KR0139525B1

KR0139525B1 - 신규한 에스테라제 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR0139525B1
Application number: KR1019910004004A
Authority: KR
Inventors: 다께지 시바따니; 히로아끼 마쓰마에; 히로유끼 아까쓰까
Original assignee: 지바따 이찌로; 다나베세이야꾸가부시끼가이샤
Priority date: 1990-03-13
Filing date: 1991-03-13
Publication date: 1998-06-15
Also published as: IE910751A1; DE69120318T2; US5208156A; JPH04228070A; CA2037634A1; SG43356A1; EP0446771A3; EP0446771B1; DE69120318D1; AU643758B2; DK0446771T3; IL97454A0; ATE139563T1; IE75884B1; EP0446771A2; HK1000128A1; AU7269591A; JPH0779690B2; CA2037634C; KR910016917A

Abstract

세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)에서 유래한 신규의 에스테라제를 기재한다. 이 에스테라제는 하기위 물리-화학적 성질 및 효소 특성을 가진다 :

(1)활성 : 유기 카르복실레이트의 에스테르 결합을 가수 분해하고,

(2) 기질 특이성 : 유기 카르복실산의 알킬에스테르, 트리글리세라이드 또는 티올 에스테르에 작용하며, (3) 최적 pH : 기질로서 올리브유를 사용하여 가수분해할때 최적 pH는 7.5∼9.0이고, (4) pH 안정성 : 30℃에서 1시간 동안 보관될 때 pH 5.0∼9.0에서 안정하며, (5) 최적온도 : 기질로서 올리브유를 사용하여 가수분해할때 최적온도는 45∼50℃이고, (6) 열 안정성 : pH 8.0에서 30분간 보관될 때 50℃ 이하의 온도에서 안정하며, (7) 분자량 : 62,000 ± 2,000 (SDS - 폴리아크릴아미트 겔 전기영동) 이고, (8) 등전점 : 4.6 ±0.1 이며, (9) 금속이온 효과 : 1mM 칼슘 이온 존재하에 활성화되고, 1mM 코발트 이온, 니켈이온, 철이온 또는 에틸렌디아민테트라아세트산 존지하에 억제된다. 이 에스테라제는 유기 합성 반응에 널리 사용될 수 있다.

Description

[발명의 명칭]

신규한 에스테라제 및 그의 제조방법

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 신규한 에스테라제 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

최근, 유기 합성 반응(예. 가수분해 반응)에 에스테라제를 사용하려는 시도가 있었다. 예를들어, 돼지 간에서 유래한 에스테라제를 상기 목적에 종종 사용하였다. 그러나, 이 에스테라제는 비용이 고가이므로 산업상 불리하다. 한편, 아르트로박터 글로비포르미스 (Arthrobacter globiformis) IFO 12985[일본국 특허 공기 제 181788/1989호] (분자량 : 43,000), 바실루스 스테아로테르모필루스 (Bacillus Stearothermophilus) [Archiv. Biochem. Biophys. 160. 504 ∼ 513 (1974)] (분자량 : 47,000), 게오트리쿰 칸디듐 (Geotrichum candidum) [Agric. Biol. Chem. 37 (6), 1457 ∼ 1464 (1973)] (분자량 : 53,000 ∼ 55,000), 수도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) [J. Biochem. 86, 643 ∼ 656 (1979)] (분자량 : 55,000), 수도모나스 플루오리센스 (Pseudomnas fluorescens) [J. Biochem. 95, 1047 ∼ 1054 (1984)] (분자량 : 48,000)와 같은 미생물에서 유래한 에스테라제가 공지되어 있다. 그러나, 이들 에스테라제는 좁은 기질 특이성을 가져서 널리 사용될 수 없는 단점을 가진다.

본 발명의 목적은 미생물에서 유래하며 돼지 간 에스테라제 만큼 유기 합성 반응에 널리 사용될 수 있는 신규의 에스테라제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 이 에스테라제의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 에스테라제를 사용하여 저급 알킬 (2R, 3S) - 3 - (4 - 저급 알콕시페닐) 글리시데이트의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자는 광범위하게 연구한 결과, 세라티아속에 속하는 미생물에서 유래하는 강력한 에스테라제를 발견하였다.

본 발명의 에스테라제는 하기의 물리 - 화학적 성질 및 효소 특성을 갖는 신규의 에스테라제 이다 :

(1) 활성

이것 (상기 에스테라제) 은 유기 카르복실레이트의 에스테르 결합을 가수 분해 한다.

(2) 기질 특이성

이것은 유기 카르복실산의 알킬 에스테르, 트리글리세라이드 또는 티올에스테르에 작용한다. 예를들어, 본 발명의 에스테라제는 유기 카르복실산 (예. 저급 지방산, 고급 지방산, 저급 알콕시 - 치환 - 페닐글리시드산 등) 의 저급 또는 고급 알킬 에스테르를 가수분해할 수 있다. 또한, 이것은 글리세롤 및 수용성 저급 지방산 또는 수난용성 고급 지방산으로 이루어진 트리글리세라이드를 가수 분해하는 강력한 성능을 가진다. 또한, 이것은 디메르카프롤 트리부티레이트 등과 같은 티올 에스테르를 가수분해 할수 있다.

(3) 최적 pH

이것은 기질로서 올리브유가 사용될때 약 7.5∼ 9.0의 최적 pH를 나타낸다.

(4) pH 안정성

이것은 pH 5∼ 9, 30℃에서 60분간 보관될때 95% 이상의 활성을 보유한다.

(5) 최적온도

이것은 기질로서 올리브유를 사용하여 100mM 트리스 - HCl 완충액 (pH 8.0) 중에서 효소 반응이 수행될때 약 40∼50℃의 최적 온도를 나타낸다.

(6) 열 안정성

이것은 50℃ 이하 온도의 100mM 트리스 - HCl 완충액 (pH 8.0) 중에서 30분간 보관될때 100% 활성을 보유한다.

(a) 올리브유에 대한 활성

기질로서 올리브유를 사용하여 pH 8.0, 37℃에서 20분간 효소 반응을 수행한다. 1분당 1μ몰의 지방산을 생성하는 에스테라제의 활성을 1 단위로 정의한다 (실시예 1 참조)

(b) 트리글리세라이드 또는 지방산 에스테르에 대한 활성

기질로서 트리글리세라이드 또는 지방산 에스테르를 사용하여 pH 8.0, 37℃에서 10분간 효소 반응을 수행한다. 1분당 1μ몰의 지방산을 생성하는 에스테라제의 활성을 1 단위로 정의한다 (실시예 3 참조)

(c) 티올 에스테르에 대한 활성

기질로서 디메르카프롤 트리부티레이트를 사용하여 pH 8.5, 30℃에서 10분간 효소 반응을 수행한다. 반응후, 반응 혼합물에 4, 5 - 디티오비스(2 - 니트로벤조산) (착색제) 를 가한다. 유리된 5 - 메르캅 토- 2 - 니트로벤조산의 양을 분광 광도계에 의해 측정한다. 1분당 5 - 메르캅 토- 2 -니트로벤조산 1μ몰을 생성하는 에스테라제의 활성을 1 단위로 정의한다 (실시예 4 참조)

(8) 분자량

62,000 ± 2,000 (SDS - 폴리아크릴아미드겔 전기영동)

(9) 등전점

4.6 ± 0.1

(10) 금속 이온 효과

1mM 칼슘이온 존재하에 활성화 된다. 한편, 활성은 1mM 아연이온, 구리이온, 망간이온 존재하에 40 ∼ 90% 억제되며, 1mM 코발트이온, 니켈이온, 철(II) 이온, 철(III) 이온 또는 에틸렌디아민테트라아세트산 존재하에 완전히 억제된다.

본 발명의 상술된 에스테라제는 62,000 ± 2,000 (SDS - 폴리아크릴아미트겔 전기영동에 의해 측정됨)의 분자량 및 4.6 ± 0.1의 등전점을 갖는다는 점에서 공지된 에스테라제와 분명히 다르다.

본 발명에 있어서, 상술된 에스테라제는 배지에 세라티아속에 속하는 미생물을 배양하고, 미생물의 내부 또는 외부에 상기 에스테라제를 축적하고 그로 부터 축적된 에스테라제를 회수함으로써 제조될 수 있다.

상술된 에스테라제를 생성할 수 있는 세라티아속에 속하는 임의의 미생물을 본 발명의 에스테라제 - 생성 미생물로서 사용할 수 있다. 이러한 미생물의 예에는 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens) Sr 41 (FERM-BP No 487), 그의 변이체등이 포함된다. 그런, 본 발명에 사용된 미생물은 상술된 것에 의해 제한되지 않는다. 예를 들면, 생물공학법에 따른 상술된 미생물로 부터 제조된 재조합체를 사용할 수도 있다.

본 발명의 에스테라제 - 생성 미생물이 성장 및 증식할 수 있는 임의의 배지를 배지로 사용할 수 있다. 탄소원의 예에는 예를 들어 글루코스, 수크로스, 몰라세 등과 같은 당류, 푸마르산, 시트르산 등과 같은 유기산, 글리세롤 등과 같은 알코올, 알라닌, 글루타민, 아스파라긴 등과 같은 아미노산이 포함된다. 황산암모늄, 염화암모늄등과 같은 무기 암모늄염, 우레아, 펩톤, 옥수수 침출액, 효모추출물, 카제인 가수분해물등을 질소원으로서 사용할 수 있다. 1 ∼ 15 w/w % 의 탄소원 및 0.1 ∼ 2.0 w/w % 의 질소원을 사용하는 것이 바람직하다. 필요하면, 배지에 포스페이트, 마그네슘염, 칼륨염, 칼슘염 등과 같은 무기염, 또는 철이온, 망간이온, 구리이온, 아연이온 등과 같은 금속이온을 첨가할 수 있다. 합성 배지를 사용할 경우, 필요하면, 배지에 비오틴, 티아민 등과 같은 비타민, 또는 카르니틴과 같은 성장 - 촉진 물질을 첨가할 수 있다. 또한, 필요하면, 식물성 기름 또는 게면 활성제와 같은 유도질을 배지에 첨가할 수 있다. 배지의 pH를 약 5 ∼ 8로 조절하는 것이 바람직하다.

배지에 미생물을 접종한 후 통상적인 방법으로 배양시킨다. 예를들어, 진탕배양, 폭기 스피너 배양, 정상 배양 또는 연속 배양과 같은 임의의 방법을 상기 목적에 사용할 수 있다.

배양조건은 배지의 종류, 배양 방법등에 따라 변할 수 있다. 본 발명의 미생물이 성장, 증식하여 에스테라제를 생성할 수 있으면 어떠한 조건도 상기 목적에 적절하다. 그러나, 통상적으로 약 5 ∼ 8의 pH에서 배양을 시작하고, 실온 또는 예를들어 20 ∼ 40℃의 온도에서 보온하에 1 ∼ 2 일간 배양하는 것이 바람직하다.

배양된 미생물의 내부 또는 외부에 축적된 에스테라제를 통상적인 방법으로 회수하고 정제할 수 있다. 예를들어, 배양 브로쓰에 축적된 에스테라제를 무기염 (예. 황산암모늄, 알칼리금속 술페이트 또는 알칼리 금속 할라이드)을 사용한 염석, 친수성 유기 용매 (예. 알코올 또는 아세톤) 를 사용한 분별 침전, 이온교환수지 또는 소수성 수지에 의한 컬럼 크로마토그래피, 겔여과 및 핵산, 탄닌 등을 사용한 단백질 침전과 같은 공지된 방법을 조합하여 회수할 수 있다. 이렇게 수득된 에스테라제를 등전 침전, 투석, 전기투석, 전기영동과 같은 공지된 정제방법을 조합하여 정제할 수 있다. 예를들어, 하기에 기재된 바와같이 정제시킨다 :

(1) 원심분리에 의해 배양 브로쓰로 부터 미생물 세포를 제거하고,

(2) 상층액을 45% 포화 황산 암모늄 용액으로 처리하고,

(3) 수득한 침전물을 투석한후, 음이온 교환 수지 (DEAE - TOYOPEARL 650M, Mono Q) 크로마토그래피시키고,

(4) 활성 분획을 투석한 후, 소수성 수지 (부틸 - TOYOPEARL 650S) 크로마토그래피하고, 및

(5) 수득된 활성 분획을 투석 및 농축한 후, 겔 여과 (Superose 6) 시킨다. 이렇게 수득된 정제 에스테라제는 SDS - 폴리아크릴아미트 겔 전기영동에 의해 분자량 62,000 ± 2,000을 갖는 단일 밴드를 나타내는 폴리펩티드이다.

상술된 바와같이, 본 발명의 에스테라제는 유기 카르복실산의 알킬 에스테르, 트리글리세라이드 또는 티올 에스테르와 같은 광범위한 기질을 가수분해할 수 있는 강한 성능을 갖는다. 따라서, 이것을 돼지간 에스테라제 만큼 널리 유기합성 반응에 사용할 수 있다. 예를들어, 이것을 라세미 혼합물로 부터의 임의의 활성 이성질체의 제조 또는 프로키랄 화합물로 부터의 키랄 화합물의 제조에 사용할 수 있다. 특히, 본 발명의 에스테라제는 (저급) 알킬 (저급) 알콕시페닐글리시데이트를 가수분해하는 강한 성능을 가짐을 특징으로 한다. 예를들어, 이것이 라세미 저급 알킬 트랜스 - 3 - ( 4 - 저급 알콕시페닐) 글리시데이트의 가수분해에 사용되는 경우, 저급 알킬 (2R, 3S) - 3 - ( 4 - 저급 알콕시페닐) 글리시데이트가 우수한 수율로 제조될 수 있다. 이렇게 수득된 저급 알킬 (2R, 3S)- 3 - ( 4 - 저급 알콕시페닐) 글리시데이트는 딜티아젬 히드로클로라이드와 같은 약제의 합성 중간체로서 유용하다.

하기 실시예에서 % 는 다른 표시가 없는 한 w/v %를 의미한다.

[실시예 1]

덱스트린 (1%), 황산 암모늄 (0.2%), 육즙 - S (2%), 인산증수소 칼륨 (0.1%), 황산 마그네슘 (0.05%), 염화칼슘 (0.01%), 황산제일철 (0.001%), Tween 80 (0.5 v/v %) 및 폴리알킬렌 글리콜 유도체형 계면활성제 (산요 케미칼 인더스트리사제 상표명 : KARARIN 102, 0.1 v/v %)를 함유하는 배지 (pH 7.0, 20ℓ)를 30ℓ 단지 - 발효기에 넣고 오토글레이브 멸균한다. 상기와 동일한 배지중에서 30℃에서 20시간 동안 왕복 진탕시킴으로써 수득된 세라티아 마르세센스 Sr 41 의 브로쓰를 멸균 배지에 접종한다. 30℃에서 18시간 동안 폭기 및 교반함으로써 배양을 수행한다. 배양 브로쓰를 원심 분리하고, 상층액 (4.5ℓ)을 45% 포화 황산 암모늄 용액으로 투석한다. 침전물을 셀라이트로 여과 수거하고 물로 용리시킨다. 용출물을 투석하고 동결 건조시킨다. 4.1g의 에스테라제 (18,600 단위 / g)를 조 효소 분말로서 소득한다.

(효소 활성 분석)

하기 방법에 따라 효소 활성을 조사한다.

225ml의 2% 폴리비닐 알코올 (Poval 117, 구라레 가부시끼가이샤 제)과 75ml의 올리브유의 혼합물을 5 ∼ 10℃에서 10분간 교반함으로써 유화시킨다. 이렇게 수득된 올리브유 - 유제 5.0ml 및 0.25M 트리스 - HCl 완충액 (pH 8.0, 2.5mM 염화칼슘을 함유) 4.0ml 을 37℃에서 10분간 예비 보온한다. 거기에 효소용액 1ml을 가하여 효소 반응을 개시한다. 혼합물을 37℃에서 20분간 보온한후, 반응 혼합물에 아세톤 - 에탄올 (1:1)의 혼합물 20ml을 가하여 효소 반응을 중지시킨다. 혼합물을 지시약으로서 페놀프탈레인을 사용하여 0.05N 수산화나트륨으로 적정한다. 효소 용액을 가하기 전에 기질 용액에 아세톤 - 에탄올 (1:1)을 가함을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 블랭크 용액을 제조한다. 상기 블랭크 용액을 상기와 동일하게 적정한다. 1분당 1μ몰의 지방산을 유리시키는 효소양을 1단위 (U)로 정의한다.

[실시예 2]

실시예 1에서와 동일한 방법으로 제조된 상층액 10ℓ를 45% 포화 황산 암모늄 용액으로 염석한다. 침전물 (에스테라제) 을 20mM 트리스 -HCl 완충액 (pH 7.5)에 용해시킨다. 용액을 투석하고 동일 완충액으로 예비 평형된 음이온 교환 수지 (DEAE - TOYOPEARL 650M, 도요소다 가부시끼가시야 제)의 컬럼 처리한다. 컬럼을 20mM 트리스 -HCl 완충액 (pH 7.5)으로 세척한다. 20mM 트리스 -HCl 완충액 (pH 7.5)을 함유하는 0 ∼ 1.0M 염화나트륨 용액의 선형 구배에 의해 효소를 용출한다. 20mM 트리스 -HCl 완충액 (pH 7.5)을 함유하는 약 0.27N 염화나트륨 용액을 사용하여 에스테라제를 용출한다. 활성분획을 수거하고 20mM 트리스 -HCl 완충액 (pH 7.5)에 대해 투석하고, 동일 완충액으로 예비 평형된 강한 음이온 교환수지 (MonoQ,, 파르마시아 LKB 바이오테크놀로지사 제)의 컬럼 처리한다. 컬럼을 20mM 트리스 -HCl 완충액 (pH 7.5)으로 세척한다. 20mM 트리스 -HCl 완충액 (pH 7.5)을 함유하는 0 ∼ 0.6M 염화나트륨 용액의 선형 구배에 의해 효소를 용출한다. 20mM 트리스 -HCl 완충액 (pH 7.5)을 함유하는 약 0.35M 염화나트륨 용액을 사용하여 에스테라제를 용출한다. 활성 분획을 수거하고, 20mM 트리스 -HCl 완충액 (pH 7.5)을 함유하는 5% 포화 황산암모늄 용액에 대해 투석하고, 동일 완충액으로 예비 평형된 소수성 수지 (부틸 - TOYOPEAL 652S, 도요소다 가부시끼가이샤 제)의 컬럼 처리한다. 컬럼을 동일한 완충액 (pH 7.5)으로 세척한다. 20mM 트리스 -HCl 완충액 (pH 7.5)을 함유하는 5 ∼ 0% 포화 황산암모늄 용액의 선형 구배에 의해 효소를 용출한다. 활성 분획을 수거하고, 20mM 트리스 -HCl 완충액 (pH 7.5)을 함유하는 0.15M 염화나트륨 용액에 대해 투석하고 농축시킨다. 잔류물을 동일 완충액으로 예비 평형된 분자 시이브 수지 (Superose 6, 파르마시아 LKB 바이오테크놀로지사제)의 겔 여과시킨다. 56.8㎎의 정제된 에스테라제 단백질을 수득한다.

정제된 에스테라제는 겔여과에 의한 약 590,000 및 SDS - 폴리아크릴아미드 겔에 의한 약 62,000의 분자량을 나타낸다.

상기 정제 단계에서 각각 수득된 에스테라제의 고유활성 및 수율을 하기 표 1 에 나타낸다 (효소 활성은 실시예 1 에서와 동일한 방법으로 계산되며 단백질의 양은 로우리법에 의해 측정된다).

기질로서 카제인이 사용되는 경우 상기 수득된 에스테라제는 프로테아제 활성을 나타내지 않는다.

[실시예 3]

실시예 2 에서 수득된 에스테라제에 대해서 각종 종류의 트리글리세라이드 및 지방산 에스테르에 대한 기질 특이성을 조사한다.

(트리글리세라이드 및 지방산 에스테르에 대한 가수분해 활성의 분석)

각 기질 0.2g, 0.2M 트리그 - HCl 완충액 (pH 8.0) 4ml 및 6mM 염화칼슘 용액 1ml을 100ml 플라스크에 넣는다. 10분 - 예비 보온후에, 거기에 1ml의 효소 용액을 가하여 효소 반응을 개시한다. 혼합물을 80rpm하에 37℃에서 10분간 보온한다. 반응 혼합물에 아세톤 - 에탄올 (1:1) 의 혼합물 20ml을 가하여 효소 반응을 중지시킨다. 지시약으로서 페놀프탈레인을 사용하여 혼합물을 0.05N 수산화나트륨 용액으로 적정한다. 효소 용액 첨가전에 기질 용액에 아세톤 - 에탄올 (1:1)을 가함을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 블랭크 용액을 제조한다. 이 블랭크 용액을 상기와 동일한 방법으로 적정한다. 1분당 1μ 몰의 지방산을 유리시키는 효소의 양을 1 단위로 정의한다.

(결과)

그 결과를 표 2 및 3에 나타낸다. 효소 활성을 상대 활성(%)으로 나타낸다 [메닐 n - 카프릴레이트 (표 2), 트리카프릴린 (표 3) = 100].

1) : 204 단위 / ㎎ 단백질

2) : 1169 단위 / ㎎ 단백질

[실시예 4]

실시예 2 에서 수득된 정제 에스테라제에 대해 디메르카프롤 트리부티레이트에 대한 기질 특이성을 조사한다.

에스테라제를 리파아제 키트 S [기질 : 디메르카프롤 트리부티레이트, 다이닛뽕제약 주식회사제]의 기질 용액에 가한다. 가수분해를 수행한 후, 반응 혼합물에 5, 5 - 디티오비스 (2 - 니트로벤조산) (착색제) 을 가한다. 412nm에서 유리된 5 - 메르캅토 - 2 - 니트로벤조산의 양을 측정함으로써 효소 활성을 측정한다.

에스테라제는 1.7 × 10단위 / ㎎ 단백질의 효소 활성을 나타낸다.

[실시예 5]

실시예 2 에서 수득된 정제 에스테라제 1.5㎎을 1mM 염화칼슘 수용액 75ml에 가한다. 거기에 1M 라세미 메틸 트랜스 - 3 - (4 - 메톡시페닐) 글리시데이트를 함유하는 톨루엔 용액 75ml을 가한다. 혼합물을 pH8.0으로 조절하고 30℃에서 4시간 동안 교반한다. 반응후, 톨루엔층 중의 메틸 트랜스- 3 - (4 - 메톡시페닐) 글리시데이트의 (+)- 이성질체 [(2S, 3R) - 이성질체] 와 (-)-이성질체 [(2S, 3R) - 이성질체]의 비율을 고성능 액체 크로마토그래피 (컬럼 : Chiralcel OJ, 다이셀 케미칼 인더스트리사제, 이동상 : n - 헥산 : 이소프로필 알코올 = 9 : 1)에 의해 측정한다.

결과를 하기 표 4 에 나타낸다.

[실시예 6]

실시예 2 에서 수득된 정제 에스테라제에 대히 최적 pH 및 pH 안정성을 조사한다.

여러가지 pH에서 효소 반응을 수행함을 제외하고는 실시예 1 에서와 동일하게 효소 활성을 측정함으로써 최적 pH를 결정한다. 활성을 각각 상대 활성 (%) (pH 8 에서의 활성 = 100)으로 나타낸다.

한편, 효소 용액을 특정 pH로 조절하고, 30℃에서 1시간 동안 보온한 후, 실시예 1 에서와 동일한 방법으로 효소 활성을 계산함으로써 pH 안정성을 조사한다. 효소 활성을 잔류 활성의 상대활성 (%) (보온직전에 측정된 활성 = 100)으로서 나타내고 McIlvaine 완충액 (pH 3.0 ∼ 7.0), 100mM 트리스 - HCl 완충액 (pH 8.0 ∼ 9.0) 및 100mM 글리신 완충액 (pH 9.0 ∼ 11.0) 을 사용함으로써 pH를 조절한다.

(결과)

결과를 하기 표 5 및 6에 나타낸다. 이들 표로 부터 에스테라제의 최적 pH는 약 7.5 ∼ 9.0이고 에스테라제는 약 5 ∼ 9의 pH에서 안정함이 명백하다.

[실시예 7]

실시예 2 에서 수득된 정제 에스테라제에 대해 최적 온도 및 열안정성을 조사한다.

각종 온도에서 효소 반응을 수행함을 제외하고는 실시예 1 에서와 동일한 방법으로 효소 활성을 측정함으로써 최적 온도를 결정한다. 효소 활성을 상대 활성 %) (45℃ 에서의 활성 = 100) 으로서 나타낸다.

한편, 100mM 트리스 - HCl 완충액중의 효소를 특정 pH에서 30분간 보온시키고 실시예 1 에서와 동일한 방법으로 효소 활성을 계산함으로써 열 안정성을 조사한다. 효소 활성을 잔류 활성의 상대화성 (%) (보온직전에 측정된 활성 = 100) 으로서 나타낸다.

(결과)

결과를 표 7 및 표 8 에 나타낸다. 표로 부터 최적온도가 약 40 ∼ 50℃이고, 에스테라제가 50℃ 이하 온도에서 안정함이 명백하다.

[실시예 8]

실시예 2 에서 수득된 정제 에스테라제의 등전점을 하기 조건하의 전기 영동에 의해 조사한다 :

담체 : 암포린 (pH 3 - 10)

0 ∼ 50% 수크로스의 밀도 구배

전압 : 40V 에서 26시간 동안 및 이어서 800V 에서 14시간 동안

온 도 : 2℃

110ml 컬럼을 사용한다.

그 결과, 상기 에스테라제의 등전점은 4.6 ± 0.1 인 것으로 밝혀졌다.

[실시예 9]

실시예 2 에서 수득된 정제 에스테라제 (단백질 : 95㎍) 을 증류수에 대해 투석하고, 투석된 용액을 증발 건조시킨다. 잔류물을 아미노산 서열기 처리한다. 그 결과, N - 말단에서 12번째 까지의 아미노산 서열은 다음과 같다 :

N - 말단 - (X) - Ile- Phe - Ser - Tyr- Lys - Asp - Leu - Asp - Glu- Asn - Ala

(이때, X는 아직 확인되지 않은 아미노산이다.)

실시예 10

실시예 2 수득된 정제 에스테라제에 대한 금속이온 또는 공지된 효소 - 억제제의 효과를 다음과 같이 조사한다 :

효소 용액에 각 금속이온 1mM 또는 각 억제제 1mM을 가하고 실시예 1 에서와 동일한 방법으로 효소 활성을 측정한다.

활성을 상대 활성 (%) (금속이온 또는 억제제를 첨가하지 않고 계산된 활성 = 100) 으로서 나타낸다.

(결과)

결과를 하기 표 9 및 10에 나타낸다.

[실시예 11]

실시예 1 에서와 동일한 방법으로 배양 브로쓰로 부터 수득된 상층액 12ℓ를 한외여과막 (SIP-3013, 아사히 케미칼 인더스트리사 제)을 사용하여 농축시킨다. 농축물을 10mM 트리스 - HCl 완충액 (pH 7.5)을 함유하는 35% 포화 황산 암모늄 용액으로 염석한다. 침전물 (에스테라제)을 10mM 트리스 - HCl 완충액 (pH 7.5)에 용해시킨다. 용액을 투석하고 동일 완충액으로 예비 평형된 음이온 교환 수지 (DEAE-TOYOPEAL 650M, 도요소다사제) 컬럼 처리한다. 컬럼을 10mM 트리스 - HCl 완충액 (pH 7.5)으로 세척한다. 10mM 트리스 - HCl 완충액 (pH 7.5)을 함유하는 0 ∼ 0.8M 염화나트륨 용액의 선형 구배에 의해 효소를 용출한다. 에스테라제를 10mM 트리스 - HCl 완충액 (pH 7.5)을 함유하는 약 0.3M 염화나트륨 용액으로 용출한다. 활성 분획을 수거하고 10mM 트리스 - HCl 완충액 (pH 7.5)을 함유하는 0.15M 염화나트륨 용액에 대해 투석한다. 용액 (101ml)을 한외여과 (디아플로 울트라필터 PM-10, 아미콘사제)에 의해 8ml로 농축시킨다. 농축물을 동일 완충액으로 예비 평형된 분자 시이브 수지 (세파크릴 S-300HR, 파르마시아 LKB 바이오테크놀로지사 제)의 겔 여과한다. 활성 분획을 수거하고 10mM 트리스 - HCl 완충액 (pH 7.5)을 함유하는 2% 포화 황산 암모늄 용액에 대해 투석하고 동일 완충액으로 예비 평형된 소수성 수지 (페닐 - TOYOPEAL 650M, 도요소다사제)의 컬럼 처리한다. 컬럼을 동일 완충액으로 세척한다. 10mM 트리스 - HCl 완충액 (pH 7.5)을 함유하는 2% ∼ 0% 포화 황산 암모늄 용액의 단계적 구배에 의해 수지로 부터 효소를 용출한다. 133㎎의 정제 에스테라제 단백질을 수득한다.

이 정제 에스테라제의 물리 - 화학적 성질 및 효소 특성은 실시예 2 에서 수득된 것과 동일하다.

각 상기 - 정제 단게에서 수득된 에스테라제의 고유활성 및 수율을 하기 표 11 에 나타낸다. (효소 활성을 실시예 1 에서와 동일한 방법으로 계산하고 단백질 양을 로우리법에 의해 측정한다.) 기질로서 카제인을 사용하는 경우 상기 수득된 에스테라제는 프로테아제 활성을 나타내지 않는다.

상기 정제 단게를 모두 5℃포화 황산 암모늄 용액 이하에서 수행한다.

[실시예 12]

실시예 11 에서 수득된 정제 에스테라제의 아미노산 조성을 하기 조건하에 아미노산 분석기를 사용함으로써 조사한다.

6M 염산염 (2.0㎎/ML)중의 효소 용액을 각각 유리 튜브에 진공하에 밀봉한 후 100℃ 에서 20, 40 또는 70 시간 동안 가수분해 한다.

가수분해 물을 감압하에 증발 건조시키고, 0.02N 염산염 용액에 용해시키고, 아미노산 분석기 (히다찌 모델 l-8500)로 분석한다. 무어법에 따른 시료의 과산화포름산 산화후에 시스테인 및 시스틴을 시스테인 산으로서 결정한다. 심프슨 등의 방법에 따라 트립토판을 결정한다.

참고문헌 : 1) Moore, S. (1963) J. Biol. Chem. 238, 235 ∼ 237.

2) Simpson, R. J., Neuberger, M. R., 및 Lin, T. -Y. (1976)

J. Biol. Chem. 251 1936 ∼ 1940.

a) : 62,000 분자량을 기초로 함.

b) : 산과 아미드 형태의 합.

c) : 세린 및 트레오닌 값은 제 1 붕괴로 추측되는 제로 시간까지의 외삽법에 의해 수득된다.

[실시예 13]

실시예 11 에서 수득된 정제 에스테라제를 물에 대해 투석하고, 그의 칼슘 함량을 원자 흡수 분광 분석기 (히다찌 모델 Z - 9000)를 사용함으로써 측정한다.

그 결과, 정제 에스테라제내 칼슘 함량은 62,000 분자량당 1몰 이다.

[실시예 14]

디메르카프롤 트리부티레이트에 대한 실시예 11 에서 수득한 정체 에스테라제의 기질 특이성을 실시예 4 에서와 동일한 방법으로 조사한다.

에스테라제는 5.2 x 10단위 / ㎎ 단백질의 효소 활성을 나타낸다.

Claims

하기의 물리 - 화학적 성질 및 효소 특성을 갖는, 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens) Sr41 (FERM BP-487)로부터 유래한 에스테라제:

(1) 활성 : 유기 카르복실레이트의 에스테르 결합을 가수 분해하고,

(2)기질 특이성 : 유기 카르복실산의 알킬에스테르, 트리글리세라이드 또는 티올 에스테르에 작용하며,

(3) 최적 pH : 기질로서 올리브유를 사용하여 가수분해할때 최적 pH는 7.5 - 9.0 이고,

(4) pH 안정성 : 30℃에서 1시간 동안 보관될 때 pH 5.0 - 9.0 에서 안정하며,

(5) 최적온도 : 기질로서 올리브유를 사용하여 가수분해할때 최적온도는 40 - 50℃이고,

(6) 열 안정성 : pH 8.0에서 30분간 보관될 때 50℃ 이하의 온도에서 안정하며,

(7) 분자량 ; 62,000 ± 2,000 (SDS - 폴리아크릴아미트 겔 전기영동) 이고,

(8) 등전점 : 4.6 ± 3.1 이며,

(9) 금속이온 효과 : 1mM 칼슘 이온 존재하에 활성화되고, 1mM 코발트 이온, 니켈이온, 철이온, 또는 에틸렌디아민테트라아세트산 존재하에 억제된다.
(a) 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens) Sr41 (FERM BP-487)을 배양하고,

(b) 배양 브로쓰로 부터 상기 에스테라제를 회수함을 특징으로 하는, 신규한 에스테라제의 제조방법.
(a) 라세미 저급 알킬 트랜스 - 3 - (4 - 저급 알콕시페닐) 글리시데이트를 제 1 항에 기재된 에스테라제로 처리함으로써 그의 2S, 3R - 이성질체를 입체 선택적 가수분해 하는 단계, 및

(b) 반응 혼합물로 부터 미반응 2S, 3R - 이성질체를 회수하는 단계를 특징으로 하는, 저급 알킬 (2S, 3R) -3 - (4 - 저급알콕시페닐) 글리시데이트의 제조방법.