WO2020246572A1 - 細胞及び／又はその集合体の回収方法 - Google Patents

細胞及び／又はその集合体の回収方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2020246572A1
WO2020246572A1 PCT/JP2020/022235 JP2020022235W WO2020246572A1 WO 2020246572 A1 WO2020246572 A1 WO 2020246572A1 JP 2020022235 W JP2020022235 W JP 2020022235W WO 2020246572 A1 WO2020246572 A1 WO 2020246572A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell
liquid
recess
cells
diameter
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/022235
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
朋未 牧野
史明 島
Original Assignee
株式会社日本触媒
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社日本触媒 filed Critical 株式会社日本触媒
Priority to JP2021524917A priority Critical patent/JP7263512B2/ja
Publication of WO2020246572A1 publication Critical patent/WO2020246572A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/26—Inoculator or sampler
    • C12M1/28—Inoculator or sampler being part of container

Definitions

  • the present invention relates to a method for recovering cells and / or an aggregate thereof.
  • Patent Document 1 a method of precipitating cultured cells by using a medium containing cellulose nanofibers during cell culture to disrupt a network of cellulose nanofibers formed in the medium by applying a light impact or the like. It is disclosed.
  • Patent Document 2 discloses a method of collecting cells in the form of a sheet by seeding cells on a temperature-responsive polymer to form a cell sheet and then stimulating a low temperature treatment to peel the cells. ing.
  • An object of the present invention is to provide a method for recovering a novel cell and / or an aggregate thereof, and a cell population recovered by the above method.
  • Another object of the present invention is to provide a simple and efficient method for recovering cells and / or an aggregate thereof.
  • the present inventors have stably fed the liquid from a member having a specific diameter to the culture vessel in a culture vessel having a small diameter of the culture compartment (well). Therefore, they have found that cells can be recovered easily and efficiently, and further studies have been carried out to complete the present invention.
  • the present invention relates to the following [1] to [10].
  • Liquid is fed to a cell culture substrate containing cells in a recess having an opening having a diameter of 1000 ⁇ m or less, from a liquid feeding port having a diameter of 3 mm or less, and / or at a flow velocity of 100 cm / s or more.
  • a method for recovering cells and / or an aggregate thereof which comprises a step of feeding a solution.
  • [2] The method according to [1] above, wherein the liquid is sent at a flow rate of 0.001 mL / s or more per 1 cm 2 of the opening area.
  • the cell culture substrate has a plurality of recesses having a pore diameter of 1000 ⁇ m or less at the opening, the inner surface of the recess has a non-cell adhesive surface, and the bottom surface of the recess is cell adhesive.
  • the method according to any one of [1] to [5] above which is a cell culture sheet having a surface.
  • cells and / or aggregates thereof can be easily and efficiently recovered.
  • FIG. 1 is a photograph of a culture vessel before collecting spheroids in Example 1.
  • FIG. 2 is a photograph of the culture vessel after collecting the spheroids in Example 1.
  • the method for recovering cells and / or an aggregate thereof of the present invention is to use a cell culture substrate having a recess with a diameter of 1000 ⁇ m or less at the opening, from a liquid feed port having a diameter of 3 mm or less, and / or. Includes the step of feeding the liquid for feeding at a flow velocity of 100 cm / s or more.
  • the cells and / or their aggregates existing in the recesses of the cell culture substrate may be peeled from the recesses or released to the outside of the recesses, and can be recovered as they are.
  • the recovery method of the present invention can be applied to any cell culture substrate having a recess having a diameter of 1000 ⁇ m or less on the surface of the opening, and cells can be cultured in the recess.
  • the diameter of the recess is not particularly limited as long as it has a diameter of 1000 ⁇ m or less, and may be, for example, 800 ⁇ m or less, 600 ⁇ m or less, 500 ⁇ m or less, 400 ⁇ m or less, or 300 ⁇ m or less. Further, the lower limit is not particularly set, and for example, 10 ⁇ m can be mentioned.
  • the diameter of the recess is the maximum diameter of the opening.
  • the area of the opening of the recess is, for example, in the range of 0.5 ⁇ 10 -3 to 5.0 ⁇ 10 -1 cm 2 per recess, 1.0 ⁇ 10 -1 cm 2 , 5.0 ⁇ 10 -2 cm. 2 , 2.0 ⁇ 10 -2 cm 2 , 1.0 ⁇ 10 -2 cm 2 , 5.0 ⁇ 10 -3 cm 2 , 2.5 ⁇ 10 -3 cm 2 , 2.0 ⁇ 10 -3 cm 2 , 1.0 ⁇ 10 -3 cm 2, etc. Is exemplified.
  • the depth of the recess is not particularly limited as long as the cells can be cultured, and can be appropriately set according to the common general knowledge of the art depending on the size of the cells to be cultured, the method of forming the recess, and the like.
  • the depth of the recess may be 10 nm or more (for example, 100 nm or more), and is within a range of 1 ⁇ m or more [for example, 5 ⁇ m or more, 10 ⁇ m or more (for example, 10 to 1000 ⁇ m, 10 to 300 ⁇ m)]. There may be.
  • the shape of the opening and the bottom surface (bottom) of the recess is not limited to a circle, and may be, for example, a polygon or an ellipse, and the shape of the bottom surface may be the same as or different from the shape of the opening. Good. Further, the bottom surface may be flat (flat), curved, or smooth, but it is more preferable that the bottom surface is flat and / or smooth.
  • the area of the bottom surface is, for example, in the range of 0.5 ⁇ 10 -3 to 5.0 ⁇ 10 -1 cm 2 per recess, 1.0 ⁇ 10 -1 cm 2 , 5.0 ⁇ 10 -2 cm 2 , 2.0.
  • the diameter (length) of the bottom surface may be the same as or different from the diameter of the opening, and even if the diameter of the bottom surface is smaller than the diameter of the opening, the diameter of the bottom surface is the opening. It may be larger than the caliber of. Examples of the diameter of the bottom surface include the range of 10 to 1000 ⁇ m, 10 to 700 ⁇ m, 10 to 600 ⁇ m, 10 to 500 ⁇ m, 10 to 400 ⁇ m, and 10 to 300 ⁇ m.
  • the shape of the recess is a pillar shape, and when the shape of the opening and the bottom surface is circular, a cylindrical shape is formed.
  • the shape of the recess is tapered toward the bottom surface side of the recess.
  • the ratio of the pore diameter of the bottom surface to the pore diameter of the opening is not particularly limited, but from the viewpoint of ease of seeding and recovery of cells, 5/1 to 1 / 5, 3/1 to 1/3, 1/1 to 1/2 are exemplified.
  • the distance (gap) between the opening and the adjacent opening is not particularly limited, but is, for example, 800 ⁇ m or less, 700 ⁇ m or less, 600 ⁇ m or less, 500 ⁇ m depending on the desired large-scale culture.
  • the range of 300 ⁇ m or less, 200 ⁇ m or less, 100 ⁇ m or less, etc. is exemplified, and any finite value may be used.
  • the ratio of the hole diameter of the opening to the depth of the recess is not particularly limited, but from the viewpoint of ease of seeding and recovery of cells, from 5/1 to Examples are 1/5, 3/1 to 1/3, and 2/1 to 1/1. When it is within the above range, it is difficult for cells to jump out of the recess, and it may be advantageous in terms of cell recovery.
  • the number of recesses cannot be unconditionally set depending on the area of the base material, the type of cells to be cultured and / or their aggregate, and the like, and can be appropriately set according to the common general technical knowledge.
  • the lower limit number of pieces per unit area (cm 2 ) is 1, 10, 30, 50 pieces, etc.
  • the upper limit number is 1000 pieces, 500 pieces, 300 pieces, 200 pieces, 100 pieces, etc. ..
  • the total number of recesses on the surface of the base material can be appropriately set, for example, 10 or more, 100 or more, 1000 or more, 10000 or more, 50,000 or more.
  • the material of the base material for cell culture is not particularly limited and may be any known material. Further, the entire cell culture substrate may be made of the same material, or may be made of a plurality of materials. Specifically, for example, the recess and the surface of the base material may be made of different materials, and further, they may be made of different materials depending on the position in the recess.
  • the inner surface of the recess has a non-cell adhesive surface
  • the bottom surface of the recess is a cell adhesive surface.
  • a sheet for cell culture having the above can be mentioned.
  • Such a cell culture sheet has the above-mentioned surface characteristics in addition to having a small opening diameter, which makes it easier for the culture to adhere to the substrate and makes recovery more difficult. It is possible to obtain high recovery efficiency while reducing damage.
  • the method for recovering cells and / or an aggregate thereof of the present invention can be applied to various cell culture substrates, but is preferably used for recovering cells cultured on the cell-adhesive surface of the substrate. More preferably, it is used for recovery of cells adherently cultured on a surface exhibiting appropriate cell adhesion.
  • the "cell adhesion surface” is, for example, a surface on which cells adhere to each other with a certain adhesion point when the cells settle on the surface in a solution used for culturing. ..
  • the cell adhesion surface may be composed of at least a substance exhibiting cell adhesion.
  • the substance exhibiting cell adhesion is not particularly limited as long as it can bind to cell surface molecules such as proteins and sugar chains present in the cell membrane of the cell to be used. It may be hydrophilic or hydrophobic, but from the viewpoint of cell adhesion, spheroid formation, etc., it is hydrophilic (particularly hydrophilic, not superhydrophilic) or hydrophobic. (In particular, hydrophobic ones that are not superhydrophobic) are preferable, and those exhibiting hydrophobicity are even more preferable. Further, the degree of adhesion of the substance exhibiting cell adhesion may be such that the cells do not pop out from the recess.
  • Such substances include substances obtained or synthesized from living organisms, such as proteins (collagen, fibronectin, laminin, etc.) and synthetic resins (styrene resins, polyolefin resins, etc.). , Polycycloolefin resin, polyethylene terephthalate resin, acrylic resin, fluororesin, polyimide resin, polysulfone resin, polyethersulfone resin, polydimethylsiloxane resin, mixtures thereof, surface modifiers, etc.).
  • synthetic resin is selected, a cell culture sheet having excellent handleability can be obtained from the strength and heat resistance of the synthetic resin itself.
  • a synthetic resin such as a styrene resin, a polyolefin resin or a polyimide resin.
  • non-living components such as styrene resin, polyolefin resin and polyimide resin
  • spheroids obtained by using a cell culture substrate containing styrene resin, polyolefin resin, polyimide resin and the like can be used for regenerative medicine. It will be easy to apply to fields such as and drug discovery.
  • polyimide resin a polyimide resin containing a structural unit represented by the following formula (I) can be exemplified. Further, from the viewpoint of good spheroid formation, a resin having a fluorine atom in the molecule is preferable, and a fluorine-containing polyimide (fluorine-containing polyimide resin) is more preferable.
  • the polyimide resin used in the present invention is typically obtained by imidizing a polyamic acid obtained by polymerizing one or more kinds of acid dianhydride and diamine.
  • the polyimide resin may contain polyamic acid as part of its chemical structure.
  • a method for producing the polyimide resin it may be produced by a known method. As an example, the two-stage synthesis method can be used.
  • the two-stage synthesis method of a polyimide resin is a method of synthesizing a polyamic acid as a precursor and converting the polyamic acid into a polyimide.
  • the polyamic acid as a precursor may be a polyamic acid derivative.
  • the polyamic acid derivative include a polyamic acid salt, a polyamic acid alkyl ester, a polyamic acid amide, a polyamic acid derivative from bismethylidene pyromeride, a polyamic acid silyl ester, and a polyamic acid isoimide.
  • the polyimide consists of acid anhydrides such as pyromellitic dianhydride, biphenyltetracarboxylic dianhydride, and benzophenonetetracarboxylic dianhydride, and diamines such as oxydiamine, paraphenylenediamine, metaphenylenediamine, and benzophenonediamine.
  • Polyimide can be exemplified.
  • the resin having a fluorine atom include 4,4'-hexafluoroisopropyridene diphthalic acid anhydride (6FDA) / 1,4-bis (aminophenoxy) benzene (TPEQ) copolymer, 6FDA / 1,3.
  • X 0 represents either an oxygen atom, a sulfur atom, a carbonyl group, a sulfonyl group, or a divalent organic group
  • Y represents a divalent organic group
  • Z 1 , Z 2 , Z 3 , Z 4 , Z 5 , and Z 6 independently indicate either a hydrogen atom, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom.
  • p is 0 or 1.
  • the chemical structure represented by the formula (I) may be different or the same for each constituent unit of the resin. It is preferable that at least one of X 0 , Y, Z 1 , Z 2 , Z 3 , Z 4 , Z 5 , and Z 6 contains one or more fluorine atoms.
  • the divalent organic group represented by X 0 include an alkylene group, an arylene group, an aryleneoxy group, an arylentio group and the like. Further, it may be a condensed ring type divalent hydrocarbon group, a heterocyclic condensed ring type divalent hydrocarbon group, and these oxy groups and thio groups. Among these, an alkylene group, an aryleneoxy group and an arylenthio group are preferable, an alkylene group and an aryleneoxy group are more preferable, and these may be substituted with a fluorine atom.
  • the alkylene group has, for example, 1 to 12 carbon atoms, preferably 1 to 6 carbon atoms.
  • Examples of the alkylene group substituted with a fluorine atom, which is an example of X 0 include -C (CF 3 ) 2- , -C (CF 3 ) 2- C (CF 3 ) 2-, and the like. ..
  • alkylene groups which are examples of X 0 , ⁇ C (CF 3 ) 2 ⁇ is preferable.
  • Examples of the arylene group, which is an example of X 0 include the following.
  • Examples of the arylene oxy group which is an example of X 0 , include the following.
  • arylentio group which is an example of X 0 , for example, the following can be exemplified.
  • the divalent organic group represented by X 0 is selected from the group consisting of b-2 to b-10 and c-2 to c-10. It may be selected from the group consisting of b-7 to b-9 and c-7 to c-9, and may have a structure represented by b-8.
  • arylene group is an example of X 0, arylene group and Arirenchio groups are each independently a halogen atom (e.g., fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom, preferably fluorine atom or chlorine It may be substituted with a group selected from the group consisting of an atom, more preferably a fluorine atom), a methyl group and a trifluoromethyl group.
  • the number of these substituents may be plural, and in that case, the types of the substituents may be the same or different from each other.
  • Suitable substituents substituted with an arylene group, an aryleneoxy group and an arylentio group are a fluorine atom and / or a trifluoromethyl group, preferably a fluorine atom.
  • the arylene group, the aryleneoxy group and the arylentio group are preferably substituted with at least one fluorine atom when Y does not contain a fluorine atom.
  • the divalent organic group represented by Y is not particularly limited, and examples thereof include a divalent organic group having an aromatic ring. Specifically, a group consisting of one benzene ring or a group having a structure in which two or more benzene rings are directly bonded via a carbon atom (that is, a single bond or an alkylene group), an oxygen atom, or a sulfur atom. Can be mentioned. Specifically, the following groups can be exemplified.
  • the above-mentioned divalent organic group having an aromatic ring which is an example of Y, is a halogen atom (for example, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom, preferably a fluorine atom or a chlorine atom, if substitutable. , More preferably a fluorine atom), may be substituted with a group selected from the group consisting of a methyl group and a trifluoromethyl group.
  • the number of these substituents may be plural, and in that case, the types of the substituents may be the same or different from each other.
  • a suitable substituent substituted with a divalent organic group having an aromatic ring is preferably a fluorine atom and / or a trifluoromethyl group, particularly when X 0 does not contain a fluorine atom, and is more preferable. Is a fluorine atom.
  • Y is a structure selected from the group consisting of d-3, d-9, e-1 to e-4, f-6, and f-7 in the above formula (I).
  • the structure is preferably e-1, e-3 or e-4.
  • Z 1 , Z 2 , Z 3 , Z 4 , Z 5 , and Z 6 may be the same or different from each other, and each of them independently has a hydrogen atom and a fluorine atom. , Chlorine, bromine or iodine, and if at least one of X 0 and Y does not contain a fluorine atom, then at least one of Z 1 , Z 2 , Z 3 , Z 4 , Z 5 , and Z 6 .
  • One is preferably a fluorine atom.
  • the divalent organic group represented by X 0 in the above formula (I) is ⁇ C (CF 3 ) 2- , the above b-2-b. Selected from the group consisting of -10 and c-2 to c-10; and from the group consisting of d-3, d-9, e-1 to e-4, f-6, and f-7. Be selected.
  • the divalent organic group represented by X 0 is ⁇ C (CF 3 ) 2- , b-7 to b-9 and c-7 to. Selected from the group consisting of c-9; and Y is selected from the group consisting of e-1, e-3 and e-4.
  • the polyimide resin composed of the structural unit represented by the above formula (I) can be obtained by a method of calcining a polyamic acid obtained by polymerizing an acid dianhydride and a diamine.
  • the imidization rate of the above-mentioned "polyimide resin composed of the structural unit represented by the formula (I)" does not have to be 100%. That is, the polyimide resin composed of the structural units represented by the formula (I) may be composed of only the structural units represented by the above formula (I), but as long as the objective effect of the present invention is not impaired.
  • a structural unit in which the cyclic imide structure remains as an amic acid without dehydration ring closure may be partially contained.
  • the polyamic acid synthesis reaction is carried out in an organic solvent.
  • the organic solvent used in the polyamic acid synthesis reaction is not particularly limited as long as the reaction between the acid dianhydride as a raw material and the diamine can proceed efficiently and is inert to these raw materials. ..
  • N-methylpyrrolidone N, N-dimethylacetamide, N, N-dimethylformamide, tetrahydrofuran, dimethyl sulfoxide, sulfolane, methyl isobutyl ketone, acetonitrile, benzonitrile, nitrobenzene, nitromethane, acetone, methyl ethyl ketone, isobutyl ketone.
  • Polar solvents such as methanol; non-polar solvents such as toluene and xylene. Above all, it is preferable to use a polar solvent. These organic solvents may be used alone or as a mixture of two or more.
  • the reaction mixture after the amidation reaction may be directly subjected to thermal imidization.
  • concentration of the polyamic acid in the polyamic acid solution is not particularly limited, but is preferable from the viewpoints of the polymerization reactivity of the obtained resin composition, the viscosity after the polymerization, and the ease of handling in the subsequent film formation and firing. , 5% by weight or more, more preferably 10% by weight or more, preferably 50% by weight or less, more preferably 40% by weight or less.
  • the viscosity of the resin composition is not particularly limited, but can be measured according to a known measuring method, for example, in the range of 1 to 20 Pa ⁇ s, preferably 3 to 15 Pa ⁇ s at 23 ° C. ..
  • the polyamic acid is imidized by either thermal imidization or chemical imidization to obtain a resin composition containing a fluorine-containing polyimide.
  • the polyamic acid is imidized (thermally imidized) by heat treatment to obtain a resin containing a fluorine-containing polyimide.
  • the polyimide obtained by thermal imidization has no possibility of residual catalyst and is more preferable for cell culture applications.
  • the polyamic acid When imidizing by thermal imidization, for example, the polyamic acid is placed in air, more preferably in an atmosphere of an inert gas such as nitrogen, helium, or argon, or in vacuum, preferably at a temperature of 50 to 400 ° C. , More preferably 100 to 380 ° C., preferably 0.1 to 10 hours, more preferably 0.2 to 5 hours, to carry out an imidization reaction to obtain a resin composition containing polyimide.
  • an inert gas such as nitrogen, helium, or argon
  • the polyamic acid to be subjected to the thermal imidization reaction is preferably in the form of being dissolved in a suitable solvent.
  • the solvent may be any one that dissolves polyamic acid, and the above-mentioned solvent for the polyamic acid synthesis reaction can also be used.
  • the polyamic acid can be directly imidized in a suitable solvent by using the dehydration cyclization reagent described later.
  • the dehydration cyclization reagent can be used without particular limitation as long as it has an action of chemically dehydrating and cyclizing polyamic acid to form polyimide.
  • the imidization can be efficiently promoted by using the tertiary amine compound alone or in combination with the tertiary amine compound and the carboxylic acid anhydride. Is preferable.
  • tertiary amine compound examples include trimethylamine, triethylamine, tripropylamine, tributylamine, pyridine, 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octane (DABCO), and 1,8-diazabicyclo [5.4.
  • pyridine, DABCO, N, N, N', N'-tetramethyldiaminomethane are preferable, and DABCO is more preferable.
  • the tertiary amine may be only one kind or two or more kinds.
  • carboxylic acid anhydride examples include acetic anhydride, trifluoroacetic anhydride, propionic anhydride, butyric anhydride, isobutyric anhydride, succinic anhydride, maleic anhydride and the like.
  • acetic anhydride and trifluoroacetic anhydride are particularly preferable, and acetic anhydride is more preferable.
  • the carboxylic acid anhydride may be only one kind or two or more kinds.
  • a polar solvent having excellent solubility is preferable.
  • tetrahydrofuran, N, N-dimethylacetamide, N, N-dimethylformamide, N-methylpyrrolidone, dimethyl sulfoxide and the like can be mentioned, and among these, N, N-dimethylacetamide, N, N-dimethylformamide and N are particularly mentioned.
  • -It is preferable that at least one selected from the group consisting of methylpyrrolidone is used from the viewpoint of uniform reaction.
  • the weight average molecular weight of the polyimide resin is, for example, 5000 to 2000000, preferably 8000 to 1000000, and more preferably 20000 to 500000.
  • the weight average molecular weight of the resin can be measured according to a known measuring method, and when the weight average molecular weight is within the above range, the synthesis and handling of the polyimide resin, film formation, and spheroid formation property are further improved. It will be good.
  • the cell-adhesive surface may further contain additive components such as a plasticizer and an antioxidant in addition to the above-mentioned substance exhibiting cell adhesion.
  • a substance exhibiting cell adhesion or a cell adhesion surface [a substance exhibiting hydrophobicity (particularly hydrophobicity not superhydrophobic) or a cell adhesion surface] has a static water contact angle of 70 ° or more.
  • the roll angle may be 15 ° or more
  • the static water contact angle may be 70 ° or more and the fall angle may be 15 ° or more.
  • substances exhibiting cell adhesion or cell adhesion surfaces [substances exhibiting hydrophobicity (particularly hydrophobicity that is not superhydrophobic) or cell adhesion surfaces] have a static water contact angle of 70 ° or more. Is preferable. When the cell adherent surface satisfies such conditions, spheroid formation is further promoted.
  • the static water contact angle is more preferably more than 75 °, still more preferably 77 ° or more, even more preferably 79 ° or more, and particularly preferably 80 ° or more (for example, more than 80 °).
  • the upper limit of the static water contact angle is, for example, less than 150 °, preferably 120 ° or less (for example, less than 120 °), more preferably 110 ° or less, and particularly 100 ° or less (for example, 99 °). Less than °, 98 ° or less, 97 ° or less, 95 ° or less, etc.), and more preferably less than 90 °.
  • the static water contact angle of a substance exhibiting cell adhesion or a cell adhesion surface is preferably 65. It may be ° or less, more preferably 55 ° or less, still more preferably 50 ° or less.
  • the lower limit value may be 0 ° or more, preferably 5 ° or more, and more preferably 10 ° or more.
  • the fall angles of substances exhibiting cell adhesion or cell adhesion surfaces are 18 ° or more, 19 ° or more, 20 ° or more, 22 ° or more, 24 ° or more, 26 ° or more, 28 ° or more.
  • the upper limit of the fall angle is, for example, less than 80 °, preferably 70 ° or less (for example, less than 70 °), more preferably 60 ° or less (for example, less than 60 °), and further preferably 50 ° or less (for example, less than 60 °). For example, less than 50 °).
  • the static water contact angle and the fall angle may be values on the cell adhesion surface, or may be values on a substance exhibiting cell adhesion (or a substance constituting the cell adhesion surface). Good.
  • the surface characteristics can be measured according to a known method. For example, the static water contact angle and the fall angle may be measured by, for example, the method described later.
  • the ratio of the substance showing cell adhesion to the bottom surface of the recess is not particularly limited, but 90% or more and 95% of the bottom surface of the recess. As mentioned above, it is preferable that 99% or more occupies substantially the entire bottom surface. Further, the cell adhesion surface on the bottom surface is preferably flat (flat bottom shape, flat plate shape) from the viewpoint of observability.
  • cell non-adhesive surface means, for example, that when cells settle on the surface in a solution used for culturing, the cells hardly change their shape and do not adhere at all or temporarily. It is a surface that naturally detaches even if it adheres weakly.
  • the cell non-adhesive surface may be composed of at least a substance exhibiting cell non-adhesion.
  • the substance exhibiting cell non-adhesion is not particularly limited as long as it does not adhere to the cells used for culturing or does not bind to cell surface molecules such as proteins and sugar chains present in the cell membrane of the cells used. It may or may not be biocompatible. Further, the substance exhibiting cell non-adhesiveness (or cell non-adhesive surface) may be either hydrophobic or hydrophilic, and is, for example, super-hydrophobic (super-hydrophobic). It may be a substance or a superhydrophilic substance.
  • hydrophobic particularly superhydrophobic
  • a hydrophobic or hydrophilic (particularly hydrophobic) cell-adhesive surface or the surface thereof For example, a hydrophobic or hydrophilic (particularly hydrophobic) cell-adhesive surface or the surface thereof.
  • a substance that is more hydrophobic (particularly superhydrophobic) to the resin (and its contact angle)] is particularly preferred, but hydrophilic (particularly superhydrophilic) [eg, hydrophilic or hydrophobic (eg, hydrophobic). ), Or a substance that is more hydrophilic (particularly superhydrophilic) to the cell-adhesive surface or the resin (and the contact angle thereof) constituting the surface is also preferable.
  • Such substances include (poly) ethylene glycol and its derivatives, MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine) and its derivatives, HEMA (hydroxyethyl methacrylate) and its derivatives, and the like.
  • Compounds such as compounds containing or polymers of these compounds [for example, poly-HEMA (polyhydroxyethyl methacrylate)], SPC (segmented polyurethane) and derivatives thereof, proteins (albumin, etc.) obtained from living organisms, and cells Sugar chains that do not adhere (agarose, cellulose, etc.) can be appropriately selected and used according to the type of cells.
  • the substance exhibiting cell non-adhesiveness a substance that is appropriately modified according to the handleability, the desired degree of hydrophobicity (for example, superhydrophobicity), hydrophilicity (for example, superhydrophilicity), etc. is used. You may. For example, hydrophilicity and low solubility in water may be achieved at the same time by cross-linking a hydrophilic substance.
  • the raw material for example, hydrophobic or hydrophilic
  • is appropriately hydrophobized or hydrophilized for example, introduction of a hydrophobic group or a hydrophilic group
  • the material may be obtained.
  • Immobilization of substances exhibiting cell non-adhesiveness includes a method of drying a solution containing these on the surface of a base material, a method of melting and crimping the substance, and an energy ray such as UV applied to the material applied to the base material.
  • a covalent bond is formed by causing a chemical reaction (for example, a condensation reaction between functional groups such as a carboxyl group and an amino group) between the functional group of the substance and the functional group on the base material. It can be immobilized on the surface of the base material by a method of subjecting the substance to a thiol group and a method of binding a metal (platinum, gold, etc.) thin film previously formed on the base material.
  • the thickness at the time of immobilization is not particularly limited, and 0.01 to 1000 ⁇ m is exemplified.
  • the ratio of the surface exhibiting cell non-adhesiveness occupying the inner surface of the recess is not particularly limited, but to the extent that the adhesiveness of cultured cells is reduced. Is preferable. It is preferable to occupy 90% or more, more preferably 95% or more, and particularly preferably all of the area of the inner surface.
  • the surface exhibiting cell non-adhesiveness can be judged as an index of, for example, the static water contact angle as its surface characteristics from the viewpoint of making the size of the cultured cells uniform and improving the circularity. ..
  • the static water contact angle is preferably 90 ° or more, more preferably 93 ° or more, still more preferably 95 ° or more. Further, it may be 150 ° or less, preferably 130 ° or less, and more preferably 120 ° or less.
  • the static water contact angle is preferably 65 ° or less, more preferably 55 ° or less, still more preferably 50 ° or less. Further, it may be 0 ° or more, preferably 5 ° or more, and more preferably 10 ° or more.
  • the static water contact angle is, for example, 90 ° or more, 100 ° or more.
  • a static water contact angle may be a value on a cell non-adhesive surface, or may be a value on a substance exhibiting cell non-adhesiveness (or a substance constituting a cell non-adhesive surface).
  • the static water contact angle may be measured by, for example, a method described later.
  • the cell non-adhesive surface exhibits adhesion to cells, it may be less adhesive than the cell adhesive surface.
  • the difference (or absolute value) of the static water contact angle on the cell non-adhesive surface (or a substance showing cell non-adhesion) is 3 ° or more (for example, its absolute value).
  • the upper limit of the above difference is the hydrophobicity / hydrophilicity of the cell non-adhesive surface (or the substance showing cell non-adhesion) and the cell adhesion surface (or the substance showing cell adhesion). It can be appropriately selected depending on the combination and the like, and is not particularly limited, but may be, for example, 100 °, 90 °, 80 °, 70 °, 60 °, 50 °, 40 °, 30 ° and the like.
  • a substance having the characteristics is physically or physically applied to the surface of the base material so that the inner surface of the recess becomes a cell non-adhesive surface and the bottom surface of the recess becomes a cell adhesive surface. It may be formed by being chemically fixed or arranged, or may be formed in the form of a sheet in which the relevant portion is made of a substance having the relevant characteristics.
  • the sheet surface which is also the edge portion of the recess, may have a cell non-adhesive surface from the viewpoint of simplifying the production of the cell culture sheet.
  • the cell non-adhesive surface of the sheet surface may be the same cell non-adhesive surface as the inner surface of the recess or a different cell non-adhesive surface.
  • the sheet surface and the inner surface of the recess may have continuous surfaces.
  • the cell culture sheet having the recess having such a structure may be a layered structure including a layer including the bottom surface of the recess and a layer including the inner surface of the recess.
  • the layer including the inner side surface of the recess constitutes a layer having a through hole. Therefore, one aspect of the sheet may be a laminate including a layer having a cell non-adhesive surface having through holes and a layer having a cell adhesive surface.
  • the layer having a cell non-adhesive surface having a through hole fixes a substance exhibiting a cell non-adhesive property to a layered base material from the viewpoint of forming a through hole or from the viewpoint of simplifying the production of a cell culture sheet. Is preferable.
  • any material known in the art can be used. For example, synthesis of polystyrene, polyethylene, polypropylene, polycarbonate, polyamide, polyacetal, polyester (polyethylene terephthalate, etc.), polyurethane, polysulfone, polyacrylate, polymethacrylate, polycycloolefin, polyetherketone, polyetheretherketone, polyimide, silicon, etc. Examples thereof include a plate-like body made of resin, synthetic rubber such as EPDM (ethylenepropylene diene rubber), natural rubber, glass, ceramic, and a metal material such as stainless steel.
  • a transparent base material is also one of the preferable forms.
  • the through hole preferably has a wall corresponding to the inner surface of the recess, and the hole diameter and shape of the opening and the opposite end can be set in the same manner as the recess. Further, the depth of the through hole corresponds to the thickness of the layer having the cell non-adhesive surface, but also corresponds to the depth of the recess mentioned above, and can be set in the same manner as the recess.
  • the layer of the substance exhibiting cell non-adhesiveness is preferably, for example, 1 nm or more, and more preferably 10 nm or more. If the thickness of the entire layer including the layer of the substance exhibiting non-cell adhesion and the base material is within the range of the thickness of the layer having the non-adhesive surface of cells, it can be appropriately set.
  • the formation of the through hole is not particularly limited as long as the through hole of the above size can be formed, and the through hole can be formed.
  • it can be formed by drilling (drilling or the like), optical micromachining (laser (for example, CO 2 laser, excimer laser, semiconductor laser, YAG laser), etc.), etching processing, embossing processing or the like.
  • the shape of the through hole may be tapered, and at that time, the periphery of the end portion is deformed, and the edge portion of the opening portion and the opening portion adjacent to the opening portion are formed.
  • a structure may be formed in which the layer thicknesses of the portions located in the intermediate region of the above are different.
  • the thickness of the layer having the cell adhesion surface is, for example, 1 nm or more and 4 mm or less, preferably 1 ⁇ m or more and 1 mm or less, and may be the same as the bottom surface thickness of the recess.
  • the cell culture sheet also includes an aspect in which an adhesive layer (adhesive layer) is further included between the layer having the cell adhesive surface and the layer having the cell non-adhesive surface.
  • an adhesive layer adheresive layer
  • any material known in the art can be used.
  • acrylic resin, silicon resin, synthetic rubber, natural rubber and the like can be mentioned, and a low-elution adhesive layer can be preferably used.
  • Commercially available double-sided tape or the like may be used.
  • the thickness of the adhesive layer is not particularly limited and can be appropriately set as long as the effect of the present invention is not impaired. For example, 0.5 to 100 ⁇ m is exemplified.
  • the cell culture sheet can be produced by laminating a layer having a cell non-adhesive surface having through holes and a layer having a cell adhesive surface in this order. Layers other than the above may be laminated, or layers having cavities may be laminated.
  • each layer prepared in advance may be laminated in order, or a method of separately forming a layer on the prepared layer may be used, and these may be combined. May be good.
  • a substance exhibiting cell adhesion is cast, spray-coated, on a release sheet whose surface has been peeled off (for example, an organic polymer film such as a polyethylene base material, ceramics, metal, glass, etc.).
  • a release sheet whose surface has been peeled off
  • a release sheet for example, an organic polymer film such as a polyethylene base material, ceramics, metal, glass, etc.
  • a layer having a cell adhesion surface can be formed into a sheet by coating and heating to an appropriate thickness.
  • the surface is coated with a substance exhibiting cell non-adhesiveness to prepare a layer having a cell non-adhesive surface in advance. Can be done. Then, it can be produced by peeling the release sheet of the layer having the cell adhesive surface formed above and then laminating the layer having the cell non-adhesive surface prepared separately.
  • the above-mentioned adhesive layer may be used for lamination, or welding (high frequency welding, ultrasonic welding). Etc.), may be laminated by crimping (thermocompression bonding, etc.).
  • the thickness of the cell culture sheet is not particularly limited, but is preferably 10 to 5000 ⁇ m, more preferably 10 to 2000 ⁇ m from the viewpoint of handleability.
  • the sheet area is also not particularly limited, and examples thereof include 0.01 to 10000 cm 2 , preferably 0.03 to 5000 cm 2 .
  • the cell culture substrate such as the cell culture sheet thus obtained may be appropriately sized according to the size of the target device from the viewpoint of being used as it is in a known cell culture device.
  • a medium containing cells may be placed on one of the surfaces to carry out cell culture, and the cell culture substrate may be used as a culture plate, each well of the plate, a culture nest (culture dish), a flask, a culture bag, or the like.
  • Cell culture can be carried out on a part or the entire surface of the fixed cell culture substrate, which is housed and fixed in various cell culture containers.
  • the cells and / or their aggregates collected from the recesses of the cell culture substrate may be suspension-cultured in the recesses or adherently cultured on the bottom surface of the recesses.
  • the type is also not particularly limited, and for example, any organ or tissue (brain, liver, pancreas, spleen, heart, lung, intestine) of human or non-human animal (monkey, pig, dog, rabbit, rat, mouse, etc.) , Cartilage, bone, fat, kidney, nerve, skin, bone marrow, dental pulp, embryo, etc.), established cell lines, or cells obtained by genetically manipulating these cells can be used.
  • the cell aggregate may be an aggregate (cell aggregate, spheroid) formed by culturing cells.
  • the number of cells and / or an aggregate thereof in the recess is not particularly limited, and for example, 1 to 10000 cells are exemplified per recess.
  • the size (diameter) of the recovered cells and / or their aggregate is preferably, for example, 5 to 1000 ⁇ m, more preferably 10 to 500 ⁇ m.
  • the amount of the culture solution in the entire substrate is not limited as long as the recess is filled with the culture solution.
  • the cell culture substrate may be defoamed in advance, if necessary.
  • the defoaming treatment is not particularly limited, and general treatments such as temperature change such as spraying, shaking, heating and cooling, centrifugal treatment, vacuum degassing, and ultrasonic treatment can be performed.
  • the concave portion of the cell culture substrate used in the present invention has an opening having a diameter of 1000 ⁇ m or less, it can be used from a liquid feeding port having a diameter of 3 mm or less and / or at a flow velocity of 100 cm / s or more.
  • the liquid for sending liquid may be sent to perform the defoaming treatment. By doing so, a series of steps from defoaming treatment to recovery can be efficiently performed. Therefore, as one aspect of the present invention, a cell culture substrate having a recess having an opening having a diameter of 1000 ⁇ m or less can be used.
  • Cell culture in which a liquid feed solution is sent from a liquid feed port having a diameter of 3 mm or less and / or at a flow velocity of 100 cm / s or more to defoam, and the culture solution is provided to the substrate and at least the recess.
  • Process of preparing a container for In the step of culturing cells and / or their aggregates in the obtained cell culture vessel, and in the cell culture vessel after the culture step, from the liquid feed port having a diameter of 3 mm or less, and / or the flow velocity. Examples thereof include a method for recovering cells and / or an aggregate thereof, which comprises a step of feeding and recovering a liquid for feeding liquid at 100 cm / s or more.
  • the device or instrument used for liquid feeding in defoaming is, for example, one having at least a liquid feeding port having a diameter of 3 mm or less.
  • the liquid feed port portion may have a liquid feed port having a diameter of 3 mm or less, and may have, for example, a diameter of 2.5 mm or less, 2.0 mm or less, or 1.7 mm or less.
  • the ratio of the diameter of the liquid feed port to the diameter of the recess opening is determined from the viewpoint of the liquid feed flow rate and the liquid feed flow rate for removing air bubbles from the recess. It is preferably 30 or less, more preferably 20 or less, still more preferably 10 or less.
  • the lower limit is not particularly limited, and for example, 0.1 or more can be mentioned.
  • the diameter of the liquid feed port is the maximum inner diameter of the liquid feed port.
  • the shape and material of the liquid feed port are not particularly limited as long as they have the above-mentioned size.
  • a known dispenser manufactured or adjusted to have the diameter at the liquid feeding port an injection needle, a blunt needle cannula, a tip, a sonde, etc. having the diameter can also be used.
  • the liquid feeding device or instrument for defoaming preferably has a member for holding the liquid feeding liquid in addition to the liquid feeding port portion.
  • a member for holding the liquid feeding liquid may be a cartridge, a tank, a bottle, or a syringe.
  • the size (capacity), shape, and material are not particularly limited.
  • the member may be indirectly or directly connected to the liquid feeding port portion via a tube or the like, or may be integrally formed.
  • the liquid for sending liquid in defoaming is not particularly limited.
  • the culture solution itself may be used as the liquid feed solution for defoaming, or physiological saline or a buffer solution may be used.
  • the solution filled in the recess may be removed after the solution is sent, and at that time, the solution may be removed to the extent that the solution does not completely disappear, and then the solution is replaced with the culture solution.
  • the recesses of the cell culture base material can be filled with the culture solution.
  • the liquid feeding liquid can be injected into the cell culture substrate in advance and then the defoaming treatment can be performed. When this pre-injection is performed, bubbles are confirmed in the recesses. You may.
  • the method of pre-injection and the amount of liquid for sending liquid are not particularly limited.
  • the method of sending liquid in defoaming is not particularly limited as long as it flows out from the liquid feeding port and the inside of the recess can be filled with the liquid for sending liquid.
  • a method of arranging the tip of the liquid feeding port portion 0.1 to 10 mm above the upper end surface of the opening of the concave portion to feed the liquid can be mentioned.
  • the tip of the liquid feed port may be arranged so as to be immersed in the liquid previously injected into the culture container on which the base material is installed.
  • the number of liquid feed ports to be arranged may be one or two or more per base material.
  • the liquid may be fed to a plurality of recesses at once, or the cell culture substrate itself may be fed, or the liquid feed port may be moved to continuously or intermittently feed the liquid. It may also be automated or manual. After the liquid is once fed, the liquid existing above the recess may be sucked, and the liquid may be fed again above the same recess or above a different recess. In this case, since bubbles are likely to be generated when a small amount of liquid is repeatedly fed and sucked, the amount of liquid to be fed at one time may be, for example, 10 mL or more, and 10 to 50 mL is exemplified.
  • the flow rate of liquid feeding in defoaming can be 100 cm / s or more. Further, it may be 200 cm / s or more, 250 cm / s or more, 300 cm / s or more, and the like. Further, the upper limit includes a flow velocity at which the non-cell adhesive substance on the substrate does not peel off or the substrate is not damaged, and examples thereof include 2000 cm / s.
  • the flow rate of the liquid to be sent in defoaming is not particularly limited, and for example, 0.001 mL / s or more per 1 cm 2 of the opening area is exemplified. It may be 0.01 mL / s or more, 0.03 mL / s or more, 0.05 mL / s or more, 0.07 mL / s or more, and the upper limit is, for example, 20 mL / s.
  • Culturing of cells and / or their aggregates in the obtained cell culture container cannot be unconditionally set depending on the cells used and / or their aggregates, and can be appropriately performed according to a known technique.
  • the culture solution and culture conditions are not particularly limited. After culturing for a desired period, it can be used for the next recovery.
  • liquid is sent to collect cells and / or an aggregate thereof.
  • the device or instrument used for liquid feeding in recovery is, for example, one having at least a liquid feeding port having a diameter of 3 mm or less.
  • the liquid feed port portion may have a liquid feed port having a diameter of 3 mm or less, and may have, for example, a diameter of 2.5 mm or less, 2.0 mm or less, or 1.7 mm or less.
  • the diameter of the recess opening is preferably 30 or less, more preferably 20 or less, still more preferably 10 or less.
  • the lower limit is not particularly limited, and for example, 0.1 or more can be mentioned.
  • the diameter of the liquid feed port is the maximum inner diameter of the liquid feed port.
  • the shape and material of the liquid feed port are not particularly limited as long as they have the above-mentioned size.
  • a known dispenser manufactured or adjusted to have the diameter at the liquid feeding port an injection needle, a blunt needle cannula, a tip, a sonde, etc. having the diameter can also be used.
  • the liquid feeding device or instrument in the recovery has a member for holding the liquid feeding liquid in addition to the liquid feeding port portion.
  • a member for holding the liquid feeding liquid in addition to the liquid feeding port portion.
  • it may be a cartridge, a tank, a bottle, or a syringe.
  • the size (capacity), shape, and material are not particularly limited.
  • the member may be indirectly or directly connected to the liquid feeding port portion via a tube or the like, or may be integrally formed.
  • the liquid for sending liquid in recovery is not particularly limited.
  • a physiological saline solution, a buffer solution, or the like may be used, but the culture solution itself may be used, or the culture solution that has been previously injected into the cell culture container may be used.
  • the method of delivering the liquid in the collection may be such that the cells and / or their aggregates in the recess are separated from the recess by flowing out from the liquid feeding port, or may be discharged to the outside of the recess, in particular.
  • a method of arranging the tip of the liquid feeding port portion 0.1 to 10 mm above the upper end surface of the opening of the concave portion to feed the liquid can be mentioned.
  • the tip of the liquid feed port may be arranged so as to be immersed in the liquid previously injected into the culture container on which the base material is installed.
  • the number of liquid feed ports to be arranged may be one or two or more per base material.
  • the liquid may be fed to a plurality of recesses at once, or the cell culture substrate itself may be fed, or the liquid feed port may be moved to continuously or intermittently feed the liquid. It may also be automated or manual.
  • the flow rate of the liquid to be fed in the recovery is not particularly limited, but it is preferable to feed the liquid at a predetermined flow rate.
  • 0.001 mL / s or more per 1 cm 2 opening area is exemplified. It may be 0.01 mL / s or more, 0.03 mL / s or more, 0.05 mL / s or more, 0.07 mL / s or more, and the upper limit is, for example, 20 mL / s.
  • the flow velocity of the liquid to be sent during recovery is not particularly limited, and for example, 100 cm / s or more can be exemplified. Further, it may be 200 cm / s or more, 250 cm / s or more, 300 cm / s or more, and the like.
  • the upper limit is a flow velocity at which the non-cell adhesive substance on the substrate does not peel off or the substrate is not damaged, and examples thereof include 2000 cm / s.
  • the liquid transfer in the above recovery can be performed in a sterile environment.
  • cells and / or their aggregates can be exfoliated and / or released from the recesses, cells and / or their aggregates are placed on the substrate in addition to the culture medium and the liquid feed solution. Since it is present, for example, by recovering the liquid existing on the substrate, it is possible to recover the cells and / or the aggregate itself.
  • the means used for recovering the liquid existing on the substrate is not particularly limited as long as it does not exert a strong force that damages cells and / or their aggregates. For example, it may be collected by suction, or it may be collected by tilting it from the culture container.
  • additional fluid delivery may be performed to exfoliate and / or release cells and / or aggregates thereof from the recesses.
  • the recovered cells and / or aggregates thereof can be subjected to known treatments (eg, passage, freezing, fixation, sectioning, flow cytometry evaluation, microscopic observation, gene analysis, transplantation).
  • cells and / or aggregates thereof can be recovered by sending the liquid to the cell culture substrate.
  • cells and / or an aggregate thereof can be easily recovered, and since it is easy to recover, it is possible to recover them with high efficiency.
  • the viable cell rate in the recovered cell population is as high as 80% or more, for example. Therefore, the present invention can also provide a cell population with a viable cell rate of 80% or more, which is recovered by the above method.
  • room temperature means 20 to 30 ° C.
  • Manufacturing example 1 ⁇ Preparation of layer having cell adhesive surface (preparation of fluorine-containing polyimide film)> 25.332 g (0.057 mol) of 4,4'-hexafluoroisopropyridene diphthalic acid anhydride and 166.60 g of N-methylpyrrolidone were charged and dissolved in a 500 mL volumetric flask. A solution prepared by dissolving 16.668 g (0.049 mol) of 1,4-bis (aminophenoxy) benzene in 71.4 g of N-methylpyrrolidone was added dropwise thereto, and the mixture was stirred at room temperature in a nitrogen atmosphere and held for 5 days.
  • a fluoropolyamic acid resin composition (solid content concentration: 15% by mass, 6FDA / TPEQ polyamic acid) was obtained.
  • the weight average molecular weight of the polyamic acid was 153,000, and the viscosity was 6.7 Pa ⁇ s.
  • the weight average molecular weight of the polyamic acid and the weight average molecular weight of the fluorine-containing polyimide after firing are substantially the same.
  • the fluorine-containing polyamic acid resin composition obtained above was applied onto a glass substrate using a die coater so that the thickness of the fluorine-containing polyimide film after firing was 40 ⁇ m to form a coating film. Then, the coating film was fired at 360 ° C. for 1 hour in a nitrogen atmosphere. Then, the fired product was peeled off from the glass substrate to obtain a fluorine-containing polyimide film.
  • the static water contact angle of this fluorine-containing polyimide film was 83.2 °, and the fall angle was 26.4 °.
  • the method for measuring physical properties in the above is as follows.
  • JS 14000 Measuring method After calibrating with a standard solution for viscometer calibration, measure with 0.3 g of varnish. (Measurement temperature: 23 ° C) (Measurement of static water contact angle) Equipment: Automatic contact angle meter (Kyowa Interface Science: DM-500) Measuring method: The adhesion angle of the droplet immediately after 2 ⁇ L of water is dropped on the surface (non-cell adhesive surface or cell adhesive surface) or film (film formed of a substance exhibiting cell non-adhesive or cell adhesive property). Measure (measurement temperature: 25 ° C).
  • Equipment Automatic contact angle meter (Kyowa Interface Science: DM-500) Measuring method: After dropping 25 ⁇ L of water on a surface (non-cell adhesive surface or cell adhesive surface) or a film (film formed of a substance exhibiting cell non-adhesive or cell adhesive property), the sheet is continuously tilted. Let the fall angle be the angle at which it flows down (measured temperature: 25 ° C).
  • a single-sided release tape (thickness 25 ⁇ m) is attached to a transparent PET film (thickness 250 ⁇ m) after peeling, and a CO 2 laser is used to make staggered through holes with a diameter of 300 ⁇ m and a pitch of 500 ⁇ m. Formed (through holes formed: 400 pcs / cm 2 , 42000 pcs / sheet, laser incident side hole diameter 500 ⁇ m, laser emission side hole diameter 300 ⁇ m).
  • the surface on the PET film side was coated with a spin coater (Mikasa: MS-A150) so that the thickness was 0.05 ⁇ m, and the MPC polymer solution (0.5% ethanol solution) was coated in a dryer at 50 ° C.
  • the time-drying treatment gave a layer having a cell non-adhesive surface [static water contact angle 107.5 ° on the PET film coating layer (MPC polymer coating layer) side].
  • the layer having the cell-adhesive surface prepared above was attached to the surface on the side from which the other release tape of the double-sided tape having the cell non-adhesive surface was removed to prepare a cell culture sheet. (Sheet thickness: 315 ⁇ m).
  • the obtained cell culture sheet was placed in a culture plate to complete a container used for cell culture.
  • Example 1 ⁇ Expansion culture of cells> As cells, human adipose derived stem cells (AdSC) were used. AdSC purchased and used a manufacturer's product (Lonza, PT-5006).
  • Frozen cells were lysed in a constant temperature water bath at 37 ° C. and added to 9 mL of KBM ADSC-2 medium (basal medium, manufactured by Kojin Bio) containing 5% FBS and 1% antibiotics. Then, after centrifuging at 210 ⁇ g for 5 minutes, the supernatant was removed and dispersed in 1 mL of basal medium. Add basal medium in advance to a flask with a filter cap for 800 mL cell culture (manufactured by Sumitomo Bakelite) so that the total volume after adding the cell suspension is 30 mL, and add the cell suspension to 1.5 ⁇ 10 6 cells. In addition, the cells were cultured in a 5% (v / v) CO 2 incubator at 37 ° C. (expansion culture).
  • the culture vessel prepared in Production Example 1 was defoamed. Specifically, in the safety cabinet, about 20 mL of PBS was first added to the culture vessel in advance. Next, fill 20 mL of PBS with 20 mL all-plastic (made by Nipro) equipped with an 18G non-bevel needle (inner diameter 0.9 mm, made by Terumo), and the position where the tip of the needle is immersed in the PBS liquid in the container (above the concave opening).
  • the entire amount is sent to the area of about 1/3 of the entire bottom surface of the culture vessel in about 8 seconds, and then the PBS in the vessel is injected with the syringe.
  • the same liquid feeding was repeated again for the remaining area to defoam. No bubbles were found in most of the wells, but the above operation was performed in the same manner for the portion where bubbles remained. Then, after standing in a 5% (v / v) CO 2 incubator at 37 ° C. for 15 minutes, the PBS filled in the syringe was extruded again to remove newly generated bubbles.
  • ⁇ Making spheroids> The medium was removed from the culture flask, 5 mL of the cell exfoliating solution Accutase (manufactured by Promocell) was added, and then the cells were detached by holding in a 5% (v / v) CO 2 incubator at 37 ° C. for about 5 minutes. The strip was then collected and transferred to a tube using PBS to a total volume of 15 mL. The cells were counted by centrifuging at 210 xg for 5 minutes and suspending in 4 mL of KBM ADSC-2 medium containing 1% antibiotic. Then, the concentration was adjusted to 1.0 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • the cells were allowed to stand overnight in a 5% (v / v) CO 2 incubator at 37 ° C. to remove the medium of the defoamed culture vessel, and the cells were seeded to 500 cells / hole. After standing in a safety cabinet for 15 minutes, the cells were placed in a 5% (v / v) CO 2 incubator at 37 ° C. and cultured for 3 days.
  • the survival rate of cells in the recovered spheroids was measured as follows.
  • the spheroid dispersion was centrifuged at 210 ⁇ g for 5 minutes, suspended in 7 mL of Accumax (manufactured by Nacalai Tesque), and treated at room temperature for 30 minutes.
  • the cell suspension filtered through a cell strainer (manufactured by Corning) was centrifuged at 210 ⁇ g for 5 minutes, suspended in 1 mL of PBS, and the number of cells was counted to calculate the survival rate.
  • the viable cell rate in the recovered spheroids is as high as 98%, indicating that it is a recovery method with less damage to cells.
  • the method of the present invention damage can be easily reduced, and cells and / or aggregates thereof can be easily and efficiently recovered. Therefore, the method is preferably used in the field of cell preparations such as spheroid-containing preparations. be able to.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

新規な細胞及び／又はその集合体の回収方法、ならびに前記方法により回収された細胞集団を提供すること。開口部の口径が直径1000μm以下の凹部に細胞を含有する細胞培養用基材に、口径が直径3mm以下の送液口部から、及び／又は、流速100cm/s以上で、送液用液を送液する工程を含む、細胞及び／又はその集合体の回収方法、好ましくは、細胞培養用基材が、開口部の孔径が直径1000μm以下の凹部を複数有し、該凹部の内側面が細胞非接着性表面を有し、かつ、該凹部の底面が細胞接着性表面を有する細胞培養用シートである回収方法。

Description

細胞及び／又はその集合体の回収方法
　本発明は、細胞及び／又はその集合体の回収方法に関する。
　従来、培養細胞の回収では、種々検討がなされていた。
　例えば、特許文献１では、細胞培養時にセルロースナノファイバーを含む培地を用いることで、培地中に形成されたセルロースナノファイバーのネットワークを軽い衝撃等を与えて崩壊させて、培養細胞を沈降させる方法が開示されている。
　また、特許文献２には、温度応答性ポリマー上に細胞を播種して細胞シートを形成させた後、低温処理の刺激を与えて剥離させることで、細胞をシート状に回収する方法が開示されている。
ＷＯ２０１７／１９９７３７号 特開２０１５－１１９６９４号公報
　しかしながら、従来技術の方法においては、回収のために特定の容器や場合によっては専用の機器が必要となるなど煩雑な準備を要するほか、低温処理とする場合には回収までに時間を要するなど、未だ十分ではない。また、回収時に強い力がかかったりすると細胞にダメージを与えたり、回収効率が低いことがあったりするため、更なる改良方法が求められている。
　本発明は、新規な細胞及び／又はその集合体の回収方法、ならびに前記方法により回収された細胞集団を提供することを目的とする。
　また、本発明は、簡便で効率的に細胞及び／又はその集合体を回収する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、培養区画（ウェル）の径が小さい培養容器においては、該区画に特定口径を有する部材から液を安定して送液することで、簡便かつ効率的に細胞を回収できることを見出し、更なる検討を行って本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は、下記〔１〕～〔１０〕に関する。
〔１〕　開口部の口径が直径1000μm以下の凹部に細胞を含有する細胞培養用基材に、口径が直径3mm以下の送液口部から、及び／又は、流速100cm/s以上で、送液用液を送液する工程を含む、細胞及び／又はその集合体の回収方法。
〔２〕　開口部面積1cm2あたり0.001mL/s以上の流量で送液する、前記〔１〕記載の方法。
〔３〕　凹部の0.1～10mm上方から送液する、前記〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕　送液口部の口径が直径2.5mm以下である、前記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕　送液口部の直径と凹部開口部の直径の比（送液口部の直径／凹部開口部の直径）が30以下である、前記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕　細胞培養用基材が、開口部の孔径が直径1000μm以下の凹部を複数有し、該凹部の内側面が細胞非接着性表面を有し、かつ、該凹部の底面が細胞接着性表面を有する細胞培養用シートである、前記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕　無菌環境下で行う、前記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕　さらに、送液工程後の基材上に存在する液を回収する工程を含む、前記〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕　細胞がスフェロイドを形成している、前記〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕　前記〔１〕～〔９〕のいずれかに記載の方法により得られる、生細胞率80％以上の細胞集団。
　本発明により、簡便に効率的に細胞及び／又はその集合体の回収を行なうことが可能となる。
図１は、実施例１においてスフェロイドを回収する前の培養容器の写真である。 図２は、実施例１においてスフェロイドを回収した後の培養容器の写真である。
　本発明の細胞及び／又はその集合体の回収方法は、開口部の口径が直径1000μm以下の凹部を有する細胞培養用基材に、口径が直径3mm以下の送液口部から、及び／又は、流速100cm/s以上で、送液用液を送液する工程を含む。かかる工程によって、細胞培養用基材の凹部内に存在する細胞及び／又はその集合体を凹部内から剥離させても、凹部外に放出させてもよく、そのまま回収することが可能となる。
　本発明の回収方法は、開口部の口径が直径1000μm以下の凹部をその表面に有する細胞培養用基材であれば適用でき、前記凹部内にて細胞を培養することができればよい。
　凹部の口径は直径1000μm以下であれば特に限定はなく、例えば、800μm以下、600μm以下、500μm以下、400μm以下、300μm以下のものであってもよい。また、下限は特に設定されず、例えば、10μmを挙げることができる。なお、凹部の直径とは開口部の最大径のことである。
　凹部の開口部の面積としては、凹部1個あたり、例えば、0.5×10-3～5.0×10-1cm2の範囲内が例示され、1.0×10-1cm2、5.0×10-2cm2、2.0×10-2cm2、1.0×10-2cm2、5.0×10-3cm2、2.5×10-3cm2、2.0×10-3cm2、1.0×10-3cm2等が例示される。
　凹部の深さは、細胞を培養することができれば特に限定されず、培養する細胞のサイズや凹部の形成方法等によって当該技術常識に従って適宜設定することができる。例えば、凹部の深さは、10nm以上（例えば、100nm以上）等であってもよく、1μm以上［例えば、5μm以上、10μm以上（例えば、10～1000μm、10～300μm）］等の範囲内であってもよい。
　凹部の開口部及び底面（底部）の形状は、円形に限られず、例えば、多角形や楕円であってもよく、底面の形状は開口部の形状と同一であっても異なるものであってもよい。また、底面は平板状（平坦状）であっても湾曲していてもよく、平滑であってもよいが、平坦及び／又は平滑な底面であることがより望ましい。底面の面積としては、凹部1個あたり、例えば、0.5×10-3～5.0×10-1cm2の範囲内が例示され、1.0×10-1cm2、5.0×10-2cm2、2.0×10-2cm2、1.0×10-2cm2、5.0×10-3cm2、2.5×10-3cm2、2.0×10-3cm2、1.0×10-3cm2等が例示される。また、底面の口径(長さ)は開口部の口径と同一であっても異なるものであってもよく、底面の口径が開口部の口径より小さいものであっても、底面の口径が開口部の口径より大きいものであってもよい。底面の口径としては、例えば、10～1000μm、10～700μm、10～600μm、10～500μm、10～400μm、10～300μmの範囲内が例示される。例えば、底面の口径が開口部の口径と同じ場合、凹部の形状としては柱形状が、なかでも、開口部と底面の形状が円形の場合は円柱形状が形成される。底面の口径が開口部の口径より小さい場合、凹部の形状としては、凹部の底面側に向かったテーパー形状が形成される。
　底面の孔径と開口部の孔径の比(底面の孔径／開口部の孔径)は、特に限定されるものではないが、細胞の播種や回収のしやすさの観点から、5/1～1/5、3/1～1/3、1/1～1/2が例示される。
　また、開口部と隣接する開口部との間の距離(間隙)は、例えば、特に限定されるものではないが、所望する大量培養に応じて、例えば、800μm以下、700μm以下、600μm以下、500μm以下、300μm以下、200μm以下、100μm以下などの範囲内が例示され、有限値であればよい。
　開口部の孔径と凹部の深さの比(開口部の孔径／凹部の深さ)は、特に限定されるものではないが、細胞の播種や回収のしやすさの観点から、5/1～1/5、3/1～1/3、2/1～1/1が例示される。前記範囲内の場合、細胞が凹部から飛び出し難く、また、細胞の回収の点で有利となりうる。
　凹部の個数は、基材の面積や培養する細胞及び／又はその集合体の種類等によって一概に設定することはできず、当該技術常識に従って適宜設定することができる。例えば、単位面積(cm2)あたりの下限個数は1個、10個、30個、50個など、上限個数は1000個、500個、300個、200個、100個などを例示することができる。また、基材表面における凹部の総数は、例えば、10個以上、100個以上、1000個以上、10000個以上、50000個以上など、適宜設定することができる。
　細胞培養用基材の材質は、特に限定されず、公知のものであればよい。また、細胞培養用基材全体が同一の材質からなるものであっても、複数の材質で構成されるものであってもよい。具体的には、例えば、凹部と基材表面とで異なる材質のものであってもよく、さらに、凹部内の位置によって異なる材質で構成されていてもよい。
　例えば、凹部の内側面と凹部の底面が異なる材質で構成される細胞培養用基材の一例として、凹部の内側面が細胞非接着性表面を有し、かつ、凹部の底面が細胞接着性表面を有する細胞培養用シートを挙げることができる。かかる細胞培養用シートは、開口部の口径が小さいことに加え前記表面特性を有することで、培養物が基材に接着しやすくなって回収がより困難になるところ、本発明では培養物へのダメージを低減しながら、高い回収効率を得ることが可能となる。
　本発明の細胞及び／又はその集合体の回収方法は、種々の細胞培養用基材に適用可能であるが、好ましくは、基材の細胞接着性表面上で培養された細胞の回収に用いられ、さらに好ましくは、適度な細胞接着性を示す表面で接着培養された細胞の回収に用いられる。
　「細胞接着性表面」とは、例えば、培養に用いる溶液中において、細胞が当該表面上に沈降した場合に、当該細胞が、ある一定の接着点を持って接着するような表面のことである。細胞接着性表面は、少なくとも細胞接着性を示す物質で構成されていればよい。
　細胞接着性を示す物質としては、用いる細胞の細胞膜に存在するたんぱく質や糖鎖等の細胞表面分子に対して結合し得る物質であれば特に限られず用いることができる。親水性を示すものであっても疎水性を示すものであってもよいが、細胞接着性、スフェロイドの形成性等の観点から、親水性（特に、超親水性ではない親水性）又は疎水性（特に、超疎水性ではない疎水性）のものが好ましく、疎水性を示すものがさらに好ましい。また、細胞接着性を示す物質の接着性の程度は、細胞が凹部内から飛び出さない程度であってもよい。
　このような物質の一例を挙げると、具体的には、生体から取得され若しくは合成された物質が挙げられ、例えば、タンパク質(コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等)や、合成樹脂(スチレン系樹脂、ポリオレフィン樹脂、ポリシクロオレフィン樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリイミド樹脂、ポリスルホン樹脂、ポリエーテルスルホン樹脂、ポリジメチルシロキサン樹脂、これらの混合物や表面改質物等)が含まれる。合成樹脂を選択する場合、合成樹脂自体の強度や耐熱性から、取り扱い性に優れる細胞培養用シートを得ることができる。また、生体適合性の観点から、該シートを用いて得られる培養細胞もしくはスフェロイドの均一性が向上する観点から、または、種々の細胞と適度に接着することにより培地交換作業が容易となる観点から、スチレン系樹脂、ポリオレフィン樹脂やポリイミド樹脂のような合成樹脂を選択することが好ましい。スチレン系樹脂、ポリオレフィン樹脂やポリイミド樹脂のような非生物由来の成分を選択することで、スチレン系樹脂、ポリオレフィン樹脂やポリイミド樹脂等を含む細胞培養用基材を用いて得られるスフェロイドは、再生医療や創薬等の分野への適用が容易となる。
　ポリイミド樹脂としては、以下の式（Ｉ）で示される構成単位を含むポリイミド樹脂が例示できる。また、スフェロイド形成が良好であるという観点から、分子内にフッ素原子を有する樹脂が好ましく、含フッ素ポリイミド（含フッ素ポリイミド樹脂）がより好ましい。本発明で用いられるポリイミド樹脂は、典型的には、酸二無水物とジアミンとを各々１種以上重合させて得られるポリアミド酸をイミド化することにより得られる。ポリイミド樹脂は、ポリアミド酸を化学構造の一部に含んでいてもよい。ポリイミド樹脂を製造する方法としては、公知の手法で製造すればよい。一例として二段合成法が使用できる。ポリイミド樹脂の二段合成法は前駆体としてポリアミド酸を合成し、ポリアミド酸をポリイミドに変換する方法である。前駆体としてのポリアミド酸はポリアミド酸誘導体であってもよい。ポリアミド酸誘導体としては、例えばポリアミド酸塩、ポリアミド酸アルキルエステル、ポリアミド酸アミド、ビスメチリデンピロメリチドからのポリアミド酸誘導体、ポリアミド酸シリルエステル、ポリアミド酸イソイミドなどが挙げられる。ポリイミドとしてはピロメリット酸二無水物、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物等の酸無水物と、オキシジアミン、パラフェニレンジアミン、メタフェニレンジアミン、ベンゾフェノンジアミン等のジアミンとからなるポリイミドが例示できる。フッ素原子を有する樹脂としては、例えば、４，４’－ヘキサフルオロイソプロピリデンジフタル酸無水物（６ＦＤＡ）／１，４－ビス（アミノフェノキシ）ベンゼン（ＴＰＥＱ）共重合体、６ＦＤＡ／１，３-ビス（４-アミノフェノキシ）ベンゼン（ＴＰＥＲ）共重合体、６ＦＤＡ／４，４’－オキシジフタル酸無水物（ＯＤＰＡ）／ＴＰＥＱ共重合体、４，４’－（４，４’－イソプロピリデンジフェノキシ）ジフタル酸（ＢＰＡＤＡ）／２，２－ビス［４－（４－アミノフェノキシ）フェニル］ヘキサフルオロプロパン（ＨＦＢＡＰＰ）、６ＦＤＡ／２，２－ビス（４－（４－アミノフェノキシ）フェニル）プロパン（ＢＡＰＰ）共重合体等の以下の式（Ｉ）で示される構成単位を含む含フッ素ポリイミド樹脂；エチレン－テトラフルオロエチレン共重合体等が例示できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　上記式（Ｉ）中、Ｘ０は酸素原子、硫黄原子、カルボニル基、スルホニル基、または２価の有機基のいずれかを示し；
Ｙは２価の有機基を示し；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、及びＺ６は互いに独立して水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子のいずれかを示し、
ｐは０または１である。
なお、ポリイミド樹脂において、式（Ｉ）で示される化学構造は、樹脂の構成単位ごとに異なってもよく、同一であってもよい。Ｘ０、Ｙ、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、及びＺ６の少なくとも１つはフッ素原子を１個以上含むことが好ましい。
　上記式（Ｉ）中、ｐ＝０である場合にはＸ０は存在していなくても（換言すれば、左右のベンゼン環が直接結合していても）よいが、ｐ＝１である場合には、左右のベンゼン環はＸ０を介して結合する。
　Ｘ０で示される２価の有機基としては、具体的には、アルキレン基、アリーレン基、アリーレンオキシ基、アリーレンチオ基等が挙げられる。また、縮合環式の２価の炭化水素基、ヘテロ環縮合環式の２価の炭化水素基、及びこれらのオキシ基、チオ基であってもよい。これらの中でも、アルキレン基、アリーレンオキシ基、アリーレンチオ基が好ましく、アルキレン基、アリーレンオキシ基がより好ましく、これらはフッ素原子で置換されていてもよい。上記アルキレン基の炭素数は、例えば１～１２であり、好ましくは１～６である。
　Ｘ０の例であるフッ素原子で置換されたアルキレン基としては、例えば、－Ｃ（ＣＦ３）２－、－Ｃ（ＣＦ３）２－Ｃ（ＣＦ３）２－等を例示することができる。Ｘ０の例である上述したアルキレン基の中では、－Ｃ（ＣＦ３）２－が好適である。
　Ｘ０の例であるアリーレン基としては、例えば、以下のものを例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　Ｘ０の例であるアリーレンオキシ基としては、例えば、以下のものを例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　Ｘ０の例であるアリーレンチオ基としては、例えば、以下のものを例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　基材上にスフェロイドを良好に形成しうるという観点からは、Ｘ０で示される２価の有機基としては、上記ｂ－２～ｂ－１０およびｃ－２～ｃ－１０からなる群から選択されるものでもよく、上記ｂ－７～ｂ－９およびｃ－７～ｃ－９からなる群から選択されるものでもよく、ｂ－８で表される構造であってもよい。
　Ｘ０の例である上述したアリーレン基、アリーレンオキシ基及びアリーレンチオ基は、各々独立して、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であり、好ましくはフッ素原子または塩素原子であり、より好ましくはフッ素原子である）、メチル基およびトリフルオロメチル基よりなる群から選択される基により置換されていてもよい。これら置換基は複数であってもよく、その場合には置換基の種類は互いに同一であっても異なっていてもよい。アリーレン基、アリーレンオキシ基およびアリーレンチオ基に置換している好適な置換基は、フッ素原子および／またはトリフルオロメチル基であり、好適にはフッ素原子である。アリーレン基、アリーレンオキシ基およびアリーレンチオ基は、Ｙにフッ素原子が含まれない場合、少なくとも１つ以上のフッ素原子で置換されることが好ましい。
　上記式（Ｉ）中、Ｙで示される２価の有機基としては、特に制限されないが、例えば、芳香環を有する２価の有機基が挙げられる。詳しくは、１個のベンゼン環からなる基もしくは、２個以上のベンゼン環が炭素原子（すなわち、単結合、またはアルキレン基）、酸素原子、硫黄原子を介してまたは直接結合した構造を有する基が挙げられる。具体的には、以下の基を例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　Ｙの例である上述した芳香環を有する２価の有機基は、置換可能であれば、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であり、好ましくはフッ素原子または塩素原子、より好ましくはフッ素原子である）、メチル基およびトリフルオロメチル基からなる群から選択される基により置換されていてもよい。これら置換基は複数であってもよく、その場合には置換基の種類は互いに同一であっても異なっていてもよい。芳香環を有する２価の有機基に置換している好適な置換基は、特にＸ０にフッ素原子が含まれない場合は、フッ素原子および／またはトリフルオロメチル基であることが好ましく、より好適にはフッ素原子である。
　スフェロイド形成性の観点から、上記式（Ｉ）中、Ｙはｄ－３、ｄ－９、ｅ－１～ｅ－４、ｆ－６、およびｆ－７からなる群から選択される構造であることが好ましく、より好ましくはｅ－１、ｅ－３またはｅ－４の構造である。
　上記式（Ｉ）中、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、及びＺ６は、各々同じであってもよく異なっていてもよく、それぞれ独立して、水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子から選ばれ、Ｘ０およびＹの少なくとも一方にフッ素原子が含まれない場合、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、およびＺ６の少なくとも１つはフッ素原子であることが好ましい。
　スフェロイド形成性の観点から、本発明の好ましい一実施形態では、上記式（Ｉ）中、Ｘ０で示される２価の有機基が、－Ｃ（ＣＦ３）２－、上記ｂ－２～ｂ－１０およびｃ－２～ｃ－１０からなる群から選択され；かつ、Ｙが、ｄ－３、ｄ－９、ｅ－１～ｅ－４、ｆ－６、およびｆ－７からなる群から選択される。本発明のより好ましい一実施形態では、上記式（Ｉ）中、Ｘ０で示される２価の有機基が、－Ｃ（ＣＦ３）２－、ｂ－７～ｂ－９およびｃ－７～ｃ－９からなる群から選択され；かつ、Ｙが、ｅ－１、ｅ－３およびｅ－４からなる群から選択される。
　上記の式（Ｉ）で示される構成単位からなるポリイミド樹脂は、酸二無水物とジアミンとの重合により得られるポリアミド酸を焼成する手法により得ることができる。なお、上記「式（Ｉ）で示される構成単位からなるポリイミド樹脂」のイミド化率は、１００％でなくともよい。すなわち、式（Ｉ）で示される構成単位からなるポリイミド樹脂は、上記式（Ｉ）で表される構造単位のみからなるものであってもよいが、本発明の目的効果が損なわれない範囲において、環状イミド構造が脱水閉環せずにアミド酸のままである構成単位が一部に含まれていてもよい。
　ポリアミド酸合成反応は有機溶媒中で行われることが好適である。ポリアミド酸合成反応に用いられる有機溶媒としては、原料である酸二無水物とジアミンとの反応が効率よく進行でき、かつこれらの原料に対して不活性であれば、特に限定されるものではない。例えば、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、スルホラン、メチルイソブチルケトン、アセトニトリル、ベンゾニトリル、ニトロベンゼン、ニトロメタン、アセトン、メチルエチルケトン、イソブチルケトン、メタノール等の極性溶媒；トルエンやキシレン等の非極性溶媒等が挙げられる。中でも、極性溶媒を用いることが好ましい。これらの有機溶媒は、単独で使用されてもよいし、２種以上の混合物として使用されてもよい。アミド化反応後の反応混合物をそのまま熱イミド化に供してもよい。前記ポリアミド酸の溶液中の前記ポリアミド酸の濃度は特に限定されないが、得られる樹脂組成物の重合反応性と重合後の粘度、その後の製膜、焼成での取り扱いやすさの観点から、好ましくは、5重量％以上、より好ましくは10重量％以上、好ましくは50重量％以下、より好ましくは40重量％以下である。前記樹脂組成物の粘度は特に限定されるものではないが、公知の測定方法に従って測定することができ、例えば、23℃において1～20Pa・s、好ましくは3～15Pa・sの範囲内である。
　前記ポリアミド酸を、熱イミド化または化学イミド化のいずれかによりイミド化して含フッ素ポリイミドを含む樹脂組成物を得る。特定の実施形態では、前記ポリアミド酸を、加熱処理によりイミド化（熱イミド化）して含フッ素ポリイミドを含む樹脂を得る。熱イミド化で得られたポリイミドは、触媒の残存の可能性がなく、細胞培養用途ではより好ましい。
　熱イミド化によりイミド化する場合、例えば、前記ポリアミド酸を、空気中で、またはより好ましくは窒素、ヘリウム、アルゴン等の不活性ガス雰囲気下で、或いは真空中で、好ましくは温度50～400℃、より好ましくは100～380℃、好ましくは時間0.1～10時間、より好ましくは0.2～5時間の条件下で焼成してイミド化反応を行うことによりポリイミドを含む樹脂組成物を得ることができる。
　熱イミド化反応に供する前記ポリアミド酸は、適当な溶媒中に溶解された形態であることが好ましい。溶媒としては、ポリアミド酸を溶解するものであれば良く、ポリアミド酸合成反応に関して上記した溶媒を用いることもできる。
　化学イミド化によりイミド化する場合では、適当な溶媒中で後述の脱水環化試薬の使用によりポリアミド酸を直接イミド化することができる。
　前記脱水環化試薬は、ポリアミド酸を化学的に脱水環化してポリイミドとする作用を有するものであれば、特に制限なく用いることができる。このような脱水環化試薬としては、第三級アミン化合物を単独で用いるか、または、第三級アミン化合物とカルボン酸無水物とを組合せて用いることが、イミド化を効率よく促進させうる点で好ましい。
　第三級アミン化合物としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン、１，５－ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ－５－エン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルジアミノメタン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－１，３－プロパンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－１，４－フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－１，６－ヘキサンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラエチルメチレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラエチルエチレンジアミン等が挙げられる。これらの中でも特に、ピリジン、ＤＡＢＣＯ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルジアミノメタンが好ましく、ＤＡＢＣＯがより好ましい。３級アミンは１種のみであってもよいし、２種以上であってもよい。
　カルボン酸無水物としては、例えば、無水酢酸、無水トリフルオロ酢酸、無水プロピオン酸、無水酪酸、無水イソ酪酸、無水コハク酸、無水マレイン酸等が挙げられる。これらの中でも特に、無水酢酸、無水トリフルオロ酢酸が好ましく、無水酢酸がより好ましい。カルボン酸無水物は１種のみであってもよいし、２種以上であってもよい。
　化学イミド化においてポリアミド酸を溶解する溶媒としては、溶解性に優れる極性溶媒が好適である。例えば、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ－メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド等が挙げられ、これらの中でも特に、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドおよびＮ－メチルピロリドンからなる群より選ばれる１種以上であることが均一反応をする観点から好ましい。アミド化反応の溶媒としてこれらの溶媒を用いた場合、アミド化反応後の反応混合物からポリアミド酸を分離せずそのまま化学イミド化に用いることができる。
　ポリイミド樹脂の重量平均分子量は、例えば、5000～2000000、好ましくは8000～1000000であり、さらに好ましくは20000～500000である。なお、本明細書において、樹脂の重量平均分子量は公知の測定方法に従って測定することができ、重量平均分子量が上記範囲であることにより、ポリイミド樹脂の合成および取扱い、フィルム化、スフェロイド形成性がより良好となる。
　細胞接着性表面は、前記した細胞接着性を示す物質以外に、可塑剤、酸化防止剤等の添加剤成分をさらに含んでもよい。
　細胞接着性を示す物質又は細胞接着性表面［疎水性（特に、超疎水性でない疎水性）の細胞接着性を示す物質又は細胞接着性表面］は、静的水接触角が70°以上であってもよく、転落角が15°以上であってもよく、また、静的水接触角が70°以上かつ転落角が15°以上であってもよい。
　特に、細胞接着性を示す物質又は細胞接着性表面［疎水性（特に、超疎水性でない疎水性）の細胞接着性を示す物質又は細胞接着性表面］は、静的水接触角が70°以上であることが好ましい。細胞接着性表面がこのような条件を満たすことにより、スフェロイド形成がより一層促進される。スフェロイド形成性の観点から、静的水接触角は、より好ましくは75°超であり、さらに好ましくは77°以上、よりさらに好ましくは79°以上、特に好ましくは80°以上（例えば80°超）であり、静的水接触角の上限は、例えば150°未満であり、好ましくは120°以下（例えば、120°未満）であり、より好ましくは110°以下であ、特に100°以下（例えば99°未満、98°以下、97°以下、95°以下等）であり、さらに好ましくは90°未満である。
　一方、細胞接着性を示す物質又は細胞接着性表面［親水性（特に、超親水性でない親水性）の細胞接着性を示す物質又は細胞接着性表面］の静的水接触角は、好ましくは65°以下、より好ましくは55°以下、さらに好ましくは50°以下であってもよい。なお、下限値は、0°以上であってもよく、好ましくは5°以上、より好ましくは10°以上であってもよい。
　また、同様の観点から、細胞接着性を示す物質又は細胞接着性表面の転落角は、18°以上、19°以上、20°以上、22°以上、24°以上、26°以上、28°以上、30°以上の順で高いほど好ましい。転落角の上限値は、例えば80°未満であり、好ましくは70°以下（例えば70°未満）であり、より好ましくは60°以下（例えば60°未満）であり、さらに好ましくは50°以下（例えば50°未満）である。
　なお、このような静的水接触角や転落角は、細胞接着性表面における値であってもよく、細胞接着性を示す物質（又は細胞接着性表面を構成する物質）における値であってもよい。
　なお、前記表面特性は公知の方法に従って測定することができる。例えば、静的水接触角や転落角は、例えば後述の方法等により測定してもよい。
　細胞接着性を示す表面が凹部の底面を構成する場合、細胞接着性を示す物質が、凹部の底面を占める割合としては、特に限定はされないが、凹部の底面のうち、90％以上、95％以上、99％以上、実質的に底面全てを占めることが好ましい。また、底面における細胞接着性表面は観察性の観点から平坦状（平底状、平板状）であることが好ましい。
　「細胞非接着性表面」とは、例えば、培養に用いる溶液中において、細胞が当該表面上に沈降した場合に、当該細胞が、その形状をほとんど変化させず、全く接着しないか又は一時的に弱く接着したとしても自然に脱離する表面のことである。細胞非接着性表面は、少なくとも細胞非接着性を示す物質で構成されていればよい。
　細胞非接着性を示す物質としては、培養に用いる細胞が接着しないか、又は用いる細胞の細胞膜に存在するたんぱく質や糖鎖等の細胞表面分子に対して結合しない物質であれば特に限られず用いることができ、生体適合性を有するものであっても、有さないものであってもよい。
　また、細胞非接着性を示す物質（又は細胞非接着性表面）は、疎水性を示すものであっても親水性を示すものであってもよく、例えば、超撥水性（超疎水性）のものや超親水性のものであってもよい。細胞の非接着性、スフェロイドの均一性および形成性等の観点から、疎水性（特に超疎水性）［例えば、疎水性又は親水性（特に疎水性）の細胞接着性表面又は当該表面を構成する樹脂（さらにはその接触角）に対してより疎水性（特に超疎水性）］を示す物質が特に好ましいが、親水性（特に超親水性）［例えば、親水性又は疎水性（例えば、疎水性）の細胞接着性表面又は当該表面を構成する樹脂（さらにはその接触角）に対してより親水性（特に超親水性）］を示す物質も好ましい。
　このような物質の一例を示すと、具体的には、例えば、（ポリ）エチレングリコール及びその誘導体、MPC(2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン)及びその誘導体、HEMA(ヒドロキシエチルメタクリレート)及びその誘導体等を含む化合物あるいはそれら化合物の重合体［例えば、poly-HEMA(ポリヒドロキシエチルメタクリレート)等］、SPC(セグメント化ポリウレタン)及びその誘導体等の化合物や、生体から取得されたタンパク質(アルブミン等)、細胞が接着しない糖鎖（アガロース、セルロース等）を、細胞の種類に応じて適宜選択して用いることができる。なかでも、細胞接着性表面や合成樹脂との接着性の観点から、または、細胞培養用基材ないし細胞培養用シートの製造工程を簡素化できる観点から、または、得られる培養細胞もしくはスフェロイドの均一性が向上する観点から、MPC及びその誘導体あるいはそれらの重合体が好ましい。
　なお、細胞非接着性を示す物質は、取扱性、所望の疎水性（例えば、超疎水性）・親水性（例えば、超親水性）の程度等に応じて、適宜、変性したものを使用してもよい。例えば、親水性の物質を架橋処理等することで、親水性と水に対する低溶解性を両立させてもよい。また、原料となる物質（例えば、疎水性又は親水性）を、適宜、疎水化処理ないし親水化処理（例えば、疎水性基ないし親水性基の導入等）し、所望の疎水性ないし親水性の材質を得てもよい。
　細胞非接着性を示す物質の固定化は、これらを含有する溶液を基材表面上で乾燥させる方法、当該物質を溶融させて圧着する方法、基材に塗布した当該物質をＵＶ等のエネルギー線で硬化させる方法、当該物質が有する官能基と基材上の官能基との間で化学反応(例えば、カルボキシル基やアミノ基等の官能基間の縮合反応等)を起こさせて共有結合を形成させる方法、又は当該物質が有するチオール基と基材に予め形成された金属(プラチナ、金等)薄膜とを結合させる方法により、当該基材表面上に固定化することができる。固定化する際の厚みは特に限定されず、0.01～1000μmが例示される。
　細胞非接着性を示す表面が凹部の内側面を構成する場合、細胞非接着性を示す表面が凹部の内側面を占める割合としては、特に限定はされないが、培養細胞の付着性を低減させる程度であることが好ましい。好ましくは内側面の面積の90％以上、より好ましくは95％以上、特に好ましくは全てを占めることが好ましい。
　細胞非接着性を示す表面は、培養される細胞のサイズを均一にしたり、円形度を向上させたりする観点から、その表面特性として、例えば、静的水接触角を指標として判断することができる。例えば、前記細胞非接着性を示す物質で形成された疎水性表面である場合、静的水接触角は、好ましくは９０°以上、より好ましくは９３°以上、さらに好ましくは９５°以上である。また、１５０°以下であってもよく、好ましくは１３０°以下、より好ましくは１２０°以下である。
　一方、親水性表面である場合、静的水接触角は、好ましくは６５°以下、より好ましくは５５°以下、さらに好ましくは５０°以下である。また、０°以上であってもよく、好ましくは５°以上、より好ましくは１０°以上である。
　このような物質の一例を示すと、疎水性が高いMPC（又は当該MPCで形成された表面）では、静的水接触角が、例えば９０°以上、１００°以上のような静的水接触角を実現しうる。
　なお、このような静的水接触角は、細胞非接着性表面における値であってもよく、細胞非接着性を示す物質（又は細胞非接着性表面を構成する物質）における値であってもよい。
　また、静的水接触角は、例えば後述の方法等により測定してもよい。
　得られるスフェロイドのサイズ均一性及び円形度を向上させる観点から、細胞接着性表面と細胞非接着性表面との接着程度のバランスをとることが好ましい。よって、仮に、細胞非接着性表面が細胞に接着性を示すものであっても、細胞接着性表面より低接着性であればよい。例えば、上記の静的水接触角を指標とした場合、細胞非接着性表面（又は細胞非接着性を示す物質）における静的水接触角の差（又はその絶対値）が３°以上（例えば、５°以上）であることが好ましく、１０°以上（例えば、１２°以上）であることがより好ましく、１５°以上であることがさらに好ましい。また、上記差（又はその絶対値）の上限は、細胞非接着性表面（又は細胞非接着性を示す物質）及び細胞接着性表面（又は細胞接着性を示す物質）の疎水性・親水性の組み合わせ等に応じて適宜選択することができ、特に限定されないが、例えば、１００°、９０°、８０°、７０°、６０°、５０°、４０°、３０°などであってもよい。
　これらの特性を有する表面は、凹部の内側面が細胞非接着性表面に、凹部の底面が細胞接着性表面となるよう、それぞれ独立して、当該特性を有する物質がベース材表面に物理的又は化学的に固定又は配置されて形成されたものであっても、前記該当箇所が当該特性を有する物質で作製したシート状のもので構成されてもよい。
　また、前記した細胞培養用シートにおいては、凹部の辺縁部でもあるシート表面は、細胞培養用シート製造の簡便化の観点から細胞非接着性表面を有していてもよい。シート表面の細胞非接着性表面は、凹部の内側面と同じ細胞非接着性表面であっても、異なる細胞非接着性表面であってもよい。同じ細胞非接着性表面の場合は、シート表面と凹部の内側面は連続した表面を有していてもよい。
　かかる構成の凹部を有する細胞培養用シートは、凹部の底面を含む層と凹部の内側面を含む層を含む層状構造物であってもよい。ここで、凹部の内側面を含む層とは、層自体は貫通孔を有する層を構成している。よって、前記シートの一態様として、貫通孔を有する細胞非接着性表面を有する層と、細胞接着性表面を有する層を含む積層物である態様を挙げることができる。
　貫通孔を有する細胞非接着性表面を有する層は、貫通孔を形成する観点から、または細胞培養用シートの製造を簡略化する観点から、細胞非接着性を示す物質を層状のベース材に固定化したものが好ましい。
　層状のベース材としては、当該技術分野で公知のものであれば用いることができる。例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエステル（ポリエチレンテレフタレート等）、ポリウレタン、ポリスルホン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシクロオレフィン、ポリエーテルケトン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリイミド、シリコン等の合成樹脂、ＥＰＤＭ（エチレンプロピレンジエンゴム）等の合成ゴムや天然ゴム、ガラス、セラミック、ステンレス鋼等の金属材料等からなる板状体が挙げられる。透明のベース材であることも好ましい形態の一つである。
　層状のベース材への細胞非接着性を示す物質の固定化は、作業性の観点から、後述の貫通孔を形成してから、固定化を行うことが好ましい。
　貫通孔は、好ましくはその壁が前記した凹部の内側面に相当するものであり、開口部やその反対の端部の孔径や形状は、前記した凹部と同様に設定することができる。また、貫通孔の深さは細胞非接着性表面を有する層の厚みに相当するが、前記した凹部の深さにも相当し、凹部と同様に設定することができる。なお、細胞非接着性を示す物質を層状のベース材に固定化する場合は、細胞非接着性を示す物質の層として、例えば、1nm以上であることが好ましく、10nm以上であることがより好ましく、細胞非接着性を示す物質の層と基材を含めた層全体の厚みが、前記した細胞非接着性表面を有する層の厚みの範囲内になるのであれば適宜設定することができる。
　貫通孔の形成は、前記したサイズの貫通孔が形成できるのであれば特に限定されず、実施することができる。例えば、穿孔加工(ドリル等)、光微細加工(レーザー(例えば、CO2レーザー、エキシマレーザー、半導体レーザー、YAGレーザー)等)、エッチング加工、エンボス加工等により形成することができる。前記加工において、貫通孔の形状がテーパー形状になるような加工であってもよく、その際に、端部の周囲が変形して、開口部の辺縁部と、開口部と隣接する開口部の中間領域に位置する部分の層厚みが異なるような構造を形成してもよい。
　細胞接着性表面を有する層の厚みは、例えば、1nm以上、4mm以下であり、1μm以上、1mm以下であることが好ましく、凹部の底面厚みと同じであっても良い。
　前記細胞培養用シートとしては、前記した細胞接着性表面を有する層と細胞非接着性表面を有する層との間に、さらに接着層（粘着層）を含む態様も含む。
　接着層としては、当該技術分野で公知のものであれば用いることができる。例えば、アクリル系樹脂、シリコン系樹脂、合成ゴム、天然ゴムなどが挙げられ、好ましくは低溶出性の接着層を用いることができる。市販の両面テープなどを用いてもよい。
　接着層の厚みは、特に限定されず、本発明の効果を損なわない範囲内であれば、適宜設定することができる。例えば、0.5～100μmが例示される。
　前記細胞培養用シートは、貫通孔を有する細胞非接着性表面を有する層及び細胞接着性表面を有する層をこの順に積層して製造することができる。上記以外の層が積層されていても良く、空洞を有する層が積層されていても良い。
　各層を積層する際には、予め調製した各層を順に積層するものであってもよく、予め調製した層上に別途、層を形成する方法であってもよく、これらを組み合わせたものであってもよい。具体的には、例えば、表面を剥離処理した離型シート(例えば、ポリエチレン基材等の有機ポリマーフィルム、セラミックス、金属、ガラス等)の上に、細胞接着性を示す物質をキャスティング、スプレーコーティング、ディップコーティング、スピンコーティング、ロールコーティングなどの方法により、適当な厚さに塗工して加熱することにより細胞接着性表面を有する層をシート状に成形することができる。一方、細胞非接着性表面を有する層のベース材に対して、貫通孔を形成後、細胞非接着性を示す物質を表面にコーティングして、細胞非接着性表面を有する層を予め調製することができる。そして、上記で成形した細胞接着性表面を有する層の剥離シートを剥離後に、別途調製した細胞非接着性表面を有する層を積層することで、製造することができる。なお、細胞非接着性表面を有する層と細胞接着性表面を有する層の積層においては、前記した接着層（粘着層）を用いて積層してもよく、あるいは、溶着（高周波溶着、超音波溶着等）、圧着（熱圧着等）により積層してもよい。
　細胞培養用シートは、厚みは特に限定されないが、取り扱い性の観点から、10～5000μmが好ましく、10～2000μmがより好ましい。シート面積も特に限定されず、例えば、0.01～10000cm2、好ましくは0.03～5000cm2が例示される。
　かくして得られた細胞培養用シート等の細胞培養用基材は、公知の細胞培養装置にそのまま設置して用いる観点から、対象装置の大きさに合わせて、適宜サイジング加工してもよい。その一方の表面に細胞を含む培地を載せて細胞培養を実施すればよく、該細胞培養用基材を培養用のプレート、プレートの各ウェル、培養シャーレ（培養ディッシュ）、フラスコ、培養バック等の各種細胞培養用容器に収容して固定し、固定した該細胞培養用基材の一部または全面において細胞培養を実施することができる。
　かかる細胞培養用基材の凹部から回収される細胞及び／又はその集合体は、凹部内にて浮遊培養されるものでも、凹部底面に接着培養されるものであってもよい。その種類も特に限定はなく、例えば、ヒト又はヒト以外の動物（サル、ブタ、イヌ、ウサギ、ラット、マウス等）の任意の臓器又は組織（脳、肝臓、膵臓、脾臓、心臓、肺、腸、軟骨、骨、脂肪、腎臓、神経、皮膚、骨髄、歯髄、胚等）に由来する初代細胞、樹立された株化細胞、又はこれらに遺伝子操作等を施した細胞を用いることができる。細胞集合体は、細胞を培養することで形成された集合体（細胞凝集体、スフェロイド）であってもよい。凹部内の細胞及び／又はその集合体の個数は特に限定されず、例えば、凹部1個あたり、例えば、1～10000個が例示される。また、回収される細胞及び／又はその集合体のサイズ（直径）は、例えば、5～1000μmが好ましく、10～500μmがより好ましい。
　前記細胞及び／又はその集合体は凹部内にて培養可能であれば、少なくとも凹部内に培養液が充填されていれば基材全体における培養液量は限定されない。なお、細胞及び／又はその集合体を凹部内にて培養するに際して、必要に応じて予め前記細胞培養用基材の脱泡処理を行ってもよい。脱泡処理としては、特に限定されず、霧吹き、振盪、加温冷却などの温度変化、遠心処理、真空脱気、超音波処理などの一般的な処理を行うことができる。また、本発明で用いる細胞培養用基材の凹部が開口部の口径が直径1000μm以下であることから、口径が直径3mm以下の送液口部から、及び／又は、流速100cm/s以上で、送液用液を送液して脱泡処理を行ってもよい。このようにすることで、脱泡処理から回収までの一連の工程を効率よく行なうことができる。よって、本発明の一態様として、開口部の口径が直径1000μm以下の凹部を有する細胞培養用基材に、
口径が直径3mm以下の送液口部から、及び／又は、流速100cm/s以上で、送液用液を送液して脱泡し、該基材と少なくとも前記凹部に培養液を供える細胞培養用容器を調製する工程、
得られた細胞培養用容器にて細胞及び／又はその集合体を培養する工程、ならびに
前記培養工程後の細胞培養用容器に、口径が直径3mm以下の送液口部から、及び／又は、流速100cm/s以上で、送液用液を送液して回収する工程
を含む、細胞及び／又はその集合体の回収方法を挙げることができる。
　前記脱泡する工程では、細胞培養用基材の材質が疎水性の高い程気泡の付着性が強くなるようであるが、このような疎水性の高い材質であっても簡便に気泡を除くことができる。
　脱泡における送液に用いる装置又は器具としては、例えば、口径が直径3mm以下の送液口部を少なくとも有するものである。送液口部は、直径が3mm以下の送液口を有するものが挙げられ、例えば、2.5mm以下、2.0mm以下、1.7mm以下の口径を有するものであってもよい。また、凹部から気泡を取り除くための送液流量や送液流速の観点から、送液口部の直径と凹部開口部の直径の比（送液口部の直径／凹部開口部の直径）は、好ましくは30以下、より好ましくは20以下、更に好ましくは10以下であることが好ましい。下限は特に限定されず、例えば、0.1以上を挙げることができる。なお、送液口部の直径とは送液口部の最大内径のことである。
　送液口部は、前記した大きさの口径を有するのであれば、その形状や材質は特に限定されない。例えば、公知のディスペンサーの送液口部において前記口径を有するように製造または調整されたものや、前記口径を有する注射針、鈍針カニューレ、チップ、ゾンデなども用いることができる。
　また、前記脱泡における送液用装置又は器具は、前記送液口部以外に、送液用液を保持する部材を有するものが好ましい。具体的には、カートリッジやタンク、ボトルであってもよく、シリンジなども用いることができる。その大きさ（容量）や形状、材質は特に限定されない。前記部材は、送液口部とチューブなどを介して間接的に又は直接的に結合していてもよく、一体型に形成されたものであってもよい。
　脱泡における送液用液は、特に限定されない。脱泡用の送液用液として培養液そのものを用いてもよいし、生理食塩水や緩衝液などを用いてもよい。培養液を用いない場合には、送液後に凹部内に充填された液を除去し、その際には完全に液がなくならない程度まで除去してもよく、その後培養液に交換することで、あるいは、送液後にそのまま培養液を加えることで、細胞培養用基材の凹部に培養液を充填した状態にすることができる。また、送液前に、送液用液を事前に細胞培養用基材に注入してから前記脱泡処理を行うことができ、この事前注入を行なった際には凹部内に気泡が確認されてもよい。事前注入の方法や送液用液の液量は特に限定されない。
　脱泡における送液の方法は、前記送液口部から流出して凹部内を送液用液で充填することができれば、特に限定されない。具体的には、例えば、凹部の開口上端面の0.1～10mm上方に送液口部の先端を配置して送液する方法が挙げられる。その際に、送液口部の先端が、基材が設置された培養用容器に予め注入された液内に浸かる位置となるよう配置されてもよい。配置する送液口部は基材１個あたり１個でも、２個以上であってもよい。また、複数の凹部に一度に送液してもよく、細胞培養用基材そのものを、あるいは送液口部を移動させて連続的に又は間欠的に送液してもよい。また、自動化されていても手動であってもよい。一旦送液した後に凹部上方に存在する液を吸引して、再度、同じ凹部の上方でまたは異なる凹部の上方で送液してもよい。この場合、少量の送液と吸引を繰り返すと泡が生じ易くなることから、一度の送液量としては、例えば、10mL以上であってもよく、10～50mLが例示される。
　脱泡における送液流速は、例えば、100cm/s以上を挙げることができる。また、200cm/s以上、250cm/s以上、300cm/s以上などであってもよい。また、上限としては、基材上の細胞非接着性物質が剥離しなかったり、基材が破損したりしない流速が挙げられ、例えば、2000cm/sなどが挙げられる。
　また、脱泡における送液流量としては、特に限定されず、例えば、開口部面積1cm2あたり0.001mL/s以上が例示される。0.01mL/s以上、0.03mL/s以上、0.05mL/s以上、0.07mL/s以上などであってもよく、上限としては、例えば、20mL/sが挙げられる。
　また、前記脱泡における送液は無菌環境下で行うことができる。本発明においては、凹部内に液を充填できれば、必要により、細胞培養に要する公知の処理（例えば、安全キャビネット内での培養液交換、インキュベーター内での静置）を細胞培養用基材に行ってもよい。
　このようにして、少なくとも凹部内に気泡を形成又は残存させにくい状態で培養液を充填した細胞培養用容器を調製することができる。なお、前記送液により、液が存在しない所に液を充填して形成された気泡であっても、充填後しばらく放置してから形成された気泡であっても、除くことができる。
　得られた細胞培養用容器における細胞及び／又はその集合体の培養は、用いる細胞及び／又はその集合体によって一概には設定することができず、公知技術に従って適宜行なうことができる。培養液や培養条件は特に制限されない。所望の期間培養後に次の回収に供することができる。
　本発明では、細胞及び／又はその集合体を回収するために送液を行なう。回収における送液に用いる装置又は器具としては、例えば、口径が直径3mm以下の送液口部を少なくとも有するものである。送液口部は、直径が3mm以下の送液口を有するものが挙げられ、例えば、2.5mm以下、2.0mm以下、1.7mm以下の口径を有するものであってもよい。また、凹部から細胞又はその集合体を剥離及び／又は放出させるための送液流量や送液流速の観点から、送液口部の直径と凹部開口部の直径の比（送液口部の直径／凹部開口部の直径）は、好ましくは30以下、より好ましくは20以下、更に好ましくは10以下であることが好ましい。下限は特に限定されず、例えば、0.1以上を挙げることができる。なお、送液口部の直径とは送液口部の最大内径のことである。
　送液口部は、前記した大きさの口径を有するのであれば、その形状や材質は特に限定されない。例えば、公知のディスペンサーの送液口部において前記口径を有するように製造または調整されたものや、前記口径を有する注射針、鈍針カニューレ、チップ、ゾンデなども用いることができる。
　また、前記回収における送液用装置又は器具は、前記送液口部以外に、送液用液を保持する部材を有するものが好ましい。具体的には、カートリッジやタンク、ボトルであってもよく、シリンジなども用いることができる。その大きさ（容量）や形状、材質は特に限定されない。前記部材は、送液口部とチューブなどを介して間接的に又は直接的に結合していてもよく、一体型に形成されたものであってもよい。
　回収における送液用液は、特に限定されない。生理食塩水や緩衝液などを用いてもよいが、培養液そのものを用いてもよく、予め細胞培養用容器中に注入されていた培養液であってもよい。
　回収における送液の方法は、前記送液口部から流出して凹部内の細胞及び／又はその集合体を凹部内から剥離する程度のものでも、凹部外へ放出させる程度のものでもよく、特に限定されない。具体的には、例えば、凹部の開口上端面の0.1～10mm上方に送液口部の先端を配置して送液する方法が挙げられる。その際に、送液口部の先端が、基材が設置された培養用容器に予め注入された液内に浸かる位置となるよう配置されてもよい。配置する送液口部は基材１個あたり１個でも、２個以上であってもよい。また、複数の凹部に一度に送液してもよく、細胞培養用基材そのものを、あるいは送液口部を移動させて連続的に又は間欠的に送液してもよい。また、自動化されていても手動であってもよい。
　回収における送液流量としては、特に限定されないが、所定の流量で送液することが好ましい。例えば、開口部面積1cm2あたり0.001mL/s以上が例示される。0.01mL/s以上、0.03mL/s以上、0.05mL/s以上、0.07mL/s以上などであってもよく、上限としては、例えば、20mL/sが挙げられる。
　また、回収における送液流速は、特に限定されず、例えば、100cm/s以上を例示することができる。また、200cm/s以上、250cm/s以上、300cm/s以上などであってもよい。上限としては、基材上の細胞非接着性物質が剥離しなかったり、基材が破損したりしない流速が挙げられ、例えば、2000cm/sなどが挙げられる。
　また、前記回収における送液は無菌環境下で行うことができる。本発明においては、凹部から細胞及び／又はその集合体を剥離及び／又は放出させることができれば、基材上には、培養液と送液用液に加えて、細胞及び／又はその集合体が存在することになるので、例えば、基材上に存在する液を回収することで、細胞及び／又はその集合体そのものの回収が可能となる。基材上に存在する液の回収に用いる手段としては、細胞及び／又はその集合体にダメージを与えるような強い力がかからないものであれば特に制限はない。例えば、吸引による回収であってもよく、培養用容器から傾注して回収してもよい。必要により、追加の送液を行なって、凹部から細胞及び／又はその集合体を剥離及び／又は放出させてもよい。回収された細胞及び／又はその集合体は、公知の処理（例えば、継代、凍結、固定、切片作製、フローサイトメトリー評価、顕微鏡観察、遺伝子解析、移植）に供することができる。
　このようにして、細胞培養用基材に送液することで細胞及び／又はその集合体を回収することができる。かかる方法により、細胞及び／又はその集合体を簡単に回収でき、また、回収し易くなることから、高い効率で回収することが可能となる。また、回収された細胞及び／又はその集合体はダメージが少なくなりやすいことから、回収された細胞集団における生細胞率が例えば、80％以上と高いものとなる。よって、本発明はまた、前記方法により回収された、生細胞率80％以上の細胞集団を提供することができる。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、以下の実施例において、室温とは20～30℃を意味する。
製造例１
＜細胞接着性表面を有する層の調製（含フッ素ポリイミドフィルムの調製）＞
　５００ｍＬ容量の三口フラスコに、４，４’－ヘキサフルオロイソプロピリデンジフタル酸無水物２５．３３２g（０．０５７モル）、Ｎ－メチルピロリドン１６６．６０ｇを仕込み溶解した。そこへ、１，４－ビス（アミノフェノキシ）ベンゼン１６．６６８ｇ（０．０４９モル）をＮ－メチルピロリドン７１．４ｇに溶解したものを滴下投入し、窒素雰囲気下室温で撹拌後、５日間保持することで、含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物（固形分濃度１５質量％、６ＦＤＡ／ＴＰＥＱポリアミド酸）を得た。該ポリアミド酸の重量平均分子量は１５．３万で、粘度は６．７Ｐａ・ｓであった。なお、ポリアミド酸の重量平均分子量と、焼成後の含フッ素ポリイミドの重量平均分子量とは実質的に同一である。
　上記で得られた含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物を、焼成後の含フッ素ポリイミドフィルムの厚みが40μmとなるようにダイコーターを用いてガラス基体上に塗布し、塗膜を形成した。次いで、360℃にて１時間、窒素雰囲気下で塗膜の焼成を行った。その後、焼成物をガラス基体から剥離して、含フッ素ポリイミドフィルムを得た。この含フッ素ポリイミドフィルムの静的水接触角は83.2°、転落角は26.4°であった。
　上記における物性の測定方法は以下の通りである。
（重量平均分子量の測定）
装置：東ソー株式会社製ＨＣＬ－８２２０ＧＰＣ
カラム：ＴＳＫｇｅｌ Ｓｕｐｅｒ ＡＷＭ－Ｈ
溶離液（ＬｉＢｒ・Ｈ２Ｏ、リン酸入りＮＭＰ）：０．０１ｍｏｌ／Ｌ
測定方法：０．５重量％の溶液を溶離液で作製し、ポリスチレンで作製した検量線をもとに分子量を算出する。
（粘度の測定）
装置：アズワン製　粘度計　VISCOMETER TV-22
設定：VI　　RANGE：H　　ROTOR No.6　　SPEED：10rpm
粘度計校正用標準液：日本グリース（株）　JS 14000
測定方法：粘度計校正用標準液で校正後、ワニス0.3gを用いて測定する。（測定温度：２３℃）
（静的水接触角の測定）
装置：自動接触角計（協和界面科学製：ＤＭ－５００）
測定方法：表面（細胞非接着性表面又は細胞接着性表面）又はフィルム（細胞非接着性又は細胞接着性を示す物質で形成したフィルム）上に水２μＬを滴下した直後の液滴の付着角度を測定する（測定温度：２５℃）。
（転落角の測定）
装置：自動接触角計（協和界面科学製：ＤＭ－５００）
測定方法：表面（細胞非接着性表面又は細胞接着性表面）又はフィルム（細胞非接着性又は細胞接着性を示す物質で形成したフィルム）上に水２５μＬを滴下した後、シートを連続的に傾けていき、流れ落ちた際の角度を転落角とする（測定温度：２５℃）。
＜細胞非接着性表面を有する層の調製＞
　両面テープ(厚み25μm)の片面の剥離テープを剥離後透明なPETフィルム(厚み250μm)に貼り合わせたものに対して、CO2レーザーを用いて、直径300μm、ピッチ500μmで千鳥配置の貫通孔を形成した(形成された貫通孔：400個/cm2、42000個/シート、レーザー入射側孔径500μm、レーザー放出側孔径300μm)。その後、PETフィルム側の表面にスピンコーター（ミカサ製：MS-A150）を用いて、MPCポリマー溶液（0.5％エタノール溶液）を厚みが0.05μmとなるようにコーティングし、50℃の乾燥機内で2時間乾燥処理して、細胞非接着性表面を有する層［PETフィルムのコーティング層（MPCポリマーのコーティング層）側の静的水接触角１０７．５°］を得た。
＜細胞培養用シート・培養容器の調製＞
　次いで、細胞非接着性表面を有する層の両面テープのもう一方の剥離テープを除去した側の面に、上記で作製した細胞接着性表面を有する層を貼りあわせて、細胞培養用シートを調製した(シート厚み：315μm)。得られた細胞培養用シートを培養プレート内へ設置し、細胞培養に用いる容器を完成した。
実施例１
＜細胞の拡大培養＞
　細胞は、ヒト脂肪由来幹細胞（Human adipose derived stem cell：AdSC）を用いた。AdSCはメーカー品（ロンザ社、PT-5006）を購入して使用した。
　凍結細胞を37℃の恒温水槽で溶解させ、5％FBS、1％抗生物質を含んだKBM ADSC-2培地(基礎培地、コージンバイオ製）9mLに加えた。次いで、210×gで５分間の遠心処理を施した後、上清を除去して1mLの基礎培地に分散させた。800mL細胞培養用フィルターキャップ付フラスコ(住友ベークライト製）に細胞懸濁液を加えた後の全量が30mLとなるように基礎培地を予め加えておき、そこに細胞懸濁液を1.5×106細胞/フラスコとなるように加え、37℃の5％(v/v)CO2インキュベーター内で培養(拡大培養)を行った。
＜脱泡処理＞
　別途、製造例１で調製した培養容器の脱泡処理を行った。具体的には、安全キャビネット内で、はじめに培養容器に予め20mL程度のPBSを加えた。次に、18Gノンベベル針（内径0.9mm、テルモ製）を取り付けた20mLオールプラスチック（ニプロ製）に20mLのPBSを充填し、針の先端が容器内のPBSの液中に浸かる位置（凹部開口上端面から2mm程上方）で水平移動させながらシリンジを押し出すことによって、培養容器底部全表面の1/3程度の範囲に8秒程で全量を送液した後、次いで、容器内のPBSをシリンジで吸い取ってシリンジにPBSを再充填してから、再び、残る範囲に対しても同様の送液を繰り返して脱泡を行った。ほとんどのウェルに気泡が認められなくなったが、気泡が残った部分に対しては上記の操作を同様にして行った。その後、37℃の5％(v/v)CO2インキュベーター内で15分間静置した後、再びシリンジに充填したPBSを押し出すことで新たに生じた気泡を取り除いた。このような脱泡後、凹部からPBSが完全にはなくならないようにPBSを除去してから、1％抗生物質を含んだKBM ADSC-2培地を21mL加えて、37℃の5％(v/v)CO2インキュベーター内で１晩静置して、脱泡処理を行った培養容器を得た。
＜スフェロイドの作製＞
　培養用フラスコから培地を除去し、細胞剥離液accutase(プロモセル製)を5mL添加した後、37℃の5％(v/v)CO2インキュベーター内で５分程度保持して細胞を剥離した。次いで、剥離液を回収し、PBSを用いて総量が15mLとなるようにしてチューブへ移した。210×gで５分間遠心処理を施し、4mLの1％抗生物質を含んだKBM ADSC-2培地で懸濁させて、細胞数のカウントを行った。その後、1.0×106細胞/mLの濃度となるように調製した。
　37℃の5％(v/v)CO2インキュベーター内で１晩静置して脱泡処理を行った培養容器の培地を除去し、500細胞/穴となるように細胞を播種した。安全キャビネット内で15分静置した後、37℃の5％(v/v)CO2インキュベーターに入れて3日間培養した。
＜スフェロイドの回収＞
　3日間培養した容器の培地を吸引除去し、20mLのPBSを加えた。次に、18Gノンベベル針（内径0.9mm、テルモ製）を取り付けた20mLオールプラスチック（ニプロ製）に20mLのPBSを充填し、針の先端が容器内のPBSの液中に浸かる位置（凹部開口上端面から2mm程上方）で水平移動させながらシリンジを押し出すことによって、容器の凹部全体の1/3に8秒程で送液（開口部面積1cm2あたり約0.09mL/s、流速約393cm/s）を行い、スフェロイドを基材から剥離した。剥離したスフェロイドとPBSを20mLオールプラスチックで吸い取り、50mL遠沈管に回収した。
＜スフェロイド回収効率の算出＞
　スフェロイドを剥離、及び回収した容器をプレートスキャナー（スクリーン製）で撮影し、得られた画像を9分割して各地点でのスフェロイド回収効率を以下の式で算出し、その平均値を求めた。
　　回収効率（％）＝{（回収前のプレートに存在するスフェロイド数）－（回収後のプレートに存在するスフェロイド数）}÷（回収前のプレートに存在するスフェロイド数）×100
　また、回収したスフェロイド中の細胞の生存率を次のようにして測定した。スフェロイド分散液を210×gで5分間遠心処理を施し、7mLのAccumax（ナカライテスク製）液で懸濁させて室温で30分処理した。セルストレーナー（コーニング製）で濾過した細胞懸濁液を210×gで5分間遠心処理し、1mLのPBSで懸濁させて、細胞数のカウントを行うことで生存率を算出した。
＜結果＞
　シリンジを用いることで、容器外へPBSが漏れ出すことなくスフェロイドを回収することができた。回収効率は93±3％（9か所の平均値）であった。容器を無菌環境から出すことなくさらに大型の装置を用いずにスフェロイドを回収することができた（図１、２参照）。
　また、回収されたスフェロイドにおける生細胞率は98％と高いものであり、細胞に与えるダメージの少ない回収方法であることが分かる。
　本発明の方法により、ダメージを低減しやすく、細胞及び／又はその集合体の回収を簡便に効率的に行なうことが可能となるので、例えば、スフェロイド含有製剤などの細胞製剤の分野に好適に用いることができる。

Claims (10)

  1. 　開口部の口径が直径1000μm以下の凹部に細胞を含有する細胞培養用基材に、口径が直径3mm以下の送液口部から、及び／又は、流速100cm/s以上で、送液用液を送液する工程を含む、細胞及び／又はその集合体の回収方法。
  2. 　開口部面積1cm2あたり0.001mL/s以上の流量で送液する、請求項１記載の方法。
  3. 　凹部の0.1～10mm上方から送液する、請求項１又は２記載の方法。
  4. 　送液口部の口径が直径2.5mm以下である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　送液口部の直径と凹部開口部の直径の比（送液口部の直径／凹部開口部の直径）が30以下である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 　細胞培養用基材が、開口部の孔径が直径1000μm以下の凹部を複数有し、該凹部の内側面が細胞非接着性表面を有し、かつ、該凹部の底面が細胞接着性表面を有する細胞培養用シートである、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 　無菌環境下で行う、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  8. 　さらに、送液工程後の基材上に存在する液を回収する工程を含む、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  9. 　細胞がスフェロイドを形成している、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
  10. 　請求項１～９のいずれかに記載の方法により得られる、生細胞率80％以上の細胞集団。
PCT/JP2020/022235 2019-06-07 2020-06-05 細胞及び／又はその集合体の回収方法 WO2020246572A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021524917A JP7263512B2 (ja) 2019-06-07 2020-06-05 細胞及び／又はその集合体の回収方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019107478 2019-06-07
JP2019-107478 2019-06-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020246572A1 true WO2020246572A1 (ja) 2020-12-10

Family

ID=73652251

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2020/022235 WO2020246572A1 (ja) 2019-06-07 2020-06-05 細胞及び／又はその集合体の回収方法

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JP7263512B2 (ja)
TW (1) TW202113068A (ja)
WO (1) WO2020246572A1 (ja)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014148647A1 (ja) * 2013-03-19 2014-09-25 国立大学法人九州大学 肝臓組織型スフェロイド
WO2015163043A1 (ja) * 2014-04-22 2015-10-29 株式会社日本触媒 フッ素含有ポリマーを表面に含む細胞培養用基材
JP2017532970A (ja) * 2014-10-29 2017-11-09 コーニング インコーポレイテッド 灌流バイオリアクタ・プラットフォーム

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014148647A1 (ja) * 2013-03-19 2014-09-25 国立大学法人九州大学 肝臓組織型スフェロイド
WO2015163043A1 (ja) * 2014-04-22 2015-10-29 株式会社日本触媒 フッ素含有ポリマーを表面に含む細胞培養用基材
JP2017532970A (ja) * 2014-10-29 2017-11-09 コーニング インコーポレイテッド 灌流バイオリアクタ・プラットフォーム

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2020246572A1 (ja) 2020-12-10
JP7263512B2 (ja) 2023-04-24
TW202113068A (zh) 2021-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2015012415A1 (ja) 細胞の培養方法、細胞培養装置及びキット
JP6497677B2 (ja) ブロック共重合体、表面処理剤、その膜、およびそれを被覆した細胞培養基材
JP2021169523A (ja) 細胞製剤
JP7105887B2 (ja) 細胞培養用シート
WO2021029241A1 (ja) 細胞培養用基材
WO2020246572A1 (ja) 細胞及び／又はその集合体の回収方法
JP2016171778A (ja) 細胞培養用基材
CN107208126B (zh) 分离、除去、和分析细胞的方法
JP7421909B2 (ja) 細胞の輸送方法
WO2020246571A1 (ja) 細胞培養用容器の製造方法
JP6632205B2 (ja) ポリイミドを表面に含む細胞培養用基材
JP2021024860A (ja) 骨組織関連疾患の予防または治療剤
JP2017077241A (ja) 接着性細胞培養用基材、ならびにこれを利用した細胞培養容器および細胞培養方法
JP2020137519A (ja) ヒト脂肪由来幹細胞スフェロイドの製造方法
US20220145241A1 (en) Method for producing cell spheroids
JP2020094044A (ja) ヒアルロン酸含有スフェロイド及びその作製方法
KR20220139402A (ko) 세포 배양 기판, 이의 제조방법 및 용도
CN109477055B (zh) 细胞的制备方法、细胞培养装置和试剂盒
JP2019033742A (ja) 多能性幹細胞の培養基材及び多能性幹細胞の製造方法
JP2017077240A (ja) 接着性細胞培養用基材、ならびにこれを利用した細胞培養容器および細胞培養方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20818233

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021524917

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 20818233

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1