JP2002318230A - 定量方法 - Google Patents
定量方法Info
- Publication number
- JP2002318230A JP2002318230A JP2002040747A JP2002040747A JP2002318230A JP 2002318230 A JP2002318230 A JP 2002318230A JP 2002040747 A JP2002040747 A JP 2002040747A JP 2002040747 A JP2002040747 A JP 2002040747A JP 2002318230 A JP2002318230 A JP 2002318230A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- specific substance
- skin
- tape
- urea
- quantifying
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】放射性物質を使用しない、安全で簡便な生体内
組織中の特定物質の定量方法を提供する。 【解決手段】テープストリッピング法によって生体組織
中の特定物質を回収し、テープから特定物質を回収し測
定検体を調製し、測定検体中の特定物質を定量すること
からなる新規定量方法によって、上記の課題を解決でき
た。
組織中の特定物質の定量方法を提供する。 【解決手段】テープストリッピング法によって生体組織
中の特定物質を回収し、テープから特定物質を回収し測
定検体を調製し、測定検体中の特定物質を定量すること
からなる新規定量方法によって、上記の課題を解決でき
た。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は生体に吸収された物
質の定量方法に関する。さらに詳しくは、皮膚に塗布し
た組成物中に含有される物質が皮膚角質内に吸収された
量を定量する方法に関する。
質の定量方法に関する。さらに詳しくは、皮膚に塗布し
た組成物中に含有される物質が皮膚角質内に吸収された
量を定量する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】尿素には皮膚角質の保湿作用や角質溶解
作用があるため、アトピー性皮膚炎、老人性乾皮症等の
皮膚疾患の治療や、乾燥肌や肌のかゆみ、あかぎれ等を
改善するために、皮膚化粧料や医薬品・部外品の外用剤
の成分として汎用されている。しかし、皮膚に塗布した
外用剤中の尿素は、皮膚上で析出したり、基剤中に貯留
し移行しなかったりする場合があり、塗布された尿素の
全てが角質層にまで浸透するわけではない。尿素の皮膚
への移行性は製剤によってさまざまであり、角質層にど
の程度の尿素が浸透したか把握できれば、製剤設計上、
有用な指標とすることができる。
作用があるため、アトピー性皮膚炎、老人性乾皮症等の
皮膚疾患の治療や、乾燥肌や肌のかゆみ、あかぎれ等を
改善するために、皮膚化粧料や医薬品・部外品の外用剤
の成分として汎用されている。しかし、皮膚に塗布した
外用剤中の尿素は、皮膚上で析出したり、基剤中に貯留
し移行しなかったりする場合があり、塗布された尿素の
全てが角質層にまで浸透するわけではない。尿素の皮膚
への移行性は製剤によってさまざまであり、角質層にど
の程度の尿素が浸透したか把握できれば、製剤設計上、
有用な指標とすることができる。
【０００３】特定の物質の定量には、液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）を利用するのが簡単であり、また実
際に広く行われている方法である。しかし、角質層から
採取したサンプル中には、生体が分泌する種々雑多な成
分が混入しているため、そのままＨＰＬＣにサンプルを
注入しても、多数の妨害ピークが現れ測定は不可能であ
る。したがって、妨害ピークを除去するための操作や成
分としてほぼ目的の物質のみが含まれる状態にまで精製
するなどの煩雑な操作が必要となり、上記の様な角質層
中の尿素の定量には不向きな方法である。
フィー（ＨＰＬＣ）を利用するのが簡単であり、また実
際に広く行われている方法である。しかし、角質層から
採取したサンプル中には、生体が分泌する種々雑多な成
分が混入しているため、そのままＨＰＬＣにサンプルを
注入しても、多数の妨害ピークが現れ測定は不可能であ
る。したがって、妨害ピークを除去するための操作や成
分としてほぼ目的の物質のみが含まれる状態にまで精製
するなどの煩雑な操作が必要となり、上記の様な角質層
中の尿素の定量には不向きな方法である。
【０００４】そこで従来より、角質層中の尿素の定量方
法としては、放射性炭素（14Ｃ）によって標識した尿素
を使用するラベル化方法が行われているが、放射性物質
を扱うことのできる特別な実験施設中で煩雑な操作を実
施しなければならず、高額な経費を要したり、放射性物
質の暴露を受けたりする危険がある等の問題点があっ
た。
法としては、放射性炭素（14Ｃ）によって標識した尿素
を使用するラベル化方法が行われているが、放射性物質
を扱うことのできる特別な実験施設中で煩雑な操作を実
施しなければならず、高額な経費を要したり、放射性物
質の暴露を受けたりする危険がある等の問題点があっ
た。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上述の様に放射性炭素
を使用した尿素の定量方法には、様々な問題点があるた
め、より簡便で安全な定量方法の開発が求められてい
た。
を使用した尿素の定量方法には、様々な問題点があるた
め、より簡便で安全な定量方法の開発が求められてい
た。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者はこの様な現状
に鑑み鋭意検討を行った結果、下記の方法で簡単かつ正
確に、皮膚角質層中の尿素を定量できることを見出し、
本発明を完成させた。
に鑑み鋭意検討を行った結果、下記の方法で簡単かつ正
確に、皮膚角質層中の尿素を定量できることを見出し、
本発明を完成させた。
【０００７】すなわち本発明は、テープストリッピング
法によって生体組織中の特定物質を回収し、テープから
該特定物質を回収して測定検体を調製し、測定検体中の
特定物質を定量することからなる生体組織中の特定物質
の定量方法である。
法によって生体組織中の特定物質を回収し、テープから
該特定物質を回収して測定検体を調製し、測定検体中の
特定物質を定量することからなる生体組織中の特定物質
の定量方法である。
【０００８】本発明は上記生体組織が皮膚、皮膚角質層
または粘膜であることを特徴とする上記定量方法であ
る。また、本発明は特定物質が含窒素化合物、特に尿素
である前記定量方法である。
または粘膜であることを特徴とする上記定量方法であ
る。また、本発明は特定物質が含窒素化合物、特に尿素
である前記定量方法である。
【０００９】さらに本発明は、定量法が比色法、特にウ
レアーゼ−グルタミン酸脱水素酵素法である前記定量方
法である。
レアーゼ−グルタミン酸脱水素酵素法である前記定量方
法である。
【００１０】また、本発明は上記方法により、生体組織
中の特定物質を定量するために使用するキットまたはテ
ープである。さらに本発明には、テープストリッピング
法によって回収した生体組織中の特定物質を定量するた
めに使用するキットまたはテープも含まれる。
中の特定物質を定量するために使用するキットまたはテ
ープである。さらに本発明には、テープストリッピング
法によって回収した生体組織中の特定物質を定量するた
めに使用するキットまたはテープも含まれる。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明においてテープストリッピ
ング法とは、シート状物質を生体に貼付した後、剥がし
て生体の表層を回収する方法である。適用部位は髪、皮
毛、粘膜、皮膚等、特に限定されないが、好ましくは皮
膚である。皮膚である場合には、貼付して剥がすという
１回の操作で、通常は第１層の角質層を採取することが
できる。すなわち10枚のシートを使用してこの操作を繰
り返すことで、表面から10層分の角質層が採取される。
ング法とは、シート状物質を生体に貼付した後、剥がし
て生体の表層を回収する方法である。適用部位は髪、皮
毛、粘膜、皮膚等、特に限定されないが、好ましくは皮
膚である。皮膚である場合には、貼付して剥がすという
１回の操作で、通常は第１層の角質層を採取することが
できる。すなわち10枚のシートを使用してこの操作を繰
り返すことで、表面から10層分の角質層が採取される。
【００１２】本発明においては、上記シート状物質をテ
ープと称する。シート状物質の種類は、皮膚に密着させ
ることができるものであればよく、特に限定されない
が、紙や布、ビニルテープ、薄いアクリル板のように形
状を変化させられるものであることが好ましい。また、
粘着性を有するように加工し、皮膚に一定時間、付着・
保持できるようにしたものが好ましい。
ープと称する。シート状物質の種類は、皮膚に密着させ
ることができるものであればよく、特に限定されない
が、紙や布、ビニルテープ、薄いアクリル板のように形
状を変化させられるものであることが好ましい。また、
粘着性を有するように加工し、皮膚に一定時間、付着・
保持できるようにしたものが好ましい。
【００１３】このシートを裁断、ホモジナイズまたはそ
のままの状態で、回収しようとする目的物質に適する溶
媒に浸漬し、必要に応じて加熱したり試薬を加えたりし
て、目的物質を溶媒中に回収する。
のままの状態で、回収しようとする目的物質に適する溶
媒に浸漬し、必要に応じて加熱したり試薬を加えたりし
て、目的物質を溶媒中に回収する。
【００１４】シートを皮膚に貼付して角質層を採取した
場合には、例えばアルコール等の有機溶媒を使用して溶
媒中に目的物質を溶出させることができる。
場合には、例えばアルコール等の有機溶媒を使用して溶
媒中に目的物質を溶出させることができる。
【００１５】この溶媒に加水混濁、有機溶媒の除去な
ど、必要な処理を施して、目的物質を含んだ測定用検体
を調製する。そして、この検体をケルダール(Kjeldahl)
法(ネスラー試薬発色法、滴定法、インドフェノール反
応法等との組み合わせ法)やウレアーゼ法(インドフェノ
ール反応法、グルタミン酸脱水素酵素による紫外部測定
法、ロイシン脱水素酵素による紫外部測定法、アンモニ
ア電極法等との組み合わせ法)等、適切な方法によって
目的物質の定量を行うことができる。
ど、必要な処理を施して、目的物質を含んだ測定用検体
を調製する。そして、この検体をケルダール(Kjeldahl)
法(ネスラー試薬発色法、滴定法、インドフェノール反
応法等との組み合わせ法)やウレアーゼ法(インドフェノ
ール反応法、グルタミン酸脱水素酵素による紫外部測定
法、ロイシン脱水素酵素による紫外部測定法、アンモニ
ア電極法等との組み合わせ法)等、適切な方法によって
目的物質の定量を行うことができる。
【００１６】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明はこれら実施例によって限定される
ものではない。
説明するが、本発明はこれら実施例によって限定される
ものではない。
【００１７】実施例１ 塗布製剤の作製 表１に示す処方で、尿素の20％製剤（処方１）および10
％製剤（処方２）を調製した。
％製剤（処方２）を調製した。
【００１８】 ＰＧＭ：プロピレングリコールモノステアレート
【００１９】実施例２ 尿素製剤の経皮投与および皮膚
角質層の採取 一群６例の雄のヘアレスラット（HWY/Slc系、日本エス
エルシー生産、実験時９週齢、体重220〜260g）の左側
の腹部から背部にかけての皮膚、50cm2（5×10cm）に実
施例１で作製した処方１または処方２の製剤を1400mg塗
布した。その５時間後に塗布部を洗浄し、皮膚を拭いて
残留製剤を除去した。その後、市販のビニルテープ（約
5×10cm）を使用して、テープストリッピングを皮膚１
カ所あたり10回行い、皮膚角質層を採取した。なお、右
側の皮膚は無塗布対照として、同様の処置を行った。
角質層の採取 一群６例の雄のヘアレスラット（HWY/Slc系、日本エス
エルシー生産、実験時９週齢、体重220〜260g）の左側
の腹部から背部にかけての皮膚、50cm2（5×10cm）に実
施例１で作製した処方１または処方２の製剤を1400mg塗
布した。その５時間後に塗布部を洗浄し、皮膚を拭いて
残留製剤を除去した。その後、市販のビニルテープ（約
5×10cm）を使用して、テープストリッピングを皮膚１
カ所あたり10回行い、皮膚角質層を採取した。なお、右
側の皮膚は無塗布対照として、同様の処置を行った。
【００２０】実施例３ 尿素量の定量 上記のビニルテープを約5×2cmに切断し、15mlのエタノ
ールに浸漬させて、一夜、密栓放置した。エタノール液
を約30分間攪拌した後、ビニルテープを除去し、そのう
ち10mlを分取して、窒素ガスを使ってエタノールを除去
した。エタノール除去後、1mlの注射用蒸留水を加え、
混和後、遠心操作を行い、上清を除去し、残液中の尿素
測定用の検体とした。検体中の尿素窒素を自動分析装置
（商品名：AU400、オリンパス光学(株)製）を使用し
て、比色法（ウレアーゼ−グルタミン酸脱水素酵素法）
で測定し、常法にしたがって尿素濃度に換算した(表
２)。また、皮膚の単位面積あたりの吸収尿素量を算出
した(表３)。
ールに浸漬させて、一夜、密栓放置した。エタノール液
を約30分間攪拌した後、ビニルテープを除去し、そのう
ち10mlを分取して、窒素ガスを使ってエタノールを除去
した。エタノール除去後、1mlの注射用蒸留水を加え、
混和後、遠心操作を行い、上清を除去し、残液中の尿素
測定用の検体とした。検体中の尿素窒素を自動分析装置
（商品名：AU400、オリンパス光学(株)製）を使用し
て、比色法（ウレアーゼ−グルタミン酸脱水素酵素法）
で測定し、常法にしたがって尿素濃度に換算した(表
２)。また、皮膚の単位面積あたりの吸収尿素量を算出
した(表３)。
【００２１】ウレアーゼ−グルタミン酸脱水素酵素法の
測定原理： 尿素＋H2O（ウレアーゼ存在下）→2NH3＋CO2 NH3＋α-ケトグルタル酸（GLDH存在下）＋NADH→グルタ
ミン酸＋H2O＋NAD+
測定原理： 尿素＋H2O（ウレアーゼ存在下）→2NH3＋CO2 NH3＋α-ケトグルタル酸（GLDH存在下）＋NADH→グルタ
ミン酸＋H2O＋NAD+
【００２２】
【００２３】 （表２の値(mg/dl)×1.5／50cm2）
【００２４】
【発明の効果】上記結果から明らかなように、皮膚角質
中への尿素吸収量は、処方製剤中の尿素濃度に依存して
増加した。また、無塗布対照部位では、尿素は検出され
なかった。したがって、本発明方法によって、簡便でか
つ短時間で皮膚角質中の尿素測定が可能になった。ま
た、従来法のように放射性炭素（14Ｃ）を使用しないた
め、放射線の暴露の心配がなく安全で、かつ経費の節減
にもなる。
中への尿素吸収量は、処方製剤中の尿素濃度に依存して
増加した。また、無塗布対照部位では、尿素は検出され
なかった。したがって、本発明方法によって、簡便でか
つ短時間で皮膚角質中の尿素測定が可能になった。ま
た、従来法のように放射性炭素（14Ｃ）を使用しないた
め、放射線の暴露の心配がなく安全で、かつ経費の節減
にもなる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G045 AA29 BA13 BB01 BB10 BB11 CB09 DA16 FA26 FA27 FA34 FB01 FB13 GC10 GC15 2G052 AA28 AB16 AD12 AD32 AD46 BA23 DA05 DA23 EB11 EC04 ED17 FC05 FC12 FC15 FC19 FD09 GA11 GA29 JA04 JA07 JA16 JA26 2G054 AA06 AB02 BB01 BB02 BB10 BB13 CA21 CE01 EA06 JA06 JA09
Claims (11)
- 【請求項１】テープストリッピング法によって生体組織
中の特定物質を回収し、テープから上記特定物質を回収
して測定検体を調製し、測定検体中の特定物質を定量す
ることからなる生体組織中の特定物質の定量方法。 - 【請求項２】生体組織が皮膚または粘膜であることを特
徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項３】皮膚が皮膚角質層であることを特徴とする
請求項２記載の方法。 - 【請求項４】特定物質が含窒素化合物であることを特徴
とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】含窒素化合物が尿素であることを特徴とす
る請求項４記載の方法。 - 【請求項６】定量法が比色法であることを特徴とする請
求項１〜５のいずれかに記載の方法。 - 【請求項７】比色法がウレアーゼ−グルタミン酸脱水素
酵素法であることを特徴とする請求項６記載の方法。 - 【請求項８】請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法
により、生体組織中の特定物質を定量するために使用す
るキット。 - 【請求項９】テープストリッピング法によって回収した
生体組織中の特定物質を定量するために使用するキッ
ト。 - 【請求項１０】請求項１〜７のいずれか１項に記載の方
法により、生体組織中の特定物質を定量するために使用
するテープ。 - 【請求項１１】テープストリッピング法によって生体内
組織中の特定物質を回収するためのテープ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002040747A JP3986319B2 (ja) | 2001-02-16 | 2002-02-18 | 定量方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001039281 | 2001-02-16 | ||
| JP2001-39281 | 2001-02-16 | ||
| JP2002040747A JP3986319B2 (ja) | 2001-02-16 | 2002-02-18 | 定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002318230A true JP2002318230A (ja) | 2002-10-31 |
| JP3986319B2 JP3986319B2 (ja) | 2007-10-03 |
Family
ID=26609492
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002040747A Expired - Fee Related JP3986319B2 (ja) | 2001-02-16 | 2002-02-18 | 定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3986319B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007127543A (ja) * | 2005-11-04 | 2007-05-24 | Kose Corp | 外用製剤の角層貯留性評価方法 |
| WO2018043636A1 (ja) * | 2016-08-31 | 2018-03-08 | 株式会社ヤクルト本社 | 皮膚分析又は観察用検体の調製方法 |
-
2002
- 2002-02-18 JP JP2002040747A patent/JP3986319B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007127543A (ja) * | 2005-11-04 | 2007-05-24 | Kose Corp | 外用製剤の角層貯留性評価方法 |
| JP4690174B2 (ja) * | 2005-11-04 | 2011-06-01 | 株式会社コーセー | 外用製剤の角層貯留性評価方法 |
| WO2018043636A1 (ja) * | 2016-08-31 | 2018-03-08 | 株式会社ヤクルト本社 | 皮膚分析又は観察用検体の調製方法 |
| CN109642856A (zh) * | 2016-08-31 | 2019-04-16 | 株式会社益力多本社 | 皮肤分析或观察用样品的制备方法 |
| JPWO2018043636A1 (ja) * | 2016-08-31 | 2019-06-27 | 株式会社ヤクルト本社 | 皮膚分析又は観察用検体の調製方法 |
| EP3508835A4 (en) * | 2016-08-31 | 2020-04-22 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | METHOD FOR PREPARING A SAMPLE FOR ANALYZING OR MONITORING SKIN |
| JP7060509B2 (ja) | 2016-08-31 | 2022-04-26 | 株式会社ヤクルト本社 | 皮膚分析又は観察用検体の調製方法 |
| US11644458B2 (en) | 2016-08-31 | 2023-05-09 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Method for preparing specimen for analysis or observation of skin |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3986319B2 (ja) | 2007-10-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU742552B2 (en) | Non-invasive transdermal detection of analytes | |
| Diembeck et al. | Test guidelines for in vitro assessment of dermal absorption and percutaneous penetration of cosmetic ingredients | |
| US7189341B2 (en) | Electrochemical sensor ink compositions, electrodes, and uses thereof | |
| US6902905B2 (en) | Glucose measuring assembly with a hydrogel | |
| Lieb et al. | Self-adhesive thin films for topical delivery of 5-aminolevulinic acid | |
| EP1320751A2 (en) | Method and kit for the transderaml determination of analyte concentration in blood | |
| Sheth et al. | Measurement of the stratum corneum drug reservoir to predict the therapeutic efficacy of topical iododeoxyuridine for herpes simplex virus infection | |
| Zis et al. | In vivo neurochemical effects of electroconvulsive shock studied by microdialysis in the rat striatum | |
| Stoughton | Percutaneous absorption of drugs | |
| Patil et al. | Quantification of sodium lauryl sulfate penetration into the skin and underlying tissues after topical application—pharmacological and toxicological implications | |
| WO2003015636A1 (en) | Body fluid collection and analysis | |
| Babaei et al. | Multi-walled carbon nanotubes/chitosan polymer composite modified glassy carbon electrode for sensitive simultaneous determination of levodopa and morphine | |
| JP2011163944A (ja) | エストロゲンの定量方法 | |
| JP2002318230A (ja) | 定量方法 | |
| Nixon et al. | Reverse iontophoresis of L‐lactate: In vitro and in vivo studies | |
| Yekkala et al. | An improved sample preparation for an LC method used in the age estimation based on aspartic acid racemization from human dentin | |
| Tsai et al. | Drug and vehicle deposition from topical applications: localization of minoxidil within skin strata of the hairless mouse | |
| Wang et al. | Development and evaluation of the Sinomenine transdermal patch. | |
| Altun et al. | Development and Validation of Voltammetric Techniques for Nabumetone in Pharmaceutical Dosage Form, Human Serum and Urine. | |
| MARUTA et al. | Percutaneous absorption of methyl salicylate from medicated plaster in mice and humans | |
| Liu et al. | Study of noninvasive sampling of subcutaneous glucose by reverse iontophoresis | |
| JP6105252B2 (ja) | 皮膚内挙動評価方法 | |
| Kikuchi et al. | Usefulness of pressure-sensitive adhesives as a pretreatment material before application of topical drug formulations and a peeling tape for excess stratum corneum layers | |
| JP3281610B2 (ja) | ヒト角層中のスフィンゴリピドの定量法 | |
| Dutkiewicz et al. | Percutaneous absorption studies after forty years |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050117 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20060705 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20061023 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20061030 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061225 |
|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20061225 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20061225 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070629 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070710 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100720 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110720 Year of fee payment: 4 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |