TW202113068A - 細胞及/或其集合體之回收方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種新穎的細胞及/或其集合體之回收方法以及藉由上述方法回收之細胞集群。本發明之細胞及/或其集合體之回收方法包括如下步驟：自口徑為直徑3 mm以下之送液口部及/或以流速100 cm/s以上，將送液用液送液至開口部之口徑為直徑1000 μm以下之凹部中含有細胞之細胞培養用基材；較佳為本發明之回收方法中，細胞培養用基材為如下細胞培養用片：其具有複數個開口部之孔徑為直徑1000 μm以下之凹部，該凹部之內側面具有細胞非接著性表面，且該凹部之底面具有細胞接著性表面。

Description

細胞及/或其集合體之回收方法

本發明係關於一種細胞及/或其集合體之回收方法。

先前，對培養細胞之回收進行了各種研究。

例如，專利文獻1中揭示有如下方法：藉由於細胞培養時使用包含纖維素奈米纖維之培養基，而對培養基中形成之纖維素奈米纖維之網絡給予較輕之衝擊等，使其崩解，而使培養細胞沈澱。

又，專利文獻2中揭示有如下方法：藉由將細胞接種於溫度響應性聚合物上，形成細胞片之後，給予低溫處理之刺激使其剝離，從而以片狀回收細胞。 [先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]WO2017/199737號 [專利文獻2]日本專利特開2015-119694號公報

[發明所欲解決之問題]

然而，先前技術之方法並不充分，如：需要進行繁雜之準備，如：為了回收而需要特定之容器或根據情形需要專用之設備等，此外，於低溫處理之情形時，直至回收之前需要時間等。又，若回收時施加強力，則會對細胞造成損害，或存在回收效率低之情況，故要求進一步之改良方法。

本發明之目的在於提供一種新穎的細胞及/或其集合體之回收方法以及藉由上述方法而回收之細胞集群。

又，本發明之目的在於提供一種簡便且有效率地回收細胞及/或其集合體之方法。 [解決問題之技術手段]

本發明人等為了達成上述目的而進行銳意研究，結果發現，於培養區間(孔)之直徑小之培養容器中，藉由自具有特定口徑之構件穩定地將液體送液至該區間，而可簡便且有效率地回收細胞，進行進一步之研究，從而完成本發明。

即，本發明係關於下述[1]～[10]。 [1]一種細胞及/或其集合體之回收方法，其包括如下步驟：自口徑為直徑3 mm以下之送液口部及/或以流速100 cm/s以上，將送液用液送液至開口部之口徑為直徑1000 μm以下之凹部中含有細胞之細胞培養用基材。 [2]如上述[1]記載之方法，其中以相對於開口部面積每1 cm² 為0.001 mL/s以上之流量進行送液。 [3]如上述[1]或[2]記載之方法，其中自凹部之0.1～10 mm上方進行送液。 [4]如上述[1]至[3]中任一項記載之方法，其中送液口部之口徑為直徑2.5 mm以下。 [5]如上述[1]至[4]中任一項記載之方法，其中送液口部之直徑與凹部開口部之直徑之比(送液口部之直徑/凹部開口部之直徑)為30以下。 [6]如上述[1]至[5]中任一項記載之方法，其中細胞培養用基材為如下細胞培養用片，上述細胞培養用片具有複數個開口部之孔徑為直徑1000 μm以下之凹部，該凹部之內側面具有細胞非接著性表面，且該凹部之底面具有細胞接著性表面。 [7]如上述[1]至[6]中任一項記載之方法，其係於無菌環境下進行。 [8]如上述[1]至[7]中任一項所記載之方法，其進而包括對送液步驟後存在於基材上之液體進行回收之步驟。 [9]如上述[1]至[8]中任一項記載之方法，其中細胞形成球狀細胞團塊(spheroid)。 [10]一種活細胞率80%以上之細胞集群，其係藉由如上述[1]至[9]中任一項記載之方法而獲得。 [發明之效果]

藉由本發明，可簡便且有效率地對細胞及/或其集合體進行回收。

本發明之細胞及/或其集合體之回收方法包括如下步驟：自口徑為直徑3 mm以下之送液口部及/或以流速100 cm/s以上，將送液用液送液至具有開口部之口徑為直徑1000 μm以下之凹部之細胞培養用基材。藉由該步驟，可將存在於細胞培養用基材之凹部內之細胞及/或其集合體自凹部內剝離，亦可釋出至凹部外，能夠直接回收。

關於本發明之回收方法，只要為其表面具有開口部之口徑為直徑1000 μm以下之凹部之細胞培養用基材，則可應用，只要可於上述凹部內培養細胞即可。

凹部之口徑只要直徑為1000 μm以下，則並無特別限定，例如可為800 μm以下、600 μm以下、500 μm以下、400 μm以下、300 μm以下。又，並不特別設定下限，例如可列舉10 μm。再者，凹部之直徑係指開口部之最大徑。

作為凹部之開口部之面積，相對於每1個凹部例如可例示0.5×10^-3 ～5.0×10^-1 cm² 之範圍內，可例示：1.0×10^-1 cm² 、5.0×10^-2 cm² 、2.0×10^-2 cm² 、1.0×10^-2 cm² 、5.0×10^-3 cm² 、2.5×10^-3 cm² 、2.0×10^-3 cm² 、1.0×10^-3 cm² 等。

凹部之深度只要可培養細胞，則並無特別限定，可根據培養之細胞之尺寸或凹部之形成方法等並依照該技術常識而適當設定。例如凹部之深度可為10 nm以上(例如100 nm以上)等，亦可為1 μm以上[例如：5 μm以上、10 μm以上(例如：10～1000 μm、10～300 μm)]等範圍內。

凹部之開口部及底面(底部)之形狀不限於圓形，例如可為多邊形或橢圓，底面之形狀可與開口部之形狀相同，亦可不同。又，底面可為平板狀(平坦狀)，可彎曲，亦可平滑，更理想為平坦及/或平滑之底面。作為底面之面積，相對於每1個凹部例如可例示0.5×10^-3 ～5.0×10^-1 cm² 之範圍內，可例示：1.0×10^-1 cm² 、5.0×10^-2 cm² 、2.0×10^-2 cm² 、1.0×10^-2 cm² 、5.0×10^-3 cm² 、2.5×10^-3 cm² 、2.0×10^-3 cm² 、1.0×10^-3 cm² 等。又，底面之口徑(長度)可與開口部之口徑相同，亦可不同。底面之口徑可小於開口部之口徑，亦可大於開口部之口徑。作為底面之口徑，例如可例示10～1000 μm、10～700 μm、10～600 μm、10～500 μm、10～400 μm、10～300 μm之範圍內。例如，於底面之口徑與開口部之口徑相同之情形時，凹部之形狀為柱形狀，其中，於開口部與底面之形狀為圓形之情形時，形成圓柱形狀。於底面之口徑小於開口部之口徑之情形時，凹部之形狀形成朝向凹部之底面側之錐形狀。

底面之孔徑與開口部之孔徑之比(底面之孔徑/開口部之孔徑)並無特別限定，就細胞之接種或回收之容易度之觀點而言，可例示5/1～1/5、3/1～1/3、1/1～1/2。

又，開口部與相鄰之開口部之間之距離(間隙) 例如並無特別限定，根據所需之大量培養，例如可例示800 μm以下、700 μm以下、600 μm以下、500 μm以下、300 μm以下、200 μm以下、100 μm以下等範圍內，只要為有限值即可。

開口部之孔徑與凹部之深度之比(開口部之孔徑/凹部之深度)並無特別限定，就細胞之接種或回收之容易度之觀點而言，可例示5/1～1/5、3/1～1/3、2/1～1/1。於上述範圍內之情形時，細胞不易自凹部跳出，又，就細胞回收之方面而言可有利。

凹部之個數視基材之面積或培養之細胞及/或其集合體之種類等，無法籠統地設定，可根據該技術常識適當設定。例如每單位面積(cm² )之下限個數可例示1個、10個、30個、50個等，上限個數可例示1000個、500個、300個、200個、100個等。又，基材表面中之凹部之總數例如可適當設定為10個以上、100個以上、1000個以上、10000個以上、50000個以上等。

細胞培養用基材之材質並無特別限定，只要為公知者即可。又，細胞培養用基材整體可由相同之材質構成，亦可由複數種材質構成。具體而言，例如，可凹部與基材表面為不同材質，進而，可根據凹部內之位置，由不同之材質構成。

例如，作為凹部之內側面與凹部之底面由不同之材質構成之細胞培養用基材之一例，可列舉凹部之內側面具有細胞非接著性表面，且凹部之底面具有細胞接著性表面之細胞培養用片。該細胞培養用片由於開口部之口徑小並具有上述表面特性，故培養物易與基材接著，回收變得更困難，但本發明可減少對培養物之損害，並且獲得高回收效率。 本發明之細胞及/或其集合體之回收方法可應用於各種細胞培養用基材，較佳為用於回收基材之細胞接著性表面上培養之細胞，進而較佳為用於回收表現出適度之細胞接著性之表面上接著培養之細胞。

所謂「細胞接著性表面」，係指例如於培養時使用之溶液中，於細胞沈澱於該表面上之情形時，該細胞具有某一定之接著點而接著之表面。細胞接著性表面只要至少包含表現出細胞接著性之物質即可。

作為表現出細胞接著性之物質，只要為可與存在於使用之細胞之細胞膜的蛋白質或糖鏈等細胞表面分子結合之物質，則可無特別限定地使用。可為表現出親水性者，亦可為表現出疏水性者，就細胞接著性、球狀細胞團塊之形成性等觀點而言，較佳為親水性(尤其是非超親水性之親水性)或疏水性(尤其是非超疏水性之疏水性)者，進而較佳為表現出疏水性者。又，表現出細胞接著性之物質之接著性之程度可為細胞不自凹部內跳出之程度。 若列舉此種物質之一例，具體而言，可列舉自活體取得或合成之物質，例如包含蛋白質(膠原蛋白、纖維黏連蛋白、層黏連蛋白等)或合成樹脂(苯乙烯系樹脂、聚烯烴樹脂、聚環烯烴樹脂、聚對苯二甲酸乙二酯樹脂、丙烯酸系樹脂、氟樹脂、聚醯亞胺樹脂、聚碸樹脂、聚醚碸樹脂、聚二甲基矽氧烷樹脂、該等之混合物或表面改質物等)。於選擇合成樹脂之情形時，由於合成樹脂本身之強度或耐熱性，故可獲得操作性優異之細胞培養用片。又，就生物相容性之觀點而言、就使用該片獲得之培養細胞或球狀細胞團塊之均勻性提昇之觀點而言、或就藉由與各種細胞適度接著而使得培養基更換作業變得容易之觀點而言，較佳為選擇苯乙烯系樹脂、聚烯烴樹脂或聚醯亞胺樹脂之類之合成樹脂。藉由選擇苯乙烯系樹脂、聚烯烴樹脂或聚醯亞胺樹脂之類之來自非生物之成分，使用包含苯乙烯系樹脂、聚烯烴樹脂或聚醯亞胺樹脂等之細胞培養用基材而獲得之球狀細胞團塊容易應用於再生醫學或藥物開發等領域。

作為聚醯亞胺樹脂，可例示包含以下式(I)所表示之結構單元之聚醯亞胺樹脂。又，就良好地形成球狀細胞團塊之觀點而言，較佳為分子內具有氟原子之樹脂，更佳為含氟聚醯亞胺(含氟聚醯亞胺樹脂)。典型而言，本發明中使用之聚醯亞胺樹脂藉由將使酸二酐與二胺各1種以上聚合而獲得之聚醯胺酸進行醯亞胺化而獲得。聚醯亞胺樹脂可於化學結構之一部分包含聚醯胺酸。作為製造聚醯亞胺樹脂之方法，只要利用公知之方法製造即可。作為一例，可使用兩階段合成法。聚醯亞胺樹脂之兩階段合成法係合成聚醯胺酸作為前驅物並將聚醯胺酸轉換為聚醯亞胺之方法。作為前驅物之聚醯胺酸可為聚醯胺酸衍生物。作為聚醯胺酸衍生物，例如可列舉：聚醯胺酸鹽、聚醯胺酸烷基酯、聚醯胺酸醯胺、來自二亞甲基均苯四甲酸(bismethylidene pyromellitide)之聚醯胺酸衍生物、聚醯胺酸矽烷基酯、聚醯胺酸異醯亞胺等。作為聚醯亞胺，可例示：包含均苯四甲酸二酐、聯苯四羧酸二酐、二苯甲酮四羧酸二酐等酸酐、及氧二胺、對苯二胺、間苯二胺、二苯甲酮二胺等二胺之聚醯亞胺。作為具有氟原子之樹脂，例如可例示：4,4'-六氟亞異丙基二鄰苯二甲酸酐(6FDA)/1,4-雙(胺基苯氧基)苯(TPEQ)共聚物、6FDA/1,3-雙(4-胺基苯氧基)苯(TPER)共聚物、6FDA/4,4'-氧二鄰苯二甲酸酐(ODPA)/TPEQ共聚物、4,4'-(4,4'-亞異丙基二苯氧基)二鄰苯二甲酸(BPADA)/2,2-雙[4-(4-胺基苯氧基)苯基]六氟丙烷(HFBAPP)、6FDA/2,2-雙(4-(4-胺基苯氧基)苯基)丙烷(BAPP)共聚物等包含以下式(I)所表示之結構單元之含氟聚醯亞胺樹脂；乙烯-四氟乙烯共聚物等。

[化1]

上述式(I)中，X⁰ 表示氧原子、硫原子、羰基、磺醯基或2價有機基之任一者； Y表示2價有機基； Z¹ 、Z² 、Z³ 、Z⁴ 、Z⁵ 、及Z⁶ 互相獨立地表示氫原子、氟原子、氯原子、溴原子或碘原子之任一者， p為0或1。 再者，於聚醯亞胺樹脂中，式(I)所表示之化學結構可樹脂之每個結構單元不同，亦可相同。較佳為X⁰ 、Y、Z¹ 、Z² 、Z³ 、Z⁴ 、Z⁵ 及Z⁶ 之至少1者包含1個以上氟原子。

上述式(I)中，於p＝0之情形時，X⁰ 可不存在(換言之，左右苯環可直接鍵結)，於p＝1之情形時，左右苯環經由X⁰ 鍵結。

作為X⁰ 所表示之2價有機基，具體而言，可列舉：伸烷基、伸芳基、伸芳基氧基、伸芳基硫基等。又，可為縮合環式之2價烴基、雜環縮合環式之2價烴基及該等之氧基、硫基。該等之中，較佳為伸烷基、伸芳基氧基、伸芳基硫基，更佳為伸烷基、伸芳基氧基，該等可經氟原子取代。上述伸烷基之碳數例如為1～12，較佳為1～6。

作為X⁰ 之例之經氟原子取代之伸烷基，例如可例示-C(CF₃ )₂ -、-C(CF₃ )₂ -C(CF₃ )₂ -等。X⁰ 之例之上述伸烷基之中，較佳為-C(CF₃ )₂ -。

作為X⁰ 之例之伸芳基，例如可例示以下者。

[化2]

作為X⁰ 之例之伸芳基氧基，例如可例示以下者。

[化3]

作為X⁰ 之例之伸芳基硫基，例如可例示以下者。

[化4]

就可於基材上良好地形成球狀細胞團塊之觀點而言，作為X⁰ 所表示之2價有機基，可為選自由上述b-2～b-10及c-2～c-10所組成之群者，可為選自由上述b-7～b-9及c-7～c-9所組成之群者，亦可為b-8所表示之結構。

X⁰ 之例之上述伸芳基、伸芳基氧基及伸芳基硫基可分別獨立地經選自由鹵素原子(例如為氟原子、氯原子、溴原子、碘原子，較佳為氟原子或氯原子，更佳為氟原子)、甲基及三氟甲基所組成之群中之基取代。該等取代基可為複數個，於該情形時，取代基之種類互相可相同，亦可不同。取代於伸芳基、伸芳基氧基及伸芳基硫基上之較佳之取代基為氟原子及/或三氟甲基，較佳為氟原子。於Y中不包含氟原子之情形時，伸芳基、伸芳基氧基及伸芳基硫基較佳為經至少1個以上氟原子取代。

上述式(I)中，作為Y所表示之2價有機基，並無特別限定，例如可列舉具有芳香環之2價有機基。詳細而言，可列舉包含1個苯環之基或具有2個以上苯環經由碳原子(即，單鍵或伸烷基)、氧原子、硫原子或直接鍵結之結構之基。具體而言，可例示以下基。

[化5]

[化6]

[化7]

[化8]

Y之例之上述具有芳香環之2價有機基若能夠取代，則可經選自由鹵素原子(例如：氟原子、氯原子、溴原子、碘原子，較佳為氟原子或氯原子，更佳為氟原子)、甲基及三氟甲基所組成之群中之基取代。該等取代基可為複數個，於該情形時，取代基之種類互相可相同，亦可不同。尤其於X⁰ 中不包含氟原子之情形時，取代於具有芳香環之2價有機基上之較佳之取代基較佳為氟原子及/或三氟甲基，更佳為氟原子。

就球狀細胞團塊形成性之觀點而言，上述式(I)中，Y較佳為選自由d-3、d-9、e-1～e-4、f-6、及f-7所組成之群之結構，更佳為e-1、e-3或e-4之結構。

上述式(I)中，Z¹ 、Z² 、Z³ 、Z⁴ 、Z⁵ 及Z⁶ 可分別相同，亦可不同，分別獨立地選自氫原子、氟原子、氯原子、溴原子或碘原子，於X⁰ 及Y之至少一者中不包含氟原子之情形時，較佳為Z¹ 、Z² 、Z³ 、Z⁴ 、Z⁵ 、及Z⁶ 之至少1者為氟原子。

就球狀細胞團塊形成性之觀點而言，本發明之較佳之一實施形態中，上述式(I)中，X⁰ 所表示之2價有機基選自由-C(CF₃ )₂ -、上述b-2～b-10及c-2～c-10所組成之群；且Y選自由d-3、d-9、e-1～e-4、f-6及f-7所組成之群。本發明之更佳之一實施形態中，上述式(I)中，X⁰ 所表示之2價有機基選自由-C(CF₃ )₂ -、b-7～b-9及c-7～c-9所組成之群；且Y選自由e-1、e-3及e-4所組成之群。

包含上述式(I)所表示之結構單元之聚醯亞胺樹脂可藉由對利用酸二酐與二胺之聚合而獲得之聚醯胺酸進行焙燒之方法而獲得。再者，上述「包含式(I)所表示之結構單元之聚醯亞胺樹脂」之醯亞胺化率可不必為100%。即，包含式(I)所表示之結構單元之聚醯亞胺樹脂可僅由上述式(I)所表示之結構單元構成，亦可於不損害本發明之目標效果之範圍內，一部分包含環狀醯亞胺結構不脫水閉環而保持為醯胺酸之結構單元。

聚醯胺酸合成反應較佳為於有機溶劑中進行。作為聚醯胺酸合成反應時使用之有機溶劑，只要作為原料之酸二酐與二胺之反應可高效率地進行，且對該等原料為惰性，則並無特別限定。例如可列舉：N-甲基吡咯啶酮(NMP)、N,N-二甲基乙醯胺、N,N-二甲基甲醯胺、四氫呋喃、二甲基亞碸、環丁碸、甲基異丁基酮、乙腈、苯甲腈、硝基苯、硝基甲烷、丙酮、甲基乙基酮、異丁基酮、甲醇等極性溶劑；甲苯或二甲苯等非極性溶劑等。其中較佳為使用極性溶劑。該等有機溶劑可單獨使用，亦可以2種以上混合物之形式使用。可將醯胺化反應後之反應混合物直接供於熱醯亞胺化。上述聚醯胺酸之溶液中之上述聚醯胺酸之濃度並無特別限定，就獲得之樹脂組合物之聚合反應性與聚合後之黏度、其後之製膜、焙燒時之操作容易性之觀點而言，較佳為5重量%以上，更佳為10重量%以上，較佳為50重量%以下，更佳為40重量%以下。上述樹脂組合物之黏度並無特別限定，可依照公知之測定方法進行測定，例如23℃下為1～20 Pa・s，較佳為3～15 Pa・s之範圍內。

藉由熱醯亞胺化或化學醯亞胺化之任一者使上述聚醯胺酸醯亞胺化而獲得包含含氟聚醯亞胺之樹脂組合物。特定之實施形態中，藉由加熱處理使上述聚醯胺酸醯亞胺化(熱醯亞胺化)，獲得包含含氟聚醯亞胺之樹脂。利用熱醯亞胺化所獲得之聚醯亞胺無觸媒殘留之可能性，於細胞培養用途中更佳。

於藉由熱醯亞胺化進行醯亞胺化之情形時，例如可藉由將上述聚醯胺酸於空氣中、或更佳為氮氣、氦氣、氬氣等惰性氣體氛圍下或真空中、較佳為溫度50～400℃、更佳為100～380℃、較佳為0.1～10小時、更佳為0.2～5小時之條件下進行焙燒，進行醯亞胺化反應而獲得包含聚醯亞胺之樹脂組合物。

供於熱醯亞胺化反應之上述聚醯胺酸較佳為溶解於適當之溶劑中之形態。作為溶劑，只要為使聚醯胺酸溶解者即可，亦可使用關於聚醯胺酸合成反應在上文敍述之溶劑。

於藉由化學醯亞胺化進行醯亞胺化之情形時，可藉由於適當之溶劑中使用後文中敍述之脫水環化試劑而使聚醯胺酸直接醯亞胺化。

上述脫水環化試劑只要為具有使聚醯胺酸化學性地脫水環化而製成聚醯亞胺之作用者，則可無特別限定地使用。作為此種脫水環化試劑，就高效率地促進醯亞胺化之方面而言，較佳為單獨使用三級胺化合物，或將三級胺化合物與羧酸酐加以組合而使用。

作為三級胺化合物，例如可列舉：三甲胺、三乙胺、三丙胺、三丁胺、吡啶、1,4-二氮雜雙環[2.2.2]辛烷(DABCO)、1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯、1,5-二氮雜雙環[4.3.0]壬-5-烯、N,N,N',N'-四甲基二胺基甲烷、N,N,N',N'-四甲基乙二胺、N,N,N',N'-四甲基-1,3-丙二胺、N,N,N',N'-四甲基-1,4-苯二胺、N,N,N',N'-四甲基-1,6-己二胺、N,N,N',N'-四乙基亞甲基二胺、N,N,N',N'-四乙基乙二胺等。該等之中，尤佳為吡啶、DABCO、N,N,N',N'-四甲基二胺基甲烷，更佳為DABCO。三級胺可為僅1種，亦可為2種以上。

作為羧酸酐，例如可列舉：乙酸酐、三氟乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐、異丁酸酐、琥珀酸酐、馬來酸酐等。該等之中，尤佳為乙酸酐、三氟乙酸酐，更佳為乙酸酐。羧酸酐可為僅1種，亦可為2種以上。

作為化學醯亞胺化時使聚醯胺酸溶解之溶劑，較佳為溶解性優異之極性溶劑。例如可列舉：四氫呋喃、N,N-二甲基乙醯胺、N,N-二甲基甲醯胺、N-甲基吡咯啶酮、二甲基亞碸等，該等之中，就進行均勻反應之觀點而言，尤佳為選自由N,N-二甲基乙醯胺、N,N-二甲基甲醯胺及N-甲基吡咯啶酮所組成之群中之1種以上。於使用該等溶劑作為醯胺化反應之溶劑之情形時，可不使聚醯胺酸自醯胺化反應後之反應混合物分離而直接用於化學醯亞胺化。

聚醯亞胺樹脂之重量平均分子量例如為5000～2000000，較佳為8000～1000000，進而較佳為20000～500000。再者，於本說明書中，樹脂之重量平均分子量可依照公知之測定方法進行測定，藉由使重量平均分子量為上述範圍，聚醯亞胺樹脂之合成及處理、膜化、球狀細胞團塊形成性變得更良好。

細胞接著性表面除上述表現出細胞接著性之物質以外，亦可進而包含塑化劑、抗氧化劑等添加劑成分。

表現出細胞接著性之物質或細胞接著性表面[疏水性(尤其是非超疏水性之疏水性)之表現出細胞接著性之物質或細胞接著性表面]之靜態水接觸角可為70°以上，降落角可為15°以上，又，可靜態水接觸角為70°以上且降落角為15°以上。 尤其是表現出細胞接著性之物質或細胞接著性表面[疏水性(尤其是非超疏水性之疏水性)之表現出細胞接著性之物質或細胞接著性表面]較佳為靜態水接觸角為70°以上。藉由使細胞接著性表面滿足此種條件，進一步促進球狀細胞團塊形成。就球狀細胞團塊形成性之觀點而言，靜態水接觸角更佳為超過75°，進而較佳為77°以上，進而更佳為79°以上，尤佳為80°以上(例如超過80°)，靜態水接觸角之上限例如為未達150°，較佳為120°以下(例如未達120°)，更佳為110°以下，尤佳為100°以下(例如未達99°、98°以下、97°以下、95°以下等)，進而較佳為未達90°。

另一方面，表現出細胞接著性之物質或細胞接著性表面[親水性(尤其是非超親水性之親水性)之表現出細胞接著性之物質或細胞接著性表面]之靜態水接觸角較佳可為65°以下，更佳可為55°以下，進而較佳可為50°以下。再者，下限值可為0°以上，較佳可為5°以上，更佳可為10°以上。 又，就相同之觀點而言，表現出細胞接著性之物質或細胞接著性表面之降落角以18°以上、19°以上、20°以上、22°以上、24°以上、26°以上、28°以上、30°以上之順序越高越佳。降落角之上限值例如為未達80°，較佳為70°以下(例如未達70°)，更佳為60°以下(例如未達60°)，進而較佳為50°以下(例如未達50°)。 再者，此種靜態水接觸角或降落角可為細胞接著性表面之值，亦可為表現出細胞接著性之物質(或構成細胞接著性表面之物質)之值。 再者，上述表面特性可依照公知之方法進行測定。例如，靜態水接觸角或降落角例如可藉由後文中敍述之方法等進行測定。

於表現出細胞接著性之表面構成凹部之底面之情形時，作為表現出細胞接著性之物質占凹部之底面之比率，並無特別限定，較佳為占凹部之底面中之90%以上、95%以上、99%以上、實質上占底面全部。又，就觀察性之觀點而言，底面中之細胞接著性表面較佳為平坦狀(平底狀、平板狀)。

「細胞非接著性表面」係指如下表面：例如於培養時使用之溶液中，於細胞沈澱於該表面上之情形時，該細胞之形狀幾乎不發生變化，完全不接著或即使暫時性地較弱地接著亦會自然脫離。細胞非接著性表面只要至少包含表現出細胞非接著性之物質即可。

作為表現出細胞非接著性之物質，只要為培養時使用之細胞不接著、或不與存在於使用之細胞之細胞膜的蛋白質或糖鏈等細胞表面分子結合之物質，則可無特別限定地使用，可為具有生物相容性者，亦可為不具有者。 又，表現出細胞非接著性之物質(或細胞非接著性表面)可為表現出疏水性者，亦可為表現出親水性者，例如可為超撥水性(超疏水性)者或超親水性者。就細胞之非接著性、球狀細胞團塊之均勻性及形成性等觀點而言，尤佳為表現出疏水性(尤其是超疏水性)[例如相對於疏水性或親水性(尤其是疏水性)之細胞接著性表面或構成該表面之樹脂(進而其接觸角)更為疏水性(尤其是超疏水性)]之物質，亦較佳為表現出親水性(尤其是超親水性)[例如相對於親水性或疏水性(例如疏水性)之細胞接著性表面或構成該表面之樹脂(進而其接觸角)更為親水性(尤其是超親水性)]之物質。 若例示此種物質之一例，具體而言，例如可根據細胞之種類適當選擇包含(聚)乙二醇及其衍生物、MPC(2-甲基丙烯醯氧基乙基磷酸膽鹼)及其衍生物、HEMA(甲基丙烯酸羥基乙酯)及其衍生物等之化合物或該等化合物之聚合物[例如poly-HEMA(聚甲基丙烯酸羥基乙酯)等]、SPC(鏈段化聚胺基甲酸酯)及其衍生物等化合物或自活體取得之蛋白質(白蛋白等)、細胞不接著之糖鏈(瓊脂糖、纖維素等)使用。其中，就與細胞接著性表面或合成樹脂之接著性之觀點而言、或就可簡化細胞培養用基材或細胞培養用片之製造步驟之觀點而言、或就提昇獲得之培養細胞或球狀細胞團塊之均勻性之觀點而言，較佳為MPC及其衍生物或該等之聚合物。 再者，表現出細胞非接著性之物質可根據處理性、所需之疏水性(例如超疏水性)、親水性(例如超親水性)之程度等使用適當改性者。例如，可藉由對親水性之物質進行交聯處理等，而兼具親水性及對水之低溶解性。又，可對成為原料之物質(例如疏水性或親水性)適當進行疏水化處理或親水化處理(例如疏水性基或親水性基之導入等)，而獲得所需之疏水性或親水性之材質。

關於表現出細胞非接著性之物質之固定化，可藉由使含有該等之溶液於基材表面上乾燥之方法、使該物質熔融並進行壓接之方法、利用UV等能量線使塗佈於基材上之該物質硬化之方法、使該物質具有之官能基與基材上之官能基之間發生化學反應(例如羧基或胺基等官能基間之縮合反應等)而形成共價鍵之方法、或使該物質具有之硫醇基與預先形成於基材上之金屬(鉑、金等)薄膜結合之方法，從而於該基材表面上固定化。進行固定化時之厚度並無特別限定，可例示0.01～1000 μm。

於表現出細胞非接著性之表面構成凹部之內側面之情形時，作為表現出細胞非接著性之表面占凹部之內側面之比率，並無特別限定，較佳為使培養細胞之附著性減少之程度。較佳為占內側面之面積之90%以上，更佳為95%以上，尤佳為全部。 關於表現出細胞非接著性之表面，就使培養之細胞之尺寸變均勻，或使圓形度提昇之觀點而言，作為其表面特性，例如可將靜態水接觸角作為指標進行判斷。例如，於由上述表現出細胞非接著性之物質形成之疏水性表面之情形時，靜態水接觸角較佳為90°以上，更佳為93°以上，進而較佳為95°以上。又，可為150°以下，較佳為130°以下，更佳為120°以下。 另一方面，於親水性表面之情形時，靜態水接觸角較佳為65°以下，更佳為55°以下，進而較佳為50°以下。又，可為0°以上，較佳為5°以上，更佳為10°以上。 若例示此種物質之一例，疏水性高之MPC(或由該MPC形成之表面)中，靜態水接觸角可實現例如90°以上、100°以上之靜態水接觸角。 再者，此種靜態水接觸角可為細胞非接著性表面之值，亦可為表現出細胞非接著性之物質(或構成細胞非接著性表面之物質)之值。 又，靜態水接觸角例如可藉由後文中敍述之方法等進行測定。

就使獲得之球狀細胞團塊之尺寸均勻性及圓形度提昇之觀點而言，較佳為與細胞接著性表面及細胞非接著性表面之接著程度取得平衡。因此，即使細胞非接著性表面對細胞表現出接著性，接著性只要較細胞接著性表面低即可。例如，於將上述靜態水接觸角作為指標之情形時，細胞非接著性表面(或表現出細胞非接著性之物質)中之靜態水接觸角之差(或其絕對值)較佳為3°以上(例如5°以上)，更佳為10°以上(例如12°以上)，進而較佳為15°以上。又，上述差(或其絕對值)之上限可根據細胞非接著性表面(或表現出細胞非接著性之物質)及細胞接著性表面(或表現出細胞接著性之物質)之疏水性、親水性之組合等適當選擇，並無特別限定，例如可為100°、90°、80°、70°、60°、50°、40°、30°等。

具有該等特性之表面係以凹部之內側面成為細胞非接著性表面、凹部之底面成為細胞接著性表面之方式，分別獨立地由具有該特性之物質物理性地或化學性地固定或配置於基底材表面而形成，亦可上述相應部位由利用具有該特性之物質製作之片狀者構成。

又，於上述細胞培養用片中，就簡化細胞培養用片製造之觀點而言，亦作為凹部之邊緣部之片表面可具有細胞非接著性表面。片表面之細胞非接著性表面可為與凹部之內側相同之細胞非接著性表面，亦可為不同之細胞非接著性表面。於相同之細胞非接著性表面之情形時，片表面與凹部之內側面可具有連續之表面。

具有該構成之凹部之細胞培養用片可為具備包含凹部之底面之層及包含凹部之內側面之層的層狀結構物。此處，包含凹部之內側面之層係指層本身構成具有貫通孔之層。因此，作為上述片之一態樣，可列舉包含具有具備貫通孔之細胞非接著性表面之層及具有細胞接著性表面之層的積層物之態樣。

就形成貫通孔之觀點而言、或就簡化細胞培養用片之製造之觀點而言，具有具備貫通孔之細胞非接著性表面之層較佳為將表現出細胞非接著性之物質固定化於層狀之基底材上而成者。

作為層狀之基底材，只要為該技術領域中公知者，則可使用。例如可列舉包含聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚醯胺、聚縮醛、聚酯(聚對苯二甲酸乙二酯等)、聚胺基甲酸酯、聚碸、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚環烯烴、聚醚酮、聚醚醚酮、聚醯亞胺、矽等合成樹脂、EPDM(乙烯丙烯二烯橡膠)等合成橡膠或天然橡膠、玻璃、陶瓷、不鏽鋼等金屬材料等之板狀體。透明之基底材亦為較佳之形態之一。

就作業性之觀點而言，表現出細胞非接著性之物質於層狀基底材上之固定化較佳為於形成後文中敍述之貫通孔之後進行固定化。

貫通孔較佳為其壁相當於上述凹部之內側面者，開口部或其相反之端部之孔徑或形狀可與上述凹部同樣地設定。又，貫通孔之深度相當於具有細胞非接著性表面之層之厚度，亦相當於上述凹部之深度，可與凹部同樣地設定。再者，於將表現出細胞非接著性之物質固定化於層狀之基底材之情形時，作為表現出細胞非接著性之物質之層，例如較佳為1 nm以上，更佳為10 nm以上，包含表現出細胞非接著性之物質之層及基材之層整體之厚度只要為上述具有細胞非接著性表面之層之厚度之範圍內，則可適當設定。

關於貫通孔之形成，只要可形成上述尺寸之貫通孔，則可無特別限定地實施。例如可藉由穿孔加工(鑽孔等)、光微細加工(雷射(例如CO² 雷射、準分子雷射、半導體雷射、YAG雷射)等)、蝕刻加工、壓紋加工等而形成。於上述加工中，可為貫通孔之形狀成為錐形狀之加工，此時，亦可形成端部之周圍發生變形，開口部之邊緣部與位於開口部與相鄰之開口部之中間區域之部分之層厚度不同的結構。

具有細胞接著性表面之層之厚度例如為1 nm以上、4 mm以下，較佳為1 μm以上、1 mm以下，可與凹部之底面厚度相同。

作為上述細胞培養用片，亦包含上述具有細胞接著性表面之層與具有細胞非接著性表面之層之間進而包含接著層(黏著層)之態樣。

作為接著層，只要為該技術領域中公知者，則可使用。例如可列舉：丙烯酸系樹脂、矽系樹脂、合成橡膠、天然橡膠等，較佳可使用低溶出性之接著層。可使用市售之雙面膠帶等。

接著層之厚度並無特別限定，只要為不損害本發明之效果之範圍內，則可適當設定。例如可例示0.5～100 μm。

上述細胞培養用片可使具有具備貫通孔之細胞非接著性表面之層及具有細胞接著性表面之層依序積層而製造。可積層除上述以外之層，亦可積層具有空腔之層。

於使各層積層時，可使預先製備之各層依序積層，可為於預先製備之層上另外形成層之方法，亦可將該等加以組合。具體而言，例如藉由流延、噴塗、浸漬塗佈、旋轉塗佈、輥塗等方法於對表面進行過剝離處理之離型片(例如聚乙烯基材等有機聚合物膜、陶瓷、金屬、玻璃等)之上將表現出細胞接著性之物質塗佈為適當的厚度並進行加熱，藉此，可使具有細胞接著性表面之層成形為片狀。另一方面，可於使具有細胞非接著性表面之層之基底材形成貫通孔之後，將表現出細胞非接著性之物質塗佈於表面，預先製備具有細胞非接著性表面之層。而且，可藉由於將上述成形之具有細胞接著性表面之層之剝離片剝離之後，使另外製備之具有細胞非接著性表面之層積層而製造。再者，於具有細胞非接著性表面之層與具有細胞接著性表面之層之積層中，可使用上述接著層(黏著層)進行積層，或亦可藉由熔接(高頻熔接、超音波熔接等)、壓接(熱壓接等)進行積層。

細胞培養用片之厚度並無特別限定，就操作性之觀點而言，較佳為10～5000 μm，更佳為10～2000 μm。片面積亦無特別限定，例如可例示0.01～10000 cm² ，較佳可例示0.03～5000 cm² 。

以此方式獲得之細胞培養用片等細胞培養用基材就直接設置於公知之細胞培養裝置而使用之觀點而言，可迎合對象裝置之大小適當進行校形加工。只要於其中一表面上放置包含細胞之培養基實施細胞培養即可，可將該細胞培養用基材收容於培養用之板、板之各孔、培養皿(培養盤)、燒瓶、培養袋等各種細胞培養用容器中並固定，於固定之該細胞培養用基材之一部分或整面上實施細胞培養。

自該細胞培養用基材之凹部回收之細胞及/或其集合體可為於凹部內懸浮培養者，亦可為於凹部底面接著培養者。其種類亦無特別限定，例如可使用來自人類或除人類以外之動物(猴、豬、狗、兔、大鼠、小鼠等)之任意之器官或組織(腦、肝臟、胰腺、脾臟、心臟、肺、腸、軟骨、骨、脂肪、腎臟、神經、皮膚、骨髓、齒髓、胚胎等)之初代細胞、確立之培養細胞株、或對該等實施了基因操作等之細胞。細胞集合體可為藉由培養細胞而形成之集合體(細胞凝集體、球狀細胞團塊)。凹部內之細胞及/或其集合體之個數並無特別限定，例如相對於每1個凹部，例如可例示1～10000個。又，回收之細胞及/或其集合體之尺寸(直徑)例如較佳為5～1000 μm，更佳為10～500 μm。

上述細胞及/或其集合體只要可於凹部內培養即可，只要至少於凹部內填充有培養液即可，基材整體中之培養液量無限定。再者，於凹部內培養細胞及/或其集合體時，可視需要預先對上述細胞培養用基材進行消泡處理。作為消泡處理，並無特別限定，可進行噴霧、振盪、加溫冷卻等溫度變化、離心處理、真空除氣、超音波處理等一般之處理。又，由於本發明中使用之細胞培養用基材之凹部之開口部之口徑為直徑1000 μm以下，故可自口徑為直徑3 mm以下之送液口部及/或以流速100 cm/s以上將送液用液進行送液而進行消泡處理。藉此，可高效率地進行自消泡處理至回收之一系列步驟。因此，作為本發明之一態樣，可列舉包括如下步驟之細胞及/或其集合體之回收方法：製備如下細胞培養用容器之步驟，該細胞培養用容器係自口徑為直徑3 mm以下之送液口部及/或以流速100 cm/s以上，將送液用液送液至具有開口部之口徑為直徑1000 μm以下之凹部之細胞培養用基材進行消泡，將培養液供給至該基材及至少上述凹部； 於獲得之細胞培養用容器中培養細胞及/或其集合體之步驟；以及 自口徑為直徑3 mm以下之送液口部及/或以流速100 cm/s以上，將送液用液送液至上述培養步驟後之細胞培養用容器進行回收之步驟。

上述進行消泡之步驟中，雖然細胞培養用基材之材質疏水性越高，則氣泡之附著性越強，但此種疏水性高之材質亦可簡便地去除氣泡。

作為消泡時用於送液之裝置或器具，例如為至少具有口徑為直徑3 mm以下之送液口部者。送液口部可列舉具有直徑為3 mm以下之送液口者，例如可為具有2.5 mm以下、2.0 mm以下、1.7 mm以下之口徑者。又，就用於自凹部去除氣泡之送液流量或送液流速之觀點而言，送液口部之直徑與凹部開口部之直徑之比(送液口部之直徑/凹部開口部之直徑)較佳為30以下，更佳為20以下，進而較佳為10以下。下限並無特別限定，例如可列舉0.1以上。再者，所謂送液口部之直徑，係指送液口部之最大內徑。

送液口部只要具有上述大小之口徑，則其形狀或材質並無特別限定。例如亦可使用以於公知之分注器之送液口部具有上述口徑之方式製造或調整者、或具有上述口徑之注射針、鈍針套管、吸嘴、探棒等。

又，上述消泡時之送液用裝置或器具較佳為除具有上述送液口部以外亦具有保持送液用液之構件者。具體而言，可為筒或罐、瓶，亦可使用注射器等。其大小(容量)或形狀、材質並無特別限定。上述構件可經由管等而與送液口部間接地或直接地結合，亦可形成為一體型。

消泡時之送液用液並無特別限定。可使用培養液本身作為消泡用之送液用液，亦可使用生理鹽水或緩衝液等。於不使用培養液之情形時，藉由送液後將填充至凹部內之液體去除，此時可去除至完全不存在液體之程度，其後更換為培養液，或藉由於送液後直接添加培養液，而可成為細胞培養用基材之凹部中填充有培養液之狀態。又，可於送液前事先將送液用液注入至細胞培養用基材之後進行上述消泡處理，進行該事先注入時，於凹部內確認到氣泡亦無妨。事先注入之方法或送液用液之液量並無特別限定。

關於消泡時之送液之方法，只要可自上述送液口部流出並利用送液用液填充凹部內，則並無特別限定。具體而言，例如可列舉於凹部之開口上端面之0.1～10 mm上方配置送液口部之前端進行送液之方法。此時，送液口部之前端可配置成浸至預先注入至設置有基材之培養用容器之液體內之位置。配置之送液口部可相對於每1個基材為1個，亦可為2個以上。又，可一次送液至複數個凹部，亦可使細胞培養用基材本身、或使送液口部移動而連續地或間歇性地送液。又，可自動化亦可手動。可於暫時送液之後抽吸存在於凹部上方之液體，並再次送液至相同凹部之上方或不同凹部之上方。於該情形時，若反覆少量之送液與抽吸，則易產生氣泡，故作為一次之送液量，例如可為10 mL以上，可例示10～50 mL。

消泡時之送液流速例如可列舉100 cm/s以上。又，可為200 cm/s以上、250 cm/s以上、300 cm/s以上等。又，作為上限，可列舉基材上之細胞非接著性物質不剝離、或基材不破損之流速，例如可列舉2000 cm/s等。

又，作為消泡時之送液流量，並無特別限定，例如可例示相對於開口部面積每1 cm² 為0.001 mL/s以上。可為0.01 mL/s以上、0.03 mL/s以上、0.05 mL/s以上、0.07 mL/s以上等，作為上限，例如可列舉20 mL/s。

又，上述消泡時之送液可於無菌環境下進行。於本發明中，只要可將液體填充至凹部內即可，可視需要對細胞培養用基材進行細胞培養所需之公知之處理(例如於安全櫃內之培養液更換、於保溫箱內之靜置)。

以此方式可以至少不易於凹部內形成或殘留氣泡之狀態製備填充有培養液之細胞培養用容器。再者，藉由上述送液，無論是將液體填充至不存在液體之地方所形成之氣泡、抑或是填充後放置一段時間之後形成之氣泡均能夠去除。

獲得之細胞培養用容器中之細胞及/或其集合體之培養視使用之細胞及/或其集合體無法籠統地設定，可依照公知技術適當進行。培養液或培養條件並無特別限定。可於所需時間之培養之後供於接下來之回收。

本發明中，為了回收細胞及/或其集合體而進行送液。作為回收時之送液所使用之裝置或器具，例如為至少具有口徑為直徑3 mm以下之送液口部者。送液口部可列舉具有直徑為3 mm以下之送液口者，例如可為具有2.5 mm以下、2.0 mm以下、1.7 mm以下之口徑者。又，就用於自凹部將細胞或其集合體剝離及/或釋出之送液流量或送液流速之觀點而言，送液口部之直徑與凹部開口部之直徑之比(送液口部之直徑/凹部開口部之直徑)較佳為30以下，更佳為20以下，進而較佳為10以下。下限並無特別限定，例如可列舉0.1以上。再者，送液口部之直徑係指送液口部之最大內徑。

送液口部只要具有上述大小之口徑，則其形狀或材質並無特別限定。例如亦可使用以於公知之分注器之送液口部具有上述口徑之方式製造或調整者、或具有上述口徑之注射針、鈍針套管、吸嘴、探棒等。

又，上述回收時之送液用裝置或器具較佳為除上述送液口部以外亦具有保持送液用液之構件者。具體而言，可為筒或罐、瓶，亦可使用注射器等。其大小(容量)或形狀、材質並無特別限定。上述構件可經由管等而與送液口部間接地或直接地結合，亦可形成為一體型。

回收時之送液用液並無特別限定。可使用生理鹽水或緩衝液等，可使用培養液本身，亦可為預先注入至細胞培養用容器中之培養液。

回收時之送液之方法可為自上述送液口部流出並將凹部內之細胞及/或其集合體自凹部內剝離之程度者，亦可為釋出至凹部外之程度者，並無特別限定。具體而言，例如可列舉於凹部之開口上端面之0.1～10 mm上方配置送液口部之前端進行送液之方法。此時，送液口部之前端可配置成浸至預先注入至設置有基材之培養用容器之液體內之位置。配置之送液口部可相對於每1個基材為1個，亦可為2個以上。又，可一次向複數個凹部送液，亦可使細胞培養用基材本身、或送液口部移動而連續地或間歇地送液。又，可自動化，亦可手動。

作為回收時之送液流量，並無特別限定，較佳為以特定之流量進行送液。例如可例示相對於開口部面積每1 cm² 為0.001 mL/s以上。可為0.01 mL/s以上、0.03 mL/s以上、0.05 mL/s以上、0.07 mL/s以上等，作為上限，例如可列舉20 mL/s。

又，回收時之送液流速並無特別限定，例如可例示100 cm/s以上。又，可為200 cm/s以上、250 cm/s以上、300 cm/s以上等。作為上限，可列舉基材上之細胞非接著性物質不剝離、或基材不破損之流速，例如可列舉2000 cm/s等。

又，上述回收時之送液可於無菌環境下進行。於本發明中，只要可自凹部將細胞及/或其集合體剝離及/或釋出即可，由於在基材上除培養液與送液用液以外亦存在細胞及/或其集合體，故例如藉由回收存在於基材上之液體，能夠回收細胞及/或其集合體本身。作為用於回收存在於基材上之液體之方法，只要不施加對細胞及/或其集合體造成損害之強力，則並無特別限定。例如可利用抽吸進行回收，亦可自培養用容器傾注而回收。可視需要進行追加之送液而將細胞及/或其集合體自凹部剝離及/或釋出。回收之細胞及/或其集合體可供於公知之處理(例如：繼代、冷凍、固定、切片製作、流式細胞分析評價、顯微鏡觀察、基因解析、移植)。

如此，可藉由送液至細胞培養用基材而回收細胞及/或其集合體。藉由該方法，可簡單地回收細胞及/或其集合體，又，由於易回收，故可以高效率回收。又，回收之細胞及/或其集合體之損害易變少，故回收之細胞集群中之活細胞率例如高達80%以上。因此，本發明又可提供藉由上述方法而回收之活細胞率80%以上之細胞集群。 [實施例]

以下，藉由實施例詳細地說明本發明，但本發明並不限定於該等。再者，於以下實施例中，室溫意指20～30℃。

製造例1 ＜具有細胞接著性表面之層之製備(含氟聚醯亞胺膜之製備)＞ 向500 mL容量之三口燒瓶中加入25.332 g(0.057莫耳)之4,4'-六氟亞異丙基二鄰苯二甲酸酐、166.60 g 之N-甲基吡咯啶酮，並進行溶解。向其中滴加投入使16.668 g(0.049莫耳)之1,4-雙(胺基苯氧基)苯溶解於71.4 g 之N-甲基吡咯啶酮而成者，於氮氣氛圍下在室溫下攪拌之後，保持5天，藉此，獲得含氟聚醯胺酸樹脂組合物(固形物成分濃度15質量%、6FDA/TPEQ聚醯胺酸)。該聚醯胺酸之重量平均分子量為15.3萬，黏度為6.7 Pa・s。再者，聚醯胺酸之重量平均分子量與焙燒後之含氟聚醯亞胺之重量平均分子量實質上相同。

使用模嘴塗佈機以焙燒後之含氟聚醯亞胺膜之厚度成為40 μm之方式將上述所獲得之含氟聚醯胺酸樹脂組合物塗佈於玻璃基體上，形成塗膜。其次，於360℃下在氮氣氛圍下進行1小時塗膜之焙燒。其後，將焙燒物自玻璃基體剝離，獲得含氟聚醯亞胺膜。該含氟聚醯亞胺膜之靜態水接觸角為83.2°，降落角為26.4°。

上述中之物性之測定方法如下。 (重量平均分子量之測定) 裝置：Tosoh股份有限公司製造之HCL-8220GPC 管柱：TSKgel Super AWM-H 溶離液(LiBr・H₂ O、摻磷酸之NMP)：0.01 mol/L 測定方法：利用溶離液製作0.5重量%之溶液，並根據利用聚苯乙烯製作之校準曲線，算出分子量。 (黏度之測定) 裝置：AS ONE製造 黏度計 VISCOMETER TV-22 設定：VI RANGE：H  ROTOR No.6 SPEED：10 rpm 黏度計校正用標準溶液：Nippon Grease (股) JS 14000 測定方法：利用黏度計校正用標準溶液校正之後，使用0.3 g之清漆進行測定。(測定溫度：23℃) (靜態水接觸角之測定) 裝置：自動接觸角計(協和界面科學製造：DM-500) 測定方法：測定向表面(細胞非接著性表面或細胞接著性表面)或膜(利用表現出細胞非接著性或細胞接著性之物質所形成之膜)上滴加2 μL之水後即刻之液滴之附著角度(測定溫度：25℃)。 (降落角之測定) 裝置：自動接觸角計(協和界面科學製造：DM-500) 測定方法：向表面(細胞非接著性表面或細胞接著性表面)或膜(利用表現出細胞非接著性或細胞接著性之物質所形成之膜)上滴加25 μL之水之後，使片連續地逐漸傾斜，將滴落時之角度設為降落角(測定溫度：25℃)。

＜具有細胞非接著性表面之層之製備＞ 使用CO₂ 雷射，對將雙面膠帶(厚度25 μm)之單面之剝離帶剝離後與透明之PET膜(厚度250 μm)貼合而成者形成直徑300 μm、以間距500 μm鋸齒狀配置之貫通孔(形成之貫通孔：400個/cm² 、42000個/片、雷射入射側孔徑500 μm、雷射釋出側孔徑300 μm)。其後，使用旋轉塗佈機(Mikasa製造：MS-A150)以厚度成為0.05 μm之方式於PET膜側之表面塗佈MPC聚合物溶液(0.5%乙醇溶液)，並在50℃之乾燥機內進行2小時乾燥處理，獲得具有細胞非接著性表面之層[PET膜之塗佈層(MPC聚合物之塗佈層)側之靜態水接觸角為107.5°]。

＜細胞培養用片、培養容器之製備＞ 其次，使上述製作之具有細胞接著性表面之層貼合於具有細胞非接著性表面之層之將雙面膠帶之另一剝離帶去除之側之面上，製備細胞培養用片(片厚度：315 μm)。將獲得之細胞培養用片設置於培養盤內，完成細胞培養時使用之容器。

實施例1 ＜細胞之擴大培養＞ 細胞使用來自人類脂肪之幹細胞(Human adipose derived stem cell：AdSC)。AdSC購買成品(龍沙公司、PT-5006)使用。

使冷凍細胞於37℃之恆溫水槽中溶解，並添加至9 mL之包含5% FBS、1%抗生素之KBM ADSC-2培養基(基礎培養基、Kohjin Bio公司製造)中。其次，以210×g實施5分鐘之離心處理之後，將上清液去除，分散至1 mL之基礎培養基中。向800 mL之細胞培養用之帶過濾器蓋之燒瓶(住友電木公司製造)中以添加細胞懸浮液後之總量成為30 mL之方式預先添加基礎培養基，並以成為1.5×10⁶ 細胞/燒瓶之方式向其中添加細胞懸浮液，於37℃之5%(v/v)CO₂ 保溫箱內進行培養(擴大培養)。

＜消泡處理＞ 另外，對製造例1中製備之培養容器進行消泡處理。具體而言，於安全櫃內，首先向培養容器中預先添加20 mL左右之PBS(Phosphate buffered saline，磷酸鹽緩衝液)。其次，向安裝有18 G平口針(內徑0.9 mm、Terumo公司製造)之20 mL之全塑針筒(Nipro公司製造)中填充20 mL之PBS，使其於針之前端浸漬於容器內之PBS之液體中之位置(距離凹部開口上端面2 mm左右上方)處水平移動並推出注射器，藉此，以8秒左右將總量送液至培養容器底部整個表面之1/3左右之範圍之後，其次，利用注射器吸取容器內之PBS，向注射器再次填充PBS之後，再次對剩餘範圍亦反覆進行相同之送液而進行消泡。大多數孔中未確認到氣泡，對殘留有氣泡之部分以相同之方式進行上述操作。其後，於37℃之5%(v/v)CO₂ 保溫箱內靜置15分鐘之後，再次擠出填充至注射器之PBS，藉此，去除新產生之氣泡。此種消泡之後，自凹部將PBS去除直至PBS完全消失，之後，添加21 mL之包含1%抗生素之KBM ADSC-2培養基，於37℃之5%(v/v)CO₂ 保溫箱內靜置1晩，獲得經消泡處理之培養容器。

＜球狀細胞團塊之製作＞ 自培養用燒瓶去除培養基，添加5 mL之細胞剝離液accutase(PromoCell公司製造)之後，於37℃之5%(v/v)CO₂ 保溫箱內保持5分鐘左右，將細胞剝離。其次，回收剝離液，使用PBS以總量成為15 mL之方式轉移至管中。以210×g實施5分鐘離心處理，並使其懸浮於4 mL之包含1%抗生素之KBM ADSC-2培養基中，進行細胞數之計數。其後，製備成1.0×10⁶ 細胞/mL之濃度。

於37℃之5%(v/v)CO₂ 保溫箱內靜置1晩，將經過消泡處理之培養容器之培養基去除，以成為500細胞/孔之方式接種細胞。於安全櫃內靜置15分鐘之後，放入至37℃之5%(v/v)CO₂ 保溫箱培養3天。

＜球狀細胞團塊之回收＞ 抽吸去除經過3天培養之容器之培養基，添加20 mL之PBS。其次，向安裝有18 G平口針(內徑0.9 mm、Terumo公司製造)之20 mL全塑針筒(Nipro公司製造)中填充20 mL之PBS，使其於針之前端浸漬於容器內之PBS之液體中之位置(距離凹部開口上端面2 mm左右上方)水平移動並推出注射器，藉此，以8秒左右向容器之凹部整體之1/3進行送液(相對於開口部面積每1 cm² 為約0.09 mL/s、流速約393 cm/s)，將球狀細胞團塊自基材剝離。利用20 mL之全塑針筒吸取剝離之球狀細胞團塊及PBS，回收至50 mL之離心管。

＜球狀細胞團塊回收效率之算出＞ 利用板掃描儀(Screen公司製造)對剝離及回收有球狀細胞團塊之容器進行拍攝，將獲得之圖像分割為9份，以下式算出各地點之球狀細胞團塊回收效率，求出其平均值。 回收效率(%)＝{(回收前存在於板之球狀細胞團塊數)－(回收後存在於板之球狀細胞團塊數)}÷(回收前存在於板之球狀細胞團塊數)×100

又，以如下方式測定回收之球狀細胞團塊中之細胞之存活率。以210×g對球狀細胞團塊分散液實施5分鐘離心處理，使其於7 mL之Accumax(Nacalai Tesque公司製造)液體中懸浮，於室溫下處理30分鐘。以210×g對利用細胞濾器(Corning公司製造)過濾之細胞懸浮液進行5分鐘離心處理，並使其於1 mL之PBS中懸浮，進行細胞數之計數，藉此，算出存活率。

＜結果＞ 藉由使用注射器，可不使PBS漏出至容器外地回收球狀細胞團塊。回收效率為93±3%(9處之平均值)。可不將容器自無菌環境拿出且不進而使用大型之裝置而回收球狀細胞團塊(參照圖1、2)。

又，可知回收之球狀細胞團塊中之活細胞率高達98%，為對細胞造成之損害較少之回收方法。 [產業上之可利用性]

藉由本發明之方法，容易減少損害，可簡便且有效率地進行細胞及/或其集合體之回收，故例如可良好地用於含有球狀細胞團塊之製劑等細胞製劑之領域。

圖1係實施例1中回收球狀細胞團塊前之培養容器之照片。 圖2係實施例1中回收球狀細胞團塊後之培養容器之照片。

Claims (10)

1. 一種細胞及/或其集合體之回收方法，其包括如下步驟：自口徑為直徑3 mm以下之送液口部及/或以流速100 cm/s以上，將送液用液送液至開口部之口徑為直徑1000 μm以下之凹部中含有細胞之細胞培養用基材。
2. 如請求項1之方法，其中以相對於開口部面積每1 cm² 為0.001 mL/s以上之流量進行送液。
3. 如請求項1或2之方法，其中自凹部之0.1～10 mm上方進行送液。
4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中送液口部之口徑為直徑2.5 mm以下。
5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中送液口部之直徑與凹部開口部之直徑之比(送液口部之直徑/凹部開口部之直徑)為30以下。
6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中細胞培養用基材為如下細胞培養用片，上述細胞培養用片具有複數個開口部之孔徑為直徑1000 μm以下之凹部，該凹部之內側面具有細胞非接著性表面，且該凹部之底面具有細胞接著性表面。
7. 如請求項1至6中任一項之方法，其係於無菌環境下進行。
8. 如請求項1至7中任一項之方法，其進而包括對送液步驟後存在於基材上之液體進行回收之步驟。
9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中細胞形成球狀細胞團塊。
10. 一種活細胞率80%以上之細胞集群，其係藉由如請求項1至9中任一項之方法而獲得。

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