JPWO2019152796A5 - - Google Patents
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Description
非改変のタンパク質医薬品と比較して、二量体化または非共有結合性相互作用が減少した改変タンパク質医薬品を提供するための方法も提供される。１つの実施形態では、タンパク質医薬は、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。
[本発明1001]
タンパク質医薬中の非共有結合性相互作用部位または二量体化インターフェースを特定するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
ネイティブ条件下でタンパク質医薬の制限消化を行い、単量体と非共有結合性二量体とを含有するタンパク質医薬二量体サンプル混合物を形成させる、工程；
前記タンパク質医薬二量体サンプル混合物の前記二量体および前記単量体に、検出可能な修飾を導入して、修飾二量体および修飾単量体を生成する、工程；
ネイティブサイズ排除クロマトグラフィーを使用して前記修飾二量体および前記修飾単量体を、修飾二量体分画および修飾単量体分画へと分離させる、工程；
前記修飾二量体分画および前記修飾単量体分画を消化して、ペプチドサンプルを形成させる、工程；
液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ－ＭＳ）を使用して前記ペプチドサンプルを分離させ、前記ペプチドサンプルの質量分析データを取得する、工程；および
前記タンパク質医薬の各ペプチドおよび修飾ペプチドの質量を算出することにより、前記タンパク質医薬の公知の質量データと比較された前記ペプチドの前記質量分析データを使用して、前記ペプチドサンプル中の各ペプチドの修飾部位を決定する、工程。
[本発明1002]
ネイティブ制限消化条件が、ポリペプチド間のジスルフィド結合、および二量体間の非共有結合性相互作用を保持する、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記二量体および前記単量体が、迅速光化学酸化により修飾されて、前記二量体および前記単量体内に検出可能な酸化修飾を形成する、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記タンパク質医薬が、抗体もしくはその抗原結合断片、組み換えタンパク質、融合タンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1001～1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記タンパク質医薬が抗体であり、前記混合物中の前記二量体が本質的に2つの相互作用するＦ（ａｂ’）断片またはＦ（ａｂ）断片からなる、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記タンパク質医薬が抗体であり、前記混合物中の前記単量体が本質的にＦ（ａｂ）断片およびＦｃ断片からなる、本発明1001～1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記修飾が、アミノ酸側鎖の修飾である、本発明1001～1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記抗体が、モノクローナル抗体、二特異性抗体、またはその抗原結合断片である、本発明1004～1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記ネイティブサイズ排除クロマトグラフィーが、酢酸アンモニウムと重炭酸アンモニウムを含有する移動相を使用して実施される、本発明1001～1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記消化されたタンパク質サンプルが、逆相液体クロマトグラフィーを用いて分離される、本発明1001～1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記修飾が、酸化、二酸化、三酸化、キヌレニン、ジチオメチル、脱炭酸、ヒドロキシキヌレニン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、本発明1001～1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記タンパク質医薬が、酵素で消化される、本発明1001または1002の方法。
[本発明1013]
前記酵素が、パパイン、フィカイン、エンドプロテアーゼのＬｙｓ－ＣおよびＩｄｅＳ、またはそれらの改変型からなる群から選択される、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記修飾二量体分画および前記修飾単量体分画が、2つの連続アミノ酸残基を結合させる共有結合性化学結合を切断してペプチドを形成させる酵素により消化される、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記タンパク質医薬サンプルが、流加培養、精製プロセスステップ、または製剤化原薬からのサンプルである、本発明1001～1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
抗体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法：
前記抗体を産生する細胞を、前記抗体を産生するのに適した条件下で細胞培養において培養する、工程；
前記抗体を、前記抗体を抽出するのに適した条件下で精製する、工程；
前記抗体と賦形剤を、前記抗体を安定化するのに適した条件下で混合する、工程；
（ｉ）前記細胞培養から、（ｉｉ）前記細胞培養から前記抗体を精製した後に、または（ｉｉｉ）前記精製された抗体に賦形剤を添加した後に、前記抗体のサンプルを取得する、工程；
本発明1001～1015のいずれかの方法に従い、前記抗体の二量体化インターフェースまたは非共有結合性相互作用部位を特徴解析する、工程；および
1つもしくは複数の細胞培養、精製、または賦形剤の条件を変更して、前記抗体の二量体化または非共有結合性相互作用の量を減少させる、工程。
[本発明1017]
二量体化または非共有結合性相互作用の量を減少させるために変更される前記1つまたは複数の条件が、ｐＨ、細胞密度、アミノ酸濃度、浸透圧、成長因子の濃度、撹拌、溶存酸素、金属イオン、ガス分圧、アフィニティマトリクス、クロマトグラフィー樹脂、緩衝剤、界面活性剤、安定剤またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記細胞が、細菌細胞、酵母細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えばＣＨＯ Ｋ1、ＤＸＢ－11 ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ－7）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＶ1細胞、腎細胞（例えばＨＥＫ293、293 ＥＢＮＡ、ＭＳＲ 293、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ21）、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ2細胞、ＷＩ38細胞、ＭＲＣ 5細胞、Ｃｏｌｏ25細胞、ＨＢ 8065細胞、ＨＬ－60細胞、リンパ球細胞、例えば自己Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔリンパ球）またはＤａｕｄｉ（Ｂリンパ球）、Ａ431（表皮）細胞、Ｕ937細胞、3Ｔ3細胞、Ｌ細胞、Ｃ127細胞、ＳＰ2／0細胞、ＮＳ－0細胞、ＭＭＴ細胞、幹細胞、腫瘍細胞、および上述の細胞のいずれかに由来する細胞株からなる群から選択される、本発明1016または1017の方法。
[本発明1019]
前記細胞が、ハイブリドーマ細胞またはクアドローマ細胞である、本発明1016または1017の方法。
[本発明1020]
本発明1012～1015のいずれかの方法により作製される抗体。
[本発明1021]
改変抗体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法：
本発明1001～1015のいずれかの方法を使用して、前記抗体中の二量体化インターフェースまたは非共有結合性相互作用部位を特徴解析する、工程；および
前記二量体化インターフェースまたは非共有結合性相互作用部位のアミノ酸を改変して、前記抗体の二量体化または非共有結合性相互作用を減少させる、工程。
[本発明1022]
本発明1021の改変抗体。
[本発明1023]
前記抗体が、モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である、本発明1021または1022の抗体。
[本発明1001]
タンパク質医薬中の非共有結合性相互作用部位または二量体化インターフェースを特定するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
ネイティブ条件下でタンパク質医薬の制限消化を行い、単量体と非共有結合性二量体とを含有するタンパク質医薬二量体サンプル混合物を形成させる、工程；
前記タンパク質医薬二量体サンプル混合物の前記二量体および前記単量体に、検出可能な修飾を導入して、修飾二量体および修飾単量体を生成する、工程；
ネイティブサイズ排除クロマトグラフィーを使用して前記修飾二量体および前記修飾単量体を、修飾二量体分画および修飾単量体分画へと分離させる、工程；
前記修飾二量体分画および前記修飾単量体分画を消化して、ペプチドサンプルを形成させる、工程；
液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ－ＭＳ）を使用して前記ペプチドサンプルを分離させ、前記ペプチドサンプルの質量分析データを取得する、工程；および
前記タンパク質医薬の各ペプチドおよび修飾ペプチドの質量を算出することにより、前記タンパク質医薬の公知の質量データと比較された前記ペプチドの前記質量分析データを使用して、前記ペプチドサンプル中の各ペプチドの修飾部位を決定する、工程。
[本発明1002]
ネイティブ制限消化条件が、ポリペプチド間のジスルフィド結合、および二量体間の非共有結合性相互作用を保持する、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記二量体および前記単量体が、迅速光化学酸化により修飾されて、前記二量体および前記単量体内に検出可能な酸化修飾を形成する、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記タンパク質医薬が、抗体もしくはその抗原結合断片、組み換えタンパク質、融合タンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1001～1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記タンパク質医薬が抗体であり、前記混合物中の前記二量体が本質的に2つの相互作用するＦ（ａｂ’）断片またはＦ（ａｂ）断片からなる、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記タンパク質医薬が抗体であり、前記混合物中の前記単量体が本質的にＦ（ａｂ）断片およびＦｃ断片からなる、本発明1001～1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記修飾が、アミノ酸側鎖の修飾である、本発明1001～1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記抗体が、モノクローナル抗体、二特異性抗体、またはその抗原結合断片である、本発明1004～1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記ネイティブサイズ排除クロマトグラフィーが、酢酸アンモニウムと重炭酸アンモニウムを含有する移動相を使用して実施される、本発明1001～1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記消化されたタンパク質サンプルが、逆相液体クロマトグラフィーを用いて分離される、本発明1001～1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記修飾が、酸化、二酸化、三酸化、キヌレニン、ジチオメチル、脱炭酸、ヒドロキシキヌレニン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、本発明1001～1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記タンパク質医薬が、酵素で消化される、本発明1001または1002の方法。
[本発明1013]
前記酵素が、パパイン、フィカイン、エンドプロテアーゼのＬｙｓ－ＣおよびＩｄｅＳ、またはそれらの改変型からなる群から選択される、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記修飾二量体分画および前記修飾単量体分画が、2つの連続アミノ酸残基を結合させる共有結合性化学結合を切断してペプチドを形成させる酵素により消化される、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記タンパク質医薬サンプルが、流加培養、精製プロセスステップ、または製剤化原薬からのサンプルである、本発明1001～1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
抗体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法：
前記抗体を産生する細胞を、前記抗体を産生するのに適した条件下で細胞培養において培養する、工程；
前記抗体を、前記抗体を抽出するのに適した条件下で精製する、工程；
前記抗体と賦形剤を、前記抗体を安定化するのに適した条件下で混合する、工程；
（ｉ）前記細胞培養から、（ｉｉ）前記細胞培養から前記抗体を精製した後に、または（ｉｉｉ）前記精製された抗体に賦形剤を添加した後に、前記抗体のサンプルを取得する、工程；
本発明1001～1015のいずれかの方法に従い、前記抗体の二量体化インターフェースまたは非共有結合性相互作用部位を特徴解析する、工程；および
1つもしくは複数の細胞培養、精製、または賦形剤の条件を変更して、前記抗体の二量体化または非共有結合性相互作用の量を減少させる、工程。
[本発明1017]
二量体化または非共有結合性相互作用の量を減少させるために変更される前記1つまたは複数の条件が、ｐＨ、細胞密度、アミノ酸濃度、浸透圧、成長因子の濃度、撹拌、溶存酸素、金属イオン、ガス分圧、アフィニティマトリクス、クロマトグラフィー樹脂、緩衝剤、界面活性剤、安定剤またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記細胞が、細菌細胞、酵母細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えばＣＨＯ Ｋ1、ＤＸＢ－11 ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ－7）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＶ1細胞、腎細胞（例えばＨＥＫ293、293 ＥＢＮＡ、ＭＳＲ 293、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ21）、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ2細胞、ＷＩ38細胞、ＭＲＣ 5細胞、Ｃｏｌｏ25細胞、ＨＢ 8065細胞、ＨＬ－60細胞、リンパ球細胞、例えば自己Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔリンパ球）またはＤａｕｄｉ（Ｂリンパ球）、Ａ431（表皮）細胞、Ｕ937細胞、3Ｔ3細胞、Ｌ細胞、Ｃ127細胞、ＳＰ2／0細胞、ＮＳ－0細胞、ＭＭＴ細胞、幹細胞、腫瘍細胞、および上述の細胞のいずれかに由来する細胞株からなる群から選択される、本発明1016または1017の方法。
[本発明1019]
前記細胞が、ハイブリドーマ細胞またはクアドローマ細胞である、本発明1016または1017の方法。
[本発明1020]
本発明1012～1015のいずれかの方法により作製される抗体。
[本発明1021]
改変抗体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法：
本発明1001～1015のいずれかの方法を使用して、前記抗体中の二量体化インターフェースまたは非共有結合性相互作用部位を特徴解析する、工程；および
前記二量体化インターフェースまたは非共有結合性相互作用部位のアミノ酸を改変して、前記抗体の二量体化または非共有結合性相互作用を減少させる、工程。
[本発明1022]
本発明1021の改変抗体。
[本発明1023]
前記抗体が、モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である、本発明1021または1022の抗体。
Claims (22)
- タンパク質医薬中の非共有結合性相互作用部位または二量体化インターフェースを特定するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
ネイティブ条件下でタンパク質医薬の制限酵素消化を行い、単量体と非共有結合性二量体とを含有するタンパク質医薬二量体サンプル混合物を形成させる、工程；
前記タンパク質医薬二量体サンプル混合物の前記二量体および前記単量体に、検出可能な修飾を導入して、修飾二量体および修飾単量体を生成する、工程であって、前記検出可能な修飾が、タンパク質の迅速光化学酸化により導入される、工程；
ネイティブサイズ排除クロマトグラフィーを使用して前記修飾二量体および前記修飾単量体を、修飾二量体分画および修飾単量体分画へと分離させる、工程；
前記修飾二量体分画および前記修飾単量体分画を消化して、ペプチドサンプルを形成させる、工程；
液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ－ＭＳ）を使用して前記ペプチドサンプルを分離させ、前記ペプチドサンプルの質量分析データを取得する、工程；および
前記タンパク質医薬の各ペプチドおよび修飾ペプチドの質量を算出することにより、前記タンパク質医薬の公知の質量データと比較された前記ペプチドの前記質量分析データを使用して、前記ペプチドサンプル中の各ペプチドの修飾部位を決定する、工程。 - ネイティブ制限消化条件が、ポリペプチド間のジスルフィド結合、および二量体間の非共有結合性相互作用を保持する、請求項１に記載の方法。
- 前記タンパク質医薬が、抗体もしくはその抗原結合断片、組み換えタンパク質、融合タンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記タンパク質医薬が抗体であり、前記混合物中の前記二量体が本質的に２つの相互作用するＦ（ａｂ’）断片またはＦ（ａｂ）断片からなる、請求項１に記載の方法。
- 前記タンパク質医薬が抗体であり、前記混合物中の前記単量体が本質的にＦ（ａｂ）断片およびＦｃ断片からなる、請求項１に記載の方法。
- 前記修飾が、アミノ酸側鎖の修飾である、請求項１に記載の方法。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体、二特異性抗体、またはその抗原結合断片である、請求項３に記載の方法。
- 前記ネイティブサイズ排除クロマトグラフィーが、酢酸アンモニウムと重炭酸アンモニウムを含有する移動相を使用して実施される、請求項１に記載の方法。
- 前記消化されたタンパク質サンプルが、逆相液体クロマトグラフィーを用いて分離される、請求項１に記載の方法。
- 前記修飾が、酸化、二酸化、三酸化、キヌレニン、ジチオメチル、脱炭酸、ヒドロキシキヌレニン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
- 前記タンパク質医薬が、酵素で消化される、請求項１に記載の方法。
- 前記酵素が、パパイン、フィカイン、エンドプロテアーゼのＬｙｓ－ＣおよびＩｄｅＳ、またはそれらの改変型からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
- 前記修飾二量体分画および前記修飾単量体分画が、２つの連続アミノ酸残基を結合させる共有結合性化学結合を切断してペプチドを形成させる酵素により消化される、請求項１に記載の方法。
- 前記タンパク質医薬サンプルが、流加培養、精製プロセスステップ、または製剤化原薬からのサンプルである、請求項１に記載の方法。
- 抗体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法：
前記抗体を産生する細胞を、前記抗体を産生するのに適した条件下で細胞培養において培養する、工程；
前記抗体を、前記抗体を抽出するのに適した条件下で精製する、工程；
前記抗体と賦形剤を、前記抗体を安定化するのに適した条件下で混合する、工程；
（ｉ）前記細胞培養から、（ｉｉ）前記細胞培養から前記抗体を精製した後に、または（ｉｉｉ）前記精製された抗体に賦形剤を添加した後に、前記抗体のサンプルを取得する、工程；
請求項１に記載の方法に従い、前記抗体の二量体化インターフェースまたは非共有結合性相互作用部位を特徴解析する、工程；および
１つもしくは複数の細胞培養、精製、または賦形剤の条件を変更して、前記抗体の二量体化または非共有結合性相互作用の量を減少させる、工程。 - 二量体化または非共有結合性相互作用の量を減少させるために変更される前記１つまたは複数の条件が、ｐＨ、細胞密度、アミノ酸濃度、浸透圧、成長因子の濃度、撹拌、溶存酸素、金属イオン、ガス分圧、アフィニティマトリクス、クロマトグラフィー樹脂、緩衝剤、界面活性剤、安定剤またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
- 前記細胞が、細菌細胞、酵母細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えばＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ－１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ－７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＶ１細胞、腎細胞（例えばＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ２１）、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＷＩ３８細胞、ＭＲＣ ５細胞、Ｃｏｌｏ２５細胞、ＨＢ ８０６５細胞、ＨＬ－６０細胞、リンパ球細胞、例えば自己Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔリンパ球）またはＤａｕｄｉ（Ｂリンパ球）、Ａ４３１（表皮）細胞、Ｕ９３７細胞、３Ｔ３細胞、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ－０細胞、ＭＭＴ細胞、幹細胞、腫瘍細胞、および上述の細胞のいずれかに由来する細胞株からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
- 前記細胞が、ハイブリドーマ細胞またはクアドローマ細胞である、請求項１５に記載の方法。
- 請求項１５に記載の方法により作製される抗体。
- 改変抗体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法：
請求項１に記載の方法を使用して、前記抗体中の二量体化インターフェースまたは非共有結合性相互作用部位を特徴解析する、工程；および
前記二量体化インターフェースまたは非共有結合性相互作用部位のアミノ酸を改変して、前記抗体の二量体化または非共有結合性相互作用を減少させる、工程。 - 請求項２０に記載の改変抗体。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である、請求項２０に記載の抗体。
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