JPWO2021132180A1

JPWO2021132180A1 - 口腔用抗菌組成物

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Publication number: JPWO2021132180A1
Application number: JP2021526608A
Authority: JP
Inventors: みちよ本田; 政志藤木; 航平豊福; 啓司庵原; 大輔小泉; 基樹住田; 理絵外川
Original assignee: MEIJI UNIVERSITY LEGAL PERSON; Maruha Nichiro Corp
Current assignee: MEIJI UNIVERSITY LEGAL PERSON; Maruha Nichiro Corp
Priority date: 2019-12-25
Filing date: 2020-12-21
Publication date: 2021-12-23
Anticipated expiration: 2040-12-21
Also published as: WO2021132180A1; JP7007626B2

Abstract

短時間で抗菌性を示す口腔用組成物を提供するため、Ａ成分：プロタミン、プロタミン分解物およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種と、Ｂ成分：フェノール系抗菌剤と、を含有する、口腔用抗菌組成物を用いる。特に、Ｂ成分が３−メチル−４−イソプロピルフェノールであり、対象とする菌が、Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉである。Ａ成分とＢ成分との質量比が、３０〜１００，０００：１０００の範囲である。特に、５秒〜１０分の接触時間で抗菌作用を有する。

Description

本発明は、口腔用抗菌組成物に関する。

ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ、以下、「Ｓ．ｍｕｔａｎｓ」と略する場合がある。）は、グラム陽性で通性嫌気性のレンサ球菌の一種である。ヒトの口腔内にも存在し、う蝕（虫歯）の原因菌のひとつである。そして、Ｓ．ｍｕｔａｎｓは最初からヒトの口腔内に存在しているのではなく、口移しや食器の共有などによって、感染者の唾液が口に入ることによって感染することが知られている。

また、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｄｏｎｉｉ、以下、「Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ」と略す場合がある。）は、同じくグラム陽性菌であり、ヒトの口腔内に存在し、歯面における初期定着細菌としてプラークバイオフィルムの形成の促進に関与していることが知られている。そして、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉは、う蝕（虫歯）や歯周病等の口腔感染症の誘発に関わるとともに、細菌性心内膜炎などの全身疾患との関連が指摘されている細菌である。

一方、３−メチル−４−イソプロピルフェノール（イソプロピルメチルフェノール、以下、「ＩＰＭＰ」と略す場合がある。）は、フェノール系の抗菌剤として知られている。

特許文献１には、アルギニンまたはその誘導体とＩＰＭＰを用いた殺菌・消毒剤が開示されている。

また、プロタミンは、脊椎動物の精子核中でＤＮＡと結合している塩基性のたんぱく質であり、ＤＮＡを圧縮、保護することにより、遺伝情報の保護機能を担っていると考えられている。プロタミンは、生物種によりアミノ酸配列は若干異なるが、アルギニン残基が２／３を占めることが特徴で、一般細菌に対して抗菌作用があることから、主に魚類精巣であるいわゆる白子から抽出されたプロタミンが食品の保存剤などとして広く利用されている（特許文献２）。さらに、プロタミンは、細胞膜の溶解または透過性亢進を起こすことなく、抗菌効果を発揮することが知られている。

特許文献３には、プロタミンを含有する口腔内衛生用具の消毒剤が開示されている。また、特許文献４には、プロタミンを含有する、睡眠時に使用者の歯および／または歯肉に貼り付けて用いる歯周病用フィルム状外用剤が開示されている。

特開平８−１５１３２４号公報特開昭６１−２１９３６３号公報特開２００１−１０９０４号公報特開２０１６−８４２８７号公報

しかし、抗菌性を有する組成物を口腔内で使用する場合には、口腔内でとどまる時間が限られているため、より短時間で抗菌性を示す口腔用組成物が求められている。

本発明者らは、プロタミンとＩＰＭＰとを併用することにより、短時間で抗菌性を発揮する口腔用抗菌組成物が得られることを見出した。
すなわち、本発明は、以下に示すものである。
［１］Ａ成分：プロタミン、プロタミン分解物およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種と、Ｂ成分：フェノール系抗菌剤と、を含有する、口腔用抗菌組成物。
［２］前記Ｂ成分が、３−メチル−４−イソプロピルフェノールである、［１］に記載の口腔用抗菌組成物。
［３］前記Ａ成分と前記Ｂ成分との質量比（Ａ：Ｂ）が、３０〜１００，０００：１，０００の範囲である、［１］または［２］に記載の口腔用抗菌組成物。
［４］前記口腔用抗菌組成物中の前記Ａ成分と前記Ｂ成分を合計した濃度が、質量基準で１０ｐｐｍ以上３００，０００ｐｐｍ以下である、［１］〜［３］のいずれかに記載の口腔用抗菌組成物。
［５］対象とする菌が、Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ属細菌である、［１］〜［４］のいずれかに記載の口腔用抗菌組成物。
［６］対象とする菌が、Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉである、［５］に記載の口腔用抗菌組成物。
［７］溶媒として、水および／またはＰＢＳを含む、［１］〜［６］のいずれかに記載の口腔用抗菌組成物。
［８］抗菌剤を含有しない対照の口腔用組成物または培地に菌を作用させたときの菌の生存率を１００％とした場合、菌の生存率が８０％以下である、［１］〜［７］のいずれかに記載の口腔用抗菌組成物。
［９］５秒〜３０分の接触時間で作用を有する、［１］〜［８］のいずれかに記載の口腔用抗菌組成物。
［１０］［１］〜［９］のいずれかに記載の口腔用抗菌組成物を含有する、口腔用抗菌作用を有する食品。
［１１］［１］〜［９］のいずれかに記載の口腔用抗菌組成物を含有する、口腔衛生用品。

本発明によれば、短時間で抗菌性を示す口腔用組成物が得られる。

Ｓ．ｍｕｔａｎｓに対するプロタミンとＩＰＭＰの併用による抗菌効果を示す図である（実施例１）。Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉに対するプロタミンとＩＰＭＰの併用による抗菌効果を示す図である（実施例２）。短時間におけるプロタミンとＩＰＭＰの併用による抗菌効果を示す図である（実施例３）。Ｓ．ｍｕｔａｎｓに対するプロタミン分解物とＩＰＭＰの併用による抗菌効果を示す図である（実施例５）。Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉに対するプロタミン分解物とＩＰＭＰの併用による抗菌効果を示す図である（実施例６）。短時間におけるプロタミン分解物とＩＰＭＰの併用による抗菌効果を示す図である（実施例７）。

本発明において「抗菌」あるいは「抗菌性」の語は、細菌の発育や増殖を阻止することのほか、細菌の数や濃度を減少させることあるいは死滅させることを意味する。また、「抗菌剤」の語は、このような「抗菌性」を有する物質（化合物）を意味し、「抗菌成分」の語と同義となる場合も含む。さらに、本発明において、「抗菌組成物」とは、上記「抗菌性」を有する成分（抗菌剤も含む）を含む組成物を意味し、少なくとも本発明で定義するＡ成分とＢ成分とを含む。また、「口腔用」とは、口腔内及び口腔周辺への適用を意味するが、これら以外への使用を妨げるものではない。

本発明に用いられるＡ成分、すなわち、プロタミン、プロタミン分解物およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種としては、特に制限はないが、主に魚類の白子を原料として調製されるプロタミン、その分解物ならびにそれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。原料となる白子の種類としては特に制限はなく、サケ、ニジマス、ニシン、サバ、チョウザメ、マグロ、タラ、コイ、スズキ等の白子が挙げられるが、入手容易性や、コスト等を考慮すると特にサケとニシンの白子が好ましい。そして、これらの白子から調製されるプロタミンの例としては、サケ由来のサルミン、ニジマス由来のイリジン、ニシン由来のクルペイン、サバ由来のスコンブリン、チョウザメ由来のスツリン等を挙げることができる。

市販のプロタミンとしては、例えば、プロタミン（商品名、マルハニチロ社製）、プロザーブ（商品名、マルハニチロ社製）などを挙げることができる。市販のプロタミン分解物としては、例えばＨＡＰ−１００（商品名、マルハニチロ社製）などを挙げることができる。

本発明に用いられるプロタミン分解物としては、プロタミンを分解したものであれば特に制限はないが、例えばプロタミンの加水分解物を挙げることができる。プロタミン分解物を調製するためのプロタミンの加水分解方法としては、酸、アルカリまたは蛋白質分解酵素による加水分解法を用いることができ、又これらの方法の組合せによる分解も利用できるが、蛋白質分解酵素を用いることが望ましい。より詳細には次の通りである。プロタミンに脱イオン水を加え、水酸化ナトリウム又は塩酸を加えてｐＨを酵素の至適ｐＨに調整する。酵素の至適温度に加温した後、酵素を添加して、攪拌しながら酵素反応を行う。
反応終了後、反応液を８０〜１００℃に加温して５〜６０分間加熱失活させｐＨを中性域となるように調整後、反応液を凍結乾燥し、プロタミン分解物を得ることができる。プロタミン分解物は、タンパク質が分解して得られる複数のオリゴペプチドの混合物を含み、目的とするプロタミン分解物が得られたかどうかについては、ＨＰＬＣ分析で確認することのほか、その抗菌性を測定することにより確認することができる。プロタミンの分解率は、目的とする抗菌性を得ることができれば特に限定されないが、分子量が５００〜４，０００Ｄａの範囲に分布するようにプロタミンを部分分解することが望ましい。
本発明において加水分解に用いることのできる蛋白質分解酵素としては、例えばバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属（例えばバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ），バシラス・サーモプロテオティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）、バシラス・リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）等）の産生する酵素、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属（例えばアスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・メレンス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｍｅｌｌｅｎｓ）等）の産生する酵素、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属（例えばリゾパス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓｎｉｖｅｕｓ）、リゾパス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓｄｅｌｅｍａｒ）等）の産生する酵素、ペプシン、パンクレアチン、パパイン等が挙げられる。これらの酵素は単独、又は２種以上を組み合わせても良い。

また、蛋白質分解酵素は、蛋白質の内部配列を特異的に認識して切断するエンドペプチダーゼと、末端から１〜２アミノ酸残基ずつ切断するエキソペプチダーゼに分類される。
従って、必要に応じて、エンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼの組合せにより、様々なペプチド鎖を生成させることが可能である。酵素により加水分解する場合には、基質に対して、酵素０．００１〜１０％を添加し、溶液を使用される酵素の至適ｐＨとして加水分解する。

本発明に用いられるプロタミンおよびプロタミン分解物（ペプチド混合物）は、必要に応じて無機酸若しくは有機酸との塩や無機塩基若しくは有機塩基との塩を形成させることができる。酸や塩基としては、塩の用途に応じて選択できるが、口腔用抗菌組成物（食品、化粧品、医薬品など）への用途を考慮すると、以下に挙げる薬学的に許容される塩（以下、単に「塩」という）である。酸付加塩形成用の無機酸及び有機酸としては、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸及びフマル酸等のジカルボン酸、酢酸、プロピオン酸及び酪酸等のモノカルボン酸等を挙げる事ができる。塩形成用の無機塩基としては、例えば、アンモニア、ナトリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム等の水酸化物、炭酸塩及び重炭酸塩等を挙げることができる。
塩形成用の有機塩基としては、例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリエチルアミン等のモノ−、ジ−及びトリ−アルキルアミン、モノ−、ジ−及びトリ−ヒドロキシアルキルアミン、グアニジン、Ｎ−メチルグルコサミン等を挙げる事ができる。これらの塩は必要に応じて単独であるいはこれらの２種以上を組み合わせて使用することができる。

本発明に用いられるＢ成分のフェノール系抗菌剤としては、口腔用に使用できるものであれば特に制限はないが、食品グレードまたは化粧品、医薬部外品、医薬品、医療機器グレードのものを用いることが好ましい。フェノール系抗菌剤としては、例えば３−メチル−４−イソプロピルフェノール（ＩＰＭＰ）、フェノール、オルトフェニルフェノール、オルトフェニルナトリウムフェノキシド、４−クロロフェノール、４−クロロ−３−メチルフェノール及び４−クロロ−２−メチルフェノールなどのクロロキシレノール、４−クロロ−３，５−ジメチルフェノール、オルトクレゾール、メタクレゾール、パラクレゾール、トリクロサン、クロルチモール、カルバクロル、クロロフェン、ジクロロフェン、ヘキサクロロフェンなどを挙げることができ、これらの中から、使用目的、各国の法規制を考慮して適宜選択したものを使用することができる。特に本発明では、フェノール系抗菌剤としてＩＰＭＰを使用する。ＩＰＭＰは、本来は水に難溶であるため、界面活性剤を用いてＩＰＭＰを可溶化した溶液を用いてもよい。具体的には、ＢＩＯＳＯＬ（登録商標）−ＬＩＱＵＩＤ（商品名、大阪化成社製）（ＩＰＭＰを１０％含有）などを挙げることができる。

本発明の口腔用抗菌組成物の対象とする菌としては、口腔内に存在する菌であれば特に制限はないが、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ属細菌のＳ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓ．ｈｙｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ，Ｓ．ｕｒｉｎａｌｉｓ，Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ，Ｓ．ｃａｎｉｓ，Ｓ．ｐｈｏｃａｅ，Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ，Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅｓ．ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ，Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅｓ．ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ，Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ，Ｓ．ｄｉｄｅｌｐｈｉｓ，Ｓ．ｐｏｒｃｉｎｕｓ，Ｓ．ｉｎｉａｅ，Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ，Ｓ．ｅｑｕｉｓ．ｓ．ｅｑｕｉ，Ｓ．ｅｑｕｉｓ．ｓ．ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ，Ｓ．ｃｒｉｃｅｔｉ，Ｓ．ｄｏｗｎｅｉ，Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ，Ｓ．ｆｅｒｕｓ，Ｓ．ｍａｃａｃａｅ，Ｓ．ａｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ，Ｓ．ｂｏｖｉｓ，Ｓ．ｅｑｕｉｎｕｓ，Ｓ．ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ，Ｓ．ｌｕｔｅｔｉｅｎｓｉｓ，Ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓｓ．ｓ．ｍａｃｅｄｏｎｉｃｕｓ，Ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓｓ．ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ，Ｓ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ，Ｓ．ｏｒｉｓｒａｔｔｉ．Ｓ．ｒａｔｔｉ，Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ，Ｓ．ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ，Ｓ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ，Ｓ．ｐｅｒｏｒｉｓ，Ｓ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ，Ｓ．ｉｎｆａｎｔｉｓ，Ｓ．ｏｒａｌｉｓ，Ｓ．ｍｉｔｉｓ，Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｓ．ｃｒｉｓｔａｔｕｓ，Ｓ．ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ，Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ，Ｓ．ｏｌｉｇｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ，Ｓ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ，Ｓ．ａｃｉｄｏｍｉｎｉｍｕｓ，Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃｕｓ，Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｃｅｕｓ，Ｓ．ｓｕｉｓ，Ｓ．ｈｙｏｖａｇｉｎａｌｉｓ，Ｓ．ｐｌｕｒａｎｉｍａｌｉｕｍ，Ｓ．ｔｈｏｒａｌｔｅｎｓｉｓ，Ｓ．ｏｖｉｓ，Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ，Ｓ．ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒｉｕｓなどを挙げることができる。

本発明の口腔用抗菌組成物は、Ａ成分とＢ成分、例えばプロタミンとＩＰＭＰを、水またはＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）溶液に溶解または分散させることにより調製することができる。

本発明に用いられるＰＢＳの濃度としては、特に制限はないが、例えば、１０ｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、１ｍｏｌ／Ｌ以下のものを挙げることができる。

本発明において、Ａ成分とＢ成分の質量比としては、特に制限はないが、Ｂ成分１，０００に対して、Ａ成分を５以上、好ましくは１０以上、より好ましくは２０以上、さらに好ましくは３０以上となる質量比を挙げることができる。また、Ｂ成分１，０００に対して、Ａ成分を２００，０００以下、好ましくは、１００，０００以下、より好ましくは７０，０００以下、更に好ましくは６０，０００以下となる質量比を挙げることができる。例えば、Ａ：Ｂ＝３０〜１００，０００：１，０００の質量比を挙げることができる。

本発明において、Ａ成分とＢ成分を合計した濃度（質量基準）としては、特に制限はないが、例えば口腔用抗菌組成物中に１ｐｐｍ以上、好ましくは５ｐｐｍ以上、より好ましくは１０ｐｐｍ以上、さらに好ましくは１００ｐｐｍ以上含むものが挙げられる。一方、合計濃度の上限は１００％（１，０００，０００ｐｐｍ）以下、好ましくは５０％（５００，０００ｐｐｍ）以下、より好ましくは３０％（３００，０００ｐｐｍ）以下、さらに好ましくは２０％（２００，０００ｐｐｍ）以下である。例えば、合計濃度が１０ｐｐｍ以上３００，０００ｐｐｍ以下の範囲であるものが挙げられる。

本発明において、菌の生存率は特に制限はないが、例えば抗菌剤を含有しない対照の口腔用組成物または培地に、菌を作用させたときの菌の生存率を１００％とした場合、本発明の口腔用抗菌組成物を作用させた後の菌の生存率として、８０％以下（殺菌率２０％以上）、好ましくは６０％以下（殺菌率４０％以上）、より好ましくは４０％以下（殺菌率６０％以上）、さらに好ましくは３０％以下（殺菌率７０％以上）、特に好ましくは２０％以下（殺菌率８０％以上）などを挙げることができる。中でも９９％以上の殺菌率（生存率１％以下）となることが特に好ましい。ここで、「抗菌剤を含有しない対照の口腔用組成物または培地」とは、本発明に係る口腔用抗菌組成物のみならず、従来公知の抗菌剤（抗菌成分）のいずれも含有せず、それ以外の口腔用組成物に使用される成分を含む組成物或いは、このような抗菌成分を適用しない培地を意味する。例えば、本発明に係る口腔用抗菌組成物を調製する際に使用する、Ａ成分及びＢ成分を含まず、これら以外の溶媒、その他添加剤を含む組成物や、未処理の培地などが挙げられる。なお、単に「未処理」と表示することがある。

本発明において、口腔用抗菌組成物と菌との接触時間としては特に制限はないが、例えば５秒、１０秒、２０秒、３０秒、あるいは、３０秒以上などを挙げることができる。また、本発明に係る口腔用抗菌組成物は短時間で抗菌性を示すものであり、菌との接触時間は、例えば３０分以下、好ましくは２０分以下、より好ましくは１０分以下、さらに好ましくは６分以下でも十分な効果を示す。

本発明の口腔用抗菌組成物には、Ａ成分、Ｂ成分及び溶媒以外に、湿潤剤、ｐＨ調節剤、矯味剤、防腐剤、香料、可溶化剤、他の抗菌剤、界面活性剤等を適宜添加することができる。

湿潤剤としては、食品または化粧品、医薬部外品、医薬品、医療機器として市販されているものであればよく、例えば、多価アルコール、具体的にはグリセリン、濃グリセリン、ソルビット、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、１，３−プロパンジオール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、マルチット、ラクチット、キシリット、ヒアルロン酸ナトリウム、トレハロース、加水分解コラーゲン等が挙げられ、これらの１種または２種以上を組み合わせて用いてもよい。

本発明の口腔用抗菌組成物のｐＨは、４．５〜８．０の範囲であるのが好ましい。本発明に使用しうるｐＨ調整剤としては、例えばリン酸、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、酢酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、ピロリン酸またはこれらの塩、水酸化ナトリウム等が挙げられる。これらの１種または２種以上を組み合わせて用いてもよい。

矯味剤としては、例えば、ショ糖、ブドウ糖、果糖、乳糖、スクラロース、マルトース、マルトシルトレハロース、キシリトール、イノシトール、マルチトール、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、ラフィノース、ラクチュロース、ラクチトール、エリスリトール、還元パラチノース、パラチノース、パラチニット、ハチミツ、ステビア、アスパルテーム、アセスルファムＫ、サッカリン、サッカリンナトリウム、グリチルリチン酸二ナトリウム、グリチルリチン酸三ナトリウムまたはが挙げられる。これらの１種または２種以上を組み合わせて用いてもよい。

防腐剤としては、例えば、メチルパラベン、エチルパラベン、イソプロピルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、イソブチルパラベン、ベンジルパラベン等のパラベン（パラオキシ安息香酸エステル）類、フェノキシエタノール、エタノール等のアルコール類、あるいはソルビン酸、安息香酸、デヒドロ酢酸、プロピオン酸またはこれらの塩等が挙げられる。これらの１種または２種以上を組み合わせて用いてもよい。

香料としては、例えば、Ｌ−メントール、ペパーミント、スペアミントまたはフルーツ香料、ハッカ油等が挙げられる。香料は、唾液分泌を刺激するという利点も有する。これらの１種または２種以上の組み合わせを適宜選択して配合することができる。

可溶化剤としては、例えば、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ブチレングリコール、ポリエチレングリコール等の多価アルコール類等を挙げることができる。これらの１種または２種以上の組み合わせを適宜選択して配合することができる。

他の抗菌剤としては、例えば、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、フッ化ナトリウム（ＮａＦ）、グルコン酸クロルヘキシジン（ＣＨＧ）などを挙げることができる。これらの１種または２種以上を組み合わせて用いてもよい。

界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤のいずれを用いてもよく、これらの１種または２種以上組み合わせて用いてもよい。

非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル等の糖アルコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル等の多価アルコール脂肪酸エステルなどを挙げることができる。

アニオン性界面活性剤とは、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなどのアルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウムなどのポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、ラウリルスルホン酸ナトリウムなどのアルキルスルホン酸塩、ラウリルリン酸ナトリウムなどのアルキルリン酸塩、ラウロイルグルタミン酸ナトリウムなどのアミノ酸系界面活性剤、脂肪酸塩などを挙げることができる。

カチオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルアンモニウム塩などの４級アンモニウム塩、アシルアルギニンエチルエステル塩などのアミノ酸系界面活性剤などを挙げることができる。

両性界面活性剤としては、例えば、ベタイン型両性界面活性剤、イミダゾリン型両性界面活性剤などを挙げることができる。

本発明にかかる口腔用抗菌組成物は、食品や口腔衛生用品（オーラルケア用品）の製造に使用することができる。食品や口腔衛生用品の製造における適当な段階で、本発明にかかる組成物をそのまま、あるいは水あるいは適当な液媒体に分散した分散液として目的とする効果が得られる量を添加し、抗菌性を有する食品や口腔衛生用品を製造することができる。このような食品としては、飴、ドロップ、トローチ、グミ、ゼリー、ペースト、チューインガム、清涼飲料等を挙げることができる。また、口腔衛生用品としては、粉状、ペースト状、クリーム状、ジェル状、液状などの形態の歯磨き剤、うがい薬、口腔洗浄剤（マウスウオッシュ）等を挙げることができる。なお、うがい薬やマウスウオッシュはスプレータイプとすることができる。
例えば、ペースト状の練り歯磨きの場合は、研磨剤、粘結剤、粘稠剤及び界面活性剤、必要に応じて甘味剤、着色剤、防腐剤及び香料の少なくとも１種を用いて練り歯磨きを製造する際に、適当な段階で、本発明に係る口腔用抗菌組成物をそのまま、あるいは分散液として添加して練り歯磨きを製造することができる。

以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明は実施例に記載されたものに限られるものではない。

（試薬等）
プロタミンはプロタミン（商品名、マルハニチロ社製）を、プロタミン分解物はＨＡＰ−１００（商品名、マルハニチロ社製）、ＩＰＭＰはＢＩＯＳＯＬ（登録商標）−ＬＩＱＵＩＤ（商品名、大阪化成社製、１０％ＩＰＭＰ可溶化液）を用いた。
Ｓ．ｍｕｔａｎｓは、ＮＢＲＣ１３９５５^Ｔ（商品名、ＮＢＲＣ社製）を用い、トリプシン処理大豆酵母抽出培地（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）中で、嫌気ジャー（三菱ガス化学社製）で３７℃にて培養した。Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉは、ＮＣＴＣ７８６８（商品名、ＮＣＴＣ社製）を用い、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培地（日水製薬社製）中で培養した。これらの培地は、２５％グリセリンを含む溶媒中で−８０℃にて保存した。

（抗菌性試験）
プロタミンとＩＰＭＰのＳ．ｍｕｔａｎｓおよびＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉに対する抗菌性を評価するために、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）（商品名、Ｔｈｅｒｍｏ社製）アッセイを行った。抗菌組成物をＰＢＳ（２０μｌ）で希釈し、各菌の分散液（４×１０^５ＣＦＵ／ｍｌ）をＢＨＩ培地（１８０μｌ）で希釈し、液量２００μｌで９６ウェルプレートに注入した。３７℃で２４時間インキュベート後、２０μｌのａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）溶液をすべてのウェルに加え、さらに３時間インキュベートして色の変化を観察した。最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、色の変化が起こらない（赤が成長を示し、青が成長しないことを示す）最低濃度として測定した。最小殺菌濃度（ＭＢＣ）は、１００μｌの懸濁液を載置したアガープレート上で成長が起こらない最低濃度として測定した。結果を表１に示す。

プロタミンとＩＰＭＰを含む抗菌組成物
（実施例１）
Ｓ．ｍｕｔａｎｓに抗菌組成物を作用させて、コロニー数を数えることで、細菌生存率を決定した。一晩放置した細菌培地をＰＢＳで一回洗浄し、ＰＢＳ中で細菌濃度が４×１０^５ＣＦＵ／ｍｌとなるように調製した。９００μｌの細菌懸濁液に１００μｌの所定濃度の抗菌組成物を添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、コロニー数をカウントすることにより、生細菌数を測定した。そして、抗菌組成物において、プロタミン及びＩＰＭＰのいずれも含まない液（Ｐ（０）＋Ｉ（０））を添加した場合の生細菌数を対照（１００％）とし、抗菌組成物を添加した場合の生細菌数をその相対値として、細菌生存率を求めた。結果を図１に示す。なお、「抗菌組成物」には、図1に示すとおり、プロタミンのみ、或いはＩＰＭＰのみを添加した組成物も含むが、これらは比較例に相当し、プロタミン及びＩＰＭＰの両方を含む本発明に係る抗菌組成物には該当しない。以下も同様である。
図１より、プロタミンのみを５００ｐｐｍ（ＭＢＣの２〜４倍）含む抗菌組成物を作用させても、８０％付近の細菌生存率があった。また、ＩＰＭＰのみを１０００ｐｐｍ（ＭＢＣの２倍）含む抗菌組成物を作用させても、対照と変わらない抗菌性しか示さなかった。これに対し、本発明に係る抗菌組成物では、ＩＰＭＰを１０００ｐｐｍ含み、さらにプロタミンをわずか３１．３ｐｐｍ含有するだけで、細菌生存率が２０％以下まで低下していることがわかる。さらにプロタミンの濃度が上昇するのに伴い、細菌生存率が低下していくことがわかる。

（実施例２）
Ｓ．ｍｕｔａｎｓに代えて、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉを用いた以外は、実施例１と同様にして細菌生存率を求めた。結果を図２に示す。
図２より、プロタミンのみを５００ｐｐｍ含む抗菌組成物を作用させても、対照と変わらない抗菌性しか示さなかった。また、ＩＰＭＰのみを１０００ｐｐｍ（ＭＢＣの２倍）含む抗菌組成物を作用させても、８０％付近の細菌生存率であった。これに対し、ＩＰＭＰを１０００ｐｐｍ含み、さらにプロタミンをわずか３１．３ｐｐｍ含有するだけで、細菌生存率が３０％付近まで低下していることがわかる。さらにプロタミンの濃度が上昇するのに伴い、細菌生存率が低下していくことがわかる。

（実施例３）
６２．５ｐｐｍ（ＭＩＣ）のプロタミンと、１０００ｐｐｍ（２×ＭＢＣ）のＩＰＭＰを含む抗菌組成物を、各菌に１、３および５分間の短時間作用させた場合の効果を検証した。一晩放置した細菌培地をＰＢＳで一回洗浄し、ＰＢＳ中で同一の細菌濃度（４×１０^５ＣＦＵ／ｍｌ）となるように調製した。９００μｌの細菌懸濁液に１００μｌの抗菌組成物を添加し、３７℃でインキュベートした。所定の時間ごとに、コロニー数をカウントすることにより、生細菌数を測定した。そして、抗菌組成物未処理における生細菌数を対照（１００％）とし、時間変化ごとの生細菌数をその相対値として、細菌生存率を求めた。結果を図３に示す。
図３より、本発明の口腔用抗菌組成物を作用させた場合、Ｓ．ｍｕｔａｎｓに対しては、わずか１分間で効果を発揮し、時間の経過とともに細菌生存率が低下することがわかる。また、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉに対しては、わずか５分間で細菌生存率が低下していることがわかる。

（実施例４）
ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）ＢａｃｌｉｇｈｔＢｃｔｅｒｉａｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＫｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用いて細胞を染色し、抗菌組成物による細胞膜の損傷を評価した。一晩放置した細菌培地をＰＢＳで一回洗浄し、ＰＢＳ中で同一の細菌濃度（４×１０^７ＣＦＵ／ｍｌ）となるように調製した。９００μｌの細菌懸濁液に３μｌの染色液と１００μｌの抗菌組成物を添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。その後５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを除去した。細胞をＰＢＳで再懸濁させ、グラスボトムディッシュに載せ、蛍光顕微鏡（キーエンス社製、ＢＺ−Ｘ７１０）にて観察した。
その結果、細菌に６２．５ｐｐｍのプロタミンを単独で作用させた際には、プロタミンは細菌の細胞膜内部まで侵入しなかった。一方、１０００ｐｐｍのＩＰＭＰを単独で作用させた際には、半数以上の細菌の膜損傷を引き起こした。そして、６２．５ｐｐｍのプロタミンと１０００ｐｐｍのＩＰＭＰを同時に作用させた際には、プロタミンは細菌の細胞膜内部まで侵入した。

実施例１〜４の結果を考察するに、プロタミンとＩＰＭＰの抗菌的な相乗効果が発揮されるメカニズムとしては、必ずしも以下の理論に拘束されるものではないが、次のように考えられる。すなわち、ＩＰＭＰが細菌のバイオフィルム及び細胞膜を損傷することで、プロタミンの細胞膜内部への侵入が促進され、抗菌効果が発揮されると考えられる。

プロタミン分解物とＩＰＭＰを含む抗菌組成物
（実施例５）
Ｓ．ｍｕｔａｎｓに抗菌組成物を作用させて、コロニー数を数えることで、細菌生存率を決定した。一晩放置した細菌培地をＰＢＳで一回洗浄し、ＰＢＳ中で細菌濃度が４×１０^５ＣＦＵ／ｍｌとなるように調製した。９００μｌの細菌懸濁液に１００μｌの所定濃度の抗菌組成物を添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、コロニー数をカウントすることにより、生細菌数を測定した。そして、抗菌剤を含まない液を添加した場合の生細菌数を対照（１００％）とし、抗菌剤を含む抗菌組成物を添加した場合の生細菌数をその相対値として、細菌生存率を求めた。結果を図４に示す。
図４より、プロタミン分解物とＩＰＭＰ１０００ｐｐｍ処理においては、Ｓ．ｍｕｔａｎｓを９９％以上殺菌することができた。なお、ＩＰＭＰ１０００ｐｐｍのみでも５０％の殺菌効果が示されたが、ＩＰＭＰを５００ｐｐｍ、及びプロタミン分解物を５００ｐｐｍ含む抗菌組成物では、ＩＰＭＰ１０００ｐｐｍのみよりも優れた殺菌効果が得られた。しかしながら、プロタミン分解物５００ｐｐｍのみでは、十分な殺菌効果は得られなかった。

（実施例６）
Ｓ．ｍｕｔａｎｓに代えて、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉを用いた以外は、実施例５と同様にして細菌生存率を求めた。結果を図５に示す。
図５より、プロタミン分解物とＩＰＭＰ１０００ｐｐｍ処理においては、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉを９９％以上殺菌することができた。なお、ＩＰＭＰ１０００ｐｐｍのみでも８０％の殺菌効果が示され、ＩＰＭＰを５００ｐｐｍ、プロタミン分解物を５００ｐｐｍ含む抗菌組成物でも、ＩＰＭＰ１０００ｐｐｍのみと同程度の優れた殺菌効果が得られた。しかしながら、プロタミン分解物５００ｐｐｍのみでは、十分な殺菌効果は得られなかった。

（実施例７）
６２．５ｐｐｍのプロタミン分解物と、１０００ｐｐｍのＩＰＭＰを含む抗菌組成物を、Ｓ．ｍｕｔａｎｓに３０秒、１、３および５分間の短時間作用させた場合の効果を検証した。一晩放置した細菌培地をＰＢＳで一回洗浄し、ＰＢＳ中で同一の細菌濃度（４×１０^５ＣＦＵ／ｍｌ）となるように調製した。９００μｌの細菌懸濁液に１００μｌの抗菌組成物を添加し、３７℃でインキュベートした。所定の時間ごとに、コロニー数をカウントすることにより、生細菌数を測定した。そして、抗菌組成物未処理における生細菌数を対照（１００％）とし、時間変化ごとの生細菌数をその相対値として、細菌生存率を求めた。結果を図６に示す。
図６より、本発明の口腔用抗菌組成物を作用させた場合、Ｓ．ｍｕｔａｎｓに対しては、わずか３０秒間で効果を発揮し、３分において４０％の殺菌効果が、５分において６５％の殺菌効果が得られた。
以上の実施例５〜７の結果から、プロタミンに代えてプロタミン分解物を使用しても、ＩＰＭＰとの相乗効果が短時間で発揮されたことが理解される。

以上、実施形態例を参照して本発明を説明したが、本発明は上記実施形態例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明の範囲内で当業者が理解できる様々な変更を行うことができる。
この出願は、２０１９年１２月２５日に出願された日本出願特願２０１９−２３４３８５を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。

Claims

Ａ成分：プロタミン、プロタミン分解物およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種と、
Ｂ成分：フェノール系抗菌剤と、
を含有する、口腔用抗菌組成物。
前記Ｂ成分が、３−メチル−４−イソプロピルフェノールである、請求項１に記載の口腔用抗菌組成物。
前記Ａ成分と前記Ｂ成分との質量比（Ａ：Ｂ）が、３０〜１００，０００：１，０００の範囲である、請求項１または２に記載の口腔用抗菌組成物。
前記口腔用抗菌組成物における前記Ａ成分と前記Ｂ成分を合計した濃度が、質量基準で１０〜３００，０００ｐｐｍである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の口腔用抗菌組成物。
対象とする菌が、Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ属細菌である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の口腔用抗菌組成物。
前記Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ属細菌が、Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉである、請求項５に記載の口腔用抗菌組成物。
溶媒として、水および／またはＰＢＳを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の口腔用抗菌組成物。
抗菌剤を含有しない対照の口腔用組成物または培地に菌を作用させたときの菌の生存率を１００％とした場合、前記Ａ及びＢ成分を含む口腔用抗菌組成物を作用させた場合の菌の生存率が８０％以下である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の口腔用抗菌組成物。
５秒〜３０分の接触時間で抗菌作用を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の口腔用抗菌組成物。
請求項１〜９のいずれか１項に記載の口腔用抗菌組成物を含有する、口腔用抗菌作用を有する食品。
請求項１〜９のいずれか１項に記載の口腔用抗菌組成物を含有する、口腔衛生用品。