CN107208126A - 分离、除去、和分析细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明目的在于提供一种分离、除去、和分析细胞的方法。提供的前述分离、除去、和分析细胞的方法包括，将包含细胞的液体样品通过聚酰亚胺多孔膜过滤，针对未能通过聚酰亚胺多孔膜而被膜捕捉的细胞、或通过聚酰亚胺多孔膜的液体样品中的细胞，对选自由以下组成的组的一个以上的细胞的特性进行检查：细胞的数量或种类，细胞的外部或内部结构，细胞表面抗原的种类或量，细胞来源的分泌物质的种类或量、细胞附着性和细胞生存率。

Description

分离、除去、和分析细胞的方法
技术领域
本发明涉及，使用聚酰亚胺多孔膜，分离、除去、和分析细胞的方法。
背景技术
细胞的特性
细胞在体内一般作为三维群体存在，在经典的平面培养中，细胞以粘到容器的形式单层培养。由于培养环境的差异，细胞性质也显著不同的情况被报告许多。此外，对于在液体培养培养基中培养细胞的悬浮培养，存在适合于悬浮培养的细胞，也不适合于悬浮培养的的细胞。
近年来，通过药物发现研究的加速和评价技术的改进，使用这些细胞的各种评价体系和试剂盒已经被开发出来。通过将物质产生量通过抗原抗体反应和酶反应的组合作为显色反应的ELISA试剂盒或由两个对象部位的接近度将发生能量转移的现象作为光进行测量的形式而被利用的FRET和BRET等，通过许多原理，新的高灵敏度，高强度和高选择性的方法已被开创(非专利文献1和2)。
在这些筛选方法，将细胞转移现象作为原理的各种试剂盒与方法也被制定并实施。例如专利文献1中记载的，在汇合的培养细胞中制备孔部，并将所述孔部的填充现象作为伤口愈合速度而进行比较的方法，如在专利文献2中记载的，通过插入培养样(インサートカルチャー)的结构穿过一定大小的多个孔，由细胞的移动比较化合物趋化性的方法已被开发。特别是，在专利文献2中记载的方法已经以各种形式应用和实现。此外，如通过将细胞运动本身作为目标捕捉、并确定细胞布朗运动和原形质流动流动、追查原形质流动流动、进行评价的专利文献3或活用喷墨、在狭窄的区域中规则播种大量细胞、对该运动进行示踪调查的专利文献4这样的尝试也正在进行。
当将使用细胞运行性能和转移现象用于药物开发等的评价，由以前的研究组在定量性和明确性方面所表示，由于能够澄清深感兴趣的细胞的特性，成为非常有吸引力的方法，但是，在另一方面，非常复杂的系统和复杂设备成为必要的情况和时间或处理中需要很多功夫的情况有许多，更简单、快速评价方法的建设已被期望。
此外，从生物体来源的样品取决于或生物体的一部分或所有的状态、其中包含的细胞可以变化的情况存在。例如，基于细胞的状态变化，与某种病因关联、除去活化的白细胞的治疗法也被知晓。
血液样品来源的血液成分除去疗法
血液，以白细胞和红细胞作为起始，包含许多细胞种类。对于如自身免疫性疾病的细胞性疾病，活性过高自细胞导致过度反应的情况被知道，由药物导致的免疫反应的抑制或细胞本身的消除，被用作医疗实践而采用。例如，将珠或纤维填充为圆柱状，在其空间中使血液通过，由此将高附着性淋巴细胞和细胞除去，由此对风湿性疾病和克罗恩氏病或溃疡性结肠炎等进行治疗的方法已被知道(专利文献5、6、7和非专利文献3)。此外，验证对于呼吸系统疾病的有效性的研究被显示(非专利文献4)。此外，将抗体固定化至表面上的珠包装为柱形状，选择地获得呈递的相同抗原的细胞的方法也有报道(专利文献8)。
这些载体使用纤维或珠(小珠)等，在结构上是线性的和球形的集合体，缺乏与生物体结构的相似性，并非具有在结构上取得细胞的特性，因此，提供许多机会，吸附附着性强的细胞是有必要的。长时间接触设备，诱导意想不到血栓形成和血细胞活化成为主要原因，因此，更简单快速和血液活化性能低的细胞除去方法已经被期望。因此，如果不仅血细胞，而且生物体来源的样品中细胞的特性能够被简单和快速地评估，则导致生物体的简单和快速的评估被涉及。
聚酰亚胺多孔膜
聚酰亚胺是在重复单元中包含酰亚胺键的高分子(聚合物)的总称，通常是指芳族化合物通过直接酰亚胺键连接的芳族聚酰亚胺。芳族聚酰亚胺具有芳族和芳族通过酰亚胺键的共轭结构，具有刚硬、牢固的分子结构，并且酰亚胺键具有强的分子间力，因此，具有非常高水平的热的、机械的、化学的性质。
聚酰亚胺多孔膜过滤器在本发明前更多地用于滤器，低介电常数膜，燃料电池电解质膜，特别地以电池关系中心的用途。专利文献9-11中记载了，特别是在气体等物质透过性中是优异的，孔隙率高，两个表面的平滑性优异，相对强度高，孔隙率高，但是对于膜厚度方向的压缩应力耐力优良的具有大量大孔隙的聚酰亚胺多孔膜。这些都是经由酰胺酸制备聚酰亚胺多孔膜。
现有技术文献
专利文献
【专利文献1】特许(特許)第3682772号
【专利文献2】特许(特許)第4857292号
【专利文献3】特许(特許)第4507060号
【专利文献4】特许(特許)第5024823号
【专利文献5】特许(特許)第2835923号
【专利文献6】特许(特許)第3812909号
【专利文献7】特许(特許)第4473324号
【专利文献8】特许(特許)第4196592号
【专利文献9】WO2010/038873
【专利文献10】特开(特開)2011－219585
【专利文献11】特开(特開)2011－219586
【非专利文献】
【非专利文献1】ORISTM CELL-BASED ASSAYS brochure
【非专利文献2】ASCB 2014 POSTER,An Automatable3-Dimensional CellInvasion Assay Compatible with High Content Analysis,Fronczak et.Al.
【非专利文献3】Hagiwara等人,Journal of Surgical Research171,777-782(2011)
【非专利文献4】ONORATI等人.Ann Thorac Surg2011；92:111-21
发明概述
发明要解决的课题
本发明目的是提供，分离、除去、和/或分析细胞的方法，细胞活化抑制物质的筛选方法，用于本发明方法的装置和试剂盒，和，聚多孔膜在本发明的的方法中的用途。
使用于解决课题的手段
本发明人努力以解决上述问题，结果是发现，通过使用聚酰亚胺多孔膜容易且迅速地分离、除去、并且分析细胞，从而完成本发明。本发明的方法也可用于对细胞特性无影响的物质的筛选。
不存在限制，但是，本发明优选包括以下方式。
[方式1]
分离、除去、和/或分析细胞的方法，其包括，将包含细胞的液体样品通过聚酰亚胺多孔膜过滤，针对未能通过聚酰亚胺多孔膜而被膜捕捉的细胞、或通过聚酰亚胺多孔膜的液体样品中的细胞，对选自由以下组成的组的一个以上的细胞的特性进行检查：细胞的数量或种类，细胞的外部或内部结构，细胞表面抗原的种类或量，细胞来源的分泌物质的种类或量、细胞附着性和细胞生存率。
[方式2]
方式1中记载的方法，成为对象的细胞是活化的细胞。
[方式3]
方式2中记载的方法，活化细胞是活化白细胞。
[方式4]
方式1～3的任一项中记载的方法，包括在过滤工序前，将聚酰亚胺多孔膜的表面的全部或一部分预处理的工序。
[方式5]
方式4中记载的方法，聚酰亚胺多孔膜的表面处理使用选自由以下组成的组的一种以上试剂或处理方法来进行：抗凝血剂，胶原蛋白，聚-L-赖氨酸，UV，等离子体和结合亲水树脂的PDS。
[方式6]
方式1～5的任一项中记载的方法，包括向含有细胞的液体样品中添加细胞活化剂后，培养细胞，然后将所述液体样品通过聚酰亚胺多孔膜过滤。
[方式7]
一种用于筛选细胞活化抑制物质的方法，其包括
(i)任选地向含有细胞的液体样品中添加细胞活化剂后，培养细胞，
(ii)向(i)的液体样品中添加测试物质，
(iii)将(ii)的液体样品通过聚酰亚胺多孔膜过滤，针对未能通过聚酰亚胺多孔膜而被膜捕捉的细胞、或通过聚酰亚胺多孔膜的液体样品中的细胞，对选自由以下组成的组的一个以上的细胞的特性进行检查：细胞的数量或种类，细胞的外部或内部结构，细胞表面抗原的种类或量，细胞来源的分泌物质的种类或量、细胞附着性和细胞生存率，并且，
(iv)如果未能通过聚酰亚胺多孔膜而被膜捕捉的细胞中、活化的细胞的比例和/或数目比(ii)的工序中没有加入测试物质的情况减小，或者，如果通过聚酰亚胺多孔膜的液体样品中的细胞中、活化的细胞的比例和/或数目比(ii)的工序中没有加入测试物质的情况增加，那么确定测试物质是细胞活化抑制物质。
[方式8]
方式1～7的任一项中记载的方法，含有细胞的液体样品是细胞悬浮液，其包含选自原代细胞、确立细胞和血液分离细胞的一种以上细胞。
[方式9]
方式1～7的任一项中记载的方法，含有细胞的液体样品是选自由以下组成的组的生物样品：血液，尿，汗，贮存体(储存泡)腔液，体腔清洗液和痰液。
[方式10]
方式1～9的任一项中记载的方法，过滤选自由以下组成的组：自然过滤，离心过滤，减压过滤和加压过滤。
[方式11]
方式1～10的任一项中记载的方法，包括，将通过聚酰亚胺多孔膜的液体样品中的细胞进一步培养。
[方式12]
方式1～10的任一项中记载的方法，包括，将未能通过聚酰亚胺多孔膜而被膜捕捉的细胞，在保持将所述细胞施加于聚酰亚胺多孔膜的状态进行进一步培养。
[方式13]
方式1～12的任一项中记载的方法，前述聚酰亚胺多孔膜是，包括由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔膜。
[方式14]
方式13中记载的方法，前述聚酰亚胺多孔膜是，使包含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰胺酸溶液和着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形后、在250℃以上进行热处理、由此得到的着色的聚酰亚胺多孔膜。
[方式15]
方式13或14中记载的方法，前述聚酰亚胺多孔膜是具有两个不同的表层面和大空隙层的多层结构的聚酰亚胺多孔膜。
[方式16]
方式15中记载的方法，前述聚酰亚胺多孔膜的厚度是75微米以下。
[方式17]
方式1～16的任一项中记载的方法，两个以上(两种以上)聚酰亚胺多孔膜上下或左右地层叠而使用。
[方式18]
用于在方式1～17中任一项中记载的方法中使用的装置，含有聚酰亚胺多孔膜。
[方式19]
用于在方式1～17中任一项中记载的方法中使用的试剂盒，含有聚酰亚胺多孔膜。
[方式20]
聚酰亚胺多孔膜在方式1～17中任一项中记载的方法中的用途。
发明的效果
通过由本发明的方法使用聚酰亚胺多孔膜，将细胞简便且快速地分离、除去分析这已经成为可能。本发明的方法也可用于对细胞中的特性无影响的物质的筛选。此外，本发明的方法，通过从生物体得到的样品而使用、在体外检查，由此快速且简便地知道生物体的状态已经成为可能。
附图的简要说明
[图1]图1是示出，在本发明的方法中，作为典型的例子，用于将含有细胞的液体样品(细胞悬浮液)通过聚酰亚胺多孔膜过滤的一个方式的示意图。(1)(细胞过滤-基本系统1)
[图2]图2是示出，在本发明的方法中，作为典型的例子，用于将含有细胞(细胞悬浮液)的液体样品通过聚酰亚胺多孔膜过滤的一个方式的示意图。(2)(细胞过滤-基本系统2)
[图3]图3是示出，在本发明的方法中，作为典型的例子，用于将含有细胞(细胞悬浮液)的液体样品通过聚酰亚胺多孔膜过滤的一个方式的示意图。(3)(细胞过滤-离心型)
[图4]图4是示出，本发明的方法中，作为典型的例子，用于将含有细胞(细胞悬浮液)的液体样品通过聚酰亚胺多孔膜过滤的一个方式的示意图。(4)(细胞滤网-压力型)
[图5]图5是示出实施例1的工序和结果的照片。
[图6]图6示出一个例子，其中进行本发明的全血过滤(实施例2)。
[图7]图7示出了使用小鼠的过滤实验的结果。
用于实施发明的方式
本发明，在一个方案中，分离、除去、和/或分析细胞的方法。本发明中，作为分离，除去，和/或分析细胞的方法的一个实例，涉及细胞活化抑制物质的筛选方法。
本发明人已经发现如下事实，用含细胞的液体样品(例如，细胞悬浮液)和血液样品，使其通聚酰亚胺多孔膜，聚酰亚胺多孔膜根据膜上承载的细胞的大小、特性，影响细胞的通过度，设想了本发明。当过滤附着性细胞时，发现大多数细胞被捕捉在聚酰亚胺多孔膜内。此外，尺寸小细胞内，特别是悬浮系细胞容易通过膜，由此在悬浮系的小细胞为对象时，也可能反映了细胞状态可能性被构思，在使用通过佛波酯活化的免疫系确立细胞而证实的情况下，为诱导炎症的细胞的细胞中几乎未能通过聚酰亚胺多孔膜的现象被发现。同样，如果能够抑制这种炎症状态，细胞通过率可恢复。也就是说，通过聚酰亚胺多孔膜的通过的短时间的评价，能够普遍评价炎症状态的程度。适用于快速筛选的单膜评价方法已经被首次发现。
I.分离，除去，和/或分析细胞的方法
本发明中，在一个方式中，涉及分离，除去和/或分析细胞的方法。本发明分离，除去和/或分析细胞的方法中包括以下，通过聚酰亚胺多孔膜，通常使细胞悬浮液过滤，通过由所述操作通过的细胞和聚酰亚胺多孔膜捕捉的细胞，分析细胞的状态的系统和方法论。本发明人发现，聚酰亚胺多孔膜具有的多面多孔结构，根据细胞的大小和特性，保持原样地停留在膜中或通过的现象，并想到了本发明。聚酰亚胺多孔膜具有的立体环境给出了细胞合适的多种的环境，根据情况能够选择是否停留在膜内或通过。通过利用这种原理，而不需要特别的装置，可以分析细胞的状态。此外，使用现有的各种分析设备，可以分析分离后的细胞群。细胞的活化状态和炎症状态进展和抑制，通过膜的移动的简单的方法可以分析。通过应用这些，迅速且简便的药物研发筛选试剂盒的发展是容易的，大的工业价值被预期。
本发明的分离，除去和/或分析细胞的方法，包括，将包含细胞的液体样品通过聚酰亚胺多孔膜过滤，针对未能通过聚酰亚胺多孔膜而被膜捕捉的细胞、或通过聚酰亚胺多孔膜的液体样品中的细胞，对选自由以下组成的组的一个以上的细胞的特性进行检查：细胞的数量或种类，细胞的外部或内部结构，细胞表面抗原的种类或量，细胞来源的分泌物质的种类或量、细胞附着性和细胞生存率。
本发明的分离，除去和/或分析细胞的方法可用于从血液样品在体外成功地除去活化的白细胞。在过滤时，通过将由聚酰亚胺多孔膜捕捉的活化的白细胞除去，进行细胞除去疗法的方法论被包括。本发明人已经发现，当聚酰亚胺多孔膜具有非纤维形式的多方面的多孔结构，降低高附着性细胞和炎症状态细胞的膜通过特性，将患者的血液样品过滤时，这些细胞容易保留在膜中的现象已经被发现。本发明以前，血细胞除去疗法的医疗装置很多被发明实施。然而，通过细胞的附着性，成为纤维或球形的载体上附着的细胞的方式，过滤体(濾濾躯体)本身，因为不一定具有过滤特性，需要大量的接触面积。如果将聚酰亚胺多孔膜用作细胞过滤器的主体，由于材料本身也具有细胞过滤特性，与其本体接触时间非常短是可能的，除去疗法的时间缩短是可能的。必须接受这种处置的患者的负担显著减少。另外，由于在血液中给予不必要的应力的情况被减少，因此能够减少血栓形成的可能性。它有望成为突破性细胞除去疗法的材料。
1.细胞
本发明的方法对象是包含细胞的液体样品。细胞的种类没有特别的限制，可用于任何细胞的增殖。
例如，细胞选自由动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，酵母菌和细菌组成的组中。动物细胞大致分为，来源于属于脊椎动物门的细胞和来源于无脊椎动物(属于脊椎动物动物门的动物以外的动物)的细胞。在本说明书中，动物细胞的来源没有特别的限制。优选地，意味着来源于属于脊椎动物门的动物的细胞。脊椎动物门包括无颚纲和有颔纲，有颔纲包括哺乳纲，鸟纲，两栖纲，爬行纲等。优选地，在一般情况下，是来源于属于称为哺乳动物的哺乳纲的动物的细胞。哺乳动物包括，但不特别限于，优选小鼠，大鼠，人，猴，猪，狗，猫，绵羊，山羊等。
不存在限制，但是作为动物细胞优选，如动物细胞选自，中国仓鼠卵巢组织来源的细胞(CHO细胞)，非洲绿猴肾来源的确立细胞株(Vero细胞)，犬肾管上皮细胞细胞株(MDCK细胞)和人肝癌组织来源的已建立的细胞株(huGK-14)，的细胞被使用。
在本说明书中植物细胞的来源没有特别的限制。包括苔藓植物，蕨类植物，种子植物的植物的细胞成为对象。
植物种子细胞来源的植物包括，单子叶植物、双子叶植物的任一种。单子叶植物中包括，不存在限制，但是，兰科植物，禾本科植物(稻，玉米，大麦，小麦，高粱等)，莎草科植物等等。在双子叶植物中，包括属于菊亚纲，木兰亚纲，蔷薇亚纲等的多种亚纲的植物。
藻类，可视为细胞来源生物。从是真细菌的蓝细菌(蓝绿藻(蓝藻))，在真核生物中是单细胞生物的(硅藻，黄绿藻，涡鞭藻甲藻等)和是多细胞生物的海藻类(红藻，褐藻，绿藻)等的不同组被包括。
在本说明书中的古细菌和细菌种类没有特别限制。古细菌包括产甲烷菌，极度嗜盐菌，嗜热嗜酸菌，超嗜热菌等。细菌选自由以下组成的组：例如，乳酸菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌和蓝细菌。
可以在本发明的方法使用的动物细胞或植物细胞的种类选、但不限于自由以下组成的组：优选地，多能干细胞，组织干细胞，体细胞，和生殖细胞。
在本发明中术语“多能干细胞”意指具有分化成所有组织细胞的能力(分化多能性)细胞的总称。多能干细胞包括，不存在限制，但是，胚胎干细胞(ES细胞)，人工多能干细胞(诱导多能干细胞)(iPS细胞)，胚胎生殖干细胞(EG细胞)，生殖干细胞(GS细胞)等。优选的是，ES细胞或iPS细胞。iPS细胞是特别优选的，其原因是不存在伦理问题等的理由。作为多能干细胞可以使用任何已知的，例如，可以使用在国际公开WO2009/123349(PCT/JP2009/057041)中记载的多能干细胞。
作为“组织干细胞”，可分化细胞株列已经限定于特定的组织，这意味着有可向多种细胞种类分化的能力(分化多能性)的干细胞。例如，在骨髓中的造血干细胞成为血细胞的来源，神经干细胞分化为神经细胞。除此之外，存在构造肝脏的肝干细胞，成为皮肤组织的皮肤干细胞等的不同的种类。优选地，组织干细胞选自，间质干细胞，肝干细胞，胰干细胞，神经干细胞，皮肤干细胞，或造血干细胞。
作为“体细胞”，意指构成多细胞生物的细胞中除生殖细胞以外的细胞。在有性繁殖中没有被下一代继承。优选地，体细胞选自，肝细胞，胰细胞，肌细胞，骨细胞，成骨细胞，破骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞，皮肤细胞，成纤维细胞，胰细胞，肾细胞，肺细胞，或淋巴细胞，红细胞，白细胞，单核细胞，巨噬细胞或巨核细胞的血细胞。
“生殖细胞”指的是具有在生殖中将遗传信息传递给下一代的作用的细胞。例如，包括用于有性生殖的配子、即卵子、卵细胞、精子、精子细胞，用于无性繁殖的孢子。
细胞也可以选自由以下组成的组:肉瘤细胞，确立细胞和转化的细胞。作为“肉瘤”，包括骨、软骨、脂肪、肌肉、血液等非上皮细胞来源的结缔组织细胞中发生的癌症，软组织肉瘤，恶性骨肿瘤等。肉瘤细胞是肉瘤来源的细胞。“确立细胞”是指，长期间在体内外保持的、具有一定稳定的性质、可以半永久性传代培养的培养细胞。PC12细胞(来自大鼠肾上腺髓质)，CHO细胞(来自中国仓鼠卵巢)，HEK293细胞(来自人胎儿肾脏)，HL-60细胞(来自人白细胞)，HeLa细胞(来自人宫颈癌)，Vero细胞(来自非洲绿猴肾上皮细胞)，MDCK细胞(来自犬肾小管上皮细胞)，HepG2细胞(来自人肝癌)等的包括人类的不同物种的各种组织来源的细胞株存在。“转化的细胞”意味着，从细胞外部导入核酸(DNA等)，改变遗传性质的细胞。
不存在限制，但是作为本发明的方法的对象的“含有细胞的液体样品”优选为来自人，猴，狗，猫等哺乳动物的生物样品。因此，“细胞”优选包含在来自哺乳动物的生物样品中被包括，动物细胞或细菌。
生物体来源的样品可取决于生物体的一部分或整体而改变包含在其中的细胞的状态。本发明的方法中，在一个方式中，通过分析来自生物体的“含有细胞的液体样品”，目的是知道生物体的状态。例如，当来自生物体的液体样品中含有大量活化细胞时，生物的整体(全身)或一部分被活化，即有可能引发炎症的情况被确定。在本发明的一个方式中，成为对象的细胞是被活化的细胞(例如，活化白细胞)。
2.包括细胞的液体样品等
本发明的方法对象是包含细胞的液体样品。在本发明中的液体样品包括细胞，或者如果有可能含有细胞则没有特别的限制。生物体来源的，即从生物体获得的生物样品，或者可以人工调节的样品均可。此外，“液体样品”包括但估计含有活化的白细胞的“血液样品”，在本说明书中，以从血液样品除去活化的白细胞为目的而采取样品被限定地称为“血液样品”，与“液体样品”区分使用的情况存在。此外，尽管含血液样品的液体样品适当记载为“液体样品等”，“液体样品”，“液体样品等”和“血液样品”可以互换使用。
含有细胞的液体样品也可以是，包括选自原代细胞，确立细胞，以及细胞血液分离细胞的一种或多种细胞的细胞悬浮液。用于制备这些细胞的，和包含细胞的液体样品的方法是本领域技术人员公知的。
术语“原代细胞”，是指将从生物体采取的组织和细胞第一次接种、培养的细胞。通常它指的是执行传代操作之前培养的培养状态的细胞，在许多情况下，非单一细胞而是多种细胞的混合。
那些传代原代细胞的细胞被称为传代细胞。由传代维护增殖能力的一系列细胞称为“确立细胞”。各种确立细胞被建立，如在“细胞”项目中所述，PC12细胞(来自大鼠肾上腺髓质)，CHO细胞(来自中国仓鼠卵巢)，HEK293细胞(来自人胎儿肾脏)，HL-60细胞(来自人白细胞)，HeLa细胞(来自人宫颈癌)，Vero细胞(来自非洲绿猴肾上皮细胞)，MDCK细胞(来自犬肾小管上皮细胞)，HepG2细胞(来自人肝癌)等等被包括。
“血液分离细胞”是指可以从包含在所述血液(血细胞)的血液中分离出来的一组细胞。血液成分包括，血细胞成分(细胞性成分，血细胞)，血小板，血细胞成分和使血小板悬浮的血浆成分(液性成分)。血细胞成分(血细胞)，包括红细胞，白细胞，血小板。
本发明人已经发现，血液的成分中，白细胞，具体地由炎症等作用活化的白细胞被选择性地捕捉。白细胞，在广义上是指参与生物防御的免疫活性细胞，通常，是淋巴细胞，粒细胞，单核细胞的总称。当使用血液样品时，在本发明中特别是由聚酰亚胺多孔膜选择性地捕捉的是活化的粒细胞。粒细胞，通常是，嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞和嗜酸性粒细胞的总称。不存在限制，但是，特别是选择性地捕捉的活化的嗜酸性粒细胞。
含有细胞的液体样品可以是选自血液，尿，汗，贮存体(储存泡)腔液，体腔清洗液和痰液的生物样品。对于血液样品如上所述。尿样品，汗液样品包括尤其是白细胞，红细胞，尿管型(尿円柱)，等细胞组分。由将这些生物样品通过聚酰亚胺多孔膜过滤，样品中的细胞成分中特别活化的细胞可以选择性地由聚酰亚胺多孔膜捕捉。
3.细胞活化剂
在本发明中，在向含细胞的液体样品中添加细胞活化剂、从而培养细胞后，将所述液体样品通过聚酰亚胺多孔膜过滤是可能的。
“细胞活化剂”是用于在体外或体内活化细胞的物质的总称，它没有特别的限制。引起细胞炎症的“炎症诱导物质”也可以被包含在本文细胞活化剂中。
通过向含有细胞的液体样品加入细胞活化剂，对于包含在液体样品中的细胞，选自细胞种类或数目，细胞外部或内部结构，细胞表面抗原的种类或量，细胞来源的分泌物质种类或量，细胞的附着性和细胞的生存率的一个以上的细胞的特性，可能发生变化。其结果是，未能通过聚酰亚胺多孔膜而由膜捕捉的细胞，和/或通过聚酰亚胺多孔膜的液体样品中的细胞可以发生变化。
“细胞活化剂”可以包括，不存在限制地，佛波酯，二酰基甘油，脂多糖，炎性细胞因子如TNFα等。
4.聚酰亚胺多孔膜
本发明是特征是，包括使含有细胞的液体样品通过聚酰亚胺多孔膜过滤的工序。
聚酰亚胺是在重复单元中包含酰亚胺键的高分子(聚合物)的总称，通常是指芳族化合物通过直接酰亚胺键连接的芳族聚酰亚胺。芳族聚酰亚胺具有芳族和芳族通过酰亚胺键的共轭结构，具有刚硬、牢固的分子结构，并且酰亚胺键具有强的分子间力，因此，具有非常高水平的热的、机械的、化学的性质。
在本发明中使用的聚酰亚胺多孔膜是，包括由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺(作为主要成分)的聚酰亚胺多孔膜，更优选为由通过四羧酸二酐和二胺所得到的聚酰亚胺形成的聚酰亚胺多孔膜。所述“作为主要组分包括”意指，作为聚酰亚胺多孔膜的构成成分，从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺以外的成分是基本上不被包含的，或者即使被包含，也是不影响由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的性质的另外的成分。
在本发明中使用的聚酰亚胺多孔膜、包括从四羧酸成分和二胺组分得到的聚酰胺酸溶液与着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形后，在250℃以上仅限热处理，由此得到的的聚酰亚胺多孔膜也被包括。
聚酰胺酸
聚酰胺酸是通过聚合四羧酸成分和二胺成分而获得。聚酰胺酸是，通过热酰亚胺化或化学酰亚胺化的闭环、可以成为聚酰亚胺的聚酰亚胺前体。
聚酰胺酸，即使酰胺酸的部分被酰亚胺化，只要它不影响本发明，也可以使用。即，聚酰胺酸的一部分可以被热酰亚胺化或者化学酰亚胺化。
在将聚酰胺酸热酰亚胺化的情况下，根据需要，酰亚胺化催化剂，有机含磷化合物，无机微粒，有机微粒等的微粒等可被添加到聚酰胺酸溶液。此外，如果将聚酰胺酸化学酰亚胺化，根据需要，化学酰亚胺化剂，脱水剂，无机微粒，有机微粒等的微粒等可被添加到聚酰胺酸溶液。聚酰胺酸溶液中即使混合前述成分、在着色前体不析出的条件下进行也是优选的。
着色前体
在本发明中着色前体是指，通过250℃以上的热处理、部分或完全碳化、以产生着色化物的前体。
作为本发明中使用的着色前体，在聚酰胺酸溶液或聚酰亚胺溶液中均匀地溶解或分散，通过250℃以上、优选260℃以上、更优选280℃以上、更优选300℃以上的热处理，优选在空气等的氧存在下的250℃以上、优选260℃以上、更优选280℃以上、更优选300℃以上的热处理而热分解，碳化，从而产生着色化物的前体是优选的，产生黑色系的着色化物的前体是更优选的，碳系着色前体是更优选的。
着色前体如果进行加热则变得可以一下就看到碳化物，但是，在组织(结构)中包括除碳之外的不同元素，包括层结构，芳族交联结构，含有四面体碳的无序结构。
碳系着色前体，没有特别限定，可以列举，例如，石油焦油、石油沥青、煤焦油、煤沥青等的焦油、或沥青、焦炭、从含有丙烯腈的单体而得到的聚合物、二茂铁化合物(二茂铁和二茂铁衍生物)等。其中，从含有丙烯腈的单体得到的聚合物和/或二茂铁化合物是优选的，作为由含有丙烯腈的单体得到的聚合物，聚丙烯腈是优选的。
四羧酸二酐可以使用任何四羧酸二酐，可以根据所期望的性质来适当地选择。作为四羧酸二酐的具体例子，可以列举苯均四酸二酐、3，3’，4，4’－联苯四羧酸二酐(s－BPDA)、2，3，3’，4’－联苯四羧酸二酐(a－BPDA)等的联苯四羧酸二酐、氧双邻苯二甲酸二酐、二苯砜－3，4，3’，4’－四羧酸二酐、双(3，4－二羧基苯基)硫化物二酐、2，2－双(3，4－二羧基苯基)－1，1，1，3，3，3－六氟丙烷二酐、2，3，3’，4’－二苯甲酮四羧酸二酐、3，3’，4，4’－二苯甲酮四羧酸二酐、双(3，4－二羧基苯基)甲烷二酐、2，2－双(3，4－二羧基苯基)丙烷二酐、p－苯撑双(偏苯三酸单酯酸酐)、p－双苯撑双(偏苯三酸单酯酸酐)、m－三联苯基－3，4，3’，4’－四羧酸二酐、p－三联苯基－3，4，3’，4’－四羧酸二酐、1，3－双(3，4－二羧基苯氧基)苯二酐、1，4－双(3，4－二羧基苯氧基)苯二酐、1，4－双(3，4－二羧基苯氧基)双苯基二酐、2，2－双[(3，4－二羧基苯氧基)苯基]丙烷二酐、2，3，6，7－萘四羧酸二酐、1，4，5，8－萘四羧酸二酐、4，4’－(2，2－六氟亚异丙基)二苯二甲酸二酐等を挙げることができる。此外，优选使用2，3，3’，4’－二苯砜四羧酸等的芳香族四羧酸。前述这些可以单独使用，也可以两种以上组合使用。
在这些中，特别优选的是，从由联苯四羧酸二酐和均苯四羧酸二酐组成的组中选择的至少一种芳族四羧酸二酐。作为联苯四羧酸二酐，可以适当地使用3，3’，4，4’－联苯四羧酸二酐。
二胺可以使用任何二胺。作为二胺的具体例子，可以举出以下。
1)1，4－二氨基苯(对苯撑二胺)、1，3－二氨基苯、2，4－二氨基甲苯、2，6－二氨基甲苯等的苯核1个的苯二胺；
2)4，4’－二氨基二苯醚、3，4’－二氨基二苯醚等的二氨基二苯醚、4，4’－二氨基二苯基甲烷、3，3’－二甲基－4，4’－二氨基联苯，2，2’－二甲基－4，4’－二氨基联苯，2，2’－双(三氟甲基)－4，4’－二氨基联苯，3，3’－二甲基－4，4’－二氨基二苯基甲烷、3，3’－二羧基－4，4’－二氨基二苯基甲烷、3，3’，5，5’－四甲基－4，4’－二氨基二苯基甲烷、双(4－氨基苯基)硫化物、4，4’－二氨基苯甲酰苯胺、3，3’－二氯联苯胺、3，3’－二甲基联苯胺、2，2’－二甲基联苯胺、3，3’－二甲氧基联苯胺、2，2’－二甲氧基联苯胺、3，3’－二氨基二苯醚、3，4’－二氨基二苯醚、4，4’－二氨基二苯醚、3，3’－二氨基二苯基硫化物、3，4’－二氨基二苯基硫化物、4，4’－二氨基二苯基硫化物、3，3’－二氨基二苯砜、3，4’－二氨基二苯砜、4，4’－二氨基二苯砜、3，3’－二氨基二苯甲酮、3，3’－二氨基－4，4’－二氯二苯甲酮、3，3’－二氨基－4，4’－二甲氧基二苯甲酮、3，3’－二氨基二苯基甲烷、3，4’－二氨基二苯基甲烷、4，4’－二氨基二苯基甲烷、2，2－双(3－氨基苯基)丙烷、2，2－双(4－氨基苯基)丙烷、2，2－双(3－氨基苯基)－1，1，1，3，3，3－六氟丙烷、2，2－双(4－氨基苯基)－1，1，1，3，3，3－六氟丙烷、3，3’－二氨基二苯基亚砜、3，4’－二氨基二苯基亚砜、4，4’－二氨基二苯基亚砜等的苯核2个的二胺；
3)1，3－双(3－氨基苯基)苯、1，3－双(4－氨基苯基)苯、1，4－双(3－氨基苯基)苯、1，4－双(4－氨基苯基)苯、1，3－双(4-氨基苯氧基)苯、1，4－双(3-氨基苯氧基)苯、1，4－双(4-氨基苯氧基)苯、1，3－双(3-氨基苯氧基)－4－三氟甲基苯、3，3’－二氨基－4－(4－苯基)苯氧基二苯甲酮、3，3’－二氨基－4，4’－二(4－苯基苯氧基)二苯甲酮、1，3－双(3－氨基苯基硫化物)苯、1，3－双(4－氨基苯基硫化物)苯、1，4－双(4－氨基苯基硫化物)苯、1，3－双(3－氨基苯基砜)苯、1，3－双(4－氨基苯基砜)苯、1，4－双(4－氨基苯基砜)苯、1，3－双[2－(4－氨基苯基)异丙基]苯、1，4－双[2－(3－氨基苯基)异丙基]苯、1，4－双[2－(4－氨基苯基)异丙基]苯等的苯核3个的二胺；
4)3，3’－双(3-氨基苯氧基)联苯，3，3’－双(4-氨基苯氧基)联苯，4，4’－双(3-氨基苯氧基)联苯，4，4’－双(4-氨基苯氧基)联苯，双[3－(3-氨基苯氧基)苯基]醚、双[3－(4-氨基苯氧基)苯基]醚、双[4－(3-氨基苯氧基)苯基]醚、双[4－(4-氨基苯氧基)苯基]醚、双[3－(3-氨基苯氧基)苯基]酮、双[3－(4-氨基苯氧基)苯基]酮、双[4－(3-氨基苯氧基)苯基]酮、双[4－(4-氨基苯氧基)苯基]酮、双[3－(3-氨基苯氧基)苯基]硫化物、双[3－(4-氨基苯氧基)苯基]硫化物、双[4－(3-氨基苯氧基)苯基]硫化物、双[4－(4-氨基苯氧基)苯基]硫化物、双[3－(3-氨基苯氧基)苯基]砜、双[3－(4-氨基苯氧基)苯基]砜、双[4－(3-氨基苯氧基)苯基]砜、双[4－(4-氨基苯氧基)苯基]砜、双[3－(3-氨基苯氧基)苯基]甲烷、双[3－(4-氨基苯氧基)苯基]甲烷、双[4－(3-氨基苯氧基)苯基]甲烷、双[4－(4-氨基苯氧基)苯基]甲烷、2，2－双[3－(3-氨基苯氧基)苯基]丙烷、2，2－双[3－(4-氨基苯氧基)苯基]丙烷、2，2－双[4－(3-氨基苯氧基)苯基]丙烷、2，2－双[4－(4-氨基苯氧基)苯基]丙烷、2，2－双[3－(3-氨基苯氧基)苯基]－1，1，1，3，3，3－六氟丙烷、2，2－双[3－(4-氨基苯氧基)苯基]－1，1，1，3，3，3－六氟丙烷、2，2－双[4－(3-氨基苯氧基)苯基]－1，1，1，3，3，3－六氟丙烷、2，2－双[4－(4-氨基苯氧基)苯基]－1，1，1，3，3，3－六氟丙烷等的苯核4个的二胺。
前述这些可以单独施用，也可以两种以上混合使用。使用的二胺可以根据所期望的特性适当地选择。
在这些中，芳族二胺化合物是优选的，3，3’－二氨基二苯醚、3，4’－二氨基二苯醚、4，4’－二氨基二苯醚以及对苯撑二胺、1，3－双(3－氨基苯基)苯、1，3－双(4－氨基苯基)苯、1，4－双(3－氨基苯基)苯、1，4－双(4－氨基苯基)苯、1，3－双(4-氨基苯氧基)苯、1，4－双(3-氨基苯氧基)苯它可以适当地使用。特别是，从苯二胺，二氨基二苯醚和双(氨基苯氧基)苯基组成的组中选择的至少一种二胺是优选的。
本发明中使用的从耐热性、高温下的尺寸稳定性的观点来看，从组合玻璃化转变温度是240℃以上、或300℃以上的没有明确的转变温度的四羧酸二酐和二胺而获得的聚酰亚胺形成是优选的。
在本发明中使用的聚酰亚胺多孔膜，从耐热性，高温下的尺寸稳定性的观点考虑，优选由以下芳族聚酰亚胺形成的聚酰亚胺多孔膜。
(i)由选自联苯基四羧酸单元和均苯四酸单元组成的组中选择的至少一种四羧酸单元与，芳族二胺单元形成的芳香族聚酰亚胺、
(ii)由四羧酸单元与，从苯二胺单元、二氨基二苯基醚单元和双(氨基苯氧基)苯基单元组成的组中选择的至少一种芳族二胺单元形成的芳族聚酰亚胺、
和/或，
(iii)由选自联苯四羧酸单元和均苯四酸单元组成的组中的至少一种四羧酸单元与，从苯二胺单元、二氨基二苯基醚单元和双(氨基苯氧基)苯基单元组成的组中选择的至少一种芳族二胺单元形成的芳族聚酰亚胺。
虽然没有限制，作为聚酰亚胺多孔膜，在本发明的方法中可以使用至少具有两个表面层和(A面和B面)，和夹在这两个表面层之间的大空隙层的多层结构的聚酰亚胺多孔膜。优选地，聚酰亚胺多孔膜具有以下多层结构，前述大空隙层具有，结合到前述表面层(A面和B面)的隔壁(隔板、隔膜)，由所述隔壁(隔板、隔膜)和前述表面层(A面和B面)所包围的、膜平面方向的平均孔径是微米(μm)的多个大空隙，前述大空隙层的隔壁(隔板、隔膜)和前述表面层(A面和B面)各自厚度是微米，具有多个具有 微米的平均孔直径的孔，所述细孔(微孔)可以相互连通，还可以与前述大空隙部分或完全连通的多层结构，并且总的膜厚度为 微米，孔隙率为40％以上而小于95％，的聚酰亚胺多孔膜。
在本发明中使用的聚酰亚胺多孔膜的总厚度包括不限制于，作为一个方式，可以是微米。膜厚度的差异，细胞的增殖速度，细胞形态，在平面内的细胞饱和度等差异的可观察到。
在本发明中，在具有两个不同的表面层(A面和B面)、所述两个表面层之间夹的大空隙层的聚酰亚胺多孔膜被使用的情况下，A面中存在的孔的平均孔径，与B面中存在的孔的平均孔径可以存在差异。优选地，A面中存在的孔的平均孔径，小于B面中存在的孔的平均孔径。更优选地，A面中存在的孔的平均孔径，小于B面中存在的孔的平均孔径，A面中存在的孔的平均孔径为 或B面中存在的孔的平均孔径为 或特别优选地，聚酰亚胺多孔膜的A面为具有平均孔径15μm以下，例如的小孔的网状结构，B面为具有平均孔径20μm或更大的孔的表面上，例如在 的大孔结构。
在本发明中使用的聚酰亚胺多孔膜的总厚度的测定通过接触式的厚度计进行。
聚酰亚胺多孔膜表面的平均孔径如下求得，通过多孔膜表面的扫描式电子显微照片，测定200点以上的开孔部的孔面积，根据所述孔面积按照下式(1)计算孔形状为正圆时的平均直径。
[数学公式1]
(式中、Sa指孔面积的平均值。)
本发明中使用的聚酰亚胺多孔膜的孔隙率可以如下求得，测量切割成预定尺寸的多孔膜的厚度和质量，从观察到的质量根据下式(2)来求得。
[数学公式2]
孔隙率(％)＝(1-w/(S×d×D))×100 (2)
(式中分别地、S意指多孔膜的面积，d意指总的膜厚度，w意指所测定的质量，D意指聚酰亚胺的密度。聚酰亚胺的密度为1.34克/厘米3。)
例如，国际公开WO2010/038873，特开2011-219585，或特开2011-219586中记载的聚酰亚胺多孔膜也可以在本发明的方法中使用。
在本发明的方法中填装细胞的聚酰亚胺多孔膜，当然优选，不含施加以外的细胞的状态，即，优选是无菌的。本发明的方法优选包括将聚酰亚胺多孔膜预先灭菌的工序。聚酰亚胺多孔膜的耐热性非常优异，重量轻，形状和尺寸也可自由选择，容易进行灭菌处理。干热灭菌，蒸汽灭菌，通过乙醇等消毒剂灭菌，UV或γ射线等的电磁波灭菌等任意的灭菌处理都是可能的
在本发明中，过滤工序之前，可以包括对聚酰亚胺多孔膜的表面的全部或部分进行预处理的工序。通过表面处理，液体样品是血液的情况下，可以防止凝固，提高分离、除去、和分析的效率，赋予亲水性，得到同等的效果。聚酰亚胺多孔膜的表面处理可以进行，抗凝血剂，胶原蛋白，聚-L-赖氨酸，层粘连蛋白，明胶，纤连蛋白，整联蛋白，胰岛素，血清，结合亲水性树脂的PDS等的使用表面处理剂的化学处理。或者，也可以进行UV，等离子体或类似的物理处理。
5.将含有细胞的液体样品等通过聚酰亚胺多孔膜过滤
本发明特征是，包括使含有细胞的液体样品等通过聚酰亚胺多孔膜过滤的工序。
在通过细胞的聚酰亚胺多孔膜过滤中，具体工序没有特别限制。本文描述的工序，或者它可以采用适合用于施加细胞膜载体的任何方法。
在本发明中的方法中，聚酰亚胺多孔膜，也可以固定使用，但也可以通过只在培养皿(皮氏培养皿)(シャーレ)中设置而使用。另外，也可以润湿膜的部分在培养皿(皮氏培养皿)(シャーレ)或存在凹部试验仪器的凹部上部简单地固定。为了促进凹部评估光学有效性，通过使用玻璃底培养皿(皮氏培养皿)(シャーレ)作为接收器导致效率的提高。
通过改善过滤速度减少分析时间，聚酰亚胺多孔膜可以整体通过磷酸缓冲液或培养基等被润湿。此外，将细胞悬浮液承载于干燥的聚酰亚胺多孔膜，并保存在培养箱，经很长一段时间，也可以进行过滤。此外，如果将细胞悬浮液承载于这样的聚酰亚胺干燥多孔膜并进行过滤，则从将悬浮液承载例如数分钟后，通过移动该聚酰亚胺多孔膜的位置，导致过滤速度大大增加。
类似地，通过如离心力或压力的方法，对液体部分施加力，可加速过滤。当利用离心力时，通过将离心管装备于支撑台，通过转离心分离机旋，能够增大液体部分的渗透速度。
不存在限制，过滤选自，自然过滤，离心过滤，真空过滤和压滤，可以应用任何已知的过滤技术。在下文中，不存在限制，但是，在本发明的方法中，示出了用于将含有细胞的液体样品通过聚酰亚胺多孔膜过滤的方式。
(1)(细胞过滤-基本系统1)放置(自然过滤)(图1)的聚酰亚胺多孔膜放置在玻璃底培养皿(皮氏培养皿)(シャーレ)上，从其上将所述细胞悬浮液承载。液体通过后，分离薄膜和玻璃底培养皿(皮氏培养皿)(シャーレ)，保持活细胞的原样或固定细胞，在玻璃底培养皿(皮氏培养皿)(シャーレ)残留细胞和聚酰亚胺多孔膜捕捉的细胞被观察到，对细胞进行评估。残留在玻璃底培养皿(皮氏培养皿)(シャーレ)的细胞，在保持其原样的情况下，例如，可以使用光学显微镜，例如倒置显微镜观察。
(2)(细胞过滤-基本系统2)放置(自然过滤)(图2)聚酰亚胺多孔膜放置于培养皿(皮氏培养皿)(シャーレ)上，从其上承载置细胞悬浮液。液体通过后，分离膜和培养皿(皮氏培养皿)(シャーレ)，保持活细胞的原样或固定细胞，培养皿(皮氏培养皿)(シャーレ)内液体部分和的聚酰亚胺多孔膜捕捉的细胞被观察到，评估细胞。
示出方式的示意图。
(3)(细胞过滤-离心)(离心过滤)聚酰亚胺多孔膜置于(图3)为支持台的离心管中，从其上加入细胞悬浮液。液体通过离心而通过，实施细胞过滤。对于回收的液体部分，保持活细胞的原样或固定细胞，进行观察，评估细胞。此外，对聚酰亚胺多孔膜捕捉的细胞进行观察，评价细胞。
(4)(细胞滤网-压力型)(加压过滤)(图4)聚酰亚胺多孔膜放置在与注射器可接合的过滤装置中，细胞悬浮液装入到注射器中，通过注射器进行悬浮液的过滤。过滤后，对回收的液体部分，保持活细胞的原样或固定细胞，进行观察，评估细胞。此外，对聚酰亚胺多孔膜捕捉的细胞进行观察到，评价细胞。
6.细胞的特性的测定
本发明的方法中，在过滤工序之后，针对未能通过聚酰亚胺多孔膜而被膜捕捉的细胞、或通过聚酰亚胺多孔膜的液体样品中的细胞，对选自由以下组成的组的一个以上的细胞的特性进行检查：细胞的数量或种类，细胞的外部或内部结构，细胞表面抗原的种类或量，细胞来源的分泌物质的种类或量、细胞附着性和细胞生存率。
细胞的数量或种类，细胞的外部或内部结构，细胞表面抗原的种类或量，细胞来源的分泌物质的种类或量、细胞附着性和细胞生存率等，可以使用用于对细胞特性“定性地”或“定量地”分析的任何已知的方法来确定或检查。
“细胞种类或数个”，例如，可以使用用于流式细胞术，血细胞分析装置等观察的细胞的装置来确定或检查。细胞的数量，可能只知道数量的增加或减少，而不是确切的数字。例如，当施用某些细胞活化抑制物质给受试者，在给药之前和之后，可以在聚酰亚胺多孔膜所捕捉的细胞中的百分比中发生变化。由该物质的施用导致的未能通过聚酰亚胺多孔膜而在膜中捕捉的细胞的比例降低，或者如果通过聚酰亚胺多孔膜的液体样品中的细胞的百分比增加时，活化细胞减少，这意味着施用物质作为细胞活化抑制物质而发挥作用。
细胞的数量(百分比)增加或减少，例如，可以通过用光学显微镜、立体显微镜观察，体腔液细胞诊断方法的姬姆萨(ギムザ)染色简单的方法来证实。
例如，“细胞的外部或内部结构”，可使用光学显微镜，电子显微镜，荧光显微镜等显微镜，流式细胞术，Western印迹，FIB-SEM等来执行。
所谓“细胞表面抗原”是，例如，人的白细胞等各种细胞的表面上存在的糖蛋白糖的各种分子的总称。例如，根据骨髓系(髓样)树突状细胞(树状细胞)，T细胞中的抗原CD8α，造血干细胞中的CD34抗原，细胞如CD133的种类，特定表面抗原被表达。通过检查(确定)细胞表面抗原，能够知道细胞的种类，特性(如附着性)。细胞表面抗原，例如，可以通过使用针对各个细胞表面抗原的特异性抗体来检查(确定)。
作为“来自细胞的分泌物质”，例如，细胞因子的产生，细胞外基质产生等，可被检查(确定)。分泌物质IL-6，例如，可以通过技术，诸如ELISA证实。
“细胞的附着性”可以使用针对细胞外基质的附着比色法等方法进行检查(确定)。
“细胞生存率”，例如，可使用台盼蓝染色法，LIVE/DEAD(注册商标)的测定法等的方法来检查(确定)。
未能通过聚酰亚胺多孔膜细胞而被膜捕捉的细胞，通过聚酰亚胺多孔膜的液体样品中的细胞中任一者，或两者可以被检查(确定)。通过测定的简便性、快速性，优选检查通过聚酰亚胺多孔膜的液体样品中的细胞。例如，如果通过聚酰亚胺多孔膜的液体样品中的细胞的数量增加，而不检查未能通过聚酰亚胺多孔膜而被膜捕捉的细胞，活化的细胞减少，即炎症状态被缓和的情况是可以估计的。
对于未能通过聚酰亚胺多孔膜而被膜捕捉的细胞，还任选例如，通过经历以保持在被施加到聚酰亚胺多孔膜的原样的状态下而进一步培养、等工序，检查细胞的特性是可能是。
II.细胞活化抑制物质的筛选方法
本发明包括，使用聚酰亚胺多孔膜筛选细胞活化抑制物质的方法。本发明的筛选方法中，本发明涉及的分离，除去，和/或分析细胞的方法的一个方式。本发明的筛选方法，其包括
(i)任选地向含有细胞的液体样品中添加细胞活化剂后，培养细胞，
(ii)向(i)的液体样品中添加测试物质，
(iii)将(ii)的液体样品通过聚酰亚胺多孔膜过滤，针对未能通过聚酰亚胺多孔膜而被膜捕捉的细胞、或通过聚酰亚胺多孔膜的液体样品中的细胞，对选自由以下组成的组的一个以上的细胞的特性进行检查：细胞的数量或种类，细胞的外部或内部结构，细胞表面抗原的种类或量，细胞来源的分泌物质的种类或量、细胞附着性和细胞生存率，并且，
(iv)如果未能通过聚酰亚胺多孔膜而被膜捕捉的细胞中、活化的细胞的比例和/或数目比(ii)的工序中没有加入测试物质的情况减小，或者，如果通过聚酰亚胺多孔膜的液体样品中的细胞中、活化的细胞的比例和/或数目比(ii)的工序中没有加入测试物质的情况增加，那么确定测试物质是细胞活化抑制物质。
在工序(i)和(iii)中，分离，除去，和分析细胞的方法如所描述的。在本发明的筛选方法中，在工序(i)通过细胞活化剂，对活化的细胞，通过加入测试物质(工序(ii))，检查细胞活化是否被抑制，细胞被聚酰亚胺多孔膜捕捉的程度，将其作为指标。
未能通过聚酰亚胺多孔膜而被膜捕捉的细胞中，如果活化的细胞的比例和/或数目比在工序(ii)中不添加试验物质时减少，或如果通过聚酰亚胺多孔膜的液体样品中的细胞中，活化的细胞的比例和/或数目比在(ii)工序中不加入测试物质时增加，那么判断测试物质是细胞活化抑制物质。
“测试物质”指的是要确定效果的任何物质，没有特别限定，例如，低分子化合物，蛋白质，肽，糖蛋白，和短链RNA可以用作细胞活化抑制物质的候选化合物。
III.细胞培养
本发明中，分离，除去，和/或分析细胞的方法，和本发明的筛选方法中可包括，进一步培养通过聚酰亚胺多孔膜的液体样品中的细胞。或者，将未能通过聚酰亚胺多孔膜而被膜捕捉的细胞，在保持施加到聚酰亚胺多孔膜的状态下进一步培养。此外，对所捕捉的细胞产生的物质进行分析。
通过使用聚酰亚胺多孔膜的过滤分离的细胞进一步培养，由此细胞的特性分析变得容易的情况存在，或将分离、培养的细胞施加至适当的生物体的用途均可以使用。
适用于植物细胞，动物细胞和细菌的各细胞的培养方法是已知的，通过使用本领域技术人员已知的任何方法可以通过聚酰亚胺多孔膜培养细胞。根据细胞培养培养基和细胞种类可以进行适当调制。
动物细胞的细胞培养方法、细胞培养基，例如，在朗达公司(ロンザ社)细胞培养培养基产品目录中记载。植物细胞的细胞培养方法、细胞培养培养基，例如，在WAKO公司植物组织培养基系列等中记载。细菌的细胞培养方法、细胞培养培养基，例如，在BD公司一般细菌用培养基目录中记载。
在本发明的方法中，细胞已经在聚酰亚胺多孔膜被捕捉后，可以使用任何已知方法培养细胞。对于使用聚酰亚胺多孔膜培养细胞，微载体和纤维素海绵等，和其他悬浮型培养载体也可以共存。
用于在保持将细胞施加到聚酰亚胺多孔膜的原样而培养的细胞培养装置中，同时，也可以将聚酰亚胺多孔膜固定地使用，也可以在悬浮液中悬浮地使用，即使放置在细胞培养中，可以从培养基中露出在。在该细胞培养装置中，两个或更多的聚酰亚胺多孔膜可以上下或左右地层叠。层叠的集合体和集成体可以被放置在培养基中，也可以从培养基中露出。
可在本发明的方法中使用可采取任何形式的含有聚酰亚胺多孔膜的细胞培养装置，可以使用公知的细胞培养装置。培养装置的形状没有特别的限制，例如从培养皿(皮氏培养皿)(シャーレ)，试管到大罐可以适当地使用。培养中使用的系统的形状、规模等没有特别的限制，从细胞培养用的培养皿(皮氏培养皿)(シャーレ)、烧瓶、塑料袋、试管到大型的罐都可适当利用。例如，BD Falcon公司制的セルカルチャーディッシュ、サーモサイエンティフィック公司制的Nuncセルファクトリー等被包括。顺便提及，通过在本发明中使用聚酰亚胺多孔膜，即使对于生来不可能悬浮培养的细胞，在靶向悬浮培养的装置中，也可能以悬浮培养类似的状态下进行培养。作为悬浮培养装置，可用例如，Corning公司(コーニング社)制的转瓶(旋转烧瓶)或旋转培养等。此外，作为可以提供相同的功能的环境，VERITAS公司的FiberCell(注册商标)System这样的中空纤维培养也可以使用。
根据本发明的培养细胞的细胞培养装置，通过如在网膜连续添加培养基的，如通过循环或开放式装置，将聚酰亚胺多孔膜暴露到空气的形式型也可以运行。
IV.用于本发明的方法中使用的装置
本发明中还涉及包括聚酰亚胺多孔膜，用于本发明的方法中使用的装置。在本发明的装置中，两个以上的聚酰亚胺多孔膜可以上下或左右地层叠。
本发明的装置中，除了聚酰亚胺多孔膜可适当包括用于过滤包含细胞的样品的构成要素。例如，支撑聚酰亚胺多孔膜的玻璃或模块，送液管，泵，任选的灭菌罐(灭菌袋)等被包括。不存在限制，但是，作为一个方面，在一个透明的袋，聚酰亚胺多孔膜被固定在内部、包括填充有无菌液体的柱模块可以被包括。此外，连续的培养基供给装置，连续的培养基循环装置，细胞培养装置等细胞培养的构成要素可以被包括。
在本发明中的方法中，聚酰亚胺多孔膜，可以固定地使用，也可以仅在灭菌的柱或模块中放置地使用。此外，以在用无菌填充液体填充柱的状态，也可以开始使用。对于在该状态下柱或模块，使用来自泵的压力和重力，通过在柱中设置单个或多个聚酰亚胺多孔膜，在膜内残留性持高的细胞被除去。
柱或模块，也可以选择圆柱或圆盘状等，自由的形状。还相对于所述材料的组成，没有特别的约束被接收。GE医疗集团有限公司(GEヘルスケア社)制的XK柱，如赛默飞世尔科技公司(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)制的一次性塑料柱(ディスポーザブル·プラスチックカラム)等的市售空柱可能使用。
V.试剂盒
本发明还涉及包括聚酰亚胺多孔膜的用于本发明的方法中使用的试剂盒。
本发明的试剂盒中，除了聚酰亚胺多孔膜可适当包括用于过滤包含细胞的样品的构成要素。例如，施加到聚酰亚胺多孔膜的细胞，支撑聚酰亚胺多孔膜的玻璃或模块，送液管，泵，任选的灭菌罐(灭菌袋)以及使用说明书等被包括。此外，细胞培养培养基，连续介质供给装置，连续培养基循环装置，细胞培养装置等用于细胞培养的构成要素可以被包括。
不存在限制，作为一个方式，包括在透明的袋(小袋)内保存单独或多个经灭菌的聚酰亚胺多孔膜，保持其原样地在细胞培养中可使用形式的包装，或在相同袋(小袋)内封入聚酰亚胺多孔膜与灭菌液体，使得有效地吸式接种成为可能的膜-液体集成形式的试剂盒。此外，关于试剂盒集成的膜-液体，从所述受试者的血液样品在本发明的方法中，的形式以这样的方式来返回活化的白细胞除去血液向受试者，例如，进入无菌透明背面，内聚酰亚胺多孔膜是固定的，包括填充有液体的无菌柱模块，如果撕开无菌背面还可以提供可用的沿着主体的集成套件被直接连接到其泵。
VI.用途
本发明进一步包括聚酰亚胺多孔膜在上述的本发明的方法中的用途。
[实施例]
以下、基于实施例对本发明更具体地描述。本发明不限于这些实施例。本领域技术人员基于本说明书中的描述可以容易地对本发明添加修改和改变，它们被包括在本发明的技术范围内。此后，当没有特别描述时，“聚酰亚胺多孔膜”是指，总厚度25μm，孔隙率73％的聚酰亚胺多孔膜。所述聚酰亚胺多孔膜具有，两个不同的表面层(A面和B面)，夹在两个表面层之间的大空隙层。存在于A面的孔的平均孔径为6μm，存在于在B面的孔的平均孔径为46μm。
顺便说一下，在以下实施例中使用的聚酰亚胺多孔膜如下制成，包括从为四羧酸成分的3，3’，4，4’－联苯四羧酸二酐(s－BPDA)与为二胺成分的4，4’－二氨基二苯醚(ODA)得到的聚酰胺酸溶液以及是着色前体的聚丙烯酰胺的聚酰胺酸溶液组合物成形后，在250℃以上进行加热处理，由此进行制备。
实施例1
在本实施例中，使用人白血病T细胞株Jurkat细胞，通过添加佛波酯培养、活化后，使用聚酰亚胺多孔膜进行细胞的过滤，通过观察被过滤的细胞的数量，对细胞的状态进行分析。
将Jurkat细胞(每1ml 1.5×106个细胞)，在加入了10％FBS的RPMI 1640培养基中培养，向其每1毫升添加10纳克佛波酯，温育5分钟。
在预先聚L-赖氨酸包被的玻璃底培养皿(皮氏培养皿)(シャーレ)周围通过甘油制作湿润部位(照片1)，使用该部位将灭菌的2厘米角的正方形聚酰亚胺多孔膜，在大孔结构的B面上设置(照片2)。在该状态下，将预先制备的活化的Jurkat细胞作为悬浮液承载至100μl膜上(照片3)，在CO2培养箱温育12小时，液体部分是几乎全部通过聚酰亚胺多孔膜(照片4)在底部获得通过液体(照片5)。小心除去液体部分，将残余细胞用磷酸缓冲液洗涤两次后，固定在福尔马林中。将类似的实验，加入DMSO而不是佛波酯，用Jurkat细胞来实施，和进行对照试验。将过滤后附着于玻璃面的细胞，通过倒置显微镜，将对照组(照片6)和佛波酯组相比(照片7)。尽管观察到在对照组中的大量细胞，在佛波酯组中大多数细胞未被观察到。
实施例2
在本实施例中，脂多糖腹腔内给予6只6周龄Balb/c小鼠，16小时后，使用BDマイクロティナ(注册商标)MAP微量采血管，采取全血。使用聚酰亚胺多孔膜过滤全血(过滤时间5-10分钟)，将过滤前、过滤后的血细胞成分，使用SIEMENS公司制血细胞分析装置Adovia(アドヴィア)2120，对过滤前血液和过滤后血液进行了分析。作为比较例，使用五只健康Balb/c小鼠、进行了同样的过滤实验(图2)。
在表1和图3中示出结果。通过本发明的方法，白细胞，特别是，嗜酸性粒细胞的大量减少被观察到。过滤后的嗜酸性粒细胞的值与在LPS小鼠和健康小鼠中的没有实质性的区别。
[表1]

Claims (20)

1.分离、除去、和/或分析细胞的方法，其包括，将包含细胞的液体样品通过聚酰亚胺多孔膜过滤，针对未能通过聚酰亚胺多孔膜而被膜捕捉的细胞、或通过聚酰亚胺多孔膜的液体样品中的细胞，对选自由以下组成的组的一个以上的细胞的特性进行检查：细胞的数量或种类，细胞的外部或内部结构，细胞表面抗原的种类或量，细胞来源的分泌物质的种类或量、细胞附着性和细胞生存率。
2.权利要求1中记载的方法，成为对象的细胞是活化的细胞。
3.权利要求2中记载的方法，活化的细胞是活化白细胞。
4.权利要求1～3中任一项中记载的方法，包括在过滤工序前，将聚酰亚胺多孔膜的表面的全部或一部分预处理的工序。
5.权利要求4中记载的方法，聚酰亚胺多孔膜的表面处理使用选自由以下组成的组的一种以上试剂或处理方法来进行：抗凝血剂，胶原蛋白，聚-L-赖氨酸，UV，等离子体和结合亲水树脂的PDS。
6.权利要求1-5中任一项中记载的方法，包括向含有细胞的液体样品中添加细胞活化剂后，培养细胞，然后将所述液体样品通过聚酰亚胺多孔膜过滤。
7.一种用于筛选细胞活化抑制物质的方法，其包括
(i)任选地向含有细胞的液体样品中添加细胞活化剂后，培养细胞，
(ii)向(i)的液体样品中添加测试物质，
(iii)将(ii)的液体样品通过聚酰亚胺多孔膜过滤，针对未能通过聚酰亚胺多孔膜而被膜捕捉的细胞、或通过聚酰亚胺多孔膜的液体样品中的细胞，对选自由以下组成的组的一个以上的细胞的特性进行检查：细胞的种类或数量，细胞的外部或内部结构，细胞表面抗原的种类或量，细胞来源的分泌物质的种类或量、细胞附着性和细胞生存率，并且，
(iv)如果未能通过聚酰亚胺多孔膜而被膜捕捉的细胞中、活化的细胞的比例和/或数目比(ii)的工序中没有加入测试物质的情况减小，或者，如果通过聚酰亚胺多孔膜的液体样品中的细胞中、活化的细胞的比例和/或数目比(ii)的工序中没有加入测试物质的情况增加，那么确定测试物质是细胞活化抑制物质。
8.权利要求1～7中任一项中记载的方法，含有细胞的液体样品是细胞悬浮液，其包含选自原代细胞、确立细胞和血液分离细胞的一种以上细胞。
9.权利要求1～7中任一项中记载的方法，含有细胞的液体样品是选自由以下组成的组的生物样品：血液，尿，汗，贮存体(储存泡)腔液，体腔清洗液和痰液。
10.权利要求1～9中任一项中记载的方法，过滤选自由以下组成的组：自然过滤，离心过滤，减压过滤和加压过滤。
11.权利要求1～10中任一项中记载的方法，包括，将通过聚酰亚胺多孔膜的液体样品中的细胞进一步培养。
12.权利要求1～10中任一项中记载的方法，包括，将未能通过聚酰亚胺多孔膜而被膜捕捉的细胞，在保持将所述细胞施加于聚酰亚胺多孔膜的状态进行进一步培养。
13.权利要求1～12中任一项中记载的方法，前述聚酰亚胺多孔膜是，包括由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔膜。
14.权利要求13中记载的方法，前述聚酰亚胺多孔膜是，使包含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰胺酸溶液和着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形后、在250℃以上进行热处理、由此得到的着色的聚酰亚胺多孔膜。
15.权利要求13或14中记载的方法，前述聚酰亚胺多孔膜是具有两个不同的表层面和大空隙层的多层结构的聚酰亚胺多孔膜。
16.权利要求15中记载的方法，前述聚酰亚胺多孔膜的厚度是75微米以下。
17.权利要求1～16中任一项中记载的方法，两个以上(两种以上)聚酰亚胺多孔膜上下或左右地层叠而使用。
18.用于在权利要求1～17中任一项中记载的方法中使用的装置，含有聚酰亚胺多孔膜。
19.用于在权利要求1～17中任一项中记载的方法中使用的试剂盒，含有聚酰亚胺多孔膜。
20.聚酰亚胺多孔膜在权利要求1～17中任一项中记载的方法中的用途。
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