CN109642856A - 皮肤分析或观察用样品的制备方法 - Google Patents

皮肤分析或观察用样品的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于范围广泛地分析皮肤常驻细菌和/或存在于角质层的蛋白质、脂质等物质、或用于观察角质层形状的样品的制备方法。本发明是一种样品的制备方法，其特征在于：其是制备用于分析皮肤常驻细菌和/或存在于角质层的物质、或为了观察角质层形状的样品的方法，且将含有聚乙烯醇系聚合物的溶液以形成薄膜的方式涂抹在皮肤上并剥离回收所形成的薄膜。

Description

皮肤分析或观察用样品的制备方法
技术领域
本发明是关于一种皮肤分析或观察用样品的制备方法。更详细而言是关于一种用于分析皮肤常驻细菌和/或存在于角质层的物质、或为了观察角质层形状的样品的制备方法。
背景技术
近年来，因皮肤常驻细菌产生的对皮肤产生的影响(有用性等)备受关注。皮肤常驻细菌是存在于皮肤上的微生物，以汗或皮脂等为营养源。这些皮肤常驻细菌若在皮肤上处于平衡状态时，则发挥抑制病原菌或霉菌的增殖等有用的作用，但也存在因压力等而异常增殖，对皮肤产生不良影响的情况。例如，因同时发生皮脂的分泌与毛孔堵塞而发生痤疮丙酸杆菌异常增殖，引起痤疮。因此，对皮肤上的常驻细菌或者成为其营养源的皮脂等存在于角质层的物质进行分析、或者客观地掌握沟表皮、脊表皮、肌理、毛孔、皱纹等采集角质层的两面的形状对于追究肌肤问题的原因或开发化妆品的方面而言非常重要。而且，认为只要可同时采集由皮肤常驻细菌产生的各种代谢物(例如甘油、游离脂肪酸等)与常驻细菌，则在调查这些菌的有用性的机制方面非常有用。
先前，皮肤常驻细菌或角质层的采集主要使用拭子(swab)法(非专利文献1)或胶带剥离法(非专利文献2)。擦拭法是使用棉签等擦拭捕集皮肤表面的常驻细菌或角质层，利用溶剂冲洗该棉签而回收样品的方法，胶带剥离法是将涂布有黏着剂的胶带贴附于皮肤并回收附着于胶带的常驻细菌或角质层的方法。
然而，擦拭法存在根据进行采集的人不同而施力方法不同、存在发生擦拭残留的可能性、无法完全冲洗下附着于棉签的菌等问题，不确定是否已稳定地回收菌。另外，不仅是细菌，皮肤上的其他成分自棉签的回收率也较低，无法充分地采集角质层等，可回收的样品有限。
胶带剥离法通常未公开使用的胶带中的黏着剂成分，为了回收所附着的菌，根据胶带而需使用有机溶剂，无法以存活的状态回收皮肤常驻细菌。而且，认为由于黏着剂而对经采集样品的生物体或者回收的菌体造成危害。而且，由于胶带上附有支撑体，因此存在如下等问题：若希望采集具有曲线的部位的菌或角质层，则产生间隙而回收率下降；由于胶带的宽度而可回收的范围有限。
另外，胶带剥离法虽可回收角质层，但仅可回收多个层中的表面的一层或数层，因此该方法也存在有分析角质层中的成分的情况时无法获得充分量的样品的可能性。
另外，作为测定角质细胞的面积与体积的方法，报告有如下方法：于将在支撑体涂敷有包含乙烯吡咯啶酮-乙酸乙烯酯共聚物的水溶性固着剂的角质细胞采集用具贴附于皮肤后，自固着剂采集角质细胞(专利文献1)。
然而，该方法是不损坏体积形状而采集角质细胞的，在角质细胞的分散时使用蛋白酶或界面活性剂，因此难言其是用于在存活的状态下分析皮肤常驻细菌的样品制备法，另外，由于使用支撑体，因此存在在支撑体上残留聚合物而未保持定量性、不适于采集弯曲部位的样品的问题。
进而，乙烯吡咯啶酮-乙酸乙烯酯共聚物是对于水系溶剂的溶解度较低，为了涂抹于皮肤需要使用乙醇等有机溶剂，因此还担忧如下情形：无法以存活的状态回收皮肤常驻细菌；单独使用乙烯吡咯啶酮-乙酸乙烯酯共聚物时粘度较低，成膜性较差，因此为了涂抹于皮肤而需添加羟丙基甲基纤维素等的使粘度上升的成分，这些成分有阻碍样品的分析的可能性。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第3868345号公报
非专利文献
非专利文献1：Costello et al.Bacterial community variation in humanbody habitats across space and time.Science,326,1694-1697,2009.
非专利文献2：B.Lange-Asschenfeldt el al.Distribution of bacteria inthe epidermal layers and hair follicles of the human skin.SkinPharmacol.Physiol.,24,305-311,2011.
发明内容
发明所要解决的课题
本发明涉及提供一种用于范围宽广地分析皮肤常驻细菌和/或存在于角质层的蛋白质、脂质等物质、或用于观察角质层形状的样品的制备方法。
用于解决课题的方法
本发明是鉴于上述问题而进行研究，结果发现：将含有聚乙烯醇系聚合物的溶液涂抹于皮肤上而形成薄膜，由此能够以活细菌的状态回收该薄膜中的皮肤常驻细菌，并且可效率良好地回收角质层中所包含的物质，通过使用该薄膜，可分析皮肤常驻细菌或存在于角质层的各种物质，而且，可准确地观察采集角质层两面的形状。
即，本发明是关于以下的1)至12)的。
1)一种样品的制备方法，其特征在于：
其是制备用于分析皮肤常驻细菌和/或存在于角质层的物质、或观察角质层形状的样品的方法，该方法将含有聚乙烯醇系聚合物的溶液以形成薄膜的方式涂抹于皮肤上，并剥离回收所形成的薄膜。
2)如1)的方法，其中皮肤常驻细菌包含活细菌。
3)如1)或2)的方法，其中存在于角质层的物质包含选自蛋白质、氨基酸、脂质、核酸、糖、维生素、激素及肽中的1种或2种以上。
4)如1)的方法，其是制备用于观察角质层形状的样品的方法，该方法包含将剥离回收的薄膜固定化于显微镜观察用支撑体，并将聚乙烯醇系聚合物溶解去除，其后进行干燥的步骤。
5)如4)的方法，其中固定化是贴附于涂布在显微镜观察用支撑体的固定化剂的方式。
6)如1)至5)中任一项的方法，其中聚乙烯醇系聚合物是皂化度为70～99摩尔％的聚乙烯醇系聚合物。
7)如1)至6)中任一项的方法，其中聚乙烯醇系聚合物是聚合度为50～3,000的聚乙烯醇系聚合物。
8)如1)至7)中任一项的方法，其中聚乙烯醇系聚合物是粘度(4％水溶液，温度为20℃)为4～60mPa·s的聚乙烯醇系聚合物。
9)如1)至8)中任一项的方法，其中含有聚乙烯醇系聚合物的溶液为10～30质量％的聚乙烯醇系聚合物溶液。
10)如1)至9)中任一项的方法，其中，将含有聚乙烯醇系聚合物的溶液涂抹于皮肤上后，在室温放置20分钟以上。
11)一种皮肤分析或观察用样品，其是通过如1)至10)中任一项的方法制备而成。
12)一种角质层形状的观察方法，其特征在于，使用通过如4)或5)的方法所制备的皮肤观察用样品进行显微镜观察。
发明效果
根据本发明的方法，无论身体的哪一部位，均可低侵入且简便地以活细菌的状态回收皮肤常驻细菌，而且，可效率良好地回收存在于角质层的物质。而且，可适当地观察沟表皮、脊表皮、肌理、毛孔、皱纹、采集角质层的深度等采集角质层的两面的状态。
附图说明
图1是从前腕部采集的角质层的正面及背面的显微镜观察图像。
图2是从前额部采集的角质层的正面及背面的显微镜观察图像。
具体实施方式
本发明的制备皮肤分析或观察用样品的方法是用于分析皮肤常驻细菌或存在于角质层的物质、或观察角质层形状的样品的制备方法，且将含有聚乙烯醇系聚合物的溶液以形成薄膜的方式涂抹于皮肤并剥离回收所形成的薄膜。
作为本发明的皮肤分析的对象之一，可例举皮肤常驻细菌。所谓皮肤常驻细菌是指生长于人的皮肤上的细菌，在本发明中，其菌种并无特别限定。皮肤常驻细菌被认为由于个人差异、部位差异、或者季节变动等而不同，但作为厌氧性最优势菌而栖息的有痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)，作为好氧性菌而栖息的有金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。皮肤常驻细菌被认为与防御生物体免受其他病原微生物的影响及疾患表现有关，若因外伤、疾病等引起的全身状态不良、精神压力、寒冷、干燥、不适当的清洗等导致皮肤常驻细菌的平衡瓦解，则金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌等过度增殖，而诱发各种皮肤症状，引起疾患表现。而且，已知有表皮葡萄球菌等有用菌由于分解皮脂，产生甘油与游离脂肪酸，因此在保湿方面有效，此外，将皮肤保持为酸性，抑制霉等的增殖。在本发明中，能够以活细菌的状态回收包含痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等的皮肤常驻细菌。
作为本发明的皮肤分析的对象，进而可例举存在于角质层的物质。所谓存在于角质层的物质是指存在于角质层表面(皮肤表面)或角质层中的物质，其来源或种类并无特别限定。具体而言，除角蛋白、丝聚蛋白等角质层构成成分以外，还包含神经酰胺、胆固醇等角质层细胞间脂质构成成分、白介素等细胞因子、趋化因子、酶等蛋白质、皮肤常驻细菌的代谢产物、自皮脂腺分泌的皮脂、脂质、脂肪酸或激素等。
作为皮肤常驻细菌的代谢产物，例如可例举选自存在于角质层中的蛋白质或脂质等物质由皮肤常驻细菌分解、产生的各种代谢产物。具体而言，可例举自皮脂分解、产生的甘油三酸酯、甘油二酸酯、脂肪酸、甘油。
另外，在存在于角质层(皮肤)表面的物质中，除自顶泌腺、外分泌腺产生的汗或血浆的成分以外，亦包含氨基酸、肽等。在这些成分中，特别是成为皮肤性状的指标的，容易受到皮肤常驻细菌分布的影响的方面而言，较优选为包含蛋白质、氨基酸、脂质、核酸、糖、维生素、激素、肽中的1种或2种以上。
本发明的方法是可回收上述皮肤常驻细菌，并且回收存在于角质层的物质。另外，由于能够将包含活细菌、死菌在内的以存在于皮肤上的状态直接回收皮肤常驻细菌，因此可明确形成皮肤上的菌群的菌种或其存在形态。
作为本发明的皮肤观察的对象，例如可例举角质层形状。
即，使用本发明的皮肤观察用样品进行显微镜观察，由此能够以自皮肤的外侧可见的状态观察角质层表面的微细结构、例如沟表皮的状态(宽度、倾斜角、密度)、由沟表皮与沟表皮包围的脊表皮的状态(即肌理)、毛孔的大小、皱纹、采集角质层的深度。
在制备本发明的皮肤分析或观察用样品时，以形成薄膜的方式将含有聚乙烯醇(PVA)系聚合物的溶液(PVA系聚合物溶液)涂抹于皮肤。
这里，PVA系聚合物是具有[CH2CH(OH)]作为单元结构的聚合物质，通常通过聚乙烯酯的皂化而制造。作为该聚乙烯酯，可单独使用或并用甲酸乙烯酯、乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、癸酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、棕榈酸乙烯酯、硬脂酸乙烯酯等，较优选为乙酸乙烯酯。
另外，本发明的PVA系聚合物也可以具有羟基以外的官能基，作为羟基以外的官能基，例如可例示氨基、硫醇基、羧基、砜基、磷酸基、羧酸酯基、磺酸根离子基、磷酸根离子基、铵基、鏻基、硅烷基、硅氧烷基、烷基、烯丙基、氟烷基、烷氧基、羰基、卤基等。
本发明的PVA系聚合物的皂化度较优选为70～99摩尔％，更优选为75～95摩尔％，进而较优选为86.5～89.0摩尔％。这里，PVA系聚合物的皂化度是将聚乙烯酯皂化、即进行水解而获得的羟基的摩尔百分比(摩尔％)，且是通过依据JIS K6726的测定方法而测得的值。
本发明的PVA系聚合物的聚合度就薄膜形成或分析或观察对象物的回收效率的方面而言，较优选为50～3,000，更优选为500～2,500，进而较优选为600～2,400。PVA系聚合物的聚合度是依据JIS K6726而测定。
通常，聚合度的差异可由一定浓度(通常为4％水溶液、20℃)下的粘度代替。本发明的PVA系聚合物的粘度较优选为4～60mPa·s、更优选为4.5～52mPa·s。这里，粘度是将4％水溶液、在温度20℃的条件下，使用霍普勒(Hoeppler)粘度计而算出的值。
另外，本发明的PVA系聚合物的平均分子量较优选为2,200～132,000，更优选为20,000～110,000。
作为可使用于本发明的PVA系聚合物的市售品，例如可例示自日本合成化学股份有限公司制造的以商品名“Gohsenol”系列售出的EG-40(粘度(4％、20℃)：40.0～46.0mPa·s，皂化度：86.5～89.0mol％，聚合度2400)、EG-25(粘度(4％、20℃)：20.5～24.5mPa·s，皂化度：86.5～89.0mol％，聚合度1800)、EG-05(粘度(4％、20℃)：4.8～5.8mPa·s，皂化度：86.5～89.0mol％、聚合度600)等各种等级。
该PVA系聚合物可单独使用，也可混合皂化度或者聚合度和/或粘度不同的PVA系聚合物而使用。通过混合皂化度或者聚合度和/或粘度不同的PVA系聚合物而使用，可改变粘度，从而可改变对皮肤的密合度。再者，就形成薄膜的方面而言，较优选为调配1种以上的聚合度1,500以上的PVA系聚合物。
含有PVA系聚合物的溶液(PVA系聚合物溶液)中的PVA系聚合物的含量是根据PVA的分子量、皂化度而不同，但就防止所涂布的溶液的滴液或易于干燥的方面而言，通常为10～30质量％的浓度，较优选为12～25质量％，更优选为15～25质量％，特优选为15～22质量％。
而且，作为溶液的溶剂，较优选为使用水、磷酸缓冲液、生理食盐水，特优选为水。在该溶液中，可在对于皮肤常驻细菌或存在于角质层的物质不产生影响的范围内含有乙醇。在该情形时，乙醇的含量较优选为0～20质量％，更优选为0～5质量％。再者，在需要回收皮肤常驻细菌的活细菌的情况时，较优选为使用不含乙醇的溶剂。另外，由于存在对此后的分析产生阻碍的可能性，因此重要的是在PVA系聚合物溶液中不使用包含固态物质、蛋白质、氨基酸、脂质等的添加物。因此，PVA系聚合物溶液仅含有PVA聚合物及溶剂。
PVA系聚合物溶液在皮肤上的涂抹只要是以在皮肤表面形成薄膜的方式进行涂抹即可，例如以将该溶液均匀且连续地附着至皮肤表面的方式涂抹。涂抹方法并无特别限制，较优选为使用保持卫生的刮勺、或直接涂抹装入管中的PVA系聚合物溶液。
涂抹于皮肤的PVA系聚合物溶液通常是通过在室温放置20～40分钟左右进行干燥而形成薄膜。这里，薄膜是厚度为0.03～0.5mm，较优选为0.04～0.2mm。
放置时间只要形成薄膜即可，但就充分地回收皮肤常驻细菌或存在于角质层的物质的方面而言，通常在室温放置20分钟以上，较优选为20～40分钟，更优选为20～35分钟。
所形成的薄膜在从皮肤剥离后，根据其后的分析或观察方法而适当地接受处理。即，在制成皮肤常驻细菌的分析或角质层成分的分析用样品的情况时，将该薄膜溶解于水、生理食盐水、PBS(Phosphate Buffered Saline，磷酸盐缓冲液)、林葛尔氏溶液等水系溶剂、或者溶解于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、二乙醚等有机溶剂而提取样品，由此可利用与胶带剥离相同的方法供于分析。特别是，为了分析皮肤常驻细菌的活细菌，较优选为溶解于水系溶剂、特别是生理食盐水或PBS。再者，为了防止样品的改性，较优选为在室温以下进行分析。
如上所述，在通过本发明获得的剥离后的薄膜中，以存活的状态回收栖息于表皮的皮肤常驻细菌，另外，也可同时回收多个层的角质层，因此效率良好地回收存在于角质层中的物质。因此，所剥离的薄膜可用作用于将皮肤常驻细菌作为活细菌而进行分析的样品，而且，可用作为用于分析存在于角质层的物质的样品。例如，可使用本发明回收皮肤常驻细菌及存在于角质层的皮肤常驻细菌的代谢物、存在于角质层的源自生物体的细胞因子等蛋白质、如脂肪酶、蛋白酶的酶等，并使用于如下情形等：特定常驻细菌或代谢物、源自生物体的蛋白质的种类或量而验证与皮肤状态的关联性；单离出新颖皮肤常驻细菌并特定其性状；用于诊断皮肤性状；对化妆品或医药品等的涂抹前后的皮肤性状进行分析。另外，本发明可效率良好地回收存在于角质层的物质，因此无需浓缩包含样品的溶解液，可有效率地进行分析。
使用通过本发明制备的样品的各种分析可根据目的而使用适当公知的方法进行。例如，可例举如下情形等：从将本发明的样品溶解于水系溶剂而成的溶液中提取DNA，使用核酸扩增法测定目标皮肤常驻细菌的菌量；使用利用新一代测序仪的16S宏基因组解析法网罗性地解析皮肤常驻细菌；接种至GAM琼脂培养基等培养基而测定活细菌；测定活细菌与死菌的比率；通过BCA蛋白质分析等测定蛋白质量；通过气相层析法分析脂肪酸；使用CE-TOF MS等网罗性地分析皮肤上的离子性代谢物；使用Milliplex等试剂盒网罗性地分析角质层中的细胞因子；通过激光显微镜剖检法而直接利用激光自剥离的薄膜切出回收一部分，藉此获得存在于皮肤上的特定位置的皮肤常驻细菌的基因信息。
另外，在将所形成的薄膜用作用于观察角质层形状的样品的情况时，剥离回收的薄膜是在从正面观察的情况时，将采集样品的角质层侧固定化于显微镜观察用支撑体，在溶解去除聚乙烯醇系聚合物后进行干燥而制成显微镜观察用样品。另外，在观察背面的情况时，将采集样品的聚乙烯醇侧固定化在显微镜观察用支撑体，在干燥后制成显微镜观察用样品。
这里，作为显微镜观察用支撑体，可例举金属、硅基板、载玻片、培养皿、培养盘等支撑体，较优选为载玻片、培养皿、培养盘等透明支撑体，更优选为载玻片。
薄膜于该支撑体的固定化例如可通过在涂布于支撑体的固定化剂贴附薄膜而进行。
作为固定化剂，只要是黏着在支撑体且能够将薄膜中的角质层结构固定化的非水溶性化合物即可，进而较优选为透明的化合物，例如可例举热塑性树脂类(乙酸乙烯酯树脂类、聚乙烯醇缩醛类、乙烯乙酸乙烯酯树脂类、氯乙烯树脂类、丙烯酸是树脂类、聚酰胺类、纤维素类、α-烯烃类)、热硬化性树脂类(尿素树脂类、三聚氰胺树脂类、酚醛树脂类、间苯二酚树脂类、环氧树脂类、结构用丙烯酸类树脂类、聚酯类、聚氨基甲酸酯类、聚芳烃类)、弹性体类(氯丁二烯橡胶类、腈橡胶类、苯乙烯丁二烯橡胶类、聚硫醚类、丁基橡胶类、聚硅氧橡胶类、丙烯酸是橡胶类、改性聚硅氧橡胶类、氨基甲酸酯橡胶类、硅烷化氨基甲酸酯树脂类、遥爪聚丙烯酸酯类)等有机黏着剂。
对通过此方式获得的显微镜观察用样品，利用光学显微镜、电子显微镜等进行观察，由此能够以从皮肤外侧可见的状态观察角质层表面的微细结构的状态。
实施例
实施例1样品的制备
分别将2种聚乙烯醇EG-40(粘度(4％、20℃)：40.0～46.0mPa·s，皂化度：86.5～89.0mol％，聚合度2400，日本合成化学(股)制造)及EG-25(粘度(4％、20℃)：20.5～24.5mPa·s，皂化度：86.5～89.0mol％，聚合度1800，日本合成化学(股)制造)各15g添加于加热至80℃的水100g中，然后加入20g的乙醇进行混合而制备PVA溶液(20质量％)。
将所制备的PVA溶液(400μL)涂抹在左额部的一部分(4cm2)，在室温干燥30分钟左右，然后剥离所形成的薄膜。将所剥离的薄膜浸渍至2mL的PBS中，在4℃下静置一夜，然后利用旋涡混合器进行搅拌而获得本发明样品1。需要说明的是，对3名受验者进行相同的操作。
比较例1(擦拭法)
利用棉签在右额部的一部分(4cm2)往返25次。将该棉签的前端浸渍至1mL的PBS中，在4℃下静置一夜，然后利用旋涡混合器进行搅拌而获得比较样品1。需要说明的是，对3名受验者进行相同的操作。
试验例1皮肤常驻细菌的检测
(1)痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)的检测
通过下面所示的方法调查在上述内容中获得的本发明样品1及比较样品1中的痤疮丙酸杆菌量。
首先，对本发明样品1实施离心处理(15,000rpm、10分钟)，在所获得的沈淀物中加入1mL的PBS并利用旋涡混合器进行搅拌，实施相同的离心处理并进行清洗。将所获得的沈淀物分散至200μL的PBS。在分散液100μL中添加100μL的PBS，进而加入250μL的Lysis缓冲液(200mM的Tris-HCl(pH 9.0)、80mM的EDTA(pH 9.0)、50μL的10％SDS溶液。此后，反复进行3次冻结融化，在100℃进行煮沸，其后冷却至室温。添加500μL的TE饱和酚及300mg的玻璃珠，使用组织-细胞破碎装置(Fast Prep)以5.0m/s粉碎30秒钟。以15,000rpm进行5分钟的离心分离并将水层400μL移至另一个管中。对其添加苯酚(phenol)/氯仿(chloroform)/异戊醇(isoamylalcohol)(25∶24∶1)400μL，使用Fast Prep以4.0m/s振荡45秒钟。此后，以15,000rpm进行5分钟的离心并回收250μL的水层。在所获得的水层中加入25μL的3M乙酸钠(pH5.4)与300μL的异丙醇并进行倒置混和，在-30℃下静置5分钟。在以15,000rpm进行5分钟的离心分离后，去除上清液，向沈淀物中添加500μL的70％乙醇。在以15,000rpm进行5分钟的离心分离后，去除上清液，进行风干。将所获得的提取DNA溶解至50μL的纯水(超纯水)。PCR试剂是使用SYBR(注册商标)Premix Ex Taq(注册商标)II(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa公司制造)。引物的序列如表1所示。另外，PCR条件是设为以95℃、5分钟为1循环且以95℃、15秒及60℃、1分钟设为一组循环并进行40循环。
比较样品1是实施离心处理(15,000rpm、10分钟)，将所获得的沈淀物分散至200μL的PBS，其后使用分散液100μL并利用与本发明样品1相同的方法测定痤疮丙酸杆菌量。
[表1]
(2)结果
将结果示于表2。需要说明的是，结果是将实施例1及试验例1的操作于另一天合计进行3次所得的平均值。将3名受验者分别标示为A～C。已知在面部的左右侧存在相同程度的菌(文献：J.Clinical Microbiology,48,3575-3581,2010)。因此，根据表2确认到本发明样品1可回收与通过擦拭法采集的比较样品1相同程度或其以上的痤疮丙酸杆菌(包含活细菌与死菌在内的总菌数)。
[表2]
Log<sub>10</sub>(菌数/cm<sup>2</sup>) A B C
比较样品1(擦拭法) 平均数 2.16 3.93 4.44
本发明样品1 平均数 2.20 4.70 4.80
实施例2样品的制备
分别将2.625g的EG-40及EG-25添加于加热至80℃的水24.75g中而制备PVA溶液(PVA 17.5质量％)。
将上述PVA溶液150μL分别涂抹于左额部(9cm2)与右额部(9cm2)，干燥30分钟后剥离所形成的薄膜。将所剥离的薄膜分别浸渍于600μL的生理食盐水中，在室温使用振荡机MICRO TUBE MIXER MT-400(TOMY制造)进行1小时的振荡而获得本发明样品2。
试验例2皮肤常驻细菌的定量性
(1)痤疮丙酸杆菌的定量性
通过下面所示的方法，调查在上述内容中获得的本发明样品2中的痤疮丙酸杆菌量。
量取200μL的本发明样品2，加入200μL的生理食盐水，以15,000rpm进行20分钟的离心而去除上清液。在所获得的沈淀中加入400μL的生理食盐水并反复进行相同的离心操作。将所获得的沈淀物分散至200μL的PBS。使用分散液100μL，通过与试验例1相同的方法提取DNA并溶解于50μL的纯水(超纯水)中。使用与试验例1相同的方法(PCR)测定样品中的痤疮丙酸杆菌的菌数。
(2)结果
确认到所获得的痤疮丙酸杆菌是左额部为3.20(Log10(菌数/cm2))，右额部为3.14(Log10(菌数/cm2))，从左额部与右额部获得的菌数几乎相同。如上所述，已知于面部的左右存在相同程度的菌，因此确认到本发明样品2可定量地采集皮肤常驻细菌(包含活细菌与死菌在内的总菌数)的可能性较高。
实施例3样品的制备
将与实施例2同样方式制备的PVA溶液(PVA 17.5％)150μL涂抹在右颊部的一部分(9cm2)，干燥30分钟左右后将所剥离的薄膜浸渍于600μL的生理食盐水中，振荡30分钟而获得本发明样品3。
比较例2(擦拭法)
利用棉签在左额部的一部分(9cm2)往返25次。将该棉签的前端浸渍至1mL的PBS，并振荡15分钟而获得比较样品2。
试验例3活细菌的定量性
(1)总活细菌数量的定量性
于本发明样品3中进而添加600μL的生理食盐水，以15,000rpm进行10分钟的离心，并自上清液取出600μL，重复进行2次该操作，其后将上清液全部去除。最后，利用600μL再次进行清洗(15,000rpm、10分钟)而去除上清液，之后将沈淀物分散至100μL的生理食盐水。将利用生理食盐水将分散液稀释100倍所得的液体分别以每次2.5μL接种于GAM琼脂培养基，在37℃下培养3天。需要说明的是，通过该方法，可非选择性地测定活细菌。
比较样品2是在以15,000rpm进行10分钟的离心并回收沈淀物后，分散至100μL的生理食盐水。在与本发明样品3同样地利用生理食盐水稀释分散液后，进行相同的操作。
(2)结果
本发明样品3中获得了3.15(Log10(菌数/cm2))的菌数，比较样品2中获得了3.45(Log10(菌数/cm2))的菌数。因此，本发明可回收与擦拭法相同程度的皮肤常驻细菌(活细菌)。
实施例4样品的制备
将与实施例2同样方式制备的PVA溶液(PVA 17.5％)150μL涂抹于左颊部的一部分(9cm2)，干燥30分钟左右后将所剥离的薄膜浸渍于600μL的生理食盐水中，振荡30分钟而获得本发明样品4。
试验例4脂肪酸分析
(1)利用生理食盐水将80μL的本发明样品4稀释成5倍，添加甲醇3.4mL、8％盐酸甲醇溶液600μL，在100℃下加热1小时后，使用800μL的己烷进行分液而提取脂肪酸甲酯。
(2)使用Agilent 7890B GC系统，并使用InterCap(注册商标)WAX管柱对在(1)中获得的样品进行气相层析法分析。作为标准而使用肉豆蔻酸甲酯、棕榈酸甲酯、顺式-9-十六碳烯酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯制作标定线，测定各样品的浓度。
(3)结果
结果如表3所示，可回收肉豆蔻酸、棕榈酸、顺式-9-十六碳烯酸、硬脂酸、油酸。表3的数值是指本发明样品4中所包含的脂肪酸量。需要说明的是，虽然实际上未进行脂肪酸的定量，但由于比较样品2是水溶液完全未浑浊，推测难以从棉签回收脂肪酸。
[表3]
(μg/mL)
肉豆蔻酸 52.35
棕榈酸 188.14
顺式-9-十六碳烯酸 176.06
硬脂酸 39.69
油酸 148.35
实施例5样品的制备
将与实施例1同样方式制备的PVA溶液(PVA 20％)100μL涂抹于左额部(4cm2)，干燥30分钟左右后剥离所形成的薄膜。将所剥离的薄膜浸渍至1mL的PBS，在室温振荡1小时而获得本发明样品5。
比较例3(擦拭法)
利用棉签在额部中心的一部分(4cm2)往返25次，将棉签的前端浸渍至1mL的PBS，振荡1小时而获得比较样品3。
试验例5蛋白质的分析
(1)样品的预处理
在利用生理食盐水对本发明样品5进行一次离心清洗后(15,000rpm、20分钟)，将沈淀物溶解在100μL的Lysis缓冲液(20mM的HEPES(pH＝7.8)、350mM的NaCl、0.5mM的EDTA、0.1mM的EGTA、1mM的DTT、1mM的MgCl2、20％甘油(Glycerol)、1％NP-40)中，利用旋涡混合器搅拌10分钟，在冰浴中以4℃静置15分钟。以15,000rpm进行20分钟离心并回收上清液，用于下面的测定。
另外，比较样品3是以15,000rpm进行20分钟离心并将沈淀物溶解至100μL的Lysis缓冲液，利用旋涡混合器搅拌10分钟，在冰浴中以4℃静置15分钟。以15,000rpm进行20分钟离心并回收上清液，用于下面的测定。
(2)总蛋白质量的测定
使用BCA蛋白质分析(protein assay)，以BSA为基准，从562nm的吸收波长算出浓度。
(3)IL-8量的测定
使用人IL-8ELISA试剂盒(Thermo Scientific公司制造)从450～550nm的吸收波长进行测定。
(4)结果
将结果示于表4。
根据表4，确认到本发明样品5回收的总蛋白质量及IL-8量多于通过擦拭法获得的样品，蛋白质分析优异。
[表4]
实施例6样品的制备
根据实施例2制作17.5％的PVA溶液。将所获得的PVA溶液150μL涂抹于额部(9cm2、3处)、将PVA溶液50μL涂抹于颊部(3cm2、12处)并干燥30分钟左右，其后剥离所形成的薄膜。将从额部的3处剥离的各薄膜、从颊部的12处剥离的薄膜每4处缠在一起，分别溶解或者溶出至1.4mL的生理食盐水、水及甲醇，在室温振荡1小时而获得分析用样品(生理食盐水溶解样品、水溶解样品、甲醇溶出样品)。
试验例6利用CE-TOF MS进行的角质层中的离子性代谢物的网罗性分析
(1)使用Agilent公司制造的CE/(Q)TOF MS进行测定。
关于阳离子及阴离子的各模式的测定时的稀释倍率，在阳离子模式下所有样品均直接使用原液，在阴离子模式下甲醇溶出样品使用原液、水溶解及生理食盐水溶解样品进行2倍稀释。
(2)结果
i)检测物质数量
将样品中的离子性代谢物的检测数量示于表5。确认到连同阳离子、阴离子模式下的检测数量在内，在角质层中存在约50种物质。需要说明的是，确认到阴离子模式与阳离子模式中不含相同的成分。
[表5]
将从水溶解样品检测到的物质示于下述表6。已知在角质层中存在较多的乳酸、尿素、甘油(H.W.Spier et al.,Zur analytischen und funktionellen Physiologie derHautoberflache,Der Hautarzt,7,55-60,1956.,E.H.Choi et al.,Is Endogeneousglycerol a determinant of stratum corneum hydration in humans.,J.Invest.Dermatol.,125,288-293,2005.)，且确认到在本发明的样品中，通过CE-TOF MS也都检测到了上述乳酸、脲、甘油。另外，关于氨基酸，也确认到检测了合成蛋白质所需的20种氨基酸的全部。需要说明的是，m/z是将分子量除以电荷所得的值，相对面积(relativearea)表示检测物质的量。
[表6-1]
[表6-2]
实施例7样品的制备
根据实施例2，制备17.5质量％的PVA溶液。在前腕部左侧、前额部左侧的3×1cm2上涂抹50μL的PVA溶液，干燥20分钟并剥离所形成的薄膜。将该薄膜贴附至涂布有硅烷化氨基甲酸酯树脂类黏着剂(“超强力黏着剂超多用途S·U”(Konishi制造))的载玻片并干燥2天。继而，将该载玻片轻轻地浸渍于超纯水中12小时而使PVA完全溶解。利用超纯水轻轻地清洗2次，完全干燥而获得显微镜观察用样品。
试验例7角质层形状的观察
对用于实施例7中所获得的显微镜观察用样品进行显微镜观察(光学显微镜及电子显微镜)。将显微镜观察图像示于图1～2。
根据图1～2，确认到了所采集的角质层的正面及背面肌理或毛囊的翻转。
产业上的可利用性
根据通过本发明的方法制备的皮肤分析或观察用样品，可综合地分析皮肤常驻细菌群与存在于角质层的物质，可对这些建立关联。而且，能够以活细菌的状态单离有用菌或未知菌。而且，可回收的总蛋白质量较多，因此蛋白质的解析变得更容易。而且，能够以从皮肤的外侧可见的状态将采集的角质层的两面的微细结构的状态进行可视化。作为其结果，可对化妆品的开发或肌肤的诊断技术的确立发挥作用。
序列表
<110> 株式会社益力多本社
<120> 皮肤分析或观察用样品的制备方法
<130> YK0097
<150> JP 2016-168718
<151> 2016-08-31
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1
gcgtgagtga cggtaatggg ta 22
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 2
ttccgacgcg atcaacca 18

Claims (12)

1.一种样品的制备方法，其特征在于：
其是制备用于分析皮肤常驻细菌和/或存在于角质层的物质、或观察角质层形状的样品的方法，该方法将含有聚乙烯醇系聚合物的溶液以形成薄膜的方式涂抹于皮肤上并剥离回收所形成的薄膜。
2.如权利要求1所述的方法，其中，
皮肤常驻细菌包含活细菌。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，
存在于角质层的物质包含选自蛋白质、氨基酸、脂质、核酸、糖、维生素、激素及肽中的1种或2种以上。
4.如权利要求1所述的方法，
其是制备用于观察角质层形状的样品的方法，该方法包含将剥离回收的薄膜固定化于显微镜观察用支撑体，并将聚乙烯醇系聚合物溶解去除，其后进行干燥的步骤。
5.如权利要求4所述的方法，其中，
固定化为贴附于涂布在显微镜观察用支撑体的固定化剂的方式。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，
聚乙烯醇系聚合物是皂化度为70～99摩尔％的聚乙烯醇系聚合物。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，
聚乙烯醇系聚合物是聚合度为50～3,000的聚乙烯醇系聚合物。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，
聚乙烯醇系聚合物是在温度20℃、4％水溶液的粘度为4～60mPa·s的聚乙烯醇系聚合物。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，
含有聚乙烯醇系聚合物的溶液为10～30质量％的聚乙烯醇系聚合物溶液。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，
将含有聚乙烯醇系聚合物的溶液涂抹于皮肤上后，在室温放置20分钟以上。
11.一种皮肤分析或观察用样品，
其是通过权利要求1至10中任一项所述的方法制备的。
12.一种角质层形状的观察方法，其特征在于：
使用通过权利要求4或5所述的方法所制备的皮肤观察用样品进行显微镜观察。
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