CN109477837A - 用于检测血液样品中的分析对象物的方法、组合物和芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种能够在不需要来自血液样品的成分的分级的情况下高精度地检测分析对象物的方法。本发明为检测血液样品中的分析对象物的方法，包括：准备血液样品，通过使折射率调节剂溶解于所述血液样品而得到使红细胞与红细胞外液的折射率差减少的分析样品，以及使用分析样品来检测分析对象物。

Description

用于检测血液样品中的分析对象物的方法、组合物和芯片
技术领域
本发明涉及用于检测血液样品中所含的葡萄糖等分析对象物的方法、组合物和芯片。
背景技术
一直以来，已知有通过电化学方法(电极法)、光学方法(比色法)测定血液样品中所含的分析对象物(例如，葡萄糖)的技术。
例如，专利文献1中记载了一种涉及干式分析元件的发明，所述干式分析元件由点样了试样的一侧的面的细孔的大小比检测显色的一侧的面的细孔的大小大的各向异性膜构成，用于测定血液中的葡萄糖等。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2008-148656号公报
发明内容
专利文献1中记载的发明中，使用在点样了试样的一侧的面具有直径大的孔，在检测显色的一侧的面具有直径小的孔的各向异性膜。由此，来自血液的成分中，红细胞这样的尺寸大的成分无法到达检测各向异性膜的显色的一侧而被过滤出。因此，专利文献1中记载的发明中，在红细胞这样的尺寸大的成分的非存在下进行显色反应。然而，在使用这样的各向异性膜的情况下，存在因来自试样的成分、夹杂物等引起细孔堵塞的可能性，由此可能对测定精度造成影响。另外，在需要这样的来自血液样品的成分的分级的方法中，从测定的迅速度的观点出发，有时并不充分。
另一方面，已知如果不进行来自血液样品的成分的分级而通过光学方法进行分析对象物的测定，则基线变高(即，噪音变强)，难以以高精度进行测定。
因此，本发明是鉴于上述情况而完成的，其目的在于提供能够在不需要来自血液样品的成分的分级的情况下高精度地检测分析对象物的方法。
本发明人等为了解决上述问题，进行了深入研究。其结果发现通过将使用折射率调节剂使红细胞与红细胞外液的折射率差减少的分析样品供于分析对象物的检测，能够解决上述课题，以至完成了本发明。
本发明的第1方面涉及一种检测血液样品中的分析对象物的方法，包括：
(1)准备所述血液样品，
(2)通过使折射率调节剂溶解于所述血液样品，得到使红细胞与红细胞外液的折射率差减少的分析样品，以及
(3)使用所述分析样品来检测所述分析对象物。
本发明的第2方面涉及一种用于检测血液样品中的分析对象物的组合物，含有显色试剂、氧化还原酶和折射率调节剂。
本发明的第3方面涉及一种血液样品中的分析对象物的检测用芯片，具有含有显色试剂、氧化还原酶和折射率调节剂的反应部。
附图说明
图1是示意性地表示安装有一实施方式涉及的检测用芯片的检测装置(成分测定装置)的平面图。
图2是将图1的检测用芯片和装置主体的测光块放大而表示的立体图。
图3是示意性地表示分析对象物的检测用芯片的一实施方式的图。
图4A是表示图1的检测用芯片和装置主体的安装动作的第1平面图。
图4B是表示接着图4A的安装动作的第2平面截面图。
图5A是示意性地表示实施例中使用的分析对象物的检测用芯片的图。
图5B是示意性地表示实施例中使用的分析对象物的检测用芯片的图。
图6是用于实施例的光谱解析的评价系统的概要。
图7A表示通过实施例和比较例的光谱解析得到的透过率曲线(血液点样前)。
图7B表示通过实施例、比较例和参考例(血液样品)的光谱解析得到的透过率曲线(血液点样后)。
图8表示通过使用Acid Yellow 23作为折射率调节剂的实施例2的光谱解析得到的吸光度的时间变化。
图9表示通过使用三氯蔗糖作为折射率调节剂的实施例3的光谱解析得到的吸光度的时间变化。
具体实施方式
本发明的第1方面涉及一种检测血液样品中的分析对象物的方法，包括：
(1)准备上述血液样品，
(2)通过使折射率调节剂溶解于上述血液样品，得到使红细胞与红细胞外液的折射率差减少的分析样品，以及
(3)使用上述分析样品来检测上述分析对象物。
本发明的第2方面涉及一种用于检测血液样品中的分析对象物的组合物，含有显色试剂、氧化还原酶和折射率调节剂。
本发明的第3方面涉及一种血液样品中的分析对象物的检测用芯片，具有含有显色试剂、氧化还原酶和折射率调节剂的反应部。
本说明书中，关于上述本发明的某一方面相关的记载可与其它方面相互适当改变而应用。
根据本发明，能够在不需要血液成分的分级的情况下高精度地检测分析对象物。本发明人等对不进行来自血液样品的成分的分级而通过光学方法进行分析对象物的测定时基线变高的原因进行了各种研究。发现如果不进行来自血液样品的成分的分级而通过光学方法进行分析对象物的测定，则因红细胞与红细胞外液(即，样品中存在的红细胞以外的成分)之间的折射率差引起光的散射，来自散射光的基线变高而使测定精度降低。针对这样的问题，本发明人等进一步发现通过使减小红细胞与红细胞外液的折射率差的化合物溶解于红细胞外液，分析对象物的测定精度提高。例如，认为通过使渗透压高且化合物溶解于血液时的折射率也大的化合物(例如，实施例的Acid Yellow 23等)溶解于血液样品后进行分析对象物的测定，因由渗透压引起的收缩而上升的红细胞自身的折射率与红细胞外液的折射率得到平衡，由此光的散射得到抑制。另一方面，认为即使是渗透压与红细胞接近且化合物溶解于血液时的折射率没有上述化合物那样高的化合物(例如，实施例的三氯蔗糖等)，通过使其溶解于血液样品后进行分析对象物的测定，由渗透压引起的红细胞的收缩得到抑制，并且通过使红细胞外液的折射率接近红细胞内部的折射率，红细胞/红细胞外液的折射率差减少，作为结果，光的散射得到抑制。应予说明，上述机理属于推测，并不限制本发明的技术范围。
以下，对本发明的实施方式进行说明。应予说明，本发明不仅限定于以下的实施方式。另外，附图的尺寸比率为了方便说明而进行了放大，有时与实际的比率不同。
本说明书中，表示范围的“X～Y”是指“X以上且Y以下”。另外，只要没有特别说明，操作和物性等的测定在室温(20～25℃)/相对湿度40～50％RH的条件下进行。
＜血液样品中的分析对象物检测方法＞
本发明的一个方面涉及一种检测血液样品中的分析对象物的方法，包括：
(1)准备上述血液样品，
(2)通过使折射率调节剂溶解于上述血液样品，得到使红细胞与红细胞外液的折射率差减少的分析样品，以及
(3)使用上述分析样品来检测上述分析对象物。
本发明的一个方面涉及的方法中，使用含有红细胞的血液样品。根据本发明的一个方面涉及的方法，即使是这样的含有红细胞的样品，也能够在不需要血液成分的分级的情况下高精度地检测分析对象物。
血液样品可以为来自人或非人动物的血液样品。作为非人动物，可例示小鼠、大鼠、仓鼠等实验动物；狗、猫、兔子等宠物；猪、牛、山羊、绵羊、马、鸡等家畜类、家禽类，但并不限定于这些。优选血液样品来自人。优选血液样品为全血。
本说明书中的“折射率调节剂”只要是能够通过使其溶解于血液而使红细胞与红细胞外液的折射率差减少就没有特别限制。应予说明，“红细胞外液”是指含有红细胞以外的来自血液样品的成分、折射率调节剂和可任意地使用的显色试剂等其它试剂的液体。
红细胞与红细胞外液的折射率差减少可以将分析样品在长波长区域(例如，700nm～950nm)的透过率比血液样品高作为指标进行确认。在某一实施方式中，以分析样品在700nm～950nm的范围内具有透过率为50％以上的波长的方式使折射率调节剂溶解于上述血液样品。即，该实施方式中，提供一种检测血液样品中的分析对象物的方法，包括：
(1)准备血液样品，
(2)使折射率调节剂溶解于上述血液样品，制备在700nm～950nm的范围内具有透过率为50％以上的波长的分析样品，以及
(3)使用上述分析样品来检测上述分析对象物。
在优选的一实施方式中，使折射率调节剂溶解后的血液样品(即，分析样品)在700nm～950nm的范围内具有透过率为60％以上的波长。在更优选的一实施方式中，在700nm～950nm的范围内具有透过率为65％以上的波长。在进一步优选的一实施方式中，在700nm～950nm的范围内具有透过率为70％以上的波长。
应予说明，本说明书中，血液样品、分析样品的“透过率”和“吸光度”是以光路长度50μm测定的值，例如可通过实施例＜光谱解析＞中记载的方法求出。作为上述透过率(T(％))的测定方法的一个具体例，可以通过使用实施例中记载的检测用芯片，利用下述式由点样血细胞比容值40的血液后5秒以后且30秒以前的吸光度(Abs)进行换算而求出。某一实施方式中，下述式的吸光度(Abs)为810nm处的吸光度(Abs)。
应予说明，本发明的一个方面涉及的方法并不限定于使用实施例中记载的检测用芯片的方法。例如，在使用光路长度10mm的比色皿进行分析的情况下，可以依照朗伯－比尔定律，由进行考虑了测定比色皿内存在的血液样品中的分析对象物的浓度的校正而求出的吸光度求出“透过率(％)”。
在一实施方式中，使折射率调节剂溶解后的血液样品(即，分析样品)的800nm～950nm的波长范围内的透过率为50％以上，更优选800nm～900nm的波长范围内的透过率为60％以上，进一步优选750nm～900nm的波长范围内的透过率超过65％，进一步优选800nm～900nm的波长范围内的透过率为70％以上，特别优选750nm～900nm的波长范围内的透过率为70％以上。
在一实施方式中，在750nm～850nm的波长区域中，分析样品的透过率比血液样品的透过率高。在更优选的其它实施方式中，在650nm～900nm的波长区域中，分析样品的透过率比血液样品的透过率高。在进一步优选的其它实施方式中，在600nm～950nm的波长区域中，分析样品的透过率比血液样品的透过率高。
在一实施方式中，作为折射率调节剂，采用下述的显色试剂的吸收峰波长处的透过率高的折射率调节剂。即，在使用显色试剂进行分析对象物的检测的情况下，显色试剂的吸收峰波长处的折射率调节剂的摩尔吸光系数优选为200L/(mol·cm)以下。通过将这样的折射率调节剂与显色试剂组合使用，能够进行更高精度的分析对象物的检测。显色试剂的吸收峰波长处的折射率调节剂的摩尔吸光系数更优选为150L/(mol·cm)以下，进一步优选为70L/(mol·cm)以下(下限为0L/(mol·cm))。
波长545nm和575nm为血红蛋白的吸光峰波长。因此，通过使用这些波长处的透过率高的分析样品，容易算出基于波长545nm和/或575nm处的吸光度的分析样品中的血红蛋白量。因此，通过使用波长545nm和575nm处的透过率高的分析样品，在基于血红蛋白量容易进行分析对象物含量的校正方面具有优点。即，分析样品优选在545nm和575nm的至少一个波长观察到向下凸的峰。应予说明，本说明书中“在545nm观察到的峰”是指极小值存在于545±5nm的波长范围内的最大峰。同样地，本说明书中“在575nm观察到的峰”是指极小值存在于575±5nm的波长范围内的最大峰。另外，通过在考虑折射率调节剂的波长545nm和575nm处的透过率的同时任意地选择折射率调节剂，能够降低波长545nm和575nm处的分析样品的透过率。
具体而言，分析样品的在545nm观察到的峰和在575nm观察到的峰中的至少一者的透过率优选为15％以上，更优选为20％以上。在进一步优选的一实施方式中，分析样品的在545nm观察到的峰和在575nm观察到的峰的透过率均为15％以上。在特别优选的一实施方式中，分析样品的在545nm观察到的峰和在575nm观察到的峰的透过率均为20％以上。在545nm观察到的峰和在575nm观察到的峰的透过率也是以光路长度50μm测定的值，例如也可以通过实施例中记载的方法测定。
在折射率调节剂的溶解度高的情况下，具有能够调整为范围宽的折射率的优点。因此，折射率调节剂优选为溶解性高的折射率调节剂。例如，可以使用在20℃的水中的溶解度超过50mM的折射率调节剂。折射率调节剂在20℃的水中的溶解度优选为100mM以上，更优选为200mM以上，更优选为400mM以上，特别优选为1000mM以上。折射率调节剂的溶解度的上限没有特别限制，越高越优选，例如可以为2M左右。
作为折射率调节剂，更具体而言，例如可例示下述式(1)表示这样的色素、色原体、在水中的溶解度为200mM以上的具有苯并噻唑基的四唑盐、多糖类、糖醇、苯磺酸化合物这样的具有离子性官能团的芳香族烃化合物等。这些化合物可以为盐的形式，更具体而言，可以为钠盐、钾盐、铵盐、甲胺盐、乙胺盐、二乙胺盐、三乙胺盐、单乙醇胺盐和氯化物等卤化物等，但并不限定于这些。上述的盐优选为钠盐或钾盐。
其中，从分析对象物的检测精度的观点出发，折射率调节剂优选为选自下述式(1)表示的化合物、苯磺酸化合物和二糖类以及它们的盐中的1种以上。
Q1-N＝N-Q2 式(1)
其中，上述式(1)中，Q1和Q2各自独立地表示可以具有1个以上的取代基的芳基或含氮杂环基；上述取代基选自卤素原子、羟基、碳原子数1～3的烷基、碳原子数1～3的烷氧基、羧基、磺基、氨基、氨基甲酰基、氨磺酰基、苯基、羧基苯基和磺基苯基。
式(1)表示的化合物中，作为“芳基”，可例示苯基、萘基、蒽基和菲基等，优选选自苯基和萘基。
式(1)表示的化合物中，作为“含氮杂环基”，可例示吡咯烷基、吡咯基、哌啶基、吡啶基、咪唑基、吡唑基、吡唑啉酮基、唑基、噻唑基、吡嗪基、吲哚基、异吲哚基和苯并咪唑基等，优选选自咪唑基、吡唑基和吡唑啉酮基。
上述芳基、含氮杂环基可以具有1个以上选自卤素原子(例如，氟原子、氯原子、溴原子、碘原子)、羟基、碳原子数1～3的烷基(例如，甲基、乙基、正丙基和异丙基)、碳原子数1～3的烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基、正丙氧基和异丙氧基)、羧基、磺基、氨基、氨基甲酰基、氨磺酰基、苯基、羧基苯基和磺基苯基中的取代基。另外，作为芳基、含氮杂环基的取代基的苯基可以进一步被选自上述卤素原子(例如，氟原子、氯原子、溴原子、碘原子)、羟基、碳原子数1～3的烷基(例如，甲基、乙基、正丙基和异丙基)、碳原子数1～3的烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基、正丙氧基和异丙氧基)、羧基、磺基、氨基、氨基甲酰基、氨磺酰基、苯基、羧基苯基和磺基苯基中的1个以上的取代基取代。
从分析对象物的高精度的检测的观点出发，在优选的一实施方式中，Q1由
表示；其中R11、R12、R13、R21、R22和R23各自独立地选自氢原子、卤素原子、羧基、羧酸盐的基团、磺基、磺酸盐的基团、氨基甲酰基和氨磺酰基。
从分析对象物的高精度的检测的观点出发，在优选的一实施方式中，Q2由
表示；其中R31、R32和R41各自独立地选自氢原子、羟基、碳原子数1～3的烷基、羧基、羧酸盐的基团、磺基、磺酸盐的基团、氨基、氨基甲酰基和氨磺酰基か；R33和R42各自独立地选自氢原子、羧基、羧酸盐的基团、磺基和磺酸盐的基团；R51、R52、R53和R54各自独立地选自氢原子、卤素原子、羟基、羧基、羧酸盐的基团、磺基、磺酸盐的基团、氨基甲酰基和氨磺酰基。
在更优选的一实施方式中，Q2由
表示；其中R31、R32和R33如上所述。
在优选的一实施方式中，式(1)表示的化合物由
表示；其中R11、R12、R13、R31、R32、R33、R41、R42、R51、R52、R53和R54如上所述。
作为上述式(1)表示的化合物，更具体而言，可例示Acid Yellow 11、Acid Yellow23、Acid Yellow 49、Acid Yellow 59、Acid Orange 12、Orange G、Acid Red 18、Acid Red26、Acid Red 27、Acid Red 88、Solvent Yellow5、Solvent Yellow 6、Solvent Yellow11、Food Yellow 3、Food Yellow 5等。其中，优选使用选自Acid Yellow 11、Acid Yellow23、Acid Yellow 49、Acid Yellow 59和Food Yellow 3中的化合物。在更优选的一实施方式中，使用Acid Yellow 23作为折射率调节剂。
作为用作折射率调节剂的苯磺酸化合物，可例示苯磺酸、1,2-苯二磺酸、1,3-苯二磺酸、1,4-苯二磺酸、1,2,4-苯三磺酸、1,3,5-苯三磺酸等。其中，苯磺酸化合物优选选自1,2-苯二磺酸、1,3-苯二磺酸和1,4-苯二磺酸，更优选为1,3-苯二磺酸。
作为用作折射率调节剂的二糖类，例如可例示蔗糖、麦芽糖、异麦芽糖、乳糖、海藻糖、三氯蔗糖、纤维二糖、乳果糖、松二糖、半乳蔗糖、海藻糖胺、麦芽糖醇、乳糖醇等，但不限定于这些。作为二糖类，优选使用蔗糖、海藻糖、三氯蔗糖、半乳糖蔗糖、海藻糖胺、麦芽糖醇、乳糖醇等非还原性糖，更优选使用海藻糖和/或三氯蔗糖。特别是红细胞的收缩抑制效果大、能够大量溶解于分析样品的方面出发，优选渗透压低的三氯蔗糖。
溶解于分析样品的折射率调节剂的量例如为200～1500(mmol/L红细胞外液)，优选为300～1500(mmol/L红细胞外液)，更优选为330～800(mmol/L红细胞外液)。如果为这样的量，则能够更有效地抑制散射光，能够更高精度地检测分析对象物。应予说明，上述折射率调节剂的量为通过实施例中记载的计算方法求出的值。
在本发明的一个方面涉及的方法中，分析对象物的检测通过比色法进行。在一实施方式中，检测方法包括使显色试剂溶解于血液样品或分析样品进行显色反应，分析对象物的检测基于由显色反应产生的显色强度进行。例如，分析对象物的检测可基于由显色反应产生的显色试剂的吸收峰处的显色强度进行。
作为上述的显色试剂，没有特别限制，例如，也可以使用为了检测血液样品中的各种分析对象物而一直使用的显色试剂。在优选的一实施方式中，显色试剂在550～750nm的波长范围内具有吸收峰波长，在更优选的一实施方式中，显色试剂在600nm以上且小于700nm的波长范围内具有吸收峰波长。
作为显色试剂，更具体而言，例如可例示四唑盐；4-氨基安替比林(4AA)、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)、2-亚肼基-2,3-二氢-3-甲基-6-苯并噻唑磺酸(SMBTH)等发色剂(coupler)与后述的苯胺化合物、酚类等特林德(Trinder)试剂的组合；N-(羧甲基氨基羰基)-4,4’-双(二甲基氨基)二苯胺钠盐(DA-64)等二苯胺系色原体；10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲基氨基)吩噻嗪钠盐(DA-67)等吩噻嗪系色原体等。上述显色试剂中，从测定精度的观点出发，优选使用四唑盐。
上述的“四唑盐”例如可以为氟化物、氯化物、臭化物、碘化物、钠盐、钾盐、铵盐、甲胺盐、乙胺盐、二乙胺盐、三乙胺盐、单乙醇胺盐等形态。作为四唑盐，更具体而言，可举出2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑盐、2-(4-碘苯基)-3-(2,4-二硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑盐、2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-[4-(2-磺基乙基氨基甲酰基)苯基]-2H-四唑盐、2,2’-二苯并噻唑基-5,5’-双[4-二(2-磺基乙基)氨基甲酰基苯基]-3,3’-(3,3’-二甲氧基4,4’-亚联苯基)二四唑盐、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑盐、2-(4-硝基苯基)-5-苯基-3-[4-(4-磺基苯基偶氮基)-2-磺基苯基]-2H-四唑、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑盐、3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑盐、2,3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑-5-羧酰苯胺盐、2,2’-二(4-硝基苯基)-5,5’-二苯基-(3,3’-二甲氧基)-4,4’-双亚苯基二四唑盐等，其中，更优选具有苯并噻唑基结构的四唑盐，优选2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-[4-(2-磺基乙基氨基甲酰基)苯基]-2H-四唑钠盐(WST-4)。
使用四唑盐的显色反应例如可以为使用后述的氧化还原酶的反应。例如，在分析对象物为葡萄糖并且使用后述的葡萄糖脱氢酶(GDH)的情况下，通过测定基于通过以下的反应机制生成的甲臜(formazan)的吸收波长(例如，吸收峰波长)处的吸光度，能够定量地检测葡萄糖。
本说明书中分析对象物没有特别限制，例如可适用于葡萄糖、胆固醇、中性脂肪、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、乳酸、酒精、尿酸等的检测。其中，根据本发明的优选的方式，分析对象物选自葡萄糖、胆固醇、中性脂肪、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和尿酸。
＜血液样品中的分析对象物检测用组合物＞
本发明的其它方面涉及一种用于检测血液样品中的分析对象物的组合物，含有显色试剂、氧化还原酶和折射率调节剂。
作为组合物中所含的显色试剂和折射率调节剂，可以使用本说明书中上述的显色试剂和折射率调节剂。
组合物中的折射率调节剂的含量没有特别限制，折射率调节剂相对于显色试剂1摩尔以0.1～10摩尔的比率配合。从进一步降低红细胞与红细胞外液的折射率差的效果的观点出发，折射率调节剂相对于显色试剂1摩尔优选为0.1～8摩尔，更优选以0.2～4摩尔的比率配合。
组合物中所含的氧化还原酶没有特别限制，可根据分析对象物的种类适当选择。作为氧化还原酶的例子，具体而言，可举出葡萄糖脱氢酶(GDH)(例如，将吡咯喹啉醌(PQQ)作为辅酶的葡萄糖脱氢酶(PQQ-GDH)，将黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为辅酶的葡萄糖脱氢酶(GDH-FAD)，将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)作为辅酶的葡萄糖脱氢酶(GDH-NAD)和将烟碱腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)作为辅酶的葡萄糖脱氢酶(GDH-NADP)等)、葡萄糖氧化酶(GOD)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、胆固醇脱氢酶、胆固醇氧化酶、磷酸甘油脱氢酶、磷酸甘油氧化酶、乳酸脱氢酶(LDH)、乳酸氧化酶、酒精脱氢酶、酒精氧化酶、尿酸酶、尿酸脱氢酶等。这里，氧化还原酶可以单独使用1种，或者也可以组合2种以上。例如，在生物体成分为葡萄糖的情况下，氧化还原酶优选为葡萄糖脱氢酶、葡萄糖氧化酶。另外，在生物体成分为胆固醇的情况下，氧化还原酶优选为胆固醇脱氢酶、胆固醇氧化酶。这里，氧化还原酶可以单独使用1种，或者也可以组合2种以上。
例如，在分析对象物为葡萄糖的情况下，氧化还原酶优选为葡萄糖脱氢酶、葡萄糖氧化酶。在分析对象物为胆固醇的情况下，氧化还原酶优选为胆固醇脱氢酶、胆固醇氧化酶。在分析对象物为中性脂肪的情况下，氧化还原酶优选为磷酸甘油脱氢酶、磷酸甘油氧化酶。除了上述氧化还原酶，根据分析对象物、显色反应机理，可组合使用心肌黄酶、过氧化酶、脂蛋白脂肪酶和甘油激酶等其它酶。
组合物的氧化还原酶的含量也没有特别限制，可根据使用的酶适当设定，例如，相对于显色试剂1摩尔为1×105～5×107μkat(即，6×106～3×109U)，优选为5×105～1×107μkat(即，3×107～6×108U)，更优选为1×106～5×106μkat(即，6×107～3×108U)。
组合物可以根据需要含有电子载体。作为可使用于组合物的电子载体，可举出吩嗪硫酸甲酯(PMS)、1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯(m-PMS)、麦尔多拉蓝(Meldola'sblue)、心肌黄酶、二氯酚靛酚、铁氰化钾、二茂铁、钌配合物、锇络合物、苯醌等，但并不限定于这些。
氧化还原酶与电子载体的组合没有特别限制，可根据目的适当设定，例如，可例示GDH/吩嗪硫酸甲酯的组合、GDH/1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯的组合、GDH/铁氰化钾的组合、GDH/钌配合物的组合、GOD/铁氰化钾的组合、胆固醇脱氢酶/二茂铁的组合、磷酸甘油脱氢酶/心肌黄酶的组合等。
组合物的电子载体的含量也没有特别限制，例如，相对于显色试剂1摩尔为1×10-3～1摩尔，优选为2×10-3～1×10-1摩尔，更优选为1×10-2～5×10-2摩尔。
组合物可以根据需要含有辅酶。作为可使用于组合物的辅酶，可举出吡咯喹啉醌(PQQ)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、烟碱腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、三磷酸腺苷(ATP)等，但并不限定于这些。
此外，组合物可以在不损害本发明的目的效果的程度下任意地含有缓冲剂(例如，磷酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、柠檬酸-磷酸缓冲剂、Tris盐酸缓冲剂(三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲剂)、MES缓冲剂(2-吗啉基乙磺酸缓冲剂)、TES缓冲剂(N-三(羟基甲基)甲基-2-氨基乙磺酸缓冲剂)、乙酸缓冲剂、MOPS缓冲剂(3-吗啉基丙磺酸缓冲剂)、MOPS-NaOH缓冲剂、HEPES缓冲剂(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲剂)、HEPES-NaOH缓冲剂等GOOD缓冲剂、甘氨酸-盐酸缓冲剂、甘氨酸-NaOH缓冲剂、双甘氨肽-NaOH缓冲剂、双甘氨肽-KOH缓冲剂等氨基酸系缓冲剂、Tris-硼酸缓冲剂、硼酸-NaOH缓冲剂、硼酸缓冲剂等硼酸系缓冲剂、咪唑缓冲剂等)、酶(例如，心肌黄酶、过氧化酶、葡萄糖激酶、己糖激酶、脂蛋白脂肪酶、甘油激酶等)、苯胺化合物(例如，N-(3-磺基丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3-甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3,5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-磺基丙基-3-甲基苯胺、N-乙基-N-磺基丙基-3-甲氧基苯胺、N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3,5-二甲氧基苯胺等)、酚类(例如，苯酚、4-氯苯酚、3-甲基苯酚、3-二甲基氨基苯甲酸、3-羟基-2,4,6-三碘苯甲酸等)、表面活性剂等。
组合物的制备方法没有特别限制，只要通过任意的方法将显色试剂、氧化还原酶、折射率调节剂和任意含有的其它成分混合即可。将组合物的各成分混合时，可以在水、甲醇、乙醇、甘油、二甲基亚砜等任意的溶剂、分散介质中进行。
＜血液样品中的分析对象物检测用芯片＞
本发明的第3方面涉及一种血液样品中的分析对象物的检测用芯片，具有含有显色试剂、氧化还原酶和折射率调节剂的反应部。
以下，以本发明的一实施方式涉及的分析对象物检测用芯片12(以下，也将分析对象物检测用芯片12简称为“检测用芯片12”。)和用于使用检测用芯片12的分析对象物的检测的分析对象物检测装置10(以下，也将分析对象物检测装置10简称为“检测装置10”。)为例，参照图1～图4对本发明的第3方面更详细地进行说明，但本发明并不限定于以下的实施方式。
如图1所示，检测装置10构成为测定血液样品中的分析对象物(例如，葡萄糖图)的设备。该检测装置10主要可作为用户(受试者)操作的个人应用使用。例如，在分析对象物为葡萄糖的情况下，用户也可以测定饭前的血糖进行自身的血糖管理。另外，医疗从业者为了评价受检者的健康状态，也可以使用检测装置10，此时，可以适当改变检测装置10而制成能够设置于医疗设施等的构成。
检测装置10采用光学测定血液样品中所含的分析对象物的含量的比色法的原理。特别是，该检测装置10对分析样品照射规定波长的测定光，通过接收透过分析样品的光的透过型的测定部14检测分析对象物。
检测装置10安装取入有血液的检测用芯片12，或者在安装检测用芯片12的状态下使检测用芯片12取入血液，通过测定部14检测分析对象物。检测用芯片12可以构成为每次测定废弃的一次性类型。另一方面，检测装置10优选以用户能够简单地重复测定的方式构成为能够携带且牢固的设备。
如图2所示，检测用芯片12具备形成为板状的芯片主体部18和在芯片主体部18的内部沿着板面的面方向延伸的空腔部20(液体用空腔部)。检测用芯片12优选为葡萄糖检测用芯片。
芯片主体部18在侧面视中形成为在检测装置10的插入和脱离方向(检测装置10的前端和基端方向)具有长的长边22，并且在上下方向具有短的短边24的长方形。例如，芯片主体部18的长边22的长度可以设定为短边24的2倍以上的长度。由此可确保检测用芯片12相对于检测装置10的充分的插入量。
另外，芯片主体部18的厚度与形成为长方形的侧面相比，极小(薄)地形成(在图2中，特意以具有充分的厚度的方式图示)。例如，芯片主体部18的厚度优选设定为上述的短边24的1/10以下。对于该芯片主体部18的厚度，可以根据检测装置10的插入孔58的形状适当设计。
检测用芯片12以具有空腔部20的方式由一对板片30和一对隔离件32构成芯片主体部18。
图3是表示图1的检测用芯片的侧视图。图3中，芯片主体部18的角部为尖状，但例如角部也可以形成为圆角。另外，芯片主体部18并不限定于薄板状，当然可以自由设计其形状。例如，芯片主体部18在侧面视中可以形成为正方形、其它多边形或圆形(包括椭圆形)等。
设置于芯片主体部18的内部的空腔部20位于芯片主体部18的上下方向中间位置，遍及芯片主体部18的长边方向呈直线状地形成。该空腔部20分别与形成于芯片主体部18的前端边24a的前端口部20a和形成于基端边24b的基端口部20b相连，与芯片主体部18的外侧连通。空腔部20如果从前端口部20a取入用户的血液，则可基于毛细现象沿着延伸方向使血液流动。在空腔部20流动的血液是少量的，即便移动至基端口部20b也可通过张力而抑制泄漏。此外，可以在芯片主体部18的基端边24b侧设置吸收血液的吸收部(例如，将后述的隔离件32仅基端侧采用多孔质体的隔离件等)。
另外，在空腔部20的规定位置(例如，比图3中示出的前端口部20a与基端口部20b的中间点略靠近基端的位置)设定有进行显色反应的反应部26和通过检测装置10进行测定的测定对象部28。反应部26含有显色试剂、氧化还原酶和折射率调节剂。在空腔部20向基端方向流动的血液与反应部26接触，反应部26的试剂成分溶解于血液中而进行显色反应，由此进行显色。应予说明，在空腔部20的长边方向上，反应部26的涂布位置和测定对象部28可以相互错开，例如可以将反应部26设置于测定对象部28的血液流动方向上游侧。
反应部中所含的各试剂成分的量可根据每次测定中使用的血液样品量(每个芯片的血液量)适当设定。应予说明，下述反应部中所含的各试剂成分含量为依据实施例中记载的计算方法求出的值。
反应部的折射率调节剂的含量例如为200～1500(mmol/L红细胞外液)，优选为300～1500(mmol/L红细胞外液)，更优选为330～800(mmol/L红细胞外液)。通过使反应部的折射率调节剂的含量为如上所述的范围，能够更进一步抑制来自血球的散射光的产生，分析对象物的检测精度提高。应予说明，折射率调节剂可以单独使用1种，或者，只要能够实现本发明的目的效果，则也可以混合使用2种以上。在使用2种以上的折射率调节剂的情况下，上述数值范围为其合计量。
反应部的显色试剂的含量例如为110～825(mmol/L红细胞外液)，优选为165～825(mmol/L红细胞外液)，更优选为180～450(mmol/L红细胞外液)。应予说明，显色试剂可以单独使用1种，或者，只要能够实现本发明的目的效果，则也可以混合使用2种以上。在使用2种以上的显色试剂的情况下，上述数值范围为其合计量。
反应部的氧化还原酶的含量例如为3×105～2.5×106(μkat/L红细胞外液)(即，1.8×107～1.5×108(U/L红细胞外液))，优选为4.5×105～2.5×106(μkat/L红细胞外液)(即，2.7×107～1.5×108(U/L红细胞外液))，更优选为5×105～1.2×106(μkat/L红细胞外液)(即，3×107～7.2×107(U/L红细胞外液))。应予说明，氧化还原酶可以单独使用1种，或者，只要能够实现本发明的目的效果，则也可以混合使用2种以上。在使用2种以上的氧化还原酶的情况下，上述数值范围为其合计量。
反应部根据可以使用的氧化还原酶而含有电子载体。反应部的电子载体的含量例如为2～15(mmol/L红细胞外液)，优选为3～15(mmol/L红细胞外液)，更优选为3～8(mmol/L红细胞外液)。应予说明，电子载体可以单独使用1种，或者，只要能够实现本发明的目的效果，则可以不添加电子载体，也可以混合使用2种以上。在使用2种以上的电子载体的情况下，上述数值范围为其合计量。
在不损害本发明的目的效果的程度下，反应部可以含有上述显色试剂、氧化还原酶和折射率调节剂以外的试剂，例如，上述辅酶、缓冲剂(例如，Tris缓冲剂、Tricine缓冲剂、HEPES缓冲剂、磷酸缓冲剂、乙酸缓冲剂等)、酶(例如，心肌黄酶、过氧化酶、葡萄糖激酶、己糖激酶、脂蛋白脂肪酶、甘油激酶等)、苯胺化合物(例如，N-(3-磺基丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3-甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3,5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺基丙基)-3-甲基苯胺、N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3,5-二甲氧基苯胺等)、酚类(例如，苯酚、4-氯苯酚、3-甲基苯酚、3-二甲基氨基苯甲酸、3-羟基-2,4,6-三碘苯甲酸等)、表面活性剂等。
反应部26的形成方法没有特别限制，例如，可以在板片30中的任一者或两者涂布含有显色试剂、氧化还原酶、折射率调节剂和根据需要使用的其它试剂的涂布液(例如，本发明的第2方面涉及的组合物)，根据需要使涂膜干燥而形成。反应部26的形成中使用的涂布液可以任意地含有溶剂。作为这样的溶剂，例如，可例示选自水、低级醇(例如，甲醇、乙醇、1-丙醇、异丙醇等)、酮类(例如，丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、二异丁基酮、环己酮、二丙酮醇等)、二甲基亚砜、甘油等中的1种或者2种以上的混合物，但并不限定于这些。
检测用芯片12以具有以上的空腔部20的方式由一对板片30和一对隔离件32构成芯片主体部18。一对板片30在侧面视中分别形成为上述的长方形，相互在层叠方向配置。即，一对板片30构成芯片主体部18的两侧面(左侧面和右侧面)。各板片30的板厚非常小，例如，可以设定为5μm～50μm左右的相同尺寸。2个(一组)板片30的厚度可以相互不同。
一对板片30具有即使从与面方向正交的方向施加某种程度的按压力，仍维持板形状而不会产生塑性变形的强度。另外，各板片30以测定光能够透过的方式呈透明或半透明地构成。此外，各板片30优选形成为具有适度的亲水性的平坦的板面(或者在板面涂布有涂布剂)以使血液能够在空腔部20流动。
构成各板片30的材料没有特别限定，可以应用热塑性树脂材料、玻璃、石英等。作为热塑性树脂材料，例如可举出聚烯烃(例如，聚乙烯、聚丙烯等)、环烯烃聚合物、聚酯(例如，聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚萘二甲酸乙二醇酯等)、聚氯乙烯、聚苯乙烯、ABS树脂、丙烯酸树脂、聚酰胺、氟树脂等高分子材料或它们的混合物。
另外，一对隔离件32以被夹持在一对板片30之间的方式配置，通过规定的接合手段(粘合剂等)牢固被粘接于各板片30的对置面。即各隔离件32是通过以使一对板片30彼此分离的方式在中间配置，从而在一对板片30和一对隔离件32自身之间形成空腔部20的构成。此时，一个隔离件32以与图3中的芯片主体部18的上侧长边22a相接并沿着该上侧长边22a在前端和基端方向延伸的方式配置。另一个隔离件32以与图3中的芯片主体部18的下侧长边22b相接并沿着该下侧长边22b在前端和基端方向延伸的方式配置。
构成一对隔离件32的材料没有特别限定，例如可举出苯乙烯系、聚烯烃系、聚氨酯系、聚酯系、聚酰胺系、聚丁二烯系、反式聚异戊二烯系、氟橡胶系、氯化聚乙烯系等各种热塑性弹性体。或者，除了热塑性弹性体以外，也可以应用可弹性变形的各种材料，另外，也可以应用可弹性变形的多孔质体(例如海绵)等结构体、双面胶带。此外，也可以作为在基材的一侧或两面具有通过在一对板片30之间成为固化状态或半固化状态而将板片30彼此粘接的粘接剂的隔离件32应用。另外，隔离件32进一步可以为如下构成：通过含有反应部26，从而随着血液样品的流入而在空腔部20溶出反应部26。
板片30、隔离件32可以为进行了亲水化处理的板片30、隔离件32。作为亲水化处理的方法，例如可举出通过浸渍法或喷涂法等涂布除表面活性剂、聚乙二醇、聚丙二醇、羟丙基纤维素、水溶性硅油之外还含有聚丙烯酸、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酰胺等亲水性高分子的水溶液的方法，等离子体照射、辉光放电、电晕放电、紫外线照射等方法等，这些方法可以单独或组合。
通过隔离件32形成的一对板片30之间的距离例如为5μm～200μm，优选为0μm～100μm。
检测用芯片12以以上的方式构成。接着对检测装置10的装置主体16进行说明。
如图1所示，检测装置10具有构成外观的壳体40。壳体40包括箱体部44和筒状的测光块46，所述箱体部44为用户容易把持操作的大小且在其内部收纳有检测装置10的控制部42，所述筒状的测光块46从箱体部44的一边(前端侧)向前端方向突出且在内部收纳有光学系的测定部14。另外，在箱体部44的上表面设置有电源按钮48、操作按钮50、显示器52，在测光块46的上表面设置有弹出杆54。
电源按钮48在用户的操作下切换检测装置10的启动和启动停止。操作按钮50在成为启动状态的检测装置10中，作为基于用户的操作，进行分析对象物的测定、显示并且切换测定结果(包括过去的测定结果)的显示的等操作部件而发挥功能。显示器52由液晶、有机EL等构成，显示如测定结果的显示、错误显示等那样在测定操作中向用户提供的信息。
弹出杆54在前端和基端方向可移动地设置，解除设置于测光块46内的弹出销56的锁定，使弹出销56能够向前端方向前进(参照图2)。
另一方面，为了将前端压靠于用户的手指等，装置主体16的测光块46从箱体部44向前端方向较长地延伸。如图2所示，在该测光块46中设置有具有插入孔58的芯片安装部60和光学检测血中的分析对象物的测定部14。
芯片安装部60由具有高的硬质性(刚性)的材料(例如，不锈钢)形成为在前端侧具有向外方向突出的凸缘部60a，在轴方向具有规定长度的筒状。该芯片安装部60遍及由树脂材料构成的测光块46的前端面和轴心部(中心部)进行定位固定。如图4A所示，在测光块46的内表面突出形成有将芯片安装部60牢固地固定的固定壁46a。
作为构成芯片安装部60的材料，例如，可举出不锈钢、钛等金属；进行了防蚀铝皮膜处理的铝；液晶聚合物；添加了玻璃、云母等填料的塑料；通过镀镍等对表面进行了固化皮膜的塑料；碳纤维、精细陶瓷等硬质且尺寸不容易变化并且即使反复进行检测用芯片12的拔出插入也不易磨损且能够尺寸精度良好地加工的材料。其中，如果应用金属材料，则在制造芯片安装部60(注射成型、压制成型等)时，能够高尺寸精度且容易地将插入孔58成型。应予说明，装置主体16通过由硬质的材料(例如，金属材料)构成测光块46自身，可以将芯片安装部60一体成型。
通过被该芯片安装部60的壁部62包围，从而在芯片安装部60的轴心部设置插入孔58。插入孔58形成为在上下方向长、在左右宽度方向短的截面长方形。插入孔58在将测光块46固定于芯片安装部60的状态下从其前端面向内部(基端方向)具有规定深度。
在芯片安装部60的前端侧形成有与插入孔58相连并且与外部连通的插入开口部58a。该插入开口部58a的上下方向的尺寸与检测用芯片12的短边24的尺寸(上下方向的长度)一致。另外，如图4A所示，插入开口部58a的左右宽度方向的尺寸，即构成插入孔58的侧面的一对壁部62的间隔与测定用芯片12的层叠方向的厚度(图4A中的Tall)实质相同。
如图4A所示，芯片安装部60在插入孔58(测定用孔部59)延伸的中途位置与测光块46的固定壁46a协同地形成有一对元件收纳空间64。一对元件收纳空间64为测定部14的一部分，夹持插入孔58并相互设置于对置位置，介由由芯片安装部60形成的各导光部66与测定用孔部59连通。
测定部14通过在一个元件收纳空间64收纳发光元件68而构成发光部70，通过在另一个元件收纳空间64收纳光接收元件72而构成光接收部74。芯片安装部60的导光部66通过形成为具有适当的直径的圆形的孔，发挥所谓光圈(aperture)的作用。
发光部70的发光元件68包括第1发光元件68a和第2发光元件68b，其中，所述第1发光元件68a对检测用芯片12照射具有第1波长的测定光，所述第2发光元件68b对检测用芯片12照射具有与第1波长不同的第2波长的测定光(图2中省略图示)。第1发光元件68a和第2发光元件68b并排设置于朝向元件收纳空间64的导光部66的位置。
发光元件68(第1和第2发光元件68a、68b)可由发光二极管(LED)构成。第1波长为用于检测与血糖量对应的试剂26的显色浓度的波长，例如为600nm～680nm。第2波长例如为用于检测血液中的红细胞浓度的波长，例如为510nm～540nm。箱体部44内的控制部42供给驱动电流，使第1和第2发光元件68a、68b分别在规定时机发光。此时，使用由红细胞浓度得到的血细胞比容值对由显色浓度得到的测定值进行校正，求出分析对象物的含量(例如，血糖值)。应予说明，通过进一步用其它测定波长进行测定，可以校正起因于血细胞的噪音。
光接收部74在朝向元件收纳空间64的导光部66的位置配置1个光接收元件72而构成。该光接收部74接收来自检测用芯片12的透过光，例如，可由光电二极管(PD)构成。
另外，在插入孔58的底部(基端面)设置有与弹出杆54连接的弹出销56(弹出部)。弹出销56具备沿着测光块46的轴方向延伸的棒部56a和在棒部56a的前端部沿着径向外侧为较大直径的接受部56b。插入于插入孔58的检测用芯片12的基端边24b与接受部56b接触。另外，在插入孔58的底部与弹出销56的接受部56b之间设置有非接触地包围弹出销56的螺旋弹簧76。螺旋弹簧76弹性地支撑弹出销56的接受部56b。
弹出销56随着基于用户的检测用芯片12的插入而按下接受部56b，从而移位到基端方向，通过设置于壳体40内的未图示的锁定机构进行锁定(固定)。螺旋弹簧76根据接受部56b的移位而弹性地收缩。而且，通过用户的弹出杆54的操作而弹出销56略微移动时，锁定机构的锁定被解除，通过螺旋弹簧76的弹性恢复力而滑动到前端方向。由此，检测用芯片12被弹出销56挤出，从插入孔58取出。
返回到图1，装置主体16的控制部42例如由具有未图示的运算部、存储部、输入输出部的控制电路构成。该控制部42可应用周知的计算机。控制部42例如在用户的操作按钮50的操作下，驱动控制测定部14而检测和算出分析对象物，在显示器52中显示算出的值(分析对象物的含量)。
例如，在使测定光透过检测用芯片12而测定分析对象物(例如，葡萄糖)的检测装置10中，控制部42基于以下的式(A)表示的Beer-Lambert定律算出测定结果。
log10(I1/I0)＝-αL…(A)
上述式(A)中，l0为入射到血液样品前的光的强度，l1为从血液样品射出后的光的强度，α为吸光系数，L为测定光通过的距离(比色皿长度)。
实施例
使用以下的实施例和比较例说明本发明的效果。但是，本发明的技术范围并不仅限制于以下的实施例。
＜折射率调节剂的折射率上升能力＞
对于各折射率调节剂，准备在0～350mg/ml的范围内制备成多个浓度的水溶液。利用折射仪PAL-RI(ATAGO株式会社)求出各水溶液的折射率。在横轴绘制各水溶液的浓度，在纵轴对每个折射率调节剂绘制折射率而制成图，求出近似直线的斜率(表1“折射率上升能力”的值是指每1[mg/ml]的折射率增加量，斜率越大表示折射率调节剂的折射率上升能力越高)。将其结果示于表1。应予说明，表1中“无法测定”是指因沉淀的产生而无法制作水溶液。
＜折射率调节剂的红细胞缩小能力＞
从1.0ml的血液样品(血细胞比容值：40)回收400μL量的血浆。以相对于回收的400μL的血浆，浓度为125mM的方式添加折射率调节剂。将添加折射率调节剂后的血浆与原来的血液样品合并，颠倒混合(血液样品中的折射率调节剂的浓度为50mM)。将颠倒混合5分钟后的样品填充于血细胞比容管，通过血细胞比容离心机以11×103rpm离心分离5分钟。读取离心分离后的血细胞比容值(Ht)。从添加折射率调节剂前的血细胞比容值(＝40)减去离心分离后的血细胞比容值(Ht)而求出血细胞比容值变化量(ΔHt)(ΔHt越大，表示折射率调节剂的红细胞缩小能力越高)。将其结果示于表1。应予说明，表1中，“无法测定”表示折射率调节剂的溶解度低而无法测定。
＜光谱测定＞
将光谱测定中使用的评价系统的概要示于以下。另外，将评价系统的概要示于图6：
光源 卤素光源 SPL-2H(KLV株式会社)
光纤连接器 SMA
适合纤维：纤芯直径＝200μ以上
分光计 小型光纤光学分光器 USB2000+(Ocean Optics公司)
检测器范围 200～1100nm。
使用各实施例和比较例中得到的血糖值检测用芯片进行光谱解析。应予说明，由于血糖值检测用芯片的隔离件厚度为50μm，因此，光路长度为50μm。为了将各实施例和比较例间的血液点样量的差异标准化，在间隙35μm的情况下对各测定波长处的吸光度(实测值)进行校正，由校正后的吸光度求出透过率。将由点样前的光谱解析得到的透过率曲线示于图7A。应予说明，吸光度的校正通过将各测定波长处的吸光度(实测值)除以各芯片中实测的间隙(CL)(μm)的值并进一步乘以35(μm)而进行。
接着，向上述血糖值检测用芯片点样血液样品(血细胞比容值：40)，进行点样后10～15秒的光谱解析。以得到的光谱解析结果为基础，与点样前同样地对吸光度进行校正而求出透过率。将由点样后的光谱解析得到的透过率曲线示于图7B。另外，作为表示红细胞与红细胞外液的折射率差减少的指标，将810nm处的透过率示于表1。
由点样后的透过率曲线求出在545nm观察到的峰极小值的透过率和在575nm观察到的峰极小值的透过率。将其结果示于表1。应予说明，表1中，“◎”表示在545nm和575nm观察到的两峰极小值的透过率为15％以上。表1中，“○”表示在545nm和575nm观察到的任一个峰极小值的透过率为15％以上。表1中，“×”表示在545nm和575nm未观察到峰，或者在545nm和575nm观察的两峰极小值的透过率小于15％。应予说明，将比较例2的Wst-1和比较例3的Wst-8通过NaOH水溶液进行了处理的还原体的值记载于表1。
在各实施例和比较例的条件下，使用点样前的芯片测定的650nm(WST-4的吸收峰波长)处的吸光度的值与使折射率调节剂溶解于水并以光路长度50μm测定的吸光度值实质上没有不同。因此，由点样前的透过率曲线求出WST-4的吸收峰波长即650nm处的折射率调节剂的透过率。将其结果示于表1。应予说明，表1中，“◎”表示650nm处的透过率为60％～100％，“○”表示650nm处的透过率为40％以上且小于60％，“×”表示650nm处的透过率小于40％。
＜析出物＞
血糖值检测用芯片的制造工序中，在涂膜形成后干燥前，目视确认析出物的有无。
＜溶解度＞
表1所示的折射率调节剂的溶解度是在20℃的水中的溶解度。应予说明，表1的“×”是指在20℃的水中的溶解度为50mM以下。
(实施例1-1)
使35μkat(2104U)的葡萄糖脱氢酶(氧化还原酶；FAD-GDH GDL-351，东洋纺株式会社)、12.5μmol的2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-[4-(2-磺基乙基氨基甲酰基)苯基]-2H-四唑钠盐(显色试剂；WST-4、吸收峰波长650nm)、0.25μmol的1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯(电子载体；m-PMS)和22.5μmol的Acid Yellow 23(折射率调节剂；AY23)溶解于162.5μl的纯水，制备涂布液。
接着，使用上述涂布液制作图5所示的血糖值检测用芯片。具体而言，以1.5mm×3mm的尺寸且干燥后厚度为约15μm的方式对进行了亲水化处理的聚对苯二甲酸乙二醇酯制的板片30a’涂布上述涂布液，在25℃使涂膜干燥12小时，形成反应部26’。接着，以沿着板片30a’的两端的方式，在反应部26’的左右，利用粘合剂将一对隔离件32’(聚酯膜基材，厚度50μm)贴附于板片30a’。最后，利用粘合剂将与板片30a’相同大小的板片30b’贴附于上述一对隔离件32’的与板片30a’相反的面。如此得到血糖值检测用芯片12’。实际得到的芯片的反应部26’的厚度库利用Optical MicroGauge厚度计(C11011-01，浜松Photonics株式会社)测定。板片30b’与反应部26’之间的间隙(CL)从隔离件32’的厚度(50μm)减去反应部26’的厚度而求出。
(实施例1-2)
将实施例1-1的WST-4的量变更为49.9μmol，使用27.1μmol的1,3-苯二磺酸(DSB)代替Acid Yellow 23，除此以外，与实施例1-1同样地得到血糖值检测用芯片。
(实施例1-3)
使用30.2μmol的三氯蔗糖代替实施例1-1的Acid Yellow 23，除此以外，与实施例1-1同样地得到血糖值检测用芯片。
(实施例1-4)
使用35.1μmol的海藻糖代替实施例1-1的Acid Yellow 23，除此以外，与实施例1-1同样地得到血糖值检测用芯片。
(实施例1-5)
使用26.5μmol的Orange G(OG)代替实施例1-1的Acid Yellow 23，除此以外，与实施例1-1同样地得到血糖值检测用芯片。
(实施例1-6)
使用19.9μmol的Acid Red 27(AR27)代替实施例1-1的Acid Yellow23，除此以外，与实施例1-1同样地得到血糖值检测用芯片。
(比较例1)
使用20.5μmol的Acid Fuchsin(AF)代替实施例1-1的Acid Yellow 23，除此以外，与实施例1-1同样地得到血糖值检测用芯片。
(比较例2)
代替实施例1-1的Acid Yellow 23，将18.4μmol的2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑钠盐用于涂布液的制备，但对血液样品的溶解性低，无法进行光谱解析。
(比较例3)
代替实施例1-1的Acid Yellow 23，将20.0μmol的2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑钠盐用于涂布液的制备，但对血液样品的溶解性低，无法进行光谱解析。
(比较例4)
代替实施例1-1的Acid Yellow 23，将22.0μmol的Acid Blue 1用于涂布液的制备，但对水的溶解性低，从涂布液产生析出物。另外，对血液样品的溶解性低，无法进行光谱解析。
(参考例1)
不具有反应部26’，除此以外，制作与实施例1-1同样的芯片。使用该芯片进行血液样品的光谱解析。应予说明，波长810nm处的血液(血细胞比容值：40)的透过率为25％。
[表1]
根据上述表1和图7B，实施例中，长波长区域的透过率比血液样品提高。由此可知，通过红细胞与红细胞外液的折射率差降低，使作为噪音的由红细胞引起的散射降低。因此，根据本发明，能够在不需要来自血液样品的成分的分级情况下高精度地检测分析对象物。
(实施例2)
使35μkat(2104U)的葡萄糖脱氢酶(氧化还原酶；FAD-GDH GDL-351，东洋纺株式会社)、12.5μmol的WST-4(显色试剂)、0.25μmol的m-PMS(电子载体)和22.5μmol的AcidYellow 23(折射率调节剂；AY23)溶解于190μl的纯水，制备涂布液。
如下述表2那样变更涂膜的厚度，除此以外，通过与实施例1-1同样的方法制作血糖值检测用芯片。应予说明，反应部26’的厚度通过增减涂布次数进行调整。反应部26’的厚度利用Optical MicroGauge厚度计(C11011-01，浜松Photonics株式会社)测定。板片30b’与反应部26’之间的间隙(CL)从隔离件32’的厚度(50μm)减去反应部26’的厚度而求出。通过下述式算出血液点样后的红细胞外液的体积以及血液样品点样后的显色试剂和折射率调节剂各自的浓度(点样时浓度)。
(血液点样后的体积的计算)
血液点样后的红细胞外液的体积(L)
＝血液流入量(L)×(1-血细胞比容值×10-2)
＝(间隙(CL)(mm)×1.5(mm)×3(mm)×10-6)×0.6
(显色试剂浓度)
显色试剂浓度(mmol/L红细胞外液)
＝显色试剂的存在量(mmol)/(血液点样后的红细胞外液的体积(L)+反应部26’的体积(L))
(折射率调节剂的浓度)
显色试剂浓度(mmol/L红细胞外液)
＝显色试剂的存在量(mmol)/(血液点样后的红细胞外液的体积(L)+反应部26’的体积(L))
向上述的血糖值检测用芯片点样血液样品(血细胞比容值：40)，测定810nm的吸光度(实测值)。为了将各血糖值检测用芯片间的血液样品点样量标准化而进行比较，通过将吸光度(实测值)除以各芯片的间隙(μm)的值并进一步乘以35(μm)，将间隙校正为35μm。将校正后的吸光度Abs示于图8。另外，将各芯片的间隙(实测值)除以点样开始25秒后的吸光度(35μm校正前的实测值)而得的值(CL/Abs810)示于表2。CL/Abs810表示相对于间隙的散射光的影响度，该值的值越大，表示越能够有效地抑制散射光的产生。
[表2]
(实施例3)
将实施例2的Acid Yellow 23变更为三氯蔗糖，除此以外，与实施例2同样地制作血糖值检测用芯片。将吸光度(实测值)校正为间隙35μm时而得的结果示于图9。应予说明，图9的吸光度Abs也通过与实施例2同样的方法进行校正。另外，将各芯片的间隙(实测值)除以点样开始25秒后的吸光度(35μm校正前の实测值)而得的值(CL/Abs810)示于表3。CL/Abs810表示相对于间隙的散射光的影响度，该值的值越大，表示越能够有效地抑制散射光的产生。
[表3]
本申请基于2016年9月28日提出申请的日本专利申请第2016-190379号，将其公开内容通过参照全部援引入本说明书中。
符号说明
10 检测装置、
12,12’ 检测用芯片、
14 测定部、
16 装置主体、
18 芯片主体部、
20 空腔部、
20a 前端口部、
20b 基端口部、
22 长边、
22a 上侧长边、
22b 下侧长边、
24 短边、
24a 前端边、
24b 基端边、
26,26’ 反应部、
28 测定对象部、
30,30’ 板片、
32,32’ 隔离件、
40 壳体、
42 控制部、
44 箱体部、
46 测光块、
48 电源按钮、
50 操作按钮、
52 显示器、
54 弹出杆、
56 弹出销、
56a 棒部、
566 接受部、
58 插入口、
58a 插入开口部
59 测定用孔部、
60 芯片安装部、
60a 凸缘部、
62 壁部、
64 元件收纳空间、
66 导光部、
68 发光元件、
70 发光部、
72 光接收元件、
74 光接收部、
76 螺旋弹簧。

Claims (17)

1.一种检测血液样品中的分析对象物的方法，包括：
(1)准备所述血液样品，
(2)通过使折射率调节剂溶解于所述血液样品，得到使红细胞与红细胞外液的折射率差减少的分析样品，以及
(3)使用所述分析样品来检测所述分析对象物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述(2)中，以所述分析样品在700nm～950nm的范围内具有透过率为50％以上的波长的方式使所述折射率调节剂溶解于所述血液样品。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，包括使显色试剂溶解于所述血液样品或所述分析样品而进行显色反应，
所述分析对象物的检测是基于由所述显色反应产生的显色强度进行的。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述显色试剂的吸收峰波长处的所述折射率调节剂的摩尔吸光系数为200L/(mol·cm)以下。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，所述显色试剂为四唑盐。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，所述折射率调节剂在20℃的水中的溶解度为100mM以上。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，在750nm～850nm的波长区域中，所述分析样品的透过率比所述血液样品的透过率高。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，所述折射率调节剂为选自下述式(1)表示的化合物、苯磺酸化合物和二糖类以及它们的盐中的1种以上，
Q1-N＝N-Q2 式(1)
其中，上述式(1)中，Q1和Q2各自独立地表示可以具有1个以上的取代基的芳基或含氮杂环基；所述取代基选自卤素原子、羟基、碳原子数1～3的烷基、碳原子数1～3的烷氧基、羧基、磺基、氨基、氨基甲酰基、氨磺酰基、苯基、羧基苯基和磺基苯基。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，所述分析对象物选自葡萄糖、胆固醇、中性脂肪、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和尿酸。
10.一种用于检测血液样品中的分析对象物的组合物，含有显色试剂、氧化还原酶和折射率调节剂。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中，所述显色试剂的吸收峰波长处的所述折射率调节剂的摩尔吸光系数为200L/(mol·cm)以下。
12.根据权利要求10或11所述的组合物，其中，所述显色试剂为四唑盐。
13.根据权利要求10～12中任一项所述的组合物，其中，所述折射率调节剂为选自下述式(1)表示的化合物、苯磺酸化合物和二糖类、以及它们的盐中的1种以上，
Q1-N＝N-Q2 式(1)
其中，上述式(1)中，Q1和Q2各自独立地表示可以具有1个以上的取代基的芳基或含氮杂环基；所述取代基选自卤素原子、羟基、碳原子数1～3的烷基、碳原子数1～3的烷氧基、羧基、磺基、氨基、氨基甲酰基、氨磺酰基、苯基、羧基苯基和磺基苯基。
14.根据权利要求10～13中任一项所述的组合物，其中，所述折射率调节剂的含量相对于所述显色试剂1摩尔为0.2～5摩尔。
15.根据权利要求10～14中任一项所述的组合物，其中，所述分析对象物选自葡萄糖、胆固醇、中性脂肪、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和尿酸。
16.一种用于检测血液样品中的分析对象物的芯片，具有含有显色试剂、氧化还原酶和折射率调节剂的反应部。
17.根据权利要求16所述的芯片，其中，所述反应部的所述折射率调节剂的含量为330～800(mmol/L红细胞外液)。
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