JPS6210099A - 抗ヒト上皮細胞成長因子モノクロ−ナル抗体およびその製造方法 - Google Patents
抗ヒト上皮細胞成長因子モノクロ−ナル抗体およびその製造方法Info
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- JPS6210099A JPS6210099A JP14824585A JP14824585A JPS6210099A JP S6210099 A JPS6210099 A JP S6210099A JP 14824585 A JP14824585 A JP 14824585A JP 14824585 A JP14824585 A JP 14824585A JP S6210099 A JPS6210099 A JP S6210099A
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- JP
- Japan
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- growth factor
- epidermal growth
- egf
- human epidermal
- antibody
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
この発明は、ヒト上皮細胞成長因子に対して特異的に反
応するモノクローナル抗体およびその製造方法に関する
。
応するモノクローナル抗体およびその製造方法に関する
。
細胞融合技術〔ネイチュア−(Nature)256.
495(1975) )が紹介されて以来、この技術を
用いて種々のモノクローナル抗体が造成されており、ヒ
ト上皮細胞成長因子(huo+an Epiderma
l Growth Fac−tor/以下h−EGFと
記す)に対して特異的に反応するモノクローナル抗体が
造成されたとの報告がある〔ハイプリドーマ(Hibr
idoma 、 2.321(1983)等)。
495(1975) )が紹介されて以来、この技術を
用いて種々のモノクローナル抗体が造成されており、ヒ
ト上皮細胞成長因子(huo+an Epiderma
l Growth Fac−tor/以下h−EGFと
記す)に対して特異的に反応するモノクローナル抗体が
造成されたとの報告がある〔ハイプリドーマ(Hibr
idoma 、 2.321(1983)等)。
しかしながら、今までに造成されたh−EGFに対する
モノクローナル抗体は、ヒト尿より抽出されたh−EG
Fを抗原として調製された動物のBリンパ系細胞と腫瘍
細胞との融合によりハイプリドーマを得、このハイプリ
ドーマが産生ずるものとして得られた抗体である。
モノクローナル抗体は、ヒト尿より抽出されたh−EG
Fを抗原として調製された動物のBリンパ系細胞と腫瘍
細胞との融合によりハイプリドーマを得、このハイプリ
ドーマが産生ずるものとして得られた抗体である。
一般に、ヒト尿中のh−EGF含量は少なく、不純物が
多いため、ヒト尿からh−EGFを単離精製することは
極めて困難であり、純度の高いh−EGFを十分な量得
ることはできなかった。このため、ヒト尿由来のh−E
GFを用いて効率良く動物を免疫することは困難であり
、従って抗h−EGF抗体産生Bリンパ球を得ることは
必ずしも容易ではなかった。このため、所望の特異性を
有するハイプリドーマを得るためのスクリーニング方法
も煩雑であり、このようなハイプリドーマを用いて製造
されたモノクローナル抗体はコストの高いものとなった
。
多いため、ヒト尿からh−EGFを単離精製することは
極めて困難であり、純度の高いh−EGFを十分な量得
ることはできなかった。このため、ヒト尿由来のh−E
GFを用いて効率良く動物を免疫することは困難であり
、従って抗h−EGF抗体産生Bリンパ球を得ることは
必ずしも容易ではなかった。このため、所望の特異性を
有するハイプリドーマを得るためのスクリーニング方法
も煩雑であり、このようなハイプリドーマを用いて製造
されたモノクローナル抗体はコストの高いものとなった
。
従ってこの発明は、特異性が高い抗h−EGFモノクロ
ーナル抗体を効率よく低いコストで製造することができ
る方法、及びこの方法により製造される抗h−EGFモ
ノクローナル抗体を提供しようとするものである。
ーナル抗体を効率よく低いコストで製造することができ
る方法、及びこの方法により製造される抗h−EGFモ
ノクローナル抗体を提供しようとするものである。
前記のごとく、従来、高純度のh−EGFを製造するこ
とが出来ず、従って高純度のh−EGFに対するモノク
ローナル抗体の製造を試みることも不可能であった0本
発明者等の共同発明者は、先に遺伝子工学的手法により
99%以上という非常に高純度に精製されたh−EGF
を製造する方法を見出しく特願昭60−22630号明
細書)、この高純度h−EGFを抗原として用いること
により特異性の高い抗h−EGFを容易に製造すること
ができることを見出し、この発明を完成した。
とが出来ず、従って高純度のh−EGFに対するモノク
ローナル抗体の製造を試みることも不可能であった0本
発明者等の共同発明者は、先に遺伝子工学的手法により
99%以上という非常に高純度に精製されたh−EGF
を製造する方法を見出しく特願昭60−22630号明
細書)、この高純度h−EGFを抗原として用いること
により特異性の高い抗h−EGFを容易に製造すること
ができることを見出し、この発明を完成した。
従って、この発明は、高純度に精製されたヒト上皮細胞
成長因子に対して産生された、ヒト上皮細胞成長因子と
特異的に反応するがマウス上皮細胞成長因子とは実質上
反応しない抗ヒト上皮細胞成長因子モノクローナル抗体
;及び高純度に精製されたヒト上皮細胞成長因子で免疫
された哺乳動物のBリンパ系細胞と腫瘍細胞との細胞融
合によって得られたハイプリドーマを培養し、培養液か
らモノクローナル抗体を採取することを特徴とする、ヒ
ト上皮細胞成長因子と特異的に反応するがマウス上皮細
胞成長因子とは実質上反応しない抗ヒト上皮細胞成長因
子モノクローナル抗体の製造方法に関する。
成長因子に対して産生された、ヒト上皮細胞成長因子と
特異的に反応するがマウス上皮細胞成長因子とは実質上
反応しない抗ヒト上皮細胞成長因子モノクローナル抗体
;及び高純度に精製されたヒト上皮細胞成長因子で免疫
された哺乳動物のBリンパ系細胞と腫瘍細胞との細胞融
合によって得られたハイプリドーマを培養し、培養液か
らモノクローナル抗体を採取することを特徴とする、ヒ
ト上皮細胞成長因子と特異的に反応するがマウス上皮細
胞成長因子とは実質上反応しない抗ヒト上皮細胞成長因
子モノクローナル抗体の製造方法に関する。
世−坑凰 ゛
本発明においては、高純度に精製されたh−EGFを、
抗体産生細胞の調製および所望のモノクローナル抗体の
検出に使用する。ここで「高純度に精製された」とは実
質的に単一であるという意味であり、例えば純度約90
%以上であり、約95%以上が好ましく、純度99%程
度以上のものが一層好ましい。このように高純度に精製
されたh−EGFを大量ニ、かつ従来より低コストで製
造するには、遺伝子工学的手法によりh−EGF造成し
たのち精製する方法、特に本発明者らの共同研究者らに
より提案された方法〔特願昭60−22630号の明細
書参照〕に従って行うのが好ましい。この方法は下記の
工程A−Cよりなることを特徴とする精製h−EGFの
製造方法である。すなわち(A)(イ)シグナルペプチ
ドをコードする遺伝子であってその遺伝子の下流側末端
直後にh−EGFの構造遺伝子を結合させ得るものを含
み、かつ予定した宿主細胞内で増殖可能なベクターに、
h−EGFをコードする遺伝子を組込み、(olこの組
換体によってダラム陰性微生物を形質転換させ、&す得
られる形質転換された微生物を、微生物の増殖過程にお
いて対数増殖期の後期から停止期前期にかけて蛋白質合
成能の誘導がおこるのに必要な量の無機燐を含有する培
地での培養に付したのち、これを集め、に)ついでこの
微生物をオスモティック・ショック法によって処理する
ことによりh−EGFを含む両分を回収し; (B)回
収されたh−EGFを含む両分をイオン交換クロマトグ
ラフィーに付したのち、h−EGF画分を回収し;そし
て(C)上記で回収されたh−EGFを含む両分をさら
に高速液体クロマトグラフィーに付したのち、h−EG
F画分を回収する。
抗体産生細胞の調製および所望のモノクローナル抗体の
検出に使用する。ここで「高純度に精製された」とは実
質的に単一であるという意味であり、例えば純度約90
%以上であり、約95%以上が好ましく、純度99%程
度以上のものが一層好ましい。このように高純度に精製
されたh−EGFを大量ニ、かつ従来より低コストで製
造するには、遺伝子工学的手法によりh−EGF造成し
たのち精製する方法、特に本発明者らの共同研究者らに
より提案された方法〔特願昭60−22630号の明細
書参照〕に従って行うのが好ましい。この方法は下記の
工程A−Cよりなることを特徴とする精製h−EGFの
製造方法である。すなわち(A)(イ)シグナルペプチ
ドをコードする遺伝子であってその遺伝子の下流側末端
直後にh−EGFの構造遺伝子を結合させ得るものを含
み、かつ予定した宿主細胞内で増殖可能なベクターに、
h−EGFをコードする遺伝子を組込み、(olこの組
換体によってダラム陰性微生物を形質転換させ、&す得
られる形質転換された微生物を、微生物の増殖過程にお
いて対数増殖期の後期から停止期前期にかけて蛋白質合
成能の誘導がおこるのに必要な量の無機燐を含有する培
地での培養に付したのち、これを集め、に)ついでこの
微生物をオスモティック・ショック法によって処理する
ことによりh−EGFを含む両分を回収し; (B)回
収されたh−EGFを含む両分をイオン交換クロマトグ
ラフィーに付したのち、h−EGF画分を回収し;そし
て(C)上記で回収されたh−EGFを含む両分をさら
に高速液体クロマトグラフィーに付したのち、h−EG
F画分を回収する。
(2)モノクローナル−の1′告
この発明に係るモノクローナル抗体の製造は、以下の通
りである。まず、■動物を高純度のh−EGFで免疫す
ることにより抗体産生細胞を調製し、■この細胞と腫瘍
細胞とを融合させることによりハイプリドーマを得、そ
して■前記の特徴を有する抗h−EGFモノクローナル
抗体を産生ずるハイブリドーマを選択する。そして■こ
のハイブリドーマを培養して、■培養物から目的とする
抗h−EGFモノクローナル抗体を得る。なお、上記の
一般的方法それ自体は公知であり、例えば、特公昭58
−45407、特開昭59−128397号各公報及び
ジャーナル・オプ・イムノロジカル・メソズ(J、 I
mmunol、 Methods)、39285〜30
B(1980)等に従って行うことができる。
りである。まず、■動物を高純度のh−EGFで免疫す
ることにより抗体産生細胞を調製し、■この細胞と腫瘍
細胞とを融合させることによりハイプリドーマを得、そ
して■前記の特徴を有する抗h−EGFモノクローナル
抗体を産生ずるハイブリドーマを選択する。そして■こ
のハイブリドーマを培養して、■培養物から目的とする
抗h−EGFモノクローナル抗体を得る。なお、上記の
一般的方法それ自体は公知であり、例えば、特公昭58
−45407、特開昭59−128397号各公報及び
ジャーナル・オプ・イムノロジカル・メソズ(J、 I
mmunol、 Methods)、39285〜30
B(1980)等に従って行うことができる。
■ 抗体産生細胞の調製
抗体産生細胞は、動物を抗原で免疫したのち牌細胞を摘
出し公知の方法〔例えば、底置[メンズ・イン・エンチ
モロジー(Methods in IENZ−YMOL
OGY)、 73 、14(1981)アカデミツクブ
レス刊を参照のこと)に従って調製することができる。
出し公知の方法〔例えば、底置[メンズ・イン・エンチ
モロジー(Methods in IENZ−YMOL
OGY)、 73 、14(1981)アカデミツクブ
レス刊を参照のこと)に従って調製することができる。
また、試験管内でBリンパ系細胞を抗原で感作すること
によっても調製できる〔特願昭59−212578号「
抗体産生細胞の調製法」参照〕。
によっても調製できる〔特願昭59−212578号「
抗体産生細胞の調製法」参照〕。
本発明においては、例えばマウスの腹腔内に抗原として
hl:GF (遺伝子工学的手法により造成され、単離
精製されたもの〕を投与したのち(初回免疫)、10日
後に免疫操作(追加免疫)を行い、最終免疫から3日後
に動物から牌細胞を摘出後、抗体産生細胞を調製する。
hl:GF (遺伝子工学的手法により造成され、単離
精製されたもの〕を投与したのち(初回免疫)、10日
後に免疫操作(追加免疫)を行い、最終免疫から3日後
に動物から牌細胞を摘出後、抗体産生細胞を調製する。
■ 細胞融合
上記で調製した抗体産生細胞と腫瘍細胞とを融合剤の存
在下で融合させ継代培養可能なハイブリドーマを得る工
程である。このような細胞融合操作はネイチャー(Ns
ture) (前記)、ジャーナル・オブ・イムノロジ
カル・メソズ(J。
在下で融合させ継代培養可能なハイブリドーマを得る工
程である。このような細胞融合操作はネイチャー(Ns
ture) (前記)、ジャーナル・オブ・イムノロジ
カル・メソズ(J。
Im−munol、 Methods)(前記)、底置
「単クローン抗体−ハイブリドーマとl!LISA−j
p50〜60講談社サイエンティフィク刊等を参照し
て行うことができる。本発明の場合は、例えば、上記抗
体産生細胞と腫瘍細胞p3−X63−Agent (P
2O3)〔メソズ・イン・エンチモロジ−(Metho
ds inENZYMOLOGY)、73.3−46(
1981) )との融合をRPMI−1640培地中、
約40%ポリエチレングリコール(PEG)存在下で行
う。
「単クローン抗体−ハイブリドーマとl!LISA−j
p50〜60講談社サイエンティフィク刊等を参照し
て行うことができる。本発明の場合は、例えば、上記抗
体産生細胞と腫瘍細胞p3−X63−Agent (P
2O3)〔メソズ・イン・エンチモロジ−(Metho
ds inENZYMOLOGY)、73.3−46(
1981) )との融合をRPMI−1640培地中、
約40%ポリエチレングリコール(PEG)存在下で行
う。
■ ハイブリドーマの選択
所望ハイプリドーマの選択は、まず本発明で用いたP2
O3のような腫瘍細胞である場合、HAT培地(ヒボキ
サンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有するR
PMI−1640培地)〔サイエンス(Science
)、145.709(1964))で行う 〔メソズ・
イン・エンチモロジ−(Methods in ENZ
−YMOLOGY) 、互、16〜1B(1981))
。
O3のような腫瘍細胞である場合、HAT培地(ヒボキ
サンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有するR
PMI−1640培地)〔サイエンス(Science
)、145.709(1964))で行う 〔メソズ・
イン・エンチモロジ−(Methods in ENZ
−YMOLOGY) 、互、16〜1B(1981))
。
ついで上記操作で得られたハイブリドーマをさらに培養
し培養上清の分析(抗体の存在の確認)を行うことによ
り所望抗体を産生じているハイブリドーマを選択する。
し培養上清の分析(抗体の存在の確認)を行うことによ
り所望抗体を産生じているハイブリドーマを選択する。
培養上清の分析は、プラーク法、凝集反応法、ラジオイ
ムノ・アッセイ法等があるが、簡便なものとして通常は
ELISA法〔メンズ・イン・エンチモロジ−(Met
hods in IENZYMOLOGY)、70.4
19−439(1980)等)によって行われる。
ムノ・アッセイ法等があるが、簡便なものとして通常は
ELISA法〔メンズ・イン・エンチモロジ−(Met
hods in IENZYMOLOGY)、70.4
19−439(1980)等)によって行われる。
■ ハイブリドーマの培養
常法に従ってハイブリドーマを生育培地〔例えばRPM
I−1640培地(10〜20%ウシ胎児血清((Fe
2))含)〕中で培養するか〔メソズ・イン・エンチモ
ロジ−(Methods in ENZYMOLOGY
)。
I−1640培地(10〜20%ウシ胎児血清((Fe
2))含)〕中で培養するか〔メソズ・イン・エンチモ
ロジ−(Methods in ENZYMOLOGY
)。
73、42−43(1981))あるいは、ハイブリド
ーマをこの細胞が増殖可能な実験動物(マウス、ラット
等)の腹腔内に投与し生体内で培養することにより行う
〔メンズ・イン・エンチモロジ−(Methods i
n t!NZYMOLOGY)、73.43−44(1
981))。
ーマをこの細胞が増殖可能な実験動物(マウス、ラット
等)の腹腔内に投与し生体内で培養することにより行う
〔メンズ・イン・エンチモロジ−(Methods i
n t!NZYMOLOGY)、73.43−44(1
981))。
■抗体の回収
抗体は、常法に従って生育培地でハイブリド−マの生育
を行った場合は培養上清より、また、実験動物の生体内
でハイブリドーマの増殖を行った場合は動物の腹水より
、常法(例えば硫安分画法)に従って回収することがで
きる。さらに、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフ
ィー法、アフィニティカラムクロマトグラフイー法、あ
るいはこれらを適宜組み合わせることにより高抗体価の
精製標品を得ることができる〔底置「モノクローナル・
アンティボディズ(MONOCLONAL ANTI
BODIES)J 405(1980)、Plenu
mPress刊)。
を行った場合は培養上清より、また、実験動物の生体内
でハイブリドーマの増殖を行った場合は動物の腹水より
、常法(例えば硫安分画法)に従って回収することがで
きる。さらに、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフ
ィー法、アフィニティカラムクロマトグラフイー法、あ
るいはこれらを適宜組み合わせることにより高抗体価の
精製標品を得ることができる〔底置「モノクローナル・
アンティボディズ(MONOCLONAL ANTI
BODIES)J 405(1980)、Plenu
mPress刊)。
皿−昔異性■羅旧
造成したモノクローナル抗体の種特異性の確認は、h−
EGFを固定化した系を用い前記ELISA法に従って
行うことができる。また、h−EGFと造成した抗h
−E C,Fモノクローナル抗体との抗原抗体反応とh
−EGFの生物活性である上皮細胞増殖促進能〔プロシ
ーディングズ・オブ・ザ・ナショナルアカデミ−・オブ
・サイエンシイス・オブ・ザ・ユナイティド・ステイク
・オブ・アメリカ(Proc、 Natl、^cad、
Sci、 USA、) 、72 、1317−132
1 (1975) )とを組合せても該抗体の特異性を
確認することができる。例えば、抗h−EGFモノクロ
ーナル抗体を固定化した系にh−EGFを添加(ここで
抗原抗体反応により系にh−EGFが固定化される)し
たのち、系の上清を回収する。
EGFを固定化した系を用い前記ELISA法に従って
行うことができる。また、h−EGFと造成した抗h
−E C,Fモノクローナル抗体との抗原抗体反応とh
−EGFの生物活性である上皮細胞増殖促進能〔プロシ
ーディングズ・オブ・ザ・ナショナルアカデミ−・オブ
・サイエンシイス・オブ・ザ・ユナイティド・ステイク
・オブ・アメリカ(Proc、 Natl、^cad、
Sci、 USA、) 、72 、1317−132
1 (1975) )とを組合せても該抗体の特異性を
確認することができる。例えば、抗h−EGFモノクロ
ーナル抗体を固定化した系にh−EGFを添加(ここで
抗原抗体反応により系にh−EGFが固定化される)し
たのち、系の上清を回収する。
ついでこの上清を上皮細胞(例えばマウス3T3細胞)
に作用させ細胞の増殖能を測定する。そしてこの結果と
該抗体を用いずに上記操作を行った対照実験および単に
h−EGFを上皮細胞に作用させた対照実験の結果とを
比較することにより該抗体の特異性を確認する。
に作用させ細胞の増殖能を測定する。そしてこの結果と
該抗体を用いずに上記操作を行った対照実験および単に
h−EGFを上皮細胞に作用させた対照実験の結果とを
比較することにより該抗体の特異性を確認する。
さらに、また、h−EGFが上皮細胞上に存在するh−
EGF受容体と結合することおよびh−EGFと抗h−
EGFモノクローナル抗体との抗原抗体反応とを組合せ
た、いわゆるリセブターアフセイ法(例えばラジオリセ
ブターアッセイ((RRA))法(J 、 Biol、
Chea+、 257.3053−3060(1982
)) ”)を用いてh−EGFの生物活性を測定するこ
とによっても該抗体の特異性を確認することができる。
EGF受容体と結合することおよびh−EGFと抗h−
EGFモノクローナル抗体との抗原抗体反応とを組合せ
た、いわゆるリセブターアフセイ法(例えばラジオリセ
ブターアッセイ((RRA))法(J 、 Biol、
Chea+、 257.3053−3060(1982
)) ”)を用いてh−EGFの生物活性を測定するこ
とによっても該抗体の特異性を確認することができる。
さらに、同一抗原(h−EGF)に対する抗体間の競合
反応を利用することによりその抗体間の抗原部位の特異
性を確認することができる。
反応を利用することによりその抗体間の抗原部位の特異
性を確認することができる。
(4) モノクローナル
前記のようにして、6種類のハイブリドーマ、すなわち
l−2−11G 、 24−4.24−6.24−9.
24−11、及び?−2−3−3が得られ、それぞれか
らモノクローナル抗体が得られた。これらのモノクロー
ナル抗体はそれぞれそれを産生ずるハイブリドーマと同
一の名称で表示する。これら6種類のバイプリドーマの
特異性を前記のようにして調べたところ、l−2−11
G 、24−4.24−6.24−9及び24−11は
h−EGFと特異的に反応し、マウス上皮細胞成長因子
(m−EGF)とは実質上反応せず、?−2−3−3は
h−EGFおよびm −E G Fの両者と反応した。
l−2−11G 、 24−4.24−6.24−9.
24−11、及び?−2−3−3が得られ、それぞれか
らモノクローナル抗体が得られた。これらのモノクロー
ナル抗体はそれぞれそれを産生ずるハイブリドーマと同
一の名称で表示する。これら6種類のバイプリドーマの
特異性を前記のようにして調べたところ、l−2−11
G 、24−4.24−6.24−9及び24−11は
h−EGFと特異的に反応し、マウス上皮細胞成長因子
(m−EGF)とは実質上反応せず、?−2−3−3は
h−EGFおよびm −E G Fの両者と反応した。
これら2群の内、本発明はh−EGFと特異的に反応し
m−EGFとは実質上反応しない前記のタイプのモノク
ローナル抗体に関する。これらモノクローナル抗体はサ
ブクラスがIgG、であり、その軽鎖がにであった。ま
た、h−EGFとのみ反応する前記5種類の抗体につい
て抗原決定基との反応性を調べたところ、l−2−11
G抗体との競合を示すグリープ24−4と、l−2−1
1G抗体との競合を示さないグリープ24−6.24−
9、及び24−11とに分類された。
m−EGFとは実質上反応しない前記のタイプのモノク
ローナル抗体に関する。これらモノクローナル抗体はサ
ブクラスがIgG、であり、その軽鎖がにであった。ま
た、h−EGFとのみ反応する前記5種類の抗体につい
て抗原決定基との反応性を調べたところ、l−2−11
G抗体との競合を示すグリープ24−4と、l−2−1
1G抗体との競合を示さないグリープ24−6.24−
9、及び24−11とに分類された。
本発明のモノクローナル抗体の製造方法においては抗原
として高純度に精製されたh−EGFを使用するため、
従来技術のヒト尿由来の低純度のh−EGFを使用する
方法に比べて実験動物を免疫することが容易であり、か
つハイブリドーマのスクリーニングも容易となり、従っ
て所望の特異性を有するモノクローナル抗体を産生ずる
ハイブリドーマを効率的に得ることができ、低コストで
モノクローナル抗体を製造することができる。
として高純度に精製されたh−EGFを使用するため、
従来技術のヒト尿由来の低純度のh−EGFを使用する
方法に比べて実験動物を免疫することが容易であり、か
つハイブリドーマのスクリーニングも容易となり、従っ
て所望の特異性を有するモノクローナル抗体を産生ずる
ハイブリドーマを効率的に得ることができ、低コストで
モノクローナル抗体を製造することができる。
この発明の抗h−EGFモノクローナル抗体はh−EG
Fとは反応するがm−EGFとは反応せず、その特異性
が極めて高い、従ってh−EGFの精製〔該抗体を用い
たアフィニティ力ラム(その実用的な方法については例
えは公表特許公報昭59−500720等を参照のこと
)〕はもとより、生化学的および臨床上のh−EGFの
検出〔生体成分(人尿や血液等)中の検出〕等にも使用
することができよう。またh−EGFおよびm −E
G Fのいずれとも反応するモノクローナル抗体と組合
せることにより生化学的実験に広く利用することができ
る。
Fとは反応するがm−EGFとは反応せず、その特異性
が極めて高い、従ってh−EGFの精製〔該抗体を用い
たアフィニティ力ラム(その実用的な方法については例
えは公表特許公報昭59−500720等を参照のこと
)〕はもとより、生化学的および臨床上のh−EGFの
検出〔生体成分(人尿や血液等)中の検出〕等にも使用
することができよう。またh−EGFおよびm −E
G Fのいずれとも反応するモノクローナル抗体と組合
せることにより生化学的実験に広く利用することができ
る。
ス】U江ム
(1)細胞の調製
Ba 1 b/cマウスに、遺伝子工学的手法によって
造成し単離されたh−EGF (前記特許60−226
30号参照)30ggを腹腔内投与することにより免疫
(初回免疫)を行い、以後は10日間の間隔で追加免疫
を1回行った。最終免疫終了後3日目にマウスより牌細
胞を無菌的に摘出し、この細胞をほぐしてRPMI−1
640培地に懸濁したのち、ナイロンメツシュで濾過す
ることによりマウス牌細胞懸濁液(2X10#′個/m
1)を調製した。
造成し単離されたh−EGF (前記特許60−226
30号参照)30ggを腹腔内投与することにより免疫
(初回免疫)を行い、以後は10日間の間隔で追加免疫
を1回行った。最終免疫終了後3日目にマウスより牌細
胞を無菌的に摘出し、この細胞をほぐしてRPMI−1
640培地に懸濁したのち、ナイロンメツシュで濾過す
ることによりマウス牌細胞懸濁液(2X10#′個/m
1)を調製した。
一方、上記細胞と融合させるマウス腫瘍細胞P31J1
(フロー社)の懸濁液(RP旧−1640培地)を常
法に従って調製した。
(フロー社)の懸濁液(RP旧−1640培地)を常
法に従って調製した。
(2) 細胞融合
上記で調製したマウス牌細胞懸濁液とP、U1細胞懸濁
液とを、牌細胞とP、U1細胞との細胞数の比がlO:
1の割合になるように混合したのち遠心し、上清を除去
した。ついで遠心管底部の細胞に約40%P E G4
000含有PBS (−)溶液1mj!をゆっくり滴下
した。これを4分間、37℃で静置したのち、RPMI
−1640(10%FC3含)を添加することによりP
EGを希釈した。ついで遠心して上滑を除去したのち、
最終的にP、U1細胞の濃度が1.0X10’個/ m
lになるようにRPMI−1640(10%FC3含
)で希釈後、96ウエルのプレートに100μl/ウエ
ルの割合で分注した。なお、このプレートには予めフィ
ーダー細胞として3週齢以内のBa Ilb/cマウス
の胸腺細胞を5X10’個/ウェルの割合で100μ7
!/ウエルずつ分注しておいた。
液とを、牌細胞とP、U1細胞との細胞数の比がlO:
1の割合になるように混合したのち遠心し、上清を除去
した。ついで遠心管底部の細胞に約40%P E G4
000含有PBS (−)溶液1mj!をゆっくり滴下
した。これを4分間、37℃で静置したのち、RPMI
−1640(10%FC3含)を添加することによりP
EGを希釈した。ついで遠心して上滑を除去したのち、
最終的にP、U1細胞の濃度が1.0X10’個/ m
lになるようにRPMI−1640(10%FC3含
)で希釈後、96ウエルのプレートに100μl/ウエ
ルの割合で分注した。なお、このプレートには予めフィ
ーダー細胞として3週齢以内のBa Ilb/cマウス
の胸腺細胞を5X10’個/ウェルの割合で100μ7
!/ウエルずつ分注しておいた。
(3) ハイブリドーマの選択
上記融合操作の翌日から4日間毎日各ウェルの培地の半
量(100μm)ずつをHA T培地に交換し、さらに
、1日おきにHAT培地により培地の交換を行いながら
10日間培養を行った。なお、上記HAT培地は、l?
PMT−1640培地に100μMヒボキサンチン、0
.1gMアミノプテリン、1.6μMチミジン、10%
FC3,5X 10−’M2−メルカプトエタノール、
2mMグルタミン、 100ユニツト/ m lペニ
シリン、及びOol m g / m lストレプトマ
イシンを添加したものである。
量(100μm)ずつをHA T培地に交換し、さらに
、1日おきにHAT培地により培地の交換を行いながら
10日間培養を行った。なお、上記HAT培地は、l?
PMT−1640培地に100μMヒボキサンチン、0
.1gMアミノプテリン、1.6μMチミジン、10%
FC3,5X 10−’M2−メルカプトエタノール、
2mMグルタミン、 100ユニツト/ m lペニ
シリン、及びOol m g / m lストレプトマ
イシンを添加したものである。
また、PBS (−)は、塩化ナトリウム8.0g。
リン酸二水素カリウム(無水)0.2g、リン酸−水素
ナトリウム(無水) 1.15g 、塩化カリウム0.
2gを混合し10100O!にしたものである(p11
7.4)。
ナトリウム(無水) 1.15g 、塩化カリウム0.
2gを混合し10100O!にしたものである(p11
7.4)。
ついで培養上清の分析を以下の手順で行った。
(:)分析用プレートの調製
96ウエルのプレート(ファルコン社)の各ウェルごと
にコーティング緩衝液(100mM Na1lCO:+
。
にコーティング緩衝液(100mM Na1lCO:+
。
50+Il’l Na1COs+ (pH9,7〜10
) )にン容解したh−EGF (0,5p g/m
l )及びマウスEGF(0,5μg/mz)を50μ
j!ずつ各々分注し、室温で2時間放置後、PBS (
> −Tween〔前記PBS (−)にTween
20 (0,5mf / l)を添加したもの)で3回
洗浄した。ついでPBS(−)(1%ウシ血清アルブミ
ン (B S A)含有〕を加えて室温で2時間放置したの
ち、PBS ()−Tween(上記)で洗浄すること
により分析用プレートを調製した。
) )にン容解したh−EGF (0,5p g/m
l )及びマウスEGF(0,5μg/mz)を50μ
j!ずつ各々分注し、室温で2時間放置後、PBS (
> −Tween〔前記PBS (−)にTween
20 (0,5mf / l)を添加したもの)で3回
洗浄した。ついでPBS(−)(1%ウシ血清アルブミ
ン (B S A)含有〕を加えて室温で2時間放置したの
ち、PBS ()−Tween(上記)で洗浄すること
により分析用プレートを調製した。
(ii )上清の分析
コロニーの出現したウェルの上滑をとり、上記2種の分
析用プレートに50μl/ウエル添加した。2時間放置
後、P B S (−)−Tweenで3回洗浄したの
ちパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン(
カペル社)50μ//ウエ)(、添加し、そして2時間
インキュベート(37°、5%炭酸ガス)を行った。P
B S (−) −Tweenで5回洗浄したのち、
酵素活性測定のため基質として0.1 Mクエン酸緩衝
液(pH4,2’)にABTS(2,2’−アジノビル
(3−エチルベンゾチアゾリン)−6−スルホン酸)2
.5mMと過酸化水素水5mMとを溶解したものを使用
直前に調製し、これを100μl/ウエルの割合で注入
後室温で5〜15分間反応を行った。ついで反応を停止
(2mMアジ化ナトリウムを100μl/ウヱルで添加
)したのちタイターチック・マルチスキャンI′(フロ
ー社)で00.。、を測定した。
析用プレートに50μl/ウエル添加した。2時間放置
後、P B S (−)−Tweenで3回洗浄したの
ちパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン(
カペル社)50μ//ウエ)(、添加し、そして2時間
インキュベート(37°、5%炭酸ガス)を行った。P
B S (−) −Tweenで5回洗浄したのち、
酵素活性測定のため基質として0.1 Mクエン酸緩衝
液(pH4,2’)にABTS(2,2’−アジノビル
(3−エチルベンゾチアゾリン)−6−スルホン酸)2
.5mMと過酸化水素水5mMとを溶解したものを使用
直前に調製し、これを100μl/ウエルの割合で注入
後室温で5〜15分間反応を行った。ついで反応を停止
(2mMアジ化ナトリウムを100μl/ウヱルで添加
)したのちタイターチック・マルチスキャンI′(フロ
ー社)で00.。、を測定した。
この反応によって陽性反応を示すウェルを6種選択し、
ついで、これら6種のウェル中のコロニーより細胞をと
り出し限界希釈法によってクローニングし、6種類のハ
イブリドーマを樹立した。
ついで、これら6種のウェル中のコロニーより細胞をと
り出し限界希釈法によってクローニングし、6種類のハ
イブリドーマを樹立した。
(4) ハイブリドーマの培養および抗体の回収得ら
れた6種類のハイブリドーマを各々RPMI−1640
(10%FC3含)培地中、37℃、5%炭酸ガスの存
在下、炭酸ガスインキュベータで培養し、ついで培養上
清から硫安分画法により抗体を回収した。一方、同細胞
をマウス腹腔内に投与し抗体を腹水とし得、これを硫安
分画により粗分画しDEAR−セルロースカラムクロマ
トグラフィー法にて精製抗体を回収した。なお、これら
抗体の特徴づけを行ったところ、第1表に示すような結
果を得た。表中1gG+/にの表現は、サブクラスがI
gG、でその軽鎖がにであることを示す。
れた6種類のハイブリドーマを各々RPMI−1640
(10%FC3含)培地中、37℃、5%炭酸ガスの存
在下、炭酸ガスインキュベータで培養し、ついで培養上
清から硫安分画法により抗体を回収した。一方、同細胞
をマウス腹腔内に投与し抗体を腹水とし得、これを硫安
分画により粗分画しDEAR−セルロースカラムクロマ
トグラフィー法にて精製抗体を回収した。なお、これら
抗体の特徴づけを行ったところ、第1表に示すような結
果を得た。表中1gG+/にの表現は、サブクラスがI
gG、でその軽鎖がにであることを示す。
(5)抗体の特異性の確認
前記のモノクローナル抗体の特異性をEL I SA法
によって確認した。
によって確認した。
96ウエルのプレート(ファルコン社)にh−EGFお
よびマウスEGF (mEGF)を各々コーティング緩
衝液を用いて固定化し、さらに対照として抗原を固定化
していないウェルが同一系内に存在するプレートを用意
した。そしてこのプレートを用いて上記ELISA法に
従って本発明で得られた抗体の特異性を確認した。なお
、そのときの抗体(ハイブリドーマl−2−11G株、
24−4株、24−6株、24−9株、24−11株及
び?−2−3−3株由来)の濃度はPBS (−)で各
々1.15# g / m 1 ニ調製して用いた。そ
のときの各ウェルの上清の吸光度0D4oSを第2表に
示す。なお、本実験で用いた抗体は、マウス腹水より採
取し、硫安分画を行ったのちDEAE−セルロースカラ
ムクロマトグラフィーにより精製したものであり、全て
IgG+/にであり、また抗体濃度も同一である。そし
て第2表中OD、。、の値は全て対照の値を差し引いた
ものである。
よびマウスEGF (mEGF)を各々コーティング緩
衝液を用いて固定化し、さらに対照として抗原を固定化
していないウェルが同一系内に存在するプレートを用意
した。そしてこのプレートを用いて上記ELISA法に
従って本発明で得られた抗体の特異性を確認した。なお
、そのときの抗体(ハイブリドーマl−2−11G株、
24−4株、24−6株、24−9株、24−11株及
び?−2−3−3株由来)の濃度はPBS (−)で各
々1.15# g / m 1 ニ調製して用いた。そ
のときの各ウェルの上清の吸光度0D4oSを第2表に
示す。なお、本実験で用いた抗体は、マウス腹水より採
取し、硫安分画を行ったのちDEAE−セルロースカラ
ムクロマトグラフィーにより精製したものであり、全て
IgG+/にであり、また抗体濃度も同一である。そし
て第2表中OD、。、の値は全て対照の値を差し引いた
ものである。
以下余白
第一じL−麦
(6)抗原決定基の確認
本発明のh−EGFとのみ反応する5種類のモノクロー
ナル抗体の特徴付けは、以下の方法に従ってその抗体が
認識している抗原決定基特異性を調べることによっても
できる。
ナル抗体の特徴付けは、以下の方法に従ってその抗体が
認識している抗原決定基特異性を調べることによっても
できる。
r ) l zs iによる抗体の標識株l−2−11
Gより産生され得られた抗体(以下抗体は産生株基で記
載する)10μgをPIIS(−)5μlに溶解し、こ
れに0.4 Mリン酸緩衝液(pH7,4) 10 、
l!にNa”’!(0,5iCi)を溶解したものを加
え、さらにクロラミンT(2■/m10.4Mリン酸緩
衝液(pH7,4) )の溶・液5μlを加えたのち室
温で30秒混和した。ついで、この混和液にナトリウム
メタビサルフエート2a+g/mlO,4Mリン緩衝液
(pH7,4)の溶液50μlを加え反応を停止した。
Gより産生され得られた抗体(以下抗体は産生株基で記
載する)10μgをPIIS(−)5μlに溶解し、こ
れに0.4 Mリン酸緩衝液(pH7,4) 10 、
l!にNa”’!(0,5iCi)を溶解したものを加
え、さらにクロラミンT(2■/m10.4Mリン酸緩
衝液(pH7,4) )の溶・液5μlを加えたのち室
温で30秒混和した。ついで、この混和液にナトリウム
メタビサルフエート2a+g/mlO,4Mリン緩衝液
(pH7,4)の溶液50μlを加え反応を停止した。
ついでこの溶液に0.2%牛脂仔血清アルブミン(BS
A)450μlを加えたのちセファデックスG25カラ
ムクロマトグラフイー(Nal!SIの溶出は0.2%
BSA−PBS溶液で行った)を行い未反応のNa12
51ど標識化抗体とを分離した。そしてここで得られた
標識化抗体は2528 x 10’cpm/ p gで
あった。
A)450μlを加えたのちセファデックスG25カラ
ムクロマトグラフイー(Nal!SIの溶出は0.2%
BSA−PBS溶液で行った)を行い未反応のNa12
51ど標識化抗体とを分離した。そしてここで得られた
標識化抗体は2528 x 10’cpm/ p gで
あった。
ii )競合反応を用いた抗体の特異性の確認hEGF
のみを固定化した各ウェルが切断可能な96ウエルプレ
ート(グイナテック社)を用意し、各ウェルに1251
標識化l−2−11G抗体20μl (146600c
pm、5.8ng抗体蛋白量)を加えたのち、各抗体l
−2−11G 、 24−4 、24−6 、24−9
および24−11を重量比で上記標識化抗体に対して0
.01゜0.1 、0.2 、0.5 、1.2 、
5.10.20および100となるように混和し、各ウ
ェルの最終容量が50μlとなるように0.2%BS八
−PへSで調製した。ついでこのプレートを室温で15
時間放置したのち、PBS(−)−Tweenで2回洗
浄を行った。ついで各々のウェル中の125.1の放射
活性をオートガンマ−カウンターで測定した。その結果
を第1図及び第2図に示す。なお、これらの図中Tは反
応系に放射性標識抗体のみを添加した時に抗原と結合し
ている放射性標識抗体のcpIllであり、そしてBは
上記放射性標識抗体を含む系に非放射性抗体を添加(す
なわち、被検液を添加)したときの、抗原と結合してい
る放射性標識抗体のcpmである。
のみを固定化した各ウェルが切断可能な96ウエルプレ
ート(グイナテック社)を用意し、各ウェルに1251
標識化l−2−11G抗体20μl (146600c
pm、5.8ng抗体蛋白量)を加えたのち、各抗体l
−2−11G 、 24−4 、24−6 、24−9
および24−11を重量比で上記標識化抗体に対して0
.01゜0.1 、0.2 、0.5 、1.2 、
5.10.20および100となるように混和し、各ウ
ェルの最終容量が50μlとなるように0.2%BS八
−PへSで調製した。ついでこのプレートを室温で15
時間放置したのち、PBS(−)−Tweenで2回洗
浄を行った。ついで各々のウェル中の125.1の放射
活性をオートガンマ−カウンターで測定した。その結果
を第1図及び第2図に示す。なお、これらの図中Tは反
応系に放射性標識抗体のみを添加した時に抗原と結合し
ている放射性標識抗体のcpIllであり、そしてBは
上記放射性標識抗体を含む系に非放射性抗体を添加(す
なわち、被検液を添加)したときの、抗原と結合してい
る放射性標識抗体のcpmである。
この結果より、上記で得られた5種の抗体は大きく2つ
のグループに分けられた。すなわち1つはl−2−11
G抗体と性質の似た抗体24−4とのグループ、もう1
つはl−2−11G抗体とあまり競合性を示さない抗体
24−6 、24−9および24−11のグループであ
る。
のグループに分けられた。すなわち1つはl−2−11
G抗体と性質の似た抗体24−4とのグループ、もう1
つはl−2−11G抗体とあまり競合性を示さない抗体
24−6 、24−9および24−11のグループであ
る。
髪ム舅 ゞMtph−EGFの礼装
本発明で用いる高純度h−EGFは次の方法により製造
した。
した。
形質転換された微生物E、コリ(f!、coli) K
12YK537(pTA 1522)を培養し、培養
菌体を集めてオスモティック上清を調製し、DEAR−
TOYOPEARL650Mを用いるイオン交換クロマ
トグラフィー、及びHCL 8030システムを用いる
高速液体クロマトグラフィーにより精製した。
12YK537(pTA 1522)を培養し、培養
菌体を集めてオスモティック上清を調製し、DEAR−
TOYOPEARL650Mを用いるイオン交換クロマ
トグラフィー、及びHCL 8030システムを用いる
高速液体クロマトグラフィーにより精製した。
こうして精製したh−EGF標品の純度を、常法である
ポリアクリルアミドゲル電気泳動および逆相高速液体ク
ロマトグラフィーにより決定した。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動および逆相高速液体ク
ロマトグラフィーにより決定した。
これらの結果より、純度は99%以上であることがわか
った。そのときの電気泳動の結果は第3図に、高速液体
クロマトグラフィーの結果は第4図に示す通りであった
。なお、第3図中(イ)は電気泳動のゲルを模写したも
のであり、矢印(O=)がh−EGFのバンドを示し、
また(口)はデンシトメトリーである。
った。そのときの電気泳動の結果は第3図に、高速液体
クロマトグラフィーの結果は第4図に示す通りであった
。なお、第3図中(イ)は電気泳動のゲルを模写したも
のであり、矢印(O=)がh−EGFのバンドを示し、
また(口)はデンシトメトリーである。
次に、上記の標品をアミノ酸分析機HLC−825AA
(東洋曹達)を用いて行ったところアミノ酸組成が文献
値と完全に一致した。また、−次構造の決定をジャーナ
ル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー(J、 Bi
ol、 Chew、) 256.7990−7997(
1981)の方法に従って行い、さらに二次構造の決定
を行った0以上の結果、本発明で使用したh−EGFの
一次構造及び二次構造は、1975年にグレゴリ−が提
唱〔ネイチェアー(Nature)、 257.32
5(1975))したもののそれと完全に一致した。
(東洋曹達)を用いて行ったところアミノ酸組成が文献
値と完全に一致した。また、−次構造の決定をジャーナ
ル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー(J、 Bi
ol、 Chew、) 256.7990−7997(
1981)の方法に従って行い、さらに二次構造の決定
を行った0以上の結果、本発明で使用したh−EGFの
一次構造及び二次構造は、1975年にグレゴリ−が提
唱〔ネイチェアー(Nature)、 257.32
5(1975))したもののそれと完全に一致した。
第1図及び第2図はこの発明のモノクローナル抗体の抗
原決定基特異性を説明するグラフである。 第3図はこの発明において使用した抗原h−EGFの純
度を電気泳動により決定した結果であり、図中(イ)は
電気泳動のゲルを模写したものであり、(0)はそのデ
ンシトメトリーである。 第4図はこの発明において使用した抗原h−EGFの高
速液体クロマトグラフィーの結果を示す。
原決定基特異性を説明するグラフである。 第3図はこの発明において使用した抗原h−EGFの純
度を電気泳動により決定した結果であり、図中(イ)は
電気泳動のゲルを模写したものであり、(0)はそのデ
ンシトメトリーである。 第4図はこの発明において使用した抗原h−EGFの高
速液体クロマトグラフィーの結果を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、高純度に精製されたヒト上皮細胞成長因子に対して
産生された、ヒト上皮細胞成長因子と特異的に反応する
がマウス上皮細胞成長因子とは実質上反応しない抗ヒト
上皮細胞成長因子モノクローナル抗体。 2、前記高純度に精製されたヒト上皮細胞成長因子が遺
伝子工学的手法により生産された後95%以上の高純度
に精製されたものである特許請求の範囲第1項に記載の
モノクローナル抗体。 3、高純度に精製されたヒト上皮細胞成長因子で免疫さ
れた哺乳動物のBリンパ系細胞と腫瘍細胞との細胞融合
によって得られたハイブリドーマを生体外又は生体内で
培養し、培養液又は腹水からモノクローナル抗体を採取
することを特徴とする、ヒト上皮細胞成長因子と特異的
に反応するがマウス上皮細胞成長因子とは実質上反応し
ない抗ヒト上皮細胞成長因子モノクローナル抗体の製造
方法。 4、前記高純度に精製されたヒト上皮細胞成長因子が遺
伝子工学的手法により生産された後95%以上の高純度
に精製されたものである特許請求の範囲第3項記載の方
法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP14824585A JPS6210099A (ja) | 1985-07-08 | 1985-07-08 | 抗ヒト上皮細胞成長因子モノクロ−ナル抗体およびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP14824585A JPS6210099A (ja) | 1985-07-08 | 1985-07-08 | 抗ヒト上皮細胞成長因子モノクロ−ナル抗体およびその製造方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6210099A true JPS6210099A (ja) | 1987-01-19 |
Family
ID=15448479
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP14824585A Pending JPS6210099A (ja) | 1985-07-08 | 1985-07-08 | 抗ヒト上皮細胞成長因子モノクロ−ナル抗体およびその製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6210099A (ja) |
-
1985
- 1985-07-08 JP JP14824585A patent/JPS6210099A/ja active Pending
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