CN110072535B - 细胞制剂 - Google Patents

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Abstract

提供作为治疗目标对于软骨组织相关疾病表现出高的治疗效果的含有球体的细胞制剂。一种软骨组织相关疾病的预防或治疗剂，其包含含有经过培养的间充质干细胞的球体作为有效成分。

Description

细胞制剂
技术领域
本发明涉及细胞制剂。更具体而言，本发明涉及含有规定的细胞培养物作为有效成分的特定疾病的预防或治疗剂。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells、MSCs)具有优异的自身再生能力和多分化能力。因此，间充质干细胞作为用于细胞治疗的细胞制剂的潜在性的细胞源值得期待(非专利文献1)。
使用这种间充质干细胞作为细胞制剂时，以所培养的细胞之间形成三维网络而成的球体(细胞块、细胞聚集体)的形态使用，从提高疾病的创伤治愈效果的观点考虑优选。
含有球体作为有效成分的细胞制剂中，现在仍然不知道对作为治疗目标的软骨组织相关疾病表现出高的治疗效果的细胞制剂。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Pittenger et al.,1999,Science.284:143-7
发明内容
发明要解决的问题
因此，本发明的目的在于，提供对作为治疗目标的软骨组织相关疾病表现出高的治疗效果的含有球体的细胞制剂。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述问题而进行深入研究。其结果令人惊讶地发现，包含含有经过培养的间充质干细胞的球体作为有效成分的细胞制剂对软骨组织相关疾病表现出高的治疗效果，从而完成了本发明。
即，本发明为一种软骨组织相关疾病的预防或治疗剂，其包含含有经过培养的间充质干细胞的球体作为有效成分。
发明的效果
根据本发明，提供对作为治疗目标的软骨组织相关疾病表现出高的治疗效果的含有球体的细胞制剂。
附图说明
图1为表示使用光学显微镜观察实施例1中的间充质干细胞的粘附培养的经过而得到的观察图像的照片。图1的(a)表示培养第1天的观察图像，图1的(b)表示培养第3天的观察图像。
图2为表示使用光学显微镜观察实施例2中的间充质干细胞的悬浮培养的经过而得到的观察图像的照片。
图3为表示测定实施例1和实施例2以及比较例1中经过培养的间充质干细胞中的人TGFβ1基因(软骨分化起因因子)的mRNA表达量而得到的结果的图。
图4为表示给予了比较例2中得到的经过平面培养的间充质干细胞以及实施例3和实施例4中得到的间充质干细胞球体的变形性膝关节病模型小鼠中的、组织学上的关节损伤度的半定量评分评价结果的图(评分越小则意味着关节损伤度越低)。
图5为表示对于给予了比较例2中得到的经过平面培养的间充质干细胞以及实施例3和实施例4中得到的间充质干细胞球体的变形性膝关节病模型小鼠中的关节组织进行藏红O染色而得到的结果的显微镜照片。
具体实施方式
本发明的一方式为一种软骨组织相关疾病的预防或治疗剂，其包含含有经过培养的间充质干细胞的球体作为有效成分。
以下对于本发明的实施方式进行说明。需要说明的是，本发明不仅限于以下的实施方式。本说明书中，表示范围的“X～Y”指的是“X以上且Y以下”。另外，只要没有特别说明则操作和物性等的测定在室温(20～25℃)/相对湿度40～50％RH的条件下测定。
＜有效成分(球体)＞
本方式的软骨组织相关疾病的预防或治疗剂包含含有间充质干细胞的球体作为有效成分。本说明书中，“球体”指的是细胞的聚集体(细胞块)，该概念也包括三维细胞集合体。需要说明的是，对于球体的尺寸没有特别限制，作为一例，球体的直径优选为1～500μm、优选10～300μm。在此，球体的直径能够通过常规方法(粒径分布测定)测定。
(间充质干细胞(MSC))
作为本方式的有效成分的球体的特征在于，含有经过培养的间充质干细胞。作为供于培养的间充质干细胞(MSC)，只要为未分化的间充质细胞则没有特别限制，可以使用由哺乳动物的骨髓、骨膜、脂肪组织、外周血等根据常规方法采集得到的间充质细胞。另外，采集后，也可以根据塑料附着性的有无等选择未分化的MSC。在此，作为MSC，从供应的容易程度和高的增殖性之类的观点考虑，优选使用脂肪组织来源的间充质干细胞。另外，作为MSC，优选使用种类与本发明的预防·治疗剂的给药对象相同的哺乳动物来源的MSC，可以使用给药对象以外的相同种类的哺乳动物来源的MSC、给药对象自身的MSC(自体细胞)。对于这些细胞由来的生物种类也没有特别限制，可以使用人和非人哺乳动物来源的各种细胞。作为细胞由来的生物种类，可例示出例如人、猕猴、青猴、食蟹猕猴、黑猩猩、绢毛猴(tamarin)和绒猴(marmoset)等灵长类、小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠等啮齿类、狗、猫、兔、猪、牛、山羊、绵羊、马等。需要说明的是，作为供于培养的MSC，可以将MSC增殖至70～90％铺满(优选80％铺满)而得到的细胞作为0次传代、使它们进一步增殖而使用1～10次传代的MSC。
(培养条件)
作为本方式的有效成分的球体的特征在于，含有经过培养的间充质干细胞。对于用于得到球体中含有的“经过培养的间充质干细胞”的培养条件也没有特别限制，若为本领域技术人员则能够适当选择能够培养间充质干细胞(MSC)的条件。
具体而言，作为培养间充质干细胞的方式，存在悬浮培养、粘附培养。其中，本发明中，培养优选为“粘附培养”。“粘附培养”是相对于“悬浮培养”的概念，指的是使想要培养的细胞、含有该细胞的球体粘附于细胞培养用基材的表面进行培养。培养中，“想要培养的细胞、含有该细胞的球体粘附于培养用基材的表面”指的是细胞、球体通过ECM(extracellular matrix、细胞外基质)等中含有的细胞-基质粘附分子而与培养用基材的表面粘附的状态，指的是即使轻轻摇动培养基，细胞、球体也不会悬浮于培养基中的状态。另一方面，“悬浮培养”指的是想要培养的细胞、含有该细胞的球体以不粘附于培养用基材的表面的方式进行培养。培养中，“想要培养的细胞、含有该细胞的球体不粘附于培养用基材的表面”指的是细胞、球体没有通过ECM等中含有的细胞-基质粘附分子与培养用基材的表面底面粘附的状态，指的是即使与基材的表面接触，若轻轻摇动培养基则细胞、球体也会悬浮于培养基中、或者不附着而沉落的状态等。若将其定量地表现，则本说明书中，在由培养容器内的含有细胞、球体的培养基将培养基全部去除后，再次以0.1mL/秒的速度将培养基注入到该容器时，细胞、球体由底面离开而漂浮或者细胞、球体移动500μm以上的情况下，判断该细胞、球体“悬浮(也就是说，该细胞、球体没有粘附于培养用基材的表面)”。
细胞培养中使用的培养基根据细胞适当选择即可。对于培养基的种类没有特别限定，例如可以使用任意的细胞培养基本培养基、分化培养基、初代培养专用培养基等。具体而言，可列举出Eagle’s最小必需培养基(EMEM)、达尔伯克改良Eagle’s培养基(DMEM)、α-MEM、Glasgow’s MEM(GMEM)、IMDM、RPMI1640、Ham’s F-12、MCDB培养基、William’s培养基E、肝细胞解冻培养基(Hepatocyte thaw medium)、MSC专用培养基和它们的混合培养基等，但是不限于它们，只要为含有细胞增殖、分化所需要的成分的培养基即可利用。进而也可以使用添加有血清、各种生长因子、分化诱导因子、抗生素、激素、氨基酸、糖、盐类等的培养基。对于培养温度也没有特别限制，通常在25～40℃左右进行。
对于供于培养的时间也没有特别限制，可以考虑细胞的增殖速度和所希望的球体的尺寸等适当确定。在此，培养的时间优选为4小时～30天(4～720小时)、更优选1～14天(24～336小时)、进一步优选1～7天(24～168小时)。即，优选使用由培养开始仅用上述范围的时间进行培养得到的球体作为有效成分。
间充质干细胞(MSC)的培养为粘附培养的情况下，对于培养中使用的细胞培养用基材的具体的构成没有特别限制，只要能够培养间充质干细胞(MSC)则以往公知的基材都能够合适地使用。
(细胞培养用基材)
作为细胞培养用基材的材质，可例示出树脂等，但是从并非生物来源的材料的观点考虑，细胞培养用基材优选含有树脂。作为这种树脂，只要是能够作为细胞培养用基材利用的生物相容性高的树脂则没有特别限制。作为一例，细胞培养用基材所含有的树脂能够例示出氟树脂、聚酰亚胺树脂(例如含氟聚酰亚胺树脂)、聚砜、聚醚砜、聚二甲基硅氧烷等、它们的混合物。另外，从材料的强度高的观点考虑，优选使用聚酰亚胺树脂。即，本发明的优选一实施方式中，细胞培养用基材含有聚酰亚胺树脂。作为聚酰亚胺树脂，可例示出含有以下的式(I)所示的结构单元的聚酰亚胺树脂。另外，从球体形成良好的观点考虑，优选为分子内具有氟原子的树脂、更优选含氟聚酰亚胺(含氟聚酰亚胺树脂)。本发明中使用的聚酰亚胺树脂，典型地说通过将酸二酐和二胺各1种以上聚合得到的聚酰胺酸进行酰亚胺化来得到。聚酰亚胺树脂可以在化学结构的一部分含有聚酰胺酸。作为制造聚酰亚胺树脂的方法，用公知的手法制造即可。作为一例，可以使用二段合成法。聚酰亚胺树脂的二段合成法为合成聚酰胺酸作为前体并将聚酰胺酸转换为聚酰亚胺酸的方法。作为前体的聚酰胺酸也可以为聚酰胺酸衍生物。作为聚酰胺酸衍生物，可列举出例如聚酰胺酸盐、聚酰胺酸烷基酯、聚酰胺酸酰胺、源自双亚甲基均苯四甲酰胺(bismethylidene pyromellitide)的聚酰胺酸衍生物、聚酰胺酸甲硅烷基酯、聚酰胺酸异酰亚胺等。作为聚酰亚胺，可例示出包含均苯四甲酸二酐、联苯四羧酸二酐、二苯甲酮四羧酸二酐等酸酐以及氧基二胺、对苯二胺、间苯二胺、二苯甲酮二胺等二胺的聚酰亚胺。作为具有氟原子的树脂，可例示出例如4,4’-六氟异丙叉基二邻苯二甲酸酐(6FDA)/1,4-双(氨基苯氧基)苯(TPEQ)共聚物、6FDA/4,4’-氧基二邻苯二甲酸酐(ODPA)/TPEQ共聚物、4,4’-(4,4’-异丙叉基二苯氧基)二邻苯二甲酸(BPADA)/2,2-双[4-(4-氨基苯氧基)苯基]六氟丙烷(HFBAPP)、6FDA/2,2-双(4-(4-氨基苯氧基)苯基)丙烷(BAPP)共聚物等含有以下的式(I)所示结构单元的含氟聚酰亚胺树脂；乙烯-四氟乙烯共聚物等。
Figure BDA0002080124600000071
上述式(I)中，X0表示氧原子、硫原子、或2价有机基团中的任意一种；Y表示2价有机基团；Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、和Z6互相独立地表示氢原子、氟原子、氯原子、溴原子或碘原子中的任意一种，p为0或1。需要说明的是，聚酰亚胺树脂中，式(I)所示的化学结构在树脂的各结构单元中可以不同或相同。优选X0、Y、Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、和Z6中的至少一者含有1个以上的氟原子。
上述式(I)中，p＝0的情况下，可以不存在X0(也就是说，左右的苯环可以直接键合)，而p＝1的情况下，左右的苯环借由X0键合。
作为X0所示的2价有机基团，具体而言，可列举出亚烷基、亚芳基、亚芳基氧基、亚芳基硫基等，它们之中，优选为亚烷基、亚芳基氧基、亚芳基硫基、更优选亚烷基、亚芳基氧基，它们可以被氟原子取代。上述亚烷基的碳数例如为1～12、优选1～6。
对于作为X0的例子的被氟原子取代的亚烷基，可例示出例如-C(CF3)2-、-C(CF3)2-C(CF3)2-等。作为X0的例子的上述亚烷基之中，优选为-C(CF3)2-。
对于作为X0的例子的亚芳基，可例示出例如以下的例子。
Figure BDA0002080124600000081
对于作为X0的例子的亚芳基氧基，可例示出例如以下的例子。
Figure BDA0002080124600000091
对于作为X0的例子的亚芳基硫基，可例示出例如以下的例子。
Figure BDA0002080124600000101
从即使是增殖活性降低了的细胞也能够在基材上良好地形成球体的观点考虑，X0所示的2价有机基团优选选自由上述b-2～b-10和c-2～c-10组成的组、更优选选自由上述b-7～b-9和c-7～c-9组成的组、进一步优选b-8所示的结构。另外，X0所示的2价有机基团也同样地优选为-C(CF3)2-。
作为X0的例子的上述的亚芳基、亚芳基氧基和亚芳基硫基可以各自独立地被选自由卤素原子(例如氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、优选氟原子或氯原子、更优选氟原子)、甲基和三氟甲基组成的组中的基团取代。这些取代基可以为多个，这种情况下，取代基的种类可以互相相同或不同。在亚芳基、亚芳基氧基和亚芳基硫基中进行取代的适宜的取代基为氟原子和/或三氟甲基，适宜为氟原子。对于亚芳基、亚芳基氧基和亚芳基硫基，在Y不含有氟原子的情况下，优选被至少1个以上氟原子取代。
上述式(I)中，作为Y所示的2价有机基团，没有特别限制，可列举出例如具有芳香环的2价有机基团。具体而言，可列举出包含1个苯环的基团、或者具有2个以上苯环借由碳原子(即，单键、或亚烷基)、氧原子、硫原子或直接键合的结构的基团。具体而言，可例示出以下基团。
Figure BDA0002080124600000111
Figure BDA0002080124600000121
Figure BDA0002080124600000131
作为Y的例子的上述具有芳香环的2价有机基团若能够取代，则可以被选自由卤素原子(例如氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、优选氟原子或氯原子、更优选氟原子)、甲基和三氟甲基组成的组中的基团取代。这些取代基可以为多个，这种情况下，取代基的种类可以互相相同或不同。对于在具有芳香环的2价有机基团中进行取代的适宜的取代基，特别是X0不含有氟原子的情况下，优选为氟原子和/或三氟甲基、更优选氟原子。
从球体形成性的观点考虑，上述式(I)中，Y优选为选自由d-3、d-9、e-1～e-4、f-6、和f-7组成的组中的结构、更优选e-1、e-3或e-4的结构、进一步优选e-3的结构。
上述式(I)中，Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、和Z6可以分别相同或不同，各自独立地选自氢原子、氟原子、氯原子、溴原子或碘原子，X0和Y中的至少一者不含有氟原子的情况下，优选Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、和Z6中的至少一者为氟原子。
从球体形成性的观点考虑，本发明优选的一实施方式中，上述式(I)中，X0所示的2价有机基团选自由-C(CF3)2-、上述b-2～b-10和c-2～c-10组成的组；并且Y选自由d-3、d-9、e-1～e-4、f-6、和f-7组成的组。本发明更优选的一实施方式中，上述式(I)中，X0所示的2价有机基团选自由-C(CF3)2-、b-7～b-9和c-7～c-9组成的组；并且Y选自由e-1、e-3和e-4组成的组。
包含上述式(I)所示的结构单元的聚酰亚胺树脂可以通过对利用酸二酐和二胺的聚合而得到的聚酰胺酸进行焙烧的手法得到。以下作为一具体例，示出6FDA/BAPP共聚物的合成过程。需要说明的是，上述“包含式(1)所示的结构单元的聚酰亚胺树脂”的酰亚胺化率可以并非100％。即，包含式(I)所示的结构单元的聚酰亚胺树脂可以仅包含上述式(I)所示的结构单元，但是在不会损害本发明目的效果的范围内也可以一部分含有环状酰亚胺结构没有脱水闭环而仍然为酰胺酸的结构单元。
Figure BDA0002080124600000151
聚酰胺酸合成反应优选在有机溶剂中进行。作为聚酰胺酸合成反应中使用的有机溶剂，只要作为原料的酸二酐和二胺的反应可以有效地进行并且对于这些原料为非活性则没有特别限定。可列举出例如N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜、环丁砜、甲基异丁基酮、乙腈、苯甲腈、硝基苯、硝基甲烷、丙酮、甲乙酮、异丁基酮、甲醇等极性溶剂；甲苯、二甲苯等非极性溶剂等。其中，优选使用极性溶剂。这些有机溶剂可以单独使用，也可以以2种以上的混合物形式使用。可以将酰胺化反应后的反应混合液直接供于热酰亚胺化。对于前述聚酰胺酸的溶液中的前述聚酰胺酸的浓度没有特别限定，但是从所得到的树脂组合物的聚合反应性和聚合后的粘度、此后的制膜、焙烧中的处理容易程度的观点考虑，优选为5重量％以上、更优选10重量％以上，优选50重量％以下、更优选40重量％以下。
利用热酰亚胺化或化学酰亚胺化中的任意一种将前述聚酰胺酸进行酰亚胺化而得到含有含氟聚酰亚胺的树脂组合物。特定的实施方式中，利用加热处理将前述聚酰胺酸进行酰亚胺化(热酰亚胺化)而得到含有含氟聚酰亚胺的树脂组合物。热酰亚胺化中得到的聚酰亚胺没有催化剂残留的可能性，在细胞培养用途中更优选。需要说明的是，含氟聚酰亚胺树脂的酰亚胺化率可以并非100％。即，含氟聚酰亚胺树脂可以一部分含有如下的结构单元，所述结构单元为上述式(I)所示的结构单元的环状酰亚胺结构的一部分开环而成的酰胺结构。
利用热酰亚胺化进行酰亚胺化的情况下，例如将前述聚酰胺酸在空气中、或更优选氮气、氦气、氩气等非活性气体气氛下、或者真空中，优选温度50～400℃、更优选100～380℃、优选时间0.1～10小时、更优选0.2～5小时的条件下进行焙烧而进行酰亚胺化反应，由此可以得到含有聚酰亚胺的树脂组合物。
供于热酰亚胺化反应的前述聚酰胺酸优选为溶解于适当溶剂中的形态。作为溶剂，只要溶解聚酰胺酸即可，也可以使用关于聚酰胺酸合成反应的上述的溶剂。
利用化学酰亚胺化进行酰亚胺化的情况下，通过在适当的溶剂中使用后述的脱水环化试剂，可以将聚酰胺酸直接酰亚胺化。
前述脱水环化试剂只要具有将聚酰胺酸在化学上脱水环化而形成聚酰亚胺的作用则可以没有限制地使用。作为这种脱水环化试剂，从有效促进酰亚胺化的观点考虑，优选单独使用叔胺化合物或者将叔胺化合物和羧酸酐组合来使用。
作为叔胺化合物，可列举出例如三甲胺、三乙胺、三丙胺、三丁胺、吡啶、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(DABCO)、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯、1,5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯、N,N,N’,N’-四甲基二氨基甲烷、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺、N,N,N’,N’-四甲基-1,3-丙烷二胺、N,N,N’,N’-四甲基-1,4-苯二胺、N,N,N’,N’-四甲基-1,6-己烷二胺、N,N,N’,N’-四乙基亚甲基二胺、N,N,N’,N’-四乙基乙二胺等。它们之中，特别优选为吡啶、DABCO、N,N,N’,N’-四甲基二氨基甲烷、更优选DABCO。叔胺可以仅1种或2种以上。
作为羧酸酐，可列举出例如乙酸酐、三氟乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐、异丁酸酐、琥珀酸酐、马来酸酐等。它们之中，特别优选为乙酸酐、三氟乙酸酐、更优选乙酸酐。羧酸酐可以仅1种或2种以上。
作为化学酰亚胺化中溶解聚酰胺酸的溶剂，优选为溶解性优异的极性溶剂。可列举出例如四氢呋喃、N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜等，它们之中，从进行均匀反应的观点考虑，特别优选选自由N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮组成的组中的1种以上。作为酰胺化反应的溶剂，使用这些溶剂的情况下，可以无需从酰胺化反应后的反应混合物分离聚酰胺酸而直接用于化学酰亚胺化。
作为上述的细胞培养用基材的形成材料的树脂的重均分子量例如为5000～2000000、优选8000～1000000、进一步优选20000～500000。需要说明的是，本说明书中，树脂的重均分子量为利用以下手法测定得到的值。通过使重均分子量处于上述范围内，球体形成性更良好。
(重均分子量的测定)
装置：TOSOH CORPORATION制HCL-8220GPC
柱：TSKgel Super AWM-H
洗脱液(LiBr·H2O、加入有磷酸的NMP)：0.01摩尔/L
测定方法：用洗脱液制作0.5重量％的溶液，基于用聚苯乙烯制作的标准曲线算出分子量。
细胞培养用基材的细胞培养面优选静态水接触角为75°以上且滚落角为15°以上。通过使细胞培养用基材满足这种条件，细胞培养用基材上的球体形成得到进一步促进。从球体形成性的观点考虑，静态水接触角更优选超过80°、进一步优选超过81°，静态水接触角的上限例如不足150°、优选不足120°、更优选100°以下、进一步优选不足90°。从球体形成性的观点考虑，滚落角以18°以上、20°以上、22°以上、24°以上的顺序越高越优选。滚落角的上限值例如不足80°、优选不足70°、更优选不足60°、进一步优选不足50°。需要说明的是，上述的静态水接触角、滚落角为利用以下方法测定得到的值。
(静态水接触角的测定方法)
装置：自动接触角计(协和界面科学制：DM-500)
测定方法：测定刚在薄膜上滴加水2μL之后的液滴的附着角度(测定温度：25℃)。
(滚落角的测定方法)
装置：自动接触角计(协和界面科学制：DM-500)
测定方法：在薄膜上滴加水25μL后，连续地倾斜基材，将流落时的角度作为滚落角(测定温度：25℃)。
细胞培养用基材可以还含有增塑剂、抗氧化剂等添加剂成分。对于基材的厚度没有特别限制，可以任意设定，例如为0.1μm～10mm、优选1μm～1mm。
本发明的细胞培养用基材即使不实施纳米凹凸结构的形成加工也能够用于球体形成，但是不排除具有纳米凹凸结构的情况。对于细胞培养用基材的纳米凹凸结构的形成加工例如可以利用日本特开2014-210404号公报中记载的手法进行。
细胞培养用基材可以以细胞培养容器的形态使用。具体而言，对于本发明的细胞培养容器，可以将上述细胞培养用基材和其它构件(例如支承构件)组合来构成、也可以将上述细胞培养用基材和其它构件一体化来构成、也可以仅通过上述细胞培养用基材构成。
上述细胞培养用基材与支承构件组合来构成细胞培养容器的情况下，从细胞培养容器开口一侧俯视该容器时的内廓形状和外廓形状可以分别例如为圆、多边形(方形、三角形等)等任意形状。作为构成支承构件的材料，可例示出例如无机玻璃；碳；硅等金属；聚乙烯、聚丙烯、环状烯烃等聚烯烃树脂；聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)等聚酯树脂；聚甲基丙烯酸甲酯等丙烯酸类树脂；环氧树脂；聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚苯乙烯树脂、聚乙酸乙烯酯、ABS(丙烯腈-丁二烯-苯乙烯)树脂、聚碳酸酯树脂、乙烯基醚、聚缩醛、聚苯醚(PPE)、聚芳基醚、聚苯硫醚(PPS)、聚醚醚酮(PEEK)、聚芳基醚酮、酚醛树脂、聚醚腈(PEN)等。
细胞培养容器只要具备上述细胞培养用基材即可，作为整体，可以为任意形状。例如可以为单孔板或多孔板等培养用的板、培养皿、碟、烧瓶、袋等各种容器的形状。另外，细胞培养容器也可以为大量培养装置、灌流培养装置等培养装置中的细胞培养容器的形态。
＜用途＞
作为含有上述球体作为有效成分的本发明的预防·治疗剂所预防·治疗的目标的疾病为软骨组织相关疾病。
软骨组织相关疾病指的是与软骨组织相关的疾病，指的是通过软骨的再生而能够改善症状的任意疾病。作为软骨组织相关疾病，可列举出例如变形性膝关节病、外伤性软骨损伤、肩周炎、颞下颌关节紊乱病、类风湿性关节炎、剥脱性骨软骨炎、无菌性骨坏死和半月板损伤等。
如此根据本发明，提供含有上述球体作为有效成分的软骨组织相关疾病的预防·治疗剂，但是从其它观点考虑，另外本发明也提供以下技术。
·一种软骨组织相关疾病的预防或治疗方法，其包括将含有经过培养的间充质干细胞的球体给予需要其的患者。
·用于软骨组织相关疾病的预防或治疗的含有经过培养的间充质干细胞的球体。
·含有经过培养的间充质干细胞的球体在制造用于软骨组织相关疾病的预防或治疗的药物中的应用。
本发明的含有球体作为有效成分的预防·治疗剂对于上述各种软骨组织相关疾病表现出预防·治疗效果的机理没有完全明确，但可推定以下的机理。
即，如后述的实施例的栏中所说明那样，判明了：本发明的球体含有经过培养的间充质干细胞作为有效成分(优选含有经过粘附培养的间充质干细胞作为有效成分)，由此与二维培养物相比，对于TGFβ1(Transforming Growth Factor(肿瘤生长因子)-β1)基因示出显著高的表达量。
在此，TGFβ1基因为属于TGF-β超家族的生长因子，哺乳动物的TGF-β存在β1、β2和β3的亚型。已知TGFβ1除了细胞增殖之外，还承担生长、分化、运动性的调节等功能，也与胚胎形成、组织重建、创伤治愈等生理功能相关。需要说明的是，成熟人TGFβ1的氨基酸序列与猪、狗、牛100％一致，与小鼠、大鼠、马99％一致，显示出交叉性。根据本发明人等的研究推定，该TGFβ1基因的表达量的增加对于软骨组织的再生、增殖表现出某些作用，结果表现出软骨组织相关疾病的预防·治疗效果。
如此，本发明的球体与二维培养物相比，对于规定基因表现出显著高的表达量，作为其机理，认为是由于，通过使球体形成立体的细胞状态，再现接近于在体内存在的细胞状态的状态。另外，特别是含有经过粘附培养的间充质干细胞的球体与含有经过悬浮培养的间充质干细胞的球体相比，走向类似于二维培养的经过，结果综合上基因的表达量增大。进而，含有经过粘附培养的间充质干细胞的球体以粘附于细胞培养用基材表面的状态培养，因此细胞之间的结合减少，作为结果，能够形成尺寸比较小的球体。因此，来自培养基的营养、氧的供给被阻断的可能性小，因此，有可能表现出高的功能(基因表达量)。
本发明的预防·治疗剂能够参照以往公知的细胞制剂中的发现的同时同样地制造、保管、给药。本发明的预防·治疗剂通常具有注射剂的形态。制造注射剂的情况下，可以在有效成分中添加pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、等渗剂、和局部麻醉剂等，利用常规方法制造皮下、肌肉内和静脉内用注射剂。作为此时的pH调节剂和缓冲剂，可列举出柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钠、磷酸食盐水等。作为稳定剂，可列举出焦亚硫酸钠、乙二胺四乙酸(EDTA)、巯基乙酸、和硫代乳酸等。作为局部麻醉剂，可列举出盐酸普鲁卡因、和盐酸利多卡因等。作为等渗剂，能够例示出氯化钠和葡萄糖等。
另外，对于本发明的预防剂和/或治疗剂，除了有效成分之外，根据需要能够还含有通常使用的各种添加剂成分。
本发明的预防·治疗剂中含有的有效成分的量能够根据该有效成分的用量范围、给药次数等适当确定。
对于用量范围没有特别限定，能够根据所含有的成分的有效性、给药形态、给药路径、疾病的种类、对象的性质(体重、年龄、病情和其它药物使用的有无等)、和担当医师的判断等适当设定。
实施例
利用以下的实施例和比较例对本发明的效果进行说明。但是，本发明的技术范围并非仅限于以下的实施例。需要说明的是，只要没有特别说明，则以下的操作在室温(25℃)下进行。
＜制造例1：含氟聚酰亚胺薄膜(含氟聚合物基材)的制造(1)＞
向100mL容量的三颈烧瓶中加入2,2-双(4-(4-氨基苯氧基)苯基)丙烷(BAPP)3.602g(8.77毫摩尔)、N-甲基-2-吡咯烷酮42.5g，进行溶解。向其中加入4,4’-六氟异丙叉基二邻苯二甲酸酐(6FDA)3.898g(8.77毫摩尔)，在氮气气氛下、室温下搅拌5天，得到含氟聚酰胺酸树脂组合物(固体成分浓度15.0质量％)。在此，所得到的聚酰胺酸的重均分子量为280000。需要说明的是，聚酰胺酸的重均分子量和焙烧后的含氟聚酰亚胺的重均分子量实质上相同。
使用模具涂布机，将上述中得到的含氟聚酰胺酸树脂组合物以焙烧后的含氟聚酰亚胺薄膜的厚度为40μm的方式涂布于玻璃基体上，形成涂膜。接着，在340℃、氮气气氛下进行1小时涂膜的焙烧。然后将焙烧物从玻璃基体剥离，得到含氟聚酰亚胺薄膜1。
该含氟聚酰亚胺薄膜1的静态水接触角为83.0°、滚落角为24.5°。
＜脂肪组织来源的间充质干细胞的采集＞
使用利用了胶原酶处理和离心比重法的周知方法，由人脂肪组织采集人脂肪组织来源的干细胞(Adipose derived Stem Cell：AdSC)。
具体而言，首先作为胶原酶溶液，制造含有DNaseI(0.1mg/mL、Roche、1284932)和3mM CaCl2的胶原酶1型(1mg/mL、和光纯药工业、035-17604)/1％BSA HBSS溶液。接着用手术刀将人脂肪组织(1g～2g左右)切碎，与该组织体积的3倍左右的上述胶原酶溶液一起加入到15mL管，在37℃下进行60分钟振荡培养。然后，在所培养的15mL管内加入室温的5mMEDTA/PBS(EDTA(0.5M EDTA、pH 8.0、Life Technologies、AM9260G)、10×DPBS(Ca(-)、Mg(-))(将GIBCO、14200-166稀释来制作)，形成15mL左右的细胞悬浮液后，以300×g实施5分钟的离心处理。然后，吸引去除上清液(含有脂肪层)，加入5mM EDTA/PBS形成20mL。将所得到的细胞悬浮液通过细胞过滤网(70μm、BD)的同时，回收到新的50mL管，在加入有室温的Histopaque1077 4mL的2根15mL管中，使上述所回收的细胞溶液各10mL平稳地不混入地形成多层。对于它们以室温800×g实施20分钟(没有制动)的离心处理，离心后仅将单核细胞层用带18G针的2.5mL注射器回收，转移到新的15mL管，用冷却了的5mM EDTA/PBS形成14mL。然后以200×g实施10分钟(有制动)的离心处理，弃去上清液。接着用1mL的冷却了的5mMEDTA/PBS悬浮细胞，定容至14mL后，以200×g实施10分钟的离心处理，弃去上清液。将所得到的细胞粒料用初代培养用培养基(10％FBS/DMEM F12、Sigma D8042+Antibiotic-Antimycotic、GIBCO 15240-062)悬浮后，以3×104/cm2～4×104/cm2左右的细胞密度接种于培养皿。然后在5％(v/v)CO2培养箱内培养4～5天，粘附细胞作为人脂肪组织来源的间充质干细胞用于以下实验。
＜人脂肪组织来源的间充质干细胞的放大培养＞
将上述中得到的人脂肪组织来源的间充质干细胞用1mL的CELLOTION(ZENOAQ制)洗涤，添加10％FBS/DMEM F12培养基(Sigma制)形成10mL。接着以250×g实施5分钟的离心处理。离心处理后，去除上清液，用2mL的10％FBS/DMEM F12培养基(Sigma制)悬浮，进行细胞数的计数。细胞悬浮液以2×105细胞/mL的浓度制造。然后在100mm碟子(Falcon制)预先加入9mL的培养基，向其中加入调整到上述浓度的细胞悬浮液1mL，在37℃的5％(v/v)CO2培养箱内进行放大培养。
＜实施例1：人脂肪组织来源的间充质干细胞的粘附培养＞
由100mm碟子去除培养基，添加细胞剥离液TrypLE select(Thermo FischerScientific K.K.制)3mL后，在37℃的5％(v/v)CO2培养箱内保持5分钟左右，剥离细胞。接着使用10％FBS/DMEM F12培养基以使总量为10mL的方式转移到管。以250×g实施5分钟离心处理，用2mL的10％FBS/DMEM F12培养基(Sigma制)悬浮，进行细胞数的计数。然后，以形成1×105细胞/mL的浓度的方式制造。
对在细胞培养面配置有上述制造例1中制作的作为含氟聚合物基材的含氟聚酰亚胺薄膜1的24孔板接种上述制造的细胞悬浮液各1mL(1×105细胞/孔)(培养第0天)。然后，在37℃的5％(v/v)CO2培养箱内进行培养，培养至第3天。
其结果，随着培养的经过，通过使用了光学显微镜的观察确认了，出现被保持(粘附)于含氟聚合物基材(含氟聚酰亚胺薄膜1)的球体。在此，利用光学显微镜得到的观察图像如图1所示。图1的(a)表示培养第1天的观察图像、图1的(b)表示培养第3天的观察图像。
＜实施例2：人脂肪组织来源的间充质干细胞的悬浮培养＞
替代细胞培养面配置有含氟聚酰亚胺薄膜1的24孔板，使用PrimeSurface多孔板24well(Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.制)，除此之外利用与上述实施例1相同的手法，进行人脂肪组织来源的间充质干细胞的培养。
本实施例中，也可以确认球体的形成，但是该球体没有与孔底面粘附，而是以非粘附状态沉落到孔底面。在此利用光学显微镜得到的培养第3天的观察图像如图2所示。
＜比较例1：人脂肪组织来源的间充质干细胞的平面培养＞
替代细胞培养面配置有含氟聚酰亚胺薄膜1的24孔板，使用24孔聚苯乙烯基材(Falcon制)，除此之外利用与上述实施例1相同的手法，进行人脂肪组织来源的间充质干细胞的培养。本比较例中，所培养的细胞仅二维(平面状)增殖，没有确认到球体形成。
＜基因表达量的解析＞
由实施例1和实施例2以及比较例1中进行了间充质干细胞培养的培养板回收细胞。由所回收的细胞，使用NucleoSpin RNA(Cosmo Bio Co.,Ltd.制)回收RNA。
将所回收的RNA作为试样，利用定量PCR法测定人TGFβ1基因(软骨分化起因因子)的mRNA表达量。需要说明的是，作为定量PCR用试剂盒，使用BioRad SsoFast EvaGreenMastermix(Biorad制)，利用测定仪器名：BioRad CFX Connect 96well(Biorad制)分析。TGFβ1的基因表达量通过以各基因的表达量相对于作为管家基因的GAPDH基因的表达量的相对值的形式进行校正来算出。结果如图3所示。图3为表示各培养条件下的人TGFβ1基因的表达量的结果的图。
如图3所示，实施例1和实施例2中在含氟聚酰亚胺薄膜1上培养的间充质干细胞与比较例1中培养的间充质干细胞相比，对于人TGFβ1基因表现出显著高的表达量。由此可知，含有经过培养的间充质干细胞的球体中，该基因的表达得到促进。另外，由实施例1和实施例2的对比也可知，通过在细胞培养用基材上进行粘附培养，与进行悬浮培养的情况相比，该基因的表达更进一步得到促进。
＜制造例2：含氟聚酰亚胺薄膜(含氟聚合物基材)的制造(2)＞
向100mL容量的三颈烧瓶中加入1,4-双(氨基苯氧基)苯2.976g(10.2毫摩尔)、4,4’-六氟异丙叉基二邻苯二甲酸酐4.524g(10.2毫摩尔)、N-甲基-2-吡咯烷酮42.5g。在氮气气氛下、室温下搅拌5天，由此得到含氟聚酰胺酸树脂组合物(固体成分浓度15.0质量％)。在此，所得到的聚酰胺酸的重均分子量为100000。需要说明的是，聚酰胺酸的重均分子量和焙烧后的含氟聚酰亚胺的重均分子量实质上相同。
使用模具涂布机，将上述中得到的含氟聚酰胺酸树脂组合物以焙烧后的含氟聚酰亚胺薄膜的厚度为40μm的方式涂布于玻璃基体上，形成涂膜。接着，在360℃、氮气气氛下进行1小时涂膜的焙烧。然后将焙烧物从玻璃基体剥离，得到含氟聚酰亚胺薄膜2。
该含氟聚酰亚胺薄膜2的静态水接触角为81.2°、滚落角为19.9°。
＜人脂肪组织来源的间充质干细胞的放大培养＞
将上述中得到的人脂肪组织来源的间充质干细胞用1mL的CELLOTION(ZENOAQ制)洗涤，添加KBM ADSC-1培养基(KOHJIN BIO制)形成10mL。接着以250×g实施5分钟的离心处理。离心处理后，去除上清液，用2mL的KBM ADSC-1培养基(KOHJIN BIO制)悬浮，进行细胞数的计数。细胞悬浮液以2×105细胞/mL的浓度制造。然后在100mm碟子(Falcon制)预先加入9mL的培养基，向其中加入调整到上述浓度的细胞悬浮液1mL，在37℃的5％(v/v)CO2培养箱内进行放大培养。
＜实施例3：人脂肪组织来源的间充质干细胞的粘附培养＞
由100mm碟子去除培养基，添加细胞剥离液TrypLE select(Thermo FischerScientific K.K.制)3mL后，在37℃的5％(v/v)CO2培养箱内保持5分钟左右，剥离细胞。接着使用KBM ADSC-2培养基(KOHJIN BIO制)以使总量为10mL的方式转移到管。以250×g实施5分钟离心处理，用2mL的KBM ADSC-2培养基(KOHJIN BIO制)悬浮，进行细胞数的计数。然后，以形成1×106细胞/mL的浓度的方式制造。
对在细胞培养面配置有上述制造例2中制作的作为含氟聚合物基材的含氟聚酰亚胺薄膜2的35mm培养皿接种上述制造的细胞悬浮液各0.2mL(2.0×105细胞/孔)，加入KBMADSC-2培养基(KOHJIN BIO制)1.8ml(培养第0天)。然后，在37℃的5％(v/v)CO2培养箱内进行培养，培养至第3天。
其结果，随着培养的经过，通过使用了光学显微镜的观察确认了，出现被保持(粘附)于含氟聚合物基材(含氟聚酰亚胺薄膜2)的球体。
＜实施例4：人脂肪组织来源的间充质干细胞的悬浮培养＞
替代实施例3中使用的在细胞培养面配置有含氟聚酰亚胺薄膜2的35mm培养皿，使用ELPLASIA(Kuraray制)。另外，接种制造为3.5×105细胞/mL的细胞悬浮液各1mL(培养第0天)。然后，在37℃的5％(v/v)CO2培养箱内进行培养，培养至第3天。需要说明的是，本实施例中也可以确认球体形成，但是该球体没有与孔底面粘附，而是以非粘附的状态沉落到孔底面。
＜比较例2：人脂肪组织来源的间充质干细胞的平面培养＞
替代实施例3中使用的在细胞培养面配置有含氟聚酰亚胺薄膜2的35mm培养皿，使用24孔聚苯乙烯基材(Falcon制)。另外，接种制造为8×103细胞/mL的细胞悬浮液各1mL(培养第0天)。然后，在37℃的5％(v/v)CO2培养箱内进行培养，培养至第3天。本比较例中，所培养的细胞仅二维(平面状)增殖，没有确认到球体形成。
＜使用了变形性膝关节病模型小鼠的干细胞球体的变形性膝关节病治疗效果的确认＞
对于12周龄的雄性BALB/c裸鼠进行变形性膝关节病诱发(前十字韧带和半月板单侧切除模型)。在模型制作后施加充分的旋转运动负荷，1周后，分别对于小鼠的关节(软骨缺乏区域)关节内局部给予上述比较例2中得到的经过平面培养的间充质干细胞、以及上述实施例4和实施例5中得到的间充质干细胞球体。在此，间充质干细胞给予5×104细胞/小鼠，对于间充质干细胞球体，也给予包含5×104细胞的球体。由模型制作起在3周(第21天)的时点进行解剖，实施藏红O染色，确认胫骨骨头部的软骨层的厚度和软骨基质的染色状况。结果如图4和图5所示。图4为表示给予了比较例2中得到的经过平面培养的间充质干细胞以及实施例3和实施例4中得到的间充质干细胞球体的变形性膝关节病模型小鼠中的组织学上的关节损伤度的半定量的评分评价的结果的图(评分越小则意味着关节损伤度越低)。另外，图5为表示对于给予了比较例2中得到的经过平面培养的间充质干细胞以及实施例3和实施例4中得到的间充质干细胞球体的变形性膝关节病模型小鼠中的关节组织进行藏红O染色而得到的结果的显微镜照片。
如图4所示，给予了实施例3和实施例4中得到的球体的小鼠中，与给予了比较例2中得到的经过平面培养的间充质干细胞的情况相比，都表现出优异的评分评价结果。另外，如图5所示，给予了实施例3中得到的球体的小鼠中，与给予了比较例2中得到的经过平面培养的间充质干细胞的情况相比，表现出厚的软骨层，被藏红O染色的软骨基质的红色也显著多(与比较例2相比确认到良好的倾向)。需要说明的是，图4和图5中所示的“空白”为仅给予不含有细胞的缓冲液并同样地进行实验的情况。
需要说明的是，本申请基于2016年12月2日申请的日本专利申请第2016-235286号和2017年8月22日申请的日本专利申请第2017-159670号，该公开内容通过参照作为整体引用。

Claims (303)

1.一种含有经过培养的间充质干细胞的球体在制备预防或治疗软骨组织相关疾病的制剂中的应用，其中，所述间充质干细胞为在含有聚酰亚胺树脂的细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞，并且所述间充质干细胞在不含血清的培养基中进行培养。
2.根据权利要求1所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为人和非人哺乳动物来源的细胞，所述非人哺乳动物包括：包含猕猴、青猴、食蟹猕猴、黑猩猩、绢毛猴和绒猴的灵长类、包含小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠的啮齿类、以及狗、猫、兔、猪、牛、山羊、绵羊、马。
3.根据权利要求2所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为人脂肪组织来源的细胞。
4.根据权利要求1所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为由骨髓、骨膜、脂肪组织和外周血中的任意种采集得到的。
5.根据权利要求2所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为由骨髓、骨膜、脂肪组织和外周血中的任意种采集得到的。
6.根据权利要求1所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为自体细胞。
7.根据权利要求2所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为自体细胞。
8.根据权利要求3所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为自体细胞。
9.根据权利要求4所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为自体细胞。
10.根据权利要求5所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为自体细胞。
11.根据权利要求1所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞的传代为1～10次传代。
12.根据权利要求2所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞的传代为1～10次传代。
13.根据权利要求3所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞的传代为1～10次传代。
14.根据权利要求4所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞的传代为1～10次传代。
15.根据权利要求5所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞的传代为1～10次传代。
16.根据权利要求6所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞的传代为1～10次传代。
17.根据权利要求7所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞的传代为1～10次传代。
18.根据权利要求8所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞的传代为1～10次传代。
19.根据权利要求9所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞的传代为1～10次传代。
20.根据权利要求10所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞的传代为1～10次传代。
21.根据权利要求1所述的球体的应用，其中，所述球体的尺寸为1～500μm。
22.根据权利要求2所述的球体的应用，其中，所述球体的尺寸为1～500μm。
23.根据权利要求3所述的球体的应用，其中，所述球体的尺寸为1～500μm。
24.根据权利要求4所述的球体的应用，其中，所述球体的尺寸为1～500μm。
25.根据权利要求5所述的球体的应用，其中，所述球体的尺寸为1～500μm。
26.根据权利要求6所述的球体的应用，其中，所述球体的尺寸为1～500μm。
27.根据权利要求7所述的球体的应用，其中，所述球体的尺寸为1～500μm。
28.根据权利要求8所述的球体的应用，其中，所述球体的尺寸为1～500μm。
29.根据权利要求9所述的球体的应用，其中，所述球体的尺寸为1～500μm。
30.根据权利要求10所述的球体的应用，其中，所述球体的尺寸为1～500μm。
31.根据权利要求11所述的球体的应用，其中，所述球体的尺寸为1～500μm。
32.根据权利要求12所述的球体的应用，其中，所述球体的尺寸为1～500μm。
33.根据权利要求13所述的球体的应用，其中，所述球体的尺寸为1～500μm。
34.根据权利要求14所述的球体的应用，其中，所述球体的尺寸为1～500μm。
35.根据权利要求15所述的球体的应用，其中，所述球体的尺寸为1～500μm。
36.根据权利要求16所述的球体的应用，其中，所述球体的尺寸为1～500μm。
37.根据权利要求17所述的球体的应用，其中，所述球体的尺寸为1～500μm。
38.根据权利要求18所述的球体的应用，其中，所述球体的尺寸为1～500μm。
39.根据权利要求19所述的球体的应用，其中，所述球体的尺寸为1～500μm。
40.根据权利要求20所述的球体的应用，其中，所述球体的尺寸为1～500μm。
41.根据权利要求1～40中任一项所述的球体的应用，其中，所述球体的尺寸为10～300μm。
42.根据权利要求1所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
43.根据权利要求2所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
44.根据权利要求3所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
45.根据权利要求4所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
46.根据权利要求5所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
47.根据权利要求6所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
48.根据权利要求7所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
49.根据权利要求8所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
50.根据权利要求9所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
51.根据权利要求10所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
52.根据权利要求11所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
53.根据权利要求12所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
54.根据权利要求13所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
55.根据权利要求14所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
56.根据权利要求15所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
57.根据权利要求16所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
58.根据权利要求17所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
59.根据权利要求18所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
60.根据权利要求19所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
61.根据权利要求20所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
62.根据权利要求21所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
63.根据权利要求22所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
64.根据权利要求23所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
65.根据权利要求24所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
66.根据权利要求25所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
67.根据权利要求26所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
68.根据权利要求27所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
69.根据权利要求28所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
70.根据权利要求29所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
71.根据权利要求30所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
72.根据权利要求31所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
73.根据权利要求32所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
74.根据权利要求33所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
75.根据权利要求34所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
76.根据权利要求35所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
77.根据权利要求36所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
78.根据权利要求37所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
79.根据权利要求38所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
80.根据权利要求39所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
81.根据权利要求40所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
82.根据权利要求41所述的球体的应用，其中，所述球体的培养时间为4小时～720小时。
83.根据权利要求1所述的球体的应用，其中，所述不含血清的培养基选自由Eagle’s最小必需培养基(EMEM)、达尔伯克改良Eagle’s培养基(DMEM)、α-MEM、Glasgow’s MEM(GMEM)、IMDM、RPMI1640、Ham’s F-12、MCDB培养基、William’s培养基E、肝细胞解冻培养基(Hepatocyte thaw medium)、MSC专用培养基和它们的混合培养基组成的组中的任一种。
84.根据权利要求2所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
85.根据权利要求3所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
86.根据权利要求4所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
87.根据权利要求5所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
88.根据权利要求6所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
89.根据权利要求7所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
90.根据权利要求8所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
91.根据权利要求9所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
92.根据权利要求10所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
93.根据权利要求11所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
94.根据权利要求12所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
95.根据权利要求13所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
96.根据权利要求14所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
97.根据权利要求15所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
98.根据权利要求16所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
99.根据权利要求17所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
100.根据权利要求18所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
101.根据权利要求19所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
102.根据权利要求20所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
103.根据权利要求21所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
104.根据权利要求22所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
105.根据权利要求23所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
106.根据权利要求24所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
107.根据权利要求25所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
108.根据权利要求26所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
109.根据权利要求27所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
110.根据权利要求28所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
111.根据权利要求29所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
112.根据权利要求30所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
113.根据权利要求31所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
114.根据权利要求32所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
115.根据权利要求33所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
116.根据权利要求34所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
117.根据权利要求35所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
118.根据权利要求36所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
119.根据权利要求37所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
120.根据权利要求38所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
121.根据权利要求39所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
122.根据权利要求40所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
123.根据权利要求41所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
124.根据权利要求42所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
125.根据权利要求43所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
126.根据权利要求44所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
127.根据权利要求45所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
128.根据权利要求46所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
129.根据权利要求47所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
130.根据权利要求48所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
131.根据权利要求49所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
132.根据权利要求50所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
133.根据权利要求51所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
134.根据权利要求52所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
135.根据权利要求53所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
136.根据权利要求54所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
137.根据权利要求55所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
138.根据权利要求56所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
139.根据权利要求57所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
140.根据权利要求58所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
141.根据权利要求59所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
142.根据权利要求60所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
143.根据权利要求61所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
144.根据权利要求62所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
145.根据权利要求63所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
146.根据权利要求64所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
147.根据权利要求65所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
148.根据权利要求66所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
149.根据权利要求67所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
150.根据权利要求68所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
151.根据权利要求69所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
152.根据权利要求70所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
153.根据权利要求71所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
154.根据权利要求72所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
155.根据权利要求73所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
156.根据权利要求74所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
157.根据权利要求75所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
158.根据权利要求76所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
159.根据权利要求77所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
160.根据权利要求78所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
161.根据权利要求79所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
162.根据权利要求80所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
163.根据权利要求81所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
164.根据权利要求82所述的球体的应用，其中，所述间充质干细胞为在细胞培养用基材上经过粘附培养的间充质干细胞。
165.根据权利要求1所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂为含氟聚酰亚胺树脂。
166.根据权利要求1所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂为聚酰胺酸和/或聚酰胺酸衍生物。
167.根据权利要求165所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂为聚酰胺酸和/或聚酰胺酸衍生物。
168.根据权利要求166所述的球体的应用，其中，所述聚酰胺酸衍生物选自聚酰胺酸盐、聚酰胺酸烷基酯、聚酰胺酸酰胺、源自双亚甲基均苯四甲酰胺的聚酰胺酸衍生物、聚酰胺酸甲硅烷基酯、聚酰胺酸异酰亚胺中的至少一种。
169.根据权利要求167所述的球体的应用，其中，所述聚酰胺酸衍生物选自聚酰胺酸盐、聚酰胺酸烷基酯、聚酰胺酸酰胺、源自双亚甲基均苯四甲酰胺的聚酰胺酸衍生物、聚酰胺酸甲硅烷基酯、聚酰胺酸异酰亚胺中的至少一种。
170.根据权利要求1所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂由从均苯四甲酸二酐、联苯四羧酸二酐、二苯甲酮四羧酸二酐中选择一种以上的酸酐、与从氧基二胺、对苯二胺、间苯二胺、二苯甲酮二胺中选择一种以上的二胺形成。
171.根据权利要求165所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂由从均苯四甲酸二酐、联苯四羧酸二酐、二苯甲酮四羧酸二酐中选择一种以上的酸酐、与从氧基二胺、对苯二胺、间苯二胺、二苯甲酮二胺中选择一种以上的二胺形成。
172.根据权利要求1所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂由式(I)所表示，
Figure FDA0003786292350000151
上述式(I)中，X0表示氧原子、硫原子、或2价有机基团中的任意一种；Y表示2价有机基团；Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、和Z6互相独立地表示氢原子、氟原子、氯原子、溴原子或碘原子中的任意一种，p为0或1。
173.根据权利要求172所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的X0选自由化学式b-2～b-10和c-2～c-10组成的组、或者为-C(CF3)2-，
Figure FDA0003786292350000152
Figure FDA0003786292350000161
174.根据权利要求172所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Y选自由化学式d-3、d-9、e-1～e-4、f-6和f-7组成的组，
Figure FDA0003786292350000171
175.根据权利要求173所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Y选自由化学式d-3、d-9、e-1～e-4、f-6和f-7组成的组，
Figure FDA0003786292350000172
Figure FDA0003786292350000181
176.根据权利要求172所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的X0选自由-C(CF3)2-、化学式b-7～b-9和c-7～c-9组成的组，并且Y选自由e-1、e-3和e-4组成的组，
Figure FDA0003786292350000182
Figure FDA0003786292350000191
177.根据权利要求172所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的X0被选自由包含氟原子及氯原子的卤素原子、甲基和三氟甲基组成的组中的基团取代1个部位或多个部位。
178.根据权利要求173所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的X0被选自由包含氟原子及氯原子的卤素原子、甲基和三氟甲基组成的组中的基团取代1个部位或多个部位。
179.根据权利要求174所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的X0被选自由包含氟原子及氯原子的卤素原子、甲基和三氟甲基组成的组中的基团取代1个部位或多个部位。
180.根据权利要求175所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的X0被选自由包含氟原子及氯原子的卤素原子、甲基和三氟甲基组成的组中的基团取代1个部位或多个部位。
181.根据权利要求176所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的X0被选自由包含氟原子及氯原子的卤素原子、甲基和三氟甲基组成的组中的基团取代1个部位或多个部位。
182.根据权利要求172所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Y被选自由包含氟原子及氯原子的卤素原子、甲基和三氟甲基组成的组中的基团取代1个部位或多个部位。
183.根据权利要求173所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Y被选自由包含氟原子及氯原子的卤素原子、甲基和三氟甲基组成的组中的基团取代1个部位或多个部位。
184.根据权利要求174所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Y被选自由包含氟原子及氯原子的卤素原子、甲基和三氟甲基组成的组中的基团取代1个部位或多个部位。
185.根据权利要求175所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Y被选自由包含氟原子及氯原子的卤素原子、甲基和三氟甲基组成的组中的基团取代1个部位或多个部位。
186.根据权利要求176所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Y被选自由包含氟原子及氯原子的卤素原子、甲基和三氟甲基组成的组中的基团取代1个部位或多个部位。
187.根据权利要求177所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Y被选自由包含氟原子及氯原子的卤素原子、甲基和三氟甲基组成的组中的基团取代1个部位或多个部位。
188.根据权利要求178所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Y被选自由包含氟原子及氯原子的卤素原子、甲基和三氟甲基组成的组中的基团取代1个部位或多个部位。
189.根据权利要求179所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Y被选自由包含氟原子及氯原子的卤素原子、甲基和三氟甲基组成的组中的基团取代1个部位或多个部位。
190.根据权利要求180所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Y被选自由包含氟原子及氯原子的卤素原子、甲基和三氟甲基组成的组中的基团取代1个部位或多个部位。
191.根据权利要求181所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Y被选自由包含氟原子及氯原子的卤素原子、甲基和三氟甲基组成的组中的基团取代1个部位或多个部位。
192.根据权利要求172所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Z1～Z6中的至少一者为氟原子。
193.根据权利要求173所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Z1～Z6中的至少一者为氟原子。
194.根据权利要求174所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Z1～Z6中的至少一者为氟原子。
195.根据权利要求175所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Z1～Z6中的至少一者为氟原子。
196.根据权利要求176所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Z1～Z6中的至少一者为氟原子。
197.根据权利要求177所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Z1～Z6中的至少一者为氟原子。
198.根据权利要求178所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Z1～Z6中的至少一者为氟原子。
199.根据权利要求179所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Z1～Z6中的至少一者为氟原子。
200.根据权利要求180所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Z1～Z6中的至少一者为氟原子。
201.根据权利要求181所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Z1～Z6中的至少一者为氟原子。
202.根据权利要求182所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Z1～Z6中的至少一者为氟原子。
203.根据权利要求183所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Z1～Z6中的至少一者为氟原子。
204.根据权利要求184所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Z1～Z6中的至少一者为氟原子。
205.根据权利要求185所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Z1～Z6中的至少一者为氟原子。
206.根据权利要求186所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Z1～Z6中的至少一者为氟原子。
207.根据权利要求187所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Z1～Z6中的至少一者为氟原子。
208.根据权利要求188所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Z1～Z6中的至少一者为氟原子。
209.根据权利要求189所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Z1～Z6中的至少一者为氟原子。
210.根据权利要求190所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Z1～Z6中的至少一者为氟原子。
211.根据权利要求191所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂的式(I)的Z1～Z6中的至少一者为氟原子。
212.根据权利要求165所述的球体的应用，其中，所述含氟聚酰亚胺树脂选自6FDA/TPEQ共聚物、6FDA/ODPA/TPEQ共聚物、BPADA/HFBAPP、6FDA/BAPP共聚物。
213.根据权利要求167所述的球体的应用，其中，所述含氟聚酰亚胺树脂选自6FDA/TPEQ共聚物、6FDA/ODPA/TPEQ共聚物、BPADA/HFBAPP、6FDA/BAPP共聚物。
214.根据权利要求169所述的球体的应用，其中，所述含氟聚酰亚胺树脂选自6FDA/TPEQ共聚物、6FDA/ODPA/TPEQ共聚物、BPADA/HFBAPP、6FDA/BAPP共聚物。
215.根据权利要求171所述的球体的应用，其中，所述含氟聚酰亚胺树脂选自6FDA/TPEQ共聚物、6FDA/ODPA/TPEQ共聚物、BPADA/HFBAPP、6FDA/BAPP共聚物。
216.根据权利要求1所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂利用焙烧聚酰胺酸的热酰亚胺化而得到。
217.根据权利要求165～215中任一项所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂利用焙烧聚酰胺酸的热酰亚胺化而得到。
218.根据权利要求1所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂利用化学酰亚胺化而得到。
219.根据权利要求165～215中任一项所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂利用化学酰亚胺化而得到。
220.根据权利要求1所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂生成中使用的聚酰胺酸合成反应的溶剂为从N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜、环丁砜、甲基异丁基酮、乙腈、苯甲腈、硝基苯、硝基甲烷、丙酮、甲乙酮、异丁基酮、甲醇组成的极性溶剂组中选择的1种或两种以上的溶剂。
221.根据权利要求165～216和218中任一项所述的球体的应用，其中，所述聚酰亚胺树脂生成中使用的聚酰胺酸合成反应的溶剂为从N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜、环丁砜、甲基异丁基酮、乙腈、苯甲腈、硝基苯、硝基甲烷、丙酮、甲乙酮、异丁基酮、甲醇组成的极性溶剂组中选择的1种或两种以上的溶剂。
222.根据权利要求220所述的球体的应用，其中，所述聚酰胺酸的浓度为5重量％以上且50重量％以下。
223.根据权利要求221所述的球体的应用，其中，所述聚酰胺酸的浓度为5重量％以上且50重量％以下。
224.根据权利要求220所述的球体的应用，其中，所述聚酰胺酸的浓度为10重量％以上且40重量％以下。
225.根据权利要求221所述的球体的应用，其中，所述聚酰胺酸的浓度为10重量％以上且40重量％以下。
226.根据权利要求1所述的球体的应用，其中，所述树脂的重均分子量为5000～100000。
227.根据权利要求165～216、218、220和222～225中任一项所述的球体的应用，其中，所述树脂的重均分子量为5000～100000。
228.根据权利要求227所述的球体的应用，其中，所述树脂的重均分子量为20000～500000。
229.根据权利要求83～216、218、220、222～226和228中任一项所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材的细胞培养面的静态水接触角为75°以上且不足150°。
230.根据权利要求1所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材的细胞培养面的静态水接触角为75°以上且不足150°。
231.根据权利要求217所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材的细胞培养面的静态水接触角为75°以上且不足150°。
232.根据权利要求219所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材的细胞培养面的静态水接触角为75°以上且不足150°。
233.根据权利要求221所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材的细胞培养面的静态水接触角为75°以上且不足150°。
234.根据权利要求227所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材的细胞培养面的静态水接触角为75°以上且不足150°。
235.根据权利要求83～216、218、220、222～226、228和230～234中任一项所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材的细胞培养面的滚落角为15°以上且不足50°。
236.根据权利要求1所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材的细胞培养面的滚落角为15°以上且不足50°。
237.根据权利要求217所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材的细胞培养面的滚落角为15°以上且不足50°。
238.根据权利要求219所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材的细胞培养面的滚落角为15°以上且不足50°。
239.根据权利要求221所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材的细胞培养面的滚落角为15°以上且不足50°。
240.根据权利要求227所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材的细胞培养面的滚落角为15°以上且不足50°。
241.根据权利要求229所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材的细胞培养面的滚落角为15°以上且不足50°。
242.根据权利要求83～216、218、220、222～226、228、230～234和236～241中任一项所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材的厚度为0.1μm～10mm。
243.根据权利要求1所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材的厚度为0.1μm～10mm。
244.根据权利要求217所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材的厚度为0.1μm～10mm。
245.根据权利要求219所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材的厚度为0.1μm～10mm。
246.根据权利要求221所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材的厚度为0.1μm～10mm。
247.根据权利要求227所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材的厚度为0.1μm～10mm。
248.根据权利要求229所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材的厚度为0.1μm～10mm。
249.根据权利要求235所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材的厚度为0.1μm～10mm。
250.根据权利要求242所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材的厚度为1μm～1mm。
251.根据权利要求243～249中任一项所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材的厚度为1μm～1mm。
252.根据权利要求83～216、218、220、222～226、228、230～234、236～241和243～250中任一项所述的球体的应用，其中，在所述细胞培养用基材上形成有纳米凹凸结构。
253.根据权利要求1所述的球体的应用，其中，在所述细胞培养用基材上形成有纳米凹凸结构。
254.根据权利要求217所述的球体的应用，其中，在所述细胞培养用基材上形成有纳米凹凸结构。
255.根据权利要求219所述的球体的应用，其中，在所述细胞培养用基材上形成有纳米凹凸结构。
256.根据权利要求221所述的球体的应用，其中，在所述细胞培养用基材上形成有纳米凹凸结构。
257.根据权利要求227所述的球体的应用，其中，在所述细胞培养用基材上形成有纳米凹凸结构。
258.根据权利要求229所述的球体的应用，其中，在所述细胞培养用基材上形成有纳米凹凸结构。
259.根据权利要求235所述的球体的应用，其中，在所述细胞培养用基材上形成有纳米凹凸结构。
260.根据权利要求242所述的球体的应用，其中，在所述细胞培养用基材上形成有纳米凹凸结构。
261.根据权利要求251所述的球体的应用，其中，在所述细胞培养用基材上形成有纳米凹凸结构。
262.根据权利要求83～216、218、220、222～226、228、230～234、236～241、243～250和253～261中任一项所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材与支承构件组合来构成细胞培养容器。
263.根据权利要求1所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材与支承构件组合来构成细胞培养容器。
264.根据权利要求217所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材与支承构件组合来构成细胞培养容器。
265.根据权利要求219所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材与支承构件组合来构成细胞培养容器。
266.根据权利要求221所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材与支承构件组合来构成细胞培养容器。
267.根据权利要求227所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材与支承构件组合来构成细胞培养容器。
268.根据权利要求229所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材与支承构件组合来构成细胞培养容器。
269.根据权利要求235所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材与支承构件组合来构成细胞培养容器。
270.根据权利要求242所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材与支承构件组合来构成细胞培养容器。
271.根据权利要求251所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材与支承构件组合来构成细胞培养容器。
272.根据权利要求252所述的球体的应用，其中，所述细胞培养用基材与支承构件组合来构成细胞培养容器。
273.根据权利要求262所述的球体的应用，其中，所述细胞培养容器为板、培养皿、碟、烧瓶、袋、大量培养装置用的培养容器、或灌流培养装置用的培养容器。
274.根据权利要求263～272中任一项所述的球体的应用，其中，所述细胞培养容器为板、培养皿、碟、烧瓶、袋、大量培养装置用的培养容器、或灌流培养装置用的培养容器。
275.根据权利要求1～40、42～216、218、220、222～226、228、230～234、236～241、243～250、253～261和263～273中任一项所述的球体的应用，其中，所述软骨组织相关疾病选自由变形性膝关节病、外伤性软骨损伤、肩周炎、颞下颌关节紊乱病、类风湿性关节炎、剥脱性骨软骨炎、无菌性骨坏死和半月板损伤组成的组。
276.根据权利要求41所述的球体的应用，其中，所述软骨组织相关疾病选自由变形性膝关节病、外伤性软骨损伤、肩周炎、颞下颌关节紊乱病、类风湿性关节炎、剥脱性骨软骨炎、无菌性骨坏死和半月板损伤组成的组。
277.根据权利要求217所述的球体的应用，其中，所述软骨组织相关疾病选自由变形性膝关节病、外伤性软骨损伤、肩周炎、颞下颌关节紊乱病、类风湿性关节炎、剥脱性骨软骨炎、无菌性骨坏死和半月板损伤组成的组。
278.根据权利要求219所述的球体的应用，其中，所述软骨组织相关疾病选自由变形性膝关节病、外伤性软骨损伤、肩周炎、颞下颌关节紊乱病、类风湿性关节炎、剥脱性骨软骨炎、无菌性骨坏死和半月板损伤组成的组。
279.根据权利要求221所述的球体的应用，其中，所述软骨组织相关疾病选自由变形性膝关节病、外伤性软骨损伤、肩周炎、颞下颌关节紊乱病、类风湿性关节炎、剥脱性骨软骨炎、无菌性骨坏死和半月板损伤组成的组。
280.根据权利要求227所述的球体的应用，其中，所述软骨组织相关疾病选自由变形性膝关节病、外伤性软骨损伤、肩周炎、颞下颌关节紊乱病、类风湿性关节炎、剥脱性骨软骨炎、无菌性骨坏死和半月板损伤组成的组。
281.根据权利要求229所述的球体的应用，其中，所述软骨组织相关疾病选自由变形性膝关节病、外伤性软骨损伤、肩周炎、颞下颌关节紊乱病、类风湿性关节炎、剥脱性骨软骨炎、无菌性骨坏死和半月板损伤组成的组。
282.根据权利要求235所述的球体的应用，其中，所述软骨组织相关疾病选自由变形性膝关节病、外伤性软骨损伤、肩周炎、颞下颌关节紊乱病、类风湿性关节炎、剥脱性骨软骨炎、无菌性骨坏死和半月板损伤组成的组。
283.根据权利要求242所述的球体的应用，其中，所述软骨组织相关疾病选自由变形性膝关节病、外伤性软骨损伤、肩周炎、颞下颌关节紊乱病、类风湿性关节炎、剥脱性骨软骨炎、无菌性骨坏死和半月板损伤组成的组。
284.根据权利要求252所述的球体的应用，其中，所述软骨组织相关疾病选自由变形性膝关节病、外伤性软骨损伤、肩周炎、颞下颌关节紊乱病、类风湿性关节炎、剥脱性骨软骨炎、无菌性骨坏死和半月板损伤组成的组。
285.根据权利要求262所述的球体的应用，其中，所述软骨组织相关疾病选自由变形性膝关节病、外伤性软骨损伤、肩周炎、颞下颌关节紊乱病、类风湿性关节炎、剥脱性骨软骨炎、无菌性骨坏死和半月板损伤组成的组。
286.根据权利要求274所述的球体的应用，其中，所述软骨组织相关疾病选自由变形性膝关节病、外伤性软骨损伤、肩周炎、颞下颌关节紊乱病、类风湿性关节炎、剥脱性骨软骨炎、无菌性骨坏死和半月板损伤组成的组。
287.根据权利要求1～40、42～216、218、220、222～226、228、230～234、236～241、243～250、253～261、263～273和276～286中任一项所述的球体的应用，其通过局部注射来使用。
288.根据权利要求41所述的球体的应用，其通过局部注射来使用。
289.根据权利要求217所述的球体的应用，其通过局部注射来使用。
290.根据权利要求219所述的球体的应用，其通过局部注射来使用。
291.根据权利要求221所述的球体的应用，其通过局部注射来使用。
292.根据权利要求227所述的球体的应用，其通过局部注射来使用。
293.根据权利要求229所述的球体的应用，其通过局部注射来使用。
294.根据权利要求235所述的球体的应用，其通过局部注射来使用。
295.根据权利要求242所述的球体的应用，其通过局部注射来使用。
296.根据权利要求252所述的球体的应用，其通过局部注射来使用。
297.根据权利要求262所述的球体的应用，其通过局部注射来使用。
298.根据权利要求274所述的球体的应用，其通过局部注射来使用。
299.根据权利要求287所述的球体的应用，所述局部注射为皮下、肌肉内、关节内和静脉内的注射。
300.根据权利要求288～299中任一项所述的球体的应用，所述局部注射为皮下、肌肉内、关节内和静脉内的注射。
301.根据权利要求287所述的球体的应用，在用于所述局部注射时，添加有pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、等渗剂和局部麻醉剂中的任意一种以上。
302.根据权利要求288～299和301中任一项所述的球体的应用，所述局部注射为皮下、肌肉内、关节内和静脉内的注射。
303.根据权利要求300所述的球体的应用，所述局部注射为皮下、肌肉内、关节内和静脉内的注射。
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