JPWO2020013207A1 - 細胞培養用シート - Google Patents
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Abstract
Description
〔1〕 開口部の孔径が直径1000μm以下の凹部を複数有し、該凹部の内側面が細胞非接着性表面を有し、かつ、該凹部の底面が細胞接着性表面を有する、細胞培養用シート。
〔2〕 貫通孔を有する細胞非接着性表面を有する層と、細胞接着性表面を有する層との積層物である、前記〔1〕記載の細胞培養用シート。
〔3〕 細胞非接着性表面を有する層と細胞接着性表面を有する層との間に、さらに接着層を含む、前記〔2〕記載の細胞培養用シート。
〔4〕 細胞接着性表面が合成樹脂で構成される、前記〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の細胞培養用シート。
〔5〕 細胞接着性表面がポリイミドを含む樹脂組成物で構成される、前記〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の細胞培養用シート。
〔6〕 凹部が底面側に向かってテーパー状に形成されている、前記〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の細胞培養用シート。
〔7〕 凹部が単位面積(cm2)あたり10〜1000個の個数で形成されている、前記〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載の細胞培養用シート。
〔8〕 直径1000μm以下の貫通孔を複数有する細胞非接着性表面を有する層及び細胞接着性表面を有する層を積層する、細胞培養用シートの製造方法。
〔9〕 前記〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の細胞培養用シートを含む、細胞培養用器具。
〔10〕 前記〔1〕〜〔7〕、〔9〕のいずれかに記載の細胞培養用シート又は細胞培養用器具で培養する、スフェロイドの培養方法。
このような物質の一例を示すと、ポリエチレングリコール及びその誘導体、MPC(2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン)、poly-HEMA(ポリヒドロキシエチルメタクリレート)、SPC(セグメント化ポリウレタン)等の化合物や、生体から取得されたタンパク質(アルブミン等)を、細胞の種類に応じて適宜選択して用いることができる。なかでも、基材に用いる合成樹脂との接着性の観点から、または、細胞培養用シートの製造工程を簡素化できる観点から、または得られる細胞組織体の均一性が向上する観点等から、MPC(2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン)が好ましい。
なお、物質は、取扱性、所望の疎水性(例えば、超疎水性)・親水性(例えば、超親水性)の程度等に応じて、適宜、変性したものを使用してもよい。例えば、親水性の物質を架橋処理等することで、親水性と水に対する低溶解性を両立させてもよい。また、原料となる物質(例えば、疎水性又は親水性)を、適宜、疎水化処理ないし親水化処理(例えば、疎水性基ないし親水性基の導入等)し、所望の疎水性ないし親水性の材質を得てもよい。
一方、親水性表面である場合、静的水接触角は好ましくは65°以下、より好ましくは55°以下、更に好ましくは50°以下となる。また、0°以上となってもよく、好ましくは5°以上、より好ましくは10°以上である。
一例を挙げると、疎水性が高いMPC(又は当該MPCで形成された表面)では、静的水接触角が、例えば、90°以上、100°以上のような静的水接触角を実現しうる。
なお、このような静的水接触角は、細胞非接着性表面における値であってもよく、細胞非接着性を示す物質(又は細胞非接着性表面を構成する物質)における値であってもよい。
また、静的水接触角は、例えば、後述の方法等により測定してもよい。
Yは2価の有機基を示し;
Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、及びZ6は互いに独立して水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子のいずれかを示し、
pは0または1である。
なお、ポリイミド樹脂において、式(I)で示される化学構造は、樹脂の構成単位ごとに異なってもよく、同一であってもよい。X0、Y、Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、及びZ6の少なくとも1つはフッ素原子を1個以上含むことが好ましい。
装置:東ソー株式会社製HCL−8220GPC
カラム:TSKgel Super AWM−H
溶離液(LiBr・H2O、リン酸入りNMP):0.01mol/L
測定方法:0.5重量%の溶液を溶離液で作製し、ポリスチレンで作製した検量線をもとに分子量を算出する。
細胞接着性物質又は細胞接着性表面がこのような条件を満たすことにより、スフェロイド形成がより一層促進される。
スフェロイドの接着性およびスフェロイド形成性の観点から、静的水接触角は、より好ましくは75°以上(例えば、75°超)であり、さらに好ましくは77°以上、さらに好ましくは79°以上、よりさらに好ましくは80°以上(例えば、80°超)であり、静的水接触角の上限は、例えば150°未満であり、好ましくは120°以下(例えば、120°未満)であり、より好ましくは110°以下であり、さらに好ましくは100℃以下(例えば、99℃未満、98℃以下、97℃以下、95℃以下等)である。
一方、細胞接着性物質又は細胞接着性表面[親水性(特に、超親水性でない親水性)の細胞接着性物質又は細胞接着性表面]は、静的水接触角65°以下、より好ましくは55°以下、更に好ましくは50°以下を有していてもよい。なお、下限値は、0°以上となってもよく、好ましくは5°以上、より好ましくは10°以上であってもよい。
スフェロイド形成性の観点から、転落角は、18°以上、19°以上、20°以上、22°以上、24°以上、26°以上、28°以上、30°以上の順で高いほど好ましい。転落角の上限値は、例えば80°未満であり、好ましくは70°以下(例えば、70°未満)であり、より好ましくは60°以下(例えば、60°未満)であり、さらに好ましくは50°以下(例えば、50°未満)である。なお、上記の静的水接触角や転落角は、以下の方法により測定される値であってもよい。
装置:自動接触角計(協和界面科学製:DM−500)
測定方法:表面(細胞非接着性表面又は細胞接着性表面)又はフィルム(細胞非接着性又は細胞接着性の物質で形成したフィルム)上に水2μLを滴下した直後の液滴の付着角度を測定する(測定温度:25℃)。
装置:自動接触角計(協和界面科学製:DM−500)
測定方法:表面(細胞非接着性表面又は細胞接着性表面)又はフィルム(細胞非接着性又は細胞接着性の物質で形成したフィルム)上に水25μLを滴下した後、基材を連続的に傾けていき、流れ落ちた際の角度を転落角とする(測定温度:25℃)。
<細胞接着性表面を有する層の調製(含フッ素ポリイミドフィルムの調製)>
100mL容量の三口フラスコに、1,4−ビス(アミノフェノキシ)ベンゼン2.976g(10.2ミリモル)、4,4’−ヘキサフルオロイソプロピリデンジフタル酸無水物4.524g(10.2ミリモル)、N−メチルピロリドン42.5gを仕込んだ。窒素雰囲気下室温で撹拌後、5日間保持することで、含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物(固形分濃度15.0質量%、6FDA/TPEQポリアミド酸)を得た。該ポリアミド酸の重量平均分子量は12万で、粘度は6Pa・sであった。なお、ポリアミド酸の重量平均分子量と、焼成後の含フッ素ポリイミドの重量平均分子量とは実質的に同一である。
(重量平均分子量の測定)
装置:東ソー株式会社製HCL−8220GPC
カラム:TSKgel Super AWM−H
溶離液(LiBr・H2O、リン酸入りNMP):0.01mol/L
測定方法:0.5重量%の溶液を溶離液で作製し、ポリスチレンで作製した検量線をもとに分子量を算出する。
(粘度の測定)
装置:アズワン製 粘度計 VISCOMETER TV-22
設定:VI RANGE:H ROTOR No.6 SPEED:10rpm
粘度計校正用標準液:日本グリース(株) JS 14000
測定方法:粘度計校正用標準液で校正後、ワニス0.3gを用いて測定する。(測定温度:23℃)
(静的水接触角の測定)
装置:自動接触角計(協和界面科学製:DM−500)
測定方法:フィルム上に水2μLを滴下した直後の液滴の付着角度を測定する(測定温度:25℃)。
(転落角の測定)
装置:自動接触角計(協和界面科学製:DM−500)
測定方法:フィルム上に水25μLを滴下した後、基材を連続的に傾けていき、流れ落ちた際の角度を転落角とする(測定温度:25℃)。
両面テープ(厚み25μm)の片面の剥離テープを剥離後透明なPETフィルム(厚み250μm)に貼り合わせたものに対して、CO2レーザーを用いて、直径300μm、ピッチ500μmで千鳥配置の貫通孔を形成した(形成された貫通孔:400個/cm2、24000個/シート、レーザー入射側孔径500μm、レーザー放出側孔径300μm)。その後、PETフィルム側の表面にスピンコーター(ミカサ製:MS-A150)を用いて、MPCポリマー溶液(0.5%エタノール溶液、疎水性MPCポリマー)を厚みが0.05μmとなるようにコーティング(スピン条件:1000rpm、10秒間)し、50℃の乾燥機内で2時間乾燥処理して、細胞非接着性表面を有する層[PETフィルムのコーティング層(MPCポリマーのコーティング層)側の静的水接触角107.5°]を得た。
次いで、細胞非接着性表面を有する層の両面テープのもう一方の剥離テープを除去した側の面に、上記で作製した細胞接着性表面を有する層を貼りあわせて、細胞培養用シートを調製した(シート厚み:315μm)。得られた細胞培養シートを培養プレート内へ設置し、細胞培養に用いる容器を完成した。
細胞は、ヒト脂肪由来幹細胞(Human adipose derived stem cell:AdSC)を用いた。AdSCはメーカー品(ロンザ社、PT-5006)を購入して使用した。
凍結細胞を37℃の恒温水槽で溶解させ、5%FBS、1%抗生物質を含んだKBM ADSC-2培地(基礎培地、コージンバイオ製)9mLに加えた。次いで、500×gで5分間の遠心処理を施した後、上清を除去して10mLの基礎培地に分散させた。800mL容細胞培養用フラスコ(住友ベークライト製)に細胞懸濁液を加えた後の全量が30mLとなるように基礎培地を予め加えておき、そこに細胞懸濁液を1.0×106細胞/フラスコとなるように加え、37℃の5%(v/v)CO2インキュベーター内で培養(拡大培養)を行った。
別途、実施例1の培養容器の脱泡処理を行った。具体的には、容器に25mL程度のPBSを加えてピペッティングの作業を2度繰り返し、脱泡を行った。次いで、1%抗生物質を含んだKBM ADSC-2培地を12mL加えて、37℃の5%(v/v)CO2インキュベーター内で1晩静置した。
培養用フラスコから培地を除去し、細胞剥離液accutase(プロモセル製)を5mL添加した後、37℃の5%(v/v)CO2インキュベーター内で5分程度保持して細胞を剥離した。次いで、剥離液を回収し、PBSを用いて総量が25mLとなるようにしてチューブへ移した。500×gで5分間遠心処理を施し、10mLの1%抗生物質を含んだKBM ADSC-2培地で懸濁させて、細胞数のカウントを行った。その後、1.0×106細胞/mLの濃度となるように調製した。
培養3日目、6日目、14日目にスフェロイドを撮影し(図7)、画像解析ソフトであるWinROOF(三谷商事製)でスフェロイドの円相当径、流体直径、円形度を解析した(図8〜10)。
実施例1と同様にして調製して脱泡処理した細胞培養シートを用いて、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞株(UE7T-13細胞;JCRB1154)の培養を行った。培地はDMEM+10%FBSを使用した。
播種細胞数が、細胞培養シートに1.2×107細胞(1ウェルあたり500細胞)となる以外は、試験例2と同様に細胞を培養して、培養1日目にスフェロイドの円相当径を評価した(図13)。
細胞接着性表面を有する層の調製(含フッ素ポリイミドフィルムの調製)を下記の通りに行なう以外は、実施例1と同様にして、細胞培養用容器を調製した。なお、各実施例におけるポリアミド酸の重量平均分子量と、焼成後の含フッ素ポリイミドの重量平均分子量とは実質的に同一である。
500mL容量の三口フラスコに、4,4’−ヘキサフルオロイソプロピリデンジフタル酸無水物21.792g(0.049モル)、N−メチルピロリドン148.75gを仕込み溶解した。そこへ2,2’−ビス(トリフルオロメチル)ベンジジン15.708g(0.049モル)、N−メチルピロリドン63.75gを仕込み溶解したものを滴下投入し、窒素雰囲気下室温で撹拌後、5日間保持することで、含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物(固形分濃度15質量%、6FDA/TFMBポリアミド酸)を得た。該ポリアミド酸の重量平均分子量は18.9万で、粘度は9.1Pa・sであった。得られた含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物を用いて、実施例1と同様にして含フッ素ポリイミドフィルムを得た。この含フッ素ポリイミドフィルムの静的水接触角は82.1°、転落角は19.9°であった。
500mL容量の三口フラスコに、4,4’−ヘキサフルオロイソプロピリデンジフタル酸無水物26.89g(0.058モル)、N−メチルピロリドン154.7gを仕込み溶解した。そこへ4,4’−ジアミノジフェニルエーテル12.11g(0.058モル)、N−メチルピロリドン66.3gを仕込み溶解したものを滴下投入し、窒素雰囲気下室温で撹拌後、5日間保持することで、含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物(固形分濃度15質量%、6FDA/ODAポリアミド酸)を得た。該ポリアミド酸の重量平均分子量は15.3万で、粘度は7.7Pa・sであった。得られた含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物を用いて、実施例1と同様にして含フッ素ポリイミドフィルムを得た。この含フッ素ポリイミドフィルムの静的水接触角は79.5°、転落角は31.0°であった。
500mL容量の三口フラスコに、4,4’−ヘキサフルオロイソプロピリデンジフタル酸無水物19.49g(0.044モル)、N−メチルピロリドン148.75gを仕込み溶解した。そこへ2,2−ビス(4−(4−アミノフェノキシ)フェニル)プロパン18.01g(0.044モル)、N−メチルピロリドン63.75gを仕込み溶解したものを滴下投入し、窒素雰囲気下室温で撹拌後、5日間保持することで、含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物(固形分濃度15質量%、6FDA/BAPPポリアミド酸)を得た。該ポリアミド酸の重量平均分子量は18.5万で、粘度は7.1Pa・sであった。得られた含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物を用いて、実施例1と同様にして含フッ素ポリイミドフィルムを得た。この含フッ素ポリイミドフィルムの静的水接触角は82.5°、転落角は32.2°であった。
500mL容量の三口フラスコに、4,4’−ヘキサフルオロイソプロピリデンジフタル酸無水物20.50g(0.046モル)、N−メチルピロリドン148.75gを仕込み溶解した。そこへ4,4’−ビス(4−アミノフェノキシ)ビフェニル17.00g(0.046モル)、N−メチルピロリドン63.75gを仕込み溶解したものを滴下投入し、窒素雰囲気下室温で撹拌後、5日間保持することで、含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物(固形分濃度15質量%、6FDA/BAPBポリアミド酸)を得た。該ポリアミド酸の重量平均分子量は11.2万で、粘度は8.1Pa・sであった。得られた含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物を用いて、実施例1と同様にして含フッ素ポリイミドフィルムを得た。この含フッ素ポリイミドフィルムの静的水接触角は79.0°、転落角は32.2°であった。
使用する細胞は、試験例1と同じものを用いた。
凍結細胞を37℃の恒温水槽で溶解させ、5%FBS、1%抗生物質を含んだKBM ADSC-2培地(基礎培地、コージンバイオ製)9mLに加えた。次いで、210×gで5分間の遠心処理を施した後、上清を除去して1mLの基礎培地に分散させた。800mL細胞培養用フラスコ(住友ベークライト製)に細胞懸濁液を加えた後の全量が30mLとなるように基礎培地を予め加えておき、そこに細胞懸濁液を1.0×106細胞/フラスコとなるように加え、37℃の5%(v/v)CO2インキュベーター内で培養を行った。
実施例2〜5の培養容器の脱泡処理を行った。具体的には、容器に2ML程度のPBSを加えてピペッティングの作業を2度繰り返し、脱泡を行った。次いで、1%抗生物質を含んだKBM ADSC-2培地を0.2mL加えて、37℃の5%(v/v)CO2インキュベーター内で1晩静置した。
培養用フラスコから培地を除去し、細胞剥離液accutase(プロモセル製)を5mL添加した後、37℃の5%(v/v)CO2インキュベーター内で5分程度保持して細胞を剥離した。次いで、剥離液を回収し、PBSを用いて総量が15mLとなるようにしてチューブへ移した。210×gで5分間遠心処理を施し、2mLの1%抗生物質を含んだKBM ADSC-2培地で懸濁させて、細胞数のカウントを行った。その後、1.0×106細胞/mLの濃度となるように調製した。
11 凹部
11a 凹部の内側面
11b 凹部の底面
12 シート表面
21 細胞非接着性を示す物質
22 細胞接着性を示す物質
23 接着層
Claims (10)
- 開口部の孔径が直径1000μm以下の凹部を複数有し、該凹部の内側面が細胞非接着性表面を有し、かつ、該凹部の底面が細胞接着性表面を有する、細胞培養用シート。
- 貫通孔を有する細胞非接着性表面を有する層と、細胞接着性表面を有する層との積層物である、請求項1記載の細胞培養用シート。
- 細胞非接着性表面を有する層と細胞接着性表面を有する層との間に、さらに接着層を含む、請求項2記載の細胞培養用シート。
- 細胞接着性表面が合成樹脂で構成される、請求項1〜3のいずれかに記載の細胞培養用シート。
- 細胞接着性表面がポリイミドを含む樹脂組成物で構成される、請求項1〜4のいずれかに記載の細胞培養用シート。
- 凹部が底面側に向かってテーパー状に形成されている、請求項1〜5のいずれかに記載の細胞培養用シート。
- 凹部が単位面積(cm2)あたり10〜1000個の個数で形成されている、請求項1〜6のいずれかに記載の細胞培養用シート。
- 直径1000μm以下の貫通孔を複数有する細胞非接着性表面を有する層及び細胞接着性表面を有する層を積層する、細胞培養用シートの製造方法。
- 請求項1〜7のいずれかに記載の細胞培養用シートを含む、細胞培養用器具。
- 請求項1〜7、9のいずれかに記載の細胞培養用シート又は細胞培養用器具で培養する、スフェロイドの培養方法。
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