CN117731795A - 一种天然多酚构成的免疫检查点抑制剂纳米递送系统及其制备方法 - Google Patents
一种天然多酚构成的免疫检查点抑制剂纳米递送系统及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种天然多酚构成的免疫检查点抑制剂纳米递送系统及其制备方法。本发明将HA与EGCG通过化学键偶联后，以Fe3+作为连接点与山竹子素通过金属离子‑多酚的络合作用构建得到纳米颗粒，并将PD‑L1抗体包覆在纳米粒中，将其用于PD‑L1抗体的递送，能够使PD‑L1免疫检查点的免疫治疗具有靶向性，减少PD‑L1的注射剂量，并降低PD‑L1抗体所产生的毒副作用，同时能够提高免疫激活效果。同时，本发明制备纳米粒的条件温和、制备过程简便，探头超声混匀能在短时间内制得粒径均一的纳米颗粒，再有本发明所用的原料大都来自天然产物而非人工合成，能够降低所得纳米粒会产生不良反应的风险。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种天然多酚构成的免疫检查点抑制剂纳米递送系统及其制备方法。
背景技术
在目前恶性肿瘤发病人数持续上升，且临床传统的手术切除、化疗和放疗无法很好地降低死亡率的情况下，免疫疗法的诞生在多种癌症治疗中取得了良好的效果。相比于传统手术和化放疗以“治标不治本”式的思路通过外界干预杀伤肿瘤，免疫治疗通过释放人体自身的免疫系统攻击肿瘤。2018年，诺贝尔生理学或医学奖花落肿瘤免疫治疗领域，抗肿瘤研究进入了全新的“免疫时代”。据统计，在美国获批接受免疫疗法的癌症患者比例从2011年的1.54％增加到2021年的45.28％，免疫疗法有望成为下一阶段用于降低癌症死亡率最重要的手段之一。
PD-L1免疫检查点是肿瘤抑制免疫系统起效的主要靶点之一，目前通过PD-L1抗体进行肿瘤治疗具有相对最为成熟的研究体系和临床应用。然而，由于多种免疫逃逸机制的存在，对于单一免疫检查点靶点的阻断(如PD-1/PD-L1)能带来的治疗效果十分有限，接受免疫疗法的患者中预计只有12.46％能产生明显的疗效，且具有明显的个体差异。同时，由于免疫检查点(如PD-L1)在正常组织细胞中也有比较广泛的分布，其所带来的全身毒性问题也逐渐显露出来。此外，目前临床治疗中使用免疫检查点抗体全身注射所需的剂量较大，花费极高，这也使得众多的癌症患者“谈免疫色变”。通俗来说，站在患者的角度，动辄三到五十万的治疗费用却大概率难以收到效果，反而可能产生意想不到的不良反应，这对于患者及其家庭都是极大的金钱以及心理上的负担。
因此，亟需开发免疫疗法的辅助增效方法以放大其免疫激活效果。同时，在保证抗体类免疫检查点抑制剂活性的前提下，构建更加精准的靶向递送治疗平台，以降低免疫检查点抑制的全身毒性，这是基于免疫疗法的递送治疗能否成功应用于肿瘤临床治疗的核心科学问题，也是目前该研究方向的重点和难点。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种天然多酚构成的免疫检查点抑制剂纳米递送系统，使PD-L1免疫检查点的免疫治疗方案具有靶向性，减少PD-L1的注射剂量，并降低PD-L1抗体所产生的毒副作用，同时能够提高免疫激活效果。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明第一方面提供了一种天然多酚构成的免疫检查点抑制剂纳米递送系统的制备方法，该方法包括以下步骤：
S1、通过胱胺与透明质酸羧基间的酰基化反应制备巯基化的透明质酸HA-SH；
S2、用EGCG取代HA-SH得到HA-EGCG；
S3、将HA-EGCG与山竹子素、PD-L1抗体、Fe3+混合后，采用探头超声进行超声组装，制备得到HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1纳米粒，所得分散液经离心后除去上清液，经洗涤和干燥制得HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1纳米粒。
优选地，所述的天然多酚构成的免疫检查点抑制剂纳米递送系统的制备方法包括以下步骤：
S1、将透明质酸钠溶于缓冲溶液中，再加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐和胱胺二盐酸盐，室温下反应18-30h后再加入三(2-羧乙基)膦，继续反应1-3h，最后经透析和干燥制得HA-SH；
S2、将S1所得产物溶解于缓冲溶液中，在搅拌状态下再加入EGCG，调pH后于室温下无氧反应12-24h，反应后再调pH，最后经透析和干燥制得HA-EGCG；
S3、分别将HA-EGCG、PD-L1抗体、山竹子素和氯化铁制成溶液，然后先将HA-EGCG溶液和PD-L1抗体溶液混匀，再加入山竹子素溶液和氯化铁溶液，采用探头超声混匀后得到HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1纳米粒分散液，所得分散液经离心后除去上清液，再经洗涤和干燥制得HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1纳米粒。
透明质酸(Hyaluronic Acid,HA)是一种由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺组成的双糖单位糖胺聚糖，在人体肝脏、关节、眼睛、皮肤等器官中广泛分布，具有良好的非免疫原性、可降解性和生物相容性，在生物医学领域获得了非常广泛的应用。
表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)是一种从绿茶中分离得到的天然活性多酚物质，是绿茶多酚的最主要组成成分和最重要活性成分之一，在抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎及抗肿瘤方面均表现出一定作用。尤其是在抗肿瘤方面，EGCG已被证实能够广泛抑制包括皮肤、胃、肝、前列腺在内的多种器官癌症的发生和发展。
山竹子素(Garcinol)是一种从山竹果壳中提取分离的活性天然产物，其结构为聚异戊二烯化的二苯甲酮，含有一个邻苯二酚结构单元。山竹子素可以作用于多种经典的信号通路从而产生抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用。
本发明将HA与EGCG通过化学键偶联后，以Fe3+作为连接点与山竹子素通过金属离子-多酚的络合作用构建得到纳米颗粒，并将PD-L1抗体包覆在纳米粒中，制得一种以天然多酚山竹子素和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)及透明质酸(HA)为主要成分的纳米粒。将其用于PD-L1抗体的递送，能够使PD-L1免疫检查点的免疫治疗具有靶向性，减少PD-L1的注射剂量，并降低PD-L1抗体所产生的毒副作用，同时能够提高免疫激活效果，对免疫疗法起到辅助增效的作用。
此前的复合纳米粒制备技术通常较为复杂，主要体现在：(1)复合纳米粒通常由多种成分构成，大多数纳米粒为多层结构，因此在制备时需要一层层包覆，耗时较长，且每一层包覆完均需要进行洗涤纯化，也会对产量有所影响；(2)现有的纳米粒制备多是采取搅拌的方法，耗时较长，且由于搅拌提供的能量不足，纳米粒的尺寸不均一；(3)现有的许多纳米粒原料多需要经过复杂的合成过程，涉及到多种有机溶剂，使得纳米粒具有毒性风险，并进一步增加了纳米粒制备的时间成本。相比之下，本发明所制备的纳米粒在制备工艺上有着独特的优势。首先，无需层层包覆，仅需要一次性的混合原料即可进行纳米粒的制备；其次，不同于传统的搅拌制备法，探头超声所产生的能量较大且集中，能在短时间内制备得到粒径均一的纳米颗粒；最后，本发明的纳米粒原料大都来自天然产物而非人工合成，能够降低所得纳米粒会产生不良反应的风险。
更优选地，S1中，所述透明质酸钠、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐和胱胺二盐酸盐的质量比为18-22：19-23：15-20。
更优选地，S1中，加入三(2-羧乙基)膦前，先将其配置成0.4-0.6M三(2-羧乙基)膦水溶液，调pH至7.0后再逐滴滴加。
更优选地，S1中，所述透析为先在惰性气体条件下于NaCl溶液中透析1-3天，再在隔绝空气条件下于乙醇溶液中继续透析1-2天，并于水中继续透析2-4天。
更优选地，S2中，加入EGCG后，先将pH调至7-8，无氧反应后再将pH调至5.5-6.5。
更优选地，S3中，HA-EGCG溶液和铁盐溶液所用的溶剂均为水，山竹子素溶液所用的溶剂为有机溶剂，PD-L1抗体溶液所用的溶剂为缓冲溶液，HA-EGCG溶液、山竹子素溶液、铁盐溶液和PD-L1抗体溶液的浓度分别为3-5mg/mL、10-15mg/mL、1-3mg/mL、1-3mg/mL。
更优选地，S3中，探头超声混匀的时间为20-40min，功率：50％，On/Off循环：10s/5s。
更优选地，S1-S3中，所述缓冲溶液包括(但不限于)PBS溶液。
本发明第二方面提供了一种天然多酚构成的免疫检查点抑制剂纳米递送系统，由第一方面所述的制备方法制备得到。
本发明的免疫检查点抑制剂纳米递送系统由于采用HA作为基底能够与肿瘤过表达的CD44受体特异性结合而具有精准的肿瘤靶向作用，并能够促进肿瘤细胞摄取，因而能够极大地增加纳米粒及其有效成分在肿瘤部位的富集，降低全身的不良反应及给药的剂量，降低成本。同时，所递送的PD-L1抗体能够通过阻断肿瘤细胞的PD-L1而产生基础的免疫应答增强作用。此外，山竹子素通过对NF-κB信号通路的抑制作用而降低调节性T细胞和TAM的水平，并减少相关细胞因子的分泌，进一步逆转肿瘤部位的免疫抑制微环境，进而发挥辅助放大免疫激活效果的作用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明公开了一种天然多酚构成的免疫检查点抑制剂纳米递送系统，通过构建以天然多酚山竹子素和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)及透明质酸(HA)为主要成分的纳米粒用于PD-L1抗体的递送。本发明具有以下优点：
(1)与临床直接注射PD-L1抗体仅能阻断PD-1/PD-L1轴相比，本发明所制备的纳米复合物不仅仅含有PD-L1抗体，同时其载体主要成分山竹子素还可以通过抑制NF-κB通路提高免疫治疗的效果，因而可以改善直接注射PD-L1抗体有效率低的问题；
(2)临床直接注射PD-L1抗体不具有靶向性，会产生因阻断正常组织细胞中的PD-L1而产生不良反应。本发明通过以透明质酸为基底制备纳米载体来实现PD-L1抗体的递送，能够靶向性地与肿瘤部位的CD44受体特异结合，进而降低PD-L1抗体所产生的毒副作用。
(3)由于能特异性地将PD-L1抗体递送到肿瘤部位，因此在保证肿瘤局部达到相同浓度的情况下，可以大大减少PD-L1的注射剂量，不仅能够进一步降低产生不良反应的风险，还能大大减少治疗费用，而高昂的治疗费用也是目前免疫治疗仍难以推广的重要原因之一。
(4)本发明制备纳米粒的条件温和、制备过程简便，无需层层包覆，仅需要一次性的混合原料即可进行纳米粒的制备，有利于后期实现批量化生产；同时探头超声所产生的能量较大且集中，能在短时间内制备得到粒径均一的纳米颗粒；再有本发明所用的原料大都来自天然产物而非人工合成，能够降低所得纳米粒会产生不良反应的风险。
附图说明
图1为HA-EGCG的紫外-可见分光光谱分析结果；
图2为免疫检查点抑制剂纳米递送系统HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1的透射电子显微镜(TEM)图；
图3为动态光散射所测的免疫检查点抑制剂纳米递送系统HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1的粒径分布图；
图4为免疫检查点抑制剂纳米递送系统HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1的紫外-可见分光光谱分析结果；
图5为免疫检查点抑制剂纳米递送系统HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1纳米粒具有HA介导的细胞摄取作用；
图6为免疫检查点抑制剂纳米递送系统HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1纳米粒具有NF-κB通路阻断作用；
图7为不同浓度HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1纳米粒对B16F10细胞的24小时细胞毒性实验结果；
图8为不同浓度HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1纳米粒对B16F10细胞的48小时细胞毒性实验结果。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
实施例：一种天然多酚构成的免疫检查点抑制剂纳米递送系统的制备方法
(1)HA-SH的制备：将0.2g透明质酸钠(340kD)溶于20mL PBS(pH7.4)溶液中，再加入0.21g 4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐和0.17g胱胺二盐酸盐，于室温下反应24h。同时，配置0.5M三(2-羧乙基)膦水溶液3mL，用NaOH调pH至7.0后，逐滴滴加到上述反应体系中，继续反应2h。随后先在氩气条件下于0.1M NaCl溶液中透析2天，再在隔绝空气条件下于25％乙醇溶液中继续透析1～2天，并于超纯水中继续透析2～4天，最后冻干12～24小时，得到HA-SH。
(2)HA-EGCG的制备：向步骤(1)所得产物(约200mg)中加入30mL PBS超声溶解，之后在搅拌状态下逐滴加入13mL事先配置好的5.5mg/mL的EGCG PBS溶液，用1MNaOH调pH至7.4后，于室温下无氧反应12～24h。随后，再用1M HCl调pH至6.0，并在25％乙醇溶液中透析1天，最后冻干12～24小时，制得HA-EGCG。
将HA、HA-SH、EGCG、HA-EGCG取少量溶于超纯水中(约0.05-0.2mg/mL)，各取3mL测定200-450nm处的吸收进行紫外-可见分光光谱分析。通过图1的紫外-可见分光光谱分析可知，所得到的产物包含HA-SH和EGCG的特征峰，可以推断HA-EGCG的成功制备。
其中，HA-GECG的合成过程如下列反应式所示：
(3)纳米粒的制备：分别配置4mg/mL的HA-EGCG水溶液、12.5mg/mL的山竹子素DMSO溶液、2mg/mL的氯化铁水溶液和2mg/mL的PD-L1抗体PBS溶液。先将1mL HA-EGCG水溶液和2mL PD-L1抗体PBS溶液16℃水浴超声10～30min混匀，再迅速加入160μL山竹子素DMSO溶液和400μL氯化铁水溶液，再用探头超声20～40min(功率开到最大值的50％，On/Off循环：10s/5s)，得到HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1纳米粒分散液。
(4)纳米粒的后处理：将所得的HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1纳米粒分散液置于12000～14000rpm离心10～20min，除去上清液；再加入超纯水洗涤、超声分散，于12000～14000rpm离心10～20min，重复该步骤三次；最后冻干12～24小时，制得HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1纳米粒。
将制备好的纳米粒(HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1)分散于超纯水中，浓度在0.01-0.1mg/mL左右，取10μL滴在铜网上，自然风干后用2％磷钨酸钠进行30s负染，再进行TEM观察。从图2可以看出，制备所得的纳米颗粒尺寸均一，形态饱满。同时，将制备好的纳米粒(HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1)分散于超纯水中，浓度在0.1mg/mL左右，取3mL进行动态光散射粒径检测。从图3可以看出，制备所得的纳米颗粒尺寸分布非常集中，为100nm左右。另外，将HA-EGCG、山竹子素、纳米粒(HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1)取少量分散于超纯水中(约0.01-0.1mg/mL)，其中山竹子素先用少量DMSO溶解，再用水稀释。各取3mL测定200-700nm处的吸收进行紫外-可见分光光谱分析。通过图4的紫外-可见分光光谱分析可知，所得到的纳米粒包含HA-EGCG和山竹子素的特征峰，可以推断HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1纳米粒的成功制备。
实验例：免疫检查点抑制剂纳米递送系统的性能测试
(1)HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1纳米粒具有HA介导的细胞摄取作用
将B16F10肿瘤细胞(购自中国科学院细胞库)按照8×105左右的密度接种在共聚焦皿上，24h后加入用FITC标记的纳米粒(HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1)分散液，浓度为50μg/mL，分别在0、4、8、小时后用多聚甲醛固定细胞，并用DAPI染色10min，再用激光共聚焦进行观察，并同时采用流式细胞仪检测荧光强度。其中，FITC标记的纳米粒(HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1)的制备方法为：1)取碳酸钠0.53g，碳酸氢钠3.78g，氯化钠3.68g，超纯水定容至500mL；2)取抗体蛋白PD-L1 3mg溶于上述1.5mL溶液中；3)取FITC 0.15mg，溶于0.15mLDMSO中；4)将上述FITC溶液缓慢滴加至抗体蛋白溶液中，4℃搅拌避光反应12h；5)将上述反应液在4℃下避光透析至透析液清亮，冷冻干燥24h得到FITC标记的抗体蛋白PD-L1；6)再利用FITC标记的抗体蛋白PD-L1按照实施例的方法制备HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1。
通过图5的激光共聚焦和流式细胞仪分析结果可以看出，该纳米粒具有HA介导的随时间延长细胞累积增加的行为，具有肿瘤靶向性并且可以增加摄取效率。
(2)HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1纳米粒具有NF-κB通路阻断作用
将B16F10肿瘤细胞按照8×105左右的密度接种在共聚焦皿上，24h后加入纳米粒(HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1)分散液，浓度为50μg/mL。12h后用荧光标记的Pho-p65抗体(碧云天生物)孵育过夜，再用多聚甲醛固定细胞，并用DAPI染色10min，最后通过激光共聚焦进行观察。
通过图6的激光共聚焦图可以看出，在该纳米粒作用下，NF-κB通路关键蛋白Pho-p65的表达量明显下。
(3)HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1纳米粒对B16F10的细胞毒性
将B16F10肿瘤细胞按照5×103左右的密度接种在96孔板上，24h后加入100μL对应浓度的纳米粒(HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1)分散液。培养24/48h后用cck-8试剂盒进行细胞活力测定。
从图7、8可以看出，纳米粒在体外就能够产生一定的肿瘤细胞杀伤作用，可以推测结合体内的免疫激活效应后该纳米粒可以产生良好的肿瘤治疗效果。
综上可见，将HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1纳米粒用于PD-L1抗体的递送，能够使PD-L1免疫检查点的免疫治疗具有靶向性，减少PD-L1的注射剂量，并降低PD-L1抗体所产生的毒副作用，同时能够提高免疫激活效果，对免疫疗法起到辅助增效的作用。而且，本发明制备纳米粒的条件温和、制备过程简便，有利于后期实现批量化生产，具有广阔的应用前景。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种天然多酚构成的免疫检查点抑制剂纳米递送系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、通过胱胺与透明质酸羧基间的酰基化反应制备巯基化的透明质酸HA-SH；
S2、用EGCG取代HA-SH得到HA-EGCG；
S3、将HA-EGCG与山竹子素、PD-L1抗体、Fe3+混合后，采用探头超声进行超声组装，制备得到HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1纳米粒，所得分散液经离心后除去上清液，经洗涤和干燥制得HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1纳米粒。
2.根据权利要求1所述的一种天然多酚构成的免疫检查点抑制剂纳米递送系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将透明质酸钠溶于缓冲溶液中，再加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐和胱胺二盐酸盐，室温下反应18-30h后再加入三(2-羧乙基)膦，继续反应1-3h，最后经透析和干燥制得HA-SH；
S2、将S1所得产物溶解于缓冲溶液中，在搅拌状态下再加入EGCG，调pH后于室温下无氧反应12-24h，反应后再调pH，最后经透析和干燥制得HA-EGCG；
S3、分别将HA-EGCG、PD-L1抗体、山竹子素和氯化铁制成溶液，然后先将HA-EGCG溶液和PD-L1抗体溶液混匀，再加入山竹子素溶液和氯化铁溶液，采用探头超声混匀后得到HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1纳米粒分散液，所得分散液经离心后除去上清液，再经洗涤和干燥制得HA-EGCG-Gar-Fe@αPD-L1纳米粒。
3.根据权利要求2所述的一种天然多酚构成的免疫检查点抑制剂纳米递送系统的制备方法，其特征在于，S1中，所述透明质酸钠、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐和胱胺二盐酸盐的质量比为18-22：19-23：15-20。
4.根据权利要求2所述的一种天然多酚构成的免疫检查点抑制剂纳米递送系统的制备方法，其特征在于，S1中，加入三(2-羧乙基)膦前，先将其配置成0.4-0.6M三(2-羧乙基)膦水溶液，调pH至7.0后再逐滴滴加。
5.根据权利要求2所述的一种天然多酚构成的免疫检查点抑制剂纳米递送系统的制备方法，其特征在于，S1中，所述透析为先在惰性气体条件下于NaCl溶液中透析1-3天，再在隔绝空气条件下于乙醇溶液中继续透析1-2天，并于水中继续透析2-4天。
6.根据权利要求2所述的一种天然多酚构成的免疫检查点抑制剂纳米递送系统的制备方法，其特征在于，S2中，加入EGCG后，先将pH调至7-8，无氧反应后再将pH调至5.5-6.5。
7.根据权利要求2所述的一种天然多酚构成的免疫检查点抑制剂纳米递送系统的制备方法，其特征在于，S3中，HA-EGCG溶液和铁盐溶液所用的溶剂均为水，山竹子素溶液所用的溶剂为有机溶剂，PD-L1抗体溶液所用的溶剂为缓冲溶液，HA-EGCG溶液、山竹子素溶液、铁盐溶液和PD-L1抗体溶液的浓度分别为3-5mg/mL、10-15mg/mL、1-3mg/mL、1-3mg/mL。
8.根据权利要求2所述的一种天然多酚构成的免疫检查点抑制剂纳米递送系统的制备方法，其特征在于，S3中，探头超声混匀的时间为20-40min，功率：50％，On/Off循环：10s/5s。
9.根据权利要求2所述的一种天然多酚构成的免疫检查点抑制剂纳米递送系统的制备方法，其特征在于，S1-S3中，所述缓冲溶液包括(但不限于)PBS溶液。
10.一种天然多酚构成的免疫检查点抑制剂纳米递送系统，其特征在于，由权利要求1-9任一项所述的制备方法制备得到。
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