JPWO2018061484A1 - 血液サンプル中の分析対象物を検出するための、方法、組成物およびチップ - Google Patents
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Abstract
【選択図】図7B
Description
(1)前記血液サンプルを準備すること、
(2)屈折率調整剤を前記血液サンプルに溶解させることにより、赤血球と赤血球外液との屈折率差を減少させた分析サンプルを得ること、ならびに
(3)前記分析サンプルを用いて、前記分析対象物を検出すること、
を含む、方法に関する。
(1)前記血液サンプルを準備すること、
(2)屈折率調整剤を前記血液サンプルに溶解させることにより、赤血球と赤血球外液との屈折率差を減少させた分析サンプルを得ること、ならびに
(3)前記分析サンプルを用いて、前記分析対象物を検出すること、
を含む、方法に関する。
本発明の一側面は、血液サンプル中の分析対象物を検出する方法であって、
(1)前記血液サンプルを準備すること、
(2)屈折率調整剤を前記血液サンプルに溶解させることにより、赤血球と赤血球外液との屈折率差を減少させた分析サンプルを得ること、ならびに
(3)前記分析サンプルを用いて、前記分析対象物を検出すること、
を含む、方法に関する。本発明の一側面にかかる方法では、赤血球を含む血液サンプルが使用される。本発明の一側面にかかる方法によると、かような赤血球を含むサンプルであっても、血液成分の分画を必要とせずに、分析対象物を高精度に検出し得る。
(1)血液サンプルを準備すること、
(2)屈折率調整剤を前記血液サンプルに溶解させて、透過率50%以上である波長を700nm〜950nmの範囲内に有する分析サンプルを調製すること、ならびに
(3)前記分析サンプルを用いて、前記分析対象物を検出すること、
を含む、血液サンプル中の分析対象物を検出する方法が提供される。
本発明の別の側面は、血液サンプル中の分析対象物を検出するための組成物であって、発色試薬、酸化還元酵素、および屈折率調整剤を含む、組成物に関する。
酸化還元酵素と電子キャリアーとの組み合わせは特に制限されず、目的に応じて適宜設定され得るが、例えば、GDH/フェナジンメトサルフェートの組み合わせ、GDH/1−メトキシ−5−メチルフェナジニウムメチルサルフェートの組み合わせ、GDH/フェリシアン化カリウムの組み合わせ、GDH/ルテニウム錯体の組み合わせ、GOD/フェリシアン化カリウムの組み合わせ、コレステロールデヒドロゲナーゼ/フェロセンの組み合わせ、グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ/ジアホラーゼの組み合わせ等が例示できる。
本発明の第3の側面は、血液サンプル中の分析対象物の検出用チップであって、発色試薬、酸化還元酵素、および屈折率調整剤を含む反応部を有する、チップに関する。
0〜350mg/mlの範囲内で複数の濃度に調製した水溶液を、各屈折率調整剤について用意した。屈折計PAL−RI(株式会社アタゴ)で、各水溶液の屈折率を求めた。横軸に各水溶液の濃度を、縦軸に屈折率を屈折率調整剤毎にプロットした図を作成し、近似直線の傾きを求めた(表1「屈折率上昇能力」の値は、1[mg/ml]あたりの屈折率増加量を指し、傾きが大きいほど屈折率調整剤の屈折率上昇能力が高いことを表す)。その結果を表1に示す。なお、表1において「測定不可」とは、沈殿の発生により水溶液を作製できなかったことを意味する。
1.0mlの血液サンプル(ヘマトクリット値:40)から、400μL分の血漿を回収した。回収した400μLの血漿に対して、濃度が125mMとなるように屈折率調整剤を添加した。屈折率調整剤添加後の血漿を元の血液サンプルと合一して、転倒混和した(血液サンプル中の屈折率調整剤の濃度は50mMとなる)。転倒混和から5分後のサンプルをヘマトクリット管に充填し、ヘマトクリット遠心器にて11×103rpmで5分間遠心分離した。遠心分離後のヘマトクリット値(Ht)を読み取った。屈折率調整剤添加前のヘマトクリット値(=40)から遠心分離後のヘマトクリット値(Ht)を差し引いてヘマトクリット値変化量(ΔHt)を求めた(ΔHtが大きいほど、屈折率調整剤の赤血球縮小能力が高いことを表す)。その結果を表1に示す。なお、表1中、「測定不可」は、屈折率調整剤の溶解度が低く測定できなかったことを示す。
スペクトル測定に用いた評価システムの概要を以下に示す。また、評価システムの概要を図6に示す:
光源 ハロゲン光源 SPL−2H(ケイエルブイ株式会社)
ファイバコネクタ SMA
適合ファイバ:コア径=200μ以上
分光計 小型ファイバ光学分光器 USB2000+(Ocean Optics社)
ディテクタ範囲 200〜1100nm。
血糖値検出用チップの製造工程において、塗膜形成後乾燥前に、目視にて析出物の有無を確認した。
表1に示す屈折率調整剤の溶解度は、20℃における水に対する溶解度である。なお、表1における「×」は、20℃における水に対する溶解度が50mM以下を意味する。
35μkat(2104U)のグルコースデヒドロゲナーゼ(酸化還元酵素;FAD−GDH GDL−351、東洋紡株式会社)、12.5μmolの2−ベンゾチアゾリル−3−(4−カルボキシ−2−メトキシフェニル)−5−[4−(2−スルホエチルカルバモイル)フェニル]−2H−テトラゾリウムナトリウム塩(発色試薬;WST−4、吸収ピーク波長 650nm)、0.25μmolの1−メトキシ−5−メチルフェナジニウムメチルサルフェート(電子キャリアー;m−PMS)、および22.5μmolのAcid Yellow 23(屈折率調整剤;AY23)を162.5μlの純水に溶解させ、塗布液を調製した。
実施例1−1におけるWST−4の量を49.9μmolに変更し、Acid Yellow 23に代えて27.1μmolの1,3−ベンゼンジスルホン酸(DSB)を用いた以外は実施例1−1と同様にして、血糖値検出用チップを得た。
実施例1−1におけるAcid Yellow 23に代えて30.2μmolのスクラロースを用いた以外は実施例1−1と同様にして、血糖値検出用チップを得た。
実施例1−1におけるAcid Yellow 23に代えて35.1μmolのトレハロースを用いた以外は実施例1−1と同様にして、血糖値検出用チップを得た。
実施例1−1におけるAcid Yellow 23に代えて26.5μmolのOrange G(OG)を用いた以外は実施例1−1と同様にして、血糖値検出用チップを得た。
実施例1−1におけるAcid Yellow 23に代えて19.9μmolのAcid Red 27(AR27)を用いた以外は実施例1−1と同様にして、血糖値検出用チップを得た。
実施例1−1におけるAcid Yellow 23に代えて20.5μmolのAcid Fuchsin(AF)を用いた以外は実施例1−1と同様にして、血糖値検出用チップを得た。
実施例1−1におけるAcid Yellow 23に代えて18.4μmolの2−(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウムナトリウム塩を塗布液の調製に用いたが、血液サンプルに対する溶解性が低くスペクトル解析を行うことができなかった。
実施例1−1におけるAcid Yellow 23に代えて20.0μmolの2−(2−メトキシ−4−ニトロフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウムナトリウム塩を塗布液の調製に用いたが、血液サンプルに対する溶解性が低くスペクトル解析を行うことができなかった。
実施例1−1におけるAcid Yellow 23に代えて22.0μmolのAcid Blue 1を塗布液の調製に用いたが、水に対する溶解性が低く塗布液から析出物を生じた。また、血液サンプルに対する溶解性が低くスペクトル解析を行うことができなかった。
反応部26’を有しない以外は実施例1−1と同様のチップを作製した。当該チップを用いて、血液サンプルのスペクトル解析を行った。なお、波長810nmにおける血液(ヘマトクリット値:40)の透過率は、25%であった。
35μkat(2104U)のグルコースデヒドロゲナーゼ(酸化還元酵素;FAD−GDH GDL−351、東洋紡株式会社)、12.5μmolのWST−4(発色試薬)、0.25μmolのm−PMS(電子キャリアー)、および22.5μmolのAcid Yellow 23(屈折率調整剤;AY23)を190μlの純水に溶解させ、塗布液を調製した。
実施例2におけるAcid Yellow 23をスクラロースに変更した以外は実施例2と同様に血糖値検出用チップを作製した。吸光度(実測値)をクリアランス35μmの場合に補正した結果を図9に示す。なお、図9の吸光度Absもまた、実施例2と同様の手法により補正した。また、各チップのクリアランス(実測値)を、点着から25秒後の吸光度(35μm補正前の実測値)で除した値(CL/Abs810)を表3に示す。CL/Abs810はクリアランスに対する散乱光の影響度を表しており、この値の値が大きいほど、散乱光の発生が効率的に抑制されていることを示す。
12,12’ 検出用チップ、
14 測定部、
16 装置本体、
18 チップ本体部、
20 空洞部、
20a 先端口部、
20b 基端口部、
22 長辺、
22a 上側長辺、
22b 下側長辺、
24 短辺、
24a 先端辺、
24b 基端辺、
26,26’ 反応部、
28 測定対象部、
30,30’ 板片、
32,32’ スペーサ、
40 筺体、
42 制御部、
44 箱体部、
46 測光ブロック、
48 電源ボタン、
50 操作ボタン、
52 ディスプレイ、
54 イジェクトレバー、
56 イジェクトピン、
56a 棒部、
56b 受部、
58 挿入口、
58a 挿入開口部
59 測定用孔部、
60 チップ装着部、
60a フランジ部、
62 壁部、
64 素子収容空間、
66 導光部、
68 発光素子、
70 発光部、
72 受光素子、
74 受光部、
76 コイルバネ。
Claims (17)
- 血液サンプル中の分析対象物を検出する方法であって、
(1)前記血液サンプルを準備すること、
(2)屈折率調整剤を前記血液サンプルに溶解させることにより、赤血球と赤血球外液との屈折率差を減少させた分析サンプルを得ること、ならびに
(3)前記分析サンプルを用いて、前記分析対象物を検出すること、
を含む、方法。 - 前記(2)において、前記分析サンプルが透過率50%以上である波長を700nm〜950nmの範囲内に有するように、前記屈折率調整剤を前記血液サンプルに溶解させる、請求項1に記載の方法。
- 前記血液サンプルまたは前記分析サンプルに発色試薬を溶解させて発色反応を行うことを含み、
前記分析対象物の検出は、前記発色反応による発色強度に基づいて行われる、請求項1または2に記載の方法。 - 前記発色試薬の吸収ピーク波長における前記屈折率調整剤のモル吸光係数は、200L/(mol・cm)以下である、請求項3に記載の方法。
- 前記発色試薬は、テトラゾリウム塩である、請求項3または4に記載の方法。
- 前記屈折率調整剤の20℃における水に対する溶解度は、100mM以上である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 750nm〜850nmの波長領域において、前記分析サンプルの透過率は、前記血液サンプルの透過率よりも高い、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記屈折率調整剤は、下記式(1)で表される化合物、ベンゼンスルホン酸化合物および二糖類、ならびにこれらの塩からなる群から選択される1種以上である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法:
- 前記分析対象物は、グルコース、コレステロール、中性脂肪、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、および尿酸からなる群から選択される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 血液サンプル中の分析対象物を検出するための組成物であって、
発色試薬、酸化還元酵素、および屈折率調整剤を含む、組成物。 - 前記発色試薬の吸収ピーク波長における前記屈折率調整剤のモル吸光係数は、200L/(mol・cm)以下である、請求項10に記載の組成物。
- 前記発色試薬は、テトラゾリウム塩である、請求項10または11に記載の組成物。
- 前記屈折率調整剤は、下記式(1)で表される化合物、ベンゼンスルホン酸化合物および二糖類、ならびにこれらの塩からなる群から選択される1種以上である、請求項10〜12のいずれか1項に記載の組成物:
- 前記屈折率調整剤の含有量は、前記発色試薬1モルに対して0.2〜5モルである、請求項10〜13のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記分析対象物は、グルコース、コレステロール、中性脂肪、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、および尿酸からなる群から選択される、請求項10〜14のいずれか1項に記載の組成物。
- 血液サンプル中の分析対象物の検出用チップであって、
発色試薬、酸化還元酵素、および屈折率調整剤を含む反応部を有する、チップ。 - 前記反応部における前記屈折率調整剤の含有量は、330〜800(mmol/L 赤血球外液)である、請求項16に記載のチップ。
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