JP2021169523A - 細胞製剤 - Google Patents

Abstract

【課題】治療ターゲットとして軟骨組織関連疾患に対して高い治療効果を示す、スフェロイド含有細胞製剤を提供する。【解決手段】培養された間葉系幹細胞を含むスフェロイドを有効成分として含有する、軟骨組織関連疾患の予防または治療剤である。【選択図】図４

Description

本発明は、細胞製剤に関する。より詳細には、本発明は、所定の細胞培養物を有効成分として含有する特定の疾患の予防または治療剤に関する。

間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ；ＭＳＣｓ）は、優れた自己再生能および多分化能を有する。このため、間葉系幹細胞は、細胞治療に用いられる細胞製剤の潜在的な細胞源として期待されている（非特許文献１）。

このような間葉系幹細胞を細胞製剤として用いる際には、培養された細胞同士が三次元的にネットワークを形成したスフェロイド（細胞塊；細胞凝集体）の形態で用いることが、疾患の創傷治癒効果を向上させるという観点からは好ましい。

スフェロイドを有効成分として含有する細胞製剤のうち、治療ターゲットとして軟骨組織関連疾患に対して高い治療効果を示すものはいまだ知られていない。

Pittenger et al., 1999, Science. 284:143-7

そこで本発明は、治療ターゲットとして軟骨組織関連疾患に対して高い治療効果を示す、スフェロイド含有細胞製剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記の問題を解決すべく、鋭意研究を行った。その結果、驚くべきことに、培養された間葉系幹細胞を含むスフェロイドを有効成分として含有する細胞製剤が、軟骨組織関連疾患に対して高い治療効果を示すことを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、培養された間葉系幹細胞を含むスフェロイドを有効成分として含有する、軟骨組織関連疾患の予防または治療剤である。

本発明によれば、治療ターゲットとして軟骨組織関連疾患に対して高い治療効果を示す、スフェロイド含有細胞製剤が提供される。

図１は、実施例１における間葉系幹細胞の接着培養の経過を、光学顕微鏡を用いて観察した観察像を示す写真である。図１（ａ）は培養１日目の観察像を示し、図１（ｂ）は培養３日目の観察像を示す。 図２は、実施例２における間葉系幹細胞の浮遊培養の経過を光学顕微鏡を用いて観察した観察像を示す写真である。 図３は、実施例１および実施例２並びに比較例１において培養された間葉系幹細胞におけるヒトＴＧＦβ１遺伝子（軟骨分化起因因子）のｍＲＮＡ発現量を測定した結果を示すグラフである。 図４は、比較例２で得られた平面培養された間葉系幹細胞並びに実施例３および実施例４で得られた間葉系幹細胞スフェロイドを投与した変形性膝関節症モデルマウスにおける組織学的関節損傷度の半定量的スコアリング評価の結果を示すグラフである（スコアが小さいほど関節の損傷度は低いことを意味する）。 図５は、比較例２で得られた平面培養された間葉系幹細胞並びに実施例３および実施例４で得られた間葉系幹細胞スフェロイドを投与した変形性膝関節症モデルマウスにおける関節組織に対してサフラニンＯ染色を行った結果を示す顕微鏡写真である。

本発明の一形態は、培養された間葉系幹細胞を含むスフェロイドを有効成分として含有する、軟骨組織関連疾患の予防または治療剤である。

以下、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。本明細書において、範囲を示す「Ｘ〜Ｙ」は「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０〜２５℃）／相対湿度４０〜５０％ＲＨの条件で測定する。

＜有効成分（スフェロイド）＞
本形態に係る軟骨組織関連疾患の予防または治療剤は、有効成分として間葉系幹細胞を含むスフェロイドを含有するものである。本明細書において「スフェロイド」とは、細胞の凝集体（細胞塊）を意味し、三次元細胞集合体をもその概念に含むものとする。なお、スフェロイドのサイズについて特に制限はないが、一例として、スフェロイドの直径は、好ましくは１〜５００μｍであり、好ましくは１０〜３００μｍである。ここで、スフェロイドの直径は、常法（粒子径分布測定）により測定されうる。

（間葉系幹細胞（ＭＳＣ））
本形態に係る有効成分としてのスフェロイドは、培養された間葉系幹細胞を含む点に特徴がある。培養に供される間葉系幹細胞（ＭＳＣ）としては、未分化の間葉系細胞である限り特に制限はされず、哺乳動物の骨髄、骨膜、脂肪組織、末梢血等から常法に従い採取したものを用いることができる。また、採取後、未分化のＭＳＣをプラスチック付着性の有無等により選択することもできる。ここで、ＭＳＣとしては、調達の容易さおよび高い増殖性という観点から、脂肪組織由来の間葉系幹細胞を用いることが好ましい。また、ＭＳＣとしては、本発明の予防・治療剤の投与対象と同種の哺乳動物由来のＭＳＣを用いることが好ましく、投与対象以外の同種の哺乳動物由来のＭＳＣや、投与対象自身のＭＳＣ（自家細胞）を用いることができる。これらの細胞が由来する生物種も特に制限されず、ヒトおよび非ヒト哺乳動物由来の各種細胞を用いることができる。細胞が由来する生物種としては、例えば、ヒト、アカゲザル、ミドリザル、カニクイザル、チンパンジー、タマリンおよびマーモセット等の霊長類、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモット等の齧歯類、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等が例示できる。なお、培養に供されるＭＳＣとしては、ＭＳＣを７０〜９０％コンフルエント（好ましくは８０％コンフルエント）まで増殖させて得られた細胞をゼロ継代とし、それをさらに増殖させて１〜１０継代のＭＳＣを用いることができる。

（培養条件）
本形態に係る有効成分としてのスフェロイドは、培養された間葉系幹細胞を含む点に特徴がある。スフェロイドに含まれる「培養された間葉系幹細胞」を得るための培養の条件についても特に制限はなく、当業者であれば間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を培養することが可能な条件を適宜選択することが可能である。

具体的に、間葉系幹細胞を培養する形態としては、浮遊培養や接着培養がある。なかで
も、本発明において、培養は好ましくは「接着培養」である。「接着培養」とは、「浮遊培養」に対する概念であり、培養しようとする細胞や当該細胞を含むスフェロイドを細胞培養用基材の表面に接着させて培養することを意味する。培養中、「培養しようとする細胞や当該細胞を含むスフェロイドが培養用基材の表面に接着する」とは、細胞やスフェロイドが、ＥＣＭ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ；細胞外マトリックス）などに含まれる細胞−基質接着分子を通じて、培養用基材の表面と接着している状態を意味し、培地を軽く揺らしても細胞やスフェロイドが培地中に浮遊してこない状態をいう。一方、「浮遊培養」とは、培養しようとする細胞や当該細胞を含むスフェロイドを培養用基材の表面に接着させずに培養することを意味する。培養中、「培養しようとする細胞や当該細胞を含むスフェロイドが培養用基材の表面に接着しない」とは、細胞やスフェロイドが、ＥＣＭなどに含まれる細胞−基質接着分子を通じて培養用基材の表底面と接着していない状態を意味し、たとえ基材の表面に触れていても培地を軽く揺らすと細胞やスフェロイドが培地中に浮遊してきたり、付着せずに沈んでいる状態等をいう。これを定量的に表現すると、本明細書においては、培養容器内の細胞やスフェロイドを含有する培地から培地をすべて除去した後に、再度培地を速度０．１ｍＬ／秒の速度で当該容器に注入した際に、細胞やスフェロイドが底面から離れ浮かぶか、または細胞やスフェロイドが５００μｍ以上移動した場合に、当該細胞やスフェロイドは「浮遊した（つまり、当該細胞やスフェロイドは培養用基材の表面に接着していない）」と判断するものとする。

細胞培養に用いる培地は、細胞に合わせて適宜選択すればよい。培地の種類は特に限定されないが、例えば、任意の細胞培養基本培地や分化培地、初代培養専用培地等を用いることができる。具体的には、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、α−ＭＥＭ、グラスゴーＭＥＭ（ＧＭＥＭ）、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ハムＦ−１２、ＭＣＤＢ培地、ウィリアムス培地Ｅ、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｔｈａｗ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＳＣ専用培地およびこれらの混合培地等が挙げられるが、これらには限定されず、細胞が増殖や分化に必要な成分が含まれる培地であれば利用可能である。さらに、血清、各種成長因子、分化誘導因子、抗生物質、ホルモン、アミノ酸、糖、塩類等を添加した培地を使用してもよい。培養温度も特に制限されないが、通常は２５〜４０℃程度で行う。

培養に供する時間についても特に制限はなく、細胞の増殖速度と所望のスフェロイドのサイズなどを考慮して適宜決定することが可能である。ここで、培養の時間は、好ましくは４時間〜３０日（４〜７２０時間）であり、より好ましくは１〜１４日（２４〜３３６時間）であり、さらに好ましくは１〜７日（２４〜１６８時間）である。すなわち、培養の開始から上記範囲の時間だけ培養を行って得られたスフェロイドを有効成分として用いることが好ましい。

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養が接着培養である場合、培養に用いられる細胞培養用基材の具体的な構成について特に制限はなく、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を培養することが可能なものであれば従来公知の基材がいずれも好適に用いられうる。

（細胞培養用基材）
細胞培養用基材の材質としては、樹脂等が例示できるが、生物由来の材料ではないという観点から、細胞培養用基材は樹脂を含むことが好ましい。このような樹脂としては、細胞培養用基材として利用可能な生体適合性の高いものであれば特に制限されない。一例として、細胞培養用基材が含む樹脂は、フッ素樹脂、ポリイミド樹脂（例えば、含フッ素ポリイミド樹脂）、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリジメチルシロキサン等や、これらのブレンドが例示されうる。また、材料の強度が高いという観点から、ポリイミド樹脂が好ましく用いられる。すなわち、本発明の好ましい一実施形態では、細胞培養用基材が、ポリイミド樹脂を含む。ポリイミド樹脂としては、以下の式（Ｉ）で示される構成
単位を含むポリイミド樹脂が例示できる。また、スフェロイド形成が良好であるという観点から、分子内にフッ素原子を有する樹脂が好ましく、含フッ素ポリイミド（含フッ素ポリイミド樹脂）がより好ましい。本発明で用いられるポリイミド樹脂は、典型的には、酸二無水物とジアミンとを各々１種以上重合させて得られるポリアミド酸をイミド化することにより得られる。ポリイミド樹脂は、ポリアミド酸を化学構造の一部に含んでいてもよい。ポリイミド樹脂を製造する方法としては、公知の手法で製造すればよい。一例として二段合成法が使用できる。ポリイミド樹脂の二段合成法は前駆体としてポリアミド酸を合成し、ポリアミド酸をポリイミド酸に変換する方法である。前駆体としてのポリアミド酸はポリアミド酸誘導体であってもよい。ポリアミド酸誘導体としては、例えばポリアミド酸塩、ポリアミド酸アルキルエステル、ポリアミド酸アミド、ビスメチリデンピロメリチドからのポリアミド酸誘導体、ポリアミド酸シリルエステル、ポリアミド酸イソイミドなどが挙げられる。ポリイミドとしてはピロメリット酸二無水物、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物等の酸無水物と、オキシジアミン、パラフェニレンジアミン、メタフェニレンジアミン、ベンゾフェノンジアミン等のジアミンとからなるポリイミドが例示できる。フッ素原子を有する樹脂としては、例えば、４，４’−ヘキサフルオロイソプロピリデンジフタル酸無水物（６ＦＤＡ）／１，４−ビス（アミノフェノキシ）ベンゼン（ＴＰＥＱ）共重合体、６ＦＤＡ／４，４’−オキシジフタル酸無水物（ＯＤＰＡ）／ＴＰＥＱ共重合体、４，４’−（４，４’−イソプロピリデンジフェノキシ）ジフタル酸（ＢＰＡＤＡ）／２，２−ビス［４−（４−アミノフェノキシ）フェニル］ヘキサフルオロプロパン（ＨＦＢＡＰＰ）、６ＦＤＡ／２，２−ビス（４−（４−アミノフェノキシ）フェニル）プロパン（ＢＡＰＰ）共重合体等の以下の式（Ｉ）で示される構成単位を含む含フッ素ポリイミド樹脂；エチレン−テトラフルオロエチレン共重合体等が例示できる。

上記式（Ｉ）中、Ｘ^０は酸素原子、硫黄原子、または２価の有機基のいずれかを示し；Ｙは２価の有機基を示し；Ｚ^１、Ｚ^２、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^５、及びＺ^６は互いに独立して水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子のいずれかを示し、ｐは０または１である。なお、ポリイミド樹脂において、式（Ｉ）で示される化学構造は、樹脂の構成単位ごとに異なってもよく、同一であってもよい。Ｘ^０、Ｙ、Ｚ^１、Ｚ^２、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^５、およびＺ^６の少なくとも１つはフッ素原子を１個以上含むことが好ましい。

上記式（Ｉ）中、ｐ＝０である場合にはＸ^０は存在していなくても（換言すれば、左右のベンゼン環が直接結合していても）よいが、ｐ＝１である場合には、左右のベンゼン環はＸ^０を介して結合する。

Ｘ^０で示される２価の有機基としては、具体的には、アルキレン基、アリーレン基、アリーレンオキシ基、アリーレンチオ基等が挙げられ、これらの中でも、アルキレン基、アリーレンオキシ基、アリーレンチオ基が好ましく、アルキレン基、アリーレンオキシ基が
より好ましく、これらはフッ素原子で置換されていてもよい。上記アルキレン基の炭素数は、例えば１〜１２であり、好ましくは１〜６である。

Ｘ^０の例であるフッ素原子で置換されたアルキレン基としては、例えば、−Ｃ（ＣＦ_３）_２−、−Ｃ（ＣＦ_３）_２−Ｃ（ＣＦ_３）_２−等を例示することができる。Ｘ^０の例である上述したアルキレン基の中では、−Ｃ（ＣＦ_３）_２−が好適である。

Ｘ^０の例であるアリーレン基としては、例えば、以下のものを例示することができる。

Ｘ^０の例であるアリーレンオキシ基としては、例えば、以下のものを例示することができる。

Ｘ^０の例であるアリーレンチオ基としては、例えば、以下のものを例示することができる。

増殖活性が低下した細胞であっても基材上にスフェロイドを良好に形成しうるという観点からは、Ｘ^０で示される２価の有機基は、上記ｂ−２〜ｂ−１０およびｃ−２〜ｃ−１０からなる群から選択されることが好ましく、上記ｂ−７〜ｂ−９およびｃ−７〜ｃ−９からなる群から選択されることがより好ましく、ｂ−８で表される構造であることがさらに好ましい。また、Ｘ^０で表される２価の有機基は、−Ｃ（ＣＦ_３）_２−であることも同様に好ましい。

Ｘ^０の例である上述したアリーレン基、アリーレンオキシ基及びアリーレンチオ基は、各々独立して、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であり、好ましくはフッ素原子または塩素原子であり、より好ましくはフッ素原子である。）、メチル基およびトリフルオロメチル基よりなる群から選択される基により置換されていてもよい。これら置換基は複数であってもよく、その場合には置換基の種類は互いに同一であっても異なっていてもよい。アリーレン基、アリーレンオキシ基およびアリーレンチオ基に置換している好適な置換基は、フッ素原子および／またはトリフルオロメチル基であり、好適にはフッ素原子である。アリーレン基、アリーレンオキシ基およびアリーレ
ンチオ基は、Ｙにフッ素原子が含まれない場合、少なくとも１つ以上のフッ素原子で置換されることが好ましい。

上記式（Ｉ）中、Ｙで示される２価の有機基としては、特に制限されないが、例えば、芳香環を有する２価の有機基が挙げられる。詳しくは、１個のベンゼン環からなる基もしくは、２個以上のベンゼン環が炭素原子（すなわち、単結合、またはアルキレン基）、酸素原子、硫黄原子を介してまたは直接結合した構造を有する基が挙げられる。具体的には、以下の基を例示することができる。

Ｙの例である上述した芳香環を有する２価の有機基は、置換可能であれば、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であり、好ましくはフッ素原
子または塩素原子、より好ましくはフッ素原子である。）、メチル基およびトリフルオロメチル基からなる群から選択される基により置換されていてもよい。これら置換基は複数であってもよく、その場合には置換基の種類は互いに同一であっても異なっていてもよい。芳香環を有する２価の有機基に置換している好適な置換基は、特にＸ^０にフッ素原子が含まれない場合は、フッ素原子および／またはトリフルオロメチル基であることが好ましく、より好適にはフッ素原子である。

スフェロイド形成性の観点から、上記式（Ｉ）中、Ｙはｄ−３、ｄ−９、ｅ−１〜ｅ−４、ｆ−６、およびｆ−７からなる群から選択される構造であることが好ましく、より好ましくはｅ−１、ｅ−３またはｅ−４の構造であり、さらに好ましくはｅ−３の構造である。

上記式（Ｉ）中、Ｚ^１、Ｚ^２、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^５、及びＺ^６は、各々同じであってもよく異なっていてもよく、それぞれ独立して、水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子から選ばれ、Ｘ^０およびＹの少なくとも一方にフッ素原子が含まれない場合、Ｚ^１、Ｚ^２、Ｚ^３、Ｚ^４、Ｚ^５、およびＺ^６の少なくとも１つはフッ素原子であることが好ましい。

スフェロイド形成性の観点から、本発明の好ましい一実施形態では、上記式（Ｉ）中、Ｘ^０で示される２価の有機基が、−Ｃ（ＣＦ_３）_２−、上記ｂ−２〜ｂ−１０およびｃ−２〜ｃ−１０からなる群から選択され；かつ、Ｙが、ｄ−３、ｄ−９、ｅ−１〜ｅ−４、ｆ−６、およびｆ−７からなる群から選択される。本発明のより好ましい一実施形態では、上記式（Ｉ）中、Ｘ^０で示される２価の有機基が、−Ｃ（ＣＦ_３）_２−、ｂ−７〜ｂ−９およびｃ−７〜ｃ−９からなる群から選択され；かつ、Ｙが、ｅ−１、ｅ−３およびｅ−４からなる群から選択される。

上記の式（Ｉ）で示される構成単位からなるポリイミド樹脂は、酸二無水物とジアミンとの重合により得られるポリアミド酸を焼成する手法により得ることができる。以下に、一具体例として、６ＦＤＡ／ＢＡＰＰ共重合体の合成過程を示す。なお、上記「式（Ｉ）で示される構成単位からなるポリイミド樹脂」のイミド化率は、１００％でなくともよい。すなわち、式（Ｉ）で示される構成単位からなるポリイミド樹脂は、上記式（Ｉ）で表される構造単位のみからなるものであってもよいが、本発明の目的効果が損なわれない範囲において、環状イミド構造が脱水閉環せずにアミド酸のままである構成単位が一部に含まれていてもよい。

ポリアミド酸合成反応は有機溶媒中で行われることが好適である。ポリアミド酸合成反応に用いられる有機溶媒としては、原料である酸二無水物とジアミンとの反応が効率よく進行でき、かつこれらの原料に対して不活性であれば、特に限定されるものではない。例えば、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、スルホラン、メチルイソブチルケトン、アセトニトリル、ベンゾニトリル、ニトロベンゼン、ニトロメタン、アセトン、メチルエチルケトン、イソブチルケトン、メタノール等の極性溶媒；トルエンやキシレン等の非極性溶媒等が挙げられる。中でも、極性溶媒を用いることが好ましい。これらの有機溶媒は、単独で使用されてもよいし、２種以上の混合物として使用されてもよい。アミド化反応後の反応混合物をそのまま熱イミド化に供してもよい。前記ポリアミド酸の溶液中の前記ポリアミド酸の濃度は特に限定されないが、得られる樹脂組成物の重合反応性と重合後の粘度、その後の製膜、焼成での取り扱いやすさから、好ましくは、５重量％以上、より好ましくは１０重量％以上、好ましくは５０重量％以下、より好ましくは４０重量％以下である。

前記ポリアミド酸を、熱イミド化または化学イミド化のいずれかによりイミド化して含フッ素ポリイミドを含む樹脂組成物を得る。特定の実施形態では、前記ポリアミド酸を、加熱処理によりイミド化（熱イミド化）して含フッ素ポリイミドを含む樹脂組成物を得る。熱イミド化で得られたポリイミドは、触媒の残存の可能性がなく、細胞培養用途ではより好ましい。なお、含フッ素ポリイミド樹脂のイミド化率は、１００％でなくともよい。すなわち、含フッ素ポリイミド樹脂は、上記式（Ｉ）で表される構造単位の環状イミド構造の一部が開環したアミド構造である構造単位を、一部に含むものであってもよい。

熱イミド化によりイミド化する場合、例えば、前記ポリアミド酸を、空気中で、またはより好ましくは窒素、ヘリウム、アルゴン等の不活性ガス雰囲気下で、或いは真空中で、好ましくは温度５０〜４００℃、より好ましくは１００〜３８０℃、好ましくは時間０．１〜１０時間、より好ましくは０．２〜５時間の条件下で焼成してイミド化反応を行うことによりポリイミドを含む樹脂組成物を得ることができる。

熱イミド化反応に供する前記ポリアミド酸は、適当な溶媒中に溶解された形態であることが好ましい。溶媒としては、ポリアミド酸を溶解するものであれば良く、ポリアミド酸合成反応に関して上記した溶媒を用いることもできる。

化学イミド化によりイミド化する場合では、適当な溶媒中で後述の脱水環化試薬の使用によりポリアミド酸を直接イミド化することができる。

前記脱水環化試薬は、ポリアミド酸を化学的に脱水環化してポリイミドとする作用を有するものであれば、特に制限なく用いることができる。このような脱水環化試薬としては、第三級アミン化合物を単独で用いるか、または、第三級アミン化合物とカルボン酸無水物とを組合せて用いることが、イミド化を効率よく促進させうる点で好ましい。

第三級アミン化合物としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ−５−エン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルジアミノメタン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，３−プロパンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，４−フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，６−ヘキサンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチルメチレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチルエチレンジアミン等が挙げられる。これらの中でも特に、ピリジン、ＤＡＢＣＯ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルジアミノメタンが好ましく、ＤＡＢＣＯがより好ましい。３級アミンは１種のみであってもよいし、２種以上であってもよい。

カルボン酸無水物としては、例えば、無水酢酸、無水トリフルオロ酢酸、無水プロピオン酸、無水酪酸、無水イソ酪酸、無水コハク酸、無水マレイン酸等が挙げられる。これらの中でも特に、無水酢酸、無水トリフルオロ酢酸が好ましく、無水酢酸がより好ましい。カルボン酸無水物は１種のみであってもよいし、２種以上であってもよい。

化学イミド化においてポリアミド酸を溶解する溶媒としては、溶解性に優れる極性溶媒が好適である。例えば、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド等が挙げられ、これらの中でも特に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよびＮ−メチルピロリドンからなる群より選ばれる１種以上であることが均一反応をする観点から好ましい。アミド化反応の溶媒としてこれらの溶媒を用いた場合、アミド化反応後の反応混合物からポリアミド酸を分離せずそのまま化学イミド化に用いることができる。

上記の細胞培養用基材の形成材料である樹脂の重量平均分子量は、例えば、５，０００〜２，０００，０００、好ましくは８，０００〜１，０００，０００であり、さらに好ましくは２０，０００〜５００，０００である。なお、本明細書において、樹脂の重量平均分子量は、以下の手法により測定された値である。重量平均分子量が上記範囲であることにより、スフェロイド形成性がより良好となる。

（重量平均分子量の測定）
装置：東ソー株式会社製 ＨＣＬ−８２２０ＧＰＣ
カラム：ＴＳＫｇｅｌ Ｓｕｐｅｒ ＡＷＭ−Ｈ
溶離液（ＬｉＢｒ・Ｈ_２Ｏ、リン酸入りＮＭＰ）：０．０１ｍｏｌ／Ｌ
測定方法：０．５重量％の溶液を溶離液で作製し、ポリスチレンで作製した検量線をもとに分子量を算出する。

細胞培養用基材の細胞培養面は、静的水接触角が７５°以上かつ転落角が１５°以上であることが好ましい。細胞培養用基材がこのような条件を満たすことにより、細胞培養用基材上でのスフェロイド形成がより一層促進される。スフェロイド形成性の観点から、静的水接触角は、より好ましくは８０°超であり、さらに好ましくは８１°超であり、静的水接触角の上限は、例えば１５０°未満であり、好ましくは１２０°未満であり、より好ましくは１００°以下であり、さらに好ましくは９０°未満である。スフェロイド形成性の観点から、転落角は、１８°以上、２０°以上、２２°以上、２４°以上の順で高いほど好ましい。転落角の上限値は、例えば８０°未満であり、好ましくは７０°未満であり、より好ましくは６０°未満であり、さらに好ましくは５０°未満である。なお、上記の静的水接触角や転落角は、以下の方法により測定される値である。

（静的水接触角の測定方法）
装置：自動接触角計（協和界面科学製：ＤＭ−５００）
測定方法：フィルム上に水２μＬを滴下した直後の液滴の付着角度を測定する（測定温度：２５℃）。

（転落角の測定方法）
装置：自動接触角計（協和界面科学製：ＤＭ−５００）
測定方法：フィルム上に水２５μＬを滴下した後、基材を連続的に傾けていき、流れ落ちた際の角度を転落角とする（測定温度：２５℃）。

細胞培養用基材は、可塑剤、酸化防止剤等の添加剤成分をさらに含んでもよい。基材の厚さも特に制限されず、任意に設定できるが、例えば０．１μｍ〜１０ｍｍであり、好ましくは１μｍ〜１ｍｍである。

本発明に係る細胞培養用基材は、ナノ凹凸構造の形成加工を施さなくともスフェロイド形成に用いることが可能であるが、ナノ凹凸構造を有するものを排除しない。細胞培養用基材に対するナノ凹凸構造の形成加工は、例えば、特開２０１４−２１０４０４号公報に記載の手法により行うことができる。

細胞培養用基材は、細胞培養容器の形態で用いられてもよい。具体的に、本発明の細胞培養容器は、上述した細胞培養用基材と他の部材（例えば、支持部材）とが組み合わされて構成されていてもよいし、上述した細胞培養用基材と他の部材とが一体化されて構成されていてもよいし、上述した細胞培養用基材のみにより構成されていてもよい。

上述した細胞培養用基材が支持部材と組み合わされて細胞培養容器が構成される場合、細胞培養容器が開口した側から当該容器を平面視したときの内郭形状および外郭形状は、それぞれ例えば円、多角形（四角形、三角形等）などの任意の形状であることができる。支持部材を構成する材料としては、例えば、無機ガラス；カーボン；シリコン等の金属；ポリエチレン、ポリプロピレン、環状オレフィン等のポリオレフィン樹脂；ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等のポリエステル樹脂；ポリメタクリル酸メチル等のアクリル系樹脂；エポキシ樹脂；ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン樹脂、ポリ酢酸ビニル、ＡＢＳ（アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン）樹脂、ポリカーボネート樹脂、ビニルエーテル、ポリアセタール、ポリフェニレンエーテル（ＰＰＥ）、ポリアリールエーテル、ポリフェニレンスルファイド（ＰＰＳ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリアリールエーテルケトン、フェノール樹脂、ポリエーテルニトリル（ＰＥＮ）等が例示できる。

細胞培養容器は、上述した細胞培養用基材を備えていればよく、全体としてどのような
形状であってもよい。例えば、シングルもしくはマルチウェルプレートなどの培養用のプレート、シャーレ、ディッシュ、フラスコ、バッグ等の各種容器の形状であることができる。また、細胞培養容器は、大量培養装置や潅流培養装置などの培養装置における細胞培養容器の形態であってもよい。

＜用途＞
上述したスフェロイドを有効成分として含有する本発明に係る予防・治療剤が予防・治療のターゲットとする疾患は、軟骨組織関連疾患である。

軟骨組織関連疾患とは、軟骨組織に関連した疾患であり、軟骨の再生によって症状が改善しうる任意の疾患を意味する。軟骨組織関連疾患としては、例えば、変形性膝関節症、外傷性軟骨損傷、肩関節周囲炎、顎関節症、関節リウマチ、離断性骨軟骨症、無腐性骨壊死、および半月板損傷などが挙げられる。

このように、本発明によれば、上述したスフェロイドを有効成分として含有する軟骨組織関連疾患の予防・治療剤が提供されるが、他の観点から、本発明はまた、以下のものも提供する。

・培養された間葉系幹細胞を含むスフェロイドを、それを必要とする患者に投与することを含む、軟骨組織関連疾患の予防または治療方法。

・軟骨組織関連疾患の予防または治療に用いられる、培養された間葉系幹細胞を含むスフェロイド。

・軟骨組織関連疾患の予防または治療のための医薬の製造における、培養された間葉系幹細胞を含むスフェロイドの使用。

本発明に係るスフェロイドを有効成分として含有する予防・治療剤が上述したような各種の軟骨組織関連疾患に対して予防・治療効果を示すメカニズムは完全には明らかではないが、以下のようなメカニズムが推定される。

すなわち、後述する実施例の欄において説明するように、本発明に係るスフェロイドは、培養された間葉系幹細胞を有効成分として含有するものであることにより（好ましくは、接着培養された間葉系幹細胞を有効成分として含有するものであることにより）、二次元培養物と比較して、ＴＧＦβ１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（腫瘍増殖因子）−β１）遺伝子について有意に高い発現量を示すことが判明している。

ここで、ＴＧＦβ１遺伝子は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子であり、哺乳動物のＴＧＦ−βにはβ１、β２およびβ３のアイソフォームが存在している。ＴＧＦβ１は細胞増殖のほか、成長、分化や運動性の調節といった機能を担っており、胚形成、組織再構築や創傷治癒などの生理的機能にも関与していることが知られている。なお、成熟ヒトＴＧＦβ１は、ブタ、イヌ、ウシと１００％、マウス、ラット、ウマと９９％アミノ酸配列が一致し、交差性を示す。本発明者らの検討によれば、このＴＧＦβ１遺伝子の発現量の増加が、軟骨組織の再生や増殖に何らかの作用を示す結果、軟骨組織関連疾患の予防・治療効果を示すものと推定している。

このように、本発明に係るスフェロイドは、二次元培養物と比較して所定の遺伝子について有意に高い発現量を示すが、そのメカニズムとしては、スフェロイドが立体的な細胞状態を作り出すことで、体内で存在している細胞状態に近い状態を再現しているためと考
えられる。また、特に接着培養された間葉系幹細胞を含むスフェロイドは、浮遊培養された間葉系幹細胞を含むスフェロイドよりも二次元培養に類似した経過を辿る結果、総合的に遺伝子の発現量が増大することが考えられる。さらに、接着培養された間葉系幹細胞を含むスフェロイドは、細胞培養用基材の表面に接着した状態で培養されることから、細胞同士の会合が少なくなる結果として比較的サイズの小さいスフェロイドを形成することが可能である。このため、培地からの栄養や酸素の供給が遮断される虞が小さいことから、高い機能（遺伝子発現量）を示しているのかもしれない。

本発明に係る予防・治療剤は、従来公知の細胞製剤における知見を参照しつつ、同様にして調製、保管、投与することが可能である。本発明に係る予防・治療剤は、通常、注射剤の形態を有する。注射剤を調製する場合は、有効成分にｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、および局所麻酔剤などを添加し、常法により皮下、筋肉内および静脈内用注射剤を製造することができる。この場合のｐＨ調節剤および緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸食塩水などが挙げられる。安定化剤としてはピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、チオグリコール酸、およびチオ乳酸などが挙げられる。局所麻酔剤としては塩酸プロカイン、および塩酸リドカインなどが挙げられる。等張化剤としては、塩化ナトリウムおよびブドウ糖などが例示されうる。

本発明に係る予防剤および／または治療剤はまた、有効成分に加え、必要に応じて、一般的に用いられる各種の添加剤成分をさらに含みうる。

本発明に係る予防・治療剤に含有される有効成分の量は、当該有効成分の用量範囲や投薬の回数などにより適宜決定されうる。

用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無など）、および担当医師の判断などに応じて適宜設定されうる。

本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。なお、特記しない限り、以下の操作は室温（２５℃）で行った。

＜製造例１：含フッ素ポリイミドフィルム（含フッ素ポリマー基材）の製造（１）＞
１００ｍＬ容量の三口フラスコに２，２−ビス（４−（４−アミノフェノキシ）フェニル）プロパン（ＢＡＰＰ） ３．６０２ｇ（８．７７ミリモル）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン４２．５ｇを仕込み溶解した。そこへ４，４’−ヘキサフルオロイソプロピリデンジフタル酸無水物（６ＦＤＡ） ３．８９８ｇ（８．７７ミリモル）を加え、窒素雰囲気下、室温で５日間攪拌して、含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物（固形分濃度１５．０質量％）を得た。ここで、得られたポリアミド酸の重量平均分子量は２８０，０００であった。なお、ポリアミド酸の重量平均分子量と、焼成後の含フッ素ポリイミドの重量平均分子量とは実質的に同一である。

上記で得られた含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物を、焼成後の含フッ素ポリイミドフィルムの厚みが４０μｍとなるようにダイコーターを用いてガラス基体上に塗布し、塗膜を形成した。次いで、３４０℃にて１時間、窒素雰囲気下で塗膜の焼成を行った。その後、焼成物をガラス基体から剥離して、含フッ素ポリイミドフィルム１を得た。

この含フッ素ポリイミドフィルム１の静的水接触角は８３．０°、転落角は２４．５°
であった。

＜脂肪組織由来間葉系幹細胞の採取＞
コラゲナーゼ処理および遠心比重法を利用した周知の方法を用いて、ヒト脂肪組織からヒト脂肪組織由来幹細胞（Ａｄｉｐｏｓｅ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ：ＡｄＳＣ）を採取した。

具体的には、まず、コラゲナーゼ溶液として、ＤＮａｓｅＩ（０．１ｍｇ／ｍＬ、ロッシュ、１２８４９３２）および３ｍＭ ＣａＣｌ_２を含むコラゲナーゼ１型（１ｍｇ／ｍＬ、和光純薬工業、０３５−１７６０４）／１％ＢＳＡ ＨＢＳＳ溶液を調製した。次いで、ヒト脂肪組織（１ｇ〜２ｇ程度）をメスで細断し、その組織体積の３倍程度の上記コラゲナーゼ溶液とともに１５ｍＬチューブに入れ、３７℃にて６０分間振盪インキュベーションを行った。その後、インキュベートした１５ｍＬチューブ内に室温の５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（ＥＤＴＡ（０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、ライフ テクノロジーズ、ＡＭ９２６０Ｇ）、１０×ＤＰＢＳ（Ｃａ（−）、Ｍｇ（−））（ＧＩＢＣＯ、１４２００−１６６）を希釈して作製）を加えて、１５ｍＬ程度の細胞懸濁液としてから３００×ｇで５分間の遠心処理を施した。その後、上清（脂肪層を含む）を吸引除去し、５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳを加えて２０ｍＬにした。得られた細胞懸濁液をセルストレーナー（７０μｍ、ＢＤ）に通しながら、新しい５０ｍＬチューブに回収し、室温のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７ ４ｍＬの入った２本の１５ｍＬチューブに、上記回収した細胞溶液を１０ｍＬずつ穏やかに混入させずに重層した。これらを室温８００×ｇで２０分間（ブレーキ無し）の遠心処理を施し、遠心後に単核球細胞層だけを１８Ｇ針付２．５ｍＬシリンジで回収し、新しい１５ｍＬチューブに移して、冷却した５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳで１４ｍＬとした。その後、２００×ｇで１０分間（ブレーキ有り）の遠心処理を施し、上清を捨てた。次いで、１ｍＬの冷却した５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳで細胞を懸濁し、１４ｍＬまでメスアップした後、２００×ｇで１０分間の遠心処理を施して、上清を捨てた。得られた細胞ペレットを初代培養用培地（１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ Ｆ１２、シグマ Ｄ８０４２＋Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、ＧＩＢＣＯ １５２４０−０６２）で懸濁してから３×１０^４／ｃｍ^２〜４×１０^４／ｃｍ^２程度の細胞密度で培養皿に播種した。その後、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２インキュベーター内で４〜５日間培養し、接着細胞をヒト脂肪組織由来の間葉系幹細胞として、以下の実験に用いた。

＜ヒト脂肪組織由来の間葉系幹細胞の拡大培養＞
上記で得られたヒト脂肪組織由来の間葉系幹細胞を１ｍＬのＣＥＬＬＯＴＩＯＮ（ＺＥＮＯＡＱ製）で洗浄し、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ Ｆ１２培地（シグマ製）を添加して１０ｍＬとした。次いで、２５０×ｇで５分間の遠心処理を施した。遠心処理後、上清を除去し、２ｍＬの１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ Ｆ１２培地（シグマ製）で懸濁させて、細胞数のカウントを行った。細胞懸濁液は２×１０^５細胞／ｍＬの濃度となるように調製した。その後、１００ｍｍディッシュ（ファルコン製）に９ｍＬの培地を予め加えておき、そこに上記の濃度に調整した細胞懸濁液を１ｍＬ加え、３７℃の５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２インキュベーター内で拡大培養を行った。

＜実施例１：ヒト脂肪組織由来の間葉系幹細胞の接着培養＞
１００ｍｍディッシュから培地を除去し、細胞剥離液ＴｒｙｐＬＥ ｓｅｌｅｃｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を３ｍＬ添加した後、３７℃の５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２インキュベーター内で５分間程度保持して細胞を剥離した。次いで、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ Ｆ１２培地を用いて総量が１０ｍＬになるようにチューブへ移した。２５０×ｇで５分間遠心処理を施し、２ｍＬの１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ Ｆ１２培地（シグマ製）で懸濁させて、細胞数のカウントを行った。その後、１×１０^５細胞／ｍＬの濃度となるように調製した。

上記製造例１で作製した含フッ素ポリマー基材である含フッ素ポリイミドフィルム１を細胞培養面に配置した２４穴プレートに、上記で調製した細胞懸濁液を１ｍＬずつ播種（１×１０^５細胞／ウェル）した（培養０日目）。その後、３７℃の５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２インキュベーター内で培養を行い、３日目まで培養した。

その結果、培養の経過に伴い、含フッ素ポリマー基材（含フッ素ポリイミドフィルム１）に保持された（接着した）スフェロイドが出現することが光学顕微鏡を用いた観察によって確認された。ここで、光学顕微鏡による観察像を、図１に示す。図１（ａ）は培養１日目の観察像を示し、図１（ｂ）は培養３日目の観察像を示す。

＜実施例２：ヒト脂肪組織由来の間葉系幹細胞の浮遊培養＞
含フッ素ポリイミドフィルム１を細胞培養面に配置した２４穴プレートに代えて、ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅマルチウェルプレート２４ｗｅｌｌ（住友ベークライト製）を用いたこと以外は、上述した実施例１と同様の手法により、ヒト脂肪組織由来の間葉系幹細胞の培養を行った。

本実施例においてもスフェロイドの形成が確認できたが、当該スフェロイドはウェル底面に接着しておらずウェル底面に非接着の状態で沈んでいた。ここで、光学顕微鏡による培養３日目の観察像を、図２に示す。

＜比較例１：ヒト脂肪組織由来の間葉系幹細胞の平面培養＞
含フッ素ポリイミドフィルム１を細胞培養面に配置した２４穴プレートに代えて、２４穴ポリスチレン基材（ファルコン製）を用いたこと以外は、上述した実施例１と同様の手法により、ヒト脂肪組織由来の間葉系幹細胞の培養を行った。本比較例において、培養された細胞は二次元的（平面状）に増殖するのみであり、スフェロイドの形成は確認されなかった。

＜遺伝子発現量の解析＞
実施例１および実施例２並びに比較例１において間葉系幹細胞の培養を行った培養プレートから、細胞を回収した。回収した細胞から、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ（コスモバイオ製）を用いてＲＮＡを回収した。

回収したＲＮＡを試料として、定量ＰＣＲ法にてヒトＴＧＦβ１遺伝子（軟骨分化起因因子）のｍＲＮＡ発現量を測定した。なお、定量ＰＣＲ用のキットとしてはＢｉｏＲａｄ
ＳｓｏＦａｓｔ ＥｖａＧｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（バイオラッド製）を用い、測定機器名：ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ ９６ｗｅｌｌ（バイオラッド製）により分析した。ＴＧＦβ１の遺伝子発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量に対するそれぞれの遺伝子の発現量の相対値として校正することにより算出した。結果を図３に示す。図３は、各培養条件におけるヒトＴＧＦβ１遺伝子の発現量の結果を示すグラフである。

図３に示すように、実施例１および実施例２において含フッ素ポリイミドフィルム１上で培養された間葉系幹細胞は、比較例１において培養された間葉系幹細胞と比較して、ヒトＴＧＦβ１遺伝子について有意に高い発現量を示した。このことから、培養された間葉系幹細胞を含むスフェロイドにおいては、当該遺伝子の発現が促進されることがわかる。また、実施例１と実施例２との対比から、細胞培養用基材上で接着培養することにより、浮遊培養を行う場合と比較して、当該遺伝子の発現がよりいっそう促進されることもわかる。

＜製造例２：含フッ素ポリイミドフィルム（含フッ素ポリマー基材）の製造（２）＞
１００ｍＬ容量の三口フラスコに１，４−ビス（アミノフェノキシ）ベンゼン２．９７６ｇ（１０．２ミリモル）、４，４’−ヘキサフルオロイソプロピリデンジフタル酸無水物４．５２４ｇ（１０．２ミリモル）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン４２．５ｇを仕込んだ。窒素雰囲気下、室温で、５日間攪拌することで、含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物（固形分濃度１５．０質量％）を得た。ここで、得られたポリアミド酸の重量平均分子量は１００，０００であった。なお、ポリアミド酸の重量平均分子量と、焼成後の含フッ素ポリイミドの重量平均分子量とは実質的に同一である。

上記で得られた含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物を、焼成後の含フッ素ポリイミドフィルムの厚みが４０μｍとなるようにダイコーターを用いてガラス基体上に塗布し、塗膜を形成した。次いで、３６０℃にて１時間、窒素雰囲気下で塗膜の焼成を行った。その後、焼成物をガラス基体から剥離して、含フッ素ポリイミドフィルム２を得た。

この含フッ素ポリイミドフィルム２の静的水接触角は８１．２°、転落角は１９．９°であった。

＜ヒト脂肪組織由来の間葉系幹細胞の拡大培養＞
上記で得られたヒト脂肪組織由来の間葉系幹細胞を１ｍＬのＣＥＬＬＯＴＩＯＮ（ＺＥＮＯＡＱ製）で洗浄し、ＫＢＭ ＡＤＳＣ−１培地（コージンバイオ製）を添加して１０ｍＬとした。次いで、２５０×ｇで５分間の遠心処理を施した。遠心処理後、上清を除去し、２ｍＬのＫＢＭ ＡＤＳＣ−１培地（コージンバイオ製）で懸濁させて、細胞数のカウントを行った。細胞懸濁液は２×１０^５細胞／ｍＬの濃度となるように調製した。その後、１００ｍｍディッシュ（ファルコン製）に９ｍＬの培地を予め加えておき、そこに上記の濃度に調整した細胞懸濁液を１ｍＬ加え、３７℃の５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２インキュベーター内で拡大培養を行った。

＜実施例３：ヒト脂肪組織由来の間葉系幹細胞の接着培養＞
１００ｍｍディッシュから培地を除去し、細胞剥離液ＴｒｙｐＬＥ ｓｅｌｅｃｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を３ｍＬ添加した後、３７℃の５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２インキュベーター内で５分間程度保持して細胞を剥離した。次いで、ＫＢＭ ＡＤＳＣ−２培地（コージンバイオ製）を用いて総量が１０ｍＬになるようにチューブへ移した。２５０×ｇで５分間遠心処理を施し、２ｍＬのＫＢＭ ＡＤＳＣ−２培地（コージンバイオ製）で懸濁させて、細胞数のカウントを行った。その後、１×１０^６細胞／ｍＬの濃度となるように調製した。

上記製造例２で作製した含フッ素ポリマー基材である含フッ素ポリイミドフィルム２を細胞培養面に配置した３５ｍｍシャーレに、上記で調製した細胞懸濁液を０．２ｍＬずつ播種（２．０×１０^５細胞／ウェル）し、ＫＢＭ ＡＤＳＣ−２培地（コージンバイオ製）を１．８ｍＬ加えた（培養０日目）。その後、３７℃の５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２インキュベーター内で培養を行い、３日目まで培養した。

その結果、培養の経過に伴い、含フッ素ポリマー基材（含フッ素ポリイミドフィルム２）に保持された（接着した）スフェロイドが出現することが光学顕微鏡を用いた観察によって確認された。

＜実施例４：ヒト脂肪組織由来の間葉系幹細胞の浮遊培養＞
実施例３で用いた含フッ素ポリイミドフィルム２を細胞培養面に配置した３５ｍｍシャーレに代えて、ＥＬＰＬＡＳＩＡ（クラレ製）を用いた。また、３．５×１０^５細胞／ｍＬに調製した細胞懸濁液を１ｍＬずつ播種した（培養０日目）。その後、３７℃の５％（
ｖ／ｖ）ＣＯ_２インキュベーター内で培養を行い、３日目まで培養した。なお、本実施例においてもスフェロイドの形成が確認できたが、当該スフェロイドはウェル底面に接着しておらずウェル底面に非接着の状態で沈んでいた。

＜比較例２：ヒト脂肪組織由来の間葉系幹細胞の平面培養＞
実施例３で用いた含フッ素ポリイミドフィルム２を細胞培養面に配置した３５ｍｍシャーレに代えて、２４穴ポリスチレン基材（ファルコン製）を用いた。また、８×１０^３細胞／ｍＬに調製した細胞懸濁液を１ｍＬずつ播種した（培養０日目）。その後、３７℃の５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２インキュベーター内で培養を行い、３日目まで培養した。本比較例において、培養された細胞は二次元的（平面状）に増殖するのみであり、スフェロイドの形成は確認されなかった。

＜変形性膝関節症モデルマウスを用いた幹細胞スフェロイドの変形性膝関節症治療効果の確認＞
１２週齢の雄のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに対して変形性膝関節症誘発（前十字靭帯および半月板片側切除モデル）を行った。モデル作製後に十分なホイール運動負荷をかけ、１週間後に、上記比較例２で得られた平面培養された間葉系幹細胞、並びに上記実施例４および実施例５で得られた間葉系幹細胞スフェロイドをそれぞれマウスの関節（軟骨欠如領域）に関節内局所投与した。ここで、間葉系幹細胞は５×１０^４細胞／マウスを投与し、間葉系幹細胞スフェロイドについても５×１０^４の細胞からなるスフェロイドを投与した。モデル作製から３週間（２１日目）の時点で解剖を行い、サフラニンＯ染色を実施して、脛骨骨頭部の軟骨層の厚みと軟骨基質の染色状況を確認した。結果を図４および図５に示す。図４は、比較例２で得られた平面培養された間葉系幹細胞並びに実施例３および実施例４で得られた間葉系幹細胞スフェロイドを投与した変形性膝関節症モデルマウスにおける組織学的関節損傷度の半定量的スコアリング評価の結果を示すグラフである（スコアが小さいほど関節の損傷度は低いことを意味する）。また、図５は、比較例２で得られた平面培養された間葉系幹細胞並びに実施例３および実施例４で得られた間葉系幹細胞スフェロイドを投与した変形性膝関節症モデルマウスにおける関節組織に対してサフラニンＯ染色を行った結果を示す顕微鏡写真である。

図４に示すように、実施例３および実施例４で得られたスフェロイドを投与したマウスでは、いずれも比較例２で得られた平面培養された間葉系幹細胞を投与したものと比較して優れたスコアリング評価の結果を示した。また、図５に示すように、実施例３で得られたスフェロイドを投与したマウスでは、比較例２で得られた平面培養された間葉系幹細胞を投与したものと比較して厚い軟骨層を示しており、サフラニンＯにより染色される軟骨基質の赤色も有意に多いものであった（比較例２と比べてよい傾向が認められた）。なお、図４および図５に示す「ブランク」は、細胞を含まない緩衝液のみを投与して同様に実験を行ったものである。

なお、本出願は、２０１６年１２月２日に出願された日本特許出願第２０１６−２３５２８６号および２０１７年８月２２日に出願された日本特許出願第２０１７−１５９６７０号に基づいており、その開示内容は、参照により全体として引用されている。

Claims (7)

1. 培養された間葉系幹細胞を含むスフェロイドを有効成分として含有する、軟骨組織関連疾患の予防または治療剤。
2. 細胞培養用基材上で接着培養された間葉系幹細胞を含むスフェロイドを有効成分として含有する、請求項１に記載の予防または治療剤。
3. 前記軟骨組織関連疾患が、変形性膝関節症、外傷性軟骨損傷、肩関節周囲炎、顎関節症、関節リウマチ、離断性骨軟骨症、無腐性骨壊死、および半月板損傷からなる群より選択される、請求項１または２に記載の予防または治療剤。
4. 前記間葉系幹細胞が、ヒト脂肪組織由来の細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の予防または治療剤。
5. 前記細胞培養用基材が、ポリイミド樹脂を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の予防または治療剤。
6. 前記ポリイミド樹脂が、含フッ素ポリイミド樹脂である、請求項５に記載の予防または治療剤。
7. 局部注射されることにより用いられる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の予防または治療剤。

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