JPS6210099A - 抗ヒト上皮細胞成長因子モノクロ−ナル抗体およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、ヒト上皮細胞成長因子に対して特異的に反
応するモノクローナル抗体およびその製造方法に関する
。

〔従来の技術〕

細胞融合技術〔ネイチュア−（Ｎａｔｕｒｅ）２５６．
４９５（１９７５）　）が紹介されて以来、この技術を
用いて種々のモノクローナル抗体が造成されており、ヒ
ト上皮細胞成長因子（ｈｕｏ＋ａｎ　Ｅｐｉｄｅｒｍａ
ｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃ−ｔｏｒ／以下ｈ−ＥＧＦと
記す）に対して特異的に反応するモノクローナル抗体が
造成されたとの報告がある〔ハイプリドーマ（Ｈｉｂｒ
ｉｄｏｍａ　、　２．３２１（１９８３）等）。

しかしながら、今までに造成されたｈ−ＥＧＦに対する
モノクローナル抗体は、ヒト尿より抽出されたｈ−ＥＧ
Ｆを抗原として調製された動物のＢリンパ系細胞と腫瘍
細胞との融合によりハイプリドーマを得、このハイプリ
ドーマが産生ずるものとして得られた抗体である。

一般に、ヒト尿中のｈ−ＥＧＦ含量は少なく、不純物が
多いため、ヒト尿からｈ−ＥＧＦを単離精製することは
極めて困難であり、純度の高いｈ−ＥＧＦを十分な量得
ることはできなかった。このため、ヒト尿由来のｈ−Ｅ
ＧＦを用いて効率良く動物を免疫することは困難であり
、従って抗ｈ−ＥＧＦ抗体産生Ｂリンパ球を得ることは
必ずしも容易ではなかった。このため、所望の特異性を
有するハイプリドーマを得るためのスクリーニング方法
も煩雑であり、このようなハイプリドーマを用いて製造
されたモノクローナル抗体はコストの高いものとなった
。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従ってこの発明は、特異性が高い抗ｈ−ＥＧＦモノクロ
ーナル抗体を効率よく低いコストで製造することができ
る方法、及びこの方法により製造される抗ｈ−ＥＧＦモ
ノクローナル抗体を提供しようとするものである。

〔問題点を解決するための手段〕

前記のごとく、従来、高純度のｈ−ＥＧＦを製造するこ
とが出来ず、従って高純度のｈ−ＥＧＦに対するモノク
ローナル抗体の製造を試みることも不可能であった０本
発明者等の共同発明者は、先に遺伝子工学的手法により
９９％以上という非常に高純度に精製されたｈ−ＥＧＦ
を製造する方法を見出しく特願昭６０−２２６３０号明
細書）、この高純度ｈ−ＥＧＦを抗原として用いること
により特異性の高い抗ｈ−ＥＧＦを容易に製造すること
ができることを見出し、この発明を完成した。

従って、この発明は、高純度に精製されたヒト上皮細胞
成長因子に対して産生された、ヒト上皮細胞成長因子と
特異的に反応するがマウス上皮細胞成長因子とは実質上
反応しない抗ヒト上皮細胞成長因子モノクローナル抗体
；及び高純度に精製されたヒト上皮細胞成長因子で免疫
された哺乳動物のＢリンパ系細胞と腫瘍細胞との細胞融
合によって得られたハイプリドーマを培養し、培養液か
らモノクローナル抗体を採取することを特徴とする、ヒ
ト上皮細胞成長因子と特異的に反応するがマウス上皮細
胞成長因子とは実質上反応しない抗ヒト上皮細胞成長因
子モノクローナル抗体の製造方法に関する。

〔具体的な説明〕

世−坑凰　゛ 本発明においては、高純度に精製されたｈ−ＥＧＦを、
抗体産生細胞の調製および所望のモノクローナル抗体の
検出に使用する。ここで「高純度に精製された」とは実
質的に単一であるという意味であり、例えば純度約９０
％以上であり、約９５％以上が好ましく、純度９９％程
度以上のものが一層好ましい。このように高純度に精製
されたｈ−ＥＧＦを大量ニ、かつ従来より低コストで製
造するには、遺伝子工学的手法によりｈ−ＥＧＦ造成し
たのち精製する方法、特に本発明者らの共同研究者らに
より提案された方法〔特願昭６０−２２６３０号の明細
書参照〕に従って行うのが好ましい。この方法は下記の
工程Ａ−Ｃよりなることを特徴とする精製ｈ−ＥＧＦの
製造方法である。すなわち（Ａ）（イ）シグナルペプチ
ドをコードする遺伝子であってその遺伝子の下流側末端
直後にｈ−ＥＧＦの構造遺伝子を結合させ得るものを含
み、かつ予定した宿主細胞内で増殖可能なベクターに、
ｈ−ＥＧＦをコードする遺伝子を組込み、（ｏｌこの組
換体によってダラム陰性微生物を形質転換させ、＆す得
られる形質転換された微生物を、微生物の増殖過程にお
いて対数増殖期の後期から停止期前期にかけて蛋白質合
成能の誘導がおこるのに必要な量の無機燐を含有する培
地での培養に付したのち、これを集め、に）ついでこの
微生物をオスモティック・ショック法によって処理する
ことによりｈ−ＥＧＦを含む両分を回収し；　（Ｂ）回
収されたｈ−ＥＧＦを含む両分をイオン交換クロマトグ
ラフィーに付したのち、ｈ−ＥＧＦ画分を回収し；そし
て（Ｃ）上記で回収されたｈ−ＥＧＦを含む両分をさら
に高速液体クロマトグラフィーに付したのち、ｈ−ＥＧ
Ｆ画分を回収する。

（２）モノクローナル−の１′告 この発明に係るモノクローナル抗体の製造は、以下の通
りである。まず、■動物を高純度のｈ−ＥＧＦで免疫す
ることにより抗体産生細胞を調製し、■この細胞と腫瘍
細胞とを融合させることによりハイプリドーマを得、そ
して■前記の特徴を有する抗ｈ−ＥＧＦモノクローナル
抗体を産生ずるハイブリドーマを選択する。そして■こ
のハイブリドーマを培養して、■培養物から目的とする
抗ｈ−ＥＧＦモノクローナル抗体を得る。なお、上記の
一般的方法それ自体は公知であり、例えば、特公昭５８
−４５４０７、特開昭５９−１２８３９７号各公報及び
ジャーナル・オプ・イムノロジカル・メソズ（Ｊ、　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ）、３９２８５〜３０
Ｂ（１９８０）等に従って行うことができる。

■　抗体産生細胞の調製 抗体産生細胞は、動物を抗原で免疫したのち牌細胞を摘
出し公知の方法〔例えば、底置［メンズ・イン・エンチ
モロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＩＥＮＺ−ＹＭＯＬ
ＯＧＹ）、　７３　、１４（１９８１）アカデミツクブ
レス刊を参照のこと）に従って調製することができる。

また、試験管内でＢリンパ系細胞を抗原で感作すること
によっても調製できる〔特願昭５９−２１２５７８号「
抗体産生細胞の調製法」参照〕。

本発明においては、例えばマウスの腹腔内に抗原として
ｈｌ：ＧＦ　（遺伝子工学的手法により造成され、単離
精製されたもの〕を投与したのち（初回免疫）、１０日
後に免疫操作（追加免疫）を行い、最終免疫から３日後
に動物から牌細胞を摘出後、抗体産生細胞を調製する。

■　細胞融合 上記で調製した抗体産生細胞と腫瘍細胞とを融合剤の存
在下で融合させ継代培養可能なハイブリドーマを得る工
程である。このような細胞融合操作はネイチャー（Ｎｓ
ｔｕｒｅ）　（前記）、ジャーナル・オブ・イムノロジ
カル・メソズ（Ｊ。

Ｉｍ−ｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ）（前記）、底置
「単クローン抗体−ハイブリドーマとｌ！ＬＩＳＡ−ｊ
　ｐ５０〜６０講談社サイエンティフィク刊等を参照し
て行うことができる。本発明の場合は、例えば、上記抗
体産生細胞と腫瘍細胞ｐ３−Ｘ６３−Ａｇｅｎｔ　（Ｐ
２Ｏ３）〔メソズ・イン・エンチモロジ−（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ）、７３．３−４６（
１９８１）　）との融合をＲＰＭＩ−１６４０培地中、
約４０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）存在下で行
う。

■　ハイブリドーマの選択 所望ハイプリドーマの選択は、まず本発明で用いたＰ２
Ｏ３のような腫瘍細胞である場合、ＨＡＴ培地（ヒボキ
サンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有するＲ
ＰＭＩ−１６４０培地）〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ
）、１４５．７０９（１９６４））で行う　〔メソズ・
イン・エンチモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥＮＺ
−ＹＭＯＬＯＧＹ）　、互、１６〜１Ｂ（１９８１））
　。

ついで上記操作で得られたハイブリドーマをさらに培養
し培養上清の分析（抗体の存在の確認）を行うことによ
り所望抗体を産生じているハイブリドーマを選択する。

培養上清の分析は、プラーク法、凝集反応法、ラジオイ
ムノ・アッセイ法等があるが、簡便なものとして通常は
ＥＬＩＳＡ法〔メンズ・イン・エンチモロジ−（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　ｉｎ　ＩＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ）、７０．４
１９−４３９（１９８０）等）によって行われる。

■　ハイブリドーマの培養 常法に従ってハイブリドーマを生育培地〔例えばＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地（１０〜２０％ウシ胎児血清（（Ｆｅ
２））含）〕中で培養するか〔メソズ・イン・エンチモ
ロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ
）。

７３、４２−４３（１９８１））あるいは、ハイブリド
ーマをこの細胞が増殖可能な実験動物（マウス、ラット
等）の腹腔内に投与し生体内で培養することにより行う
〔メンズ・イン・エンチモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ　ｔ！ＮＺＹＭＯＬＯＧＹ）、７３．４３−４４（１
９８１））。

■抗体の回収 抗体は、常法に従って生育培地でハイブリド−マの生育
を行った場合は培養上清より、また、実験動物の生体内
でハイブリドーマの増殖を行った場合は動物の腹水より
、常法（例えば硫安分画法）に従って回収することがで
きる。さらに、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフ
ィー法、アフィニティカラムクロマトグラフイー法、あ
るいはこれらを適宜組み合わせることにより高抗体価の
精製標品を得ることができる〔底置「モノクローナル・
アンティボディズ（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　　ＡＮＴＩ
ＢＯＤＩＥＳ）Ｊ　　４０５（１９８０）、Ｐｌｅｎｕ
ｍＰｒｅｓｓ刊）。

皿−昔異性■羅旧 造成したモノクローナル抗体の種特異性の確認は、ｈ−
ＥＧＦを固定化した系を用い前記ＥＬＩＳＡ法に従って
行うことができる。また、ｈ−ＥＧＦと造成した抗ｈ　
−Ｅ　Ｃ，Ｆモノクローナル抗体との抗原抗体反応とｈ
−ＥＧＦの生物活性である上皮細胞増殖促進能〔プロシ
ーディングズ・オブ・ザ・ナショナルアカデミ−・オブ
・サイエンシイス・オブ・ザ・ユナイティド・ステイク
・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、
　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、）　、７２　、１３１７−１３２
１　（１９７５）　）とを組合せても該抗体の特異性を
確認することができる。例えば、抗ｈ−ＥＧＦモノクロ
ーナル抗体を固定化した系にｈ−ＥＧＦを添加（ここで
抗原抗体反応により系にｈ−ＥＧＦが固定化される）し
たのち、系の上清を回収する。

ついでこの上清を上皮細胞（例えばマウス３Ｔ３細胞）
に作用させ細胞の増殖能を測定する。そしてこの結果と
該抗体を用いずに上記操作を行った対照実験および単に
ｈ−ＥＧＦを上皮細胞に作用させた対照実験の結果とを
比較することにより該抗体の特異性を確認する。

さらに、また、ｈ−ＥＧＦが上皮細胞上に存在するｈ−
ＥＧＦ受容体と結合することおよびｈ−ＥＧＦと抗ｈ−
ＥＧＦモノクローナル抗体との抗原抗体反応とを組合せ
た、いわゆるリセブターアフセイ法（例えばラジオリセ
ブターアッセイ（（ＲＲＡ））法（Ｊ　、　Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅａ＋、　２５７．３０５３−３０６０（１９８２
））　”）を用いてｈ−ＥＧＦの生物活性を測定するこ
とによっても該抗体の特異性を確認することができる。

さらに、同一抗原（ｈ−ＥＧＦ）に対する抗体間の競合
反応を利用することによりその抗体間の抗原部位の特異
性を確認することができる。

（４）　　モノクローナル 前記のようにして、６種類のハイブリドーマ、すなわち
ｌ−２−１１Ｇ　、　２４−４．２４−６．２４−９．
２４−１１、及び？−２−３−３が得られ、それぞれか
らモノクローナル抗体が得られた。これらのモノクロー
ナル抗体はそれぞれそれを産生ずるハイブリドーマと同
一の名称で表示する。これら６種類のバイプリドーマの
特異性を前記のようにして調べたところ、ｌ−２−１１
Ｇ　、２４−４．２４−６．２４−９及び２４−１１は
ｈ−ＥＧＦと特異的に反応し、マウス上皮細胞成長因子
（ｍ−ＥＧＦ）とは実質上反応せず、？−２−３−３は
ｈ−ＥＧＦおよびｍ　−Ｅ　Ｇ　Ｆの両者と反応した。

これら２群の内、本発明はｈ−ＥＧＦと特異的に反応し
ｍ−ＥＧＦとは実質上反応しない前記のタイプのモノク
ローナル抗体に関する。これらモノクローナル抗体はサ
ブクラスがＩｇＧ、であり、その軽鎖がにであった。ま
た、ｈ−ＥＧＦとのみ反応する前記５種類の抗体につい
て抗原決定基との反応性を調べたところ、ｌ−２−１１
Ｇ抗体との競合を示すグリープ２４−４と、ｌ−２−１
１Ｇ抗体との競合を示さないグリープ２４−６．２４−
９、及び２４−１１とに分類された。

〔発明の効果〕

本発明のモノクローナル抗体の製造方法においては抗原
として高純度に精製されたｈ−ＥＧＦを使用するため、
従来技術のヒト尿由来の低純度のｈ−ＥＧＦを使用する
方法に比べて実験動物を免疫することが容易であり、か
つハイブリドーマのスクリーニングも容易となり、従っ
て所望の特異性を有するモノクローナル抗体を産生ずる
ハイブリドーマを効率的に得ることができ、低コストで
モノクローナル抗体を製造することができる。

この発明の抗ｈ−ＥＧＦモノクローナル抗体はｈ−ＥＧ
Ｆとは反応するがｍ−ＥＧＦとは反応せず、その特異性
が極めて高い、従ってｈ−ＥＧＦの精製〔該抗体を用い
たアフィニティ力ラム（その実用的な方法については例
えは公表特許公報昭５９−５００７２０等を参照のこと
）〕はもとより、生化学的および臨床上のｈ−ＥＧＦの
検出〔生体成分（人尿や血液等）中の検出〕等にも使用
することができよう。またｈ−ＥＧＦおよびｍ　−Ｅ　
Ｇ　Ｆのいずれとも反応するモノクローナル抗体と組合
せることにより生化学的実験に広く利用することができ
る。

ス】Ｕ江ム （１）細胞の調製 Ｂａ　１　ｂ／ｃマウスに、遺伝子工学的手法によって
造成し単離されたｈ−ＥＧＦ　（前記特許６０−２２６
３０号参照）３０ｇｇを腹腔内投与することにより免疫
（初回免疫）を行い、以後は１０日間の間隔で追加免疫
を１回行った。最終免疫終了後３日目にマウスより牌細
胞を無菌的に摘出し、この細胞をほぐしてＲＰＭＩ−１
６４０培地に懸濁したのち、ナイロンメツシュで濾過す
ることによりマウス牌細胞懸濁液（２Ｘ１０＃′個／ｍ
１）を調製した。

一方、上記細胞と融合させるマウス腫瘍細胞Ｐ３１Ｊ１
　（フロー社）の懸濁液（ＲＰ旧−１６４０培地）を常
法に従って調製した。

（２）　　細胞融合 上記で調製したマウス牌細胞懸濁液とＰ、Ｕ１細胞懸濁
液とを、牌細胞とＰ、Ｕ１細胞との細胞数の比がｌＯ：
１の割合になるように混合したのち遠心し、上清を除去
した。ついで遠心管底部の細胞に約４０％Ｐ　Ｅ　Ｇ４
０００含有ＰＢＳ　（−）溶液１ｍｊ！をゆっくり滴下
した。これを４分間、３７℃で静置したのち、ＲＰＭＩ
−１６４０（１０％ＦＣ３含）を添加することによりＰ
ＥＧを希釈した。ついで遠心して上滑を除去したのち、
最終的にＰ、Ｕ１細胞の濃度が１．０Ｘ１０’個／　ｍ
　ｌになるようにＲＰＭＩ−１６４０（１０％ＦＣ３含
）で希釈後、９６ウエルのプレートに１００μｌ／ウエ
ルの割合で分注した。なお、このプレートには予めフィ
ーダー細胞として３週齢以内のＢａ　Ｉｌｂ／ｃマウス
の胸腺細胞を５Ｘ１０’個／ウェルの割合で１００μ７
！／ウエルずつ分注しておいた。

（３）　　ハイブリドーマの選択 上記融合操作の翌日から４日間毎日各ウェルの培地の半
量（１００μｍ）ずつをＨＡ　Ｔ培地に交換し、さらに
、１日おきにＨＡＴ培地により培地の交換を行いながら
１０日間培養を行った。なお、上記ＨＡＴ培地は、ｌ？
ＰＭＴ−１６４０培地に１００μＭヒボキサンチン、０
．１ｇＭアミノプテリン、１．６μＭチミジン、１０％
ＦＣ３，５Ｘ　１０−’Ｍ２−メルカプトエタノール、
２ｍＭグルタミン、　　１００ユニツト／　ｍ　ｌペニ
シリン、及びＯｏｌ　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌストレプトマ
イシンを添加したものである。

また、ＰＢＳ　（−）は、塩化ナトリウム８．０ｇ。

リン酸二水素カリウム（無水）０．２ｇ、リン酸−水素
ナトリウム（無水）　１．１５ｇ　、塩化カリウム０．
２ｇを混合し１０１００Ｏ！にしたものである（ｐ１１
７．４）。

ついで培養上清の分析を以下の手順で行った。

（：）分析用プレートの調製 ９６ウエルのプレート（ファルコン社）の各ウェルごと
にコーティング緩衝液（１００ｍＭ　Ｎａ１ｌＣＯ：＋
　。

５０＋Ｉｌ’ｌ　Ｎａ１ＣＯｓ＋　（ｐＨ９，７〜１０
　）　）にン容解したｈ−ＥＧＦ　（０，５ｐ　ｇ／ｍ
ｌ　）及びマウスＥＧＦ（０，５μｇ／ｍｚ）を５０μ
ｊ！ずつ各々分注し、室温で２時間放置後、ＰＢＳ　（
＞　−Ｔｗｅｅｎ〔前記ＰＢＳ　（−）にＴｗｅｅｎ　
２０　（０，５ｍｆ　／　ｌ）を添加したもの）で３回
洗浄した。ついでＰＢＳ（−）（１％ウシ血清アルブミ
ン （Ｂ　Ｓ　Ａ）含有〕を加えて室温で２時間放置したの
ち、ＰＢＳ　（）−Ｔｗｅｅｎ（上記）で洗浄すること
により分析用プレートを調製した。

（ｉｉ　）上清の分析 コロニーの出現したウェルの上滑をとり、上記２種の分
析用プレートに５０μｌ／ウエル添加した。２時間放置
後、Ｐ　Ｂ　Ｓ　（−）−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄したの
ちパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン（
カペル社）５０μ／／ウエ）（、添加し、そして２時間
インキュベート（３７°、５％炭酸ガス）を行った。Ｐ
　Ｂ　Ｓ　（−）　−Ｔｗｅｅｎで５回洗浄したのち、
酵素活性測定のため基質として０．１　Ｍクエン酸緩衝
液（ｐＨ４，２’）にＡＢＴＳ（２，２’−アジノビル
（３−エチルベンゾチアゾリン）−６−スルホン酸）２
．５ｍＭと過酸化水素水５ｍＭとを溶解したものを使用
直前に調製し、これを１００μｌ／ウエルの割合で注入
後室温で５〜１５分間反応を行った。ついで反応を停止
（２ｍＭアジ化ナトリウムを１００μｌ／ウヱルで添加
）したのちタイターチック・マルチスキャンＩ′（フロ
ー社）で００．。、を測定した。

この反応によって陽性反応を示すウェルを６種選択し、
ついで、これら６種のウェル中のコロニーより細胞をと
り出し限界希釈法によってクローニングし、６種類のハ
イブリドーマを樹立した。

（４）　　ハイブリドーマの培養および抗体の回収得ら
れた６種類のハイブリドーマを各々ＲＰＭＩ−１６４０
（１０％ＦＣ３含）培地中、３７℃、５％炭酸ガスの存
在下、炭酸ガスインキュベータで培養し、ついで培養上
清から硫安分画法により抗体を回収した。一方、同細胞
をマウス腹腔内に投与し抗体を腹水とし得、これを硫安
分画により粗分画しＤＥＡＲ−セルロースカラムクロマ
トグラフィー法にて精製抗体を回収した。なお、これら
抗体の特徴づけを行ったところ、第１表に示すような結
果を得た。表中１ｇＧ＋／にの表現は、サブクラスがＩ
ｇＧ、でその軽鎖がにであることを示す。

（５）抗体の特異性の確認 前記のモノクローナル抗体の特異性をＥＬ　Ｉ　ＳＡ法
によって確認した。

９６ウエルのプレート（ファルコン社）にｈ−ＥＧＦお
よびマウスＥＧＦ　（ｍＥＧＦ）を各々コーティング緩
衝液を用いて固定化し、さらに対照として抗原を固定化
していないウェルが同一系内に存在するプレートを用意
した。そしてこのプレートを用いて上記ＥＬＩＳＡ法に
従って本発明で得られた抗体の特異性を確認した。なお
、そのときの抗体（ハイブリドーマｌ−２−１１Ｇ株、
２４−４株、２４−６株、２４−９株、２４−１１株及
び？−２−３−３株由来）の濃度はＰＢＳ　（−）で各
々１．１５＃　ｇ　／　ｍ　１　ニ調製して用いた。そ
のときの各ウェルの上清の吸光度０Ｄ４ｏＳを第２表に
示す。なお、本実験で用いた抗体は、マウス腹水より採
取し、硫安分画を行ったのちＤＥＡＥ−セルロースカラ
ムクロマトグラフィーにより精製したものであり、全て
ＩｇＧ＋／にであり、また抗体濃度も同一である。そし
て第２表中ＯＤ、。、の値は全て対照の値を差し引いた
ものである。

以下余白 第一じＬ−麦 （６）抗原決定基の確認 本発明のｈ−ＥＧＦとのみ反応する５種類のモノクロー
ナル抗体の特徴付けは、以下の方法に従ってその抗体が
認識している抗原決定基特異性を調べることによっても
できる。

ｒ　）　ｌ　ｚｓ　ｉによる抗体の標識株ｌ−２−１１
Ｇより産生され得られた抗体（以下抗体は産生株基で記
載する）１０μｇをＰＩＩＳ（−）５μｌに溶解し、こ
れに０．４　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）　１０　、
ｌ！にＮａ”’！（０，５ｉＣｉ）を溶解したものを加
え、さらにクロラミンＴ（２■／ｍ１０．４Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，４）　）の溶・液５μｌを加えたのち室
温で３０秒混和した。ついで、この混和液にナトリウム
メタビサルフエート２ａ＋ｇ／ｍｌＯ，４Ｍリン緩衝液
（ｐＨ７，４）の溶液５０μｌを加え反応を停止した。

ついでこの溶液に０．２％牛脂仔血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）４５０μｌを加えたのちセファデックスＧ２５カラ
ムクロマトグラフイー（Ｎａｌ！ＳＩの溶出は０．２％
ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液で行った）を行い未反応のＮａ１２
５１ど標識化抗体とを分離した。そしてここで得られた
標識化抗体は２５２８　ｘ　１０’ｃｐｍ／　ｐ　ｇで
あった。

ｉｉ　）競合反応を用いた抗体の特異性の確認ｈＥＧＦ
のみを固定化した各ウェルが切断可能な９６ウエルプレ
ート（グイナテック社）を用意し、各ウェルに１２５１
標識化ｌ−２−１１Ｇ抗体２０μｌ　（１４６６００ｃ
ｐｍ、５．８ｎｇ抗体蛋白量）を加えたのち、各抗体ｌ
−２−１１Ｇ　、　２４−４　、２４−６　、２４−９
および２４−１１を重量比で上記標識化抗体に対して０
．０１゜０．１　　、０．２　、０．５　、１．２　、
５．１０．２０および１００となるように混和し、各ウ
ェルの最終容量が５０μｌとなるように０．２％ＢＳ八
−ＰへＳで調製した。ついでこのプレートを室温で１５
時間放置したのち、ＰＢＳ（−）−Ｔｗｅｅｎで２回洗
浄を行った。ついで各々のウェル中の１２５．１の放射
活性をオートガンマ−カウンターで測定した。その結果
を第１図及び第２図に示す。なお、これらの図中Ｔは反
応系に放射性標識抗体のみを添加した時に抗原と結合し
ている放射性標識抗体のｃｐＩｌｌであり、そしてＢは
上記放射性標識抗体を含む系に非放射性抗体を添加（す
なわち、被検液を添加）したときの、抗原と結合してい
る放射性標識抗体のｃｐｍである。

この結果より、上記で得られた５種の抗体は大きく２つ
のグループに分けられた。すなわち１つはｌ−２−１１
Ｇ抗体と性質の似た抗体２４−４とのグループ、もう１
つはｌ−２−１１Ｇ抗体とあまり競合性を示さない抗体
２４−６　、２４−９および２４−１１のグループであ
る。

髪ム舅　ゞＭｔｐｈ−ＥＧＦの礼装 本発明で用いる高純度ｈ−ＥＧＦは次の方法により製造
した。

形質転換された微生物Ｅ、コリ（ｆ！、ｃｏｌｉ）　Ｋ
　１２ＹＫ５３７（ｐＴＡ　１５２２）を培養し、培養
菌体を集めてオスモティック上清を調製し、ＤＥＡＲ−
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０Ｍを用いるイオン交換クロマ
トグラフィー、及びＨＣＬ　８０３０システムを用いる
高速液体クロマトグラフィーにより精製した。

こうして精製したｈ−ＥＧＦ標品の純度を、常法である
ポリアクリルアミドゲル電気泳動および逆相高速液体ク
ロマトグラフィーにより決定した。

これらの結果より、純度は９９％以上であることがわか
った。そのときの電気泳動の結果は第３図に、高速液体
クロマトグラフィーの結果は第４図に示す通りであった
。なお、第３図中（イ）は電気泳動のゲルを模写したも
のであり、矢印（Ｏ＝）がｈ−ＥＧＦのバンドを示し、
また（口）はデンシトメトリーである。

次に、上記の標品をアミノ酸分析機ＨＬＣ−８２５ＡＡ
（東洋曹達）を用いて行ったところアミノ酸組成が文献
値と完全に一致した。また、−次構造の決定をジャーナ
ル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉ
ｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）　２５６．７９９０−７９９７（
１９８１）の方法に従って行い、さらに二次構造の決定
を行った０以上の結果、本発明で使用したｈ−ＥＧＦの
一次構造及び二次構造は、１９７５年にグレゴリ−が提
唱〔ネイチェアー（Ｎａｔｕｒｅ）、　　２５７．３２
５（１９７５））したもののそれと完全に一致した。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図はこの発明のモノクローナル抗体の抗
原決定基特異性を説明するグラフである。 第３図はこの発明において使用した抗原ｈ−ＥＧＦの純
度を電気泳動により決定した結果であり、図中（イ）は
電気泳動のゲルを模写したものであり、（０）はそのデ
ンシトメトリーである。 第４図はこの発明において使用した抗原ｈ−ＥＧＦの高
速液体クロマトグラフィーの結果を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、高純度に精製されたヒト上皮細胞成長因子に対して
   産生された、ヒト上皮細胞成長因子と特異的に反応する
   がマウス上皮細胞成長因子とは実質上反応しない抗ヒト
   上皮細胞成長因子モノクローナル抗体。 ２、前記高純度に精製されたヒト上皮細胞成長因子が遺
   伝子工学的手法により生産された後９５％以上の高純度
   に精製されたものである特許請求の範囲第１項に記載の
   モノクローナル抗体。 ３、高純度に精製されたヒト上皮細胞成長因子で免疫さ
   れた哺乳動物のＢリンパ系細胞と腫瘍細胞との細胞融合
   によって得られたハイブリドーマを生体外又は生体内で
   培養し、培養液又は腹水からモノクローナル抗体を採取
   することを特徴とする、ヒト上皮細胞成長因子と特異的
   に反応するがマウス上皮細胞成長因子とは実質上反応し
   ない抗ヒト上皮細胞成長因子モノクローナル抗体の製造
   方法。 ４、前記高純度に精製されたヒト上皮細胞成長因子が遺
   伝子工学的手法により生産された後９５％以上の高純度
   に精製されたものである特許請求の範囲第３項記載の方
   法。