JPWO2018043636A1 - 皮膚分析又は観察用検体の調製方法 - Google Patents

皮膚分析又は観察用検体の調製方法 Download PDF

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Abstract

皮膚常在菌及び／又は角層に存在するタンパク質、脂質等の物質を幅広く分析するため、又は角層形状を観察するための検体の調製方法を提供する。皮膚常在菌及び／又は角層に存在する物質を分析、又は角層形状を観察するための検体の調製方法であって、ポリビニルアルコール系重合体を含有する溶液を、薄膜が形成されるように皮膚上に塗布し、形成された薄膜を剥離回収することを特徴とする、方法。

Description

本発明は、皮膚分析又は観察用検体の調製方法に関する。より詳細には、皮膚常在菌及び／又は角層に存在する物質を分析、又は角層形状を観察するための検体調製方法に関する。
近年、皮膚常在菌による皮膚への影響（有用性等）が注目を集めている。皮膚常在菌は皮膚上に存在する微生物のことであり、汗や皮脂等を栄養源としている。これらの皮膚常在菌は、皮膚上でバランスがとれていると病原菌やカビの増殖を抑える等の有用な働きをするが、ストレス等で異常増殖し、皮膚に悪影響を及ぼす場合もある。例えば、皮脂の分泌と毛穴詰まりが同時に起こることで、アクネ菌が異常増殖しニキビを引き起こす。したがって、皮膚上の常在菌、あるいはその栄養源となる皮脂等の角層に存在する物質を分析すること、或いは皮溝、皮丘、肌理、毛孔、皺といった採取角層両面の形状を客観的に把握することは、肌トラブルの原因追究や化粧品の開発にとって非常に重要である。また、皮膚常在菌が作り出す様々な代謝物（例えばグリセリン、遊離脂肪酸等）と常在菌を同時に採取することができれば、これらの菌の有用性のメカニズムを調べる上で非常に有用であると考えられる。
従来、皮膚常在菌や角層の採取は、主としてスワブ法（非特許文献１）やテープストリッピング法（非特許文献２）が用いられている。スワブ法は、皮膚表面の常在菌や角層を、綿棒等を使って拭き取って捕捉し、その綿棒を溶媒で洗い流して検体を回収する方法であり、テープストリッピング法は、粘着剤が塗布されたテープを皮膚に貼付し、テープに付着した常在菌や角層を回収する方法である。
しかし、スワブ法は、採取する人により力のかけ方が異なる、拭い残しが生じる可能性がある、綿棒に付着した菌をすべて洗い流せない等の問題があり、安定して菌の回収ができているか定かではない。また、菌に限らず他の皮膚上の成分についても綿棒からの回収率が低い、角層まで充分に採取できない等、回収できる検体が限られていた。
テープストリッピング法は、一般的に、使用するテープ中の粘着剤成分が開示されておらず、テープによっては付着した菌を回収するためには有機溶剤を使用する必要があり、皮膚常在菌を生きたまま回収することは不可能であった。また、粘着剤によって検体を採取する生体あるいは回収する菌体に害を及ぼすことが考えられた。また、テープには支持体がついているため、曲線を有する箇所の菌や角層を採取しようとすると隙間ができてしまい回収率が下がる、テープの幅により回収できる範囲が限定される等の問題点があった。
また、テープストリッピング法では角層を回収することは可能であるが、複数ある層のうち表面の一層または数層しか回収ができないため、この方法でも角層中の成分を分析する場合に十分な量の検体を得られない可能性があった。
また、角質細胞の面積と体積を測定する方法として、ビニルピロリドン・酢酸ビニル共重合体を含む水溶性の固着剤を支持体に塗工した角質細胞採取用具を皮膚に貼付した後、固着剤から角質細胞を採取する方法が報告されている（特許文献１）。
しかしながら、斯かる方法は体積形状を損なわずに角質細胞を採取するものであり、角質細胞の分散にプロテアーゼや界面活性剤を用いることから、皮膚常在菌を生きたまま分析するための検体調製法とは云えず、また、支持体を用いることから、支持体に重合物が残り定量性が保たれない、湾曲した部位の検体採取には適さないという問題がある。
さらに、ビニルピロリドン・酢酸ビニル共重合体は水系溶媒への溶解度が低く、皮膚に塗布するためにはエタノール等の有機溶媒を使用する必要があるため、皮膚常在菌を生きたまま回収することは不可能であること、ビニルピロリドン・酢酸ビニル共重合体単独では粘度が低く、成膜性が悪いため、皮膚へ塗布するためにはヒドロキシプロピルメチルセルロース等の粘度を上昇させる成分を添加する必要があり、これらの成分が検体の分析を妨げる可能性があることも懸念されている。
特許第３８６８３４５号公報
Costello et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science, 326, 1694-1697, 2009. B.Lange-Asschenfeldt el al. Distribution of bacteria in the epidermal layers and hair follicles of the human skin. Skin Pharmacol. Physiol., 24,305-311,2011.
本発明は、皮膚常在菌及び／又は角層に存在するタンパク質、脂質等の物質を幅広く分析するため、又は角層形状を観察するための検体の調製方法を提供することに関する。
本発明は、上記課題に鑑み検討したところ、ポリビニルアルコール系重合体を含有する溶液を皮膚上に塗布して薄膜を形成させることにより、当該薄膜中の皮膚常在菌を生菌の状態で回収できると共に、角層に含まれる物質を効率良く回収でき、これを用いることにより、皮膚常在菌や角層に存在する種々の物質の分析が可能となること、また採取角層両面の形状を的確に観察できることを見出した。
すなわち、本発明は、以下の１）〜１２）に係るものである。
１）皮膚常在菌及び／又は角層に存在する物質を分析、又は角層形状を観察するための検体の調製方法であって、ポリビニルアルコール系重合体を含有する溶液を、薄膜が形成されるように皮膚上に塗布し、形成された薄膜を剥離回収することを特徴とする方法。
２）皮膚常在菌が生菌を含む１）に記載の方法。
３）角層に存在する物質が、タンパク質、アミノ酸、脂質、核酸、糖、ビタミン、ホルモン及びペプチドから選ばれる１種または２種以上を含む１）又は２）に記載の方法。
４）角層形状を観察するための検体の調製方法であって、剥離回収された薄膜を、顕微鏡観察用支持体に固定化し、ポリビニルアルコール系重合体を溶解除去した後乾燥することを含む、１）に記載の方法。
５）固定化が、顕微鏡観察用支持体に塗布された固定化剤に貼付するものである４）に記載の方法。
６）ポリビニルアルコール系重合体が、ケン化度が７０〜９９モル％のポリビニルアルコール系重合体である１）〜５）のいずれかに記載の方法。
７）ポリビニルアルコール系重合体が、重合度が５０〜３，０００のポリビニルアルコール系重合体である１）〜６）のいずれかに記載の方法。
８）ポリビニルアルコール系重合体が、粘度（４％水溶液、温度２０℃）が４〜６０ｍＰａ・ｓのポリビニルアルコール系重合体である１）〜７）のいずれかに記載の方法。
９）ポリビニルアルコール系重合体を含有する溶液が、１０〜３０質量％のポリビニルアルコール系重合体溶液である１）〜８）のいずれかに記載の方法。
１０）ポリビニルアルコール系重合体を含有する溶液を、皮膚上に塗布後、室温で２０分以上放置する、１）〜９）のいずれかに記載の方法。
１１）１）〜１０）のいずれかに記載の方法により調製された皮膚分析又は観察用検体。
１２）４）又は５）に記載の方法により調製された皮膚観察用検体を用いて、顕微鏡観察することを特徴とする角層形状の観察方法。
本発明の方法によれば、身体の部位を問わず、低侵襲でかつ簡便に、皮膚常在菌を生菌の状態で回収でき、また角層に存在する物質を効率良く回収できる。また、皮溝、皮丘、肌理、毛孔、皺、採取角層の深度といった採取角層両面の状態を適格に観察できる。
前腕部採取角層の表裏の顕微鏡観察画像。 前額部採取角層の表裏の顕微鏡観察画像。
本発明の皮膚分析又は観察用検体の調製方法は、皮膚常在菌又は角層に存在する物質を分析、又は角層形状を観察するための検体の調製方法であって、ポリビニルアルコール系重合体を含有する溶液を、薄膜が形成されるように皮膚に塗布し、形成された薄膜を剥離回収するものである。
本発明の皮膚分析の対象の一つには皮膚常在菌が挙げられる。皮膚常在菌とは、ヒトの皮膚上に生育している細菌を意味するが、本発明において、その菌種は特に限定されるものではない。皮膚常在菌は、個人差、部位差、あるいは季節変動等があると考えられているが、嫌気性最優勢菌としてアクネ菌（Propionibacterium acnes）が、好気性菌として、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）やスタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）が生息している。皮膚常在菌は、他の病原微生物からの生体防御と疾患発現に関連があるとされ、外傷、病気等による全身状態の不良、精神的ストレス、寒冷、乾燥、不適切な洗浄等によって皮膚常在菌のバランスが崩れると、スタフィロコッカス・アウレウス、アクネ菌等が過剰増殖し、様々な皮膚症状が誘発され、疾患発現が起こることが知られている。また、スタフィロコッカス・エピデルミディス等の有用菌は皮脂を分解し、グリセリンと遊離脂肪酸を産生するため、保湿に効果的である他、皮膚を酸性に保ち、カビ等の増殖を抑制することが知られている。本発明においては、アクネ菌、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミディス等を含む皮膚常在菌を、生菌のまま回収することができる。
本発明の皮膚分析の対象としては、さらに角層に存在する物質が挙げられる。角層に存在する物質とは、角層表面（皮膚表面）又は角層中に存在する物質を意味し、その由来や種類は特に限定されない。具体的には、ケラチン、フィラグリン等の角層構成成分の他、セラミド、コレステロール等の角層細胞間脂質構成成分、インターロイキン等のサイトカイン、ケモカイン、酵素等のタンパク質、皮膚常在菌の代謝産物、皮脂腺から分泌された皮脂、脂質、脂肪酸やホルモン等が包含される。
皮膚常在菌の代謝産物としては、例えば角層中に存在するタンパク質や脂質等の物質から、皮膚常在菌により分解・産生される様々な代謝産物が挙げられる。具体的には、皮脂から分解・産生されるトリグリセリド、ジグリセリド、脂肪酸、グリセリンが挙げられる。
また、角層（皮膚）表面に存在する物質には、アポクリン腺、エクリン腺から産生される汗や血漿の成分の他、アミノ酸、ペプチド等も含まれる。これらの成分の中でも特に、皮膚性状の指標となり、皮膚常在菌の分布に影響を受けやすいことからタンパク質、アミノ酸、脂質、核酸、糖、ビタミン、ホルモン、ペプチドの１種または２種以上を含むことが好ましい。
本発明の方法においては、上記皮膚常在菌を回収すると共に、角層に存在する物質を回収することができる。また、皮膚常在菌を生菌、死菌を含め、皮膚上に存在するそのままの状態で回収できるため、皮膚上のフローラを形成する菌種やその存在形態を解明することができる。
本発明の皮膚観察の対象としては、例えば角層形状が挙げられる。
すなわち、本発明の皮膚観察用検体を用いて、顕微鏡観察することにより、角層表面の微細構造、例えば、皮溝の状態（幅、傾斜角、密度）、皮溝と皮溝によって囲まれる皮丘の状態（すなわち肌理）、毛穴の大きさ、皺、採取角層の深度を、皮膚の外側から見た状態で、観察することが可能である。
本発明の皮膚分析又は観察用検体の調製においては、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）系重合体を含有する溶液（ＰＶＡ系重合体溶液）を、薄膜が形成されるように皮膚に塗布される。
ここで、ＰＶＡ系重合体は、［ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）］を単位構造として持つ重合物質であり、一般的に、ポリビニルエステルのケン化により製造される。当該ポリビニルエステルとしては、ギ酸ビニル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、酪酸ビニル、カプリン酸ビニル、ラウリル酸ビニル、パルミチン酸ビニル、ステアリン酸ビニル等が単独又は併用で用いられるが、酢酸ビニルが好適である。
また、本発明のＰＶＡ系重合体は、水酸基以外の官能基を有していてもよく、水酸基以外の官能基として例えば、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、スルホン基、リン酸基、カルボキシレート基、スルホン酸イオン基、燐酸イオン基、アンモニウム基、ホスホニウム基、シリル基、シロキサン基、アルキル基、アリル基、フルオロアルキル基、アルコシキ基、カルボニル基、ハロゲン基等が例示できる。
本発明のＰＶＡ系重合体のケン化度は、７０〜９９モル％であるのが好ましく、７５〜９５モル％であるのがより好ましく、８６．５〜８９．０モル％であるのがさらに好ましい。ここで、ＰＶＡ系重合体のケン化度は、ポリビニルエステルをケン化、すなわち加水分解して得られる水酸基のモルパーセント（モル％）であり、ＪＩＳ Ｋ６７２６に準拠した測定方法により測定される値である。
本発明のＰＶＡ系重合体の重合度は、薄膜形成や分析又は観察対象物の回収効率の点から、５０〜３，０００であるのが好ましく、５００〜２，５００であるのがより好ましく、６００〜２，４００であるのがさらに好ましい。ＰＶＡ系重合体の重合度は、ＪＩＳ Ｋ ６７２６に準拠して測定される。
一般に、重合度の違いは、一定濃度（通常は４％水溶液、２０℃）における粘度で代用することができる。本発明のＰＶＡ系重合体の粘度は、好ましくは４〜６０ｍＰａ・ｓ、より好ましくは４．５〜５２ｍＰａ・ｓである。ここで、粘度は、４％水溶液、温度２０℃の条件下で、ヘプラー粘度計を用いて算出した値である。
また、本発明のＰＶＡ系重合体の平均分子量は、２，２００〜１３２，０００であるのが好ましく、より好ましくは２０，０００〜１１０，０００である。
本発明において使用可能なＰＶＡ系重合体の市販品としては、例えば、日本合成化学株式会社製の商品名「ゴーセノール」シリーズから、ＥＧ−４０（粘度（４％，２０℃）：４０．０−４６．０ｍＰａ・ｓ、ケン化度：８６．５−８９．０ｍｏｌ％、重合度２４００）、ＥＧ−２５（粘度（４％，２０℃）：２０．５−２４．５ｍＰａ・ｓ、ケン化度：８６．５−８９．０ｍｏｌ％、重合度１８００）、ＥＧ−０５（粘度（４％，２０℃）：４．８−５．８ｍＰａ・ｓ、ケン化度：８６．５−８９．０ｍｏｌ％、重合度６００）等の各種グレードが例示される。
斯かるＰＶＡ系重合体は、単独で用いることも可能であるが、ケン化度若しくは重合度及び／又は粘度の異なるＰＶＡ系重合体を混合して用いてもよい。ケン化度若しくは重合度及び／又は粘度の異なるＰＶＡ系重合体を混合して用いることにより、粘度を変化させることができ、皮膚に対する密着度を変化させることができる。なお、薄膜形成の点から、重合度１,５００以上のＰＶＡ系重合体を1種類以上配合することが好ましい。
ＰＶＡ系重合体を含有する溶液（ＰＶＡ系重合体溶液）中のＰＶＡ系重合体の含有量は、ＰＶＡの分子量、ケン化度により異なるが、塗布した溶液の液だれの防止や乾きやすさの点から、通常１０〜３０質量％の濃度であり、好ましくは１２〜２５質量％、より好ましくは１５〜２５質量％、特に好ましくは１５〜２２質量％である。
また、溶液の溶媒としては、水、リン酸バッファー、生理食塩水を用いることが好ましく、特に水が好ましい。当該溶液中には、皮膚常在菌や角層に存在する物質に影響しない範囲で、エタノールを含有することができる。この場合、エタノールの含有量は、好ましくは０〜２０質量％、より好ましくは０〜５質量％である。なお、皮膚常在菌の生菌を回収する必要がある場合にはエタノールを含有しない溶媒を使用することが好ましい。また、ＰＶＡ系重合体溶液には、その後の分析に支障をきたす可能性があることから、固形物、タンパク質、アミノ酸、脂質等を含む添加物を用いないことが重要である。よって、ＰＶＡ系重合体溶液はＰＶＡ重合体及び溶媒のみを含有する。
ＰＶＡ系重合体溶液の皮膚への塗布は、皮膚表面で薄膜が形成されるように塗布すればよく、例えば、該溶液が皮膚表面に均一にかつ連続的に付着するように塗布される。塗布する方法は特に制限されないが、衛生的に保たれたスパチュラーを使用したり、チューブに入れたＰＶＡ系重合体溶液を直接塗布することが好ましい。
皮膚に塗布されたＰＶＡ系重合体溶液は、通常、室温で２０〜４０分程度放置することにより乾燥し、薄膜を形成する。ここで、薄膜とは、厚さ０．０３〜０．５ｍｍ、好ましくは０．０４〜０．２ｍｍである。
放置時間は、薄膜が形成されれば良いが、皮膚常在菌又は角層に存在する物質を十分に回収する点から、通常室温で、２０分間以上、好ましくは２０〜４０分間、より好ましくは２０〜３５分間、放置するのが好ましい。
形成された薄膜は、皮膚から剥離し、後の分析又は観察手段に応じて適宜処理される。すなわち、皮膚常在菌の分析や角層成分の分析用検体とする場合には、水、生理食塩水、ＰＢＳ、リンゲル液等の水系溶媒に溶解する、或いはメタノール、エタノール、酢酸エチル、アセトン、クロロホルム、ジエチルエーテル等の有機溶媒に溶解し、検体を抽出することにより、テープストリッピングと同様の方法で分析に供することができる。特に、皮膚常在菌の生菌を分析するためには、水系溶媒、特に生理食塩水またはＰＢＳに溶解することが好ましい。なお、検体の変性を防止するため、分析については室温以下で行うことが好ましい。
上述のとおり、本発明により得られた剥離した薄膜中には、表皮に生息する皮膚常在菌が生きたまま回収され、また角層も複数の層を同時に回収することができるため、角層中に存在する物質が効率よく回収される。したがって、剥離した薄膜は、皮膚常在菌を生菌として分析するための検体として、また、角層に存在する物質を分析するための検体として使用できる。例えば、本発明を使用して皮膚常在菌及び角層に存在する皮膚常在菌の代謝物、角層に存在する生体由来サイトカインといったタンパク質、リパーゼ、プロテアーゼのような酵素等を回収し、常在菌や代謝物、生体由来タンパク質の種類や量を特定して皮膚の状態との関連性を検証する場合、新規皮膚常在菌を単離してその性状を特定する場合、皮膚性状診断に利用する場合、化粧品や医薬品などの塗布前後の皮膚性状解析等に用いることができる。また、本発明は角層に存在する物質が効率よく回収することができるため、検体を含む溶解液を濃縮する必要がなく、効率的に分析を行うことができる。
本発明により調製された検体を用いた各種分析は、目的に応じ適宜公知の手法を用いて行うことができる。例えば、本発明の検体を水系溶媒に溶解した溶液からＤＮＡを抽出し、核酸増幅法を用いて目的とする皮膚常在菌の菌量を測定すること、次世代シークエンサーによる１６Ｓメタゲノム解析法を用いて網羅的に皮膚常在菌を解析すること、ＧＡＭ寒天培地等の培地に播種して生菌を測定すること、生菌と死菌の比率を測定すること、ＢＣＡプロテインアッセイ等によりタンパク質量を測定すること、ガスクロマトグラフィーにより脂肪酸を分析すること、ＣＥ−ＴＯＦ ＭＳ等を用いて皮膚上イオン性代謝物を網羅的に解析すること、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘなどのキットを用いて角層中のサイトカインを網羅的に解析すること、レーザーマイクロダイセクション法により、剥離した薄膜から一部を直接レーザーで切り出して回収することにより、皮膚上の特定の位置に存在する皮膚常在菌の遺伝子情報を得ること等が挙げられる。
また、形成された薄膜を、角層形状を観察するための検体として用いる場合は、剥離回収された薄膜は、表側から観察する場合は採取検体の角層側を顕微鏡観察用支持体に固定化され、ポリビニルアルコール系重合体を溶解除去した後乾燥し、顕微鏡観察用の検体とされる。また裏側を観察する場合は採取検体のポリビニルアルコール側を顕微鏡観察用支持体に固定化し、乾燥後顕微鏡観察用の検体とされる。
ここで、顕微鏡観察用支持体としては、金属、シリコン基板、スライドグラス、ディッシュ、シャーレ等の支持体が挙げられ、スライドグラス、ディッシュ、シャーレ等の透明支持体が好ましく、より好ましくはスライドグラスである。
斯かる支持体への薄膜の固定化は、例えば支持体に塗布された固定化剤に薄膜を貼付することにより行うことができる。
固定化剤としては、支持体へ接着し、且つ薄膜中の角層構造を固定化可能な非水溶性の化合物であればよく、さらに透明な化合物が好ましく、例えば、熱可塑性樹脂系（酢酸ビニル樹脂系、ポリビニルアセタール系、エチレン酢酸ビニル樹脂系、塩化ビニル樹脂系、アクリル樹脂系、ポリアミド系、セルロース系、α-オレフィン系）、熱硬化性樹脂系（ユリア樹脂系、メラミン樹脂系、フェノール樹脂系、レゾルシノール樹脂系、エポキシ樹脂系、構造用アクリル樹脂系、ポリエステル系、ポリウレタン系、ポリアロマティック系）、エラストマー系（クロロプレンゴム系、ニトリルゴム系、スチレンブタジエンゴム系、ポリサルファイド系、ブチルゴム系、シリコーンゴム系、アクリルゴム系、変成シリコーンゴム系、ウレタンゴム系、シリル化ウレタン樹脂系、テレケリックポリアクリレート系）等の有機系接着剤が挙げられる。
斯くして得られる顕微鏡観察用の検体を用いて、光学顕微鏡、電子顕微鏡等による観察を行うことにより、角層表面の微細構造の状態を皮膚の外側から見た状態で、観察することが可能である。
実施例１ 検体の調製
２種類のポリビニルアルコールＥＧ−４０（粘度（４％，２０℃）：４０．０−４６．０ｍＰａ・ｓ、ケン化度：８６．５−８９．０ｍｏｌ％、重合度２４００、日本合成化学（株）製）及びＥＧ−２５（粘度（４％，２０℃）：２０．５−２４．５ｍＰａ・ｓ、ケン化度：８６．５−８９．０ｍｏｌ％、重合度１８００；日本合成化学（株）製）をそれぞれ１５ｇずつ、８０℃に加熱した水１００ｇ中に添加した後、エタノールを２０ｇ加え、混合して、ＰＶＡ溶液を調製した（２０質量％）。
調製したＰＶＡ溶液（４００μＬ）を左額の一部（４ｃｍ２）に塗布し、室温で３０分程度乾燥後、形成された薄膜を剥離した。剥離した薄膜を２ｍＬのＰＢＳに浸し４℃で一晩静置した後、ボルテックスミキサーで撹拌し、本発明検体１を得た。なお、被験者３人に対して同様の操作を行った。
比較例１（スワブ法）
綿棒で右額の一部（４ｃｍ２）を２５往復した。当該綿棒の先を１ｍＬのＰＢＳに浸し４℃で一晩静置した後、ボルテックスミキサーで撹拌し比較検体１を得た。なお、被験者３人に対して同様の操作を行った。
試験例１ 皮膚常在菌の検出
（１）Propionibacterium acnes （アクネ菌）の検出
以下に示す方法により、上記で得られた本発明検体１及び比較検体１中のアクネ菌量を調べた。
まず、本発明検体１に遠心処理（１５，０００ｒｐｍ、１０分）を施し、得られた沈殿物に１ｍＬのＰＢＳを加えてボルテックスミキサーで撹拌し、同様の遠心処理を施し洗浄した。得られた沈殿物を２００μＬのＰＢＳに分散させた。分散液１００μＬに１００μＬのＰＢＳを添加し、さらに２５０μＬのＬｙｓｉｓバッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（pH9.0）、８０ｍＭ ＥＤＴＡ(pH9.0)）、５０μＬの１０％ ＳＤＳ溶液を加えた。その後、凍結融解を３回繰り返し、１００℃で煮沸後、室温まで冷却した。５００μＬのＴＥ飽和フェノール及び３００ｍｇのガラスビーズを添加し、組織・細胞破砕装置（Fast Prep）を用いて5.0 m/sで３０秒間粉砕した。１５,０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、水層４００μＬを別のチューブに移した。そこにphenol/chloroform/isoamylalcohol(２５:２４:１)４００μＬを添加し、Fast Prepを用いて4.0 m/sで４５秒間振とうした。その後、１５,０００ｒｐｍで５分間遠心し、２５０μＬの水層を回収した。得られた水層に２５μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．４）と３００μＬのイソプロパノールを加えて転倒混和し、−３０℃で５分間静置した。１５,０００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を除去し、沈殿物に５００μＬの７０％エタノールを添加した。１５,０００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清除去し、風乾した。得られた抽出ＤＮＡを５０μＬの純水（ミリＱ水）に溶解した。ＰＣＲ試薬はSYBR（登録商標）Premix Ex Taq（登録商標）II(Tli RNaseH Plus)（TaKaRa社製）を用いた。プライマーの配列は表１に示したとおりである。また、ＰＣＲ条件は、９５℃５分で１サイクル、９５℃１５秒及び６０℃１分をセットで４０サイクルとした。
比較検体１は遠心処理（１５，０００ｒｐｍ、１０分）を施し、得られた沈殿物を２００μＬのＰＢＳに分散させた後、分散液１００μＬを使用して本発明検体１と同様の方法でアクネ菌量を測定した。
（２）結果
結果を表２に示す。なお、結果は実施例１および試験例１の操作を別の日に合計３回行った平均の値である。３名の被験者をそれぞれＡ〜Ｃとして示した。顔の左右では同程度の菌が存在しているということが知られている（文献：J. Clinical Microbiology, 48, 3575-3581, 2010）。よって、表２より、本発明検体１は、スワブ法により採取された比較検体１と同程度またはそれ以上のアクネ菌（生菌と死菌を含めた総菌数）を回収できることが確認された。
実施例２ 検体の調製
ＥＧ−４０及びＥＧ−２５それぞれ２．６２５ｇを８０℃に加熱した水２４．７５ｇ中に添加し、ＰＶＡ溶液（ＰＶＡ１７．５質量％）を調製した。
上記ＰＶＡ溶液１５０μＬを左額（９ｃｍ２）と右額（９ｃｍ２）にそれぞれ塗布し、３０分程度乾燥後、形成された薄膜を剥離した。剥離した薄膜をそれぞれ６００μＬの生理食塩水に浸し室温で振盪機MICRO TUBE MIXER MT-400（TOMY製）を用いて１時間振盪し、本発明検体２を得た。
試験例２ 皮膚常在菌の定量性
（１）アクネ菌の定量性
以下に示す方法により、上記で得られた本発明検体２中のアクネ菌量を調べた。
本発明検体２を２００μＬ分取し、２００μＬの生理食塩水を加え、１５,０００ｒｐｍで２０分間遠心して上清を除去した。得られた沈殿に４００μＬの生理食塩水を加え、同様の遠心操作を繰り返した。得られた沈殿物を２００μＬのＰＢＳに分散させた。分散液１００μＬを用い、試験例１と同様の方法でＤＮＡを抽出し、５０μＬの純水（ミリＱ水）に溶解させた。検体中のアクネ菌の菌数を試験例１と同様の方法（ＰＣＲ）を用いて測定した。
（２）結果
得られたアクネ菌は、左額では３．２０(Log10(菌数／cm2))、右額では３．１４(Log10(菌数／cm2))であり、左額と右額から得られた菌数がほぼ同等であることが確認された。上述のとおり、顔の左右では同程度の菌が存在しているということが知られていることから、本発明検体２では、皮膚常在菌（生菌と死菌を含めた総菌数）が定量的に採取できる可能性が高いことが確認された。
実施例３ 検体の調製
実施例２と同様に調製したＰＶＡ溶液（ＰＶＡ１７．５％）１５０μＬを右頬の一部（９ｃｍ２）に塗布し、３０分程度乾燥後、剥離した薄膜を６００μＬの生理食塩水に浸し、３０分間振盪して本発明検体３を得た。
比較例２（スワブ法）
綿棒で左額の一部（９ｃｍ２）を２５往復した。当該綿棒の先を１ｍＬのＰＢＳに浸し15分間振盪し、比較検体２を得た。
試験例３ 生菌の定量性
（１）総生菌数の定量性
本発明検体３にさらに６００μＬの生理食塩水を添加し、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清から６００μＬをとる操作を２回繰り返した後、上清を全て除去した。最後に６００μＬで再度洗浄し（１５，０００ｒｐｍ，１０分）上清を除去した後、沈殿物を１００μＬの生理食塩水に分散した。分散液を生理食塩水で１００倍希釈したものを２５μＬずつ、ＧＡＭ寒天培地にまき、３日間３７℃で培養した。なお、この方法により、非選択的に生菌を測定することができる。
比較検体２は、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心して沈殿物を回収後、１００μＬの生理食塩水に分散させた。分散液を本発明検体３と同様に生理食塩水で希釈した後、同様の操作を行った。
（２）結果
本発明検体３では３．１５（Ｌｏｇ１０（菌数／ｃｍ２））、比較検体２では３．４５（Ｌｏｇ１０（菌数／ｃｍ２））の菌数が得られた。よって、本発明とスワブ法では皮膚常在菌（生菌）を同程度回収することができた。
実施例４ 検体の調製
実施例２と同様に調製したＰＶＡ溶液（ＰＶＡ１７．５％）１５０μＬを、左頬の一部（９ｃｍ２）に塗布し、３０分程度乾燥後、剥離した薄膜を６００μＬの生理食塩水に浸し、３０分間振盪させ、本発明検体４を得た。
試験例４ 脂肪酸分析
（１）８０μＬの本発明検体４を生理食塩水で５倍に希釈し、メタノール３．４ｍＬ、８％塩酸メタノール溶液６００μＬを添加し、１００℃で１時間加熱後、ヘキサンを８００μＬ用いて分液し、脂肪酸メチルエステルを抽出した。
（２）（１）で得られた検体を、Ａｇｉｌｅｎｔ ７８９０Ｂ ＧＣシステムを用い、ＩｎｔｅｒＣａｐ（登録商標）ＷＡＸカラムを用い、ガスクロマトグラフィー解析を行った。標準としてミリスチン酸メチル、パルミチン酸メチル、Ｃｉｓ−９−ヘキサデセン酸メチル、ステアリン酸メチル、オレイン酸メチルを用いて検量線を作成し、各検体の濃度を測定した。
（３）結果
その結果、表３に示すとおり、ミリスチン酸、パルミチン酸、Ｃｉｓ−９−ヘキサデセン酸、ステアリン酸、オレイン酸を回収することができた。表３の数値は本発明検体４に含まれる脂肪酸量をさす。なお、実際に脂肪酸の定量は行っていないが、比較検体２は水溶液が全く濁っておらず、綿棒から脂肪酸を回収することは難しいことが予想された。
実施例５ 検体の調製
実施例１と同様に調製したＰＶＡ溶液（ＰＶＡ２０％）１００μＬを左額（４ｃｍ２）に塗布し、３０分程度乾燥後、形成された薄膜を剥離した。剥離した薄膜を１ｍＬのＰＢＳに浸し室温で１時間振盪し、本発明検体５を得た。
比較例３（スワブ法）
綿棒で額中心の一部（４ｃｍ２）を２５往復し、綿棒の先を１ｍＬのＰＢＳに浸し１時間振盪し比較検体３を得た。
試験例５ タンパク質の分析
（１）検体の前処理
本発明検体５を生理食塩水で一度遠心洗浄後（１５，０００ｒｐｍ、２０分）、沈殿物を１００μＬのLysisバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．８）、３５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１％ ＮＰ−４０）に溶解させ、１０分ボルテックスミキサーで撹拌し、氷浴中１５分間４℃で静置した。１５，０００ ｒｐｍで２０分間遠心して上清を回収し、以下の測定に用いた。
また、比較検体３は、１５，０００ ｒｐｍで２０分間遠心して沈殿物を１００μＬのLysisバッファーに溶解させ、１０分ボルテックスミキサーで撹拌し、氷浴中１５分間４℃で静置した。１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心して上清を回収し、以下の測定に用いた。
（２）総タンパク質量の測定
ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ を用い、ＢＳＡを基準として５６２ｎｍの吸収波長から濃度を算出した。
（３）ＩＬ−８量の測定
Ｈｕｍａｎ ＩＬ−８ ＥＬＩＳＡキット（Thermo Scientific社製）を用いて４５０−５５０ｎｍの吸収波長から測定した。
（４）結果
結果を表４に示す。
表４より、本発明検体５は、スワブ法による検体に比べて、回収される総タンパク質量及びＩＬ−８量が多く、タンパク質解析に優れていることが確認された。
実施例６ 検体の調製
実施例２に従い、１７．５％のＰＶＡ溶液を作成した。得られたＰＶＡ溶液１５０μＬを額（９ｃｍ２、３箇所）、ＰＶＡ溶液５０μＬを頬（３ｃｍ２、１２箇所）に対して塗布し、３０分程度乾燥後、形成された薄膜を剥離した。額の３箇所から剥離した各薄膜、頬の１２箇所から剥離した薄膜を４箇所ずつ纏めて、１．４ｍＬの生理食塩水、水及びメタノールにそれぞれ溶解ないしは溶出させ、室温で１時間振盪し、分析用検体（生理食塩水溶解検体、水溶解検体、メタノール溶出検体）を得た。
試験例６ ＣＥ−ＴＯＦ ＭＳによる角層中イオン性代謝物の網羅的解析
（１）Ａｇｉｌｅｎｔ 社製ＣＥ／（Ｑ）ＴＯＦ ＭＳを用いて測定を行った。
カチオン及びアニオンの各モードの測定時における希釈倍率は、カチオンモードでは全ての検体を原液のまま、アニオンモードではメタノール溶出検体は原液、水溶解及び生理食塩水溶解検体では２倍希釈して行った。
（２）結果
ｉ）検出物質数
検体中のイオン性代謝物の検出数を表５に示した。カチオン・アニオンモードでの検出数を併せて角層中におよそ５０種類の物質の存在が確認された。なお、アニオンモードとカチオンモードでは同じ成分は含まれていないことを確認している。
水溶解検体から検出された物質を下記表６に示した。角層中には乳酸、尿素、グリセリンが多く存在することは既に知られており（H. W. Spier et al., Zur analytischen und funktionellen Physiologie der Hautoberflache, Der Hautarzt, 7, 55-60, 1956.,E. H. Choi et al., Is Endogeneous glycerol a determinant of stratum corneum hydration in humans., J. Invest. Dermatol., 125, 288-293, 2005.）、本発明の検体においてもCE-TOF MS によりいずれも検出されていることが確認された。また、アミノ酸についても、タンパク質合成に必要な２０種類のアミノ酸全てが検出されることが確認された。なお、m/zは分子量を電荷で割った値、relative areaは検出物質の量を表す。
実施例７ 検体の調製
実施例２に従い、１７．５質量％のＰＶＡ溶液を調製した。前腕部、前額部の各々左の３×１ｃｍ２上に５０μＬのＰＶＡ溶液を塗布し、２０分間乾燥させ、形成された薄膜を剥離した。これを、シリル化ウレタン樹脂系接着剤（「超強力接着剤ウルトラ多用途Ｓ・Ｕ」（コニシ製））を塗布したスライドガラスに貼付し、２日間乾燥させた。次いで、当該スライドガラスを１２時間ミリＱ水中に静かに浸し、ＰＶＡを完全に溶解させた。静かに２回ミリＱ水で洗浄し、完全に乾燥して顕微鏡観察用の検体を得た。
試験例７ 角層形状の観察
実施例７で得られた顕微鏡観察用検体を用いて、顕微鏡観察（光学顕微鏡及び電子顕微鏡）を行った。顕微鏡観察画像を図１〜２に示す。
図１〜２より、採取角層の表裏で肌理や毛包が反転していることが確認された。
本発明の方法により調製された皮膚分析又は観察用検体によれば、皮膚常在菌叢と角層に存在する物質を総合的に解析することができ、これらを関連付けることが可能となる。また、有用菌や未知菌が生菌のまま単離が可能となる。また、回収できる総タンパク量が多いことから、タンパク質の解析がより容易になる。また、採取角層両面の微細構造の状態を皮膚の外側から見た状態でビジュアル化できる。結果、化粧品の開発や肌の診断技術の確立に役立てることができる。

Claims (12)

  1. 皮膚常在菌及び／又は角層に存在する物質を分析、又は角層形状を観察するための検体の調製方法であって、ポリビニルアルコール系重合体を含有する溶液を、薄膜が形成されるように皮膚上に塗布し、形成された薄膜を剥離回収することを特徴とする方法。
  2. 皮膚常在菌が生菌を含む請求項１に記載の方法。
  3. 角層に存在する物質が、タンパク質、アミノ酸、脂質、核酸、糖、ビタミン、ホルモン及びペプチドから選ばれる１種または２種以上を含む請求項１又は２に記載の方法。
  4. 角層形状を観察するための検体の調製方法であって、剥離回収された薄膜を、顕微鏡観察用支持体に固定化し、ポリビニルアルコール系重合体を溶解除去した後乾燥することを含む、請求項１に記載の方法。
  5. 固定化が、顕微鏡観察用支持体に塗布された固定化剤に貼付するものである請求項４に記載の方法。
  6. ポリビニルアルコール系重合体が、ケン化度が７０〜９９モル％のポリビニルアルコール系重合体である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. ポリビニルアルコール系重合体が、重合度が５０〜３，０００のポリビニルアルコール系重合体である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. ポリビニルアルコール系重合体が、粘度（４％水溶液、温度２０℃）が４〜６０ｍＰａ・ｓのポリビニルアルコール系重合体である請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. ポリビニルアルコール系重合体を含有する溶液が、１０〜３０質量％のポリビニルアルコール系重合体溶液である請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. ポリビニルアルコール系重合体を含有する溶液を、皮膚上に塗布後、室温で２０分以上放置する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法により調製された皮膚分析又は観察用検体。
  12. 請求項４又は５に記載の方法により調製された皮膚観察用検体を用いて、顕微鏡観察することを特徴とする角層形状の観察方法。
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