PL172184B1 - Srodek do zwalczania tkanek rakowych u zwierzat cieplokrwistych PL - Google Patents

Abstract

1. Srodek do zwalczania tkanek rakowych u zwierzat cieplokrwistych , znamienny tym, ze zawiera zarówno lek przeciwnowotworowy, jak i lek fotoaktywowany, i ewentualnie grupe kierujaca, przylaczone do nosników kopolimerycznych, wybranych z grupy obejmujacej (a) nosnik kopolimeryczny, do którego przylaczy jest zarówno lek przeciwnowotworowy, jak i lek fotoaktywowany, (b) mieszanine nosników kopolimerycznych, w której do jednego z nosników kopolimerycznych przylaczony jest lek przeciwnowotworowy, a do innego nosnika kopolimerycznego przylaczony jest lek fotoaktywowany oraz (c) mieszanine nosników polimerycz- nych, w której do jednego z nosników kopolimerycznych przylaczony jest zarówno lek przeciwnowotworowy, jak i lek fotoaktywowany, a do innego nosnika kopolimerycznego przylaczony jest czlon wybrany z grupy obejmujacej lek przeciwnowotworowy i lek fotoaktywowany, z tym, ze stosuje sie nosniki kopolimeryczne opisane w punktach a, b i c wytworzone ze skopolimeryzowanych komonomerów obejmujacych (1) okolo 5,0-99,7% molowych komonomerów nie zawierajacych grup funkcyjnych, (ii) od okolo 0,2 do 20% molowych komonomerów zawierajacych grupy funkcyjne, do których przylaczony jest czlon wybrany z grupy obejmujacej srodek przeciwnowotworowy i srodek fotoaktywowany, oraz (iii) od okolo 0 do 94,8% molowych komonome- rów zawierajacych grupy funkcyjne, do których przylaczono grupy kierujace, przy czym lek prze- ciwnowotworowy przylaczony jest do podstawionych komonomerów poprzez lancuchy boczne odporne w krwioobiegu cieplokrwistego zwierzecia, ale podatne na hydrolize przez wewnatrzkomórkowe enzymy lizoso- malne, przy czym wspomniane komonomery sa wybrane z grupy obejmujacej N-(2-hydroksypropylo)meta- krylamid (HPMA), N-metyloakryloamid, N,N-dialkiloakryloamidy, kwas akrylowy, kwas metakrylowy, poliaminokwasy, polisacharydy, kopolimery zawierajace sekwencje polioksyetylenowe i kopolimery poliwinylopirolidon-bezwodnik maleinowy. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest środek do zwalczania tkanek rakowych u zwierząt ciepłokrwistych z wykorzystaniem polimerowych leków o zwiększonej skuteczności terapeutycznej. Leki te stanowią kombinację polimeru z przyłączonymi dwoma lub więcej różnymi lekami, z których jeden jest uaktywniany przez światło. Kombinację tę stanowi mieszanina dwóch kopolimerów, z których jeden zawiera lek fotoaktywowany (sensybilizator), a drugi zawiera lek przeciwnowotworowy albo też jeden kopolimer zawierający lek fotoaktywowany oraz lek przeciwnowotworowy, przyłączone do tej samej cząsteczki polimeru. Kombinacje takie znajdują zastosowanie w leczeniu chorób nowotworowych. Polimery mogą również zawierać odpowiednią grupę kierującą. Lek fotoaktywowany może być połączony z nośnikiem polimerowym wiązaniem nie ulegającym degradacji lub wiązaniem ulegającym degradacji enzymatycznej. Lek przeciwnowotworowy jest zawsze połączony z nośnikiem polimerowym wiązaniami trwałymi w krwioobiegu, ale ulegającymi rozszczepieniu na skutek działania enzymów lizosomowych. Przy takiej budowie obydwa leki przedostają się do tych samych komórek prawie równocześnie, gdyż rozpad obydwu leków w organizmie będzie zazwyczaj taki sam. Występuje więc zasadnicza różnica w porównaniu z terapią kombinowaną obejmującą stosowanie dwóch leków o niskim ciężarze cząsteczkowym, nie przyłączonych do łańcuchów polimeru, których rozpad w organizmie jest odmienny. Ponadto po przedostaniu się do lizosomowego przedziału komórki, lek połączony wiązaniem ulegającym degradacji enzymatycznej zostaje uwolniony z nośnika na skutek działania enzymów lizosomowych i dyfunduje przez błonę lizosomową do cytoplazmy. Lek fotoaktywowany pozostaje nieaktywny w komórce. Ulega on uaktywnieniu tylko po napromieniowaniu światłem o określonej długości fali (jako źródło światła wykorzystać można laser lub reakcję chemiluminescencji, albo dowolne inne odpowiednie źródło). Szybkość uwalniania pierwszego leku przeciwnowotworowego (np. adrii^i^rycyny) w wyniku rozszczepienia przez enzymy lizosomowe można regulować zmieniając strukturę łańcuchów bocznych, np. sekwencji oligopeptydu, P. Rejmanova i inni, Makromol. Chem., 184,2009 (1983). Po upływie optymalnego okresu czasu zastosować można naświetlanie, w wyniku czego nastąpi uaktywnienie leku fotoaktywowanego. Spowoduje to uśmiercenie tych komórek, które nie zostały zniszczone przez pierwszy lek przeciwnowotworowy.

Wynalazek zmniejsza liczbę komórek rakowych odpornych na chemioterapię i w związku z tym zmniejsza prawdopodobieństwo nawrotu nowotworu. Takie rozwiązanie zapewnia większe prawdopodobieństwo powodzenia w leczeniu komórek odpornych na wiele leków (MDR), niż dostępne obecnie sposoby leczenia. W wyniku zastosowania takiej metody zwiększa się stężenie leków w komórkach, nawet jeśli transport leków do wnętrza komórki lub do komórek MDR przebiega wolniej. Jeśli dołączy się odpowiednią grupę kierującą (np. struktury komplementarne z antygenami lub receptorami powierzchni komórki), to kombinowane wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe działanie zapewni wzrost skuteczności (działanie wewnątrzkomórkowe przebiegać będzie według mechanizmu opisanego powyżej, a działanie zewnątrzkomórkowe obejmować będzie działanie na błonę plazmatyczną). Lek polimerowy będzie wiązać się z powierzchniowym receptorem/antygenem komórek MDR i nie musi wejść do środka. Jednak po napromieniowaniu lek fotoakty172 184 wowany będzie wytwarzać singletowy tlen, który spowoduje uszkodzenie błony i w efekcie śmierć komórki.

Wiele leków o niskim ciężarze cząsteczkowym stosowanych w chemioterapii szybko przedostaje się do wszelkiego rodzaju komórek w wyniku przypadkowej dyfuzji przez błonę komórkową. Taki brak selektywności zmniejsza ich dostępność w pożądanej tkance docelowej, a czasami powoduje niepożądane skutki uboczne. Przechwytywanie przez komórki jest tak szybkie, że działanie terapeutyczne nie jest rozciągnięte w czasie. Ponadto na skutek filtracji glomerularnej może nastąpić szybkie usunięcie leków w krwioobiegu.

Kowalencyjne przyłączenie bioaktywnych cząsteczek o niskim ciężarze cząsteczkowym do rozpuszczalnych nośników polimerowych zapobiega zarówno filtracji glomerularnej, jak i wchłanianiu prze komórki na drodze prostej dyfuzji. Wchłanianie ogranicza się do komórek, w których możliwy jest mechanizm selektywności względem substratu, określany jako pinocytoza, zgodnie z którym ograniczony obszar błony komórkowej otacza makrocząsteczkę, a następnie oddziela się do wewnątrz tworząc wolny wewnątrzkomórkowy pęcherzyk zawierający przechwycony materiał.

Taka różnica w mechanizmach wchłaniania stwarza możliwość kierowania leków konkretnie do tych komórek, w których działanie terapeutyczne jest niezbędne.

Kolejna różnica związana jest z odmiennym losem dwóch rodzajów cząsteczek, to znaczy leku związanego z polimerem i leku wolnego, Małe cząsteczki, które przedostają się do komórki na drodze dyfuzji, wykazują skłonność do kierowania się do wszystkich części komórki, podczas gdy makrocząsteczki po pinocytozie przenoszone są w wewnątrzkomórkowych pęcherzykach bezpośrednio do przedziału lizosomowego komórki, w którym dostępnych jest szereg enzymów hydrolitycznych.

W związku z tym wchłanianie w wyniku pinocytozy polimerowego leku, w którym wiązanie leku z nośnikiem jest podatne na hydrolizę lizosomową, dostarcza mechanizmu kontrolowanego wewnątrzkomórkowego uwalniania cząsteczki bioaktywnej, tak że pojawia się ona w cytoplaźmie komórki docelowej. Przeglądu teoretycznych rozważań dotyczących projektowania takich układów leków dokonał ostatnio J. Kopecek w artykule zatytułowanym Synthesis of Tailor-made Soluble Polymeric Carriers, w Recent Advances in Drug Delivery Systems (plemym Press, 1984).

Aby zaprojektować taki układ, należy spełnić dwa kryteria. Po pierwsze musi być utworzone takie wiązanie leku z nośnikiem, które ulega kontrolowanej hydrolizie lizosomowej, ale jest odporne na działanie enzymów w krwioobiegu. Po drugie układ dostarczania leku musi być zdolny do przedostania się do tych komórek docelowych, w których pożądane jest działanie terapeutyczne, przy minimalnym wchłanianiu przez inne komórki.

Znane są trzy podstawowe formy pinocytozy: w fazie płynnej, adsorpcyjną i z udziałem receptorów. Pinocytoza w fazie płynnej stanowi najogólniejszą postać zjawiska, zgodnie z którą rozpuszczalne makrocząsteczki i substancje rozpuszczone przedostają się do komórki w postaci kropelek cieczy. Wiele, a prawdopodobnie wszystkie komórki z jądrami wykorzystują pinocytozę w fazie płynnej do wchłaniania materiału z przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Zjawisko to określa się jako proces składowy, gdyż jest to proces ciągły (w przeciwieństwie do procesu skokowego jakim jest fagocytoza), gdyż komórka zawsze trawi kawałki swojej błony plazmatycznej.

Pinocytoza adsorpcyjną jest również procesem stosunkowo niespecyficznym. Jednakże w takim przypadku makrocząsteczka może fizycznie zaadsorbować się (niespecyficznie) w pewnym miejscu na błonie komórkowej, po czym komórka może rozpocząć proces wpochwiania.

Pinocytoza z udziałem receptorów jest zdecydowanie najbardziej specyficzną formą pinocytozy, w której makrocząsteczka z markerem komplementarnym względem powierzchniowego receptora komórki wiąże się z tym receptorem, a następnie wchłaniana jest do wnętrza komórki. W ten sposób makrocząsteczki takie jak hormony, białka transportowe, białka zmodyfikowane na drodze degradacji, czynniki wzrostu oraz pewne przeciwciała pobierane są przez komórki z płynu zewnątrzkomórkowego. Zaleta pinocytozy z udziałem receptorów związana

172 184 jest z tym, że umożliwia ona przedostanie się do określonych komórek ligandu w większym stężeniu ligandu niż na drodze innego mechanizmu.

Niezależnie od mechanizmu, po wchłonięciu w wyniku pinocytozy, ostatecznym podstawowym zadaniem substancji rozpuszczonej jest dotarcie do drugorzędowych lizosomów, w których może ona ulec degradacji i zostanie wykorzystana przez komórkę na różne sposoby. W związku z tym, że w czasie pinocytozy w fazie płynnej następuje nieograniczone wchłanianie powierzchniowych markerów komórki, jest ona wyposażona w mechanizm zawracania podstawowych lipidów i białek do błony komórkowej.

Jakkolwiek proces pinocytozy zapewnia pewien stopień selektywności względem makrocząsteczek, to selektywność tą można zoptymalizować np. zmieniając ciężar cząsteczkowy, a większą selektywność docelową osiągnąć można wprowadzając do cząsteczki określoną grupę kierującą. Komórki zawierają określone receptory i antygeny komórkowe na powierzchniach, które rozpoznają i oddziaływują z pewnymi typami grup cząsteczkowych określanych jako specyficzne determinanty. Wysoką specyficzność komórkową osiągnąć można wprowadzając w leku polimerowym determinant, który rozpoznawany jest przez ten typ komórek, w przypadku których wymagane jest działanie terapeutyczne.

W związku z tym układ dostarczania leku, który powinien zapewniać osiągnięcie określonego celu, a następnie uwolnienie leku wewnątrz komórki, musi zawierać następujące elementy:

(a) obojętny nośnik polimeryczny, który korzystnie podatny jest na hydrolizę lizosomalną, aby ułatwić wydalanie polimeru z organizmu;

(b) ulegające degradacji wiązanie lek-nośnik, odporne na hydrolizę zewnątrzkomórkową, ale ulegające kontrolowanej hydrolizie lizosomalnej, oraz (c) ewentualną grupę kierującą, jeśli jest ona potrzebna.

Mimo iż naturalne makrocząsteczki mogą być stosowane jako nośniki,m to polimery syntetyczne wykazują szereg zalet; tak np. ich ciężar cząsteczkowy można łatwo dopasowywać w celu uzyskania optymalnej selektywności komórkowej, aponadto, w przeciwieństwie do wielu naturalnych makrocząsteczek nie są one immunogenne. Łatwiej jest również wytwarzać je w skali technicznej.

Syntetyczne polimery oparte naN-(2-hydroksypropylo)-metakrylamidzie (HPMA) zaproponowano jako potencjalne nośniki leków, patrz patenty USA nr 4 062 831 i 4 097 470; polimery takie są rozpuszczalne w środowiskach wodnych i wykazują dobrą biokompatybilność. Ponadto wprowadzając estry p-nitrofenylowe oligopeptydów N-metakryloilowych można je łączyć z wieloma lekami zawierającymi pierwszorzędowe grupy aminowe. Łańcuchy polimerów można usieciować tak, aby nie osiągnąć punktu żelu, ale aby uzyskać optymalny ciężar cząsteczkowy i osiągnąć poprzez zastosowanie wiązań sieciujących ulegających biodegradacji możliwość degradacji polimeru, co ułatwia jego usuwanie z organizmu.

W związku z tym, że wśród enzymów lizosomalnych znajduje się szereg proteinaz zdolnych do hydrolizy wiązań peptydowych, bezpośrednie połączenie cząsteczki bioaktywnej z łańcuchem polimeru wiązaniem amidowym mogłoby ulec hydrolizie lizosomalnej. Jednakże w praktyce nie stwierdzono tego. Natomiast mostki peptydowe usytuowane między lekiem i nośnikiem ulegają degradacji przez enzymy lizosomalne z różnymi szybkościami. Wiązaniem ulegającym rozszczepieniu jest zazwyczaj wiązanie między lekiem i sąsiednim aminokwasem, choć nie zawsze ma to miejsce. Stwierdzono, że szybkość hydrolizy, to znaczy szybkość uwalniania leku, zależy w znacznym stopniu od liczby i charakteru reszt aminokwasów w mostku peptydowym. Mostki zawierające mniej niż dwa aminokwasy nie są zazwyczaj podatne na hydrolizę lizosomalną. Mostki peptydowe zaprojektowane tak, aby spełnić znaną specyficzność substratu dla proteinaz tiolowych, które występując w lizosomach, są szczególnie podatne na rozszczepianie.

Wykazano, że modyfikacja glikoprotein polegająca na wprowadzeniu bocznych łańcuchów oligosacharydowych kończących się galaktozą powoduje zdecydowany wzrost odkładania się galaktoprotein w komórkach miąższowych w wątrobie. Stwarza to możliwość kierowania leków wątrobiaka, nowotworu szczególnie trudnego w leczeniu. Również galaktozamina związana z kopolimerami HPMA wiązaniem amidowym zachowuje się podobnie, co oznacza, że

172 184 receptory na błonach hepatocydów rozpoznają grupę galaktozy nie tylko w glokozydach, ale również wtedy, gdy występuje ona w postaci N-acylogalaktozaminy. Znanych jest wiele innych układów rozpoznawania, np. układ rozpoznawania N-acyloglukozamina/mannoza w komórkach Kupffera i makrofagach, oraz układ rozpoznawania fosfoheksozy w fibroblastach.

Inny możliwy mechanizm kierowania obejmuje wiązanie polimerowego leku z antyciałem które rozpoznawane jest specyficznie przez te komórki, które zawierają odpowiednie receptory antygenowe. Cząsteczki leku związano bezpośrednio z immunoglobulinami, z tym że może to doprowadzić do utraty aktywności leku, utraty aktywności przeciwciała i/lub rozpuszczalności uzyskanego koniugatu.

Kolejny mechanizm kierowania obejmuje zastosowania białka lub hormonu np. transferryny i hormonu pobudzającego melanocyty, który będzie się specyficznie wiązać z komórką docelową.

Jakkolwiek znana jest konieczność syntetyzowania ukierunkowanych leków polimerowych z mostkami peptydowymi ulegającymi hydrolizie (patrz Kopacek, supra), to identyfikacja mostków peptydowych zdolnych do kontrolowanego wewnątrzkomórkowego uwalniania leku z zadawalającą szybkością i identyfikacja kombinacji grupa łącząca/determinant o właściwym ukierunkowaniu na pożądane receptory komórkowe, stanowią przedmiot ciągłych badań.

Jak to zaznaczono wcześniej, szybkość lizosomalnej hydrolizy mostka peptydowego zależy zarówno od liczby jak i charakteru aminokwasów, Stanowi to odbicie zarówno czynników sterycznych jak i strukturalnych. I tak szybkość hydrolizy końcowej grupy w mostku zawierającym 2-4 reszty aminokwasów jest zazwyczaj zależna od liczby reszt, przy czym przypisuje się to oddziaływaniom sterycznym między łańcuchem polimeru i enzymem.

Przy danej długości łańcucha szybkość hydrolizy jest zależna od charakteru (i sekwencji) reszt aminokwasów. Zależność ta wynika ze specyficznego względem substratu charakteru enzymów lizosomowych odpowiedzialnych za rozszczepianie mostka peptydowego. Region enzymu, w którym zachodzi oddziaływanie z substratem, określany jest jako aktywne centrum enzymu. Aktywne centrum spełnia podwójną rolę, gdyż wiąże substrat i równocześnie katalizuje reakcję, np. rozszczepianie. Badania struktur kompleksów proteolitycznych z peptydami wykazują, że centrum aktywne w tych enzymach jest względnie duże i wiąże szereg reszt aminokwasów peptydu.

W związku z tym zdolność do degradacji konkretnego wiązania w łańcuchu peptydowym zależy nie tylko od charakteru struktury w sąsiedztwie rozszczepianego wiązania, ale również od charakteru reszt aminokwasów względnie oddalonych od rozszczepianego wiązania, ale odgrywających istotną rolę w utrzymywaniu enzymu w miejscu podczas hydrolizy. Jak dotychczas szczegółowa budowa centrów aktywnych enzymów lizosomalnych nie została ustalona, co oczywiście stanowi przeszkodę w wytwarzaniu mostków peptydowych ulegających lizosomalnej hydrolizie z odpowiednią szybkością przy stosowaniu leków polimerowych.

W patencie USA nr 5 037 883, z 6 sierpnia 1991 (Kopecek i inni), opisano koniugat leku zawierający obojętny nośnik polimerowy połączony wiązaniem peptydowym z cząsteczkami bioaktywnymi. Koniugat zawiera również mechanizm kierunkowy taki jak przeciwciało, monosacharyd, disacharyd lub białko. Według tego patentu kopolimery N-(2-hycliOksypropylo)metakrylamidu zawierające sekwencje oligopeptydowe zakończone lekiem przeciwnowotworowym (np. adriamycyną, daunomycyną, melfalaniną) oraz grupami kierunkowymi (np. galaktozaminą, fukozylaminą, przeciwciałami anty-Thy 1.2 i przeciwciałami anty-Ia) wykazują lepsze działanie terapeutyczne niż leki o niskim ciężarze cząsteczkowym nie zawierające polimerów. W szczególności opisano koniugat zawierający adriamycynę jako lek (związany poprzez sekwencję oligopeptydową Gly-Phe-Leu-Gly) i galaktozaminę jako grupę kierującą. Patent ogranicza zakres do polimerów zawierających jedną grupę bioaktywną i jedną grupę kierującą.

J.D. Spikes, The Science of Photobiology, 2 Ed., K.C. Smith, red., Plenum Press, NY,

1988, str. 79 -110, opisał sensybilizatory aktywowane światłem o określonej długości, które ostatecznie wytwarzają singletowy tlen, formę o wysokiej aktywności. Mechanizm reakcji sensybilizowanych wykorzystano w leczeniu nowotworów. Terapia fotodynamiczna (PDT) jest terminem określającym wykorzystanie sensybilizatora i światła do destrukcji komórek nowotworowych. Zaletą tej terapii jest to, że sensybilizator pozostaje obojętny aż do uaktywnienia przez światło. Jeden z takich sensybilizatorów, pochodną hematoporfiryny (HPD), porfirynę, zbadano bardzo dokładnie z uwagi na jego wrodzoną zdolność do umiejscowiania się w komórkach rakowych, J. Moan, Photochem. Photobiol, 43, 681 (1986). Istnieje możliwość niespecyficznego wchłaniania jej przez zwykłe komórki. Stwarza to problem naduczulenia, gdy u pacjentów może wystąpić wrażliwość na światło dzienne, nawet przez 30 dni po leczeniu PDT, T.J. Dougherty, J. Invest, Derm., 77, 122 (1981). Z tego względu pożądane jest ukierunkowywanie sensybilizatorów monoklonalnymi przeciwciałami. Wykazano to sprzęgając HPD z monoklonalnymi przeciwciałami przeciw komórkom mięśniakomięsaka DDBA/2J, D. Mew i inni, J. Immunol., 130, 1473 (1983). Jednakże wiele sensybilizatorów stanowią hydrofobowe cząsteczki, które w wyniku związania mogą pogorszyć rozpuszczalność przeciwciał, B. Rihova i inni, Macromol. Chem. Suppl., 9, 13 (1985). Rozpuszczalny w wodzie nośnik polimeryczny (Dekstran) sprzężono z monoklonalnymi przeciwciałami komórek anty-T (anty-Leu) w celu skierowania sensybilizatora (chloryny er,) do ludzkich komórek HPB-ALL białaczki T in vitro, A. Oseroff i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 8744 (1986). Sensybilizatory przyłączono do polimerów i zastosowano w terapii lekowej do destrukcji różnych komórek nowotworowych, J. Kopecek i inni, Journal of Controlled Release, 16. 137-144 (1991); N.L. Krinick i inni, SPIE Advances in Photochemotherapy, 997, 70-83 (1988); N.L. Krinick i inni, Makromol. Chem., 191, 839-856 (1990).

W żadnej z tych publikacji nie zasugerowano równoczesnego podawania kombinacji leków przeciwnowotworowych i sensybilizatorów przyłączonych do nośników polimerycznych, jak to zastosowano zgodnie z wynalazkiem.

Celem wynalazku jest dostarczenie rozpuszczalnych bioaktywnych kopolimerów zawierających boczne grupy środka chemioterapeutycznego i boczne grupy sensybilizatora,przyłączone poprzez wiązania ulegające degradacji enzymatycznej.

Kolejnym celem wynalazku jest dostarczenie rozpuszczalnych bioaktywnych kopolimerów zawierających boczne grupy środka chemioterapeutycznego i boczne grupy sensybilizatora oraz boczne grupy stanowiące determinanty, przyłączone poprzez wiązania ulegające degradacji enzymatycznej.

Celem wynalazku jest również dostarczenie rozpuszczalnych bioaktywnych kopolimerów zawierających boczne cząsteczki sensybilizatora przyłączone poprzez wiązania nie ulegające lub ulegające degradacji enzymatycznej, oraz środek chemioterapeutyczny przyłączony poprzez wiązanie ulegające degradacji.

Dzięki zastosowaniu środka według wynalazku możliwe jest leczenie chorób nowotworowych poprzez podawanie rozpuszczalnych bioaktywnych kopolimerów zawierających boczne grupy środka chemioterapeutycznego i boczne grupy sensybilizatora, przyłączone poprzez wiązania ulegające degradacji enzymatycznej. Kopolimer może również zawierać detarminant lub grupę kierującą.

Możliwe jest również zastosowanie środka według wynalazku do leczenia chorób nowotworowych poprzez podawanie kombinacji kopolimerów, spośród których jeden zawiera boczne grupy środka chemioterapeutycznego, a drugi boczne grupy sensybiliz.atora, przy czym obydwa kopolimery zawierają tą samą grupę kierującą.

Dzięki zastosowaniu środka według wynalazku istnieje możliwość leczenia chorób nowotworowych poprzez podawanie kopolimerów zawierających boczne cząsteczki sensybilizatora przyłączone poprzez wiązanie nie ulegające lub ulegające degradacji enzymatycznej, oraz boczne grupy środków chemioterapeutycznych przyłączone poprzez grupy ulegające degradacji.

Jeszcze innym celem jest dostarczenie rozpuszczalnych bioaktywnych kopolimerów zawierających boczne grupy środka terapeutycznego przyłączone poprzez wiązania ulegające degradacji enzymatycznej, z grupami kierującymi specyficznymi względem markera nowotworowego na komórkach rakowych.

172 184

Dodatkowym celemjest dostarczenie rozpuszczalnych bioaktywnych kopolimerów zawierających boczne grupy sensybilizatora przyłączone poprzez wiązania nie ulegające lub ulegające degradacji enzymatycznej oraz środki chemioterapeutyczne przyłączone poprzez wiązania ulegające degradacji enzymatycznej, z grupami kierującymi specyficznymi względem markera nowotworowego na komórkach rakowych.

Ponadto dzięki zastosowaniu środka według wynalazku jest możliwość leczenia chorób nowotworowych poprzez podawanie kopolimerów zawierających boczne grupy środka terapeutycznego i boczne grupy sensybilizatora, przyłączone poprzez wiązania ulegające degradacji enzymatycznej z grupami kierującymi specyficznymi względem markera nowotworowego na komórkach rakowych.

Dzięki zastosowaniu środka według wynalazku istnieje możliwość leczenia chorób nowotworowych poprzez podawanie kopolimerów zawierających boczne grupy sensybilizatora, przyłączone poprzez wiązania nie ulegające lub ulegające degradacji enzymatycznej, oraz boczne grupy środków chemioterapeutycznych przyłączone poprzez grupy ulegające degradacji.

Środek do zwalczania tkanek rakowych u zwierząt ciepłokrwistych według wynalazku zawiera zarówno lek przeciwnowotworowy, jak i lek fotoaktywowany, i ewentualnie grupę kierującą, przyłączone do nośników kopolimerycznych wybranych z grupy obejmującej (a) nośnik kopolimeryczny, do którego przyłączony jest zarówno lek przeciwnowotworowy, jak i lek fotoaktywowany, (b) mieszaninę nośników kopolimerycznych, w której do jednego z nośników kopolimerycznych przyłączony jest lek przeciwnowotworowy, a do innego nośnika kopolimerycznego przyłączony jest lek fotoaktywowany oraz (c) mieszaninę nośników polimerycznych, w której do jednego z nośników kopolimerycznych przyłączony jest zarówno lek przeciwnowotworowy, jak i lek fotoaktywowany, a do innego nośnika kopolimerycznego przyłączony jest człon wybrany z grupy obejmującej lek przeciwnowotworowy i lek fotoaktywowany, z tym że wspomniane nośniki kopolimeryczne opisane jak w punktach a, b i c wytwarza się ze skopolimeryzowanych komonomerów obejmujących (i) około 5,0-99,7% molowych komonomerów nie zawierających pochodnych grup funkcyjnych, (ii) od około 0,2 do 20 % molowych komonomerów zawierających grupy funkcyjne, do których przyłączony jest człon wybrany z grupy obejmującej środek przeciwnowotworowy i środek fotoaktywowany, oraz (iii) od około 0 do 94,8% molowych komonomerów zawierających grupy funkcyjne, do których przyłączono grupy kierujące, przy czym lek przeciwnowotworowy przyłączony jest do podstawionych komonomerów poprzez łańcuchy boczne odporne w krwioobiegu ciepłokrwistego zwierzęcia, ale podatne na hydrolizę przez wewnątrzkomórkowe enzymy lizosomalne, przy czym wspomniane komonomery są wybrane z grupy obejmującej N-(2-hydroksypropylo)metakrylamid (HPMA), N-metyloakryloamid, N-N-dialkiloakrylamidy, kwas akrylowy, kwas metakrylowy, poliaminokwasy, polisacharydy, kopolimery zawierające sekwencje polioksyetylenowe i kopolimery poliwinylopirolidon-bezwodnik maleinowy.

Korzystnie lekiem fotoaktywowanym jest pochodna chloryny, a najkorzystniej pochodną chloryny stanowi mezochloryna e6.

Korzystnie nośnik kopolimeryczny stanowi nośnik polimeryczny, w którym lek przeciwnowotworowy i lek fotoaktywowany przyłączone są do tej samej cząsteczki polimeru lub też nośnik polimeryczny stanowi mieszaninę nośników kopolimerycznych, w której do jednego nośnika kopolimerycznego przyłączony jest lek przeciwnowotworowy, a do innego kopolimerycznego nośnika przyłączony jest lek fotoaktywowany lub też nośnik polimeryczny stanowi mieszaninę nośników polimerycznych, w której do jednego z nośników kopolimerycznych przyłączony jest zarówno lek przeciwnowotworowy, jak i lek fotoaktywowany, a do innego nośnika kopolimerycznego przyłączony jest człon wybrany z grupy obejmującej lek przeciwnowotworowy i lek fotoaktywowany.

Korzystnie środek według wynalazku zawiera nośnik polimeryczny, w którym znajduje się od 0,1 do 94,8% molowych komonomerów zawierających grupy funkcyjne, do których przyłączono grupy kierujące.

Korzystnie lek przeciwnowotworowy przyłączony jest do nośnika polimerycznego poprzez ulegające degradacji enzymatycznej łańcuchy boczne wybrane z grupy obejmującej sekwencje oligopeptydowe, sekwencje oligosacharydowe i struktury zbliżone do występujących w kwasach nukleinowych, przy czym korzystniej boczny łańcuch stanowi oligopeptyd.

W tym przypadku lek przeciwnowotworowy przyłączony do bocznego łańcucha peptydowego wybrany jest z grupy obejmującej adriamycynę daunomycynę, melfalan bleomycynę oraz ich pochodne, a korzystnie lek przeciwnowotworowy stanowi adriamycyna.

Oligopeptydowy łańcuch boczny, może stanowić peptyd wybrany z grupy obejmującej Gly-Gly, Gly-Phe-Gly, Gly-Phe-Phe, Gly-Leu-Gly, Gly-Val-Ala, Gly-Phe-Ala, Gly-Leu-Phe, Gly-Leu-Ala, Ala-Val-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID nr 1), Gly-Phe-Phe-Leu (SEQ ID nr 2), Gly-Leu-Leu-Gly (SEQ ID nr 3), Gly-Phe-Tyr-Ala (SEQ iD nr 4), Gly-Phe-Gly-Phe (SEQ ID nr 5), Ala-Gly-Val-Phe (SEQ ID nr 6), Gly-Phe-Phe-Gly (SEQ ID nr 7), Gly-Phe-Leu-Gly-Phe (SEQ ID nr 8) lub Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-Phe (SEQ ID nr 9), przy czym korzystnie boczny łańcuch peptydowy stanowi Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID nr 1).

W tym przypadku natomiast nośnik polimeryczny stanowi kopolimer wytworzony w wyniku kopolimeryzacji nie przekształconego i przekształconego w pochodne N(2-hydroksypropylo)metakrylamidu (HPMA).

Nośnikiem polimerycznym środka według wynalazku może być polisacharyd, przy czym korzystnie polisacharyd stanowi dekstran.

Nośnikiem polimerycznym może być także kopolimer zawierający nie przekształcone i przekształcone w pochodne mery kopolimerów poliwinylopirolidon-bezwodnik maleinowy.

Gdy nośnikiem polimerycznym jest kopolimer wytworzony w wyniku kopolimeryzacji nieprzekształconego i przekształconego w pochodne HPMA, lek fotoaktywowany może być przyłączony do nośnika polimerycznego poprzez mostek nie ulegający degradacji, przy czym korzystnie mostek nie ulegający degradacji, wybrany jest z grupy obejmującej glicynę i kwas ε-aminokapronowy.

Gdy nośnikiem polimerycznym jest kopolimer opisany powyżej lek fotoaktywowany może być przyłączony do nośnika polimerycznego poprzez ulegające degradacji enzymatycznej łańcuchy boczne wybrane z grupy obejmującej sekwencje oligopeptydowe, sekwencje oligosacharydowe i struktury zbliżone do występujących w kwasach nukleinowych, przy czym korzystnie boczny łańcuch stanowi oligopeptyd.

W środku według wynalazku oligopeptydowy łańcuch boczny może stanowić, jak wspomniano, peptyd wybrany z grupy obejmującej Gly-Gly, Gly-Phe-Gly, Gly-Phe-Phe, Gly-LeuGly, Gly-Val-Ala, Gly-Phe-Ala, Gly-Leu-Phe, Gly-Leu-Ala, Ala-Val-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly (sEq ID nr 1), Gly-Phe-Phe-Leu (SEQ ID nr 2), Gly-Leu-Leu-Gly (SEQ ID nr 3), Gly-Phe-TyrAla (SEQ ID nr 4), Gly-Phe-Gly-Phe (SeQ ID nr 5), Ala-Gly-Val-Phe (SeQ ID nr 6), Gly-Phe-Phe-Gly (SEQ ID nr 7), Gly-Phe-Leu-Gly-Phe (SEQ ID nr 8) lub Gly-Gly-Phe-LeuGly-Phe (SEQ ID nr 9), przy czym korzystnie boczny łańcuch peptydowy stanowi Gly-Phe-LeuGly (SEQ ID nr 1).

W przypadku powyższym lek fotoaktywowany może być wybrany z grupy obejmującej porfiryny, ftalocyjaniny, purpuryny, chloryny, naftalocyjaniny, barwniki kationowe i tetracykliny oraz ich pochodne, korzystnie lek fotoaktywowany stanowi pochodna chloryny, a najkorzystniej pochodną chloryny stanowi mezochloryna e6.

Środek według wynalazku może zawierać zarówno lek przeciwnowotworowym jak i lek fotoaktywowany przyłączone do łańcucha polimerycznego poprzez oligopeptydowy łańcuch boczny, w którym peptyd wybrany jest z grupy objemującej Gly-Gly, Gly-Phe-Gly, Gly-Phe-Phe, Gly-Leu-Gly, Gly-Val-Ala, Gly-Phe-Ala, Gly-Leu-Phe, Gly-Leu-Ala, AlaVal-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID nr 1), Gly-Phe-Phe-Leu (SEQ ID nr 2), Gly-Leu-LeuGly (SEQ ID nr 3), Gly-Phe-Tyr-Ala (SEQ ID nr 4), Gly-Phe-Gly-Phe (SeQ ID nr 5), Ala-Gly-Val-Phe (SEQ ID nr 6), Gly-Phe-Phe-Gly (SEQ ID nr 7), Gly-Phe-Leu-Gly-Phe (SEQ ID nr 8) lub Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-Phe (SEQ ID nr 9), przy czym lek przeciwnowotworowy wybrany jest z grupy obejmującej adriamycynę, daunomycynę, melfalan i bleomycynę, oraz ich pochodne a lek fotoaktywowany wybrany jest z grupy obejmującej porfiryny, ftalocyjaniny, purpuryny, chloryny, naftalocyjaniny, barwniki kationowe i tetracykliny oraz ich pochodne.

Korzystnie sekwencję peptydową stanowi Gly-Phe-Leu-Gly, natomiast lek przeciwnowotworowy stanowi adriamycyna, a lek fotoaktywowany stanowi pochodna chloryny. Cele założone do osiągnięcia przez zastosowanie środka według wynalazku uzyskuje się podając kombinowane kopolimery zawierające środek chemioterapeutyczny i sensybilizatory, które znajdują zastosowanie w celu leczenia nowotworów. Stwierdzono, że pochodne w tym samym czasie dwóch różnych kopolimerów, z których jeden zawiera środek chemioterapeutycznym a drugi zawiera sensybilizator, jest korzystniejsze od podawania każdego polimeru oddzielnie przy leczeniu chorób nowotworowych. Również jeden kopolimer zawierający zarówno środek chemioterapeutyczny, jak i sensybilizator zastosować można zamiast mieszaniny kopolimerów. Specyficzność kopolimerów można zwiększyć dołączając grupę kierującą do każdej cząsteczki polimeru. Jednakże doświadczenia ze środkami według wynalazku wykazały, że zastosowanie nośników polimerycznych zawierających zarówno lek przeciwnowotworowy, jak i sensybilizator, powoduje nagromadzenie większej ilości leku związanego z polimerem w komórkach rakowych niż w przypadku wolnego leku, nawet jeśli nie wprowadzi się grupy kierującej.

Takie polimeryczne makrocząsteczki wchodzą do komórek docelowych w wyniku pinocytozy; związanie leków o niskim ciężarze cząsteczkowym z kopolimerami powoduje zmianę mechanizmu ich przyswajania z dyfuzji na pinocytozę, co może zmniejszyć efekty uboczne zazwyczaj występujące przy stosowaniu wolnych leków. Z tego względu stosować można znacznie mniejsze dawki obydwu leków przyłączonych do kombinowanego kopolimeru. Zastosowanie dwóch kopolimerów, z których jeden zawiera sensybilizator, a drugi zawiera lek przeciwnowotworowy, albo tego samego kopolimeru, który zawiera zarówno lek przeciwnowotworowy jak i sensybilizator, stanowi istotny postęp w leczeniu chorób nowotworowych w porównaniu ze stosowaniem pojedynczego kopolimeru zawieraj ącego przyłączony tylko lek przeciwnowotworowy lub tylko sensybilizator. Dodatkowo stosować można jeszcze mniejsze dawki gdy dwa leki wykazują synergistyczne działanie przeciwnowotworowe. Przyłączenie obydwu leków do tego samego kopolimeru zapewnia, że obydwa leki znajdują się w tej samej komórce w tym samym czasie. Grupa kieruj ąca specyficzna względem markera nowotworowego na komórce rakowej, również przyłączona do kombinowanego kopolimeru będzie ułatwiać lub przyspieszać kierowanie kopolimeru zawierającego obydwa leki specyficznie do docelowych komórek rakowych.

Opróżnienie czasowe po podaniu powinno zapewnić optymalne przyswojenie kopolimerów przez tkankę rakową w odróżnieniu od otaczającej zwykłej tkanki, po czym lek przeciwnowotworowy zaczyna działać, następnie stosuje się światło laserowe lub inne źródło światło o odpowiedniej długości fali i energii wzbudzając sensybilizator do jego pierwszego wzbudzonego stanu singletowego. Krzyżowanie międzyukładowe powoduje przejście sensybilizatora ze stanu singletowego w odpowiedni stan tripletowy. Przeniesienie energii z sensybilizatora w stanie pripletowym na cząsteczkę tlenu w stanie podstawowym powoduje powstanie singletowego wzbudzonego tlenu. Powstały singletowy tlen atakuje membranę lizosomową komórki uwalniając enzymy lizosomowe do cytozolu, co w efekcie prowadzi do śmierci komórki. Działanie środka przeciwnowotworowego niszczy komórki, których nie zniszczył sensybilizator. Przy wykorzystaniu powyższej terapii znacznie zmniejsza się prawdopodobieństwo nawrotu nowotworu.

W badaniach in vitro stwierdzono, że pod względem skuteczności przeciwnowotworowej kombinacja kopolimerów (takich jak kopolimery HPMA) zawierających lek przeciwnowotworowy (np. adriamycynę) i zawierających sensybilizator (np. sól disodową mezochloryno-ee monoetylenodiaminy (cee)) jest korzystniejsza niż zastosowanie kopolimerów zawierających sensybilizator i polimerów zawierających lek przeciwnowotworowy, podawanych osobno. Adriamycyna uaktywnia się dopiero po enzymatycznym uwolnieniu z kopolimeru, a ce6 uaktywnia się pod wpływem światła i wykazuje działanie fotodynamiczne in vivo bez względu na to, czy pozostaje czy nie pozostaje związana z kopolimerem. Lek przeciwnowotworowy intensyfikuje leczenie PDT (i odwrotnie), gdyż długotrwałe leczenie stałych nowotworów z wykorzystaniem PDT jest trudne. Z drugiej strony środki chemoterapeutyczne stwarzają inne problemy takie jak odporność wielolekowa lub uboczne działanie toksyczne. Wynalazek zapewnia zmniejszenie efektów ubocznych z uwagi na zmniejszoną niezbędną dawkę kopolimerów.

Podstawowy mer kopolimeru decyduje o właściwościach nośników polimerycznych. Szereg komonomerów wykorzystać można do wytwarzania kopolimerów rozpuszczalnych w wodzie. Zastosować można dowolny obojętny funkcjonalny kopolimer, do którego przyłączyć można odpowiednie mostki w celu związania grupy bioaktywnej i/lub kierującej. Kopolimer wytwarza się zazwyczaj w wyniku kopolimeryzacji odpowiedniej ilości moli komonomeru nie zawierającego pochodnych grup funkcyjnych z odpowiednią ilością moli komonomerów będących pochodnymi monomerów zawierających przyłączone odpowiednie grupy lub mostki z grupami funkcyjnymi, do których z kolei można następnie przyłączyć środki bioaktywne lub grupy kierujące. Do typowych komonomerów należy N-(2-hydroksypropylo)metakrylamid (HPMA), N-metyloakrylamid i N,N-dialkiloakrylamidy. Do innych odpowiednich nośników należą poliaminokwasy, polisacharydy, kopolimery zawierające sekwencje polioksyetylenowe, kopolimery poliwinylopirolidon/bezwodnik maleinowy itp.

Zazwyczaj wstępny etap obejmuje wytwarzanie prekursora polimeru. W przypadku kopolimerów syntetycznych etap wstępny obejmuje zazwyczaj kopolimeryzację komonomerów nie zawierających i zawierających grupy funkcyjne, w celu uzyskania prekursora kopolimerycznego, w którym mery z komonomerów zawierających grupy funkcyjne zawierają przyłączone grupy lub mostki z grupami ulegającymi odszczepieniu (np. z grupami p-nitrofenoksylowymi), tak aby można było następnie przyłączyć bioaktywne leki lub grupy kierujące W przypadku innych polimerów, takich jak polisacharydy (np. dekstran itp) i poliaminy, przeprowadza się etap aktywowania, w którym do łańcucha polimeru przyłącza się środki aktywujące (np. grupy p-nitrofenoksylowe). Drugi etap obejmuje przyłączenie środków bioaktywnych i/lub grup kierujących do polimeru lub kopolimeru stanowiącego prekursor.

Z powyższego w sposób oczywisty wynika, że w ogólnym zakresie określenie kopolimer obejmuje dowolny odpowiedni łańcuch polimeru, w którym mery tworzące łańcuch mogą być takie same, ale mogą zawierać różne grupy boczne przyłączone do merów poprzez mostki. Tak np. kopolimer HPMA wytworzyć można z HPMA nie priz^^^^t^ł^^^nego w pochodną oraz N-metak.ryloilowych peptydów zawierających aktywne grupy p-nitrofenoksylowe. Z drugiej strony kopolimer polisacharydowy będzie zawierać mery sacharydowe nie podstawione żadnymi grupami pochodnymi oraz inne mery sacharydowe aktywowane poprzez przyłączenie grup reaktywnych takich jak grupa p-nitrofenoksylowa. Kopolimery są rozpuszczalne w wodzie, a ich ciężar cząsteczkowy, włącznie z ciężarem cząsteczkowym leku przeciwnowotworowego, leku fotoaktywowanego i determinantu, wynosi od około 10 000 do 50 000.

Jak to zaznaczono w patencie USA nr 5 037 883, od około 5,0 do 99,7% molowych stanowią mery nie przekształcone w pochodne, a korzystnym komonomerem jest HPMA.

Pewna (procentowo) liczba merów kopolimeru musi zawierać enzymatycznie odszczepiane boczne łańcuchy kończące się lekiem przeciwnowotworowym. Takie boczne łańcuchy umożliwiają miejscowo specyficzne uwalnianie leku przeciwnowotworowego w lizosomowym przedziale komórki. Mery te mogą stanowić od około 0,2 do 20,0% molowych merów tworzących kopolimer. Budowa tych bocznych łańcuchów musi być taka, aby zachowały one stabilność w krwioobiegu, a były podatne na hydrolizę przez wewnątrzkomórkowe enzymy lizosomalne. Jako miejsca przyłączania leku wykorzystać można sekwencje oligopeptydowe, sekwencje oligosacharydowe lub struktury zbliżone do występujących w kwasach nukleinowych. W związku z tym, że korzystnym kopolimerem jest HPMA, to do takich merów korzystnie należą N-metakryloilowane peptydy, do których przyłącza się lek. Wykorzystać można również wiązania lub mostki peptydowe wymienione w patencie USA nr 5 037 883, wybrane z grupy obejmującej Gly-Gly, Gly-Phe-Gly, Gly-Phe-Phe, Gly-Leu-Gly, Gly-Val-Ala, Gly-Phe-Ala, Gly-Leu-Phe, Gly-Leu-Ala, Ala-Val-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID nr 1), Gly-Phe-Phe-Leu (SEQ ID nr 2), Gly-Leu-Leu-Gly (SEQ ID nr 3), Gly-Phe-Tyr-Ala (SEQ ID nr 4), Gly-Phe-GlyPhe (SEQ ID nr 5), Ala-Gly-Val-Phe (SEQ ID nr 6), Gly-Phe-Phe-Gly (SEQ ID nr 7), Gly-Phe-Leu-Gly-Phe (SEQ ID nr 8) lub Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-Phe (SEQ ID nr 9). Szczególnie korzystnym mostkiem peptydowym jest Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID nr 1). Mostek ten będzie określany w opisie i w zastrzeżeniach jako Gly-Phe-Leu-Gly lub (SEQ ED nr 1), przy czym określenia te można stosować wymiennie.

Do odpowiednich leków przeciwnowotworowych, które przyłącza się do mostków peptydowych należą, ale nie wyłącznie, adriamycyna, daunomycyna, melfalan i bleomycyna oraz ich pochodne, korzystnie adriamycyna.

Wykorzystać można te same komonomery zawierające ulegające degradacji łańcuchy boczne kończące się lekiem fotoaktywowanym. Zakres stężeń takich merów w kopolimerze jest taki sam jak w przypadku leków przeciwnowotworowych. Nie oznacza to jednak, że lek przeciwnowotworowy i lek fotoaktywowany będą zawsze występować w stosunku molowym 1:1. Może być tak, że stosunek do tych leków w kombinowanym polimerze będzie zmieniać się w zależności od pacjenta, rodzaju leczonej choroby nowotworowej, rodzajów tkanek lub dowolnych innych zmiennych, na które może wpływać obecność takich środków bioaktywnych. Mery w kopolimerze mogą również zawierać nie ulegające degradacji łańcuchy boczne kończące się lekiem fotoaktywowanym. Takie nie ulegające degradacji mostki mogą korzystnie zawierać aminokwasy, takie jak glicyna lub kwas aminokapronowy.

Leki fotoaktywowane lub sensybilizatory mogą stanowić porfiryny, ftalocyjaniny, purpuryny, chloryny, naftocyjaniny, barwniki kationowe i tetracykliny oraz ich pochodne, korzystnie pochodne chloryny, korzystniej mezochloryna e6.

Każdy kopolimer może również zawierać grupę kierującą. Grupy kierujące mogą być przyłączone poprzez łańcuchy boczne, nie ulegające lub ulegające degradacji enzymatycznej. Zawartość komonomerów w kopolimerze, do których przyłączono grupy kierujące, może wynosić od 0 do 94,8% molowych. Powołując się na patent USA nr 5 037 883, zgodnie z którym można stosować grupy kierujące, kopolimer będzie zawierać od około 0,1 do 94,8% molowych merów zdolnych do wiązania grup kierujących. W związku z tym, że korzystnym kopolimerem jest kopolimer HPMA, komonomer wybrany będzie z grupy obejmującej N-metakrylamid, kwas N-metakrylowy i N-metakryloilowany aminokwas albo peptyd. Jeśli łańcuchy boczne ulegające degradacji enzymatycznej występują, to korzystnie są to aminokwasy lub grupy peptydowe wybrane z grupy obejmującej Leu, Phe, Gly-Gly, Gly-Leu-Gly, Gly-Val-Ala, Gly-Phe-Ala, Gly-Leu-Phe, Gly-Leu-Ala, Ala-Val-Ala, GlyPhe-Leu-Gly (SEQ ID nr 1), Gly-Phe-Phe-Leu, (SEQ ID nr 2), Gly-Leu-Leu-Gly (SEQ ID nr 3), Gly-Phe-Tyr-Ala (SEQ ID nr 4), Gly-Phe-Gly-Phe (SEQ ID nr 5), Ala-Gly-Val-Phe (SEQ ID nr 6), Gly-Phe-Phe-Gly (SEQ ID nr 7), Gly-Phe-Leu-Gly-Phe (SEQ ID nr 8) lub Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-Phe (SEQ ID nr 9), przy czym najkorzystniejsza jest Gly-Phe-LeuGly (SEQ ID nr 1).

Jako grupy kierujące wykorzystać można struktury komplementarne z antygenami lub receptorami powierzchni komórek. Należą do nich sacharydy np. galaktozamina, fukozylamina, laktoza; hormony, np. MSH, sekretyna; opiaty; oraz przeciwciała monoklonalne i poliklonalne.

Leki fotoaktywowane są podatne na aktywowanie przez źródła światła, np. z laserów lub układów włókien optycznych wykorzystywanych obecnie w PDT, układy chemiluminescencyjne itp. Aktywator chemiluminescencji może być podawany bezpośrednio do obszaru, w którym zlokalizowany jest nowotwór, albo też może być doprowadzany, co najmniej częściowo, do miejsca występowania nowotworu, z wykorzystaniem polimerycznego układu doprowadzania podobnego do opisanego powyżej. Powstawanie nadtlenku niezbędne do uaktywnienia układu chemiluminescencyjnego osiągnąć można w wyniku reakcji enzymatycznej np. doprowadzenia enzymu takiego jak oksydaza glukozowa do błony komórkowej, która reaguje z glukozą z wytworzeniem nadtlenku wodoru), albo w wyniku reakcji autoutleniania łańcucha przez sam sensybilizator, zainicjowanej przez impuls świetlny. W tym ostatnim przypadku reakcja cykliczna może doprowadzić do pewnego rodzaju mechanizmu synergizmu.

Jakkolwiek wynalazek określono w najszerszym zakresie, poniższy opis dotyczy korzystnego rozwiązania, w którym mery kopolimeru oparte są na HPMa. Dla specjalisty zrozumiałe jest jednaj, że wykorzystać można również inne komonomery w celu uzyskania cząsteczek kopolimerycznych zawierających takie same łańcuchy boczne kończące się lekami przeciwnowotworowymi, lekami fotoaktywowanymi i grupami kierującymi.

Kopolimery stosowane zgodnie ze sposobem według wynalazku syntetyzuje się znanymi sposobami i można je przedstawić następującymi uproszczonymi wzorami:

P-Gly-Phe-Leu-Gly-adria (Kopolimer I) gdzie P oznacza nośnik kppplimeryczny dokładniej określony poniżej, a adria oznacza lek przeciwnowotworowy adriamycynę, co również zostanie dokładniej opisane poniżej.

P-Gly-Phe-Leu-Gly-ceg (Kopolimer Et) gdzie P ma znacznie podane wyżej, a ceg oznacza lek ulegający fotoaktywowamiu, mezochlorynę eg.

P-Gly-ceg (ł^i^o^ol^mer IH) gdzie P ma znaczenie podane wyżej, a ceg oznacza mrzp-chlprynę eg.

Gly-Phe-Leu-Gly-ce6

P

Gly-Phe-Leu-Gly-adria (Kopolimer ΓΫ) gdzie P, ce6 i adria mają znaczenie podane wyżej.

. Gly-ce6 P^

Gly-sekretyna (Kopolimer V) gdzie P i ceg mają znaczenie podane wyżej, a sekretyna stanowi pρlioeptydowy determinant zawierający łańcuch złożony z 27 aminokwasów.

/ Gly-Phe-Leu-Gly-ceg P —Gly-Phe-Leu-Gly-adria

Gly-Phe-Leu-Gly-sekretyna (Kopolimer VI) gdzie P, ce6, adria, i sekretyna mają znaczenie podane wyżej.

Jak to zaznaczono uprzednio, HMPA jest korzystnym komonomerem. W przypadku takiego komonomeru, w formie bezpośredniej lub po przekształceniu w pochodną, poniżej przedstawiono dokładniejsze struktury każdego z kopolimerów I-VI, przy czym x, y z oraz w oznaczają procenty molowe każdego z merów w kopolimerze. I tak x oznacza liczbę od około 5,0 do 99,7% molowych; y oznacza liczbę od około 0,3 do 20,0% molowych; z oznacza liczbę od około 0,2 do 20,0% molowych, a w oznacza liczbę od około 0,1 do 25,0% molowych.

172 184 ch₃ _ _CH I__

- -ch₂-c ^L C-0 -I <I ^x

NH

I

CH,

I

CHOH

I ch₃

P-G-F-L-G-adr i a (Kopolimer I)

CH.

CH,

-CH₂~Cc=o -¹

NH

I

CH,

I c=o

-CH₂-CC=O -J I

NH

I

CH,

I

CHOH

(Kopolimer II)

Z

CH,

NH

I

CH-CH

I ’ c=o

I

NH

I

CH,

I c=o

I

NH

I adria

CH,

CH, i 3		ch2 1 3
i I	—	-ch2-c-— |
1 C=0 J		1 L c=oJ
1	X	1
NH I		NH 1
1 CH„ I ~		1 ch2
1 CHOH I		I c=o |
I CH3		1 NH I
		1 ceE

P-G-ce.

-CH₂-Cc=o

I

NH

I

CH,

I c=o

I

NH

I

CH-CH

I c=o

I

NH

I ch-ch;

I c=o

I

NH

I ch₂ c=o I

NH

I

CS_a

_zch₃

CH, (Kopolimer III)

172 184

CHj 3		Γ CH, j 3		/i .-o | ~
—CH--C—— i	—	—CH--C- I		I —ch2-c-- i
1 L c=oJ		1 L C=0 -		1 L- C=C J
1	X	!	y	|
NH |	NH I	NH 1
1 ch2 1	1 CH- I	1 ch2 I
CHOH I	1 c=o |	1 c=o 1
1 ch3	1 NH	1 NH

G-F-L-G—adria

G—F—L-G-cs_E (Kopolimer IV)

CH-CH₂

C=0

I

NH

7\'

CH-CH₂

C=0

I

NH

,CH.

CH-CH'

C=0

I

NH

I ch₂

I c=o

I

NH

I adria

CH.

CH—CH

I c=o I

NH

I ch₃ I c=o I

NH !

CSr_zch₃

CH.

ch3 |		ch3 1 3		ch3 | 3
-ch2-c- I	—	-ch2-c-- I	—	-ch2-c— 1	—
1 L c=oJ		1 L c=oJ		1 - c=oJ
1	X	|	y	|	z
NH 1	NH I		NH I
1 CH„ 1 *	1 CH- 1		1 CH- |
CHOH i	i c=o 1		1 c=o 1
1 CH3	1 NH |		1 NH
	1 ceB		1 sskretyna

,G-sekrstyna

G-ce, (Kopolimer V)

172 184

CH„ j “		ch3-		CH- J		CH- ]
-CH--C- I	—	i * 2 J	---	—ch2-c- |		-ch2-c«—|
1 L C=O J		I L c=o -		! L c=oJ		1 L c=oJ
|	X	I	y	I	z	|
NH |		NH		NH I	NH |
1 CH- I		1 CH- 1		1 CH- I	1 CH-
CHOH		1 c=o		1 c=o	1 c=o

w

CH,

CH,

G-F-L-G-adria Ρ -G-F-L-θ-ce₅ '''G—F-L-G-sekretyna (Kopolimer VI)

NH

I

CH-CH,

I ' c=o

I

NH i

CH—CH

I ¹ c=o

I

NH

I

CHI c=o

I

NH adria

CH,

NH

I

CH-CH,

I ‘ c=o

I

NH

CH-CHf

I c=o

I

NH

I ch₂

I c=o

I

NH

I ce-

,CH,

CH,

NH

CH-CH₂

C=0

I

NH

CH-CH

7©

/h₃

I ^sch₃ c=o I

NH

I

CH!

c=o

I

NH

I sekretyna

Syntezę monomerów stosowanych do wytwarzania prekursorów kopolimerów stosowanych w syntezie kopolimerów I-VI przedstawiono poniżej w przykładach I-IV.

Przykład I. N-(2-hydroksypropylo)metakrylamid (HMPA)

Synteza HMPA

ch3	CH3 acetonitryl		ch3
I CH-=C 1 c=o	1 -15°C «_ PNAJ-ł 1 u v	V	I CH-=C I c=o
Γ bnUn ...... 1 ch2	,,,ł»
1	1		I
ci	nh2		NH
chlorek	1—amino-		I ch2
metakry1 oi 1 u	2-propanol		I CHOH I
			1 ch3

Jak to przedstawiono powyższą sekwencją reakcji, monomer HMPA wytworzono (sposobem J. Strohalma i innych, Angew. Makromol. Chem., 70,109 (1978) rozpuszczając 229,7 ml (223,5 g, 2,98 mola) 1-amino-2-propanolu w 550 ml acetonitrylu. Dodano inhibitor, oktylopirokatechinę i roztwór schłodzono do -20°C. Następnie 153 ml chlorku metakryloilu (163,7 g, 1,57 mmola) rozpuszczono w 350 ml acetonitrylu. Roztwór chlorku metakryloilu powoli wkroplono do roztworu 1-amino-2-propanolu z intensywnym mieszaniem, utrzymując temperaturę -15°C. Po zakończeniu wkraplania mieszaninę pozostawiono do ogrzania się do 20°C. Produkt uboczny, 1-amino-2-propanol.HCl szybko odsączono na grubym filtrze. Po wydzieleniu się pierwszych kryształów ściankę kolby pocierano bagietką, po czym krystalizację przesączu kontynuowano w temperaturze od -30 do -40°C. Kryształy szybko odsączono. HMPA rekrystalizowano z mieszaniny MeOH/eter 1:3 (rozpuszczając kryształy pod kranem z ciepłą wodą), a następnie rekrystalizowano z acetonu w celu usunięcia śladów powstałego polimeru. Temperatura topnienia podstawowego produktu (64,4 g) wynosiła 70-71°C.

Przykładu. Ester p-nitrofenylowy metakroiioglicyny (MA-Gly-ONp lub Ma-G-ONp). Wytwarzanie półproduktu MA-Gly

Metakryloiioglicynę (MA-Gly- lub MA-G), prekursor MA-Gly-ONp, zsyntetyzowano zgodnie z następującym schematem reakcji

Synteza MA—G

CH, I 3	NH, |
1 € ł c=o I	+ CH, 1 c=o I
1 Cl	1 OH
•rek	glicyna

metakryloilu

NaOH; 1 godz.

10°C, 1 godz. temperatuta pokojowa, 30 minut o_ CH,

C | ³

-s> CH₂=C

2. HCl. 0°C

I

NH

I

CH,

I

C=O

I

OH g glicyny (0,3996 mola) rozpuszczono w 100 ml 4N NaOH i dodano inhibitor hydrochinonowy. Mieszaninę schłodzono do 0°C. Do roztworu glicyny powoli wkroplono równocześnie chlorek metakryloilu (38,7 ml, 0,3996 mola) i 99,8 ml 4n NaOH. Reakcję prowadzono w 10°C przez 1 godzinę. pH nastawiono na 9,5 dodając 4N NaOH. Reakcję kontunuowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przez 30 minut w łaźni wodnej w 20°C. Mieszaninę reakcyjną schłodzono do 0°C i powoli wkroplono około 65 ml mieszaniny 1:HCl:H2O, aż do uzyskania pH 2-3. Mieszaninę wyekstrahowano 2 razy octanem etylu (dodano więcej wody do warstwy wodnej w celu rozpuszczenia soli). Przesącz wysuszono nad siarczanem sodowym przez godzinę, po czym przesączono. Objętość zmniejszono do około 450-500 ml i dodano około 10 ml heksanu. Mieszaninę wymrażano przez noc, po czym wydzielono kryształy metakryloiloglicyny. Ług macierzysty rekrystalizowano z mieszaniny EtOH/heksan. Uzyskano produkty z wydajnościami odpowiednio 13,2 i 6,5 g obydwa o temperaturze topnienia 108-109°C.

172 184

Wytwarzanie estru p-nitrofenylowy metakryloiloglicyny (MA-Gly-ONp)

Stosując wyżej otrzymany MA-Gly- zsyntetyzowano MA-Gly-ONp (NM-G-ONp), zgodnie z następującą reakcją:

ch₃

I

CH,=C

I c=o

I

NH

I

CH,

I c=o

I

OH

Synteza MA-G-ONp

DCC/THF godz./20°C _-—>

CH_a

I

CH,=C

I c=o

I

NH

I

CH,

I c=o

I o

NO.^

MA-Gly-ONp (sposobem Rejmanovej i innych, Makromol. Chem., 178, 2159 (1977)) otrzymano rozpuszczając 6,5 g MA-Gly (0,045 mola) i 6,95 g p-nitrofenolu (0,050 mola) w około 50 ml THF. Mieszaninę tą schłodzono do -20°C, po czym powoli wkroplono 10,31 g (0,05 mola) dicykloheksylokarbodiimidu (DCC) rozpuszczonego w 9,7 ml THF utrzymując temperaturę 4°C. Reakcje kontynuowano przez noc w 4°C. Następnego ranka mieszaninę mieszano przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Dodano kilka kropli kwasu octowego w celu zakończenia reakcji, po czym mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Powstały produkt uboczny, dicykloheksylomocznik (DCU) odsączono i przemyto THF. Przesącz odparowano do sucha, po czym rozpuszczono w octanie etylu. Resztę DCU odsączono. Poprzedni etap powtórzono. Produkt rozpuszczono ponownie w octanie etylu i wymrażano przez noc. Mieszaninę przesączono jeszcze raz i odparowano do sucha. Pozostałość krystalizowano przez noc z EtOH/eteru w lodówce. Kryształy odsączono, przemyto zimnym eterem i wysuszono. Uzyskano główny produkt o temperaturze topnienia 103-104°C, z wydajnością 4,69 g. Molowy współczynnik ekstynkcji określono spektrofotometrycznie: £272 = 10⁴ 1/mol-cm (metanol).

Przykład III. Ester p-nitrofenylowy metakryloiioglicylofenyloalaniny MA-Gly-PheONp lub MA-G-F-ONp). Wytwarzanie półproduktu MA-Gly-Phe (MA-G-F).

Metakryloiloglicylofenyloalaninę (MA-Gly-Phe lub MA-G-F), prekursor MA-Gly-PheONp, zsyntetyzowano zgodnie z następującym schematem reakcji

NH,

CH, ć=o ⁺ 1

NH

CH-CH,—

C=O

Synteza MA-S-F CHCH,=C

C=O

I

Cl

CHI

CH,=C

I

NaOH/woda; CH,C1, C=O

NH ^> I

CH

0°C

OH chlorek metakrylo!lu

G-F

I c=o

I

NH

CH-CH,—

C=O

OH

172 184 g glicylofenyloalaniny (Gly-Phe) (0,068 mola) rozpuszczono w roztworze 2,72 g (0,068 mola) NaOH w 50 ml H 2O. Dodano oktylopirokatechinę (inhibitor) i mieszaninę schłodzono do 0°C. Przy intensywnym mieszaniu równocześnie powoli wkroplono mieszaninę chlorku metakryloilu (7,76 g, 7,2 ml, 0,074 mola) w 25 ml chlorku metylenu z dodanym inhibitorem i roztwór 2,98 g (0,024 mola) NaOH w 60 ml H2O. Na początku dodano więcej chlorku metakryloilu, a potem roztwory dodawano z taką samą szybkością. Po 30 minutach sprawdzano pH (pH 6), tak że konieczne było dodanie 0,3 g NaOH aż do osiągnięcia pH 8-9. Reakcja zakończyła się, gdy pH warstwy wodnej ustaliło się na słabo alkalicznym poziomie, po czym mieszaninę reakcyjną mieszano jeszcze przez 30 minut. Wierzchnią warstwę oddzielono, a warstwę chlorku metylenu wyekstrahowano wodą (10 ml). Roztwory wodne połączono, dodano 100 ml octanu etylu z inhibitorem i mieszaninę schłodzono do <20°C. Dodano 36% HCl rozcieńczony wodą w stosunku 1:1, aż do uzyskania pH 2-3 (6-7 ml). Roztwór szybko wyekstrahowano octanem etylu. Warstwę octanu etylu oddzielono, a warstwę wodna przemyto 3 razy octanem etylu. Roztwór wysuszono nad siarczanem sodowym, przesączono i oddzielone kryształy przemyto octanem etylu. Roztwór zatężono do około 100 ml i wymrażano przez noc. Kryształy odsączono, przemyto zimnym eterem i wysuszono. Uzyskano 7,63 g produktu (oraz 7,26 g z ługu macierzystego) w postaci MA-Gly-Phe o temperaturze topnienia 141-142,5°C.

Wytwarzanie estru p-nitrofenylowego metakryloiloglicylofenyloalaniny (MA-Gly-Phe-ONp).

Stosując otrzymaną powyżej MA-Gly-Phe zsyntetyzowano MA-Gly-Phe-ONp (NM-G-FONp) w podobny sposób jak MA-Gly-ONp, zgodnie z następującą reakcją:

Synteza ΜΑ-Θ—F-ONp

CH,

CH,

CH₂=C ch₂=c

C=O

I

NH

I ch₂

I c=o

I

NH

CH^CH₂

C=O

I

OH

MA-G-F + HO '/ν'

NO, p-nitrofenol

DCC/THF 6 godz./20°C noc/4°C

MA-Gly-Phe (7,63 g, 0,026 mola) i 4,02 g (0,029 mola) p-nitrofenolu rozpuszczono w około 105 ml THF w temperaturze pokojowej. Mieszaninę schłodzono do -20°C. Przy intensywnym mieszaniu powoli wkroplono roztwór 5,96 g (0,029 mola) DDC w 15 mł tHf. Reakcję prowadzono przez 6 godzin w -20°C i przez noc w 4°C. Następnego dnia roztwór mieszano przez godzinę w temperaturze pokojowej. Dodano kilka kropli kwasu octowego i mieszanie konty172 184 nuowano przez 30 minut. DCU odsączono i przemyto THF. Roztwór odparowano do sucha, po czym krystalizowano z EtOH/H2O przez noc w lodówce. Uzyskano 1,48 g głównego produktu (całkowita wydajność przy kolejnej krystalizacji 3,1 g). Czysty produkt wykazywał molowy współczynnik ekstynkcji (oznaczany spektrofotomet^z^e) £271 = 10⁴ 1/molcm (DMSO).

Przykład IV. Ester p-nitrofenylowy metakryloiiogllcylofenyloalanyloleucylpglicyny (MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp lub MA-G-F-L-G-ONp). W ytwarzanie półproduktu MA-Gly-PheLeu Gly (MA-G-F-L-G).

Metakryloiloglicylpfenyloalanylolrucylpglicynę (MA-Gly-Phe-Gly-lub MA-G-F-L-G), prekursor, M4A-Gły-Phe-Lcm-Gly-ONp, zsyntetyzowano zgodnie z następującą reakcją.

Synteza MA-G-F-L-G

ch3		nh2
1 c 1		1 CH-CH 1	,ch3 ; CH2 ch3
c=o		c=o
1 NH 1		1 NH 1	dioksan/woda 24 godziny/
1 CH- |	+	1 CHa I	temperatura pokojowa
C=O |		c=o I	NaHCO3
NH		OH
ch-ch 2—<^2^	L-	-G
C=O I
1 O λ	MA-G-F-ONp
z)

CH₃

I =C

I c=o

I

NH

I

CHI c=o

I

NH

I

CH—CH,

I c=o

I

NH

CH—CH

I c=o I

NH

I

CHI c=o I

OH _zCH₃

CH.

O

MA-Gly-Phe-ONp (0,5 g, 1,22 x 10' mola) rozpuszczono w 7,45 ml dioksanu z oktylopirokatechiną (inhibitorem) pod ciepłą wodą z kranu. Leu-Gly (0,25 g, 1,34 x W³ mola) i 0,225 g (2,68 x 10-3 mola) NaHCO3 rozpuszczono w 6 ml H2O. Do mieszaniny tej dodano hydrochinon, inhibitor. Wodną mieszaninę wlano do mieszaniny organicznej i reakcję prowadzono przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Dioksan usunięto w wyparce rotacyjnej (<40°C). Pozostałość schłodzono do 0°C i dodano 5 ml zimnego octanu etylu z dodatkiem pktylρoirρkatrchiny jako inhibitora. Do mieszaniny w octanie etylu powoli wkroplono 0,505 ml mieszaniny 1: 1 HCl z woda aż do uzyskania pH 2-3. Warstwę octanu etylu oddzielono, a warstwę wodną wyekstrahowano 3 razy (po 4 ml) octanu etylu. Frakcje octanu etylu połączono, wyekstrahowano 3 razy wodą (5 ml) w celu usunięcia nieprzereagowanej Leu-Gly i wysuszono nad siarczanem sodowym., Roztwór przesączono i odparowano do sucha. Do suchej mieszanki dodano suchy

172 184 eter z oktylopirokatechiną (inhibitorem), wymrażano przez noc i przesączono. Kryształy przemyto eterem i wysuszono. Uzyskano 320 mg głównego produktu o temperaturze topnienia 150-154°C. Analiza TLC (10:2:0,5 aceton:eter:kwas octowy) wykazała zanik reagentów w mieszaninie reakcyjnej.

W-ytwarzanie estru p-nitrofenylowego metakryloiloglicylofenyloalanylo-leucyloglicyny (MAGly-Phe-Leu-Gly-ONp)

MA-Gly-Phe-Leu-Gly-z różnych reakcji połączono w celu wykonania syntezy MA-GlyPhe-Leu-Gly-ONp, zgodnie z następującą reakcją

Synteza MA—G—F-L—G—ONp

CH₃

I

CHg—C

CH₃

c=o
1 NH
1 CHg I	+ HG—
ł C=O	p-nitrofenol

ch₂=c

I c=o

I

NH

I ch₂

I c=o

I

NH

C H”C H

C=0

C=O 1	DCC/THF
NH	30 min w -20°C
1 /CH3 ch—ch^	5 godz./10 C°
1 ch3	noc/4°C
c=o |	---
1 NH 1 CH2 1 c=o 1 OH

NH

NOg

MA-Gly-Phe-Leu-Gly (0,5 g, 1,09 x 10'³ mola) i 0,166 g (1,19 x 10'³ mola) p-nitrofenolu rozpuszczono w 8,1 ml suchego THF pod kranem z ciepłą wodą. Mieszaninę schłodzono do

-20°C. DCC (0,269 g, 1,3 x 10' mola) rozpuszczony w około 1,1 ml THF powoli wkroplono do mieszaniny. Reakcję prowadzono przez 0,5 godziny w -20°C, 5 godzin, w -10°C i przez noc w

4°C. Dodano oktylopirokatechinę (inhibitor) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Do mieszaniny wkroplono kwas octowy (12,5 pl) i mieszanie kontynuowano przez 30 minut. DCU odsączono. Produkt rozpuszczono w octanie etylu i wymrażano przez 1 godzinę. DCU odsączono, a octan etylu odparowano. Pozostałość rozpuszczono w octanie etylu, przesączono i odparowano dodatkowo dwa razy w wyparce rotacyjnej do sucha. Produkt namoczono na noc w eterze, przesączono i wysuszono. Uzyskaną substancję krystalizowano z mieszaniny aceton:eter 3:1. Uzyskano 287 mg głównego produktu o temperaturze topnienia 122-126°C, którego molowy współczynnik ekstynkcji (oznaczany spektrofotometrycznie)E269 = 10⁴ 1/mol-cm (DMSO). Analiza aminokwasów potwierdziła strukturę; stwierdzono, że stosunek Gly:Phe:Leu wynosił 2:1:1.

Syntezy prekursorowych kopolimerów z wykorzystaniem monomerów z przykładów 1 -4, które zastosowano do otrzymywania kopolimerów I-V opisano poniżej w przykładach V i VI.

Przykład V. Wytwarzanie układu polimer-Gly-ONp.

Kopolimer HPMA (przykład I) z MA-Gly-ONp (przykład II), określany jako prekursor 1a lub 1b otrzymano zgodnie z następującą reakcją:

CH, I 3	CH, | 3
1 ,=c	CH,=C
I c=o ł		aceton
c=o |	AIBN
1 NH	1 NH	24 godz.
1 CH, ]	ł CH2 I	50°C
CHOH I	1 c=o I
I ch3 HMPA	1 0 Φ no2 MA-G-ONp

CH.

CH₂-C c=o !

NH

I ch₂

I choh

I

CH,

CH₂—c

Układ polimer-Gly-ONp (prekursor 1a) otrzymano metodą rodnikowej kopolimeryzacji strąceniowej HPMA (2,26 g, 85% molowych) i MA-Gly-ONp (074 g 15% molowych) w acetonie w obecności 0,144 g azoizobutyronitrylu (AIBN), stosując 12,5% monomerów, 86,9% acetonu i 0,6% AIBN. Monomery i AIBN rozpuszczono w acetonie, przesączono, przeniesiono do ampułki i przedmuchano N2. Ampułkę zatopiono i mieszaninę polimeryzowano w 50°C przez 48 godzin. Polimer odsączono, przemyto acetonem i suchym eterem, a następnie wysuszono. Polimer rozpuszczono w MeOH i wytrącono acetonem, przemyto acetonem i eterem, po czym wysuszono. Uzyskano 1,52 g oczyszczonego produktu. Zawartość grup ONp oznaczanych spektroskopowo (8274 = 0,95 x 10⁴ 1/mol -cm (DMSO) wynosiła 10,6% molowych. Średni wagowy ciężar cząsteczkowy (17 000) i polidyspersyjność (1,5) oznaczono po aminolizie 1-amino-2-propanolem metodą FPLC w kolumnie Superose 12 (10 x 30 cm) kalibrowanej frakcjami poli-HPMA (bufor 0,5M NaCl + 0,05M TRIS; pH 8).

W podobny sposób otrzymano prekursor 1b zawierający 5,1% molowych ONp, o średnim wagowym ciężarze cząsteczkowym 23 000 i polidyspersyjności 1,5.

172 184

Przykład VI. Wytwarzanie układu polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp

Kopolimer HPMA (przykład I) z Ma-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (przykład IV), określany jako prekursor 2a lub 2b, otrzymano zgodnie z następującą reakcją:

CH.

CH.

CH.

CH.

CH₂=C

CH₂=C

CH₂-C

CH₂-C c=o

I

NH

I ch₂

I

CHOH

I ch₃

HMPA

C=0

I

NH

I ch₂ i c=o I

NH ch-ch₂

C=O

I

NH aceton AIBN 24 godz50°C

7©

CH-CH /h₃ 'CH,

C=O -J

I

NH

I

CH₂

I

CHOH

I ch₃

C=0

I

NH

I ch₂

I

C=O

I

NH

I ch-ch₂

I

C=O

NH ch-ch;

/h₃

CH.

MA-G-F-L-G-ONp

Zsyntetyzowano kopolimery zawierające dwie różne ilości bocznych łańcuchów Gly-PheLeu-Gly-ONp. Kopolimer o mniejszej zawartości łańcuchów (określony jako prekursor 2a) zastosowano do syntezy poszczególnych kopolimerów [polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6 (kopolimer III) i polimer Gly-Phe-Leu-Gly-adria (kopolimer 1)], a o większej zawartości do syntezy kombinowanego kopolimeru.

Gly-Phe-Leu-Gly-ce6

Polimer (kopolimer IV)

Gly-Phe-Leu-Cjly-adria

W przypadku prekursora 2a726,97 mg (96% molowych HPMA, 123,02 mg (4% molowej MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp i 41 mg AIBN rozpuszczono w 7,5 ml acetonu. Roztwór przesączono, przeniesiono do ampułki i przedmuchano N 2. Ampułkę zatopiono i mieszaninę polimeryzowano w 50°C przez 30 godzin. Polimer odsączono, przemyto acetonem i eterem, a następnie wysuszono. Polimer rozpuszczono w MeOH (18% wag.) i wytrącono 100 ml mieszaniny aceton:eter 3:1. Uzyskano 570,5 mg kopolimeru zawierającego 3,7% molowych ONp (£274 = 0,95 x 104 1/_moPcm w (DMSO), określana metoda spektroskopii UV). Średni wagowy ciężar cząsteczkowy (21 000) i polidyspersyjność (1,6) oznaczono po aminolizie 1-amino-2-propanolem metodą FPLC w kolumnie Superose 12 (10 x 30 cm) kalibrowanej frakcjami poli-HPMA (bufor 0,5M NaCl + 0,05M TRIS; pH 8).

Prekursor 2b otrzymano w taki sam sposób metodą rodnikowej kopolimeryzacji strąceniowej, HPMA (206,7 mg, 90% molowych), MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (93,3 mg 10% molowych) i AIBN (14,4 mg) rozpuszczono w 2,65 ml acetonu. Kopolimeryzację prowadzono przez 48 godzin w 50°C. Uzyskano 197,5 mg kopolimeru zawierającego^SUc molowych ONp (£272 = 0,95 x 104 1/mol-cm w (DMSO), określana spektrometrycznie). Średni wagowy ciężar cząstczkowy (18 000) i polidyspersyjność (1,6) oznaczono po aminolizie 1-amino-2-propanolem metodą FPLC w kolumnie Superose 12 (10 x 30 cm) kalibrowanej frakcjami poli-HPMA (bufor 0,5M NaCl + 0,5M TRIS; pH 8). 7,5% molowych bocznych łańcuchów ulegających odszczepieniu w prekursorze 2b jest wielkością zbliżoną do górnej granicy zapewniającej rozpuszczalność polimeru w roztworach fizjologicznych, zwłaszcza po przyłączeniu hydrofobowych leków do bocznych łańcuchów polimeru.

Syntezy kopolimerów I - IV z wykorzystaniem kopolimerów-prekursorów z przykładów V i VI opisano poniżej w przykładach VII-XII.

Jako lek przeciwnowotworowy wykorzystywano w przykładach chlorowodorek adiamycyny o następującej budowie:

NH₂.HC1

1Ί2 184

Lek ulegający fotoaktywowaniu stosowany w przykładach stanowi sól disodowa mezochloryno-e6-menoetylenodiaminy (ce6) o wzorze

NH

I ch₂

I

CH₂

I nh₂

Przykład VII. Wytwarzanie układu polimer-Gly-ce6

Kopolimer III z bocznymi łańcuchami nie ulegającymi degradacji, zawierający 11,2 (kopolimer IIIa), 7,9 (kopolimer IIIb) i 8,3% wag. (kopolimer IIIc) ce6 otrzymano zgodnie z następującą reakcją:

1. DMSO, 5 godz temperatura pokojowa

2. 1—amino-2-propanol

P—G—ONp + cs_B

CH- |		ch3 1 3
-ch2-c- 1	—	-ch2-c- I
1 L C=O -J		1 L c=oJ
|	X	1
NH I		NH I
1 ch2 1		1 ch2 I
CHOH I		1 C=O I
1 ch3		I NH 1 CSg

Kopolimer IIIa otrzymano w sposób następujący: polimer-Gly-ONp (prekursor 1a o ciężarze cząsteczkowym około 17 000 i polidyspersyjności 1,5) (225 mg, 10,6% molowych

ONp) rozpuszczono w 0,8 ml DMSO. Sól disodową mezochloryno-e6-monoetylenodiaminy (ceć) (39,4 mg, 57,5 μmola) (Porphiryn Products, Lagan, UT) rozpuszczono 0,4 ml DMSO.

Roztwór ce6 dodano do roztworu P-ONp (dodając jeszcze 0,3 ml DMSO do przemycia) i całość mieszano 5 godzin w temperaturze pokojowej. Następnie do mieszaniny dodano 25,7 μΐ 1-amino-2-propanolu i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Roztwór wytrącono acetonem i wymrażano przez noc. Polimer odsączono, przemyto acetonem i eterem, a następnie wysuszono, rozpuszczono go w MeOH (3,5 ml) i wprowadzono do kolumny LH-20 (55 x 3 cm). Główne frakcje polimeru zebrano, odparowano w wyparce rotacyjnej, rozpuszczono w wodzie destylowanej, zamrożono i liofilizowano. Uzyskano 142,3 mg głównej frakcji, a łącznie 217 mg polimeru, zawartość chloryny oznaczana spektrofotometrycznie (£394 = 1,58 x 10⁵ 1/mol-cm w metanolu) wynosiła 11,2% wag. (2,6% molowych).

Kopolimery IIIb i IIIc otrzymano podobnie odpowiednio z kopolimerów-prekursorów 1b (ciężar cząsteczkowy około 23 000, polidyspersyjność 1,5), oraz 1a (ciężar cząsteczkowy około 17 000, polidyspersyjność 1,5); zawierały one odpowiednio 7,9 i 8,3% wag. ce6.

Przykład VIII. Wytwarzanie układu polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-cec (kopolimeru II).

Kopolimer II zawierający ulegające degradacji łańcuchy boczne o zawartości ce6 11,2% wag. otrzymano zgodnie z następującą reakcją.

1. DMSO, 4 godz. temperatura pokojowa

2. 1-aminoP-G-F-L-6-0Np +

2-propanol 5 minut	1 — 0 X u 1		— 0 X u _1
CSg > _	-CH--C- |	—	-ch2-c- 2 I
	1 L c=oJ		1 L c=oJ
	1	X	1
	NH 1	NH 1
	1 ch2 j	1 CH, J 2
	CHOH 1	1 c=o |
	1 ch3	1 NH

CH-CH.

I ‘ c=o

I

NH

I

CH-CH

I c=o I

NH

I

CH,

I c=o I

NH

_zCH₃

CHce,

Polimer-Gly-Phe-Leu-Gly- (prekursor 2a) o ciężarze cząsteczkowym około 21 000 i polidyspersyjności 1,6) (200 mg, 3,7% molowych ONp) rozpuszczono w 0,75 ml DMSO. Ce6 (32,9 mg, 1,25 nadmiar molowy) rozpuszczono w 0,15 ml DMSO. Mieszaninę ce6 dodano do mieszaniny polimeru (stosując dodatkowo 0,2 ml DMSO do przemycia) i całość mieszano przez godziny w temperaturze pokojowej, 1-amino-2-propanol (6,4 gl, trzykrotny nadmiar w stosunku do pozostających grup ONp) dodano i mieszaninę reakcyjną wymieszano przez 5 minut. Kopolimer wytrącono mieszaniną 3:1 aceton:eter, przesączono, przemyto acetonem i eterem, po czym wysuszono. Kopolimer rozpuszczono w 5 ml MeOH i wprowadzono do kolumny LK-20 (55 x 3 cm). Pasmo kopolimeru oddzielono, odparowano do sucha, rozpuszczono w wodzie destylowanej, zamrożono i liofilizowano. Uzyskano 168 mg czystego produktu o zawartości ce6 11,2% wag., oznaczonej spektrr^ifotomet^cznie (8394 = 1,58 x 10⁵ 1/mol-cm w metanolu).

Przykł ad IX. Wytwarzanie układu polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-adria (kopolimeru 1). Kopolimer I z bocznymi łańcuchami ulegającymi degradacji, zawierający 7,4% wag.

adnamycyny otrzymano zgodnie z następującą reakcją:

1. DMSO + trietyloamina godz., temperatura pokojowa

2. 1-amino-2P-G-F-L-6-ΟΝρ + H minut

-j, edriamycyna

CH- 1 -CH--C— |		-CHa-	CHa 4.1 1
1 L C=O J			1 C=O -1
1 NH	X		1 NH

CH, CH₃

I I

CHOH C=O

NH

CH-CH,

I ch₃ c=o

I

NH

I

CHI

C=O

I

NH

I adria

Polimer-Gly-Phe-Leu-Gly (prekursor 2a) o ciężarze cząsteczkowym około 21 000 i polidyspIrsyjności 1,6) (200 mg, 3,7% molowych ONp) rozpuszczono w 0,76 ml DMSO. Chlorowodorek adnamycyny (27,8 mg, 4,8 x 10'⁵ mola) rozpuszczono w 0,18 ml DMSO i dodano do rozpuszczonego polimeru. Dodano trietyloaminę (5,35gl, 3,84 x 105 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, po czym dodano jeszcze 20% trietyloaminy (2,7 ml, 9,6 x 10'⁶ mola). Reakcję kontynuowano przez 3 godziny w temperaturze pokojowej, 1-amino-2-propanol (6,4 gl, trzykrotny nadmiar w stosunku do pozostających grup ONp) dodano i mieszaninę reakcyjną wymieszano przez 5 minut. Kopolimer

172 184 wytrącono 4,75 ml mieszaniny 4:1 aceton-eter i wymrażano przez 1 godzinę. Następnie przesączono go, przemyto acetonem i eterem, po czym wysuszono. Produkt rozpuszczono w 5 ml MeOH i wprowadzono do kolumny LK-20 (55 x 3 cm). Pasmo kopolimeru oddzielono, odparowano do sucha, rozpuszczono w wodzie destylowanej, zamrożono i liofilizowano. Zawartość adriamycyny (£488 = 1,19 x 10⁴ 1/mol-cm) wynosiła około 9,0% wag., a wydajność ostateczna 183 mg.

Przykład X. Wytwarzanie układu polimer-(Gly-Phe-Leu-Gly-adria)-Gly-Phe-LeuGly-ce6 (kopolimeru IV) Kombinowany kopolimer IV z łańcuchami ulegającymi degradacji, zawierający 4,2% wag. ce 6 i 7,25% wag. adriamycyny otrzymano zgodnie z następującą reakcją:

P-G-F-L-6-ONp pokojowa ce_B. 3 godz. , temperatura pokojowa

1. Adriamycyna.HCl

	CH, “ I 3		Γ ch3 Ί 1 3		CH, J 3
-ch2	1 I	-—	-ch2-c—		-ch2-c«—
	1 C=0		i L C=O ©		1 L c=oJ
	1	X	1	y	|
	NH	NH	NH
	1	1	1
	CH, |	CHa 1	ch2 1
i tura	CHOH |	c=o I	c=o I
	1 ch3	1 NH	1 NH

DMSO

CH—CH.

I ' c=o

I

NH

I

CH—CH

I c=o

I

NH

I

CH,

I c=o

I

NH

I adria

ch-ch₂

i I,CH.

\:η.

c=o

I

NH

CH-CH _zch₃

CH,

C=O

I

NH

I

CH,

I c=o

I

NH

I ce_B mg układu polimer-Gly-Phe-Leu-Cly-ONp (prekursora 2b o ciężarze cząsteczkowym 18 000 i polidyspersyjności 1,6) (7,8% molowych ONp) rozpuszczono w 0,10 ml DMSO. Chlorowodorek adriamycyny (4,6 mg, 7,9 gmola) rozpuszczono w 0,12 ml DMSO i dodano do roztworu polimeru. Dodano trietyloaminę (0,88 μΐ , 6,3 |m^ola) . Reakcji ę prowadzono 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dodano 40% więcej trietyloaminy (0,44 gl, 3,2 μmola) i reakcję kontynuowano przez 1 godzinę. Próbkę roztworu (0,06 ml) pobrano w celu oznaczenia adriamycyny. Metodą spektroskopową oceniono, że zawartość adriamycyny wynosi 7,25% wag. (£450 = 1,19 x 104 w wodzie). Do roztworu dodano 1,75 mg (2,6 μmola) ce6 rozpuszczonej w 0,03 ml DMSO. Dodano trietyloaminę (0,44 μ^. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 3 godziny.

172 184

Dodano 1-amino-2-propanol (2,1 jxl, 27 jmoli) i mieszaninę reakcyjną wymieszano przez 5 minut. Kopolimer wytrącono mieszaniną 3:1 aceton:eter (400 ml) i wymrażano przez 3 godziny. Następnie przesączono go, przemyto acetonem i eterem, po czym wysuszono. Produkt rozpuszczono w około 5 ml MeOH i wprowadzono do kolumny LK-20 (55 x 3 cm) doprowadzonej do stanu równowagi w MeOH. Produkt uzyskany w ilości 27,1 mg zawierał około 4,2% wag. ce6, oznaczonej spektroskopowo (£394 = 1,58 x 10⁵ 1/mol-cm w MeOH).

Przykład XI. Wytwarzanie układu polnueu-(Giy-sekretyna)-Gly-ceó.

Kopolimer V z łańcuchami bocznymi nie ulegającymi degradacji otrzymano zgodnie z następuj ącą reakcj ą:

P^—G-ONp + ce_B + sekretyna

1. DMSO

2. trietyloamina 30 godz., temperatura pokojowa

CH₂ ch₂ ch₂

CHOH I	c=o |	C=O 1
1 ch3	I NH	1 NH

ce_B sekretyna mg układu polimer-Gly-ONp (prekursora 1a o ciężarze cząsteczkowym 17 000 i polidyspersyjności około 1,5) rozpuszczono w 50jl DMSO. 2 mg ce6 (2,9 jmola) rozpuszczono w 30 jl DMSO i dodano do roztworu polimeru. Następnie 19 mg (6,2 jmola) sekretyny (świńskiej) rozpuszczono w 110 jl DMSO i dodano do mieszaniny. 10 jl (7,5 jmola) trietyloaminy (rozcieńczonej 1:10 w DMSO) dodano do mieszaniny reakcyjnej. Po mieszaniu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej dodano jeszcze 5 jl (3,7 jmola) trietyloaminy. Po kolejnej godzinie dodano jeszcze raz 5jl (3,7 jmola) trietyloaminy. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 30 godzin w temperaturze pokojowej, po czym rozcieńczono 2,5 ml wody i dializowano w 20% etanolu w wodzie przez 8 godzin w 4°C (odcinany ciężar cząsteczkowy (MWCO) 6000-8000) w celu usunięcia rozpuszczalnika organicznego. Następnie przeprowadzono przez 40 godziny dializę w wodzie. Kolejną dializę w wodzie przeprowadzono przez 24 godziny (MWCO 12 000 -14 000), aby być pewnym, że całanieprzereagowana sekretyna została usunięta (nieobecność wolnej sekretyny sprawdzano w kolumnie FPLC (kolumna Hr 10/30; Superose 12; 0,05M TRIS + 0,5M NaCl, pH 8). Wolny lek wydzielono w kolumnie PD-10 doprowadzonej do stanu równowagi z wodą. Próbkę zamrożono i liofilizowano. Zawartość ce6 określana metodą spektroskopii UV (£400 = 1,68 x ΗΤ w DMSO) wynosiła 5,9% wag. a zawartość koniugatu sekretyny oceniana na podstawie analizy aminokwasów po hydrolizie 6N HCl wyniosła 300 jg/mg.

Przykład XII. Wytwarzanie układu polimer-(Gly-Phe-Leu-Gly-adria)-(Glu-Phe-LeuGly-ce66--Gly-Phe-Leu-Gly-sekretyna) (kopolimeru VI). 400 mg P-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (prekursora 2b, 7,8%molowych ONp, M_w=18 000, polidyspersyjność 1,6) rozpuszczono w 1 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Chlorowodorek adriamycyny (23 mg, 40 jmoli), rozpuszczono w 0,6 ml DMSO i dodano do roztworu kopolimeru, po czym dodano 4,4 jl (32 pmole) trietyloaminy. Po 1 godzinie w temperaturze pokojowej dodano 2,2 jl (16 pmoli) trietyloaminy, a po 1 godzinie roztwór 8,75 mg (12 jmoli) ce6 rozpuszczonej w 0,15 ml DMSO. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 3 godziny. Dodano 400 mg (13 mmoli) sekretyny i reakcję kontynuowano przez noc w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną dializowano względem 10% etanolu w wodzie przez 5 godzin i względem czystej wody przez 48 godzin, zamrożono i liofilizowano.

Zastosować można inne kopolimery do wytwarzania kombinowanych polimerów zawierające lek przeciwnowotworowy oraz lek fotoaktywowany, przyłączone do łańcucha polimeru. Poniższe przykłady ilustrują sposób wytwarzania takich polimerów.

Przykład XIII. 1 g dekstranu (ciężar cząsteczkowy 40 000) i 35 mg 4-(N,N-dimetyloamino)pirydyny rozpuszczono w 20 ml mieszaniny dimetylosulfotlenek/pirydyna (1:1 objęt.). Do roztworu tego dodano 500 mg chloromrówczanu p-nitrofenylu w 3 porcjach. Po 20 minutach mieszaninę reakcyjną wytrącono w nadmiarze absolutnego etanolu, przemyto i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Zawartość grup p-nitrofenylowych oznaczona metodą spektrometrii UV wynosiła 5,1% molowych.

Przykład XIV. Roztwór otrzymano rozpuszczając 500 mg aktywowanego dekstranu (otrzymanego w przykładzie XIII i zawierającego około 1,5 x 10* grup aktywnych) w 8 ml dimetylosulfotlenku. Dodano roztwór 1 x 10'⁴ mola chlorowodorku adriamycyny i 1 x W⁴ mola N-(2-aminoetylo)chloryno-e6 amidu w 2 ml dimetylo-sulfotlenku, a następnie 1 x 10^ mola trietyloaminy. Po 5 godzinach reakcji dodano 2 x 104 mola 1-amino-2-propanolu. Po 10 minutach polimer zawierający zarówno grupy adriamycyny jak i e6 wydzielono przez wytrącenie, odsączono, przemyto i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem.

Przykład XV. Poli(1-winylo-2-pirolidon-co-bezwodnik maleinowy) (ciężar cząsteczkowy 20 000) wytworzono sposobem opisanym przez J.Pato i innych, Makromol, Chem. Rapid Commun., 3, 643 (1982). Roztwór otrzymano rozpuszczając 200 mg kopolimeru w suchym dimetyloformamidzie. Roztwór zawierający 1 x 10' N-puromycyny i 1 x 10^ (2-aminoetylo)chloryno-^e6-amidu w 1 ml dimetyloformamidu dodano do roztworu kopolimeru i prowadzono reakcję przez 3 godziny w 40°C. Produkt reakcji wytrącono eterem etylowym i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Koniugat polimer/lek rozpuszczono w gorącej wodzie w celu zhydrolizowania nieprzereagowanych grup bezwodnikowych. Roztwór schłodzono, dializowano w aparacie do dializy Visking przez 72 godziny względem wody i wysuszono sublimacyjnie.

Badania in vitro

Przykład XVI. Analizy fotofizyczne.

Zarówno bezpośrednie jak i pośrednie metody badania stanu wzbudzonego wykorzystano do porównania właściwości fotofizycznych wolnej ce6 i nie ulegającego rozszczepieniu układu polimer-Gly-ce6 (kopolimeru IIIb). Pomiary szybkiej fluorescencji przeprowadzono w Center for Fast Kinetics Research (CFKR), University of Texas, Austin, z wykorzystaniem techniki zliczania pojedynczych fotonów (Atherton i inni, J. Phys Chem., 93, 6809 (1989). Sprzężony, skomputeryzowany spektrofotometr do badań kinetyki błyskowej wykorzystano do wyznaczania różnicy widma tripletowego i singletowego oraz do pomiaru żywotności tripletu. Wzbudzania dokonywano za pomocą lasera Nd:YAG Quantek YG 481 ze wzbudzeniem Q. Wydajności kwantowe powstawania tlenu singletowego (^{I^rAg) wyznaczono po pulsacyjnym wzbudzeniu laserowym sensybilizatorów przy 355 nm w D2O nasyconej powietrzem, a następnie na podstawie emisji tlenu singletowego (1270 nm) w czasie.

W metodzie pośredniej wydajność kwantową pochłaniania wyznaczano na podstawie pomiarów spadku stężenia tlenu za pomocą rejestrującej elektrody tlenowej, jako stosunek (wyjściowa szybkość pochłaniania cząsteczek tlenu)/(wyjściowa szybkość absorpcji fotonów). Mieszaniny reakcyjne zawierały sensybilizator i alkohol furfurylowy jako substrat. Alkohol furfurylowy wybrano z tego względu, gdyż reaguje on chemicznie z tlenem singletowym z dużymi wydajnościami (stała szybkości 1,2 x 10). Na dodatek nie reaguje on z nadtlenkiem wodoru ani z supertlenkiem, a najprawdopodobniej nie ulega rodnikowo inicjowaniu samoutlenianiu (Maurette i inni, Helv. Chim. Acta, 66, 722 (1983) oraz Haag i inni, Chemosphere, 13, 631 (1984). Mieszaniny reakcyjne naświetlano projektorem do przezroczy o mocy 500 W, wyposażonym w filtr interferencyjny 407 nm (szerokość pasma 10±2 nm przy 50% transmitancji piku), mierząc spadek stężenia tlenu w czasie. Energię światła padaj ącego mierzono za pomocą próżniowego mikrowoltomet.ru termoparowego, kalibrowanego standardowymi lampami. Emi32 tacja energetyczna wynosiła około 2 mW/cm2. Udział światła pochłoniętego określano za pomocą fotometru z fotodiodą krzemową. Wydajności kwantowe powstawanie tlenu singletowego oceniano na podstawie wydajności kwantowej pochłaniania tlenu w nasyconym alkoholu furfurylowym, stosując róż bengalski jako wzorzec. Błąd pomiaru wydajności kwantowej wynosił 5-10%. Procedurę tą powtórzono stosując polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6 (kopolimer II) w celu ustalenia różnic w wydajności kwantowej powstawania tlenu w stosunku do układu polimer-Gly-ce6, zawierającego tylko glicynę w łańcuchu bocznym.

Powstawanie singletowego tlenu

Bezpośrednie potwierdzenie powstawania singletowego tlenu 1Ag stanowiła jego emisja przy 1270 nm po wzbudzeniu przy 355 nm 30 pmolowej ce6 lub polimer-Gly-ce6 w fosforanie sodowym jako buforze (pH 7,4) w D 2O. Zanik emisji w bliskiej podczerwieni jest procesem pierwszorzędowym, przy czym okres życia w przypadku ce6 i polimer Gly-ce6 wynosi odpowiednio 54,4±1 i 50,1±1,5 ps. Wielkości te zbliżone są do 55 ps, wielkości podanej dla zaniku tlenu singletowego w D 2O. Wydajności kwantowe pochłaniania tlenu w czasie fotoutleniania alkoholu furdui^^y(o^wego sensybilizowanego ce6, polimer-Gly-ce6 (kopolimerem Illb) i różem bengalskim w funkcji stężenia alkoholu forfurylowego osiągają maksimum i zaczynają zmniejszać się przy stężeniu alkoholu furfuryłowego około 50 mM. Całość powstałego tlenu singletowego została w tym zakresie wychwycona przez alkohol furfurylowy. Stosunek wydajności kwantowych przereagowania tlenu w tym zakresie (nasycone stężenia alkoholu furfurytowego) do wielkości literaturowej wydajności kwantowej singletowego tlenu dla różu bengalskiego (0,75) umożliwia wyliczenie wydajności kwantowej powstawania singletowego tlenu Φ¹ Ag dla układu polimerGly-ce6 i ce6. Wyniki podano w tabeli 1).

Tabela 1

Wydajności kwantowe powstawania singletowego tlenu Φ¹ dla wolnej ceę i układu polimer-Gly-ceę

Próbka	Roztwór	O^g
ce6	bufor, pH 7,4	0,73
cee	bufor + CTAB	0,81
Polimer*-Gly-ce6	bufor, pH 7,4	0,25
Polimer*-Gly-ce6	bufor + CTAB	0,83

* Kopolimer Illb; CTAB - bromek cetylotrimetyloamoniowy; bufor: 100 mM fosforan sodowy (pH 7,4)

W przypadku układu polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6 (kopolimeru II) w PBS przy stężeniu alkoholu furfurr^do'^^,cgo 100 mM wydajność kwantowa pochłaniania tlenu wynosiła 0,06, nieznacznie mniej niż w przypadku układu polimer-Gly-ce6 (wydajność kwantowa pochłaniania tlenu 0,1). Jednak po dodaniu CTAB wielkość ta wzrosła do 0,39, co jest porównywalne z wielkościami dla ce6 i układu polimer-Gly-ce6 zmierzonymi z dodatkiem CTAB.

Wyniki te wskazują, że efekt fotodynamiczny ce6 nie zależy od tego, czy zostanie ona odszczepiona od polimeru. Jednakże właściwości w roztworze ce6 związanej z kopolimerem znacznie wpływają na wydajność kwantową singletowego tlenu. Wydajność kwantowa singletowego tlenu dla układu polimer-Gly-ceć w fosforanie sodowym jako buforze jest znacznie niższa niż w przypadku wolnego leku. Dodatek detergentu (CTAB) nieznacznie podwyższa wydajność kwantową dla wolnej ce6, a znacznie zwiększa wydajność kwantową singletowego tlenu dla układu polimer-Gly-ce6. Oznacza to, że polimer-Gly-ce6 jest znacznie silniej zagregowany w buforze niż wolny lek, choć pewna monomeryzacja dla wolnego leku zachodzi po dodaniu środka powierzchniowo czynnego. Obecność agregatów potwierdzają krótkie, szerokie piki w widmie absorbancji oraz tłumienie widma fluorescencji układu polimer-Gly-ce6 w buforze w porównaniu z ce6. Micelarne agregaty tworzą się w roztworze wodnym, gdyż hydrofobowe cząsteczki ce6 odpychane są przez wodę tworząc hydrofobowy rdzeń z hydnofilowym polimerem tworzącym warstwę zewnętrzną stykającą się z wodą.

Właściwości stanu tripletowego

Zazwyczaj reakcje sensybilizowane wymagające obecności tlenu w układach biologicznych są możliwe z uwagi na długi okres życia stanów tripletowych sensybilizatora. Zarejestrowano widmo różnicowe tripletowo/singletowe mierząc absorbancję roztworów ce6 lub polimer-Gly-ceg w fosforanie sodowym jako buforze (pH 7,4) w ciągu 1,2 gs po błyskowym naświetleniu wiązką o 355 nm w powietrzu. Stwierdzono, że w przypadku obydwu sensybilizatorów najbardziej przydatny pik absorpcji występuje przy 430 nm. Zmierzono długości życia tych sensybilizatorów przy takiej długości, fali w argonie. Stwierdzono, że wynoszą one 400 gs w przypadku ce6 i 450 gs w przypadku układu polimer-Gly-ce6.

Fotowybielanie

Wydajności kwantowe fotowybielania ceć i układu polimer-Cily-ce-f, (kopolimeru IIIb) zmierzono jako stosunek (początkowej szybkości zaniku cząsteczek sensybilizatora) do (wyjściowej szybkości absorpcji fotonów). Zanik cząsteczek śledzono spektrofotometrycznie przy różnych czasach naświetlania tą samą lampą żarową 500 W z filtrem przepuszczającym pasmo 407 nm, którą stosowano w doświadczeniach fotoutleniania. Błąd w tych pomiarach wynosił również 5-10%

Tabela 2

Wydajności kwantowe fotowybielania wolnej ce i układu polimer-Cly-ceć

Roztwór	ce6	polimer-dy-ceó
bufor (pH 7,4)	1,3 x 10'3	2,8 x 10-4
bufor +10 mM alkoholu furfury Io wego	1,2 x 10'3	2,5 x 10’4
bufor + 0,5 HSA	6,8 x 10-4	4,8 x W4
bufor + CTAB	4,9 x 10-4	5,9 x 10'5

Polimer-Cly-ce6: kopolimer IIIb; HSA: albumina ludzkiej surowicy; bufor: 10(0 mM fosforan sodowy (pH 7,4).

W tabeli 2 zestawiono wydajności kwantowe fotowybielania ce6 i układu polimer-Gly-cef, (kopolimeru IIIb) w różnych warunkach reakcji. Mieszaniny zawierały 5 gm sensybilizator w 100 mM buforze, fosforanie sodowym (pH 7,4) nasyconym tlenem (0,22 mM tlenu). Fotowybielanie ce6 było procesem pierwszorzędowym, aż do wybielenia 60% sensybilizatora. Nie zaobserwowano nowych pików w świetle widzialnym w czasie fotowybielania, co świadczy że układ makrocykliczny uległ rozpadowi. Alkohol furfurylowy wywiera niewielki wpływ, natomiast HSA powoduje zmniejszenie wydajności kwantowej o około 50% w stosunku do próby kontrolne, CTAB inhiubituje fotowybielanie ce6.

Z drugiej strony fotowybielanie układu polimer-Gly-ce6 nie jest reakcją Pierwszorzędową i wydajność kwantowa stanowi jedynie 20% wydajności dla ce6. Również w tym przypadku nie zaobserwowano nowych pików w świetle widzialnym. Główna różnica w wynikach uzyskanych w przypadku układu polimer-Gly-ce6 i ce6 polega na tym, że HSA nieznacznie zwiększa wydajność kwantową, a detergent (CTAB) tylko nieznacznie inhibituje fotowybielanie.

Fotowybielanie wykorzystać można w PDT w taki sposób, że światło może penetrować coraz głębiej do tkanki rakowej w miarę jak związek ulega fotowyblaknięciu w wyniku prowadzenia PDT. Może wówczas zostać uaktywniony sensybilizator znajdujący się głębiej w tkance nowotworowej. Jeśli w górnych warstwach znajduje się dużo sensybilizatora, będzie on absorbował światło i zapobiegał jego penetracji do wnętrza tkanki nowotworowej.

Przykład XVII. Odszczepianie ce6 od układu polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6 za pomocą katepsyny B.

Przeprowadzono wstępne doświadczenia w celu zbadania aktywności katepsyny B, lizozomalnej proteazy cysternowej, wydzielonej ze śledziony wołowej. Molowy współczynnik ekstynkcji, ε28ΐ = 5,15 x 10⁴ 1/mol -cm (0,09 M bufor fosforanowy, pH 6) oznaczono spektrofotometrycznie (ciężar cząsteczkowy = 28 000 (Pohl i inni, FEBS Lett., 23, 142 (1982)). Badano różne stężenia enzymu w celu ustalenia stężenia o odpowiedniej aktywności. Zastosowano mieszaninę reakcyjną zawierającą 0,53 mg katepsyny B (19 gmoli), 1,54 mg (5 gmoli) glutationu

172 184 i 1,0 mg (0,025 ml roztworu 40 mg/ml w DMF) 2,3 mmola) Na-benzoilo-L-arginino-p-nitroanilidu (BAPNA) jako substrat. Przez bufor fosforanowy (0,09 M, pH 6) wstępnie barbotowano N2. Następnie przygotowano roztwory, które trzymano w lodzie. Przez mieszaninę enzymu, glutationu i buforu barbotowano N2 przez 5 minut. Roztwór aktywowano następnie przez 5 minut w 37°C w celu uaktywnienia przez glutation miejsca wiązanie w enzymie. Następnie szybko dodano substrat (BAPNA) i śledzono zmiany absorbancji przy 410 nm w czasie. Przy takim stężeniu uzyskano aktywność enzymu ΔΑ410/10 minut = 1,76. W celu sprawdzenia aktywności w czasie, w warunkach reakcji, w jakich przeprowadzano doświadczenia z polimerem, enzym i glutation w buforze inkubowano przez 120 godzin w 37°C, po czym dodano substrat i śledzono absorbancję przy 410 nm. Aktywność enzymu wynosiła 68% aktywności wyjściowej.

W celu zbadania rozszczepiania układu polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceó (kopolimer II) najpierw przeprowadzono próby porównawcze przy różnych stężeniach enzymu i polimeru, tak aby wybrać najlepszą kombinację. Przygotowano roztwór podstawowy polimeru (1,9 mg/ml buforu fosforanowego), enzymu (2,12 mg/ml buforu fosforanowego) i glutationu (15,36 mg/ml). Również w tym przypadku przez bufor wstępnie barbotowano N 2. Przez roztwór podstawowy enzymu (0,25 ml) i 0,4 ml buforu umieszczony w lodzie barbotowano N 2 przez 5 minut. Dodano glutation (0,1 ml) i roztwór wstępnie inkubowano w 37°C przez 5 minut. Dodano roztwór podstawowy polimeru (0,25 ml), po czym próbkę przedmuchano azotem i zatopiono. Przygotowano w ten sposób 5 próbek, które inkubowano w ciemności w 37°C przez 4, 8, 12, 24 i 49 godzin. Za każdym razem mieszaninę reakcyjną (0,95 ml + 1,55 ml wody) wprowadzano do kolumny PD-10 doprowadzonej do stanu równowagi z wodą i i odbierano frakcje po 1 ml. Kolumny były uprzednio kalibrowane za pomocą układu polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6 i wolnej ci6. Układ polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-c^ eluował się we frakcjach 1-3, a wolny lek we frakcjach

7-10. Po frakcji 10 dodano 1 ml 1N NaOH w celu uwolnienia ce6 niespecyficznie związanej w kolumnie. Po 0,5 ml każdej frakcji umieszczono w kuwecie i dodano 50 gl 10% środka Triton Χ-100. Rejestrowano absorbancję przy 398 nm i dla każdej próbki wyliczano procent odszczepionej ce6. (Zbadana w takich samych warunkach próbka kontrolna, kopolimer polimerGly-Phe-Leu-Gly-ces, nie wykazywała zdolności do odszczepiania).

Wyniki doświadczeń odszczepiania wskazują, że ce6 odszczepia się od układu polimerGly-Phe-Leu-Gly-cą,. Po 120 godzinach uzyskano 87,55% odszczepienia. Absorbancja frakcji

7-10 (odpowiadająca wolnej ce6) zwiększa się przy równoczesnym spadku absorbancji we frakcjach 1-4 (odpowiadającym zmniejszaniu się ilości układu polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6) w czasie. Wyliczono dokładne wielkości spadku stężenia układu polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6 i wzrostu ilości wolnej cec, i wykonano odpowiednie korelacje. Dla każdej próbki wyliczono ilość odzyskanego materiału; w przypadku wszystkich próbek uzyskano z kilkuprocentowymi odchyleniami 100%.

Wydajność kwantowa pochłaniania tlenu przez układ polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ceó po rozszczepianiu katepsyną B

Wyniki analiz fotofizycznych porównujących ce6 związaną z polimerem i wodą ce6 oraz wyniki in vivo porównujące kopolimer ulegający rozszczepianiu (kopolimer II) i nie ulegający rozszczepianiu (kopolimer IIIa) doprowadziły do badań porównujących aktywność fotofizyczną kopolimeru ulegającego rozszczepianiu (kopolimer II) przed i po enzymatycznym uwolnienu ce6 przez katepsynę B. W celu wykonania tego doświadczenia przygotowano 3 próbki. Zastosowano roztwór podstawowy o takich samych stężeniach i takie same mieszaniny reakcyjne jak w uprzednio opisanych doświadczeniach rozszczepiania. W przypadku 2 próbek roztwory podstawowe wymieszano i reakcje prowadzono w ciemności w 37°C przez 2 dni i 1 tydzień. Trzecią próbkę zachowano jako kontrolną. Inkubowano ją częściowo; enzym i substrat inkubowano oddzielnie przez 2 dni, po czym wymieszano je natychmiast przed wykonaniem analizy fotofizycznej. Pomiary pochłaniania tlenu wykonano metodą fotoutleniania alkoholu furfurylowego, opisaną w przykładzie XVI. Próbkę 250 gl rozcieńczono 3,75 ml buforu fosforanowego (pH 6) i dodano alkohol furfurylowy do osiągnięcia stężenia nasycenia, 100 mM. Roztwór nasycono powietrzem i wstawiono do niego elektrodę tlenową. Określano spadek stężenia tlenu w czasie przy naświetlaniu próbki światłem 407 nm. Wyznaczono wydajność kwantową pochłaniania tlenu, po czym wyliczono wydajność kwantową singleto172184 wego tlenu, przyjmując jako wzorzec wyznaczoną uprzednio wielkość dla różu bengalskiego: 0,375 (wydajność kwantowa pochłaniania tlenu) oraz 0,75 (wydajność kwantowa powstawania singletowego tlenu).

Właściwości fotofizyczne po rozszczepianiu

Tabela 3

Wpływ enzymatycznego odszczepiania przez katepsynę B ce6 od układu polimer-Gły-rhe-Leu-GIy-c^ na właściwości fotofizyczne

Inkubacja	Φ1 Ag
-	0,14
2 dni	0,66
1 tydzień	0,71

Zgodnie z wynikami innych badań fotofizycznych wykazujących wysokie wydajności kwantowe powstawania singletowego tlenu dla wolnej ce6 w porównaniu z układem polimerGly-ce6 (tabela 1) oraz potwierdzeniem odszczroiania ce6 w próbach rozszczepiania in vitro, roztwór, w którym polimer (kopolimer II) inkubowano z katepsyną B przez. 48 godzin wykazywał 5 razy większą wydajność kwantową powstawania singletowego tlenu niż roztwór, w którym enzym i polimer wymieszano natychmiast przed wykonaniem pomiarów (tabela 3). Po tygodniowym inkubowaniu wydajność kwantowa osiąga wielkość taką jak dla wolnej ce6. Podano również wydajności kwantowe pochłaniania tlenu.

Badania, w których wykonano pomiary wydajności kwantowej pochłaniania tlenu dla mieszaniny reakcyjnej zawierającej układ pρlielrr-Gly-Phe-]Leu-Gly-ce6, po inkubowaniu z katepsyną B przez 48 godzin i 1 tydzień wykazały znaczny wzrost wydajności kwantowej przy przedłużeniu czasu rozszczepiania. W miarę jak ce6 odszczepia się od nośnika polimerycznego, właściwości fotofizyczne stają się coraz bardziej zbliżone do właściwości wykazywanych przez roztwór wolnej ce6. Może to wyjaśnić wzrost działania przeciwnowotwΌrowegp w PDT zaobserwowany in vivo w przypadku kopolimeru ulegającego degradacji w stosunku do nie ulegającego. Kopolimery mogą ulegać agregacji pod wpływem niskiego pH wewnątrz lizozomów w większym stopniu niż wolny lek, a w miarę odszczepiania się lek staje się mniej zagregowany. Z drugiej strony to raczej zmiany konformacyjne a nie agregacja mogą być odpowiedzialne za różne wielkości wydajności kwantowych powstawania singletowego tlenu w przypadku leków wolnych i związanych przez kopolimer. Jednak różnice takie można zaobserwować jedynie w doświadczeniach z rozpraszaniem światła. Może to wyjaśnić, dlaczego PDT z nie ulegającym rozszczepieniu układem polimer-Gly-c^ okazują się mniej skuteczne w hamowaniu nowotworów niż w przypadku wolnej ce6 (wyników nie zamieszczono), w związku ze zwiększonym miejscowym zatrzymywaniem kopolimeru. Nawet jeśli większa ilość polimeru umiejscowi się w nowotworze, jego działanie PDT nie jest tak znaczące jak działanie wolnego leku w środowisku komórki. Jednakże porównywanie działania PDT in vivo wolnego leku i układu oplimrr-Gły-cre nie jest zbyt dokładne z uwagi na nierozouszczałnpść wolnej ce^, w stężeniach niezbędnych do przeprowadzenie skutecznie PDT. Na dodatek różnice we wchłanianiu. o czym świadczą różne czasy wchłaniania dla maksymalnego stężenia wolnej ce6 i układu polimer-Gly-ces poprzez nowotwory powodują, że opóźnienia czasowe przed naświetlaniem nowotworów muszą być różne.

Badania in vivo

Nerwiak niedojrzały stanowi 8% przypadków raka stwierdzonych u dzieci do 15 roku życia. Najwięcej przypadków występuje u dzieci pięcioletnich, przy czym w większości przypadków w czasie diagnozy choroba jest w stadium przerzutów (50% u niemowląt i 75% u dzieci starszych). Rokowania zależą od wielu czynników takich jak wiek pacjenta, stadium choroby w czasie diagnozy, a w przypadku dzieci powyżej roku, zaatakowanie węzłów chłonnych. Nerwiak niedojrzały powstaje w zwojach współczulnych, które tworzą się ze zwojów zarodkowych współczulnych migrujących z grzebienia nerwowego w rozwoju embrionalnym. Z uwagi na pochodzenie choroba może objawiać się w różnych miejscach. Dowolne miejsce w układzie nerwowym współczulnym stanowi potencjalne centrum nerwiaka niedojrzałego. Zazwyczaj pierwszy nowotwór umiejscowiony jest w brzuchu, w nadnerczu (40%) lub w zwoju parardzeniowym (40%). Znane są również pierwotne nowotwory piersiowe (5%) i miedniczne (5%). Nerwiak niedojrzały często wykazuje przerzuty około-oczodołowe (DeVita i inni, Cancer Principies and Practice, Vol. 2, 3 Ed., 1624-1631). Nawet przy ostatnich postępach w leczeniu nowotworów rokowania w odniesieniu do nerewiaka niedojrzałego nie są zachęcające. Często następują przerzuty do szpiku kostnego, co jest trudne do wykrycia (Chadwick i inni, Receptors in Tumor Biology, 169-188 (1986)).

Gdy nerwiak niedojrzały jest umiejscowiony, terapia obejmuje wycinanie nowotworu. Wyjątkową cechą nerwiaka niedojrzałego jest jego zdolność do samorzutnego cofania się. Resztki nowotworu w złożu rakowym po resekcji rzadko powodują nawroty choroby (DeVita i inni, supra). W przypadku nie dającego się zoperować umiejscowionego nerwiaka niedojrzałego oraz regionalnego nerwiaka niedojrzałego stosuje się leczenie kombinowane, operowanie i chemioterapię. Chemioterapię (często w postaci mieszaniny leków) stosuje się w przypadku choroby rozsianej. Do środków chemioterapeutycznych należy cyklofosfamid, doksorubicyna (adriamycyna), cyplastyna, tenipozyd, etopozyd, winkrystyna i dakarbazyna. Stosuje się także terapię radiacyjną.

Genetyka molekulatna nerwiaka niedojrzałego została lepiej poznana niż w przypadku jakiegokolwiek innego nowotworu u ludzi (DeVita i inni, supra), choć niewiele wiadomo o powierzchni takich komórek. Z monoklonalnych przeciwciał wyhodowano antygeny na powierzchni ludzkich komórek nerwiaka niedojrzałego, w celach diagnostycznych i terapeutycznych. Monoklonalne przeciwciała ze sprzężonym 131i okazały się skuteczne w przypadku choroby rozsianej, ale pacjenci z większymi nowotworami nie reagują na nie (DeVita i inni, supra).

Roth i inni, J. Neurichem., 42, 1145 (1984), stwierdzili, że klon z komórek nerwiaka niedojrzałego pochodzących z nowotworu C1300 myszy (N18TG2) zawiera specyficzny receptor sekretyny, sprzężony z cyklazą adenylanową. Sekretynajest 27-aminokwasowym hormonem występującym w układzie żołądkowo-jelitowym, który reguluje wydzielanie trzustkowe i zawiera sekwencję His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ser Arg Leu Arg Asp Ser Ala Arg Leu Glu Arg Leu Leu Gin Gly Leu Val (SEQ ED nr 10).

Jednakże niewiele wiadomo o znaczeniu sekretyny w tkance nerwowej, a komórki nerwiaka niedojrzałego zastosowano w badaniach jako model do sprawdzania specyficzności receptora peptydu zasocjowanego z cyklazą adenylanową w neuronach. Jednakże wielkość sekretyny stanowi zaletę, która może pozwolić na jej penetrację do stałych nowotworów, w porównaniu z grupą docelową w postaci przeciwciała.

W celach demonstracyjnych zastosowano linię komórek nerwiaka niedojrzałego Neuro 2A, gdyż tworzy ona stały, trudny do wyleczenia nowotwór u myszy A/J. Myszom A/J (w wieku 5-6 tygodni) rutynowo wstrzykiwano około 1,5 x 10⁶ żywych komórek nerwiaka niedojrzałego C1300, na krawędzi żeber. Gdy nowotwór stal się namacalny, rozpoczynano kurację. Każda z grup leczonych o kontrolnych składała się z 5 myszy. Leki rozpuszczano zazwyczaj w buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS) i wstrzykiwano dożylnie kopolimer (IV) do żyły ogonowej myszy. Dawki leku wyrażane w mg/kg leku, wyliczano w oparciu o zawartość leku związanego w kopolimerem w procentach wagowych. W przypadku zwierząt kontrolnych i leczonych środkiem chemoterapeutycznym określano objętość nowotworu mierząc długość, szerokość i wysokość nowotworów za pomocą cyrkla, po podaniu leku.

W przypadku terapii fotodynamicznej optymalne opóźnienie czasowe po podaniu leku określono w doświadczeniach lokalizacji/retencji, po czym zastosowano światło 650 nm (laser argonowy). Przeprowadzono szereg doświadczeń w celu ustalenia odpowiedniej dawki światła i leku. Działanie przeciwnowotworowe śledzono mierząc objętość nowotworu. W doświadczeniach mieszanych leki rozpuszczano razem i wstrzykiwano do żyły ogonowej. Przed naświetlaniem zastosowano opóźnienie czasowe niezbędne do zadziałania adriamycyny oraz do optymalnego wchłonięcia sensybilizatora.

Wszystkie dane odnośnie doświadczeń in vivo stanowią wielkości średnie dla wszystkich myszy w grupie.

172 184

Przykład XVIII. Chemioterapia

Układ polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-adria (7,4% wag. chlorowodorku adriamycyny) (kopolimer 1) zastosowano do wykazania działanie zmniejszającego nowotwór. We wszystkich doświadczeniach stosowano zwierzęta kontrolne oraz te, którym podawano kopolimer I w ilości odpowiadającej dawce adriamycyny 4,1, 8,2 lub 16,4 mg/kg. Leki rozpuszczano w bakteriostatycznej soli fizjologicznej kopolimer IV do żyły ogonowej. Wzrost nowotworu śledzono mierząc jego objętość. Dzień zastosowania leku oprzyjmowano na dzień 0, a objętość nowotworu mierzono do momentu, aż nowotworu nie można było odróżnić między zwierzętami leczonymi i kontrolnymi. Osobniki, które przeżyły, sprawdzono do 55 dnia po podaniu leku.

Wyniki w postaci zależności objętości nowotworu od czasu dla różnych dawek podano w tabelach 4-6.

Tabela 4

	Średnia objętość nowotworu (mm3)
Czas, dni	4,1 mg/kg	Kontrolne
3	250	250
5	500 ±200	500 ±200
6	700 ±250	1000 ±250
9	1200 ± 200	2250 ±350
13	2600 ±400	5500± 1000

Tabela 5

	Średnia objętość nowotworu (mm3)
Czas, dni	8,2 mg/kg	Kontrolne
2	200	200
4	200	500 ±200
6	200	950 ±150
8	300 ± 200	1800 ±200
10	550 ±150	4000 ±800
13	800 ± 300	4000 ±800
15	1200 ±500	5300± 1000
17	1300 ±500	7000± 1200

Tabela 6

	Średnia objętość nowotworu (mm3)
Czas, dni	16,4 mg/kg	Kontrolne
‘ 0	100	100
3	200	250
5	50	600
6	0	1(000+100
9	0	2400 ±400
13	0	5500± 1000

Jak to wynika z tabeli 6, dawka 16,4 mg/kg wykazała 100% skuteczność w leczeniu nowotworu. Wszystkie myszy w tej grupie były wolne od nowotworu i zdrowe aż do 55 dnia, w którym uśmiercono je (taka sama dawka wolnego leku była toksyczna dla myszy).

Dawka 4,1 mg/kg nie wywierała większego wpływu w porównaniu ze zwierzętami kontrol38

172 184 nymi. Dawka 8,2 mg/kg wywierała pewien wpływ na zahamowanie nowotworu, jednak nie działała leczniczo. Wzrost nowotworu został zahamowany na około 5 dni. W dziesiątym dniu nowotwory rosły z taką samą szybkością jak u zwierząt kontrolnych. Stężenie 8,2 mg/kg wykorzystano następnie w doświadczeniach mieszanych.

Adriamycyna (doksorubicyna, NSC 123127) powoduje kumulacyjną, uzależnioną od dawki kardiomiopatię, będącą jej podstawowym ograniczającym dawkowanie działaniem ubocznym. Ogranicza to jej długotrwale stosowanie w stanie wolnym. Toksyczność występuje wyraźnie w przypadku pojedynczej dawki (16,4 mg/kg) wolnej adriamycyny, podczas gdy taka dawka leku polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-adria zmniejsza nowotwór. Przy nawet większej dawce, 20 mg/kg wolny lek powoduje 100% zachorowalności. Taka dawka powoduje początkową utratę wagi myszy w ciągu pierwszych dni po podaniu leku polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-adria, z tym że waga szybko wyrównuje się.

Przykład XIX. Doświadczenialokalizacji/retencji

Doświadczenia lokalizacji/retencji przeprowadzono w celu porównania wchłaniania wolnej soli disodowej mezo-chloryno-e6-monoetylenodiaminy (ce6) oraz nie ulegającego degradacji układu polimer-Gly-ce6 (11,2% wag. ce6) (kopoli-mer IIIA) i ulegającego degradacji układu polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6 (11,2μ wag. ce6) (kopolimer II). 5 mg/kg każdego leku wstrzykiwano do żyły ogonowej myszy A/J z wyczuwalnym nowotworem nerwiaka niedojrzałego C1300. Lek najpierw rozpuszczano w buforowej fosforanem soli fizjologicznej (PBS) o pH 7,4. Polimeryczny lek lepiej rozpuszczał się w PBS niż lek wolny. W celu przeprowadzenia wolnego leku do roztworu należało podwyższyć pH lub roztwór podgrzewać w ciemności i schłodzić do temperatury pokojowej przed wstrzyknięciem i natychmiast wstrzykiwać.

Wyniki badań lokalizacji/retencji układupolimer-Gly-ce6 (kopolimeru IIIa)/wolna ce^

Jak to zaznaczono, gdy nowotwory stały się wyczuwalne, myszom wstrzykowano 5 mg/kg wolnej cee lub układu polimer-Gly-ce6. Zwierzęta uśmiercono i próbki tkanek (nowotwór, skóra, śledziona, mięsień nogi, nerka mięsień brzuszny i wątroba) usinięto w różnych okresach czasu po wstrzyknięciu. Próbki zamrożono i liofilizowano przez 2 dni. Wysuszone próbki zważono. Dodano 1 ml wody/25 mg suchej próbki. Tkankę zhomogenizowano mechanicznie i 100 μl homogenizatu przeniesiono do próbki do hydrolizy. Do każdej próbki dodano 50% wodorotlenek metylobenzetoniowy w metanolu (1 ml) i próbki odgazowano. Próbki hydrolizowano w ogrzewanym bloku przez 1 godzinę w 55°C. Po schłodzeniu dodano 2 ml 50% THF w wodzie. Po wymieszaniu wyznaczono fluorescencję (EX 397, EM 654) i porównano z krzywą wzorcową do wyliczania stężenia ce6 (ng ce6) w próbkach. Zawartość wolnego leku osiągała maksymalne stężenie w tkance rakowej w ciągu 1 godziny, natomiast w przypadku polimeru uzyskano wysokie stężenie nawet po 48 godzinach. Wyniki zestawiono w poniższych tabelach 7-13.

Tabela 7 Tkanka: nowotwór

Czas, godziny	ng ceć/mg tkanki
	P-Gly-ce6	wolna ce6
1	30 ± 5	17 ± 5
2	29 ± 8	20 ± 6
4	32 ±2	4 ± 2
8	37 ±4	7 ± 2
24	35 ±4	4 ± 2
48	39 ± 3	2

Tabela 8

Tkanka: mięsień brzuszny

Czas, godziny	ng ceć/mg tkanki
	P-dy-ceć	wolna ceć
1	5 + 2	3,5 ± 1
2	4 ±0,5	3 + 1
4	5 ± 1	3 ± 1
8	7 + 2	0,5
24	14 + 2	1
48	8	1

Tabela 9 Tkanka: nerka

Czas, godziny	ng ce6/mg tkanki
	P-dy-eeć	wolna ce6
1	31 ± 5	12,5 ±21,5
2	30 ± 2	13 ±4
4	22 ± 3	4
8	15 + 2	3
24	13 ± 1	3 ± 1
48	14± 3	2 ± 1

Tabela 10 Tkanka: śledziona

Czas, godziny	ng cee/mg tkanki
	P-dy-ceó	wolna ce6
1	16 ± 3	6
2	14 ± 1	7±3
4	14	2
8	18 ± 3	2
24	15 ± 2	2 ± 1
48	18 ±2	1

Tabela 11 Tkanka· wątroba

Czas, godziny	ng ce6/mg tkanki
	P-dy-ceć	wolna ce6
1	38 ±4	73+1
2	41 ±2	62 ±1
4	44 ±2	6+1
8	43 ±5	7 ± 1
24	65 ±6	8 ± 1
48	53 ±5	7

Tabela 12 Tkanka: mięsień nogi

Czas, godziny	ng ce6/mg tkanki
	P-dy-ce6	wolna ce6
1	3,0 ±0,1	0,9 ±0,3
2	2,7 ± 0,6	1,3 ±0,1
4	2,2 ±0,8	0
8	1,5 ±0,2	0
24	2,6 ±0,8	0
48	3,5 ±0,9	0

Tabela 13 Tkanka: skóra

Czas, godziny	ng ce6/mg tkanki
	P-dy-ce6	wolna ce6
1	0,7	0,9
2	1,2	1,9 ±1,6
4	0,8 ± 0,4	0,1
8	0,9 ± 0,2	0
24	2,7 ± 0,7	0
48	4,7 ± 0,5	0

Inne doświadczenia wykonano z polimerem pobierając tkanki po 5 dniach. Stężenie ce6 w nowotworze było w dalszym ciągu znaczne (28 nm/mg tkanki), choć niższe niż po krótszych okresach.

Wyniki badań lokalizacji/retencji układu polimer-Cly-Phe-Leu-Cly-ce6 (kopolimeru II)/wolna ce6.

Tą samą procedurę lokalizacji/retencji, którą zastosowano w przypadku układu polimerGly-ce6 (kopolimeru III), wykorzystano również w przypadku układu polimer-Gly-Phe-LeuGly-ce6 (11,2μ wag. ce6) kopolimeru II). W przeciwieństwie do wyników z lekiem nie ulegającym odszczepieniu, w przypadku polimeru ulegającemu rozszczepianiu następuje zdecydowany spadek zawartości ce6 w nowotworze po 48 godzinach oraz pełny klirens po 120 godzinach. Badania te stanowią pośrednie potwierdzenie odszczepiania ce6 od polimeru w komórkach rakowych i wykazują zdolność organizmu do usuwania wolnej ce6. Wyniki zestawiono poniżej w tabelach 14-20.

Tabela 14 Tkanka, nowotwór

Czas, godziny	ng ce6/mg tkanki
	Kopolimer II	wolna ce6
1	37 ± 5	7
2	32 ±2	6
4	42 ± 6	5
8	54 ± 3	3
48	5	2
120	0	0

Tabela 15

Tkanka: mięsień brzuszny

Czas, godziny	ng ce6/mg tkanki
	Kopolimer II	wolna ce6
1	1,0 + 0,2	0,2
2	2,3 ±0,1	0,1
4	7,5+22,0	0,1
8	10,0 ±2,0	0,2
48	0	0
120	0	0

Tabela 16 Tkanka: nerka

Czas, godziny	ng ce6/mg tkanki
	Kopolimer II	wolna cefi
1	24 ±2	9 ± 1
2	21 ± 2	3 ± 1
4	19± 1	2
8	14 ±1	1
48	3 ± 2	1
120	1 lub 0	1

Tabela 17 Tkanka: śledziona

Czas, godziny	ng ce6/mg tkanki
	Kopolimer II	wolna ce6
1	14 ± 1	24 ±3
2	18± 1	24 ±3
4	24 ± 3	24 ±3
8	33 ±3	34 ±3
48	6 ± 1	21 ± 3
120	1	11 ± 1

Tabela 18 Tkanka: wątroba

Czas, godziny	ng ce6/mg tkanki
	Kopolimer II	wolna ce6
1	42	90
2	35 ±15	50 ±6
4	55 ± 7	57± 5
8	39 ± 8	28
48	8	31 ± 2
120	3	33 ±4

172 184

Tabela 19 Tkanka: mięsień nogi

Czas, godziny	ng dfi/mg tkanki
	Kopolimer II	wolna ci6
1	1,3 ±0,3	0,2
2	1,2 ±0,4	0,1
4	1,8 ±0,8	0,3 ± 0,2
8	1,2 ±0,3	0,1
' 48	0,6 ±0,6	0
120	0	0

Tabela 20 Tkanka, skóra

Czas, godziny	ng de/mg tkanki
	Kopolimer II	wolna ci6
1	0,2 ±0,1	0
2	0,1 ±0,2	0
4	0,3 ±0,1	0
8	0,1 ±0,1	0
24	0	0

Doświadczenia lokalizacji/retencji in vivo z polimerem ulegającym rozszczepianiu (tabela 14) wykazują szybki klirens ce6 z tkanki nowotworowej w porównaniu z polimerem nie ulegającym rozszczepianiu (tabela 7). Tą samą tendencję obserwuje się w przypadku mięśni brzusznego, nerki, śledziony, wątroby, mięśnia nożnego i tkanki skórnej (tabela 15-20 w porównaniu z tabelami 8-13). Szybkość rozszczepiania in vivo można regulować stosując różne oligopeptydowe mostki. Pożądane może być nawet wolniejsze rozszczepianie (3-4 dni), tak, aby kopolimer nie wchłonięty przez nowotwór został usunięty z organizmu przed rozpoczęciem naświetlania nowotworu. Również dłuższy okres czasu między wstrzyknięciem i napromieniowaniem powoduje, że adria (przy mostku zapewniającym względnie większą szybkość uwalniania niż ce6) będzie mieć więcej czasu na wywarcie efektu.

Zastosowanie polimerycznego nośnika sensybilizatora zmniejsza efekty uboczne takie jak nadwrażliwość na światło po leczeniu, gdyż w powyższych doświadczeniach lokalizacji/retencji wykazano, że większa ilość leku związanego z polimerem gromadzi się raczej w nowotworze niż leku wolnego, nawet bez stosowania grup kierujących. Umożliwia to podawanie mniejszej ilości leku, przy zachowaniu w dalszym ciągu retencji niezbędnej ilości sensybilizatora przez nowotwór.

Przykład XX. Terapia fotodynamiczna.

Przeprowadzono szereg doświadczeń PDT. Zbadano różne dawki leku i światła, tak aby wyznaczyć optymalne zakresy leczenia. Lek w różnych stężeniach rozpuszczano w PBS i wstrzykiwano do żyły ogonowej myszy. Po upływie pewnego czasu nowotwór naświetlano (laser argonowy, 650 nm) w różnych odstępach czasu. (Myszy znieczulano uprzednio pentobarbitalem sodowym: roztwór podstawowy 6,48 mg/ml, wstrzykiwanie 0,013 ml/g wagi ciała). Najpierw porównano działanie układu polimer-Gly-CI6 (kopolimeru IIIa) i wolnego leku. Następnie działanie przeciwnowotworowe układu polimer-Gly-ce6 (kopolimeru IIIa) porównano z działaniem układu polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6 (kopolimeru II) (samego wolnego leku już nie stosowano, gdyż nie można było takiego samego stężenia leków polimerycznych z uwagi na nierozpuszczalność). Dzień naświetlania przyjęto jako dzień zerowy.

172 184

Układpolimer-Gly-ceó i wolnej ce6

W doświadczeniu PDT porównano działanie fotodynamiczne wolnej ce6 i układu polimerGly-ce6 (11,2% wag. cer,) (4 mg/kg) (kopolimer IIIa). Naświetlanie (500 mW/cm², 5 minut wykonywano po 1 i 24 godzinach, aby umożliwić wchłonięcie leku przez tkankę. Wszystkie zwierzęta w obydwu grupach padały przy naświetlaniu. Wyniki pochłaniania przez 24 godziny podano w tabeli 21.

Tabela 21

	Średnia objętość nowotworu (mm3)
Czas, dni	P-dy-ceć	Kontrolne
0	100	150
1	150	250
2	200 ±50	350 ±50
3	175 ± 50	600 ±100
4	800+400	2300± 100

Działanie wolnego leku było zasadniczo takie same jak w przypadku zwierząt kontrolnych, natomiast kopolimer IIIa powodował zahamowanie nowotworu przez około 3 dni. Z uwagi na różnice w optymalnym czasie wchłaniania wolnej ce6 i układu polimer-Gly-ce6 oraz nierozpuszczalności wolnej cey, w stężeniach niezbędnych przy stosowaniu układu polimer-Gly-ce6, wolnego leku dalej nie badano.

Wpływ 48-godzinnego wchłaniania układu polimer-Gly-ce6 i napromieniowania (500mW/cm2, 5 minut) przedstawiono w tabeli 22.

Tabela 22

	Średnia objętość nowotworu (mm3)
Czas, dni	P-dy-ceć	Kontrolne
0	100	100
2	200	200
4	300	400
6	500± 150	700 ±100
8	1400 ±200	2500 ±600
10	1800 ±500	2800 ±600

Układ polimer-Gły cee (kopolimer IIIa) i układ polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-cer (kopolimer II).

Przeprowadzono szereg doświadczeń PDT w celu porównania działania fotodynamicznego układu polimer-Gly-ce6 (kopolimeru IIIa) i układu polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6 (kopolimeru II). Kopolimer ulegający rozszczepianiu (kopolimer II) we wszystkich przypadkach działał silniej. Przy stężeniu 4 mg/kg ce6(24 godziny wchłaniania) przy napromieniowaniu z mocą 500 mW/cmprzez 5 minut zaobserwowano 60% śmiertelności (autopasja wykazała szereg uszkodzeń oraz innych uszkodzeń fotodynamicznych). Wszystkie myszy w grupie z lekiem nie ulegającym rozszczepieniu przeżyły. Zjawiska jakościowe takie jak bielenie, obrzęk i tworzenie się czarnych strupów były bardziej widoczne we wszystkich doświadczeniach z kopolimerem ulegającym rozszczepieniu niż z nie ulegającym rozszczepieniu. Najlepsze wyniki uzyskano, gdy wyraźnie tworzyły się czarne strupy. Gdy to wystąpiło, nowotwór zanikał zazwyczaj w ciągu kilku dni.

Z uwagi na oczywiste silniejsze działanie fotodynamiczne kopolimeru ulegającego rozszczepieniu (kopolimeru Π) zastosowano go zamiast układu polimer-Gly-ce6 (kopolimeru IIIa) we wszystkich późniejszych doświadczeniach PDT. W następnym etapie przeprowadzono optymalizację dawki leku (kopolimeru II) i światła tak, aby wyznaczyć optymalne parametry zapewniające maksymalną skuteczność i przeżycie myszy. Potwierdziło się, że skuteczne są zmniejszone dawki leku i zwiększone dawki światła, Zbadano dawki układu polimer-Gly-PheLeu-Gly-ce6 (kopolimeru II) 4, 3,25, 2,5 2 i 1 mg ce6/kg (wchłanianie przez 24 godziny) oraz naświetlania 500 mW/cm2 przez 10 minut. Dawki od 2,5 do 4 mg ce6/kg nieodmiennie powodowały zmienne śmiertelności w zakresie 20-100%. Dawka 1 mg/kg była w sposób oczywisty nieskuteczna przy zastosowanej dawce światła, w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi.

Do badań wybrano dawkę układu polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6 (kopolimeru II) 2 mg ce6/kg (24 godziny wchłaniania). Czas naświetlania (moc 500 mW/cm2) zmieniano w zakresie 5-20 minut. Grupa 20-minutowa wykazała 60% śmiertelność, a w grupie 5-minutowej efekt był nieznaczny. Natomiast znaczny efekt uzyskano przy czasach naświetlania 8 minut 20 s, 10 minut i 13 minut 20 s.

Najlepsze wyniki przy najmniejszym prawdopodobieństwie śmiertelności zaobserwowano w przypadku dawki leku 2 mg/kg dla układu polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6 (11,2% wag. ce6) kopolimer II) oraz naświetlaniu dawką 500 mW/cm2 przez 10 minut. Wyniki badań kopolimeru II w dawce 2 mg/kg po wstrzykiwaniu IV do żyły ogonowej myszy A/J z nerwiakiem niedojrzałym C1300 z naświetlaniem po 24 godzinach po podaniu leku światłem 650 nm, w porównaniu z grupą kontrolną przedstawiono w tabeli 23. Czarne strupy i bielenie wystąpiło wyraźnie u wszystkich zwierząt w leczonej grupie. W ciągu 3 dni po leczeniu nie stwierdzono obecności nowotworu, który zaczął następnie szybko rozwijać się, porównywalnie jak w grupach kontrolnych.

Tabela 23

	Średnia objętość nowotworu (mm3)
Czas, dni	Kopolimer II	Kontrolne
0	100	100
2	50	250
4	0	400
6	25	600 ±100
8	100 ± 50	1150 ±200
10	300+ 100	2000 ±500
12	500±200	3300 ±500

Przykład XXI. Mieszana chemioterapia + PDT

W tych doświadczeniach (1) i układ polimer-Gly-ce6 (kopolimer Ilia) i układ polimer-GlyPhe-Leu-Gly-adria (kopolimer I) lub (2) układ polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6 (kopolimer II) i polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-adria (kopolimer I) rozpuszczono razem w PBS i wstrzyknięto kopolimer IV do żyły ogonowej myszy z wyczuwalnym nowotwore. Naświetlanie laserem argonowym po znieczuleniu (dawka 500 mW/cm2, 5 minut) wykonano po 2 dniach w przypadku stosowania układu polimer-Gly-ce6 oraz po jednym dniu (dawka 500 mWW, 10 minut) w przypadku stosowania układu polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-ce6, z uwagi na różnice w lokalizacji/retencji. Dzień wstrzykiwania leku przyjmowano jako dzień zerowy.

Mieszanina układu polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-adria (kopolimeru I) i układu polimer-Glycee (kopolimeru IIIa)

Układ polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-adria (7,4% wag. chlorowodorku adriamycyny, 8,2 mg/kg adriamycyna HCl) (kopolimer I) i układ polimer-Gly-ce6 (11,21% wag. ce6, 4 mg/kg) (kopolimer III) wymieszano i wstrzyknięto kopolimer IV, gdy nowotwór stał się wyczuwalny. Po 2 dniach zastosowano naświetlanie (500 mW/cm2, 10 minut). Wydłużono przerwę czasową, aby umożliwić dłuższe działanie adriamycyny, gdyż z doświadczeń lokalizacji/retencji wiadome było, że stężenie ce6 będzie w dalszym ciągu wysokie. Uzyskano 60% wyzdrowienia, przy czym myszy, które wyzdrowiały, trzymano do 54 dnia, gdy doświadczenie zakończono. Doświadczę172 184 nie powtórzono uzyskując średni stopień wyzdrowienia 40%. Mieszana chemioterapia + PDT jest o wiele skuteczniejsza niż zastosowanie każdego z leków osobno.

Mieszanina układu polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-adria (kopolimer I) i układu polimer-GlyPhe-Leu-Gly-ce6 (kopolimer II)

Mimo iż dawka 2 mg/kg w przypadku układu polimer-Gly-Phr-Lru-Gly-cr^6 (kopolimeru II) była skuteczniejsza w prowadzonych uprzednio doświadczeniach PDT, okia^^^ał»^! się, ze jest ona toksyczna, gdy zostanie zastosowana wraz z dawką 8,2 mg/kg układu oPlimer-Gly-Phe-LeuGly-adria (kopolimeru I). Z tego względu dawkę układu ppłimrr-Gly-Phe-Lru-Gły-cr6 zmniejszono do 1,5 mg/kg. Doświadczenie kombinowane przeprowadzono stosując 1,5 mg/kg układu polimer-Gly-PŁe-Leu-Gly-c^ i 8,2 mg/kg układu polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-Edria. Zbadano wpływ naświetlania (500 mW/cm², 10 minut) po 24 i 48 godzinach. W grupie 48-godzinnej stwierdzono minimalne działanie, a w grupie 24-godzinnej działanie znaczące. W grupie tej uzyskano stopień wyzdrowienia 80% (myszy uśmiercono po 48 dniach).

Wyniki doświadczenia, w którym wymieszano polimer-Gly-Piie-Leu-Gly-ce-f, i polimerGły-Phe-Lru-Gły-adria i zastosowano przedział czasowy 48 godzin znacznie różnią się pod względem efektu PDT od doświadczenia z przedziałem czasowym 24 godziny. Osłabienie niszczenia nowotworu stanowi pośredni dowód rozszczepienia w nowotworze. Rozszczepienie może wystąpić w komórkach śródbłonkowych tworzących kapilary nowotworu, a zniszczenie tych kapilar może uniemożliwić przedostawanie się do nowotworu składników odżywczych, co prowadzi dojego zniszczenia. Jednakże transcytoza najprawdopodobniej zachodzi w komórkach śródbłonkowych, co oznaczałoby, że rozszczepienie zachodzi w rzeczywistości w komórkach rakowych, a ich rozpad powoduje śmierć nowotworu. Pewne materiały pohmeryczne mogą nie uniknąć przemiany lizosomowej w komórkach śródbłonkowych, tak że do zniszczenia nowotworu przyczyniać się mogą obydwa mechanizmy.

Bez względu na mechanizm wyniki wskazują, że zarówno w przypadku kopolimeru ulegającego rozszczepieniu (polimer-Gly-Phe-Leu-Gly-c^) jak i nie ulegającego rozszczepieniu (pplimrr-Gly-ce6) kombinowana terapia z połimer-Gły-Phe-Leu-Gły-adria jest bardziej skuteczna niż sama PDT lub sama chemioterapia przy takich samych dawkach. Stosując terapię kombinowaną wyeliminować można efekty uboczne obydwu leków.

Przykład XXII. Kopolimer kombinowany.

Kopolimer kombinowany (kopolimer 4) rozpuszczono w PBS i wstrzyknięto kopolimer IV do żyły ogonowej myszy z wyczuwalnym nowotworem (przybliżona dawka adriamycyny 3,5 mg/kg, ce61,7 mg/kg). Po 24 godzinach zastosowano światło 650 nm (laser argonowy) (500 mW/cm2,10 minut). Zmiany objętości nowotworu śledzono w odniesieniu do dnia wstrzyknięcia leku, dnia zerowego. W doświadczeniu tym kombinowany kopolimer zasadniczo nie wykazał działania fotodynamicznego. Można to wyjaśnić tym, że kopolimer kombinowany (kopolimer IV) zsyntetyzowano z prekursora zawierającego około 7,8% molowych aktywnych grup estrowych. Kopolimer ten zawierał około 0 9% molowych (4,2% wag.) ce6 i 2,0% molowych (7,25% wag.) adriamycyny. Wykorzystując środek według wynalazku nie można było uzyskać w jednym kopolimerze stosunku adriamycyny do ce6 (5,5:1 wagowo), co byłoby pożądane w świetle wyników uzyskanych w doświadczeniach z mieszaninami kopolimerów, przy zachowaniu rozpuszczalności kopolimeru. Odpowiadałoby to zawartości adriamycyny 30% wag., aby zapewnić co najmniej jedną cząsteczkę ce6 w łańcuchu polimeru. Taki stosunek nie jest możliwy przy żądanej zawartości łańcuchów bocznych, przy zachowaniu rozpuszczalności w PBS. Jednakże obecnie prowadzi się badania nad zwiększeniem rozpuszczalności polimeru, co pozwoliłoby znacznie zwiększyć obciążenie polimeru i zapewnić wymagany stosunek adriamycyny do ce6, a także wprowadzić inne środki.

Nawet mimo iż kopolimer nie zawiera adriamycyny i ce6 w wymaganym stosunku, zbadano jego działanie terapeutyczne in vivo w celu sprawdzenia czy adriamycyna (nawet w tak niskiej dawce) zwiększy działanie terapeutyczne ce6, którą podawano w dawce około 1,7 mg/kg. W związku z tym, że nie można było przekroczyć dawki ce6 2 mg/kg (co wynikało z prób kontrolnych), rzeczywista dawka adriamycyny wynosiła odpowiednio 3,5 mg/kg. Na dodatek, mimo iż kopolimer zawierał średnio mniej niż jedną cząsteczkę ce6 w łańcuchu (pewne łańcuchy zawierały jedną lub więcej cząsteczek ce6), to zawierał on więcej niż jedną cząsteczkę adriamy46

172 184 cyny w łańcuchu polimeru. (Wyliczenia te oparte są na rozkładzie właściwym dla roztworu ciężarów cząsteczkowych polimeru i z tego względu ilości cząsteczek w łańcuchu nie są dokładnie znane). Nieznaczna reakcja może być spowodowana niską dawką adriamycyny, tym że nie wszystkie łańcuchy polimeru zawierają wbudowaną ce6, lub tym, że aktywności dwóch leków nie można bezpośrednio porównywać w przypadku, gdy leki te przyłączone są do różnych kopolimerów (dalsze badania mogą wykazać, że jeden lek wpływa na rozszczepienie drugiego. Ponadto kopolimer ten zawierał więcej ulegających degradacji łańcuchów bocznych niż stosowane kopolimery kontrolnc,co może wywierać wpływ na szybkość odszczepiania leków od kopolimeru przez enzymy lizozomowe.

Jakkolwiek możnaby obciążyć kopolimer adriamycyną i ceó w wymaganym stosunku wagowym, to zawierałby on mniej niż jedną cząsteczkę ce6W przeliczeniu na łańcuch polimeru, co nie pozwoliłoby osiągnąć celu, uzyskania pojedynczego kopolimeru z obydwoma lekami wprowadzonymi do tego samego łańcucha. Jednakże w przypadku większych zwierząt modelowych możnaby podwyższyć zawartość ce6 i zawęzić stosunek dwóch leków wprowadzanych do tego samego polimeru. Inne rozwiązanie tego problemu mogłoby stanowić zastosowanie mieszaniny kopolimerów, z których jeden zawiera zarówno lek przeciwnowotworowy i lek fotoaktywowany (np. adriamycynę i ceó), a drugi zawiera tylko lek przeciwnowotworowy (np. adriamycynę). Tak np. mieszanina kopolimeru I i kopolimeru IV, z których każdy zawierałby taką samą grupę kierującą, podawana równocześnie, mogłaby zapewnić uzyskanie wymaganego stosunku adria:ceó. Podobnie kombinację kopolimeru IV z dowolnymi innymi kopolimerami zawierającymi lek przeciwnowotworowy lub lek fotoaktywowany możnaby zastosować równocześnie uzyskując wymagany stosunke między jednym składnikiem bioaktywnym i drugim. W związku z tym oczywiste jest, że kombinację kopolimerów zawierających dwa środki bioaktywne wykorzystać można w odpowiedniej proporcji w celu uzyskania wymaganego terapeutycznego działania przeciwnowotworowego.

Przykład XXIII. Ukierunkowanie układu polimer-Gly-ceó z udziałem receptora, za pomocą sekretyny.

Przeprowadzono badania w celu porównania działania PDT ukierunkowanego kopolimeru V [polimer(sekretyna)-Gly-ce6] i nie ukierunkowanego kopolimeru IIIa (polimer-Gly-cer,) w stosunku do komórek nerwiaka niedojrzałego C1300 (Neuro 2A) in vitro. Komórki Neuro 2A (2 x 10⁵ komórek/zagłębienie) naniesiono na 200 pl zmodyfikowanego ośrodka Eagle z Dulbecco (12% płodowej surowicy bydlęcej) (MEM) na płytkach do hodowli z 96 zagłębieniami, na 24 godziny przez rozpoczęciem doświadczenia, tak aby uzyskać monowarstwę, oraz aby komórki zregenerowały swoje receptory. 100 pl MEM odciągnięto i dodano 100 pl próbek (ukierunkowaną lub nie ukierunkowaną), tak aby uzyskać ostateczne stężenie 25 pg cee/ml MEM. Komórki inkubowano przez 1,5 godziny (37°C, 5% CO2). MEM usunięto i komórki przemyto 1 raz HBSS (sól fizjologiczna z buforem Hanka). Ciecz znad osadu usunięto i dodano 200 pl MEM. Komórki naświetlano przez 15, 30 lub 45 minut (650 nm, 15 mW/cm²) lampą żarową wyposażoną w filtr czerwony. Po naświetleniu płytki inkubowano przez 18 godzin (37°C, 5% CO2), aby zapewnić nieodwracalność obróbki. Dodano 10pl (5 mg/ml) MTT (bromku

3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowego) (Si-gma) [Mossmann, J. Immunol. Methods, 65,55 (1983) oraz Twentyman i inni, Br. J. Cancer, 56,279 (1987)]. Płytki inkubowano następnie przez 4 godziny (37°C, 5% CO2). Z kolei ostrożnie usunięto 175 pl cieczy znad osadu, tak aby nie zakłócić błękitnych kryształów formazonu. Dodano 200 pl DMSO do każdego zagłębienia i mieszaniny ponownie zdyspergowano 1 raz. Absorbancję określano za pomocą czytnika płytek ELISA (filtr 570 nm). Płytkę kontrolną poddawaną analogicznej obróbce trzymano w ciemni.

Kopolimer ukierunkowany sekretyną

Wyliczono wyniki dla pierwszego doświadczenia, w którym porównano wpływ na PDT układu polimer-Gly-ce6 (kopolimeru IIIc) i układu polimer-(sekretyna)-Gly-ce6 (kopolimeru V) (stężenie 25 pg ce6/ml, inkubacja 1,5 godziny, w odniesienu do linii komórek nerwiaka niedojrzałego, przy trzech różnych czasach naświetlania (15, 30 i 45 minut). Absorbancja przy

570 nm jest proporcjonalna do liczby żywych komórek, gdyż tylko dehydrogenazy mitochon172 184 driów żywych komórek mogą redukować MTT do błękitnego formazonu, który wykazuje absorpcję przy 570 nm. Wyniki podano w tabeli 24.

Tabela 24 Absorbancja (570 nm)

Kontrolna	Kopolimer IIIc	Kopolimer V
	Minuty naświetlania
	15	30	45	15	30	45
1,6	1,7	1,6	1,7	1,3	0,4	0,3

Układ polimer-Gly-cee (kopolimer nic) zasadniczo nie wywiera wpływu przy takim stężeniu, natomiast kopolimer ukierunkowany (kopolimer V) wykazuje zależne od czasu naświetlania działanie cytotoksyczne.

Drugie badanie przeprowadzono stosując RIF (włókniako-mięsak indukowany promieniowaniem) jako próbkę kontrolną (nie ma oznak występowania receptora sekretyny). Zbadano dwie różne liczby komórek dla każdej linii komórkowej przy dwóch różnych czasach inkubacji (15 lub 45 minut). W przypadku próby kontrolnej RIF użyto 5 x 104 i 1 x 104 komórek/zagłębienie, a w przypadku linii komórek Neuro 2A zbadano dużą gęstość posiewu, 2 x 10⁵ oraz małą gęstość posiewu, 5 x 104 komórek/zagłębienie. Postępowano zgodnie z procedurą opisaną powyżej, z tym że w przypadku dużej gęstości posiewu komórek inkubację skrócono do 2 godzin, aby wyeliminować przekroczenie przez odczytywaną absorbancję zakresu czytnika ELISA. Zastosowano również inny czytnik ELISA w przypadku tych płytek, na których można było rejestrować absorbancję przy 560 nm, a nie przy 570 nm. Nie miało to jednak wpływu, gdyż próbki porównywano jedynie z próbkami kontrolnymi. Wyniki dla niespecyficznej linii komórek (RIF) (bez receptorów sekretyny), zastosowanej jako próbka kontrolna, zamieszczono poniżej w tabelach 25 i 26.

Tabela 25 Absorbancja (570 nm)

RIF 5 x 10⁴ komórek/zagłębienie

Kontrolna	Kopolimer IIIc	Kopolimer V
	Minuty naświetlania
	15	45	15	45
1,3	> 1,3	1,1	1,4	1,1

Tabela 26 Absorbancja (570 nm)

RIF 5 x 10⁴ komórek/zagłębienie

Kontrolna	Kopolimer IIIc	Kopolimer V
	Minuty naświetlania
	15	45	15	45
0,63	0,63	0,57	0,75	0,52

Ani polimer ukierunkowany (kopolimer V) ani nie ukierunkowany (kopolimer IHc) (stężenie inkubacji 25 gg ce6/ml) nie wykazywał cytotoksyczności po 15 minutach naświetlania. Po 45 minutach naświetlania w przypadku obydwu kopolimerów wystąpiła pewna cytotoksyczność. Kopolimer ukierunkowany wydaje się nieco silniejszy, co może być wynikiem niespecyficznego wiązania hormonu z powierzchnią komórki. Z drugiej strony kopolimer ukierunkowany wykazał znaczące, uzależnione od czasu działanie cytotoksyczne na komórki Neuro 2A, co było szczególnie wyraźne przy mniejszej gęstości komórek. Nieukierunkowany układ polimer-Gly48 ce6 (przy tym samym stężeniu inkubacji) nie wywierał wpływu na komórki, bez względu na czas naświetlania. Wyniki podano w tabelach 27 i 28.

Tabela 27 Absorbancja (570 nm)

Neuro 2A2 2 x 10⁵ komórek/zagłębienie

Kontrolna	Kopolimer IIIc	Kopolimer V
	Minuty naświetlania
	15	45	15	45
1,6	1,7	1,8	1,3	0,5

Tabela 28 Absorbancja (570 nm)

Neuro 2A2 5 x 10⁴ komóreWzaglębieme

Kontrolna	Kopolimer IIIc	polimer V
	Minuty naświetlania
	15	45	15	45
1,7	1,7	1,8	1,2	0,2

Wyniki pomiarów cytotoksyczności, w których porównano wpływ kopolimeru V i kopolimeru Illc na PDT świadczą o obecności receptora sekretyny w linii komórek Neuro 2a, zastosowanej w tych badaniach. Selektywna PDT nie ma miejsca in vitro. PDT jest specyficzna w stosunku do linii komórek Neuro 2A, gdyż linia komórek RIF wykazuje jedynie minimalny wpływ i tylko przy najdłuższym czasie naświetlania (45 minut), w porównaniu ze zdecydowanym spadkiem ilości żywych komórek w przypadku linii Neuro. Potwierdza to, że sekretyna, wraz z innymi determinantami kierującymi wymienionymi powyżej i w patencie USA nr 5 037 883 może działać jako grupa kierująca w przypadku kombinowanych kopolimerów według wynalazku. Mimo iż wynalazek opisany został i zilustrowany powyższymi przykładami, są to jedynie przykłady, tak że wynalazek ograniczony jest jedynie zakresem poniższych zastrzeżeń i ich funkcjonalnych odpowiedników. Środek według wynalazku przeznaczony jest do stosowania w leczeniu tkanek nowotworowych u zwierząt ciepłokrwistych, w tym również u ludzi. Uważa się, że składniki aktywne, bez względu na to, czy są to środki przeciwnowotworowe czy środki fotoaktywowane, a także bez względu na to, czy zostały wymienione jako konkretne związki czy jako klasy, obejmują również pochodne takich środków znane specjalistom. Tak np. wymienione środki fotoaktywowane, porfiryny, ftalocyjaniny, purpuryny, chloryny, nąftalocyjaniny, barwniki kationowe i tetracykliny, obejmują pochodne tych klas związków. W szczególności przykładowo podany środek fotoaktywowany, mezochloryna e6 jest pochodną chloryny. W związku z tym, że wynalazek nie dotyczy nowych leków terapeutycznych, ale raczej układu nośników zwiększających dostępność takich leków w specyficznych miejscach w komórkach, gdzie osiągnąć można maksymalny efekt, wykorzystać można wiele innych związków aktywnych, ich podstawień, modyfikacji i pochodnych, bez wychodzenia poza zakres wynalazku.

Zestawienie sekwencji (2) Informacja o SEQ ID nr 1:

(i) charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 4 (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (xi) opis sekwencji: SEQ ID nr 1: Gly Phe Leu Gly (2) Informacja o SEQ ID nr 2:

(i) charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 4 (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (xi) opis sekwencji: SEQ ID nr 2: Gly Phe Phe Leu (2) Informacja o SEQ ID nr 3:

(i) charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 4 (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (xi) opis sekwencji: SEQ ID nr 3: Gly Leu Leu Gly (2) Informacja o SEQ ID nr 4:

(i) charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 4 (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (xi) opis sekwencji: SEQ ID nr 4: Gly Phe Tyr Ala (2) Informacja o SEQ ID nr 5:

(i) charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 4 (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (xi) opis sekwencji: SEQ ID nr 5: Gly Phe Gly Phe (2) Informacja o SEQ ID nr 6:

(i) charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 4 (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (xi) opis sekwencji: SEQ ID nr 6: Ala Gly Val Phe (2) Informacja o SEQ ID nr 7:

(i) charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 4 (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (xi) opis sekwencji: SEQ ID nr 7: Gly Phe Phe Gly (2) Informacja o SEQ ID nr 8:

(i) charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 5 (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (xi) opis sekwencji: SEQ ID nr 8: Gly Phe Leu Gly Phe (2) Informacja o SEQ ID nr 9:

(i) charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 6 (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (xi) opis sekwencji: SEQ ID nr 9: Gly Gly Phe Leu Gly Phe (2) Informacja o SEQ ID nr 10:

(i) charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 27 (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (xi) opis sekwencji: SEQ ID nr 10:

His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ser Arg Leu Arg

10

Asp Ser Ala Arg Leu Glu Arg Leu Leu Gin Gly Leu Val 15 20 25

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 6,00 zł

Claims (29)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Środek do zwalczania tkanek rakowych u zwierząt ciepłokrwistych , znamienny tym, że zawiera zarówno lek przeciwnowotworowy, jak i lek fotoaktywowany, i ewentualnie grupę kierującą, przyłączone do nośników kopolimerycznych, wybranych z grupy obejmującej (a) nośnik kopolimeryczny, do którego przyłączy jest zarówno lek przeciwnowotworowy, jak i lek fotoaktywowany, (b) mieszaninę nośników kopolimerycznych, w której do jednego z nośników kopolimerycznych przyłączony jest lek przeciwnowotworowy, a do innego nośnika kopolimerycznego przyłączony jest lek fotoaktywowany oraz (c) mieszaninę nośników polimerycznych, w której do jednego z nośników kopolimerycznych przyłączony jest zarówno lek przeciwnowotworowy, jak i lek fotoaktywowany, a do innego nośnika kopolimerycznego przyłączony jest człon wybrany z grupy obejmującej lek przeciwnowotworowy i lek fotoaktywowany, z tym, że stosuje się nośniki kopolimeryczne opisane w punktach a, b i c wytworzone ze skopolimeryzowanych komonomerów obejmujących (i) około 5,0-99,7% molowych komonomerów nie zawierających grup funkcyjnych, (ii) od około 0,2 do 20 % molowych komonomerów zawierających grupy funkcyjne, do których przyłączony jest człon wybrany z grupy obejmującej środek przeciwnowotworowy i środek fotoaktywowany, oraz (iii) od około 0 do 94,8% molowych komonomerów zawierających grupy funkcyjne, do których przyłączono grupy kierujące, przy czym lek przeciwnowotworowy przyłączony jest do podstawionych komonomerów poprzez łańcuchy boczne odporne w krwioobiegu ciepłokrwistego zwierzęcia, ale podatne na hydrolizę przez wewnątrzkomórkowe enzymy lizosomalne, przy czym wspomniane komonomery są wybrane z grupy obejmującej N-(2-hydroksy'propylo)met.akrylamid (HPMA), N-metyloakryloamid, N,N-dialkiloakryloamidy, kwas akrylowy, kwas metakrylowy, poliaminokwasy, polisacharydy, kopolimery zawierające sekwencje polioksyetylenowe i kopolimery poliwinylopirolidon-bezwodnik maleinowy.
2. 2. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że nośnik polimeryczny zawiera od 0,1 do 94,8% molowych komonomerów zawieraj ących grupy funkcyjne, do których przyłączono grupy kierujące.
3. 3. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że lek przeciwnowotworowy przyłączony jest do nośnika polimerycznego poprzez ulegające degradacji enzymatycznej łańcuchy boczne wybrane z grupy obejmującej sekwencje oligopeptydowe, sekwencje oligosacharydowe i struktury zbliżone do występujących w kwasach nukleinowych.
4. 4. Środek według zastrz. 3, znamienny tym, że boczny łańcuch stanowi oligopeptyd.
5. 5. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że nośnik polimeryczny stanowi kopolimer wytworzony w wyniku kopolimeryzacji nie przekształconego i przekształconego w pochodne N(2-hydroksypropylo)metakrylamidu (HPMA).
6. 6. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że nośnik polimeryczny stanowi polisacharyd.
7. 7. Środek według zastrz. 6, znamienny tym, że polisacharyd stanowi dekstran.
8. 8. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że nośnik polimeryczny stanowi kopolimer zawierający nie przekształcone i przekształcone w pochodne mery kopolimerów poliwynylopirolidon-bezwodnik maleinowy.
9. 9. Środek według zastrz. 4, znamienny tym, że oligopeptydowy łańcuch boczny, stanowi peptyd wybrany z grupy obejmującej Gly-Gly, Gly-Phe-Gly, Gly-Phe-Phe, Gly-Leu-Gly, GlyVal-Ala, Gly-Pha-Ala, Gly-Leu-Phe, Gly-Leu-Ala, Ala-Val-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID nr 1), Gly-Phe-Phe-Leu (SEQ ID nr 2), Gly-Leu-Leu-Gly (SEQ ID nr 3), Gly-Phe-Tyr-Ala (SEQ ID nr 4), Gly-Phe-Gly-Phe (SEQ ID nr 5), Ala-Gly-Val-Phe (SEQ ID nr 6), Gly-Phe-Phe-Gly (SEQ ID nr 7), Gly-Phe-Leu-Gly-Phe (sEq ID nr 8), lub Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-Phe (SEQ ID nr 9).

   172 184
10. 10. Środek według zastrz. 9, znamienny tym, że boczny łańcuch peptydowy stanowi Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID nr 1).
11. 11. Środek według zastrz. 10, znamienny tym, że lek przeciwnowotworowy przyłączony do bocznego łańcucha peptydowego wybrany jest z grupy obejmującej adriamycynę, daunomycynę, melfalan i bleomycynę oraz ich pochodne.
12. 12. Środek według zastrz. 11, znamienny tym, że lek przeciwnowotworowy stanowi adriamycyna.
13. 13. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że lek fotoaktywowany przyłączony jest do nośnika polimerycznego poprzez mostek nie ulegający degradacji.
14. 14. Środek według zastrz. 13, znamienny tym, że mostek nie ulegający degradacji wybrany jest z grupy obejmującej glicynę i kwas ε-aminokapronowy.
15. 15. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że lek fotoaktywowany przyłączony jest do nośnika polimerycznego poprzez ulegające degradacji enzymatycznej łańcuchy boczne wybrane z grupy obejmującej sekwencje oligopeptydowe, sekwencje oligosacharydowe i struktury zbliżone do występujących w kwasach nukleinowych.
16. 16. Środek według zastrz. 15, znamienny tym, że boczny łańcuch stanowi oligopeptyd.
17. 17. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że oligopeptydowy łańcuch boczny stanowi peptyd wybrany z grupy obejmującej Gly-Gly, Gly-Phe-Gly, Gly-Phe-Phe, GlyLeu-Gly, Gly-Val-Ala, Gly-Phe-Ala, Gly-Leu-Phe, Gly-Leu-Ala, Ala-Val-Ala, Gly-Phe-LeuGly (SEQ iD nr 1), Gly-Phe-Phe-Leu, (SEQ ID nr 2), Gly-Leu-Leu,Gly (SeQ ID nr 3), Gly-Phe-Tyr-Ala (SEQ ID nr 4), Gly-Phe-Gly-Phe (SEQ ID nr 5), Ala-Gly-Val-Phe (SEQ ID nr 6), Gly-Phe-Phe-Gly (SEQ ID nr 7), Gly-Phe-Leu-Gly-Phe (SEQ ID nr 8) lub Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-Phe (sEq ID nr 9).
18. 18. Środek według zastrz. 17, znamienny tym, że boczny łańcuch peptydowy stanowi Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID nr 1).
19. 19. Środek według zastrz. 17, znamienny tym, że lek fotoaktywowany wybrany jest z grupy obejmującej porfiryny, ftalocyjaniny, purpuryny, chloryny, naftalocyjaniny, barwniki kationowe i tetracykliny oraz ich pochodne.
20. 20. Środek według zastrz. 19, znamienny tym, że lek fotoaktywowany stanowi pochodna chloryny.,
21. 21. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że pochodną chloryny stanowi mezochloryna e6.
22. 22. Środek według zastrz. 1 albo 16, znamienny tym, że zarówno lek przeciwnowotworowy jak i lek fotoaktywowany przyłączone są do łańcucha polimerycznego poprzez oligopeptydowy łańcuch boczny, w którym peptyd wybrany jest z grupy obejmującej Gly-Gly, Gly-Phe-Gly, Gly-Phe-Phe, Gly-Leu-Gly, Gly-Val-Ala, Gly-Phe-Ala, Gly-Leu-Phe, Gly-Leu-Ala, Ala-Val-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID nr 1), Gly-Phe-Phe-Leu, (SEQ ID nr 2), Gly-Leu-Leu,Gly (SEQ ID nr 3), Gly-Phe-Tyr-Ala (SEQ iD nr 4), Gly-Phe-Gly-Phe (SEQ iD nr 5), Ala-Gly-Val-Phe (SEQ ID nr 6), Gly-Phe-Phe-Gly (SEQ ID nr 7), Gly-Phe-Leu-Gly-Phe (SEQ ID nr 8) lub Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-Phe (SEQ ID nr 9).
23. 23. Środek według zastrz. 22, znamienny tym, że lek przeciwnowotworowy wybrany jest z grupy obejmującej adriamycynę, daunomycynę, melfalan i bleomycynę, oraz ich pochodne, a lek fotoaktywowany wybrany jest z grupy obejmującej porfiryny, ftalocyjaniny, purpuryny, chloryny, naftalocyjaniny, barwniki kationowe i tetracykliny oraz ich pochodne.
24. 24. Środek według zastrz. 23, znamienny tym, że sekwencję peptydową stanowi Gly-PheLeu-Gly.
25. 25. Środek według zastrz. 23, znamienny tym, że lek przeciwnowotworowy stanowi adriamycyna, a lek fotoaktywowany stanowi pochodna chloryny.
26. 26. Środek według zastrz. 25, znamienny tym, że pochodna chloryny stanowi mezochloryna e6. ,
27. 27. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że nośnik kopolimeryczny stanowi nośnik polimeryczny, w którym lek przeciwnowotworowy i lek fotoaktywowany przyłączone są do tej samej cząsteczki polimeru.
28. 28. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że nośnik polimeryczny stanowi mieszaninę nośników kopolimerycznych, w której do jednego nośnika kopolimerycznego przyłączony jest lek przeciwnowotworowy, a do innego kompolimerycznego nośnika przyłączony jesUek fotoaktywowany.
29. 29. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że nośnik polimeryczny stanowi mieszaninę nośników polimerycznych, w której do jednego z nośników kopolimerycznych przyłączony jest zarówno lek przeciwnowotworowy, jak i lek fotoaktywowany, a do innego nośnika kopolimerycznego przyłączony jest człon wybrany z grupy obejmującej lek przeciwnowotworowy i lek fotoaktywowany.