályokat szűrjük és hideg éterrel mossuk, és deszikkátorba tesszük. Az elsődleges kitermelés 7,63 g és az anyalúgból származó termék 7,26 g MA-Gly-Phe, amelynek olvadáspontja 141-142,5°C.
Metakriloil-glicil-fenil-alanin-p-nitro-fenol-észter (MA-Gly-Phe-ONp) előállítása
A fent előállított MA-Gly-Phe alkalmazásával MA-Gly-Phe-ONp
-t (NM-G-F-ONp) állítunk elő a MA-Gly-ONp előállításához hasonló módon, a következő reakcióvázlat szerint.
• · · · · · • · · • · · · · • · · · ·
MA-G-F-ONp szintézise
C«3 ch3
c=o
I
NH +
I ch9
I c=o
I
NH ch-ch2-<2> c=o
I
OH
DCC/THF ----------_> 6 h, -20°C;
egy éjszakán át 4°c c=o
I
NH
I
CH, I c=o
NH
C=0
no2
MA-G-F p-nitro-fenol
7,63 g (0,026 mól) MA-Gly-Phe-t és 4,02 g (0,029 mól) p-nitro-fenolt feloldunk körülbelül 125 ml tetrahidrofuránban, szobahőmérsékleten. A keveréket -20°C-ra hűtjük, és keverés közben lassan hozzácsöpögtetjük 5,96 g (0,029 mól) DCC 15 ml tetrahidrofuránnal készített oldatát. A reakció 6 órát tart -20°C-on, és 1 éjszakán át 4°C-on. Másnap az oldatot 1 órát keverjük szobahőmérsékleten, majd hozzáadunk néhány csepp ecetsavat, és a keverést még 30 percig folytatjuk. A DCU-t kiszűrjük és tetrahidrofuránnal mossuk. A visszamaradt oldatot szárazra pároljuk, majd etil-alkohol és víz elegyében kristályosítjuk hűtőszekrényben 1 éjszakán át. Az elsődleges termék tömege 1,48 g (a további kristályosításokkal együtt a teljes kitermelés 3,1 g). A tisztított termék
moláris extinkciós koefficiensét (ε27ΐ=10^ 1/mól · cm, dimetil-szulfoxidban) spektrofotometriásán határozzuk meg.
4. példa
Metakriloil-glicil-fenil-alanil-leucil-glicin-p-nitro-fenil-észter (MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp vagy MA-G-F-L-G-ONp) MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (MA-G-F-L-G) intermedier előállítása
A metakriloil-glicil-fenil-alanil-leucíl-glicint (MA-Gly-Phe-Leu-Gly vagy MA-G-F-L-G), a MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp prekurzorát, a következő reakcióvázlat szerint állítjuk elő.
MA-G-F-L-G szintézise
CHo I J nh9 1 z / ch3
c 1 CH-CH
l c=o I 1 c=o I \ ch3 dioxán/víz
1 NH I + 1 NH [ 24 h, szoba-
1 ch9 1 1 ch9 hőmérséklet
1 c=o I 1 c=o I ----------->
1 NH 1 OH NaHCO3
ch-ch2^>
c=o
CH?
I J ch9=c
I c=o
I
NH
I
CH9
I c=o
NH
c=o
NH /CHo
I
CH-CH
C=0 \CH-j
I
NH
I ch9
I c=o
MA-G-F-ONp
L-G
OH
0,5 g (1,22 x 10'^ mól) MA-Gly-Phe-ONp-t meleg csapvíz alatt feloldunk 7,35 ml dioxánban, ami oktil-pirokatekin inhibitort tartalmaz. 0,25 g (1,34 x 10'3 mól) Leu-Gly-t és 0,225 g (2,68 x 10-3 mól) nátrium-hidrogén-karbonátot feloldunk 6 ml vízben. A keverékhez hidrokinon inhibitort adunk. A vizes keveréket beleöntjük a szerves keverékbe, és a reakciót 24 órát folytatjuk szobahőmérsékleten. A dioxánt rotációs Lepárlóval eltávolítjuk 40°C alatti hőmérsékleten. A visszamaradt terméket 0°C-ra hűtjük, és ezután körülbelül 5 ml, oktil-pirokatekin inhibitort tartalmazó hideg etil-acetátot adunk hozzá. Az etil-acetátos keverékhez a 2-3 pH eléréséig lassan hozzácsöpögtetjük egy 1:1 arányban hígított vizes sósavoldat körülbelül 0,505 ml-ét. Az etil-acetátos réteget eltávolítjuk, és a vizes réteget háromszor 4 ml etilacetáttal extraháljuk. Az etil-acetátos frakciókat egyesítjük és háromszor 5 ml vízzel extraháljuk a nem reagált Leu-Gly eltávolítására, és nátrium-szulfáttal szárítjuk. Az oldatot szűrjük és szárazra pároljuk. A száraz keverékhez oktil-pirokatekin inhibitort tartalmazó száraz étert adunk, egy éjszakán át hűtőszekrényben tartjuk, majd szűrjük. A kristályokat éterrel mossuk és deszikkátorba tesszük. A tiszta termék kitermelése 320 mg, olvadáspontja 150-154°C. A vékonyrétegkromatográfiás elemzés (10:2:0,5 = aceton:éter:ecetsav) azt mutatja, hogy a reagensek eltűntek a reakciókeverékből.
Metakriloil-qlicil-fenil-alanil-leucil-qlicil-p-nitro-fenil-észter (MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp) előállítása
A különböző reakciókból kapott MA-Gly-Phe-Leu-Gly-t egyesítjük az MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp előállításához a következő reak39
cióvázlat szerint.
MA-G-F-L-G-ONp szintézise
C=O
NH +
I
CH,
I c=o
I
NH ch-ch2-<^>
c=o
Γ
NH /CH7
I
CH-CH
I
C=O \CH->
I
NH
I ch9
I c=o
I
OH
p-nitrofenol
DCC/THF -------------->
perc, -20°C;
h, 10°C; egy éjszakán át 4°C
C=O
I
NH
C = O
NH ch-ch2-<Q>
c=o
NH
I /ch3
CH-CH c=o \ch3
NH
0,5 g (1,09 x 103 mól) MA-Gly-Phe-Leu-Gly-t és 0,166 g (1,19 x 10’3 mól) p-nitro-fenolt feloldunk 8,1 ml száraz tetrahidrofuránban meleg csapvíz alatt. A keveréket -20°C-ra hűtjük, és lassan hozzácsöpögtetjük 0,269 g (1,3 x 10-3 mól) DCC körülbelül
1,1 ml tetrahidrofuránnal készített oldatát. A reakciót fél órát folytatjuk -20°C-on, 5 órát -10°C-on, és egy éjszakán át • ·
I
4°C-on. Oktil-pirokatekin inhibitort adunk a reakciókeverékhez, és még 24 órát keverjük szobahőmérsékleten. Belecsöpögtetünk
12,5 μΐ ecetsavat és még 30 percig folytatjuk a keverést. A DCU-t kiszűrjük. A terméket feloldjuk etil-acetátban és 1 órát hűtőszekrényben tartjuk. A DCU-t kiszűrjük, és az etil-acetátot bepároljuk. A terméket feloldjuk etil-acetátban, szűrjük, és rotációs bepárlóban szárazra pároljuk; ezt még kétszer ismételjük. A kapott terméket éterben áztatjuk egy éjszakán át, szűrjük és szárítjuk. Ezt az anyagot aceton és éter 3 : 1 arányú elegyéből kristályosítjuk. Az elsődleges kitermelés 287 mg, és az anyag olvadáspontja 122-126°C. Az extinkciós koefficienst (e269
104 1/mól · cm, dimetil-szulfoxidban) spektrofotometriásán határozzuk meg. Az aminosavelemzés megerősíti a feltételezett szerkezetet; a Gly : Phe : Leu arányt 2:1: 1-nek mutatja.
A következő 5. és 6. példákban bemutatjuk kopolimer prekurzorok előállítását az 1-4. példa szerinti monomerek felhasználásával, amelyeket az I-V kopolimerek előállítására alkalmazunk.
5. példa
Polimer-Gly-ONp előállítása
HPMA (1. példa) és MA-Gly-ONp-t (2. példa) - amit prekurzor la-nak vagy lb-nek nevezünk - kopolimerjét állítjuk elő a kö vetkező reakcióvázlat szerint.
C=0
NH i
9H2
CHOH
I ch3
aceton C=O c=o
1 í
AIBN NH I NH 1
--------- 1 CH, 1 z 1 CH9 I z
24 h, 50°C 1 CHOH | c=o I
ch3 1 0 í
íAi
v-
no2
HPMA
MA-G-ONp
A polimer Gly-ONp-t (prekurzor la) gyökös kicsapásos polimerizálással állítjuk elő acetonban, 2,26 g (85 mól%) HPMA-ból és 0,74 g (15 mól%) MA-Gly-ONp-bol, 0,144 g azo-izobutil-nitril (AIBN) alkalmazásával, 12,5 t% monomer, 86,9 t% aceton és 0,6 t% AIBN alkalmazásával. A monomereket és az AIBN-t feloldjuk az acetonban, szűrjük, ampullába tesszük és nitrogéngázt buborékoltatunk át rajta. Az ampullát lezárjuk és a keveréket 50°C-on polimerizáljuk 48 óra hosszat. A polimert szűrjük, acetonnal és száraz éterrel mossuk, és deszikkátorba tesszük. A polimert felold juk metil-alkoholban, újra kicsapjuk acetonban, acetonnal és éterrel mossuk és deszikkátorba tesszük. A tisztított termék kitermelése 1,52
g. A spektroszkópiásan meghatározott
ONp-tartalom
104 1/mól · cm, dimetil-szulfoxidban)
10,6 mól%. A tömeg alapján átlagolt molekulatömeget a polidiszperzitást (1,5) 1-amino-2-propanollal végzett aminolízis után határozzuk meg FPLC analízissel 10 x 30 cm-es Superose 12 oszlópon, poliHPMA frakciókkal kalibrálva (puffer: 0,5 M nátrium-klo42
rid + 0,05 M TRISZ; pH = 8).
Hasonlóképpen állítjuk elő a prekurzor lb-t, ami 5,1 mól%
ONp-t tartalmaz, tömeg alapján átlagolt molekulatömege 23 000 és polidiszperzitása 1,5.
6. példa
Polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp előállítása
HPMA (1. példa) és MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (4. példa) kopo limerjét, amit prekurzor 2a-nak vagy 2b-nek nevezünk, állítjuk elő a következő reakcióvázlat szerint.
ch3
C=O
C=O c=o
I
NH (
CH7
I
CHOH
I ch3 aceton
+ NH 1 AIBN NH 1
1 ch9 1 1 ch2 1
c=o 24 h, 50°C l CHOH |
NH ch3
1 CH-CH I >
1 C = O I
1 NH /ch3
CH-CH
C=O \ch3
NH
NH
I ch2 l
c=o
I
NH 1 /“Ν ch-ch2-^J c=o
I
NH /CHo
I
CH-CH !
c=o \ch7
I
NH
I ch2
I c=o
NO 2
HPMA
MA-G-F-L-G-ONp
A Gly-Phe-Leu-Gly-ONp oldalláncot két különböző mennyiségben tartalmazó kopolimereket állítunk elő. A kisebb mennyiséget tartalmazót (amit prekurzor 2a-nak nevezünk) a III kopolimer (polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg) és az I kopolimer (polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-adria) egyedi polimerek előállításában, a nagyobb mennyiséget tartalmazót (prekurzor 2b) a IV kopolimer előállításában alkalmazzuk, ami kombinációs kopolimer.
/Gly-Phe-Leu-Gly-ceg (IV kopolimer) polimer \Gly-Phe-Leu-Gly-adria
A prekurzor 2a előállításához 726,97 mg (96 mól%) HPMA-t, 123,02 mg (4 mól%) ΜΑ-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp-t és 41 mg AIBN-t feloldunk 7,5 ml acetonban. Az oldatot szűrjük, ampullába tesszük és nitrogéngázt buborékoltatunk át rajta. Az ampullát lezárjuk és a monomereket 50°C-on kopolimerizáljuk 30 óra hosszat. A kicsapódott kopolimert szűrjük, acetonnal és éterrel mossuk, és deszikkátorba tesszük. Ezután feloldjuk metil-alkoholban (18 t%), és újra kicsapjuk aceton és éter 3 : 1 arányú elegyének 100 ml-ében. A végső kitermelés 570,5 mg kopolimer, amelynek ONp-tartalma UV-spektroszkópiával meghatározva 3,7 mól% (£274 ~ 0,95 x 10^ 1/mól -cm, dimetil-szulfoxidban). A tömeg alapján átlagolt molekulatömeget (21 000) és a polidiszperzitást (1,6) 1-amino-2-propanollal végzett aminolízis után határozzuk meg FPLC analízissel 10 x 30 cm-es Superose 12 oszlopon, poliHPMA frakciókkal kalibrálva (puffer: 0,5 M nátrium-klorid + 0,05 M TRISZ; pH = 8).
A prekurzor 2b-t ugyanilyen módon állítjuk elő gyökös kicsapásos kopolimerizációval. 206,7 mg (90 mól%) HPMA-t, 93,3 mg (10 mól%) MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp-t és 14,4 mg AIBN-t feloldunk 2,65 ml acetonban. A kopolimerizáció 48 órát tart 50°C-on. A kopolimer végső kitermelése 197,5 mg, ONp-tartalma spektrofotometriásán meghatározva 7,8 mól%. (ε272 = x 104 1/mól · cm, dimetil-szulfoxidban). A tömeg alapján átlagolt molekulatömeget (18 000) és a polidiszperzitást (1,6) l-amino-2-propanollal végzett aminolízis után határozzuk meg FPLC analízissel 10 x 30 cm-es Superose 12 oszlopon, poliHPMA frakciókkal kalibrálva (puffer: 0,5 M nátrium-klorid + 0,05 M TRISZ; pH = 8). A prekurzor 2b hasítható oldalláncainak 7,5 mól%-os mennyisége annak a felső határnak a közelében van, ami jelen lehet, és a polimer még megtartja fiziológiás oldatokban való oldhatóságát, különösen ha hidrofób hatóanyagokat kapcsolunk a polimer oldalláncához.
Az I-VI kopolimerek előállítását az 5. és 6. példák szerinti prekurzor kopolimerek alkalmazásával az alábbi 7-12. példákban ismertetjük.
A következő példákban az alkalmazott rákellenes hatóanyag adriamycin-hidroklorid (adria), amelynek szerkezetét az alábbi képlet mutatja.
i/Hz ‘ HCC
A következő példákban az alkalmazott fénnyel aktiválható hatóanyag a meso-chlorin eg-monoetilén-diamin-dinátriumsó (cég), amelynek szerkezetét
7. példa
Polimer-Glv-ce6 (III kopolimer) előállítása
A nem bontható oldalláncokat tartalmazó III kopolimert
11,2 t% (Illa kopolimer), 7,9 t% (Illb kopolimer), illetve 8,3 t% (lile kopolimer) ceg-ot tartalmazó formában állítjuk elő a következő reakcióvázlat szerint.
P-G-ONp + cég
1. DMSO, 5 h, szobahőfok
--------------->
2. 1-amino-2-
-propanol; 5 perc
OO | c=o I
1 NH I 1 NH I
1 CH? 1 1 CHn I Δ
CHOH c=o 1
ch3 1 NH 1 cefi
···♦ ·· · · ··β • · « ····· • ··« · t ···· ♦ ······ ·
A Illa kopolimert a következőképpen állítjuk elő: 225 mg,
10.6 mól% ONp-t tartalmazó polimer-Gly-ONp-t (prekurzor la, amelynek molekulatömege körülbelül 17 000 és polidiszperzitása 1,5) feloldunk 0,8 ml dimetil-szulfoxidban. 39,4 mg (57,5 μτηόΐ) meso-chlorin eg-monoetilén-diamin-dinátriumsót (cég) (gyártja a Porphyrin Products, Logan, Utah, Amerikai Egyesült Államok) feloldunk 0,4 ml dimetil-szulfoxidban. A cég oldatot hozzáadjuk a P-ONp oldathoz (még 0,3 ml dimetil-szulfoxidot is hozzáadunk mosásra) , és 5 órát keverjük szobahőmérsékleten. Ezután hozzáadunk
25.7 μΐ l-amino-2-propanolt és a keveréket 15 percig keverjük szobahőmérsékleten. Az oldatot acetonnal kicsapjuk és egy éjszakán át hűtőszekrényben tartjuk. A polimert szűrjük, acetonnal és éterrel mossuk, majd deszikkátorban szárítjuk. Ezután feloldjuk 3,5 ml metil-alkoholban és egy 55 x 3 cm-es LH-20 oszlopra viszszük. A fő polimerfrakciót összegyűjtjük, rotációs bepárlóban szárazra pároljuk, desztillált vízben feloldjuk, fagyasztjuk és liofilizáljuk. A fő csúcs 142,3 mg terméket tartalmaz és a polimer kapott teljes mennyisége 217 mg. A spektrofotometriásán (£238 = x 185 1/mól · cm, metanolban) meghatározott chlorintartalom 11,2 t% (2,6 mól%).
A Illb és a lile kopolimert hasonlóan állítjuk elő az lb prekurzor kopolimerből (molekulatömege körülbelül 23 000 és polidiszperzitása 1,5), illetve az la prekurzor kopolimerből (molekulatömege körülbelül 17 000 és polidiszperzitása 1,5); az előállított kopolimerek 7,9 illetve 8,3 t% ceg-ot tartalmaznak.
8. példa
PoIimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg (II kopolimer) előállítása
11,2 t% ceg-tartalmú, lebontható oldalláncokat tartalmazó II kopolimert állítunk elő a következő reakcióvázlat szerint.
1. DMSO, 4 h, szobahőmérséklet CH3\
-Í4 c=o
I
NH
I
CH9
CHOH
I ch3
P-G-F-L-G-ONp + cég
2. 1-amino-2-pro panol, 5 perc
200 mg, 3,7 mól% ONp-t tartalmazó polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp-t (prekurzor 2a, amelynek molekulatömege körülbelül 21 000 és polidiszperzitása 1,6) feloldunk 0,75 ml dimetil-szulfoxidban.
32,9 mg ceg-ot (1,25-szörös moláris felesleg) feloldunk 0,15 ml ♦ ··· ·· «· · ·· • · *···«· • ··· · · · ·· · ···»·· · « dimetil-szulfoxidban, A ceg-os keveréket hozzáadjuk a polimerkeverékhez (további 0,2 ml dimetil-szulfoxidot is hozzáadunk mosásra) , és 4 órát keverjük szobahőmérsékleten. Az elméletileg megmaradó ONp-csoportokhoz képest háromszoros feleslegben l-amino-2-propanolt (6,4 μΐ) adunk hozzá, és a keveréket még 5 percig keverjük. A kopolimert aceton és éter 3 : 1 arányú elegyével kicsapjuk, szűrjük, acetonnal és éterrel mossuk, majd deszikkátorban szárítjuk. A kopolimert azután feloldjuk 5 ml metil-alkoholban, és 55 x 3 cm-es LH-20 oszlopra visszük. A kopolimernek megfelelő sávot összegyűjtjük, szárazra pároljuk, feloldjuk desztillált vízben, és liofilizáljuk. A tiszta termék kitermelése 168 mg és ceg-tartalma spektrofotometriásán meghatározva (£394 =1,58 x 105 1/mól · cm, metanolban).
9. példa
Polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-adria (I kopolimer) előállítása
Bontható oldalláncokat tartalmazó, 7,4 t% adriamicyntartalmú I kopolimert állítunk elő a következő reakcióvázlat szerint.
etil-amin; 3 h, szoba- hőmérséklet C=0 1 NH 1 CH, I c=o 1 NH 1 CH, 1
P-G-F-L-G-ONp ---------_> 1 CHOH | 1 c=o I
+ adriamycin- 2. 1-amino- ch3 1 NH
HC1 -2-propanol; | CH-Ch 2-(Q
6 perc c=o
NH /CH, ί
CH-CH
C=0 \CH, ί 3
NH
C=0
I
NH
I adria
200 mg (3,7 mól% ONp) polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp-t (2a prekurzor, amelynek molekulatömege körülbelül 21 000 és polidiszperzitása 1,6) feloldunk 0,76 ml dimetil-szulfoxidban. 27,8 mg (4,8 x 10”5 mól) adriamycin-hidrokloridot feloldunk 0,18 ml dimetil-szulfoxidban és hozzáadjuk a feloldott polimerhez. Hozzáadunk 5,35 μΐ (3,84 x 10”5 mól) trietil-amint, és a reakcióelegyet 1 órát keverjük szobahőmérsékleten, ekkor hozzáadunk még 20 % (2,7 μΐ, 9,6 x 10~6 mól) trietil-amint. A reakció szobahőmérsékleten 3 óra hosszat tart. A keverékhez 6,4 μΐ l-amino-2-propanolt adunk az elméletileg megmaradt ONp-csoportokhoz képest háromszoros fő50 ··«· υ· 4 · »4« ·· ······ • ··· « 4 ···» ······ ·4 löslegben, és a keveréket még 5 percig keverjük. A terméket aceton és éter 4:1 arányú elegyének 4,75 ml-ében kicsapjuk és 1 órát hűtőszekrényben tartjuk. Ezután szűrjük, acetonnal és éterrel mossuk, és deszikkátorba tesszük. A terméket feloldjuk 5 ml metil-alkoholban és egy 55 x 3 cm-es LH-20 oszlopra visszük. A fő polimercsúcsot összegyűjtjük, szárazra pároljuk, megfagyasztjuk és liofilizáljuk. Az adriamycintartalom (e4gg = 1,19 x 104 1/mól· cm, vízben) körülbelül 9 t% és a végső kitermelés 183 mg.
10, példa
Polimer-(Gly-Phe-Leu-Gly-adria)-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg (IV kopolimer) előállítása
Bontható oldalláncokat tartalmazó, 4,2 t% ce6-tartalmú és 7,25 t% adriamicyntartalmú IV kombinációs kopolimert állítunk elő a következő reakcióvázlat szerint.
• · · · ·· «>· Μ 9 9 • * * · ·· · « • «·· · · · ··· ••••♦· « 9
ΝΗ
CH?
I
CHOH
I ch3
1. adriamycin-HCl +
P-G-F-L-G-ONp ----------------->
trietil-amin; 2 h szobahőmérséklet
2. ceg 3 h szobahőmérséklet
DMSO
' H í CH3\
44-
S * / \ c=o | c=o 1
l NH 1 1 NH |
1 CH9 1 1 ch7 1
c=o I c=o I
1 NH 1 NH 1
ch-ch2-<Q ch-ch2/3
c=o I c=o I
1 NH /CH3 1 NH /CH3 |
CH-CH I CH-CH |
1 c=o \ch7 I J 1 c=o \ch7 1
1 NH | 1 NH 1
1 ch7 1 z 1 ch7 I z
c=o 1 c=o t
l NH 1 NH t
adria 1 ce6
mg (7,8 mól% ONp) polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp-t (2b prekurzor, amelynek molekulatömege körülbelül 18 000 és polidiszperzitása 1,6) feloldunk 0,10 ml dimetil-szulfoxidban. A polimeroldathoz 4,6 mg (7,9 μπιόΐ) adriamycin-hidrokloridot adunk 0,12 ml dimetil-szulfoxidban oldva. Hozzáadunk 0,88 μΐ (6,3 μτηόΐ) trietil-amint. A reakciót 1 órát folytatjuk szobahőmérsékleten. Ezután hozzáadunk még 40 % (0,44 μΐ, 3,2 μιηόΐ) trietil-amint és a reakciót még 1 órát folytatjuk. Az oldat egy részét (0,06 ml) eltávolítjuk adriamycin-analízisre. Az adriamycintartalmat spektroszkópiásan (£450 = 1-19 x 104, vízben) körülbelül 7,25 t%-ra • » ····«· • ··· * 4 · ··· ·····* · · • · ♦« ·· · 4 · «4 becsüljük. Az oldathoz hozzáadjuk 1,75 mg (2,6 μιηόΐ) cég 0,03 ml dimetil-szulfoxiddal készített oldatát, majd 0,44 μΐ trietil-amint. A reakciókeveréket 3 órát keverjük, hozzáadunk 2,1 μΐ (27 μπιόΐ) l-amino-2-propanolt és a keveréket még 5 percig keverjük. Az oldatot aceton és éter 3:1 arányú elegyének 400 ml-ében kicsapjuk és 3 órát hűtőszekrényben tartjuk. A polimert ezután szűrjük, acetonnal és éterrel mossuk, és deszikkátorba tesszük. A polimert feloldjuk körülbelül 5 ml metil-alkoholban és egy 55 x 3 cm-es, metil-alkohollal ekvilibrált LH-20 oszlopra visszük. A tisztított termék kitermelése 27,1 mg és körülbelül 4,2 t% ceg-ot tartalmaz spektroszkópiásan meghatározva (e394 = 1,58 x 105
1/mól · cm, metanolban).
11. példa
Polimer-(Gly-szekretin)-Gly-ce6 (V kopolimer) előállítása
A nem bontható oldalláncokat tartalmazó V kopolimert a következő reakcióvázlat szerint állítjuk elő.
P-G-ONp + -amin, C=O I oo I C=O I
ce6 + 30 h, 1 NH | NH 1 NH I
szekretin ----------> ch2 1 ch9 I z 1 ch9 1
szoba- CHOH 1 1 c=o 1 c=o I
hőfok 1 ch3 1 NH | 1 NH
! ce6 szekretin
·· « mg polimer-Gly-ONp-t (prekurzor la, amelynek molekulatömege körülbelül 17 000 és polidiszperzitása körülbelül 1,5) feloldunk 50 μΐ dimetil-szulfoxidban. 2 mg (2,9 μιηόΐ) ce6-ot feloldunk 30 μΐ dimetil-szulfoxidban és hozzáadjuk a polimeroldathoz. Ezután 19 mg (6,2 μπιόΐ) szekretin (porcin) 110 μΐ dimetil-szulfoxiddal készített oldatát adjuk a keverékhez. A reakciókeverékhez 10 μΐ (7,5 μιηόΐ) trietil-amint (tízszeres hígítás dimetil-szulfoxidban) adunk, 1 órát keverjük szobahőmérsékleten, és hozzáadunk még 5 μΐ (3,7 μπιόΐ) trietil-amint, majd 1 óra múlva még 5 μΐ (3,7 μπιόΐ) trietil-amint. A keveréket 30 órát keverjük szobahőmérsékleten, majd 2,5 ml vízzel hígítjuk, és 20 %-os etanolban dializáljuk 8 órát, 4°C-on (6000-8000 molekulatömeg határok) a szerves oldószer eltávolítására. Ezután még 40 órát dializáljuk vízben, majd további 24 órás vizes dializálás következik (12 000-14 000 molekulatömeg határok) annak biztosítására, hogy a nem reagált szekretin teljes mennyiségét eltávolítsuk (a szabad szekretin távollétét FPLC oszlopon - HR 10/30-as oszlop, Superose 12, 0,05 M trisz + 0,5 M nátrium-klorid, pH=8 - igazoljuk). A szabad hatóanyagot vízzel ekvilibrált PD-10 oszlopon különítjük el. A mintát megfagyasztjuk és liofilizáljuk. A ceg-tartalmat UV-spektroszkópiával Ce400 = i»68 x 105) meghatározva 5,9 t%-nak találjuk, és a szekretintartalom 6 n sósavoldattal való hidrolizálás után aminosavelemzéssel meghatározva 300 μg/mg konjugátum.
12, példa
Polimer-(Gly-Phe-Leu-Gly-adria)-(Gly-Phe-Leu-Gly-ce£)-Gly-Phe-Leu-Glv-szekretin) (VI kopolimer) előállítása
400 mg P-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp-t (prekurzor 2b; ONp-tartalom ··♦♦ ·· · ·τ • · «««·«· • ··· · · · »*· ······ « *
7,8 mól%; tömeg szerinti átlagmóltömeg 18 000; polidiszperzitás
1,6) feloldunk 1 ml dimetil-szulfoxidban. A kopolimer oldathoz hozzáadjuk 23 mg (40 μπιόΐ) adriamycin-hidroklorid 0,6 ml dimetil-szulfoxiddal készített oldatát, majd 4,4 μΐ (32 μπιόΐ) trietil-amint. A reakciókeveréket 1 órát szobahőmérsékleten tartjuk, majd hozzáadunk 2,2 μΐ (16 μπιόΐ) trietil-amint, és ezután 1 óra múlva hozzáadjuk 8,75 mg (12 μπιόΐ) cég 0,15 ml dimetil-szulfoxiddal készített oldatát. A reakciókeveréket 3 órát keverjük, majd hozzáadunk 400 mg (13 mmól) szekretint, és a reakciót szobahőmérsékleten folytatjuk egy éjszakán át. A reakciókeveréket 10 %-os vizes etanollal szemben dializáljuk 5 órát, és tiszta vízzel szemben 48 órát, majd megfagyasztjuk és liofilizáljuk.
Más kopolimereket is alkalmazhatunk olyan kombinációs polimerek készítésére, amelyek a polimerlánchoz kapcsolva egy rákellenes szert és egy fénnyel aktiválható hatóanyagot tartalmaznak. Az ilyen polimerek előállítását a következő példákkal szemléltetj ük.
13. példa g dextránt (molekulatömege 40 000) és 35 mg 4-(N,N-dimetil-amino)-piridint feloldunk dimetil-szulfoxid és piridin 1:1 térfogatarányú elegyének 20 ml-ében. Ehhez az oldathoz három részletben 500 mg klór-hangyasav-p-nitro-fenil-észtert adunk. 20 perc múlva a reakciókeveréket abszolút etanol feleslegéban kicsapjuk, mossuk és vákuumban szárítjuk. A p-nitro-fenil-csoporttartalom UV-spektrofotometriával meghatározva 5,1 mól%.
14. példa
500 mg aktivált dextránt (előállítása a 13. példa szerint, aktívcsoport-tartalma körülbelül 1,5 x 10-4 mól) feloldunk 8 ml dimetil-szulfoxidban. Hozzáadjuk 1 x 10~4 mól adriamycin-hidroklorid és 1 x 10~4 mól N-(2-amino-etil)-chlorin-eg-amid 2 ml dimetil-szulfoxiddal készített oldatát, majd 1 x 10-4 mól trietilamint. 5 óra reakcióidő után hozzáadunk 2 x 10 _4 mól 1-amino-2-propanolt. 10 perc múlva a mind adriamycin-, mind pedig ceg-láncokat tartalmazó polimert kicsapjuk, szűrjük és leszívatjuk, mossuk és vákuumban szárítjuk.
15, példa
000 molekulatömegű poli(l-vinil-2-pirrolidon-ko-maleinsavanhidrid)-et készítünk J. Pato és munkatársai módszere szerint [Makromol. Chem. Rapid. Commun., 2« 643. oldal, (1982)]. Ennek a kopolimernek 200 mg-ját feloldjuk száraz dimetil-formamidban. 1 x 10-4 mól puromycin és 1 x 10~4 mól N-(2-amino-etil)-mezochlorin-eg-amid 1 ml dimetil-formamiddal készített oldatát adjuk a kopolimer oldathoz és 3 órát reagáltatjuk 40°C-on. A reakcióterméket dietil-éteres kicsapással különítjük el és vákuumban szárítjuk. A polimer - hatóanyag konjugátumot forró vízben oldjuk a nem reagált anhidridcsoportok hidrolizálására. Az oldatot ezután lehűtjük, 72 órát dializáljuk egy Visking dializálócsőben vízzel szemben és fagyasztva szárítjuk.
In vitro vizsgálatok
16. példa
Fotofizikai elemzések
A szabad cég és a nem hasítható polimer-Gly-ceg (Illb kopolimer) fotofizikai tulajdonságainak összehasonlítása során a gerjesztett állapot mérését közvetlen és közvetett módszerekkel is elvégezzük. Időfüggő fluoreszcenciás méréseket végeztünk a Center fór Fást Kinetics Research (CFKR) intézetben (Texas-i Egyetem, Austin) egyes fotonszámlálási technika alkalmazásával [Atherton és munkatársai: J. Phys. Chem. , 93, 6809. oldal, (1989)]. A triplet - szingulett spektrumok eltérését és a tripletek élettartamát számítógéppel vezérelt, on-line pillanatkinetikai spektrofotométer alkalmazásával végezzük. A gerjesztést Quantel YG 481 Q-ra kapcsolt Nd:YAG lézerrel hajtjuk végre. A szingulett oxigén képződés mennyiségi értékét ( g) a fotokémiai szenzibilizátornak levegővel telített D2O-ban, 355 nm-es pulzáló lézerrel kiváltott gerjesztése után határozzuk meg a szingulett oxigén kibocsájtása után (1270 nm), az idő függvényében.
A közvetett módszerhez az oxigénfelvétel mennyiségi értékét számítjuk ki az oxigénkoncentráció csökkenésének méréséből egy adatrőgzítős oxigénelektródás rendszerben, mint a következő arányt: (az oxigénmolekulák felvételének kezdeti sebessége)/(a fotonok abszorpciójának kezdeti sebessége). A reakciókeverékek a fotokémiai szenzibilizátort és furfuril-alkoholt tartalmaznak szubsztrátként. Azért választottuk a furfuril-alkoholt, mert az jó hatásfokkal lép kémiai reakcióba a szingulett oxigénnel (sebességi állandó 1,2 x 10®). Ezenfelül nem reagál a hidrogén-peroxiddal és -szuperoxiddal, és nagyon valószínű, hogy nem megy át gyökök által megindított autooxidáción [Maurette és munkatársai: Helv. Chim. Acta, 66, 722, (1983); és Haag és munkatársai: Chemosphere, 13 , 631, (1984)]. A reakciókeverékeket megvilágítjuk egy 500 W-os résprojetorral, amely egy 407 nm-es interferenciaszűrővel (sávszélesség 10 ± 2 nm 50 %-os csúcs transzmittanciá57 nál) van felszerelve, és rögzítjük az oxigénkoncentráció időfüggő csökkenését. Az esetenkénti fényenergiát egy vákuumos hőkapcsolásos millimikro-voltmérővel mérjük, amit standard lámpákkal kalibráltunk. Az esetenkénti fényfluencia mértéke körülbelül 2 mW/cm2. Az abszorbeált fény frakcióját egy szilíciumos fotodiódás fotométerrel határozzuk meg. A szingulett oxigén képződés mennyiségi értékeit az oxigénfelvétel mennyiségi értékeiből becsüljük a telítési furfuril-alkohol koncentrációknál, bengáli vöröst alkalmazva standardként. A mennyiségi értékek meghatározásában ± 5-10 % hiba van. Ezt az eljárást megismételjük polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg (II kopolimer) alkalmazásával, hogy öszszehasonlíthassuk az oxigénképződés mennyiségi értékében fellépő különbséget az oldalláncán csak glicint tartalmazó polimer-Gly-ceg ugyanilyen értékéhez képest.
Szingulett oxigén képződés
Az 1 g szingulett oxigén képződésének közvetlen bizonyítéka 1270 nm-en mért emissziója, amit 30 μιηόΐ cég vagy polimer-Gly-ceg nátrium-foszfát pufferben (pH-7,4), D20-ban 355 nm-en végzett pillanatgerjesztést követően határozunk meg. Az infravörös-közeli emisszió elsőrendű reakcióként cseng le, 54,4 ± 1 illetve 50,1 ±
1,5 με élettartammal a cég illetve a polimer-Gly-ceg esetében. Ezek az értékek a szingulett oxigén D2O-ban való elbomlására közölt 55 με érték tartományában vannak. Az oxigénfelvétel mennyiségi értékei a ceg-tal, polimer-Gly-ceg-tál (Illb kopolimer) és bengáli vörössel szenzibilizált furfuril-alkohol fotooxidációja során a furfuril-alkohol koncentráció függvényében maximumot érnek el és csökkenni kezdenek körülbelül 50 mM furfuril-alkohol koncentrációnál. A furfuril-alkohol ebben a tartományban semlegesíti a szingulett oxigén teljes keletkezett mennyiségét. Az oxigénfelvétel mennyiségének arányai ebben a tartományban (a furfuril-alkohol telítési koncentrációi) és a szingulett oxigén képződött mennyiségének irodalmi értéke bengáli vörös esetében (0,75) lehetővé teszi a J0^g szingulett oxigén képződés mennyiségi értékének kiszámítását polimer-Gly-ceg és szabad cég esetében (az eredmények az 1. táblázatban láthatók).
1. táblázat
Szingulett oxigén képződés mennyiségi értékei (0 Mg) szabad ce6
és polimer Glv-ce6 esetében
Minta Oldat
ce6 7,4 pH-jú puffer 0,73
ce6 puffer + CTAB 0,81
polimer*-Gly-ceg 7,4 pH-jú puffer 0,25
polimer*-Gly-ceg puffer + CTAB 0,83
*IIIb kopolimer; CTAB = cetil-trimetil-ammónium-bromid; puffer: 100 mM nátrium-foszfát puffer (pH = 7,4).
A polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg (II kopolimer) esetében PBS-ben, 100 mM furfuril-alkohol koncentrációnál az oxigénfelvétel mennyiségi értékét 0,06-nak találtuk, ami kicsit alacsonyabb, mint a polimer-Gly-ceg (Illb kopolimer) esetében (az oxigénfelvétel mennyiségi értéke 0,1). Ha azonban CTAB-ot adagolunk, ez az érték 0,39-re növekszik, ami összehasonlítható a cég és a polimer-Gly-ceg esetében CTAB hozzáadással mért értékekkel.
Ezek az adatok azt mutatják, hogy a ceg-nak nem kell feltét59 lenül lehasítva lennie a kopolimerről ahhoz, hogy fotodinamikus hatása legyen. A kopolimerhez kötött cég oldhatósági tulajdonságai azonban nagymértékben befolyásolják szingulett oxigén képzésének mennyiségi értékét. A polimer-Gly-ceg szingulett oxigén képzésének mennyiségi értéke nátrium-foszfát pufferben jóval kisebb, mint a szabad hatóanyagé. Mindkettőhöz detergenst (CTAB) adva, a szingulett oxigén mennyiségi értéke a szabad cég esetében kis mennyiséggel, a polimer-Gly-ceg esetében jelentősen nőtt. Ez azt mutatja, hogy a polimer-Gly-ceg a pufferben sokkal aggregáltabb formában van jelen, mint a szabad hatóanyag, bár némi monomerizálódás végbemegy a szabad hatóanyagnál, amikor a felületaktív anyagot hozzáadjuk. Az aggregáció bizonyítékai a rövidebb, szélesebb csúcsokon láthatók az abszorbancia spektrumban, és a kioltódásokon a polimer-Gly-ceg pufferben felvett fluoreszcencia spektrumán a ceg-éval összehasonlítva. Vizes oldatban micellás aggregátumok képződnek, mivel a hidrofób cég molekulákat a víz taszítja, így egy hidrofób magot képez, amelynek a vízzel érintkező külső héját a hidrofil polimer képezi.
Triplet állapotbeli tulajdonságok
Az oxigént igénylő fotoszenzibilizációs reakciók a biológiai rendszerekben általában azért lehetségesek, mert a fotokémiai szenzibilizátor triplet állapotai hosszú életűek. A triplet és a szingulett spektruma közötti különbséget rögzítjük a cég vagy a polimer-Gly-ceg oldatok abszorbanciájának mérésével nátrium-foszfát pufferben (pH=7,4) 1,2 μΞ-mal a 355 nm-es pillanatgerjesztés után levegőben. A leghasználhatóbb triplet abszorpciós csúcsot 430 nm-nél találjuk mindként szenzibilizátor esetében. A szenzi-
bilizátorok triplet élettartamát ezen a hullámhosszon mérjük argonatmoszférában. A cég estében ez 400 μΞ és a polimer-Gly-ceg esetében 450 με.
Fény hatására bekövetkező elszíntelenedés (photobleachinq)
A fény hatására bekövetkező elszíntelenedés mennyiségi értékét a cég és a polimer-Gly-ceg (Illb kopolimer) esetében a következő arány alakjában mérjük: (a szenzibilizátor molekulák eltűnésének kezdeti sebessége)/(a fotonok abszorpciójának kezdeti sebessége) . A molekulák eltűnését spektrofotometriásán követjük különböző időpontokban ugyanazzal az izzólámpával végzett megvilágításnál, egy 407 nm-es sáváteresztő szűrővel, amint azt a fotooxidációs vizsgálatoknál használtuk. Ezekben a mérésekben is
5-10 % a hiba.
2. táblázat
Szabad cég és polimer-Gly-ceg fény hatására bekövetkező elszíntelenedésének mennyiségi értéke
Oldat ce6 polimer-Gly-ceg
puffer (pH = 7,4) 1,3 x 10'3 2,8 x 10“4
puffer + 10 mM furfuril-alkohol 1,2 x 10-3 2,5 χ 10’4
puffer +0,5% HSA 6,8 x 10’4 4,8 x 10’4
puffer + CTAB 4,9 x 104 5,9 x 10“5
polimer-Gly-ceg: Illb kopolimer; HSA: emberi szérumalbumin;
puffer: 100 mM nátrium-foszfát (pH = 7,4)
A 2. táblázat mutatja a cég és a polimer-Gly-ceg (Illb kopolimer) fény hatására bekövetkező elszíntelenedésének mennyiségi értékeit különböző reakciókörülmények között. A reakciókeverékek 5 μΜ-osak a szenzibilizátorra nézve, levegővel telítettek (0,22 mM oxigén) és 100 mM nátrium-foszfát puffért (pH = 7,4) tartalmaznak. A cég fény által kiváltott elszíntelenedése elsőrendű kinetikát követ, amíg a szenzibilizátor 60 %-a el nem színtelenedik. A fény hatására bekövetkező elszíntelenedés során nem észlelhető csúcs a látható spektrumban, ami azt jelzi, hogy a makrociklust megzavarták. A furfuril-alkoholnak kis hatása van, míg a HSA a mennyiségi értéket körülbelül a kontrol 50 %-ára csökkenti. A CTAB azonban meggátolja a cég fény által bekövetkező elszíntelenedését .
A polimer-Gly-ceg fénnyel hatására bekövetkező elszíntelenedése másrészt nem elsőrendű kinetikát követ és a mennyiségi érték a ceg-énak csak 20 %-a. A látható spektrumban hasonlóképpen nem jelent meg új csúcs. A fő eltérés a polimer-Gly-ceg-tál kapott eredményekben a cég-hoz hasonlítva az, hogy a HSA valamelyest növeli a mennyiségi értéket a polimer-Gly-ceg esetében és a detergens (CTAB) csak enyhén gátolja a fény hatására bekövetkező elszíntelenedést.
A fény hatására bekövetkező elszíntelenedés hasznos lehet a PDT során, hogy a fény mélyebbre tudjon behatolni a daganatszövetbe, ahogy a vegyület a fény hatására elszíntelenedik, miután PDT hatását kifejtette. A daganatban mélyebben levő szenzibilizátor azután aktiválható. Ha nagy mennyiségű szenzibilizátor van a felső rétegben, az abszorbeálja a fényt és meggátolja, hogy áthatoljon a daganaton.
példa
Cég lehasítása a polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg-ból katepszin B-vel
Előzetes kísérleteket végzünk a katepszin B hatásának jel-
lemzésére, ami egy borjúlépből elkülönített lizoszomális ciszteinproteáz. A moláris extinkciós koefficienst (e281 = 5,15 x 10^ 1/mól · cm, 0,09 M foszfátpufferben, pH=6) spektrofotometriásán határozzuk meg /molekulatömeg: 28 000 [Pohl és munkatársai: FEBS Lett., 23, 142, (1982)]/. Különböző enzimkoncentrációkat vizsgálunk, hogy megtaláljuk a kielégítő aktivitásút. 0,53 mg katepszin B-t (19 μπιόΐ) és 1,54 mg (5 μπιόΐ) glutationt tartalmazó reakciókeveréket, és szubsztrátként 1,0 mg (2,3 mmól; 0,025 ml 40 mg/ml-es dimetil-szulfoxidos oldat) Na-benzoil-L-arginin-p-nitro-anilidet (ΒΑΡΝΑ) alkalmazunk. A foszfátpufferen (0,09 M, pH= 6) először nitrogéngázt buborékoltatunk át. Ezután elkészítjük az oldatokat és jégen tartjuk. Az enzimen, a glutationon és a pufferkeveréken nitrogéngázt buborékoltatunk át 5 percig. Az oldatot ezután előinkubáljuk 37°C-on 5 percig, hogy a glutation aktiválja az enzim kötődési helyét. A szubsztrátot (ΒΑΡΝΑ) gyorsan hozzáadjuk és a 410 nm-en mérhető abszorbanciát követjük az idő függvényében. Ez a koncentráció Aa^q/IO perc = 1,76 enzimaktivitást eredményez. Az aktivitás vizsgálatára az idő függvényében szimuláljuk azokat a reakciókörülményeket, amelyeket később a polimerrel alkalmazunk majd; az enzimet és a glutationt a pufferban inkubáljuk 120 órát (37°C), ekkor a szubsztrátot hozzáadjuk és figyeljük az abszorbanciát 410 nm-en. Az enzim még 68 %-osan aktív.
A polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg (II kopolimer) hasítási tulajdonságainak meghatározására először különböző enzim- és polimerkoncentrációkat hasonlítunk össze, és a legjobb kombinációt választjuk. A polimerből (1,9 mg/ml foszfátpufferben), az enzimből (2,12 mg/ml foszfátpufferben) és a glutationból (15,36 mg/ml) törzsoldatot készítünk. A pufferen most is először nitrogéngázt buborékoltatunk át. 0,25 ml enzim törzsoldaton és még 0,4 ml pufferen nitrogéngázt buborékoltatunk át jégen, 5 percig. Hozzáadunk 0,1 ml glutationt és az oldatot előinkubáljuk 5 percig 37°C-on. Hozzáadunk 0,25 ml polimer törzsoldatot és a mintát nitrogéngázzal átöblítjük és lezárjuk. 5 mintát készítünk ilyen módon és 37°C-on inkubáljuk őket sötétben 4, 8, 12, 24 illetve 49 óráig. Mindegyik reakciókeveréket (0,95 ml + 1,55 ml víz) vízzel ekvilibrált PD-10 oszlopra visszük és 1 ml-es frakciókat szedünk. Az oszlopokét előzőleg kalibráljuk polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ce g-tal és szabad ceg-tal is. A polimer-Gly-Phe-leu-Gly-ceg az 1-3. frakciókban, a szabad hatóanyag a 7-10. frakciókban eluálódik. A
10. frakció után 1 ml 1 n nátrium-hidroxid oldatot adagolunk az oszlophoz nem specifikusan kötődött szabad cég felszabadítására. Mindegyik frakció 0,5 ml-ét küvettába tesszük és hozzáadunk 50 μΐ 10 %-os Triton Χ-100-at. Rögzítjük az abszorbanciát 398 nm-en és mindegyik mintára kiszámítjuk a lehasított cég mennyiségét. Kontrolként polimer-Gly-ceg kopolimert vizsgálunk ugyanilyen körülmények között, és ez nem mutat hasadási képességet.
A hasítási vizsgálat eredményei azt mutatják, hogy a cég lehasad a polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg-ból. 120 óra alatt 87,5 %-os lehasítást érünk el. A 7-10. frakciók abszorbanciája (ami megfelel a szabad ceg-nak) növekszik az 1-4. frakciók abszorbanciájának egyidejű csökkenésével (ami megfelel a polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg mennyisége csökkenésének) az idő függvényében. Kiszámítjuk és korrelációba állítjuk a polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg koncentrációcsökkenésének és a szabad cég növekedésének pontos értékeit. Az anyag visszanyerését kiszámítjuk mindegyik mintánál és az mindegyik, esetben néhány százalékkal tér el a 100 %-tól.
Polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg oxigénfelvételének mennyiségi értéke katepszin B-vel végzett hasítás után
A polimerben kötött ceg-ot a szabad ceg-tal összehasonlító fotofizikai vizsgálat eredményei, valamint a hasítható (II kopolimer) és nem hasítható kopolimert (Illb kopolimer) összehasonlító in vivő vizsgálatok eredményei egy olyan vizsgálathoz vezettek, amelynek célja a hasítható kopolimer (II kopolimer) fotofizikai aktivitásának összehasonlítása a cég katepszin B-vel való enzimes felszabadítása előtt és után. Ehhez a vizsgálathoz három mintát készítünk. A törzsoldat koncentrációkat ugyanúgy választjuk meg és a reakciókeverékeket ugyanúgy készítjük el, mint a korábban leírt hasítási vizsgálatban. Két minta esetében a törzsoldatokat összekeverjük és a reakciót 37°C-on sötétben hagyjuk lezajlani 2 napig illetve 1 hétig. A fennmaradó mintát kontrolként használjuk. Részenként inkubáljuk; az enzimet és a szubsztrátot külön inkubáljuk 2 napig. Közvetlenül a fotofizikai elemzés előtt keverjük őket össze. Az oxigénfelvételi méréseket a 16. példában leírt furfuril-alkoholos fotooxidáxiós módszerrel végezzük. A minta 250 μΐ-ét 3,75 ml foszfátpufferrel (pH = 6) hígítjuk és 100 mM furfuril-alkohol telítési koncentrációt alkalmazunk. Az oldatot levegővel telítjük és egy oxigénelektródot teszünk bele. Mérjük az oxigénkoncentráció csökkenését az idő függvényében a minta fénnyel (407 nm) való megvilágítása során. Kiszámítjuk a minta oxigénfelvételének mennyiségi értékét, amiből kiszámítjuk a szingulett oxigén mennyiségi értékét a bengáli vörös korábban meghatározott értékeit használva standardként: 0,375 (az oxigén65
felvétel mennyiségi értéke) és 0,75 (a szingulett oxigén képződés mennyiségi értéke).
Fotofizikai tulajdonságok hasítás után
3. táblázat
Fotofizikai tulajdonságok a cég katepszin B-vel végzett enzimes lehasítása után polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg-ból
Inkubálás g
nincs 0,14
2 nap 0 , 66
1 hét 0,71
Összhangban a többi fotofizikai vizsgálatok eredményeivel,
amelyek nagyobb szingulett oxigén képződési mennyiségi értékeket mutatnak a szabad ceg-nál a polimer-Gly-ceg-tál összehasonlítva (1. táblázat), és a cég hasításának bizonyítékával az in vitro hasítási vizsgálatban, az az oldat, amelyben a polimert (II kopolimer) katepszin B-vel inkubáljuk 48 órát, ötször nagyobb meny-nyiségu szingulett oxigén képződést mutat, mint az az oldat, amelyben az enzimet és a polimert közvetlenül a mérések elvégzése előtt keverjük össze (3. táblázat). 1 hetes inkubálás után a mennyiségi érték megközelíti a szabad ceg-ét. Az oxigénfelvétel mennyiségi értékeit is feltüntetjük.
Ez a vizsgálat, amelyben az oxigénfelvétel mennyiségi értékeit mérjük polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg-os reakciókeverék esetében, katepszin B-vel végzett 48 órás és 1 hetes inkubálási időszak után, jelentős növekedést mutat a mennyiségi értékben a ha• · ♦ · ♦· · · · · · ♦ ♦ *·♦··· • ··· 4 « · ··· **···· · · sítás idejével. Ahogy a ce6 lehasad a polimerhordozóról, a fotofizikai viselkedés egyre hasonlóbbá és hasonlóbbá válik az oldatban levő szabad hatóanyagéhoz. Ez megmagyarázhatja a PDT megnövekedett daganatellenes hatását, amit a hasítható és a nem hasítható kopolimer in vivő összehasonlításánál találtunk. A kopolimerek az alacsony pH függvényében nagyobb mértékben aggregálódhatnak a lizoszóma belsejében, mint a szabad hatóanyag, és ahogy a hatóanyag lehasad, az kevésbé aggregálódott állapotba kerül. Másrészt a konformációs változások még inkább felelősek lehetnek a szingulett oxigén képződés különböző mennyiségi értékeiért a szabad és a kopolimerhez között hatóanyag esetében, mint az aggregálódás. Ezt a különbséget azonban csak fényszórási vizsgálatokkal lehet felderíteni. Ez megmagyarázhatja, miért mutatott a nem hasítható polimer-Gly-ceg-tal végzett PDT a vártnál kisebb daganatvisszaszorító hatást a szabad ceg-hoz viszonyítva (az eredményeket itt nem közöljük), a kopolimer megnövekedett lokalizációs retenciós viselkedése alapján. Még akkor is, ha több polimer lokalizálódhatott a daganatban, PDT hatása nem volt az előre várt, mint a szabad hatóanyagé sejtkörnyezetben. A szabad hatóanyag és a polimer-Gly-ceg PDT hatásának in vivő összehasonlítása azonban nem túl pontos a szabad ceg-nak a hatásos PDT-hez szükséges koncentrációnál való oldhatatlansága miatt. Ezenfelül a felszívódási tulajdonságokban levő különbség, amit a szabad cég és a polimer-Gly-ceg a daganatban való maximális koncentrációjának eléréséhez szükséges eltérő felszívódási idő jelez, különböző késleltetési idők alkalmazását teszi szükségessé a daganat besugárzása előtt.
*« ·· «· · ·· • * * *«·· · • · · · 4 · * ·♦ ·
In vivő vizsgálatok
A neuroblasztóma felelős a 15 évesnél fiatalabb gyerekeknél diagnosztizált rákok 8 %-áért. A legtöbb eset 5 évesnél fiatalabb gyerekeknél lép fel és többnyire mér áttétek vannak a diagnózis idején (a kisgyerekek 50 %-a és az idősebb gyerekek 75 %-a). A prognózis számos tényezőtől függ, így a beteg korától, a betegség súlyosságától a diagnózis időpontjában, és az 1 évesnél idősebb gyerekeknél attól, hogy a nyirokcsomók megtámadottak-e. A neuroblasztóma a szimpatikus idegdúcokból származik, amelyek a szimpatogonionokból képződnek, amik a neurális csúcsokból vándorolnak a korai embrionális fejlődés során. Eredetének helye miatt megjelenésének számos lehetséges elhelyezkedése van. A szimpatikus idegrendszer mentén bármelyik hely egy potenciális neuroblasztóma hely. Az elsődleges daganat szokásos helye a hasüreg, vagy a mellékvese (40 %), vagy egy paraspinális ganglion (40 %). Vannak mellkasi (15 %) és medencei (5 %) elsődleges daganatok is. A neuroblasztóma gyakran mutat periorbitális áttétet [DeVita és munkatársai: Cancer Principles and Practice, 2. kötet, 3. kiadás, 1624-1631, (1987)]. Még a daganatok gyógyításában újabban elért haladás alapján is rossz a neuroblasztóma prognózisa. Gyakran képez áttétet a csontvelőben és kimutatása nehéz [Chadwick és munkatársai: Receptors in Tumor Biology, 169-188, (1986)].
A neuroblasztómát a daganat kiirtásával kezelik, ha azt lokalizálták. A neuroblasztóma egyedi vonása a spontán regresszióra való képessége. A daganatágyban a kiirtás után visszamaradt daganat ritkán újul ki [DeVita és munkatársai: fenti hivatkozás]. A nem operálható lokalizált neuroblasztóma és a regionális neuroblasztóma esetében a daganatkiirtás és a kemoterápia keverékét
·· · alkalmazzák. A kemoterápia (gyakran hatóanyagok keverékével) a szóródott megbetegedés esetében alkalmazott. A kemoterápiás szerek közé tartozik a ciklofoszfamid, doxorubicin (adriamycin), ciszplatin, tenipozid, etopozid, vinkrisztin és dakarbazin. A besugárzási terápiát is alkalmazzák.
A neuroblasztóma molekuláris genetikáját jobban értjük, mint bármelyik más emberi rákos megbetegedését [DeVita és munkatársai: fenti hivatkozás], mégis keveset tudunk sejtfelszíni jelenségeiről. Az antigénekkel szemben monoklonális antitesteket alkalmaztak az emberi neuroblasztómasejtek felszínén mind diagnosztikai, mind terápiás célból. A 131I-izotóphoz kapcsolt monoklonális antitestek hatásosak voltak a szóródott megbetegedésekkel szemben, a nagy daganatot viselő betegek azonban nem reagáltak erre [DeVita és munkatársai: fenti hivatkozás].
Roth és munkatársai [J. Neurochem., 42, 1145, (1984)] azt találták, hogy gerek C1300 daganatából (N18TG2) származó neuroblasztómase j tek egy kiónjának egy specifikus szekretinreceptora van, ami adenilát-ciklázhoz .kapcsolódik. A szekretin egy 27 aminosavas hormon, amit a gyomor-bél rendszerben találtak meg, ahol a hasnyál kiválasztását szabályozza, és szekvenciája a következő :
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ser Arg Leu Arg Asp Ser Alá Arg Leu Glu Arg Leu Leu Gin Gly Leu Val (szekvencia azonosítási szám: 10).
A szekretin fontossága az idegszövetben azonban nem ismert jól, és a neuroblasztómasejteket modellként használták az adenilát-ciklázhoz kapcsolódó peptidreceptorok specifitásának vizsgálatához neuronokbán. A szekretin mérete azonban vonzó abból a ·♦·♦ ·· ·· 4·* • · «·«*·« • ··· 9 a «··· ♦ · 4 · 4 4 »« szempontból, hogy jobban lehetővé teheti a kemény daganatokba való behatolást, mint azok a megtalálást elősegítő láncok, amelyek antitesteken alapulnak.
A Neuro 2A neuroblasztóma sejtvonalat szemléltetésre használjuk, mivel kemény, nehezen kezelhető daganatot képez A/J egerekben. 5-6 hetes A/J egereknek rutinszerűen befecskendezünk körülbelül 1,5 x 10θ életképes C1300 neuroblasztóma daganatsejtet a jobboldali bordaszélnél. Timikor a daganatok kitapinthatóvá válnak, megkezdjük a kezelést. A kezelt és a kontrolcsoportok 5-5 állatból állnak. A hatóanyagokat szokásosan feloldjuk foszfáttal pufferolt konyhasóoldatban (PBS) és intravénásán befecskendezzük az egerek farokvénájába. Kiszámítjuk a mg/kg hatóanyagban kifejezett hatóanyagdózisokat a kopolimerekhez kötött hatóanyag tömegszázalékos mennyisége alapján. A kontrolnál és a kemoterápiás szerrel kezelt csoportoknál követjük a daganattérfogatot a daganatok hosszának, szélességének és mélységének kaliberkörzővel végzett mérésével a hatóanyag beadása után.
A fotodinamikus gyógykezeléshez meghatározzuk az optimális késleltetési időt a hatóanyag beadása után a lokalizációs/retenciós kísérletekből, miután 650 nm-es fényt (argon színes lézer) alkalmaztunk. Több kísérletet végeztünk a megfelelő fény- és hatóanyagdózisok meghatározására. A rákellenes hatást hasonlóképpen a daganattérfogat mérésével követjük. A kevert kísérletekben a hatóanyagokat együtt feloldjuk befecskendezzük a farokvénába. Késleltetési időt hagyunk az adriamycinnek hatása kifejtésére és a fotokémiai szenzibilizátor optimális felszívódására a fény alkalmazása előtt.
Az in vivő vizsgálatok valamennyi adatát mint a csoportban
levő egerek számának átlagértékét adjuk meg.
18. példa
Kemoterápia
A daganatésökkentő hatás szemléltetésére polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-adria-t (I kopolimer; 7,4 t% adriamycin-hidroklorid tartalom) alkalmazunk. Mindegyik vizsgálatban egy kontrolt és I kopolimert alkalmazunk, utóbbit 4,1 mg/kg, 8,2 mg/kg vagy 16,4 mg/kg adriamycin dózissal. A hatóanyagokat bakteriosztatikus sóoldatban oldjuk, és intravénásán beadjuk a farokvénába. A daganatnövekedést a daganat térfogatának feljegyzésével követjük. A kezelés napját tekintjük a nulladik napnak, és a daganatok térfogatát addig követjük, amíg a daganat terhét már nem lehet megkülönböztetni a kontroltól. A túlélőket a kezelés utáni 55. napig figyeljük.
Az eredményeket daganattérfogat/idő formában adjuk meg és a 4-6. táblázatban közöljük a különböző dózistartományokra.
4. táblázat
Átlagos daganattömeg (mm3) idő (napok) 4,1 mg/kg kontroll
3 250 250
5 500 + 200 500 + 200
6 700 + 250 1000 + 250
9 1200 ± 200 2250 ± 350
13 2600 ± 400 5500 + 1000
• · **·«·* • ··· * ♦ · ··r • » · » * A · «
5. táblázat
Átlagos daganattömeg (mm3) idő (napok)
8,2 mg/kg kontroll
2 200 200
4 200 500 + 200
6 200 950 + 150
8 300 + 200 1800 + 200
10 550 + 150 2800 + 600
13 800 + 300 4000 + 800
15 1200 + 500 5300 + 1000
17 1300 + 500 7000 + 1200
idő (napok)
6. táblázat
Átlagos daganattömeg (mm3)
16,4 mg/kg kontroll
0 100 100
3 200 250
5 50 600
6 0 1000 + 100
9 0 2400 + 400
13 0 5500 + 1000
Amint az a 6. táblázatból látható, a 16,4 mg/kg-os dózis 100 • · · · · · • · ·· · %-osan hatásos a daganatok gyógyításában. Ebben a csoportban valamennyi egér daganatmentes maradt és egészséges volt az 55.
napig, amikor megöltük őket (a szabad hatóanyag ugyanilyen dózisa toxikus az egerekre). A 4,1 mg/kg dózist kapott csoport nem műtatott lényeges hatást a kontrolihoz viszonyítva. A 8,2 mg/kg dózissal kezelt csoportban mutatkozott némi daganatot visszaszorító hatás, de nem volt gyógyult eset.
A daganatnövekedést körülbélül 5 napig szorította vissza. A 10. napra a daganatok ugyanolyan arányban növekedtek, mint a kontrolinál. A 8,2 mg/kg-os koncentrációt a későbbi keverési kísérletekben alkalmaztuk.
Az adriamycin (doxorubicin, NSC 123127) kumulatív dózisfüggő kardiomiopátiát okoz, ami legfőbb, dózisának nagyságát korlátozó mellékhatása. Szabad állapotában ez korlátokat szab hosszútávú alkalmazhatóságának. Toxicitása nyilvánvaló egyetlen dózis (16,4 mg/kg) adriamycin beadásánál, míg a polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-adria-nak ez a dózisa csökkenti a daganatokat. Még nagyobb dózisban (20 mg/kg) a szabad hatóanyag 100 %-os pusztulást okoz. Ez a dózis az egereknél kezdeti testtömegcsökkenést okoz a polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-adria beadása utáni első néhány napban, azonban
19. példa
Lokálizációs/retenciós vizsgálatok
Lokalizációs/retenciós vizsgálatokat végzünk, hogy összehasonlítsuk a szabad mezo-klorin-ceg-monoetilén-diamin-dinátriumsó (cég) felvételét a nem bontható polimer-Gly-ceg-éval (Illa kopolimer, 11,2 t% cég), illetve a bontható polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg-éval (II kopolimer, 11,2 t% cég). Mindegyik hatóanyagból 5 • · · ·· 4>· · ·» • · · ♦ · · · · • ··· · · · ·*· • · * · · · · mg/kg-ot fecskendezünk be C1300 neuroblasztóma kitapintható daganatot hordozó A/J egerek farokvénájába. A hatóanyagot először pH-7,4-nél feloldjuk egy foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS). A polimer hatóanyag jobban oldódik a PBS-ben, mint a szabad hatóanyag. A szabad hatóanyag oldatba vitelére vagy a pH-t kell növelni, vagy az oldatot sötétben kell melegíteni, befecskendezés előtt lehűteni és azonnal befecskendezni.
Polimer-Gly-ceg (Illa kopolimer)/szabad cég
Lokalizációs/retenciós eredmények /kmint azt megadtuk, a kitapintható daganatoknál az egereknek 5 mg/kg szabad ceg-ot illetve polimer-Gly-ceg-ot fecskendezünk be. Az állatokat megöljük és különböző szövetmintákat veszünk (daganat, bőr, lép, lábizom, vese, hasizom, máj) a befecskendezés után különböző időpontokban. A mintákat megfagyasztjuk és 2 napig liofilizáljuk. A megszárított mintákat mérjük, és 25 mg szárított mintára számítva 1 ml vizet adunk hozzá. Ezután a szövetet mechanikusan homogenizáljuk, és a homogenizátum 100 μΐ~ét átvisszük egy hidrolíziscsőbe. Mindegyik csőbe 1 ml 50 %-os metanolos metil-benzetónium-hidroxid oldatot teszünk, és a csöveket légtelenítjük. A mintákat hevítőblokkban hidrolizáljuk 1 óra hosszat 55°C-on. Lehűtés után hozzáadunk 2 ml 50 %-os vizes tetrahidrofurán oldatot. Összekeverés után leolvassuk a fluoreszcenciát (EX 397, EM 654), és összehasonlítjuk egy a mintákban levő ceg-koncentráció kiszámítására (ng-ban) szolgáló standard görbével. A szabad hatóanyag a daganatszövetben 1 óra alatt ér el maximális koncentrációt, ellentétben a polimerrel, ami még 48 óra után is nagy koncentrációban van jelen. Az eredményeket a követ- 74 • · · · · · ·· · ·» • · ······ • ··· · · · ·*· ······ « ·
kező , 7-13. táblázatokban szemléltetjük.
7. táblázat - Szövet : daganat
idő (óra) ng ce6/mg szövet
P-Gly-ceg szabad ι ce6
1 30 ± 5 17 ± 5
2 29 ± 8 20 ± 6
4 32 ± 2 4 ± 2
8 37 ± 4 7 ± 2
24 35 ± 4 4 ± 2
48 39 ± 3 2
8. táblázat - Szövet : hasizom
idő (óra) ng ceg/mg szövet
P-Gly-ceg szabad ce6
1 5 ± 2 3,5 ± 1
2 4 ± 0, 5 3 ± 1
4 5 ± 1 3 ± 1
8 7 ± 2 0,5
24 14 ± 2 1
48 8 1
9. táblázat - Szövet : vese idő (óra) ng ceg/mg szövet
P-Gly-ceg szabad ce6
1 31 ± 2 12,5 ±2,5
2 30 ± 2 13 ± 4
4 22 ± 3 4
8 15 ± 2 3
24 13 ± 1 3 ± 1
48 14 ± 3 2 ± 1
10. táblázat - Szövet : lép
idő (óra) ng ceg/mg szövet
P-Gly-ceg szabad cég
1 16 ± 3 6
2 14 ± 1 7 ± 3
4 14 2
8 18 ± 3 2
24 15 ± 2 2 ± 1
48 18 ± 2 1
11. táblázat - Szövet : máj
4 4«
4· ·♦ · idő (óra) ng ceg/mg szövet
P-Gly-ceg szabad cég
1 38 ± 4 73 ± 1
2 41 ± 2 62 ± 1
4 44 ± 2 6 ± 1
8 43 ± 5 7 ± 1
24 65 ± 6 8 ± 1
48 53 ± 5 7
12. táblázat - Szövet : lábizom
idő (óra) P-Gly-ceg ng ceg/mg szövet szabad ce6
1 3,0 ± 0,1 0,9 ± 0,3
2 2,7 ± 0,6 1,3 ± 0,1
4 2,2 ± 0,8 0
8 1,5 ± 0,2 0
24 2,6 ± 0,8 0
48 3,5 ± 0,9 0
»··· ·♦
13. táblázat - Szövet : bőr idő (óra) ng ceg/mg szövet * · · · ·· V · • ··· · Μ « ··· ♦ · · · · · · ·* ·« *· ·»» ««
P-Gly-ceg szabad ce6
1 0,7 0,9
2 1,2 1,9 ± 1,6
4 0,8 ± 0,4 0,1
8 0,9 ± 0,2 0
24 2,7 ± 0,7 0
48 4,7 ± 0,5 0
A polimerrel egy másik kísérletet is végzünk, amelynek során 5 nap után veszünk mintákat. A cég koncentrációja a daganatban ekkor még mindig jelentős (28 ng/mg szövet), bár alacsonyabb, mint a rövidebb időtartamoknál.
Polimer-Glv-Phe-Leu-Glv-ce6 (II kopolimer)/szabad ce6
Lokálizációs/retenciós eredmények
A polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg (II kopolimer; 11,2 t% cég) esetében ugyanazt a lokalizációs/retenciós eljárást alkalmazzuk, mint a polimer-Gly-ceg (Illa kopolimer) esetében. A nem hasítható anyagok vizsgálatának eredményeivel szemben a hasítható polimernél a ceg-tartalom drasztikus csökkenését tapasztaljuk a daganatban 48 óra után és teljes kiürülését 120 óra után. Ez a vizsgálat közvetett módon bizonyítja a cég lehasadását a polimerről daganatsejtekben, és megmutatja a testnek azt a képességét, hogy ki78 ürítse a szabad ceg-ot. Az eredményeket az alábbi 14-20. táblázatokban szemléltetjük.
14. táblázat - Szövet : daganat idő (óra) ng ceg/mg szövet
II kopolimer szabad ce6
1 37 ± 5 7
2 32 ± 2 6
4 42 ± 6 5
8 54 ± 3 3
48 5 2
120 0 0
15. táblázat - Szövet : hasizom
idő (óra) ng ceg/mg szövet
II kopolimer szabad cég
1 1,0 ± 0,2 0,2
2 2,3 ± 0,1 0,1
4 7,5 ± 2,0 0,1
8 10,0 ± 2,0 0,2
48 0 0
120 0 0
16. táblázat - Szövet ; vese idő (óra) ng ceg/mg szövet
II kopolimer szabad cég
1 24 ± 2 9 ± 1
2 21 ± 2 3 ± 1
4 19 ± 1 2
8 14 ± 1 1
48 3 ± 2 1
120 1 vagy 0 1
17 . táblázat - Szövet : lép
idő (óra) ng ceg/mg szövet
II kopolimer szabad ce 6
1 14 ± 1 24 ± 3
2 18 ± 1 24 ± 3
4 24 ± 3 24 ± 3
8 33 ± 3 34 ± 3
48 6 ± 1 21 ± 3
120 1 11 ± 1
·« * «··
80 -
18. táblázat - Szövet : mái
idő (óra) ng ceg/mg szövet
II kopolimer szabad cég
1 42 90
2 35 ± 15 50 ± 6
4 55 ± 7 57 ± 5
8 39 ± 8 28
48 8 31 ± 2
120 3 33 ± 4
19. táblázat - Szövet : lábizom
idő (óra) ng ceg/mg szövet
II kopolimer szabad cég
1 1,3 ± 0,3 0,2
2 1,2 ± 0,4 0,1
4 1,8 ± 0,8 0,3 ± 0,2
8 1,2 ± 0,3 0,1
48 0,6 ± 0,6 0
120 0 0
20. táblázat - Szövet : bor idő (óra) ng ce6/mg szövet
II kopolimer szabad ce6
1 0,2 + 0,1 0
2 0,1 + 0,2 0
4 0,3 + 0,1 0
8 0,1 + 0,1 0
24 0 0
A hasítható polimerrel végzett in vivő lokalizációs/retenciós vizsgálatok (14. táblázat) a ce6 gyors kiürülését mutatják a daganatszövetbol a nem hasítható polimerrel összehasonlítva (7. táblázat). Ugyanezt a tendenciát láthatjuk a hasizom, vese, lép, máj, lábizom és bőrszövet esetében (15-20. táblázat összehasonlítása a 8-13. táblázatokkal). Az in vivő hasítás sebességét különböző oligopeptid-típusú spacer karok alkalmazásával lehet szabályozni. A lassabb hasítás (3-4 nap) is kívánatos lehet, hogy a daganat által fel nem vett kopolimer kiürüljön a test többi részeiből a daganat besugárzása előtt. A befecskendezés és a besugárzás közötti hosszabb felszívódási idő több időt biztosít az adria-nak (vagy egy a ceg-énál viszonylag gyorsabb felszabadulási sebességgel rendelkező spacer karnak) a hatás kifejtésére.
Egy polimer hordozó alkalmazása egy fotokémiai szenzibilizátorhoz csökkenti a mellékhatásokat, úgymint a fénnyel szembeni túlérzékenységet kezelés után, mert amint azt a fenti lokalizá• «
- 82 ciós/retenciós vizsgálatok kimutatták, úgy tűnik, hogy a polimerhez kötött hatóanyagból nagyobb mennyiség halmozódik fel a daganatban, mint a szabad hatóanyagból, még akkor is, ha nem alkalmazunk megtalálást elősegítő láncot. Ez lehetővé teszi alacsonyabb hatóanyagdózis beadását és még mindig lehetséges a daganat retenciója a fotokémiai szenzibilizátor megfelelő koncentrációjával .
20, példa
Fotodinamikus terápia
Több PDT vizsgálatot végzünk. Tanulmányozzuk a különböző hatóanyag- és fénydózisokat, hogy megtaláljuk az optimális kezelési tartományokat. A hatóanyagból különböző koncentrációjú PBSes oldatokat készítünk, és azokat befecskendezzük egerek farokvénájába. Egy bizonyos felszívódási várakozási idő után a daganatot fénysugárzásnak tesszük ki (argon színes lézer, 650 nm) különböző időtartamokig. Az egereket előzetesen anesztetizáljuk nátrium-pentobarbitállal; a törzsoldat 6,48 mg/ml koncentrációjú, 0,013 ml törzsoldat/g testtömeg mennyiséget fecskendezünk be). Először a polimer-Gly-ceg /(Illa) kopolimer/ hatását hasonlítjuk össze a szabad hatóanyagéval. Ezután a polimer-Gly-ceg (Illa kopolimer) daganatellenes hatását hasonlítjuk össze a polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg-éval (II kopolimer). A szabad hatóanyagot már nem használjuk, mert a polimer hatóanyagéval azonos koncentrációt annak oldhatatlansága miatt nem tudtuk elérni. A kezelés (besugárzás) napját tekintjük a nulladik napnak.
Polimer-Gly-ceg (Illa kopolimer) összehasonlítása szabad ceg-tal
A szabad cég és a polimer-Gly-ceg (11,2 t% cég-tartalom, mg/kg, Illa kopolimer) fotodinamikus hatását összehasonlító PDT vizsgálatot végzünk. A besugárzást (500 mW/cm2; 5 perc) egy 1 vagy 24 órás, a szöveti felszívódás érdekében beiktatott várakozási idő után végezzük. Az 1 órás felszívódási idő mindkét csoport esetében toxikusnak bizonyult besugárzás után; mindkét csoport valamennyi állata elpusztult a fénnyel való besugárzást követően. A 24 órás felszívódási idő esetén kapott adatokat a 21. táblázatban adjuk meg.
21. táblázat
Átlagos daganattérfogat (mm3)
Idő (napok) P-Gly-ce g Kontrol
0 100 150
1 150 250
2 200 ± 50 350 ± 50
3 175 ± 50 600 ± 100
4 800 ± 400 2300 ± 100
A szabad hatóanyag lényegében ugyanúgy viselkedik, mint a kontrol, míg a Illa kopolimer a daganatot körülbelül 3 napig visszaszorítja. A szabad ce6 és polimer-Gly-ceg a daganatban való optimális felszívódási idejének különbözősége miatt és a szabad cég oldhatatlansága következtében azoknál a koncentrációknál, amelyek a polimer-Gly-ceg esetében kívánatosak, a szabad hatóanyagot nem tanulmányozzuk tovább.
A polimer-Gly-ceg 48 órás felszívódásának és a besugárzásnak (500 mW/cm2; 5 perc) a hatását a 22. táblázatban szemléltetjük.
22. táblázat
Átlagos daganattérfogat (mm3)
idő (nap) P-Gly-ce 6 kontroll
0 100 100
2 200 200
4 300 400
6 500 ± 150 700 ± 100
8 1400 ± 200 2500 ± 600
10 1800 ± 500 2800 ± 600
Polimer-Gly-ceg (Illa kopolimer) összehasonlítása polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg-tal (II kopolimer)
Több PDT vizsgálatot végzünk a polimer-Gly-ceg (Illa kopolimer) és a polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg (II kopolimer) fotodinamikus hatásának összehasonlítására. A hasítható kopolimer (II kopolimer) mindegyik esetben hatékonyabb. 4 mg/kg ce6 koncentrációnál (24 órás felszívódási idő) és 500 mW/cm2 besugárzási erősségnél (5 percig) 60 %-os halálozás lép fel a hasítható polimerrel kezelt csoportban (az autopszia súlyos fotodinamikus károsodást mutatott a máj és más belső szervek esetében). A nem hasítható polimerrel kezelt csoportban mindegyik egér életben maradt. A kvalitatív hatások, úgymint kifehéredés, ödéma és fekete varasodás valamennyi vizsgálatban jobban észlelhető a hasítható polimer esetében, mint a nem hasíthatóéban. A legjobb eredményeket akkor érjük el, ha jól látható a fekete varasodás. Ha ez fellép, a daganat általában eltűnik néhány napra.
A hasítható kopolimer (II kopolimer) nyilvánvalóan nagyobb fotodinamikus hatása miatt valamennyi további PDT vizsgálatban ezt a polimert alkalmazzuk a polimer-Gly-ceg (Illa kopolimer) helyett. A következő lépést a hatóanyag (II kopolimer) és a fény dózisának optimalizálására végezzük, hogy megállapítsuk a maximális hatást és az egerek maximális túlélését biztosító paramétereket. Hatékonynak bizonyult egy minimális hatóanyagdózis egy megnövelt fénydózissal kombinálva. A polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg (II kopolimer, 11,2 t% cég tartalom) 4, 3,25, 2,5, 2 és 1 mg/kg-os cég dózisait (24 órás felszívódási idő) hasonlítjuk össze 500 mW/cm2 fényerősségnél és 10 perc besugárzási időnél. A 2,5 és 4 mg/kg közötti cég dózisok 20 % és 100 % között váltakozó halálozási arányokat eredményeznek. Az 1 mg/kg-os csoport hatóanyagdózisa látszólag hatástalan volt ennél a fénydózissal a kontrollal összehasonlítva.
A polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg (II kopolimer) 2 mg/kg ce6 dózisát (24 órás felszívódási idő) választjuk tanulmányozásra. A fénydózis (500 mW/cm2) alkalmazásának idejét 5 és 20 perc között változtatjuk. A 20 perces csoportban 60 %-os halálozási arány lép fel, míg az 5 perces csoport kis hatékonyságot mutat. Jelentős hatást érünk el azonban 8 perc 20 másodperces, 10 perces, illetve 13 perc 20 másodperces besugárzási idő esetén.
A legjobb hatást a legkisebb halálozási eséllyel együtt a 2 mg/kg-os polimer-Gly-Phe-Leu-Glyceg (II kopolimer, cég tartalom
11,2 t%) hatóanyagdózis és 10 percig alkalmazott, 500 mW/cm2-es fénydózis esetében érjük el. A 23. táblázatban mutatjuk be azokat az eredményeket, amiket a II kopolimer vizsgálata során a kontrollal összehasonlítva kaptunk; a hatóanyagot 2 mg/kg dózisban intravénásán fecskendezzük be C1300 neuroblasztóma daganatot hordozó A/J egerek farokvénájába, majd a beadás után 24 órával besugározzuk 650 nm-es fénnyel. A kezelt csoport valamennyi tagján jól láthatóan fekete foltok vagy kifehéredés jelenik meg. A kezelést követően 3 napig daganat nem mutatható ki, ezután az idő után a daganatok gyorsan nőnek a kontrolihoz viszonyítva.
23. táblázat
Átlagos daganattérfogat (mm3) idő (óra)
II kopolimer kontroll
0 100 100
2 50 250
4 0 400
6 25 600 ± 100
8 100 ± 50 1150 ± 200
10 300 ± 100 2000 ± 500
12 500 ± 200 3300 ± 500
21. példa
Kemoterápia és PDT együttes alkalmazása
Ezekben a vizsgálatokban vagy 1) polimer-Gly-ceg-ot (Illa kopolimer) és polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-adria-t (I kopolimer), vagy ·· · ···· · ••••4 · · ···
4····· 4 4
2) polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg-ot (II kopolimer) és polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-adria-t (I kopolimer) oldunk fel együtt PBS-ben, és az oldatot intravénásán befecskendezzük kitapintható daganatot hordozó egerek farokvénájába. A fénnyel való besugárzás (argon színes lézer) alkalmazása előtt 2 napos felszívódási időt hagyunk, majd anesztetizálás után besugárzunk a polimer-Gly-ceg vizsgálati protokol szerint (500 mW/cm2; 5 perc), míg polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg alkalmazása esetén csak 1 nap felszívódási időt hagyunk (besugárzás 500 mW/cm^; 10 perc) a lokalizációs/retenciós viselkedésükben levő eltérés miatt. A hatóanyag befecskendezésének napját tekintjük nulladik napnak, ez a kezelési nap.
Polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-adria (I kopolimer) és polimer-Gly-ceg (Illa kopolimer) keveréke
Polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-adria-t (I kopolimer, 7,4 t% adriamycin-hidroklorid; 8,2 mg/kg adriamycin-hidroklorid) és polimer-Gly-ceg-ot (III kopolimer, 11,2 t% cég; 4 mg/kg) keverünk össze és intravénásán befecskendezzük, amikor a daganatok kitapinhatóvá válnak. A második napon a daganatokat besugározzuk (500 mW/cm2; 5 perc). A különösen nagy felszívódási időt azért hagyjuk, hogy az adriamycinnek több ideje legyen hatását kifejteni, mivel a lokalizációs/retenciós kísérletből tudjuk, hogy a cég még mindig nagy koncentrációban lenne jelen. 60 %-os gyógyulási arányt értünk el, és a gyógyultakat az 54. napig kísérjük figyelemmel, amikor a vizsgálatot befejezzük. Ezt a vizsgálatot megismételjük, és a teljes átlagos gyógyulási arány 40 %. A kemoterápia és a PDT együttes alkalmazása sokkal hatékonyabb, mint bármelyik hatóanyag egymagában.
Polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-adria (I kopolimer) és polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg (II kopolimer) együttes alkalmazása
Bár a polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg (II kopolimer) 2 mg/kg-os dózisát hatásosnak találtuk az előző PDT vizsgálatban, ezt a dózist azonban toxikusnak találtuk 8,2 mg/kg polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-adria-val (I kopolimer) együtt alkalmazva. A polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg dózisát ezért 1,5 mg/kg-ra csökkentjük. Együttes alkalmazási vizsgálatot végzünk 1,5 mg/kg polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg és 8,2 mg/kg polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-adria alkalmazásával. Két felszívódási időt (24 és 48 óra) vizsgálunk és 500 mW/cm2/10 perces besugárzást alkalmazunk. A 48 órás felszívódási idejű csoport igen kis hatást mutat, míg a 24 órás csoportban jelentős hatást értünk el; ebben a csoportban 80 %-os hosszútávú gyógyulási arányt tapasztaltunk (az állatokat a 48. napon öltük le) .
Azoknak a vizsgálatoknak az eredményei, amelyekben a polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg-ot és a polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-adria-t kevertük össze és a besugárzás előtt 48 órás felszívódási időt hagytunk, jelentősen eltértek a PDT hatás szempontjából a 24 órás felszívódási idővel kapott eredményektől. A daganat elroncsolásának csökkenése közvetett bizonyítéka a daganatban bekövetkező hatóanyag elhasításnak. A hasítás végbemehet a daganat kapillárisait szegélyező endoteliális sejtekben, és ezeknek a kapillárisoknak az elroncsolódása meggátolhatja, hogy a daganat tápanyagokat kapjon, és így annak elroncsolódásához vezethet. A transzcitózis azonban legvalószínűbben az endoteliális sejtekben megy végbe, ami azt jelezné, hogy a hasítás ténylegesen a daganatsejtekben zajlik le és így ezek elroncsolódása okozza a daganat ···· ·· ·· » ·· ·· · ·*·· · • ··· 9 « 9 ··· elhalását. Egyes polimer anyagok nem kerülhetik el a lizoszomális utat az endoteliális sejtekben, és mindkét mechanizmus hozzájárulhat a daganat elroncsolódásához.
Mindenesetre az adatok azt jelzik, hogy mind a hasítható (polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg) mind pedig a nem hasítható (polimer-Gly-ceg) kopolimer esetében a polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-adria-val összekeverve végzett kombinációs terápia hatékonyabb, mint az ugyanazokkal a dózisokkal végzett PDT vagy kemoterápia egymagában. A terápiák kombinálásával mindkét hatóanyag mellékhatásai leküzdhetők.
22. példa
Kombinációs kopolimer
A kombinációs kopolimert (IV kopolimer) feloldjuk PBS-ben és intravénásán befecskendezzük kitapintható daganatot hordozó egerek farokvénájába (körülbelüli dózis 3,5 mg/kg adriamycin; 1,7 mg/kg cég). 24 órás felszívódási idő után 650 nm-es fényt (argon színes lézer, 500 mW/cm2, 10 perc) alkalmazunk. A daganattérfogatot a kezelési naphoz képest (nulladik nap, a hatóanyag befecskendezése) . Ebben a vizsgálatban a kombinációs kopolimer látszólag nem mutat fotodinamikus hatást. Ez azonban megmagyarázható annak alapján, hogy a kombinációs kopolimert (IV kopolimer) egy olyan prekurzorból készítettük, ami körülbelül 7,8 mól% aktív észtercsoportot tartalmazott. Ez a kopolimer körülbelül 0,9 mól% (4,2 t%) ceg-ot és 2,0 mól% (7,25 t%) adriamycint tartalmaz. A jelen eljárásokkal és kopolimerrel nem lehetett egy kopolimerre olyan arányban felvinni az adriamycint és a ceg-ot (5,5 : 1 tömegarány; ez megfelel 30 t% adriamycinnek, hogy legalább 1 mole···· *· ·· · ·· • · · ···· · • ··· · · · ··· ······ · · kula cég legyen jelen polimerlánconként), ami kívánatos lett volna a kopolimer keverékekkel végzett polimervizsgálatok eredményei alapján, és emellett a kopolimer oldhatóságát is megtartani. Ezt az arányt nem lehet elérni semmilyen oldallánc tartalommal sem úgy, hogy megmaradjon a PBS-ben való oldhatóság. Jelenleg is folynak azonban a kísérletek a polimer oldhatóságának növelésére, ami lehetővé teheti azt, hogy a polimerre több hatóanyagot lehessen felvinni, és így lehetőséget biztosíthat a kívánt adriamycin : cég arány, illetve más hatóanyagok megfelelő arányának elérésére .
Bár a IV kopolimer nem rendelkezik a kívánt adriamycin : cég aránnyal, megvizsgáljuk in vivő terápiás hatását, hogy megtudjuk, az adriamycin (még ilyen kis dózisban is) növeli-e a körülbelül
1,7 mg/kg dózisban alkalmazott cég terápiás hatását. Mivel a 2 mg/kg cég dózist a kontrolvizsgálatok szerint nem lehet túllépni, ezzel együtt 3,5 mg/kg tényleges adriamycin dózist alkalmazunk. Ezenfelül, bár ez a kopolimer átlagban kevesebb mint 1 molekula ceg-ot tartalmaz polimerlánconként (egyes láncok egy vagy több cég molekulát tartalmaznak), 1 molekulánál több adriamycint tartalmaz polimerlánconként. (Ezek a számítások egy a polimer molekulatömeg eloszlásából szervesen következő eloszláson alapulnak, ezért a lánconkénti molekulaértékek nem pontosak.) A kezelésre fellépő elhanyagolható válasz lehet az alacsony adriamycindózis eredménye, annak a ténynek a következménye, hogy nem mindegyik polimerláncban volt beépített cég, vagy talán a két hatóanyag hatása nem hasonlítható össze közvetlenül a különböző kopolimerekhez között hatóanyagok hatásával (későbbi vizsgálatok kimutathatják, hogy egyik hatóanyag befolyásolja a másik hasítását). Ez a ···· · · · · · ·· ·· ·····« • ··· · · · ··« kopolimer több lebontható oldalláncot is tartalmazott, mint az alkalmazott kontrol kopolimerek, ami befolyásolhatta a hatóanyagok lizoszomális enzimekkel való lehasitásának sebességét a kopolimerről.
Bár lehetséges lehet egy kopolimerre felvinni a kívánt adria : cég tömegarányt, polimerlánconként egy molekula ceg-nál kevesebb lesz jelen, ami meghiúsítja azt a célt, hogy egyetlen olyan kopolimert készítsünk, amelyben mindkét hatóanyag egy láncba van beépítve. Nagyobb állatkísérlet-modellben lehetséges azonban a cég százalékos mennyiségének növelése és az ugyanabba a polimerbe beépíthető két hatóanyag arányának csökkentése. Ennek a problémának egy másik megoldása az lenne, hogy egy kopolimerkeveréket alkalmazunk, amelyben az egyik kopolimer tartalmazza mind a rákellenes hatóanyagot, mind a fénnyel aktiválható hatóanyagot (például adriamycin és cég), és a másik kopolimer csak a rákellenes hatóanyagot (például adriamycin) tartalmazza. Az I kopolimer és a IV kopolimer egy keveréke például, amelyek közül mindketttő ugyanazt a megtalálást elősegítő láncot tartalmazza, és egyidejűleg adjuk be őket, biztosíthatja az adria és a ceg kívánt arányát. Hasonlóképpen, a IV kopolimer és bármely másik, akár egy rákellenes hatóanyagot, akár egy fénnyel aktiválható hatóanyagot tartalmazó kopolimer kombinációja beadható együtt, hogy biztosítsuk az egyik biológiailag aktív vegyületnek a másikhoz képest kívánt arányát. Nyilvánvaló ezért, hogy a két biológiailag aktív vegyületet tartalmazó kombinációs kopolimerek alkalmazhatók a kívánt gyógyászati - rákellenes - hatás elérésére, amennyiben megfelelően vannak formulázva.
23. példa
Szekretint tartalmazó polimer-Gly-ceg receptor által kiváltott célbaluttatása
Vizsgálatokat végzünk a megtalálást (célbajuttatást) elősegítő láncot tartalmazó V kopolimer /polimer(szekretin)Gly-ceg/ és a megtalálást elősegítő láncot nem tartalmazó Illa kopolimer P-Gly-ceg/ PDT viselkedésének tanulmányozására C1300 (Neuro 2A) neuroblasztóma sejteken in vitro. A Neuro 2A sejteket (2 χ 105 sejt/üreg) szélesztünk 200 μΐ Dulbecco's Modified Eagle Médium (MÉM) tápközegen (12 % magzati borjúszérum), 96 üregű tenyésztőlemezen, 24 órával a vizsgálat előtt, hogy egy monosejtes réteget hozzunk létre, és hogy a sejtek regenerálhassák receptoraikat. 100 μΐ MEM-et szívunk fel és hozzáadunk 100 μΐ mintát (megtalálást elősegítő láncot tartalmazó vagy nem tartalmazó), így 25 μg ceg/ml MÉM végső koncentrációt érünk el. A sejteket 1,5 órát inkubáljuk (37°C; 5 % szén-dioxid). A MEM-et eltávolítjuk és a sejteket egyszer mossuk 200 μΐ HBSS-sel (Hank-féle pufférőit konyhasóoldat). A felülúszót eltávolítjuk és hozzáadunk 200 μΐ MEM-et. A sejteket 15, 30 vagy 45 percig besugározzuk (650 nm; 15 mW/cm2) egy fehérfényű, vörös szűrővel felszerelt lámpával. A besugárzás után a lemezeket inkubáljuk 18 órát (37°C; 5 % szén-dioxid), hogy biztosítsuk a kezelés hatásának visszafordíthatatlanságát. Hozzáadunk 10 μΐ (5 mg/ml) MTT-t /3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólium-bromid; gyártja a Sigma cég) [Mossmann: J. Immunoi. Methods, .65., 55, (1983); Twentyman és munkatársai: Br. J. Cancer, 56, 279, (1987)]. A lemezeket 4 óra hosszat inkubáljuk (37°C; 5 % szén-dioxid). Ezután eltávolítunk 175 μΐ felülúszót vigyázva arra, hogy ne tegyünk kárt a kék • · » · · ···· V · «« • ♦ · · • · · · · « • · · · · · formazánkristályokban. Mindegyik üregbe 200 μΐ DMSO-ot teszünk, és az oldatokat egyszer újra szuszpendáljuk. Az abszorbanciát ELISA lemezértékelőn (570 nm-es szűrő) olvassuk le. Egy párhuzamosan kezelt kontrollemezt sötétben tartunk.
Szekretin megtalálást elősegítő láncot tartalmazó kopolimer
Kiszámítjuk az első vizsgálat eredményeit, aminek célja a polimer-Gly-ceg (lile kopolimer) és a polimer(szekretin)Gly-ceg (V kopolimer) (25 μςι ceg/ml inkubálási koncentráció másfél óra hosszat) PDT hatásának összehasonlítása Neuroblastoma sejtvonalon, három különböző besugárzási időnél (15, 30 vagy 45 perc). Az 570 nm-en mért abszorbancia arányos az élő sejtek számával, mert csak az élő sejtek mitokondriális dehidrogenázai tudják az MTT-t egy kék formazánszármazékká redukálni, ami 570 nm-en abszorbeál. Az eredmények a 24. táblázatban láthatók.
24. táblázat
Abszorbancia (570 nm)
Kontroll lile kopolimer V kopolimer
Besugárzási idő (perc)
15 30 45 15 30 45
1,6 1,7 1,6 1,7 1,3 0,4 0,3
···« * · ν« · ·· ·· · ···· · • ··· · » · ··· ·»*·«· « ·
A polimer-Gly-ceg-nak (lile kopolimer) láthatólag nincs hatása ebben a koncentrációban, míg a megtalálást elősegítő láncot tartalmazó kopolimer (V kopolimer) a besugárzási időtől függő citotoxikus hatást mutat.
Egy második vizsgálatot végzünk kontrollként úgynevezetett RIF-et (rádió induced fibrosarcoma) alkalmazva (nincs bizonyíték, ami szekretinreceptor létezését mutatná). Mindegyik sejtvonal esetében két különböző sejtszámot vizsgálunk két különböző inkubálási idővel (15 vagy 45 perc). A RIF kontrolnál 5 x 104 sejt/üreg és 1 x 104 sejt/üreg, és a Neuro 2A sejtvonal esetében a 2 x 105 sejt/üreg nagy szélesztési sűrűséget és az 5 x 104 sejt/üreg kis szélesztési sűrűséget vizsgáljuk. A fent leírttal azonos módon járunk el, a nagy szélesztési sűrűséggel felvitt sejteknél azonban az MTT inkubálási időt 2 órára rövidítjük, hogy kiküszöböljük az olyan abszorbancia leolvasási értékek fellépésének lehetőségét, amelyek az ELISA kijelző skáláján kívül esnek. Ezekhez a lemezekhez egy másik ELISA kijelzőt is használunk, ami csak az 560 nm-nél fellépő abszorbanciát tudja kijelezni az 570 nm-rel ellentétben. Ennek azonban nincs jelentősége, mivel a mintákat csak kontroljaikkal hasonlítjuk össze.
A kontrolként alkalmazott nem specifikus sejtvonallal (RIF, szekretinreceptorok nélkül) kapott eredményeket a következő 25. és 26. táblázatokban mutatjuk be.
25. táblázat
Abszorbancia (570 nm)
RIF 5 x 104 sejt/üreg
Kontrol lile kopolimer V kopolimer
Besugárzási idő (perc)
15 45 15 45
1,3 1,3 1,1 1,4 1,1
26. táblázat Abszorbancia (570 nm) RIF 1 x 104 sejt/üreg
Kontrol lile kopolimer V kopolimer
Besugárzási idő (perc)
15 45 15 45
0,63 0,63 0,57 0,75 0 , 52
Sem a megtalálást elősegítő láncot tartalmazó (V kopolimer), sem a megtalálást elősegítő láncot nem tartalmazó kopolimer (lile «» «·«
- 96 kopolimer) nem volt citotoxikus 25 μg ce6/ml inkubálási időnél és 15 perces besugárzási időnél. A 45 perces besugárzási időnél mindkét kopolimer esetében mutatkozott némi citotoxicitás. A megtalálást elősegítő láncot tartalmazó kopolimer kissé hatékonyabbnak mutatkozott, ami egy nem specifikus kölcsönhatás eredménye lehet a hormon és a sejtfelszín között. A megtalálást elősegítő láncot tartalmazó kopolimernek másrészt jelentős időfüggő citotoxikus hatása van Neuro 2A sejtekre, ami különösen a kisebb sejtsűruség esetében kifejezett. A megtalálást elősegítő láncot nem tartalmazó polimer-Gly-ceg-nak (azonos inkubálási koncentrációnál) nincs hatása sejtekre egyik besugárzási időnél sem. Ezeket az eredményeket a 27. és 28. táblázatokban mutatjuk be.
27. táblázat
Abszorbancia (570 nm)
Neuro 2A2 x 10^ sejt/üreg
Kontrol lile kopolimer V kopolimer
15 Besugárzási idő (perc)
45 15 45
1,6 1,7 1,8 1,3 0 , 5
··»· h
- 97 28. táblázat
Abszorbancia (570 nm)
Neuro 2A2 5 x 104 sejt/üreg
Kontrol lile kopolimer V kopolimer
Besugárzási idő (perc)
15 45 15 45
1,7 1,7 1,8 1,2 0,2
Az V kopolimer és a lile kopolimer PDT-hatását összehasonlító citotoxikus vizsgálatok eredményei azt jelzik, hogy az ezekben a vizsgálatokban alkalmazott Neuro 2A daganatvonalban vannak szekretinreceptorok. A szelektív PDT in vitro végbemegy. A PDT specifikus a Neuro 2A sejtvonalra, mivel az RIF sejtvonal inkubálása csak igen kis hatást mutat, kizárólag a legnagyobb besugárzási idő (45 perc) esetében az élő sejtekben bekövetkezett erőteljes csökkenéssel összehasonlítva a Neuro sejtvonal esetében.
A fentiek bizonyítják, hogy a szekretin más, fentemlített és az 5 037 883. számú USA-beli szabadalmi leírásban közölt megtalálást elősegítő determinánsokkal együtt a megtalálást elősegítő láncként működhet a találmány szerinti kopolimer kombinációban.
Bár a találmányt a fenti példákban leírtuk és bemutattuk, ezek a példák csak szemléltető jellegűek és találmányunk oltalmi köre a következő igénypontok által meghatározott körre és annak • · ekvivalenseire terjed ki. A találmány szerinti készítmények célja emberek és melegvérű állatok rákos szöveteinek kezelése. A hatóanyagok konkrét nevének vagy osztályának említését úgy kell tekinteni, hogy az magában foglalja az ilyen szerek szakember számára ismert származékait is, akár rákellenes szerekről, akár fénnyel aktiválható szerekről van szó. így például a fénnyel aktiválható szerek, azaz a porfirinek, ftalocianinok, purpurinok, chlorinok, naftalocianinok, kationos festékanyagok, tetraciklinek felsorolása kiterjed ezeknek a vegyületosztályoknak a származékaira is. A bemutatott fénnyel aktiválható szer, a meso-chlorin egy chlorinszármazék. Mivel a találmány tárgya nem új gyógyszerhatóanyagok önmagukban, hanem inkább egy hordozórendszer az ilyen hatóanyagok eljutásának növelésére a sejt olyan specifikus helyeire, ahol a legnagyobb hatást lehet elérni, számos más hatóanyag, helyetteítés, módosítás vagy származék alkalmazható anélkül, hogy a találmány oltalmi körén kívül esne.
Szekvencia felsorolás (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ:
(i) BEJELENTŐ: J. Kopecek és munkatársai (ii) A TALÁLMÁNY CÍME: HATÓANYAGSZÁLLÍTÓ RENDSZER ENZIMEK-
KEL ÉS FÉNNYEL AKTIVÁLHATÓ HATÓANYAGOK EGYIDEJŰ TOVÁBBÍTÁSÁRA (iii) SZEKVENCIÁK SZÁMA: 10 (iv) LEVELEZÉSI CÍM:
(A) CÍMZETT: Thorpe, North & Western (B) UTCA: 9035 South 700 East, Suite 200 (C) VÁROS: Sandy (D) ÁLLAM: Utah (E) ORSZÁG: Amerikai Egyesült Államok (F) IRÁNYÍTÓSZÁM: 84070 (v) SZÁMÍTÓGÉPPEL OLVASHATÓ FORMA:
(A) A KÖZEG TÍPUSA: 3,5 inch-es diszkett, 720 kb tárolási kapaciás (B) SZÁMÍTÓGÉP: compaq LTE/286 (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: DOS 4.01 (D) SZOFTVER: Word Perfect 5.1 (vi) A JELEN BEJELENTÉS ADATAI:
(A) BEJELENTÉSI SZÁM: 07/822,924 (B) BEJELENTÉSI NAP: 1992. január 21.
(C) NSZO:
(vii) KORÁBBI BEJELENTÉSEK ADATAI:
(A) BEJELENTÉSI SZÁM: nincs (B) BEJELENTÉSI NAP: nem ismert
100 / (Vili) SZABADALMI ÜGYVIVO/KÉPVISELO ADATAI:
(A) NÉV: Western, M. Wayne (B) BEJEGYZÉSI SZÁM: 22 788 (C) HIVATKOZÁSI/AKTASZÁM: T377 (ix) TÁVKÖZLÉSI ADATOK:
(A) TELEFON: (801) 566-6633 (B) TELEFAX: (801) 566-0750 (2) INFORMÁCIÓ AZ 1-ES AZONOSÍTÁSI SZÁMÚ SZEKVENCIÁRÓL:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 4 (B) TÍPUS: aminosav (C) TOPOLÓGIA: lineáris (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 1: Gly Phe Leu Gly (2) INFORMÁCIÓ A 2-ES AZONOSÍTÁSI SZÁMÚ SZEKVENCIÁRÓL:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 4 (B) TÍPUS: aminosav (C) TOPOLÓGIA: lineáris (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 2: Gly Phe Phe Leu (2) INFORMÁCIÓ A 3~AS AZONOSÍTÁSI SZÁMÚ SZEKVENCIÁRÓL:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 4 (B) TÍPUS: aminosav (C) TOPOLÓGIA: lineáris (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 3: Gly Leu Leu Gly
101
f (2) (2) (2) (2)
INFORMÁCIÓ A 4~ES AZONOSÍTÁSI SZÁMÚ SZEKVENCIÁRÓL:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 4 (B) TÍPUS: aminosav (C) TOPOLÓGIA: lineáris (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI
Gly Phe Tyr Alá
INFORMÁCIÓ AZ 5-ÖS AZONOSÍTÁSI SZÁMÚ SZEKVENCIÁRÓL:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 4 (B) TÍPUS: aminosav (C) TOPOLÓGIA: lineáris (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI
Gly Phe Gly Phe
INFORMÁCIÓ A 6-OS AZONOSÍTÁSI SZÁMÚ SZEKVENCIÁRÓL:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 4 (B) TÍPUS: aminosav (C) TOPOLÓGIA: lineáris (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI
Alá Gly Val Phe
INFORMÁCIÓ A 7-ES AZONOSÍTÁSI SZÁMÚ SZEKVENCIÁRÓL:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 4 (B) TÍPUS: aminosav (C) TOPOLÓGIA: lineáris (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI
Gly Phe Phe Gly
SZÁM: 4:
SZÁM: 5:
SZÁM: 6:
SZÁM: 7:
• · · · · • · * · · · • ·
102 (2) INFORMÁCIÓ A 8-AS AZONOSÍTÁSI SZÁMÚ SZEKVENCIÁRÓL:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 5 (B) TÍPUS: aminosav (C) TOPOLÓGIA: lineáris (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 8:
Gly Phe Leu Gly Phe (2) INFORMÁCIÓ A 9-ES AZONOSÍTÁSI SZÁMÚ SZEKVENCIÁRÓL:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 6 (B) TÍPUS: aminosav (C) TOPOLÓGIA: lineáris (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 9:
Gly Gly Phe Leu Gly Phe (2) INFORMÁCIÓ A 10-ES AZONOSÍTÁSI SZÁMÚ SZEKVENCIÁRÓL:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 27 (B) TÍPUS: aminosav (C) TOPOLÓGIA: lineáris (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM:10:
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ser Arg Leu
Arg Asp 5
10 15
Ser Alá Arg Leu Glu Arg Leu Leu Gin Gly Leu Val
103
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (5)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK
1. Készítmény rákos szövetek kezelésére melegvérű állatokban, mely készítmény egy rákellenes hatóanyagot és egy fénnyel aktiválható hatóanyagot tartalmaz kopolimer hordozókhoz kapcsolva, azzal jellemezve, hogy a következő csoportok valamelyikébe tartozik: a) egy kopolimer hordozó, amelyhez egy rákellenes hatóanyag és egy fénnyel aktiválható hatóanyag is kapcsolódik; b) kopolimer hordozók keveréke, amelyek közül a rákellenes hatóanyag az egyik kopolimer hordozóhoz, a fénnyel aktiválható hatóanyag a másik kopolimer hordozóhoz kapcsolódik; vagy c) polimer hordozók keveréke, ahol mind a rákellenes hatóanyag, mind a fénnyel aktiválható hatóanyag az egyik kopolimer hordozóhoz kapcsolódik, és a másik kopolimer hordozóhoz egy olyan vegyület kapcsolódik, amely egy rákellenes hatóanyag és egy fénnyel aktiválható hatóanyag valamelyike, azzal a kikötéssel, hogy a rákellenes hatóanyag olyan oldalláncokkal kapcsolódik a polimer hordozóhoz, amelyek stabilak a melegvérű állatok véráramában, de sejten belül lizoszomális enzimekkel hidrolizálhatók, és a polimer hordozók kívánt esetben egy a megtalálást elősegítő láncot tartalmaznak.
2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a polimer hordozó egy kopolimerizált komonomer egységeket tartalmazó hordozó, amely a következő komponenseket tartalmazza: a) körülbelül 5,0-99,7 mól% nem derivatizált komonomer egység, b) körülbelül 0,2-20,0 mól% derivatizált komonomer egység, melyhez egy rákellenes szer és egy fénnyel aktiválható szer valamelyike kapcsolódik, c) körülbelül 0-94,8 mól% derivatizált komonomer
104 egység, amely megtalálást elősegítő láncokat tartalmaz.
3. A 2. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a polimer hordozó körülbelül 0,1-94,8 mól% derivatizált komonomer egységet tartalmaz, amelyen a megtalálást elősegítő láncok vannak.
4. A 2. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a hordozó egy derivatizált és nem derivatizált komonomer egységeket tartalmazó komonomer, amely a következők valamelyike: N-(2-hidroxi-propil)-metakril-amid (HPMA), N-metkaril-amid, N,N-dialkil-akril-amidok, akrilsav, metakrilsav, poliaminosavak, poliszacharidok, poli(etilén-oxid) szekvenciákat tartalmazó kopolimerek és poli(vinil-pirrolidon) - maleinsavanhidrid kopolimerek.
5. A 4. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a rákellenes hatóanyag a polimer hordozóhoz enzimekkel bontható oldalláncokkal kapcsolódik, amelyek a következők közül kerülnek ki: oligopeptid szekvenciák, oligoszacharid szekvenciák és
ezekhez hasonló szerkezetű nukleinsavak. azzal j ellemezve, 6. Az 5. igénypont szerinti készítmény, hogy az oldallánc egy oligopeptid. 7 . A 6. igénypont szerinti készítmény, azzal j ellemezve, hogy a polimer hordozó derivatizált és nem derivatizált N-(2-
HU9402142A 1992-01-21 1993-01-21 Pharmaceutical composition for treating tumors HUT68082A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/822,924 US5258453A (en) 1992-01-21 1992-01-21 Drug delivery system for the simultaneous delivery of drugs activatable by enzymes and light

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9402142D0 HU9402142D0 (en) 1994-09-28
HUT68082A true HUT68082A (en) 1995-05-29

Family

ID=25237341

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9402142A HUT68082A (en) 1992-01-21 1993-01-21 Pharmaceutical composition for treating tumors

Country Status (14)

Country Link
US (1) US5258453A (hu)
EP (1) EP0621880B1 (hu)
JP (1) JPH08500327A (hu)
KR (1) KR100217186B1 (hu)
AT (1) ATE184201T1 (hu)
AU (1) AU663167B2 (hu)
CA (1) CA2128330A1 (hu)
DE (1) DE69326322T2 (hu)
DK (1) DK0621880T3 (hu)
FI (1) FI943430A (hu)
HU (1) HUT68082A (hu)
PL (1) PL172184B1 (hu)
RU (1) RU94038047A (hu)
WO (1) WO1993014142A1 (hu)

Families Citing this family (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5827819A (en) * 1990-11-01 1998-10-27 Oregon Health Sciences University Covalent polar lipid conjugates with neurologically active compounds for targeting
US5543390A (en) * 1990-11-01 1996-08-06 State Of Oregon, Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education, Acting For And On Behalf Of The Oregon Health Sciences University Covalent microparticle-drug conjugates for biological targeting
US5474765A (en) * 1992-03-23 1995-12-12 Ut Sw Medical Ctr At Dallas Preparation and use of steroid-polyanionic polymer-based conjugates targeted to vascular endothelial cells
US5482719A (en) * 1992-10-30 1996-01-09 Guillet; James E. Drug delivery systems
US20040071637A1 (en) * 1993-04-27 2004-04-15 Elia James P. Method for repairing a damaged portion of a human organ
US5449720A (en) * 1993-05-24 1995-09-12 Biotech Australia Pty Limited Amplification of the VB12 uptake system using polymers
GB9320781D0 (en) * 1993-10-08 1993-12-01 Erba Carlo Spa Polymer-bound camptothecin derivatives
US5444650A (en) * 1994-01-25 1995-08-22 Nippondenso Co., Ltd. Semiconductor programmable read only memory device
US5599831A (en) * 1994-05-27 1997-02-04 Poretz; Ronald D. Method of preparation of pharmaceutical compositions
NO180167C (no) * 1994-09-08 1997-02-26 Photocure As Fotokjemisk fremgangsmåte til å innföre molekyler i cellers cytosol
WO1996031237A2 (en) 1995-04-04 1996-10-10 Wound Healing Of Oklahoma Cancer treatment by photodynamic therapy, in combination with an immunoadjuvant
US6316007B1 (en) 1995-04-04 2001-11-13 Wound Healing Of Oklahoma Combined physical and immunotherapy for cancer
US5776925A (en) * 1996-01-25 1998-07-07 Pharmacyclics, Inc. Methods for cancer chemosensitization
US6375930B2 (en) 1996-06-04 2002-04-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Membrane incorporation of texaphyrins
US6493570B1 (en) 1998-11-02 2002-12-10 Photogen, Inc. Method for improved imaging and photodynamic therapy
US6123956A (en) * 1997-07-10 2000-09-26 Keith Baker Methods for universally distributing therapeutic agents to the brain
CA2299368A1 (en) * 1997-08-05 1999-02-18 Watson Pharmaceuticals, Inc. Conjugates targeted to the interleukin-2 receptor
US6251866B1 (en) * 1997-08-05 2001-06-26 Watson Laboratories, Inc. Conjugates targeted to the interleukin-2 receptor
US8974363B2 (en) 1997-12-11 2015-03-10 Provectus Pharmatech, Inc. Topical medicaments and methods for photodynamic treatment of disease
JP2002500201A (ja) 1998-01-05 2002-01-08 ユニバーシティ オブ ワシントン 膜破壊剤を使用する増強された輸送
US6087952A (en) * 1998-03-06 2000-07-11 Mobile Information Systems, Inc. Remote mobile data suite and method
US6223071B1 (en) 1998-05-01 2001-04-24 Dusa Pharmaceuticals Inc. Illuminator for photodynamic therapy and diagnosis which produces substantially uniform intensity visible light
US20030223978A1 (en) * 1998-05-22 2003-12-04 Nabi Ivan R. Conjugates of an AMF ligand and a cytotoxic molecule for use in cancer therapy
US8557298B2 (en) 1998-08-06 2013-10-15 Provectus Pharmatech, Inc. Medicaments for chemotherapeutic treatment of disease
US6986740B2 (en) * 1998-11-02 2006-01-17 Xantech Pharmaceuticals, Inc. Ultrasound contrast using halogenated xanthenes
US6222093B1 (en) * 1998-12-28 2001-04-24 Rosetta Inpharmatics, Inc. Methods for determining therapeutic index from gene expression profiles
US20030114366A1 (en) * 1999-01-11 2003-06-19 Francis J. Martin Microfabricated particles and method for treating solid tumors
GB9905911D0 (en) 1999-03-15 1999-05-05 Photocure As Method
AU1820400A (en) * 1999-11-17 2001-05-30 School Of Pharmacy, University Of London, The Conjugates of hpma copolymer and ellipticin
WO2001051092A2 (en) * 2000-01-07 2001-07-19 University Of Washington Enhanced transport of agents using membrane disruptive agents
US6455073B1 (en) 2000-07-10 2002-09-24 Enzrel, Inc. Covalent microparticle-drug conjugates for biological targeting
US6454790B1 (en) * 2000-07-21 2002-09-24 Ceramoptec Industries, Inc. Treatment for Barrett's syndrome
AU2002220853B2 (en) 2000-11-29 2007-06-28 Pci Biotech As Photochemical internalization for delivery of molecules into the cytosol
AU2002216864A1 (en) * 2000-12-21 2002-07-01 Mcgill University Conjugates of antibodies and anticancer drugs
US7560424B2 (en) * 2001-04-30 2009-07-14 Zystor Therapeutics, Inc. Targeted therapeutic proteins
EP1974752B1 (en) * 2001-04-30 2012-09-26 BioMarin Pharmaceutical Inc. Subcellular targeting of therapeutic proteins
US20040005309A1 (en) * 2002-05-29 2004-01-08 Symbiontics, Inc. Targeted therapeutic proteins
US7629309B2 (en) * 2002-05-29 2009-12-08 Zystor Therapeutics, Inc. Targeted therapeutic proteins
WO2002090390A1 (en) * 2001-05-04 2002-11-14 University Of Utah Research Foundation Hyaluronic acid containing bioconjugates : targeted delivery of anti-cancer drugs to cancer cells
US20030124742A1 (en) * 2001-08-22 2003-07-03 Prakash Ramesh K. Conjugates targeted to target receptors
US20030072761A1 (en) * 2001-10-16 2003-04-17 Lebowitz Jonathan Methods and compositions for targeting proteins across the blood brain barrier
CA2497195C (en) * 2001-12-14 2014-07-08 The University Of Wyoming Methods and compositions for controlled release of drugs
US6846311B2 (en) * 2002-04-02 2005-01-25 Acueity, Inc. Method and apparatus for in VIVO treatment of mammary ducts by light induced fluorescence
US20050169883A1 (en) * 2002-05-06 2005-08-04 Prestwich Glenn D. Preblocking with non-ha gags increases effectiveness of ha conjugated anticancer agents
ATE359802T1 (de) * 2002-10-04 2007-05-15 Photokinetix Inc Photokinetische abgabe von biologisch aktiven subtanzen unter verwendung von pulsierendem inkohaerentem licht.
ATE465250T1 (de) * 2004-02-10 2010-05-15 Zystor Therapeutics Inc Saure alpha-glukosidase und fragmente davon
CA2557448C (en) * 2004-03-31 2015-06-23 University Of Utah Research Foundation Macromolecular delivery systems for non-invasive imaging, evaluation and treatment of arthritis and other inflammatory diseases
US20070287680A1 (en) * 2004-05-10 2007-12-13 University Of Utah Research Foundation Combined Active and Passive Targeting of Biologically Active Agents
US20090209508A1 (en) * 2005-05-16 2009-08-20 Universite De Geneve Compounds for Photochemotherapy
US7465312B2 (en) 2006-05-02 2008-12-16 Green Medical, Inc. Systems and methods for treating superficial venous malformations like spider veins
US20090326435A1 (en) * 2006-05-02 2009-12-31 Green Medical, Inc. Systems and methods for treating superficial venous malformations like varicose or spider veins
WO2007130465A2 (en) * 2006-05-02 2007-11-15 Green Medical, Inc. Systems and methods for treating superficial venous malformations like spider veins
WO2007143209A2 (en) * 2006-06-02 2007-12-13 University Of Virginia Patent Foundation Luminescent diketonate polymers
EP2492684B1 (en) 2006-06-02 2016-12-28 President and Fellows of Harvard College Protein surface remodeling
GB0618524D0 (en) 2006-09-20 2006-11-01 Isis Innovation Multimeric particles
AU2007322123A1 (en) * 2006-11-13 2008-05-29 Biomarin Pharmaceutical Inc. Methods for treating Pompe disease
EP2279210B1 (en) 2008-05-07 2017-04-12 BioMarin Pharmaceutical Inc. Lysosomal targeting peptides and uses thereof
BRPI0920655A2 (pt) * 2008-10-07 2019-07-09 Rexahn Pharmaceuticals Inc conjugados e hpma-docetaxel ou gencitabina e usos dos mesmos
KR20100083632A (ko) * 2009-01-14 2010-07-22 울산대학교 산학협력단 표적 단백질 분해효소 감응형 항암제 전구체
EP2424877A4 (en) * 2009-04-28 2013-01-02 Harvard College SUPERCHARGED PROTEINS FOR CELL PENETRATION
ES2569514T3 (es) 2009-06-17 2016-05-11 Biomarin Pharmaceutical Inc. Formulaciones para enzimas lisosómicas
AU2010306917B2 (en) 2009-10-13 2014-11-27 Rexahn Pharmaceuticals, Inc. Polymeric systems for the delivery of anticancer agents
US8492339B2 (en) * 2009-10-26 2013-07-23 Empire Technology Development Llc Angiogenesis promoted by caged growth factors
WO2011112482A2 (en) 2010-03-08 2011-09-15 University Of Utah Research Foundation Polymeric drug delivery conjugates and methods of making and using thereof
DK2576638T3 (da) 2010-05-25 2021-03-15 Syndevrx Inc Polymerkonjugerede metap2-inhibitorer og terapeutiske fremgangsmåder til anvendelse deraf
US9895449B2 (en) 2010-05-25 2018-02-20 Syndevrx, Inc. Polymer-conjugated MetAP2 inhibitors, and therapeutic methods of use thereof
US8883503B2 (en) 2011-06-23 2014-11-11 Indian Institute Of Technology Kanpur Hydrogel scaffolds for tissue engineering
PT2774625T (pt) * 2011-09-05 2017-06-22 Maeda Hiroshi Sonda molecular fluorescente do tipo polímero
US11773188B2 (en) 2012-01-20 2023-10-03 Immunophotonics, Inc Chitosan-derived compositions
SI2804611T1 (sl) 2012-01-20 2021-01-29 Immunophotonics, Inc., Sestavki, dobljeni iz hitozana
MX371095B (es) 2013-04-10 2020-01-16 Syndevrx Inc Inhibidores de metionina aminopeptidasa-2 y metodos de tratamiento de la obesidad.
US20190002594A1 (en) 2014-07-16 2019-01-03 Immunophotonics, Inc. Chitosan-Derived Compositions
ES2893749T3 (es) 2015-12-10 2022-02-10 Syndevrx Inc Derivados de fumagilol y polimorfos de los mismos
WO2017123603A1 (en) 2016-01-11 2017-07-20 Syndevrx, Inc. Treatment for tumors driven by metabolic dysfunction
EP3471774A4 (en) 2016-06-16 2020-04-15 Oncoselect Therapeutics, LLC PORPHYRINE COMPOUNDS AND COMPOSITIONS FOR TREATING CANCER
JP7136807B2 (ja) 2017-04-17 2022-09-13 ザ・ユニバーシティ・オブ・シカゴ ヒトの健康及び疾患の治療用途向けの短鎖脂肪酸の腸への送達用ポリマー材料
JP6894747B2 (ja) * 2017-04-19 2021-06-30 キヤノン株式会社 重合体
EP3870231A1 (en) 2018-10-26 2021-09-01 Syndevrx, Inc. Biomarkers of metap2 inhibitors and applications thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0103184B1 (en) * 1982-08-12 1990-01-17 Kanegafuchi Chemical Industry Co., Ltd. Activation of biocompatible terpolymers with biologicals whose binding complements are pathological effectors
GB8500209D0 (en) * 1985-01-04 1985-02-13 Ceskoslovenska Akademie Ved Synthetic polymeric drugs
EP0213811A3 (en) * 1985-08-16 1987-09-09 Johnson Matthey, Inc., Bateriocin-targeted compounds for cancer therapy

Also Published As

Publication number Publication date
FI943430A (fi) 1994-09-20
EP0621880A1 (en) 1994-11-02
DK0621880T3 (da) 1999-12-20
WO1993014142A1 (en) 1993-07-22
EP0621880B1 (en) 1999-09-08
HU9402142D0 (en) 1994-09-28
RU94038047A (ru) 1996-06-10
PL172184B1 (pl) 1997-08-29
JPH08500327A (ja) 1996-01-16
CA2128330A1 (en) 1993-07-22
ATE184201T1 (de) 1999-09-15
KR100217186B1 (ko) 1999-09-01
US5258453A (en) 1993-11-02
AU663167B2 (en) 1995-09-28
FI943430A0 (fi) 1994-07-20
EP0621880A4 (en) 1995-04-19
AU3593093A (en) 1993-08-03
DE69326322D1 (de) 1999-10-14
DE69326322T2 (de) 2000-02-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT68082A (en) Pharmaceutical composition for treating tumors
Krinick et al. A polymeric drug delivery system for the simultaneous delivery of drugs activatable by enzymes and/or light
Dal Corso et al. Innovative linker strategies for tumor‐targeted drug conjugates
Duncan et al. Anticancer agents coupled to N-(2-hydroxypropyl) methacrylamide copolymers. I. Evaluation of daunomycin and puromycin conjugates in vitro
US5106951A (en) Antibody conjugates
Oseroff et al. Strategies for selective cancer photochemotherapy: antibody‐targeted and selective carcinoma cell photolysis
US5053423A (en) Compositions for photodynamic therapy
US5238940A (en) Compositions for photodynamic therapy
KR102065711B1 (ko) 종양 인식형 광감각제-약물 접합체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 종양 예방 또는 치료용 약학 조성물
Schneider et al. Recent improvements in the use of synthetic peptides for a selective photodynamic therapy
CA2605617C (en) Photodynamic therapy using chemiluminescence and a ligand-photosensitiser conjugate
NZ531598A (en) A pharmaceutical composition comprising a sulphonated meso-tetraphenyl chlorin as a photosensistizing agent for use in photodynamic therapy
Abels et al. Targeting of the tumor microcirculation by photodynamic therapy with a synthetic porphycene
US5618790A (en) Protease mediated drug delivery system
CA2605205C (en) Polymeric pharmaceutical agent for treatment of cancer and method for production of the same
Domb et al. Nystatin—dextran conjugates: Synthesis and characterization
JPH10500410A (ja) フリーラジカル薬物の製造用のセレンコンジュゲート
WO2023109618A1 (zh) 抗胰腺癌多肽药物偶联物及其无载体自组装纳米药物和制备方法及应用
JP2011518891A (ja) クロリンｅ６−葉酸結合化合物およびキトサンを含有する癌治療用薬学的組成物
US20010056065A1 (en) Photosensitizers with ligand targeting properties for tumor therapy
KR100911250B1 (ko) 신규한 클로린 ｅ６-엽산 결합 화합물의 제조방법
Krinick et al. Polymer-bound meso-chlorin e6 for PDT
EP1309330B1 (en) Photosensitizers with ligand targeting properties for tumor therapy
KR100918810B1 (ko) 클로린 ｅ６-엽산 결합 화합물을 함유하는 암 치료용 약학적 조성물
Zhi et al. Enzyme-responsive design combined with photodynamic therapy for cancer treatment

Legal Events

Date Code Title Description
DFD9 Temporary protection cancelled due to non-payment of fee