CN112384604A - 细胞培养用片 - Google Patents

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Abstract

一种细胞培养用片，其具有多个开口部的口径为直径1000μm以下的凹部，该凹部的内侧面具有细胞非粘附性表面，并且该凹部的底面具有细胞粘附性表面；以及一种细胞培养用片的制造方法，其中，将具有多个直径1000μm以下的贯通孔的具有细胞非粘附性表面的层和具有细胞粘附性表面的层进行层叠。本发明的细胞培养片能够简便地制备，并且细胞培养的操作本身也能够高效地进行，因此能够适合用于例如含球状体的制剂等细胞制剂的领域。

Description

细胞培养用片
技术领域
本发明涉及细胞培养用片。更详细而言，本发明涉及细胞培养用片及其制造方法、包含该片的细胞培养用器具、以及使用上述片或器具的球状体的制造方法。
背景技术
在细胞培养中，从能够进一步模仿生物组织等观点出发，近年来对培养细胞进行三维培养的技术受到关注。
例如，专利文献1中记载了：通过在具有多个细胞保持腔的微芯片中使该腔的底面包含显示细胞粘附性的粘附性区域和围绕该粘附性区域且显示细胞非粘附性的非粘附性区域，能够形成形状和尺寸均匀的细胞组织体。另外，专利文献2中公开了在具有贯通孔的多孔膜上对细胞进行培养的方法，并公开了下述方法：该多孔膜表面由细胞粘附性区域和细胞非粘附性区域构成，在顺畅地进行新鲜培养液的供给和代谢物的排出的同时，高效地对三维组织体进行培养。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2006-121991号公报
专利文献2：日本特开2008-199962号公报
发明内容
发明所要解决的问题
但是，现有技术的方法中，细胞培养用器具的制备繁杂、或者所得到的细胞组织体的均匀性尚不充分，期望更好的技术。
本发明的目的在于提供新型的细胞培养用片。
本发明的目的在于提供能够简便地制备、并且还能够高效地进行细胞培养的细胞培养用片及其制造方法、包含该片的细胞培养用器具、以及使用上述片或器具的球状体的制造方法。
用于解决问题的方法
本发明人为了实现上述目的进行了深入研究，结果发现，通过以特定的表面形成细胞培养面，不仅细胞培养片的制备变得简便，而且培养基更换、细胞接种这样的细胞培养的操作本身也变得容易，另外，所得到的细胞聚集块(球状体)的均匀性提高，从而完成了本发明。
即，本发明涉及下述[1]～[10]。
[1]一种细胞培养用片，其具有多个开口部的口径为直径1000μm以下的凹部，该凹部的内侧面具有细胞非粘附性表面，并且该凹部的底面具有细胞粘附性表面。
[2]如上述[1]所述的细胞培养用片，其为具有贯通孔的具有细胞非粘附性表面的层与具有细胞粘附性表面的层的层叠物。
[3]如上述[2]所述的细胞培养用片，其中，在具有细胞非粘附性表面的层与具有细胞粘附性表面的层之间进一步包含粘接层。
[4]如上述[1]～[3]中任一项所述的细胞培养用片，其中，细胞粘附性表面由合成树脂构成。
[5]如上述[1]～[4]中任一项所述的细胞培养用片，其中，细胞粘附性表面由包含聚酰亚胺的树脂组合物构成。
[6]如上述[1]～[5]中任一项所述的细胞培养用片，其中，凹部朝向底面侧形成为锥状。
[7]如上述[1]～[6]中任一项所述的细胞培养用片，其中，凹部以每单位面积(cm2)10～1000个的个数形成。
[8]一种细胞培养用片的制造方法，其中，将具有多个直径1000μm以下的贯通孔的具有细胞非粘附性表面的层和具有细胞粘附性表面的层进行层叠。
[9]一种细胞培养用器具，其包含上述[1]～[7]中任一项所述的细胞培养用片。
[10]一种球状体的培养方法，其中，利用上述[1]～[7]、[9]中任一项所述的细胞培养用片或细胞培养用器具进行培养。
发明效果
本发明的细胞培养片能够简便地制备，并且细胞培养的操作本身也能够高效地进行。
另外，通过使用本发明的细胞培养片，能够发挥下述优良的效果：所得到的细胞聚集块(球状体)的均匀性提高，进而细胞的品质管理变得容易。
附图说明
图1是关于本发明的细胞培养用片的一个方式示意性地示出片截面结构的图。
图2是关于本发明的细胞培养用片的一个方式示意性地示出片截面结构的图。
图3是关于本发明的细胞培养用片的一个方式示意性地示出片截面结构的图。
图4是示意性地示出在本发明的细胞培养用片中对细胞进行培养的一个方式的图。
图5是示意性地示出在本发明的细胞培养用片中对细胞进行培养的一个方式的图。
图6是关于本发明的细胞培养用片的一个方式示意性地示出片截面结构的图。
图7是示出使用本发明的细胞培养用片得到的球状体的照片的图。
图8是示出使用本发明的细胞培养用片得到的球状体的流体直径的图。
图9是示出使用本发明的细胞培养用片得到的球状体的等效圆直径的图。
图10是示出使用本发明的细胞培养用片得到的球状体的圆形度的图。
图11是示出试验例2和3中使用的细胞培养用片的分区的图。
图12是示出使用本发明的细胞培养用片得到的球状体的各地点的等效圆直径的图。
图13是示出使用本发明的细胞培养用片得到的球状体的各地点的等效圆直径的图。
图14是示出使用实施例2～5的细胞培养用片得到的球状体的照片的图。
具体实施方式
本发明的细胞培养用片具有多个开口部的口径为直径1000μm以下的凹部，该凹部的内侧面具有细胞非粘附性表面，并且该凹部的底面具有细胞粘附性表面。在此，使用沿着垂直于凹部的方向切断的片截面图的一例对本发明的细胞培养用片的结构进行说明。如图1的示意图所示，在片表面12存在多个凹部11，凹部11由内侧面11a和底面11b构成，在凹部11内形成细胞组织体(球状体)。
本发明的细胞培养用片在片表面具有多个凹部。例如，在图1中，在片表面12存在多个凹部11。凹部的个数根据片面积、所培养的细胞的种类等而不能一概地设定，可以按照有关技术常识适当设定。例如，每单位面积(cm2)的下限个数可以设定为1个，可以例示10个、20个、30个、50个等，上限个数可以例示1000个、500个、300个、200个、100个等。另外，片表面上的凹部的总数例如可以适当设定为10个以上、100个以上、1000个以上、10000个以上、50000个以上等。
凹部的开口部的形状不限于圆形，例如可以为多边形、椭圆。开口部的口径只要为直径1000μm以下即可，可以根据所培养的细胞的尺寸而按照有关技术常识适当设定。本发明中，口径是指无论对象部位的形状如何均以包接对象部位的方式形成的圆的直径(最大长度)，例如，在图1中，开口部的口径为D(11)所示的长度。作为开口部的口径，可以例示例如10～1000μm、10～700μm、10～600μm、10～500μm的范围内。
凹部的底面的形状不限于圆形，例如可以为多边形、椭圆，可以与开口部的形状相同也可以不同。另外，底面的口径(长度)可以与开口部的口径相同也可以不同，底面的口径可以小于开口部的口径，底面的口径也可以大于开口部的口径。例如，在图1中，底面的口径为DB(11b)所示的长度，作为底面的口径，可以例示例如10～1000μm、10～700μm、10～600μm、10～500μm、10～400μm、10～300μm的范围内。例如，在底面的口径小于开口部的口径的情况下，作为凹部的形状，形成朝向凹部的底面侧的锥形形状。
底面的口径与开口部的口径之比(底面的口径/开口部的口径)没有特别限定，从细胞的接种和回收的容易性的观点出发，可以例示5/1～1/5、3/1～1/3、1/1～1/2。
另外，例如，在图1中，开口部与相邻的开口部之间的距离(间隙)为D(12)所示的长度，没有特别限定，根据所期望的细胞培养，可以例示例如800μm以下、700μm以下、600μm以下、500μm以下、300μm以下、200μm以下、100μm以下等范围内，只要为有限值即可。
凹部的深度可以根据所培养的细胞的尺寸而按照有关技术常识适当设定。例如，在图1中，凹部的深度为D(11a)所示的长度，可以例示例如10～300μm、10～1000μm的范围内。
开口部的口径与凹部的深度之比(开口部的口径/凹部的深度)没有特别限定，从细胞的接种和回收的容易性的观点出发，可以例示5/1～1/5、3/1～1/3、2/1～1/2。在上述范围内的情况下，细胞不易从凹部飞出，另外，细胞的回收、脱泡处理等操作变得容易。
凹部的底面的厚度没有特别限定，可以按照有关技术常识适当设定。
关于凹部，内侧面具有细胞非粘附性表面，底面具有细胞粘附性表面。通过具有该构成，能够提高所得到的细胞组织体的均匀性。例如，在图1中，内侧面11a具有细胞非粘附性表面，底面11b具有细胞粘附性表面。
细胞非粘附性的表面是指下述表面：例如，在培养所用的溶液中细胞沉降到该表面上的情况下，该表面几乎不会使该细胞的形状发生变化，完全不粘附；或者即使暂时性地弱粘附也会自然脱离。该表面只要是例如利用物理方法或化学方法使显示细胞非粘附性的物质固定于构成凹部的基材表面而形成的即可，基材本身也可以由显示细胞非粘附性的物质构成。例如，在使显示细胞非粘附性的物质固定于表面上的情况下，如图2的示意图所示，显示细胞非粘附性的物质21被固定于片表面12和凹部11的内侧面11a上。
作为显示细胞非粘附性的物质，只要是培养所用的细胞不发生粘附或者不与所使用的细胞的细胞膜上存在的蛋白质、糖链等细胞表面分子结合的物质，则可以没有特别限制地使用，可以是具有生物相容性的物质，也可以是不具有生物相容性的物质。另外，可以是显示疏水性的物质，也可以是显示亲水性的物质，例如可以为超拒水性(超疏水性)的物质或超亲水性的物质。从细胞的非粘附性、球状体的均匀性和形成性等观点出发，特别优选显示疏水性(特别是超疏水性)[例如，相对于疏水性或亲水性(特别是疏水性)的细胞粘附性表面或构成该表面的树脂(以及其接触角)更为疏水性(特别是超疏水性)]的物质，还优选显示亲水性(特别是超亲水性)[例如，相对于亲水性或疏水性(例如疏水性)的细胞粘附性表面或构成该表面的树脂(以及其接触角)更为亲水性(特别是超亲水性)]的物质。
若示出这样的物质的一例，可以根据细胞的种类适当选择使用聚乙二醇及其衍生物、MPC(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱)、poly-HEMA(聚甲基丙烯酸羟基乙酯)、SPC(链段化聚氨酯)等化合物、从生物体取得的蛋白质(白蛋白等)。其中，从与基材所使用的合成树脂的粘附性的观点出发、或者从能够简化细胞培养用片的制造工序的观点出发、或者从所得到的细胞组织体的均匀性提高的观点等出发，优选MPC(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱)。
需要说明的是，物质也可以使用根据处理性、所期望的疏水性(例如超疏水性)/亲水性(例如超亲水性)的程度等适当进行了改性的物质。例如，通过对亲水性的物质进行交联处理等，可以兼顾亲水性和在水中的低溶解性。另外，可以对作为原料的物质(例如，疏水性或亲水性)适当进行疏水化处理或亲水化处理(例如，导入疏水性基团或亲水性基团等)而得到所期望的疏水性或亲水性的材质。
关于显示细胞非粘附性的物质的固定化，可以通过下述方法固定化于该基材表面上：使含有这些物质的溶液在基材表面上干燥的方法；使该物质熔融并进行压接的方法；利用UV等能量射线使涂布于基材上的该物质固化的方法；使该物质所具有的官能团与基材上的官能团之间发生化学反应(例如，羧基、氨基等官能团间的缩合反应等)而形成共价键的方法；或者使该物质所具有的硫醇基与预先形成在基材上的金属(铂、金等)薄膜结合的方法。固定化时的厚度没有特别限定，可以例示0.01～1000μm。
作为显示细胞非粘附性的表面在凹部的内侧面所占的比例，没有特别限定，优选为使培养细胞的附着性降低的程度。优选占内侧面的面积的90％以上、更优选占95％以上、特别优选占全部。
对于显示细胞非粘附性的表面，从使所形成的细胞组织体的尺寸均匀、或者提高圆形度的观点出发，作为其表面特性，例如可以以后述的静态水接触角为指标来进行判断。例如，在为由上述物质形成的疏水性表面的情况下，静态水接触角优选为90°以上，更优选为93°以上，进一步优选为95°以上。另外，可以为150°以下，优选为130°以下，更优选为120°以下。
另一方面，在为亲水性表面的情况下，静态水接触角优选为65°以下，更优选为55°以下，进一步优选为50°以下。另外，可以为0°以上，优选为5°以上，更优选为10°以上。
若列举一例，在疏水性高的MPC(或者由该MPC形成的表面)的情况下，静态水接触角可以实现例如90°以上、100°以上这样的静态水接触角。
需要说明的是，这样的静态水接触角可以是细胞非粘附性表面的值，也可以是显示细胞非粘附性的物质(或者构成细胞非粘附性表面的物质)的值。
另外，静态水接触角例如可以通过后述的方法等进行测定。
细胞粘附性的表面是指，例如在培养所用的溶液中细胞沉降到该表面上的情况下，该细胞以一定的粘附点发生粘附。或者是指，按照该细胞以可通过吹打等的液流等而剥离的程度被固定化的方式发生粘附的表面。另外，不仅是细胞粘附并以二维方式维持或增殖的表面，还可以列举以能够形成层状、球体状等立体或三维的组织体的程度发生粘附的表面。该表面只要是例如利用物理方法或化学方法将显示细胞粘附性的物质固定或配置于构成凹部底面的基材表面而形成的即可，可以在该凹部以外配置有显示细胞粘附性的物质，也可以基材本身由显示细胞粘附性的物质构成。例如，在基材本身由显示细胞粘附性的物质构成的情况下，如图3的示意图所示，包含凹部11的底面11b的区域可以利用由显示细胞粘附性的物质22构成的层形成。
作为显示细胞粘附性的物质，只要是培养所用的细胞发生粘附、或者能够与所使用的细胞的细胞膜上存在的蛋白质、糖链等细胞表面分子结合的物质，则可以没有特别限制地使用。可以是显示亲水性的物质，也可以是显示疏水性的物质，从细胞粘附性、球状体的形成性等观点出发，优选亲水性(特别是非超亲水性的亲水性)或疏水性(特别是非超疏水性的疏水性)的物质，进一步优选显示疏水性的物质。另外，显示细胞粘附性的物质的粘附性的程度可以为细胞不从凹部内飞出的程度。若列举这样的物质的一例，可以列举从生物体取得或合成的物质，例如包括蛋白质(胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白等)、合成树脂(氟树脂、聚酰亚胺树脂、聚砜、聚醚砜、聚二甲基硅氧烷、它们的混合物等)。在选择合成树脂的情况下，由于合成树脂本身的强度、耐热性，能够得到处理性优良的细胞培养用片。另外，从生物相容性的观点出发、从可得到粘附性的细胞组织体的观点出发、从提高所得到的细胞组织体的均匀性的观点出发、或者从通过与各种细胞适度粘附而使培养基更换操作变得容易的观点出发，优选选择聚酰亚胺树脂这样的合成树脂。通过选择聚酰亚胺树脂这样来源于非生物的成分，利用包含聚酰亚胺树脂的本发明的细胞培养用片得到的细胞组织体(球状体)容易应用于再生医疗、药物创制等领域。
作为聚酰亚胺树脂，可以例示包含下述式(I)所示的结构单元的聚酰亚胺树脂。另外，从球状体形成良好的观点出发，优选在分子内具有氟原子的树脂，更优选含氟聚酰亚胺(含氟聚酰亚胺树脂)。本发明中使用的聚酰亚胺树脂典型地是通过将酸二酐与二胺各一种以上聚合而得到的聚酰胺酸进行酰亚胺化而得到的。聚酰亚胺树脂可以在化学结构的一部分中包含聚酰胺酸。作为制造聚酰亚胺树脂的方法，利用公知的方法进行制造即可。作为一例，可以使用两步合成法。聚酰亚胺树脂的两步合成法是合成作为前体的聚酰胺酸、并将聚酰胺酸转换为聚酰亚胺酸的方法。作为前体的聚酰胺酸可以为聚酰胺酸衍生物。作为聚酰胺酸衍生物，可以列举例如聚酰胺酸盐、聚酰胺酸烷基酯、聚酰胺酸酰胺、来自双亚甲基均苯四酸衍生物(ビスメチリデンピロメリチド)的聚酰胺酸衍生物、聚酰胺酸甲硅烷基酯、聚酰胺酸异酰亚胺等。作为聚酰亚胺，可以例示由均苯四酸二酐、联苯四羧酸二酐、二苯甲酮四羧酸二酐等酸酐与氧二胺、对苯二胺、间苯二胺、二苯甲酮二胺等二胺形成的聚酰亚胺。作为具有氟原子的树脂，可以例示4，4’-六氟异亚丙基双邻苯二甲酸酐(6FDA)/1，4-双(氨基苯氧基)苯(TPEQ)共聚物、6FDA/4，4’-氧双邻苯二甲酸酐(ODPA)/TPEQ共聚物、4，4’-(4，4’-异亚丙基二苯氧基)双邻苯二甲酸(BPADA)/2，2-双[4-(4-氨基苯氧基)苯基]六氟丙烷(HFBAPP)、6FDA/2，2-双(4-(4-氨基苯氧基)苯基)丙烷(BAPP)共聚物、6FDA/2，2’-双(三氟甲基)联苯胺(TFMB)共聚物、6FDA/4，4’-二氨基二苯醚(ODA)共聚物、6FDA/4，4’-双(4-氨基苯氧基)联苯(BAPB)共聚物等包含下述式(I)所示的结构单元的含氟聚酰亚胺树脂；乙烯-四氟乙烯共聚物等。
Figure BDA0002889264810000101
上述式(I)中，X0表示氧原子、硫原子或二价有机基团中的任一者；
Y表示二价有机基团；
Z1、Z2、Z3、Z4、Z5和Z6相互独立地表示氢原子、氟原子、氯原子、溴原子或碘原子中的任一者，
p为0或1。
需要说明的是，聚酰亚胺树脂中，式(I)所示的化学结构在树脂的各结构单元中可以不同也可以相同。优选X0、Y、Z1、Z2、Z3、Z4、Z5和Z6中的至少一个包含一个以上的氟原子。
上述式(I)中，在p＝0的情况下，X0可以不存在(换言之，左右的苯环可以直接键合)，在p＝1的情况下，左右的苯环经由X0而键合。
作为X0所示的二价有机基团，具体而言，可以列举亚烷基、亚芳基、亚芳基氧基、亚芳基硫基等，这些之中，优选亚烷基、亚芳基氧基、亚芳基硫基，更优选亚烷基、亚芳基氧基，这些基团可以被氟原子取代。上述亚烷基的碳原子数例如为1～12，优选为1～6。
作为X0的示例的被氟原子取代的亚烷基可以例示例如-C(CF3)2-、-C(CF3)2-C(CF3)2-等。在作为X0的示例的上述亚烷基中，优选-C(CF3)2-。
作为X0的示例的亚芳基可以例示例如下述基团。
Figure BDA0002889264810000121
作为X0的示例的亚芳基氧基可以例示例如下述基团。
Figure BDA0002889264810000131
作为X0的示例的亚芳基硫基可以例示例如下述基团。
Figure BDA0002889264810000141
从能够在基材上良好地形成球状体的观点出发，X0所示的二价有机基团优选选自由上述b-2～b-10和c-2～c-10组成的组，更优选选自由上述b-7～b-9和c-7～c-9组成的组，进一步优选为b-8所表示的结构。另外，X0所表示的二价有机基团为-C(CF3)2-也是同样优选的。
作为X0的示例的上述亚芳基、亚芳基氧基和亚芳基硫基可以各自独立地被选自由卤素原子(例如为氟原子、氯原子、溴原子、碘原子，优选为氟原子或氯原子，更优选为氟原子)、甲基和三氟甲基组成的组中的基团取代。这些取代基可以为多个，这种情况下，取代基的种类相互可以相同也可以不同。在亚芳基、亚芳基氧基和亚芳基硫基中进行取代的优选取代基为氟原子和/或三氟甲基，优选为氟原子。在Y中不含氟原子的情况下，亚芳基、亚芳基氧基和亚芳基硫基优选至少被一个以上的氟原子取代。
上述式(I)中，作为Y所示的二价有机基团，没有特别限制，可以列举例如具有芳香环的二价有机基团。详细而言，可以列举由一个苯环构成的基团、或者具有两个以上的苯环经由碳原子(即，单键或亚烷基)、氧原子、硫原子结合、或直接结合而成的结构的基团。具体而言，可以例示下述基团。
Figure BDA0002889264810000151
Figure BDA0002889264810000161
Figure BDA0002889264810000171
作为Y的示例的上述具有芳香环的二价有机基团在可进行取代的情况下可以被选自由卤素原子(例如为氟原子、氯原子、溴原子、碘原子，优选为氟原子或氯原子，更优选为氟原子)、甲基和三氟甲基组成的组中的基团取代。这些取代基可以为多个，这种情况下，取代基的种类相互可以相同也可以不同。关于在具有芳香环的二价有机基团中进行取代的优选取代基，特别是在X0中不含氟原子的情况下，优选为氟原子和/或三氟甲基，更优选为氟原子。
从球状体形成性的观点出发，上述式(I)中，Y优选为选自由d-3、d-9、e-1～e-4、f-6和f-7组成的组中的结构，更优选为e-1、e-3或e-4的结构。
上述式(I)中，Z1、Z2、Z3、Z4、Z5和Z6各自可以相同也可以不同，各自独立地选自氢原子、氟原子、氯原子、溴原子或碘原子，在X0和Y的至少一者中不含氟原子的情况下，Z1、Z2、Z3、Z4、Z5和Z6中的至少一个优选为氟原子。
从球状体形成性的观点出发，在本发明的一个优选实施方式中，上述式(I)中，X0所示的二价有机基团选自由-C(CF3)2-、上述b-2～b-10和c-2～c-10组成的组；并且，Y选自由d-3、d-9、e-1～e-4、f-6和f-7组成的组。在本发明的一个更优选的实施方式中，上述式(I)中，X0所示的二价有机基团选自由-C(CF3)2-、b-7～b-9和c-7～c-9组成的组；并且，Y选自由e-1、e-3和e-4组成的组中。
包含上述式(I)所示的结构单元的聚酰亚胺树脂可以通过将由酸二酐与二胺的聚合得到的聚酰胺酸进行煅烧的方法而得到。需要说明的是，上述“包含上述式(I)所示的结构单元的聚酰亚胺树脂”的酰亚胺化率也可以不为100％。即，包含式(I)所示的结构单元的聚酰亚胺树脂可以仅由上述式(I)所表示的结构单位构成，但是也可以在不损害本发明的目的效果的范围内在其一部分包含环状酰亚胺结构未脱水闭环而保持为酰胺酸的结构单元。
聚酰胺酸合成反应优选在有机溶剂中进行。作为聚酰胺酸合成反应中使用的有机溶剂，只要能够使作为原料的酸二酐与二胺的反应高效地进行、并且对这些原料呈惰性，则没有特别限定。可以列举例如N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N，N-二甲基乙酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜、环丁砜、甲基异丁基酮、乙腈、苯甲腈、硝基苯、硝基甲烷、丙酮、甲基乙基酮、异丁基酮、甲醇等极性溶剂；甲苯、二甲苯等非极性溶剂等。其中，优选使用极性溶剂。这些有机溶剂可以单独使用，也可以以两种以上的混合物的形式使用。酰胺化反应后的反应混合物可以直接供于热酰亚胺化。上述聚酰胺酸溶液中的上述聚酰胺酸的浓度没有特别限定，从所得到的树脂组合物的聚合反应性和聚合后的粘度、在之后的制膜、煅烧中的处理容易性的方面出发，优选为5重量％以上，更优选为10重量％以上，优选为50重量％以下，更优选为40重量％以下。
将上述聚酰胺酸通过热酰亚胺化或化学酰亚胺化中的任一者进行酰亚胺化，得到含有含氟聚酰亚胺的树脂组合物。在特定的实施方式中，通过加热处理对上述聚酰胺酸进行酰亚胺化(热酰亚胺化)，得到含有含氟聚酰亚胺的树脂组合物。通过热酰亚胺化得到的聚酰亚胺不存在残留催化剂的可能性，在细胞培养用途中是更优选的。
在通过热酰亚胺化进行酰亚胺化的情况下，例如将上述聚酰胺酸在空气中、或者更优选在氮气、氦气、氩气等不活泼气体气氛下、或者在真空中，在温度优选为50～400℃、更优选为100～380℃、时间优选为0.1～10小时、更优选为0.2～5小时的条件下煅烧而进行酰亚胺化反应，由此能够得到包含聚酰亚胺的树脂组合物。
供于热酰亚胺化反应的上述聚酰胺酸优选为溶解于适当的溶剂中的形态。作为溶剂，只要将聚酰胺酸溶解即可，也可以使用上述关于聚酰胺酸合成反应记载的溶剂。
在通过化学酰亚胺化进行酰亚胺化的情况下，可以在适当的溶剂中通过使用后述的脱水环化试剂而直接对聚酰胺酸进行酰亚胺化。
上述脱水环化试剂只要具有将聚酰胺酸进行化学脱水环化而形成聚酰亚胺的作用，则可以没有特别限制地使用。作为这样的脱水环化试剂，从能够高效地促进酰亚胺化的观点出发，优选单独使用叔胺化合物、或者将叔胺化合物与羧酸酐组合使用。
作为叔胺化合物，可以列举例如三甲胺、三乙胺、三丙胺、三丁胺、吡啶、1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(DABCO)、1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯、1，5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯、N，N，N’，N’-四甲基二氨基甲烷、N，N，N’，N’-四甲基乙二胺、N，N，N’，N’-四甲基-1，3-丙二胺、N，N，N’，N’-四甲基-1，4-苯二胺、N，N，N’，N’-四甲基-1，6-己二胺、N，N，N’，N’-四乙基甲二胺、N，N，N’，N’-四乙基乙二胺等。这些之中，特别优选吡啶、DABCO、N，N，N’，N’-四甲基二氨基甲烷，更优选DABCO。叔胺可以仅为一种，也可以为两种以上。
作为羧酸酐，可以列举例如乙酸酐、三氟乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐、异丁酸酐、琥珀酸酐、马来酸酐等。这些之中，特别优选乙酸酐、三氟乙酸酐，更优选乙酸酐。羧酸酐可以仅为一种，也可以为两种以上。
作为在化学酰亚胺化中溶解聚酰胺酸的溶剂，优选溶解性优良的极性溶剂。可以列举例如四氢呋喃、N，N-二甲基乙酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜等，这些之中，从使反应均匀的观点出发，特别优选为选自由N，N-二甲基乙酰胺、N，N-二甲基甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮组成的组中的一种以上。在使用这些溶剂作为酰胺化反应的溶剂的情况下，可以不从酰胺化反应后的反应混合物中分离出聚酰胺酸而直接将其用于化学酰亚胺化。
聚酰亚胺树脂的重均分子量例如为5000～2000000，优选为8000～1000000，进一步优选为20000～500000。需要说明的是，本说明书中，树脂的重均分子量为利用下述方法测定的值。通过使重均分子量为上述范围，聚酰亚胺树脂的合成和处理、膜化、球状体形成性更为良好。
(重均分子量的测定)
装置：东曹株式会社制造的HCL-8220GPC
柱：TSKgel Super AWM-H
洗脱液(含有LiBr·H2O、磷酸的NMP)：0.01mol/L
测定方法：利用洗脱液制作0.5重量％的溶液，基于利用聚苯乙烯制作的校准曲线算出分子量。
关于细胞粘附性物质或细胞粘附性表面[疏水性(特别是非超疏水性的疏水性)的细胞粘附性物质或细胞粘附性表面]，优选静态水接触角可以为70°以上、滚落角可以为15°以上，另外，可以静态水接触角为70°以上且滚落角为15°以上。
通过使细胞粘附性物质或细胞粘附性表面满足这样的条件，更进一步促进球状体形成。
从球状体的粘附性和球状体形成性的观点出发，静态水接触角更优选为75°以上(例如大于75°)，进一步优选为77°以上，进一步优选为79°以上，更进一步优选为80°以上(例如大于80°)，静态水接触角的上限例如小于150°，优选为120°以下(例如小于120°)，更优选为110°以下，进一步优选为100°以下(例如，小于99°、98°以下、97°以下、95°以下等)。
另一方面，细胞粘附性物质或细胞粘附性表面[亲水性(特别是非超亲水性的亲水性)的细胞粘附性物质或细胞粘附性表面]可以具有65°以下、更优选为55°以下、进一步优选为50°以下的静态水接触角。需要说明的是，下限值可以为0°以上，优选可以为5°以上，更优选可以为10°以上。
从球状体形成性的观点出发，滚落角按照18°以上、19°以上、20°以上、22°以上、24°以上、26°以上、28°以上、30°以上的顺序越高越优选。滚落角的上限值例如小于80°，优选为70°以下(例如小于70°)，更优选为60°以下(例如小于60°)，进一步优选为50°以下(例如小于50°)。需要说明的是，上述的静态水接触角和滚落角可以为利用下述方法测定的值。
(静态水接触角的测定方法)
装置：自动接触角仪(协和界面科学制：DM-500)
测定方法：在表面(细胞非粘附性表面或细胞粘附性表面)或膜(由细胞非粘附性或细胞粘附性的物质形成的膜)上滴加2μL水后，立即测定液滴的附着角度(测定温度：25℃)。
(滚落角的测定方法)
装置：自动接触角仪(协和界面科学制：DM-500)
测定方法：在表面(细胞非粘附性表面或细胞粘附性表面)或膜(由细胞非粘附性或细胞粘附性的物质形成的膜)上滴加25μL水后，将基材连续地倾斜，将流下时的角度作为滚落角(测定温度：25℃)。
另外，从提高所得到的球状体的尺寸均匀性、圆形度的观点出发，获得细胞粘附性表面与细胞非粘附性表面的粘附程度的平衡也很重要。因此，即使细胞非粘附性表面显示粘附性，只要粘附性比细胞粘附性表面低即可。例如，在以上述静态水接触角为指标的情况下，细胞粘附性表面(或细胞粘附性物质)与细胞非粘附性表面(或细胞非粘附性物质)的静态水接触角之差(或其绝对值)优选为3°以上(例如5°以上)，更优选为10°以上(例如12°以上)，进一步优选为15°以上。另外，上限可以根据细胞非粘附性物质(表面)和细胞粘附性物质(表面)的疏水性/亲水性的组合等而适当选择，没有特别限定，例如可以为100°、90°、80°、70°、60°、50°、40°、30°等。
构成细胞粘附性表面的树脂可以进一步含有增塑剂、抗氧化剂等添加剂成分。
作为显示细胞粘附性的表面在凹部的底面中所占的比例，没有特别限定，优选在凹部的底面中占90％以上、占95％以上、占99％以上、实质上占整个底面。
凹部具有上述的结构，但在本发明的细胞培养用片中，从简化细胞培养片制造的观点出发，优选也作为凹部的边缘部的片表面具有细胞非粘附性表面。通过具有该构成，接种于边缘部的细胞也容易在凹部内形成球状体。例如，在图1中，以片表面12示出。片表面的细胞非粘附性表面可以是与凹部的内侧面相同的细胞非粘附性表面，也可以是不同的细胞非粘附性表面。在相同的细胞非粘附性表面的情况下，片表面与凹部的内侧面具有连续的表面。显示细胞非粘附性的表面在也作为凹部的边缘部的片表面中所占的比例没有特别限定，优选在凹部的边缘部中占90％以上、占95％以上、占99％以上、实质上占整个边缘部。作为显示细胞非粘附性的表面在凹部的边缘部与凹部的内侧面的合计中所占的比例，没有特别限定，优选在凹部的边缘部与凹部的内侧面的合计中占90％以上、占95％以上、占99％以上、实质上占整个的边缘部和内侧面。
作为参考，在图4和图5中示意性地示出本发明的细胞培养用片的凹部中的细胞培养状态。本发明的细胞培养用片具有多个上述凹部结构，但根据图4和图5也可以说，本发明的细胞培养用片是包括包含凹部的底面的层与包含凹部的内侧面的层的层状结构物。在此，包含凹部的内侧面的层是指，层本身构成了具有贯通孔的层。因此，作为本发明的细胞培养用片的一个方式，可以列举作为具有贯通孔的具有细胞非粘附性表面的层与具有细胞粘附性表面的层的层叠物的方式。
具有细胞非粘附性表面的层可以是将显示细胞非粘附性的物质固定化于层状的基材上而成的层，也可以是由显示细胞非粘附性的物质构成的层，从形成贯通孔的观点出发、或者从简化细胞培养用片的制造的观点出发，优选将显示细胞非粘附性的物质固定化于层状的基材上而成的层。通过制成这样的形态，细胞培养片的制造变得更简便，进而，通过例如在基材形成贯通孔或凹部后固定显示细胞非粘附性的物质等，还能够消除细胞非粘附表面伴随细胞培养片的凹部形成而受到损伤的情况，因此，从提高细胞培养片的细胞培养特性的观点出发也是优选的。
作为层状的基材，可以使用该技术领域中公知的基材。可以列举例如由聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚缩醛、聚酯(聚对苯二甲酸乙二醇酯等)、聚氨酯、聚砜、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯基、聚环烯烃、聚醚酮、聚醚醚酮、聚酰亚胺、有机硅等合成树脂、EPDM(三元乙丙橡胶；Ethylene Propylene Diene Monomer)等合成橡胶或天然橡胶、玻璃、陶瓷、不锈钢等金属材料等形成的板状体。透明基材也是优选的方式之一。
显示细胞非粘附性的物质在层状的基材上的固定化可以与上述将显示细胞非粘附性的物质固定化于凹部的内侧面的方法同样地进行。需要说明的是，从操作性的观点出发，优选在形成后述的贯通孔后进行固定化。
具有细胞非粘附性表面的层优选包含本发明的细胞培养用片的片表面和贯通孔。上述贯通孔优选其壁相当于上述凹部的内侧面，开口部及其相反的端部的孔径、形状可以与上述凹部同样地设定。另外，贯通孔的深度相当于具有细胞非粘附性表面的层的厚度，也相当于上述凹部的深度，可以与凹部同样地设定。需要说明的是，在将显示细胞非粘附性的物质固定化于层状的基材上的情况下，作为显示细胞非粘附性的物质的层，例如优选为1nm以上，更优选为10nm以上，包含显示细胞非粘附性的物质的层和基材在内的层整体的厚度只要在上述具有细胞非粘附性表面的层的厚度的范围内则可以适当设定。
关于贯通孔的形成，只要能够形成上述尺寸的贯通孔，则可以没有特别限定地实施。可以通过例如钻孔加工(钻头等)、光微细加工(激光(例如CO2激光、准分子激光、半导体激光、YAG激光)等)、蚀刻加工、压花加工等而形成。上述加工中，可以是使贯通孔的形状为锥形的加工，此时，端部的周围发生变形，例如如图5所示，可以形成开口部的边缘部和位于与开口部相邻的开口部的中间区域的部分的层厚度不同的结构。
具有细胞粘附性表面的层可以是将显示细胞粘附性的物质固定化于层状的基材上而成的层，也可以是由显示细胞粘附性的物质构成的层。
具有细胞粘附性表面的层的厚度例如为1nm以上且4mm以下，优选为1μm以上且1mm以下，可以与上述凹部的底面的厚度相同。
作为本发明的细胞培养用片，还包括在上述具有细胞粘附性表面的层与具有细胞非粘附性表面的层之间进一步包含粘接层(粘合层)的方式。例如，图6中示出其一例，示出了在由显示细胞粘附性的物质22构成的层与固定化有显示细胞非粘附性的物质21的部分之间包含粘接层23的方式。
作为粘接层，可以使用该技术领域中公知的粘接层。可以列举例如有机硅系树脂、合成橡胶、天然橡胶等，可以优选使用低溶出性的粘接层。可以优选使用市售的双面胶带等。
粘接层的厚度没有特别限定，可以在不损害本发明效果的范围内适当设定。可以例示例如0.5～100μm。
本发明的细胞培养用片可以层叠有上述以外的层，也可以层叠有具有空洞的层。
本发明的细胞培养用片的厚度没有特别限定，从操作性的观点出发，优选为10～5000μm，更优选为100～2000μm。另外，片面积也没有特别限定，例如可以例示0.01～10000cm2，优选可以例示0.03～5000cm2。
本发明的细胞培养用片可以直接设置于公知的细胞培养装置中来使用。此时，可以根据对象装置的尺寸适当进行定尺加工。
能够适用于本发明的细胞培养用片的细胞没有限定。例如，若是相互形成结合而能够形成细胞集合体的细胞，通过使用本发明的细胞培养用片，使细胞粘附于凹部底面的细胞粘附性表面而进行培养，由此，既容易进行培养基更换等，也能够降低更换培养基时的细胞损失，能够简便地制备球状体。无论作为来源的动物、脏器、组织的种类如何，均可以适当选择使用与目的相应的任意种类的细胞。
具体而言，可以使用例如来源于人或人以外的动物(猴、猪、狗、大鼠、小鼠等)的任意的脏器或组织(脑、肝脏、胰脏、脾脏、心脏、肺、肠、软骨、骨、脂肪、肾脏、神经、皮肤、骨髓、胚胎等)的原代细胞、确立的株化细胞、或者对它们实施基因操作等而得到的细胞。
更具体而言，可以使用例如ES细胞、iPS细胞、神经干细胞、间充质干细胞、组织干细胞(成体干细胞)、造血干细胞、癌干细胞以及其他未分化的干细胞或祖细胞。另外，也可以使用例如肝脏系细胞、胰脏系细胞等来源于消化系统脏器的细胞、肾脏系细胞、神经系细胞、心肌细胞等来源于循环系统脏器的细胞、脂肪细胞、来源于皮肤真皮等结缔组织的成纤维细胞、来源于皮肤表皮等上皮系组织的上皮细胞、骨系细胞、软骨系细胞、来源于视网膜等眼组织的细胞、血管系细胞、造血细胞、生殖系细胞等分化的细胞。另外，也可以使用癌化的细胞。作为这样的细胞，可以单独使用一种细胞，或者也可以将两种以上的细胞以任意的比率混合使用。
本发明的细胞培养用片只要具有上述构成，则其制造方法没有特别限定，从制造效率的观点出发，优选下述制造方法：其特征在于，将具有多个直径1000μm以下的贯通孔的具有细胞非粘附性表面的层与具有细胞粘附性表面的层依次层叠。
具有细胞非粘附性表面的层、具有细胞粘附性表面的层各层的制备可以参考本发明的细胞培养用片的项。具有细胞非粘附性表面的层中的贯通孔的形成也同样。
层叠方法可以是将预先制备的各层依次层叠的方法，也可以是在预先制备的层上另行形成层的方法，也可以将这些方法组合。具体而言，例如可以在对表面进行了剥离处理的脱模片(例如聚乙烯基材等的有机聚合物膜、陶瓷、金属等)上通过流延、旋涂、辊涂等方法以适当的厚度涂敷显示细胞粘附性的物质，并进行加热，由此以片状成形出具有细胞粘附性表面的层。另一方面，可以在对具有细胞非粘附性表面的层的基材形成贯通孔后，在表面涂布显示细胞非粘附性的物质，预先制备具有细胞非粘附性表面的层。然后，将上述成形出的具有细胞粘附性表面的层的剥离片剥离后，层叠另行制备的具有细胞非粘附性表面的层，由此进行制造。需要说明的是，在具有细胞非粘附性表面的层与具有细胞粘附性表面的层的层叠中，可以使用上述粘接层(粘合层)进行层叠，或者也可以通过熔敷(高频熔敷、超声波熔敷等)、压接(热压接等)进行层叠。
对于本发明的细胞培养用片而言，可以其一个表面上载置包含细胞的培养基而实施细胞培养，或者也可以将该片收容于培养皿、烧瓶、培养袋等各种细胞培养用容器中并固定，在该容器中加入包含细胞的培养基而实施细胞培养。因此，本发明还提供包含本发明的细胞培养用片的细胞培养用器具。
作为本发明的细胞培养用器具，其本身可以为单孔板或多孔板等培养用板、培养盘、培养皿、烧瓶、培养袋等各种细胞培养用容器的形态。
另外，本发明还提供一种球状体的培养方法，其特征在于，利用本发明的细胞培养用片或细胞培养用器具进行培养。
培养细胞时使用的培养基和条件可以根据所使用的细胞适当设定。需要说明的是，在使用本发明的细胞培养用片或细胞培养用器具时，优选根据需要预先进行脱泡处理。作为脱泡处理，没有特别限定，可以进行喷雾、吹打、振荡、加热冷却等温度变化、离心处理、真空脱气、超声波处理等常规处理，优选为喷雾、吹打、温度变化。
通过使用本发明的细胞培养用片，利用被分区后的形状(由多个凹部形成的形状)对接种细胞进行分选，并且发挥出基材所具有的适度的附着性，因此所得到的球状体的均匀性提高。另外，由于上述适度的附着性，培养操作时的处理性优良，仅对细胞培养用片或细胞培养用器具摇晃或者轻轻吹打也能够回收球状体。据推测，本发明的细胞培养用片尽管具有1000μm以下的微细凹部，但在各个凹部中，由细胞粘附性的底面与包围底面的细胞非粘附性的侧壁面形成特殊的粘附环境，发挥出下述效果：不仅所得到的球状体的尺寸均匀性、圆形度提高，而且收率也提高。但是，本发明不受这些推测的约束。
所得到的球状体的直径没有特别限定，例如为10～1000μm，优选为10～800μm。在此，球状体的直径可以利用常规方法(例如图像分析软件、粒度分布仪)进行测定，例如可以以流体直径、等效圆直径来表示。所得到的球状体的圆形度例如为0.5～1.0，优选为0.7～1.0。
实施例
以下，利用实施例详细地对本发明进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。需要说明的是，在以下的实施例中，室温是指20～30℃。
实施例1：细胞培养用片
<具有细胞粘附性表面的层的制备(含氟聚酰亚胺膜的制备)>
在100mL容量的三口烧瓶中投入1，4-双(氨基苯氧基)苯2.976g(10.2毫摩尔)、4，4’-六氟异亚丙基双邻苯二甲酸酐4.524g(10.2毫摩尔)、N-甲基吡咯烷酮42.5g。在氮气气氛下在室温下搅拌后，保持5天，由此得到含氟聚酰胺酸树脂组合物(固体成分浓度15.0质量％、6FDA/TPEQ聚酰胺酸)。该聚酰胺酸的重均分子量为12万、粘度为6Pa·s。需要说明的是，聚酰胺酸的重均分子量与煅烧后的含氟聚酰亚胺的重均分子量实质上相同。
使用模具式涂布机将上述得到的含氟聚酰胺酸树脂组合物按照煅烧后的含氟聚酰亚胺膜的厚度为40μm的方式涂布至玻璃基体上，形成涂膜。接着，在360℃下在氮气气氛下进行1小时涂膜的煅烧。然后，将煅烧物从玻璃基体上剥离，得到含氟聚酰亚胺膜。该含氟聚酰亚胺膜的静态水接触角为83.0°、滚落角为24.0°。
上述中的物性的测定方法如下所述。
(重均分子量的测定)
装置：东曹株式会社制造的HCL-8220GPC
柱：TSKgel Super AWM-H
洗脱液(含有LiBr·H2O、磷酸的NMP)：0.01mol/L
测定方法：利用洗脱液制作0.5重量％的溶液，基于利用聚苯乙烯制作的校准曲线算出分子量。
(粘度的测定)
装置：AS ONE制造的粘度计VISCOMETER TV-22
设定：VI范围：H转子No.6速度：10rpm
粘度计校正用标准液：日本润滑脂株式会社JS 14000
测定方法：利用粘度计校正用标准液进行校正后，使用0.3g清漆进行测定(测定温度：23℃)。
(静态水接触角的测定)
装置：自动接触角仪(协和界面科学制：DM-500)
测定方法：在膜上滴加2μL水后，立即测定液滴的附着角度(测定温度：25℃)。
(滚落角的测定)
装置：自动接触角仪(协和界面科学制：DM-500)
测定方法：在膜上滴加25μL水后，将基材连续地倾斜，将流下时的角度作为滚落角(测定温度：25℃)。
<具有细胞非粘附性表面的层的制备>
将双面胶带(厚度25μm)的单面的剥离带剥离后，贴合于透明的PET膜(厚度250μm)上，对于所得物，使用CO2激光，形成直径300μm、以间距500μm交错配置的贯通孔(所形成的贯通孔：400个/cm2、24000个/片、激光入射侧孔径500μm、激光射出侧孔径300μm)。然后，使用旋涂机(MIKASA制：MS-A150)在PET膜侧的表面以厚度为0.05μm的方式涂布(旋转条件：1000rpm、10秒钟)MPC聚合物溶液(0.5％乙醇溶液、疏水性MPC聚合物)，在50℃的干燥机内进行2小时干燥处理，得到具有细胞非粘附性表面的层[PET膜的涂层(MPC聚合物的涂层)侧的静态水接触角107.5°]。
<细胞培养用片和培养容器的制备>
接着，将具有细胞非粘附性表面的层的双面胶带的另一个剥离带除去，在该侧的表面上贴合上述制作的具有细胞粘附性表面的层，制备细胞培养用片(片厚度：315μm)。将所得到的细胞培养片设置于培养板内，完成用于细胞培养的容器。
试验例1
细胞使用来源于人脂肪的干细胞(Human adipose derived stem cell：AdSC)。AdSC购入制造品(LONZA公司、PT-5006)来使用。
<细胞的扩大培养>
将冷冻细胞在37℃的恒温水槽中溶解，加入到含有5％FBS、1％抗生素的KBMADSC-2培养基(基础培养基、KOHJIN BIO制造)9mL中。接着，以500×g实施5分钟的离心处理后，除去上清并分散于10mL的基础培养基中。在800mL容积的细胞培养用烧瓶(住友电木制造)中，按照加入细胞悬浮液后的总量为30mL的方式预先加入基础培养基，以1.0×106细胞/烧瓶的方式向其中加入细胞悬浮液，在37℃的5％(v/v)CO2温箱内进行培养(扩大培养)。
<脱泡处理>
另行进行实施例1的培养容器的脱泡处理。具体而言，向容器中加入约25mL的PBS，反复进行两次吹打的操作，进行脱泡。接着，加入含有1％抗生素的KBM ADSC-2培养基12mL，在37℃的5％(v/v)CO2温箱内静置一晚。
<球状体的培养>
从培养用烧瓶中除去培养基，添加5mL细胞剥离液accutase(PromoCell制造)后，在37℃的5％(v/v)CO2温箱内保持约5分钟，将细胞剥离。接着，回收剥离液，使用PBS使总量为25mL，移入试管中。以500×g实施5分钟离心处理，用10mL的含有1％抗生素的KBM ADSC-2培养基悬浮，进行细胞数的计数。然后，制备成1.0×106细胞/mL的浓度。
在37℃的5％(v/v)CO2温箱内静置一晚，进行脱泡处理后，除去培养容器的培养基，以达到500细胞/孔或200细胞/孔的方式接种细胞。在生物安全柜内静置15分钟后，放入到37℃的5％(v/v)CO2温箱中静置4小时。接着，补充添加含有1％抗生素的KBM ADSC-2培养基，再次放入到37℃的5％(v/v)CO2温箱中进行培养(培养第0天)。培养实施至第14天。每3天一次用含有1％抗生素的KBM ADSC-2培养基对全部培养基实施更换。需要说明的是，在培养基更换时等，即使对培养容器施加振动，球状体也不会飞出，球状体的回收通过吹打来进行。
<球状体的形态评价>
在培养第3天、第6天、第14天对球状体进行拍摄(图7)，利用图像分析软件WinROOF(三谷商事制)对球状体的等效圆直径、流体直径、圆形度进行分析(图8～10)。
结果，所得到的球状体的尺寸均匀性(500细胞/孔：等效圆直径151～179μm、SD 14～16μm；200细胞/孔：等效圆直径116～130μm、SD 14～15μm)高，圆形度高(500细胞/孔：圆形度0.841～0.873、SD 0.067～0.083；200细胞/孔：圆形度0.849～0.882、SD 0.080～0.086)。另外还可知，通过改变接种细胞数，可得到大小不同的球状体。因此，通过使用本发明的细胞培养用片，能够稳定且容易地获得均匀且大量的球状体。
试验例2
使用与实施例1同样地制备并进行了脱泡处理的细胞培养片，进行来源于人骨髓的间充质干细胞株(UE7T-13细胞；JCRB1154)的培养。培养基使用DMEM+10％FBS。
具体而言，在细胞培养片上按照培养基量为22mL的方式接种4.8×106细胞(每孔200细胞)，在37℃的5％(v/v)CO2温箱内培养3天。培养中不进行培养基更换。在培养第3天、第4天评价球状体的形态。
评价如下进行：从A地点至I地点将细胞培养片划分为9个区域(图11)，对于各个区域，拍摄球状体，利用图像分析软件WinROOF(三谷商事制)对球状体的等效圆直径进行分析(图12示出培养第3天的分析结果)。
结果可知，所得到的球状体的尺寸均匀性高(培养第3天：等效圆直径96μm、SD 8μm；培养第4天：等效圆直径97μm、SD 9μm)，并且不因分区而变动。
试验例3
使细胞培养片中接种细胞数为1.2×107细胞(每孔500细胞)，除此以外，与试验例2同样地对细胞进行培养，在培养第1天对球状体的等效圆直径进行评价(图13)。
结果可知，所得到的球状体的尺寸均匀性高(培养第1天：等效圆直径151μm、SD 11μm)，并且不因分区而变动。
实施例2～5
如下进行具有细胞粘附性表面的层的制备(含氟聚酰亚胺膜的制备)，除此以外，与实施例1同样地制备细胞培养用容器。需要说明的是，各实施例中的聚酰胺酸的重均分子量与煅烧后的含氟聚酰亚胺的重均分子量实质上相同。
实施例2：6FDA/TFMB
在500mL容量的三口烧瓶中投入溶解4，4’-六氟异亚丙基双邻苯二甲酸酐21.792g(0.049摩尔)、N-甲基吡咯烷酮148.75g。向其中滴加投入加入溶解有2，2’-双(三氟甲基)联苯胺15.708g(0.049摩尔)、N-甲基吡咯烷酮63.75g的物质，在氮气气氛下在室温下搅拌后，保持5天，由此得到含氟聚酰胺酸树脂组合物(固体成分浓度15质量％、6FDA/TFMB聚酰胺酸)。该聚酰胺酸的重均分子量为18.9万、粘度为9.1Pa·s。使用所得到的含氟聚酰胺酸树脂组合物，与实施例1同样地得到含氟聚酰亚胺膜。该含氟聚酰亚胺膜的静态水接触角为82.1°、滚落角为19.9°。
实施例3：6FDA/ODA
在500mL容量的三口烧瓶中投入溶解4，4’-六氟异亚丙基双邻苯二甲酸酐26.89g(0.058摩尔)、N-甲基吡咯烷酮154.7g。向其中滴加投入加入溶解有4，4’-二氨基二苯醚12.11g(0.058摩尔)、N-甲基吡咯烷酮66.3g的物质，在氮气气氛下在室温下搅拌后，保持5天，由此得到含氟聚酰胺酸树脂组合物(固体成分浓度15质量％、6FDA/ODA聚酰胺酸)。该聚酰胺酸的重均分子量为15.3万、粘度为7.7Pa·s。使用所得到的含氟聚酰胺酸树脂组合物，与实施例1同样地得到含氟聚酰亚胺膜。该含氟聚酰亚胺膜的静态水接触角为79.5°、滚落角为31.0°。
实施例4：6FDA/BAPP
在500mL容量的三口烧瓶中投入溶解4，4’-六氟异亚丙基双邻苯二甲酸酐19.49g(0.044摩尔)、N-甲基吡咯烷酮148.75g。向其中滴加投入加入溶解有2，2-双(4-(4-氨基苯氧基)苯基)丙烷18.01g(0.044摩尔)、N-甲基吡咯烷酮63.75g的物质，在氮气气氛下在室温下搅拌后，保持5天，由此得到含氟聚酰胺酸树脂组合物(固体成分浓度15质量％、6FDA/BAPP聚酰胺酸)。该聚酰胺酸的重均分子量为18.5万、粘度为7.1Pa·s。使用所得到的含氟聚酰胺酸树脂组合物，与实施例1同样地得到含氟聚酰亚胺膜。该含氟聚酰亚胺膜的静态水接触角为82.5°、滚落角为32.2°。
实施例5：6FDA/BAPB
在500mL容量的三口烧瓶中投入溶解4，4’-六氟异亚丙基双邻苯二甲酸酐20.50g(0.046摩尔)、N-甲基吡咯烷酮148.75g。向其中滴加投入加入溶解有4，4’-双(4-氨基苯氧基)联苯17.00g(0.046摩尔)、N-甲基吡咯烷酮63.75g的物质，在氮气气氛下在室温下搅拌后，保持5天，由此得到含氟聚酰胺酸树脂组合物(固体成分浓度15质量％、6FDA/BAPB聚酰胺酸)。该聚酰胺酸的重均分子量为11.2万、粘度为8.1Pa·s。使用所得到的含氟聚酰胺酸树脂组合物，与实施例1同样地得到含氟聚酰亚胺膜。该含氟聚酰亚胺膜的静态水接触角为79.0°、滚落角为32.2°。
试验例4
所使用的细胞使用与试验例1相同的细胞。
<来源于人脂肪的干细胞的扩大培养>
将冷冻细胞在37℃的恒温水槽中溶解，加入到含有5％FBS、1％抗生素的KBMADSC-2培养基(基础培养基、KOHJIN BIO制造)9mL中。接着，以210×g实施5分钟的离心处理后，除去上清并分散于1mL的基础培养基中。在800mL细胞培养用烧瓶(住友电木制造)中，按照加入细胞悬浮液后的总量为30mL的方式预先加入基础培养基，以1.0×106细胞/烧瓶的方式向其中加入细胞悬浮液，在37℃的5％(v/v)CO2温箱内进行培养。
<容器的脱泡处理>
对实施例2～5的培养容器进行脱泡处理。具体而言，向容器中加入约2ML的PBS，反复进行两次吹打的操作，进行脱泡。接着，加入含有1％抗生素的KBM ADSC-2培养基0.2mL，在37℃的5％(v/v)CO2温箱内静置一晚。
<球状体的培养>
从培养用烧瓶中除去培养基，添加5mL细胞剥离液accutase(PromoCell制造)后，在37℃的5％(v/v)CO2温箱内保持约5分钟，将细胞剥离。接着，回收剥离液，使用PBS使总量为15mL，移入试管中。以210×g实施5分钟离心处理，用2mL的含有1％抗生素的KBM ADSC-2培养基悬浮，进行细胞数的计数。然后，制备成1.0×106细胞/mL的浓度。
将在37℃的5％(v/v)CO2温箱内静置一晚后的培养容器的培养基除去，以达到500细胞/孔的方式接种细胞。然后，与试验例1同样地开始培养，培养实施至第3天。与试验例1同样地拍摄所得到的球状体的形态。将结果示于图14。
由此可知，即使细胞粘附性表面的树脂种类、细胞种类不同，也可形成球状体。另外，所形成的球状体的均匀性也与上述试验例同样高。
可知本发明的细胞培养片制备简便，细胞培养操作也容易，还能够使所得到的细胞组织体的均匀性也良好。
产业上的可利用性
本发明的细胞培养片能够简便地制备，并且细胞培养的操作本身也能够高效地进行，因此能够适合用于例如含球状体的制剂等细胞制剂的领域。
标号说明
1 细胞培养用片
11 凹部
11a 凹部的内侧面
11b 凹部的底面
12 片表面
21 显示细胞非粘附性的物质
22 显示细胞粘附性的物质
23 粘接层

Claims (10)

1.一种细胞培养用片，其具有多个开口部的口径为直径1000μm以下的凹部，该凹部的内侧面具有细胞非粘附性表面，并且该凹部的底面具有细胞粘附性表面。
2.如权利要求1所述的细胞培养用片，其为具有贯通孔的具有细胞非粘附性表面的层与具有细胞粘附性表面的层的层叠物。
3.如权利要求2所述的细胞培养用片，其中，在具有细胞非粘附性表面的层与具有细胞粘附性表面的层之间进一步包含粘接层。
4.如权利要求1～3中任一项所述的细胞培养用片，其中，细胞粘附性表面由合成树脂构成。
5.如权利要求1～4中任一项所述的细胞培养用片，其中，细胞粘附性表面由包含聚酰亚胺的树脂组合物构成。
6.如权利要求1～5中任一项所述的细胞培养用片，其中，凹部朝向底面侧形成为锥状。
7.如权利要求1～6中任一项所述的细胞培养用片，其中，凹部以每单位面积(cm2)10～1000个的个数形成。
8.一种细胞培养用片的制造方法，其中，将具有多个直径1000μm以下的贯通孔的具有细胞非粘附性表面的层和具有细胞粘附性表面的层进行层叠。
9.一种细胞培养用器具，其包含权利要求1～7中任一项所述的细胞培养用片。
10.一种球状体的培养方法，其中，利用权利要求1～7、9中任一项所述的细胞培养用片或细胞培养用器具进行培养。
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