JPWO2016153065A1 - Ｄｈａ含有グリセリド含有組成物の製造方法 - Google Patents

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Abstract

高度不飽和脂肪酸を含有する原料油脂に対し、リパーゼを作用させてエステル化反応を行い、ＤＨＡ含有グリセリド組成物を得る工程を含み、前記反応の反応液中における水分含量が０．４質量％以上であり、前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の酸価が１２以下である、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の製造方法。

Description

本発明は、純度が高く良好な品位のＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の製造方法、及びＤＨＡ含有グリセリド含有組成物に関する。
高度不飽和脂肪酸及びその誘導体は、血中脂肪の低減等の多くの生理活性を有し、古くから医薬品、化粧品、食品等の原料として使用されてきた。その中でも、特に、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、Ｃ２２：６）は、血小板凝集抑制作用、血中中性脂肪低下作用、血中コレステロール低下作用、脳機能向上効果といった種々の生理活性を有することが知られており、国内外において医薬品や特定保健用食品、機能性表示食品、サプリメント等としての需要が非常に高い。
ＤＨＡエチルエステルとしては高純度のものが販売されているが、グリセリド形態の方がエチルエステル態より体内への吸収が優れていることが知られている。そこで、高純度かつ良好な品位のＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の製造方法が求められている。
例えば、特許文献１（特公平７−８７７９３号公報）には、原料油脂をリパーゼで加水分解し、さらにクロマトグラフィーで分画することにより、高度不飽和脂肪酸を含有するモノグリセリド及び遊離脂肪酸を得る方法が記載されている。
しかしながら、上述の方法で得られるモノグリセリドにはＤＨＡの他にＥＰＡ等その他の不飽和脂肪酸も多く含まれており、ＤＨＡを選択的に濃縮することはできていない。さらに、遊離脂肪酸が多量に生成されてしまうため、酸価が高くなり、純度が高く良好な品位のＤＨＡ含有モノグリセリドが得られない。
また、特許文献２（特許第４５３０３１号公報）には、a工程として原料油脂にリパーゼを作用させ、さらに蒸留処理を行うことでＤＨＡ及びＥＰＡを含有するグリセリド画分を分離し、続くb工程として前記グリセリド画分にリパーゼを作用させて、ＤＨＡが濃縮されたグリセリド画分を得る方法が記載されている。
しかしながら、上述の方法では、特許文献１記載の方法と同様に得られたグリセリド画分中の遊離脂肪酸含量が高く、純度が高く良好な品位のＤＨＡ含有グリセリドが得られない。その上、２段階の酵素反応工程を経由する必要があるため、目的物のロスが多く、十分量のＤＨＡ含有グリセリドが得られていない。
特公平７−８７７９３号公報 特許第４５３０３１号公報
そこで、本発明の目的は、純度が高く良好な品位のＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を効率よく得ることができる製造方法、及びＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を提供するものである。
本発明者等は、上記目的を達成すべく、高度不飽和脂肪酸を含有する原料油脂に対し、リパーゼを作用させてエステル化反応を行う工程において、前記反応の反応液中における水分含量をコントロールするならば意外にも、酸価が低い（純度が高く良好な品位）ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を効率よく得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
つまり、本願発明は、
（１）構成脂肪酸として高度不飽和脂肪酸を含有する原料油脂に対し、水及び低級アルコール存在下でリパーゼを作用させてエステル化反応を行い、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を得る工程を含み、
前記反応の反応液中における水分含量が０．４質量％以上であり、
前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の酸価が１２以下である、
ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の製造方法、
（２）（１）において、
前記反応液は、前記原料油脂９．５質量部に対して０．１質量部以上３．０質量部以下の低級アルコールを含む、
ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の製造方法、
（３）（１）又は（２）において、
前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物に対する低級アルコール脂肪酸エステル化物の割合が４０質量％以上である、
ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の製造方法、
（４）ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物は、酸価が１２以下であり、
前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物中の油脂成分に対して、
グリセリド含量が２０質量％以上６０質量％以下であり、
前記グリセリド中に構成脂肪酸としてＤＨＡとＥＰＡとを以下の質量比で含む、
ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物、
０．５≦（グリセリド中のＤＨＡ／ＥＰＡ）≦１０
（５）（４）において、前記ＤＨＡ含有グリセリド組成物のグリセリド中に構成脂肪酸として含まれるＤＨＡの割合が２０質量％以上９０質量％以下である、
ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物、
（６）（４）又は（５）において、
前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物中の油脂成分に対して、
モノグリセリドの割合が１質量％以上５５質量％以下であり、
ジグリセリドの割合が１質量％以上３５質量％以下である、
ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物。
（７）（１）乃至（３）のいずれかにおいて、
前記エステル化反応によって得られた組成物は、低級アルコール脂肪酸エステルをさらに含み、
前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を分子蒸留により、
グリセリドとそれ以外の成分とを分離する工程をさらに含み、
グリセリド含量が７０質量％以上１００質量％以下である、
ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の製造方法、
（８）ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物は、酸価が１２以下であり、
前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の油脂成分中に対して、
グリセリド含量が７０質量％以上１００質量％以下であり、
前記グリセリド中に構成脂肪酸としてＤＨＡとＥＰＡとを以下の質量比で含む、
ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物、
０．５≦（グリセリド中のＤＨＡ／ＥＰＡ）≦１０
（９）（８）において、前記ＤＨＡ含有グリセリド組成物のグリセリド中に構成脂肪酸として含まれるＤＨＡの割合が２０質量％以上９０質量％以下である、
ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物、
（１０）（８）又は（９）において、
前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の油脂成分中において、
モノグリセリドの割合が５質量％以上４５質量％以下であり、
ジグリセリドの割合が３０質量％以上９０質量％以下である、
ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物、
（１１）（７）において、
前記分子蒸留処理によって得られた組成物に対し、水存在下でリパーゼを作用させて加水分解反応を行った後、さらに分子蒸留により、
グリセリドとそれ以外の成分とを分離する工程を含み、
得られたＤＨＡ含有グリセリド含有組成物のグリセリド中に構成脂肪酸として含まれるＤＨＡの割合が３０質量％以上８０質量％以下である、
ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の製造方法、
（１２）ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物は、酸価が０．１以上５以下であり
前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物中の油脂成分に対して、
グリセリド含量が８０質量％以上１００質量％以下であり、
前記グリセリド中に構成脂肪酸としてＤＨＡとＥＰＡとを以下の質量比で含む、
ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物、
２≦（グリセリド中のＤＨＡ／ＥＰＡ）≦１５
（１３）（１２）において、
前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物中の油脂成分に対して、
モノグリセリドの割合が０％以上２０質量％以下であり、
ジグリセリドの割合が５質量％以上５０質量％以下である、
ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物、
（１４）（１２）又は（１３）において、
前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物中の油脂成分に対して、
トリグリセリドの割合が４０％以上９５質量％以下である、
ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物、
（１５）（１）乃至（３）、（７）、及び（１１）のいずれかに記載の製造方法によって得られる、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物、
（１６）（１）乃至（３）、（７）、及び（１１）のいずれかに記載の製造方法により得られたＤＨＡ含有グリセリド含有組成物、
又は（４）乃至（６）、（８）乃至（１０）、及び（１２）乃至（１５）のいずれかに記載のＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を使用して食品組成物を得る工程を含む、
食品組成物の製造方法、
（１７）（１）乃至（３）、（７）、及び（１１）のいずれかに記載の製造方法により得られたＤＨＡ含有グリセリド含有組成物、
又は（４）乃至（６）、（８）乃至（１０）、及び（１２）乃至（１５）のいずれかに記載のＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を使用してカプセル化剤を得る工程を含む、
カプセル化剤の製造方法、
である。
本発明によれば、純度が高く良好な品位のＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を効率よく得ることができる製造方法を提供できることから、ＤＨＡ含有グリセリドを利用した食品・医薬品・飼料等の更なる拡大に貢献するものである。
また、エステル化反応の反応液中における水分含量をコントロールすることにより、リパーゼの安定性が高められることから、リパーゼの繰り返し使用が可能になり、製造コストの低減及び省資源化を図ることができる。
図１は、本発明のＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の製造方法のフローチャートを示す。
次に、本発明を詳細に説明する。なお、本発明において、「％」は「質量％」を、「部」は「質量部」を意味する。
＜本発明の特徴＞
本発明の製造方法は、構成脂肪酸として高度不飽和脂肪酸を含有する原料油脂に対し、水及び低級アルコール存在下でリパーゼを作用させてエステル化反応を行い、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を得る工程を含み、前記反応の反応液中における水分含量が０．４質量％以上であることにより、酸価が１２以下である、純度が高く、良好な品位のＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を効率よく得る製造方法に特徴を有する。
より具体的には、本発明の製造方法により、ＤＨＡをグリセリド画分に濃縮させ、選択的にＤＨＡ含有グリセリドを製造することができる。
＜ＤＨＡ含有グリセリド＞
本発明において、グリセリドとは、モノグリセリド、ジグリセリド、及びトリグリセリドを含むグリセリン脂肪酸エステルを指す。また、ＤＨＡ含有グリセリドとは、グリセリン脂肪酸エステル化物を構成する脂肪酸残基の一部又は全部がＤＨＡである化合物をいう。
＜原料油脂＞
本発明の製造方法において、油脂とは、通常、トリグリセリドを意味するが、本発明では、ジグリセリド、モノグリセリド等、リパーゼが作用するその他のグリセリドも含んでいてもよい。また、本発明の製造方法に用いる原料油脂は、ＤＨＡを含む高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として含有するトリグリセリドを含む油脂であればよい。特に、エステル化反応においては、トリグリセリドの割合が９０質量％以上である油脂を用いるとよい。
なお、本発明において、「ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物中の油脂成分」としては、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、低級アルコールエステル化物、及び遊離脂肪酸を含む概念をいう。
＜原料油脂の組成＞
本発明の製造方法に用いる原料油脂としては、脂肪酸組成中のＤＨＡの含量が２質量％以上４０質量％以下（好ましくは２質量％以上３５質量％以下）である油脂を用いるとよい。また、ＥＰＡ（エイコサペンタエン酸、Ｃ２０：５）等、ＤＨＡ以外の脂肪酸を構成脂肪酸として含有するトリグリセリドを含んでいてもよい。
原料油脂が、ＥＰＡを構成脂肪酸として含有する場合、脂肪酸組成中のＥＰＡの含量は１０質量％以上３０質量％以下（好ましくは１０質量％以上２０質量％以下）とすることができる。原料油脂がＥＰＡ及びＤＨＡの両方を含む場合、得られるＤＨＡ含有グリセリド含有組成物のグリセリド中のＤＨＡ含量をより高められることから、ＥＰＡとＤＨＡの質量比率は、ＥＰＡ／ＤＨＡ＝０．５以上６以下であればよく、さらに０．５以上３以下であればよい。
また、得られるＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の酸価を低減しやすくできることから、原料油脂の酸価は０以上２．５以下であればよく、さらに０以上２以下であればよい。
＜原料油脂の種類＞
原料油脂としては、例えば、魚油、魚油以外の動物油、植物油、藻類、微生物が生産する油、又はこれらの混合油脂等が挙げられる。
魚油としては、イワシ油、マグロ油、カツオ油、タラ肝油、サケ油、イカ油、又はメンヘーデン油等が挙げられる。
藻類、微生物由来油としては、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎｅ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ等によるアラキドン酸含有油、クロメ、アラメ、ワカメ、ヒジキ、ハバノリ、ヒバマタの一種によるＥＰＡ含有油、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉ、Ｖｉｂｒｉｏ ｍａｒｉｎｕｓ、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属細菌等によるＤＨＡ含有油等が挙げられる。
＜リパーゼ＞
本発明の製造方法（エステル化反応）に用いるリパーゼは、１，３位−特異的であっても、非特異的であってもよい。ここで、１，３位特異リパーゼとしては、トリグリセリドの１，３位にのみ特異的作用する酵素、又は２位よりも１，３位に優先的に作用する酵素である。ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の割合をより高められることから、１，３位特異リパーゼを用いるとよい。
リパーゼの性状は、粗精製、部分精製、精製のいずれでもよい。また、遊離型でも固定化酵素でもよいが、再利用可能である点、エステル化反応後の処理が簡便である点で、固定化酵素を用いるとよい。
＜担体＞
固定化酵素は、酵素を担体、フィルム、又は膜に固定化されたものであってもよい。担体としては、イオン交換樹脂、多孔性樹脂、セラミックス、炭酸カルシウム、セライト、ガラスビーズ、活性炭等の有機担体、無機担体、有機無機複合担体が挙げられる。耐久性やリパーゼとの親和性に優れていることから、担体は、イオン交換樹脂、多孔性樹脂、セラミックスを用いるとよい。
固定化の方法としては、包括法、架橋法、物理的吸着法、イオン吸着法、共有結合法、疎水結合法等が挙げられる。
＜粒子径＞
固定化酵素が粒子状である場合、粒子状の担体に酵素を固定化することができる。この場合、担体の粒子径が０．０１ｍｍ以上３ｍｍ以下であればよく、さらに０．０５ｍｍ以上１．５ｍｍ以下であればよい。
＜リパーゼの具体例＞
本発明のエステル化反応において、リパーゼとしては、例えば、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、ムコール属(Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ，Ｍｕｃｏｒ ｊａｖａｎｉｃｕｓ)、アスペルギルス属(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ)、リゾプス属(Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ.)、ペニシリウム属(Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ)、サーモマイセス属(Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ)等に属する糸状菌、キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ，Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ，Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）等に属する酵母、シュードモナス属(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ.)、アクロモバクター属(Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ.)、ブルクホルデリア属(Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．)、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）、シュードザイマ属(Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｓｐ．)等に属する細菌、豚膵臓等の動物に由来するリパーゼが挙げられる。例えば、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅのリパーゼ（リパーゼＤＦ：天野エンザイム社製）、Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ（リパーゼＯＦ：名糖産業社製）およびＰｓｅｕｄｏｍａｎａｓ属のリパーゼ（リパーゼＰＳ、リパーゼＡＫ：天野製薬社製）が挙げられ、固定化酵素としては、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉのリパーゼ（リポザイムＩＭ６０：ノボザイムズ社製、リポザイムＲＭＩＭ：ノボザイムズ社製）、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａのリパーゼ（ノボザイム４３５：ノボザイムズ社製）が挙げられる。
＜リパーゼの使用量＞
リパーゼの使用量は、エステル化反応が進行すれば特に限定されないが、例えば、遊離型の酵素を用いる場合は、一般的には反応液１ｇ当たり１単位(Ｕ)以上１０，０００Ｕ添加することができ、さらに５Ｕ以上１，０００Ｕ添加することができる。
また、固定化酵素を用いる場合は、反応液の質量に対して、担体の質量を含む質量として０．１質量％以上２００質量％以下になるように、さらに１質量％以上３５質量％以下（好ましくは１質量％以上２０質量％以下）になるように添加することができる。
ここで、酵素活性の１Ｕとは、リパーゼの場合はオリーブ油の加水分解において１分間に１μｍｏｌの脂肪酸を遊離する酵素量を指す。
＜水分含量＞
本発明の製造方法において、前記エステル化反応の反応液中における水分含量を０．４質量％以上にすることで、リパーゼの安定性が高められる結果、繰り返し使用が可能になる。また、エステル化反応により生じるグリセリンを水中に誘導させることで、グリセリンが油中で固まるのを防止し、エステル化反応を円滑に進行させることができる。
リパーゼの安定性がより高められることから、さらに前記水分含量は０．５質量％以上２０質量％以下、０．５質量％以上１０質量％以下であるとよい。
前記水分含量が０．４質量％未満であると、リパーゼの安定性が低下し、エステル化反応が進行しなくなってしまう。
また、水分含量が２０質量％以下である方が、ＤＨＡ含有トリグリセリドとリパーゼとの接触が多くなり、得られるＤＨＡ含有グリセリド含有組成物のＤＨＡ含有グリセリドの含量が多くなりやすい。さらに、加水分解反応が進行しにくく、酸価を低く保ちやすい。
なお、水は、反応液中に逐次的に添加してもよいし、連続して添加してもよいし、又は一括して添加してもよい。
＜酸価＞
本発明において、酸価とは、試料から抽出した油分の酸価をいう（公益社団法人日本油化学会制定の基準油脂分析試験法（日本油化学会規格試験法委員会編、基準油脂分析試験法（Ｓｔａｎｄａｒｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆａｔｓ，ｏｉｌｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｔｅｒｉａｌｓ）：日本油化学会制定、２０１３年版、１．５ 抽出油の酸価））。
前記エステル化反応では、純度が高く良好な品位のＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を得られることから、前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の酸価が１２以下であり、さらに２．２以上１２以下、３以上９以下であるとよい。
前記酸価が１２より高いことは、遊離脂肪酸の濃度が高いことを意味する。したがって、酸価が１２より高いと、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の酸化劣化が生じ、良好な品位のものが得られない。
また、精製工程において遊離脂肪酸とグリセリドは分離するのが困難であるため、製造プロセス上負担が大きく、効率よくＤＨＡ含有グリセリドを得ることができない。
なお、本発明において、遊離脂肪酸とは、脂肪酸エステル化物として存在していない脂肪酸（非エステル結合型脂肪酸）をいう。
＜酸価の測定方法＞
本発明において、酸価の値は、公益社団法人日本油化学会制定の基準油脂分析試験法（日本油化学会規格試験法委員会編、基準油脂分析試験法（Ｓｔａｎｄａｒｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆａｔｓ，ｏｉｌｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｔｅｒｉａｌｓ）：日本油化学会制定、２０１３年版、１．５ 抽出油の酸価）により測定することができる。
具体的には、まず、試料（反応終了後の反応液）をその推定酸価に対応する採取量に準じて三角フラスコに正しく測り取り、エタノール／ジエチルエーテル＝１／１（ｗ／ｗ）の混合溶媒１００ｍＬを加え、試料を完全に溶解させた。次いで、０．１ｍｏｌ／Ｌのエタノール性水酸化カリウムで滴定し、指示薬として加えたフェノールフタレイン溶液の変色が３０秒間以上続いた点を終点とする。酸価は以下の式（３）により算出された。
酸価＝５．６１１×Ａ×Ｆ／Ｂ ・・・・（３）
Ａ：０．１ｍｏｌ／Ｌのエタノール性水酸化カリウムの使用量（ｍＬ）
Ｂ：試料採取量（ｇ）
Ｆ：エタノール性水酸化カリウムのファクター
＜低級アルコール＞
本発明の製造方法に用いる低級アルコールは、炭素原子数１、２、又は３のモノアルコールをいう。具体的には、水との混和性に優れている点で、メタノール及び／又はエタノールであるとよく、さらにエタノールであるとよい。
＜原料油脂に対する低級アルコールの質量＞
水及び油脂の双方と混和することによりエステル化反応を円滑に進行させられることから、前記反応液は、前記原料油脂９．５質量部に対して０．１質量部以上３．０質量部以下の低級アルコールを含むとよく、さらに０．３質量部以上２．５質量部含むとよい。
なお、前記反応液に低級アルコールを連続的に添加してもよいし、段階的に添加してもよいし、又は一括して添加してもよいが、リパーゼの失活を抑制できることから、連続的に又は段階的に添加するとよい。
なお、本発明において、「低級アルコールを連続的に添加する」とは、低級アルコールを継続して添加することをいい、「低級アルコールを段階的に添加する」とは、継続的ではないが、低級アルコールを複数回添加することをいう。
＜水に対する低級アルコールの質量＞
リパーゼの失活を抑制できることから、前記反応液における水に対する低級アルコールの質量比（低級アルコール／水）は、１以上５０以下とすることができ、さらに２以上２０以下とすることができる。
＜エステル化反応＞
＜エステル化率＞
前記エステル化反応では、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物におけるグリセリド中のＥＰＡに対するＤＨＡの質量比（ＤＨＡ／ＥＰＡ）を高められることから、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の油脂成分に対する低級アルコール脂肪酸エステル化物の割合（以下、「エステル化率」ともいう。）は４０質量％以上であるとよく、さらに５０質量％以上９０質量％以下、６０質量％以上８０質量％以下であるとよい。
なお、前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物に含まれる油脂成分の割合は８０質量％以上１００質量％以下とすることができ、さらに９０質量％以上１００質量％以下とすることができる。
＜反応温度及び反応時間＞
前記エステル化反応における反応液の温度は、用いるリパーゼの種類により適宜決定すればよいが、具体的には、例えば、１５℃以上５０℃以下とすることができ、さらに２５℃以上４５℃以下とすることができる。
また、反応時間は、２時間以上４８時間以下とすることができ、さらに４時間以上３６時間以下とすることができる。
＜反応経路＞
エステル化反応は通常、水分含量が少ない条件下でアルコールとグリセリドを反応させる。その理由として、水分含量が多いと、生成した脂肪酸エステル化物のエステル結合が加水分解されてしまったり、遊離脂肪酸が生成してしまうためである。
これに対して、本発明の製造方法では、反応液中における水分含量を０．４質量％以上としても、酸価が１２以下である、純度が高く良好な品位のＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を効率よく製造できる。
さらに、反応液中に含まれる水分により、リパーゼの安定性を高めることができ、その結果、リパーゼの繰り返し利用を可能にする。
［分子蒸留］
本発明の製造方法において、エステル化反応（図１のステップ１）で得られたＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を分子蒸留（図１のステップ２）する工程をさらに含むことができる。
分子蒸留（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ）は、高真空度下で行われる蒸留である。分子蒸留工程により、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物をグリセリドとそれ以外の成分に分離することができ、その結果、グリセリド含量が７０質量％以上１００質量％以下である、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を得ることができる。
＜蒸留温度及び真空度＞
分子蒸留における温度は、８０℃以上２００℃以下とすることができ、さらに１５０℃以上２００℃以下とすることができる。また、真空度は０．００１Ｔｏｒｒ以上５Ｔｏｒｒ以下とすることができ、さらに０．０１Ｔｏｒｒ以上１Ｔｏｒｒ以下とすることができる。
特に、温度１４０℃以上１６０℃以下で、かつ真空度０．０１Ｔｏｒｒ以上０．１Ｔｏｒｒ以下であるとよい。
分子蒸留に用いる装置は、一般的に市販されているものを使用して行うことができる。具体的には、例えば、遠心式分子蒸留機、ショートパス蒸留機、流下膜式蒸留機等を用いることができ、特に、ショートパス蒸留機を用いると良い。
＜加水分解反応＞
本発明の製造方法において、エステル化反応（図１のステップ１）後に分子蒸留（図１のステップ２）をすることで得られたＤＨＡ含有グリセリド含有組成物（第２組成物）を加水分解反応し、分子蒸留処理する工程（図１のステップ３）をさらに含むことができる。
前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物（第２組成物）に対し、水存在下でリパーゼを作用させて加水分解反応を行った後、分子蒸留処理によりグリセリドとそれ以外の成分とを分離することで、イワシ油（ＤＨＡ含量：１２質量％）のようなＤＨＡ含量の低い原料油脂であっても、純度の高いＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を得ることができる。具体的には、前記グリセリド含有組成物のグリセリド中に構成脂肪酸として含まれるＤＨＡの割合が３０質量％以上８０質量％以下である、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を得ることができる。
＜原料油脂に対する水分含量＞
前記加水分解反応では、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物におけるグリセリド中のＥＰＡに対するＤＨＡの質量比（ＤＨＡ／ＥＰＡ）、及びグリセリド中に構成脂肪酸として含まれるＤＨＡの割合を高められることから、原料油脂に対する水分含量は、１０質量％以上１００質量％以下であるとよく、さらに１０質量％以上５０質量％以下、さらに２０質量％以上４０質量％以下であるとよい。
＜反応温度及び反応時間＞
前記加水分解反応における反応液の温度は、用いるリパーゼの種類により適宜決定すればよいが、具体的には、例えば、１５℃以上５０℃以下とすることができ、さらに２０℃以上４５℃以下とすることができる。
また、反応時間は、５時間以上４８時間以下とすることができ、さらに１０時間以上２４時間以下とすることができる。
＜リパーゼ＞
前記加水分解反応に用いるリパーゼは、加水分解反応を触媒し、高度不飽和脂肪酸に作用しにくい性質を有すれば特に限定されない。
例えば、キャンディダ シリンドラセア（Candida cylindoracea）に属する微生物から得られるリパーゼ（リパーゼＯＦ：名糖産業(株)製）、アルカリゲネス エスピー（Alcaligenes sp.）に属する微生物から得られるリパーゼ（リパーゼQLM、リパーゼQLC、リパーゼPL：いずれも名糖産業(株)製）、バークホリデリア セパシア（Burkholderia cepacia）に属する微生物から得られるリパーゼ（リパーゼPS：天野エンザイム(株)製）、シュードモナス フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）に属する微生物から得られるリパーゼ（リパーゼAK：天野エンザイム(株)製）、サーモマイセス ラヌギノサス（Thermomyces lanuginosa）に属する微生物から得られるリパーゼ（リポザイムTLIM：ノボザイム社製）などが挙げられる。
＜リパーゼの使用量＞
リパーゼの使用量は、加水分解反応が進行すれば特に限定されないが、例えば、遊離型の酵素を用いる場合は、一般的には反応液１ｇ当たり１単位(Ｕ)以上１０，０００Ｕ添加することができ、さらに５Ｕ以上５，０００Ｕ添加することができる。
＜作用効果＞
本発明の製造方法の作用効果を説明するにあたり、まず、公知のＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の製造方法について説明する。
＜公知のＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の製造方法（特許文献１）＞
公知のＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の製造方法（特許文献１に記載）では、まず、構成脂肪酸として高度不飽和脂肪酸を含有する油脂に、精製水に溶かした酵素を作用させて加水分解反応を行い、モノグリセリド及び遊離脂肪酸を含む混合物を生成させる。さらに、前記混合物を遠心液々分配クロマトグラフィーにより分画することで、ＤＨＡを含む高度不飽和脂肪酸の遊離脂肪酸及びモノグリセリドを含む画分が得られる。
＜公知のＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の製造方法（特許文献１）−課題＞
しかしながら、特許文献１記載の方法で得られるモノグリセリド画分にはＤＨＡの他にＥＰＡ等その他の不飽和脂肪酸が含まれており、ＤＨＡを選択的に濃縮することはできない。このような複数種類の高度不飽和脂肪酸を含有するモノグリセリド画分から所望のＤＨＡ含有グリセリドを分離するためには、例えば、条件（例えば、真空度、加熱温度、加熱方法、加熱時間）を非常に厳密に制御した蒸留を行う必要があり、困難である。
また、上述の製造方法では、遊離脂肪酸が多量に生成されるため、純度の高いＤＨＡ含有モノグリセリドが得られない。
さらに、上述の製造方法では、ＤＨＡ含有ジグリセリド及びＤＨＡ含有トリグリセリドを得ることはできない。
＜公知のＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の製造方法（特許文献２）＞
公知のＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の製造方法（特許文献２に記載）では、まず、a工程として原料油脂にリパーゼを作用させ、さらに蒸留処理を行うことでＤＨＡおよびＥＰＡを含有するグリセリド画分を分離する。続いて、ｂ工程として前記グリセリド画分にリパーゼを作用させて、ＤＨＡが濃縮されたグリセリド画分を得る方法が記載されている。
＜公知のＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の製造方法（特許文献２）−課題＞
しかしながら、特許文献２記載の製造方法では、a工程及びb工程の２段階酵素反応工程を経由する必要がある。そのため、製造工程における目的物のロスが多く、十分量のＤＨＡが濃縮されたグリセリド画分が得られない。
さらに、上述の製造方法では、遊離脂肪酸が多量に生成され、酸価が高くなってしまうため、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の品位が低下してしまう。
＜本発明の製造方法の作用効果＞
これに対して、本発明の製造方法によれば、構成脂肪酸として高度不飽和脂肪酸を含有する原料油脂に対し、水及び低級アルコール存在下でリパーゼを作用させてエステル化反応を行い、前記反応の反応液中における水分含量をコントロールすることで、酸価が低いＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を効率良く得ることができる。
（ｉ）具体的には、前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の酸価を１２以下にすることで、遊離脂肪酸の少ない、良好な品位のＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を得ることができる。
また、遊離脂肪酸の含量を少なくすることで、ＤＨＡ含有グリセリドの分離を容易にし、目的物の収率を上げることができる。
一般的なエステル化反応において、水存在下では加水分解反応が進行しやすくなるため遊離脂肪酸が生成してしまうため、通常、水が少ないあるいは水が存在しない条件でエステル化反応を行う。しかしながら、本発明の製造方法では、水分含量を０．４質量％以上としながらも酸価を低く保つことができている。
さらに、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物のグリセリド中のＤＨＡ含量を高めることができ、純度の高いＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を得ることができる。
（ｉｉ）本発明の製造方法によれば、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物のグリセリド中のＥＰＡに対するＤＨＡの質量比を高めることができる。ＥＰＡとＤＨＡは分子量や二重結合数が近似しているため、ＤＨＡ含有グリセリドの一方のみを単離することが困難である。そのため、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物中のＥＰＡに対するＤＨＡの割合を高めることで、精製工程での目的物のロスを少なくし、より効率よくＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を得ることができる。
さらに、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物中のモノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの合計含量、並びに各グリセリドの含量を高めることができることから、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の収率を高めることができる。
＜ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物＞
上述のエステル化反応により得ることができるＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を第１組成物とする。
上述のエステル化反応に続く分子蒸留処理により得ることができるＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を第２組成物とする。
また、上述の分子蒸留処理に続く加水分解反応の後、分子蒸留処理により得ることができるＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を第３組成物とする。
１．第１組成物
本発明で得られる第１組成物は、酸価が１２以下であり、
前記組成物中の油脂成分に対して、グリセリド含量が２０質量％以上６０質量％以下であり、前記グリセリド中に構成脂肪酸としてＤＨＡとＥＰＡとを以下の質量比で含む、
ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物である。
０．５≦（グリセリド中のＤＨＡ／ＥＰＡ）≦１０
前記グリセリド含量は、さらに２５質量％以上５５質量％以下、３０質量％以上５０質量％以下あるとよい。
前記酸価は、さらに２．２以上１２以下、３以上９以下であるとよい。
前記ＥＰＡに対するＤＨＡの質量比は、さらに以下の割合であるとよい。
１≦（グリセリド中のＤＨＡ／ＥＰＡ）≦５
＜構成脂肪酸として含まれるＤＨＡ含量＞
前記第１組成物において、グリセリド中に構成脂肪酸として含まれるＤＨＡの割合が２０質量％以上９０質量％以下であるとよく、さらに２０質量％以上７０質量％以下、２５質量％以上６０質量％以下であるとよい。
＜モノグリセリド及びジグリセリドの割合＞
前記第１組成物中の油脂成分に対して、モノグリセリドの割合は１質量％以上５５質量％以下であるとよく、ジグリセリドの割合は１質量％以上３５質量％以下であるとよい。
さらに、モノグリセリドの割合は５質量％以上５０質量％以下であるとよく、ジグリセリドの割合は５質量％以上３０質量％以下であるとよい。
なお、トリグリセリドの割合は１質量以上３０質量％以下とすることができ、さらに１．５質量％以上２０質量％以下とすることができる。
２．第２組成物
本発明で得られる第２組成物は、酸価が１２以下であり、前記組成物中の油脂成分に対して、グリセリド含量が７０質量％以上１００質量％以下であり、前記グリセリド中に構成脂肪酸としてＤＨＡとＥＰＡとを以下の質量比で含む、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物である。
０．５≦（グリセリド中のＤＨＡ／ＥＰＡ）≦１０
前記グリセリド含量は、さらに８０質量％以上１００質量％以下、９０質量％以上１００質量％以下あるとよい。
前記酸価は、さらに０以上１２以下（２．２以上１２以下）、０．２以上９以下（例えば３以上９以下）であるとよい。
前記ＥＰＡに対するＤＨＡの質量比は、さらに以下の割合であるとよい。
１≦（グリセリド中のＤＨＡ／ＥＰＡ）≦５
＜構成脂肪酸として含まれるＤＨＡ含量＞
前記第２組成物において、グリセリド中に構成脂肪酸として含まれるＤＨＡの割合が２０質量％以上９０質量％以下であるとよく、さらに２０質量％以上７０質量％以下、２５質量％以上６０質量％以下であるとよい。
＜モノグリセリド及びジグリセリドの割合＞
前記第２組成物中の油脂成分に対して、モノグリセリドの割合は５質量％以上４５質量％以下であるとよく、ジグリセリドの割合は３０質量％以上９０質量％以下であるとよい。
さらに、モノグリセリドの割合は１０質量％以上４０質量％以下であるとよく、ジグリセリドの割合は４０質量％以８０質量％以下であるとよい。
なお、トリグリセリドの割合は１質量以上２５質量％以下とすることができ、さらに２質量％以上２０質量％以下とすることができる。
＜各グリセリド画分に含まれるＤＨＡ含量＞
前記第２組成物において、モノグリセリドに含まれるＤＨＡの含量は１５質量％以上５０質量％以下とすることができ、さらに２０質量％以上４０質量％以下とすることができる。
また、ジグリセリドに含まれるＤＨＡ含量は２０質量％以上とすることができ、さらに２５質量％以上４５質量％以下とすることができる。
さらに、トリグリセリドに含まれるＤＨＡ含量は１０質量％以上４５質量％以下とすることができ、さらに１５質量％以上３５質量％以下とすることができる。
３．第３組成物
本発明で得られる第３組成物は、グリセリド中に構成脂肪酸として含まれるＤＨＡの割合が３０質量％以上８０質量％以下である、
ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物である。
前記ＤＨＡの割合は、さらに３５質量％以上７５質量％以下、４０質量％以上７０質量％以下であるとよい。
＜酸価＞
前記第３組成物は、酸価が０．１以上５以下であるとよく、さらに０．１以上３以下であるとよい。
＜グリセリド含量＞
前記第３組成物の油脂成分に対して、グリセリド含量が８０質量％以上１００質量％以下であるとよく、さらに８５質量％以上１００質量％以下、９０質量％以上１００質量％以下であるとよい。
＜グリセリド中のＥＰＡに対するＤＨＡの質量比＞
前記第３組成物のグリセリド中に構成脂肪酸としてＤＨＡとＥＰＡとを以下の質量比で含む、
ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物である。
２≦（グリセリド中のＤＨＡ／ＥＰＡ）≦１５
前記ＥＰＡに対するＤＨＡの質量比は、さらに以下の割合であるとよい。
２．５≦（グリセリド中のＤＨＡ／ＥＰＡ）≦１０
２．５≦（グリセリド中のＤＨＡ／ＥＰＡ）≦６
＜モノグリセリドの割合＞
前記第３組成物中の油脂成分に対して、
モノグリセリドの割合は０質量％以上２０質量％以下であるとよく、さらに０質量％以上１５質量％以下、０質量％以上１０質量％以下であるとよい。
＜ジグリセリドの割合＞
前記第３組成物中の油脂成分に対して、ジグリセリドの割合は５質量％以上５０質量％以下であるとよく、さらに１０質量％以上４５質量％以下、１５質量％以上４０質量％以下であるとよい。
＜トリグリセリドの割合＞
前記第３組成物中の油脂成分に対して、トリグリセリドの割合は４０質量以上９５質量％以下であるとよく、さらに４５質量％以上９５質量％以下、５０質量％以上９０質量％以下であるとよい。
＜ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の具体例＞
ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物（第１乃至第３組成物）は、医薬品、化粧品、食品、又は飼料等の原料として使用することができる。例えば、ＤＨＡ含有モノグリセリド、ＤＨＡ含有ジグリセリド、又はＤＨＡ含有トリグリセリドが挙げられる。ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物は、サプリメント等の食品組成物及びカプセル剤の原料として使用することができる。
次に、本発明を実施例及び比較例に基づき、さらに説明する。なお、本発明はこれに限定するものではない。
［調製例１（固定化酵素の調製）］
サーモマイセス・ラヌギノーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）の４００ｇの溶液（９４０ＫＬＵ／ｍＬ）を、大川原製作所製流動層造粒装置を用いて１ｋｇのセライト５４５（ジョンマンビル社、粒径０．０２−０．１ｍｍ）上に噴霧した。
前記リパーゼ溶液はペリスタポンプ（東京理化器械株式会社）を経由して供給した。１００ｍ３／時の空気流により吸い込み口の空気の温度は５７℃であり、そして固定化産物の温度は約４０℃であった。
固定化終了後、流動層中で更に５分間乾燥して、粒子状の固定化酵素（平均粒子径６００μｍ、比重２）を得た。なお、サーモマイセス・ラヌギノーゼは１，３特異リパーゼであり、担体への固定化方法は物理的吸着法である。
［調製例２（固定化酵素の調製）］
ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）７０質量％とメタクリル酸グリシジル１５質量％とＤＥＡＥメタクレート１５質量％を通常の方法で共重合し、粒子状の樹脂担体を得た。 この樹脂担体の平均細孔径は１１．５ｎｍで細孔容積は０．５ｃｍ３／ｇ、平均粒子径は０．５ｍｍ、比重０．２であった。得られた樹脂担体１ｋｇにＲｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ.由来のリパーゼＦＡＰ−１５（天野エンザイム（株）製 １５５,０００ｕ／ｇ）の２質量％水溶液１０Ｌを加え、３時間２５℃で攪拌しながら固定化を行った。
濾過、洗浄後、真空乾燥器で２時間乾燥し、固定化酵素を得た。なお、リパーゼＦＡＰ−１５は１，３特異リパーゼであり、担体への固定化方法は共有結合法である。
［実施例１（エステル化反応）］
精製魚油（イワシ油：酸価０、トリグリセリド含量：９５質量％、脂肪酸組成中のＤＨＡ含量：１２質量％、脂肪酸組成におけるＥＰＡ／ＤＨＡ（質量比率：０．５以上６以下）１ｋｇをセパラブルフラスコ（容量３Ｌ）に入れ、エタノール５２．５ｇを添加した。
フラスコを混ぜ、エタノールを魚油中に均一に分散させた。次に、水５．２５ｇ（反応液中の水分含量：０．５質量％）を入れ、撹拌し、水を魚油−エタノール混合物中に分散させて、反応液を調製した。
次いで、調製例１で調製した固定化酵素１０５ｇを添加し、サンプル瓶中の大気を窒素で置換してから、撹拌機を使用し、サンプルを１５０ｒｐｍ、３０℃にて２４時間反応させて、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物（第１組成物）を得た。
反応開始から０時間、２時間、４時間、６時間、及び２４時間の時点でそれぞれ、反応液２００μＬ採取し、成分分析を行った。具体的には、エステル化率（質量％）、トリグリセリド、ジグリセリド、及びモノグリセリドの含量（質量％）、グリセリド含量（質量％）、グリセリド中のＤＨＡ及びＥＰＡの含量（質量％）、及びグリセリド中のＥＰＡに対するＤＨＡの質量比（ＤＨＡ／ＥＰＡ）の定量である。
また、反応開始から２時間、４時間、６時間の時点でエタノール５２．５ｇを反応液に追加し、かつ、サンプル瓶中で窒素置換を行った。また、２４時間の反応を１サイクルとし、上記反応で使用した固定化酵素を再利用して、該反応を３サイクル繰り返して行った。
各サイクルの終了後に、反応液から吸引ろ過にて油と固定化酵素とを分別し、分別した固定化酵素を反応容器に移し、その後、必要量の油、水、及びエタノールを加えて、次サイクルの反応に繰り返し使用した。
さらに、反応開始から０時間、２時間、４時間、６時間、８時間、２４時間（反応終了時）の時点で反応液を微量採取して、成分分析を行った。
［実施例２乃至６（エステル化反応）］
使用する水の量を１０．５ｇ（反応液中の水分含量：１質量％）、２１ｇ（反応液中の水分含量：２質量％）、５２．５ｇ（反応液中の水分含量：５質量％）、１０５ｇ（反応液中の水分含量：９質量％）、２１０ｇ（反応液中の水分含量：１７質量％）とした以外は、実施例１と同様の方法で、実施例２乃至６のＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を得た。
［比較例１乃至４（エステル化反応）］
使用する水の量を０ｇ（反応液中の水分含量：０％）、３．１５ｇ（反応液中の水分含量：０．３質量％）、５２５ｇ（反応液中の水分含量：３３質量％）、１０５０ｇ（反応液中の水分含量：５０質量％）とした以外は、実施例１と同様の方法で、比較例１乃至４のＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を得た。
実施例１乃至６、並びに比較例１乃至４において、成分分析は後述するＴＬＣ−ＦＩＤ又はＧＣ分析により測定された値であり、酸価は上述の方法により測定された値である。また、エステル化率は以下の式により算出された。
エステル化率（質量％）＝（脂肪酸エチルエステルのピーク面積／試料の全ピーク面積）×１００
１）脂質組成分析（ＴＬＣ−ＦＩＤ）
エステル化反応後の試料（反応液）を８，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して水相を除去し、得られた油相の１％ヘキサン溶液を調製して、Ｉａｔｒｏｓｃａｎ ＭＫ−６（三菱化学メディエンス社製）を用いたＴＬＣ−ＦＩＤ分析に供した。一次展開はトルエン：クロロホルム：酢酸（５０：３０：０．７５，ｖ／ｖ／ｖ）を溶媒に用いて約６０％、二次展開はヘキサン：ジエチルエーテル（６５：５，ｖ／ｖ）を溶媒に用いて１００％行った。当該脂質組成分析により、反応液中に存在する脂質組成（より具体的には、脂肪酸エチルエステル、トリグリセリド、ジグリセリド、及びモノグリセリドの含量）を同定することができる。これにより、上記エステル化率を算出することができる。
２）薄層ＴＬＣ
エステル化反応後の試料（反応液）から１００μＬ採取し、分取ＴＬＣにてエチルエステル以外のグリセリド画分をかきとり、前記グリセリド画分をメチルエステル化後、ＧＣ分析により脂肪酸組成を分析した。具体的には、反応液の５％ヘキサン溶液を調製し、分取用ＴＬＣに塗布して、クロロホルム：アセトン：酢酸＝９０：１０：０．５で展開した。展開後、各グリセリド画分をかきとり、そのままメチルエステル化し、後述する分析条件でＧＣ分析した。
３）ＧＣ（ガスクロマトグラフィー）分析
カラム：Ｓｕｐｅｌｃｏ製 Ｏｍｅｇａｗａｘ２５０（Ｌ×Ｉ．Ｄ．３０ｍ×０．２５ｍｍ，ｄｆ：０．２５μｍ）
キャリアーガス：ヘリウム、カラム流量１ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：ＦＩＤ、２５０℃(水素：約３０ｍＬ／分、空気：約３００ｍＬ／分、窒素:約１８ｍＬ／分)
注入口：２５０℃、スプリット比（６０：１）
カラムオーブン温度：５０℃、２分；４℃／分，２２０℃（１５分）
装置：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製 ６８９０Ｎ
昇温条件：オーブン２０５℃、１０分保持→昇温２．５℃／分→２４０℃、１１分保持
分析時間：３５分
当該ＧＣ分析により、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物のグリセリド中のＤＨＡ及びＥＰＡの含量（質量％）、並びにグリセリド中のＤＨＡ／ＥＰＡ（質量比）を同定することができる。
実施例１乃至６、並びに比較例１乃至４で得られたＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の成分分析結果を表１に示す。なお、実施例１乃至６で得られたＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の酸価は１２以下であった。
Figure 2016153065
Figure 2016153065
Figure 2016153065
表１より、前記エステル化反応の反応液における水分含量が０．４質量％以上であることにより、酸価が１２以下である、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物（第１組成物）が得られることが理解できる（実施例１乃至６）。
＜第１組成物について＞
さらに、実施例１乃至６によれば、
得られた第１組成物は、酸価が１２以下であり、
前記組成物中の油脂成分に対して、グリセリド含量が２０質量％以上６０質量％以下であり、
前記グリセリド中に構成脂肪酸としてＤＨＡとＥＰＡを以下の質量比で含む、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物であることが理解できる。
０．５≦（グリセリド中のＤＨＡ／ＥＰＡ）≦１０
前記第１組成物のグリセリド中に構成脂肪酸として含まれるＤＨＡの割合が２０質量％以上７０質量％以下である、
ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物が得られやすいことが理解できる。
前記第１組成物中の油脂成分に対して、モノグリセリドの割合が１質量％以上５５質量％以下であり、ジグリセリドの割合が１質量％以上３５質量％以下である、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物が得られやすいことが理解できる。
また、リパーゼの安定性が高められる結果、リパーゼの繰り返し使用が可能になることが理解できる。
［実施例７及び８（エステル化反応及び分子蒸留処理）］
１）エステル化反応
実施例１において、使用する固定化酵素を調製例２で調製した固定化酵素に置き換え、表２記載の水分含量及び反応時間でエステル化反応を行い、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物（第１組成物）をそれぞれ得た。
２）分子蒸留処理
実施例７及び８で得られた第１組成物を、ショートパス蒸留機（株式会社神鋼環境ソリューション製）を使用して、真空度０．１Ｔｏｒｒ以下で８０℃以上２００℃以下の温度にて分子蒸留し、ＥＰＡエチルエステルを含むその他の脂肪酸エチルエステルを留去して、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物（第２組成物）をそれぞれ得た。
実施例７及び８で得られた第１組成物及び第２組成物の成分分析の結果を表２に示す。なお、前記第１組成物及び第２組成物の酸価は１２以下であった。
Figure 2016153065
表２より、前記エステル化反応の反応液における水分含量が０．４質量％以上であることにより、酸価が１２以下である、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物が得られることが理解できる（実施例７及び８ 第１組成物及び第２組成物）。
＜第１組成物について＞
さらに、実施例７及び８で得られた第１組成物は、酸価が１２以下であり、前記組成物中の油脂成分に対して、グリセリド含量が２０質量％以上６０質量％以下であり、前記グリセリド中に構成脂肪酸としてＤＨＡとＥＰＡを以下の質量比で含む、ＨＡ含有グリセリド含有組成物であることが理解できる。
０．５≦（グリセリド中のＤＨＡ／ＥＰＡ）≦１０
前記第１組成物のグリセリド中に構成脂肪酸として含まれるＤＨＡの割合が２０質量％以上９０質量％以下である、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物が得られやすいことが理解できる。
前記第１組成物中の油脂成分に対して、モノグリセリドの割合が１質量％以上５５質量％以下であり、ジグリセリドの割合が１質量％以上３５質量％以下である、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物が得られやすいことが理解できる。
＜第２組成物＞
さらに、実施例７及び８で得られた第２組成物は、酸価が１２以下であり、前記組成物中の油脂成分に対して、グリセリド含量が７０質量％以上１００質量％以下であり、前記グリセリド中に構成脂肪酸としてＤＨＡとＥＰＡを以下の質量比で含む、ＨＡ含有グリセリド含有組成物であることが理解できる。
０．５≦（グリセリド中のＤＨＡ／ＥＰＡ）≦１０
前記第２組成物のグリセリド中に構成脂肪酸として含まれるＤＨＡの割合が２０質量％以上９０質量％以下である、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物が得られやすいことが理解できる。
前記第２組成物中の油脂成分に対して、モノグリセリドの割合が５質量％以上４５質量％以下であり、ジグリセリドの割合が３０質量％以上９０質量％以下である、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物が得られやすいことが理解できる。
実施例７の第２組成物については各グリセリド画分に含まれる構成脂肪酸としてのＤＨＡ及びＥＰＡの含量を表３に示す。
Figure 2016153065
表３より、モノグリセリドに含まれるＤＨＡ含量は１５質量％以上５０質量％以下であり、ジグリセリド画分に含まれるＤＨＡ含量は２０質量％以上５５質量％以下であり、トリグリセリド画分に含まれるＤＨＡ含量は１０質量％以上４５質量％以下であるＤＨＡ含有グリセリド含有組成物が得られやすいことが理解できる。
［実施例９乃至１２（エステル化反応）］
実施例１のエステル化反応において、表４に記載の酵素量、エタノール量、及び水分含量に置き換えた以外は、実施例１と同様の方法でエステル化反応を行い、成分分析を行った。なお、実施例９乃至１２で得られたＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の酸価は１２以下であった。
Figure 2016153065
表４より、前記エステル化反応の反応液に、前記原料油脂９．５質量部に対して０．１質量部以上３．０質量部以下の低級アルコールを含む方が、純度が高く良好な品位のＤＨＡ含有グリセリド含有組成物（第１組成物）を効率よく得られることが理解できる（実施例９乃至１２）。
＜第１組成物について＞
具体的には、得られた第１組成物は、酸価が１２以下であり、前記組成物中の油脂成分に対して、グリセリド含量が２０質量％以上６０質量％以下であり、前記グリセリド中に構成脂肪酸としてＤＨＡとＥＰＡを以下の質量比で含む、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物であることが理解できる。
０．５≦（グリセリド中のＤＨＡ／ＥＰＡ）≦１０
前記第１組成物のグリセリド中に構成脂肪酸として含まれるＤＨＡの割合が２０質量％以上９０質量％以下である、
ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物が得られやすいことが理解できる。
前記第１組成物の油脂成分に対して、モノグリセリドの割合が１質量％以上５５質量％以下であり、ジグリセリドの割合が１質量％以上３５質量％以下である、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物が得られやすいことが理解できる。
［実施例１３（エステル化反応、分子蒸留処理、及び加水分解反応）
１）エステル化反応
精製魚油（イワシ油：酸価０．３、トリグリセリド：９５質量％、ＤＨＡ含量：１２質量％）１ｋｇをセパラブルフラスコ（容量３Ｌ）に入れ、エタノール５２．５ｇを添加した。
フラスコを混ぜ、エタノールを魚油中に均一に分散させた。次に、水２．８ｇ（反応液中の水分含量：０．２４質量％）を入れて、撹拌し、水を魚油−エタノール混合物中に分散させて、反応液を調製した。
次いで、調製例１で調製した固定化酵素１００ｇを添加し、サンプル瓶中の大気を窒素で置換してから、攪拌機を使用し、サンプルを１５０ｒｐｍ、２８℃にて２１時間反応させて、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物（第１組成物）を得た。
さらに、反応開始から２時間、４時間の時点でエタノール５２．５ｇ及び水２．８ｇを反応液に追加し、かつ、サンプル瓶中で窒素置換を行い、エステル化反応を行った。
２）分子蒸留処理
前記第１組成物を、実施例７及び８と同様の方法で分子蒸留し、ＥＰＡエチルエステルを含むその他の脂肪酸エチルエステルを留去して、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物（第２組成物Ａ）を得た。前記エステル化反応及び分子蒸留処理を繰り返し行い、第２組成物Ａを１ｋｇ得た。
前記第２組成物に、下記組成１に示す組成のＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を適宜混合し、第２組成物Ｂを得た。
＜組成１＞
エチルエステル １％
トリグリセリド １８％
ジグリセリド ６９％
モノグリセリド １２％
―――――――――――――−
計１００％
３）−１ 加水分解反応
前記第２組成物Ｂ（酸価８．０）１ｋｇをセパラブルフラスコ（容量３Ｌ）に入れ、水３３３ｇ（原料油脂に対する水分含量：３３．３質量％）を添加した。
フラスコを混ぜ、水を均一に分散させ、反応液を調製した。次いで、リパーゼＯＦ（名糖産業社製）を４００，０００Ｕ（原料油脂に対して４００Ｕ／ｇ）になるように添加し、サンプル瓶中の待機を窒素で置換してから、攪拌機を使用し、サンプルを１５０ｒｐｍ、４０℃にて１７時間反応させて、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を得た。
３）−２ 分子蒸留
前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を実施例７及び８と同様の方法で分子蒸留処理し、第３組成物を得た。
第１組成物乃至第３組成物について、上述の方法で成分分析を行い、その結果を表５に示す。
Figure 2016153065
表５より、エステル化反応及び分子蒸留処理反応を含む工程により得られたＤＨＡ含有グリセリド含有組成物に対し、水存在下でリパーゼを作用させて加水分解反応を行った後、さらに分子蒸留により、グリセリドとそれ以外の成分とを分離する工程を含んだ方が、得られたＤＨＡ含有グリセリド含有組成物のグリセリド中に構成脂肪酸として含まれるＤＨＡの割合が３０質量％以上８０質量％以下である、純度が高く良好な品位のＤＨＡ含有グリセリド含有組成物（第３組成物）を効率よく得られることが理解できる（実施例１３）。
＜第３組成物について＞
具体的には、前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物は、酸価が０．１以上５以下であり、前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物中の油脂成分に対して、グリセリド含量が８０質量％以上１００質量％以下であり、前記グリセリド中に構成脂肪酸としてＤＨＡとＥＰＡとを以下の質量比で含む、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物であることが理解できる。
２≦（グリセリド中のＤＨＡ／ＥＰＡ）≦６
さらに、前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物中の油脂成分に対して、モノグリセリドの割合が０％以上２０質量％以下であり、ジグリセリドの割合が５質量％以上５０質量％以下である、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物が得られやすいことが理解できる。
さらに、前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物中の油脂成分に対して、トリグリセリドの割合が４０％以上９５質量％以下である、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物が得られやすいことが理解できる。
［実施例１４（食品組成物：クッキー）］
配合表１に基づいて、クッキーを調製した。ショートニング及び実施例７で得られたＤＨＡ含有グリセリド含有組成物（第２組成物）を攪拌機（Ｋｉｔｃｈｅｎ Ａｉｄ社製 Ｋｉｔｃｈｅｎ Ａｉｄ Ｋ５ＳＳ）に投入し、速度調節レバー６で１分間混ぜ合わせてクリーム状にし、粉末全卵、砂糖を加えミキシングを行った。
次に、除々に清水を加え比重を０．８ｇ／ｍＬに調整し、予め混合してから篩った小麦粉とベーキングパウダーを加えてから３０秒間攪拌を続けて生地を調製した。得られた生地を冷蔵庫で２時間ねかせた後、厚さ３〜５ｍｍ程度に延ばし、型を抜き、１８０℃のオーブンで１３〜１５分間焼成し、クッキーを得た。
［配合表１］
小麦粉 ２００ｇ
ベーキングパウダー １ｇ
ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物（実施例７ 第２組成物） １ｇ
ショートニング １２０ｇ
上白糖 ８０ｇ
粉末全卵 １２ｇ
清水 ２４ｇ
―――――――――――――――――――――――――――――――――
合計 ４３８ｇ
［実施例１４（ソフトカプセル）］
配合表２に基づいて、実施例１０で得られたＤＨＡ含有グリセリド含有組成物（第２組成物）を使用し、ソフトカプセルを製した。
＜配合表２＞
ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物（実施例８ 第２組成物） ２０％
オリーブ油 ５０％
ミツロウ １０％
中鎖脂肪酸トリグリセリド １０％
乳化剤 １０％
――――――――――――――――――――――――――――――――
合計 １００％

Claims (17)

  1. 構成脂肪酸として高度不飽和脂肪酸を含有する原料油脂に対し、水及び低級アルコール存在下でリパーゼを作用させてエステル化反応を行い、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を得る工程を含み、
    前記反応の反応液中における水分含量が０．４質量％以上であり、
    前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の酸価が１２以下である、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の製造方法。
  2. 請求項１において、
    前記反応液は、前記原料油脂９．５質量部に対して０．１質量部以上３．０質量部以下の低級アルコールを含む、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の製造方法。
  3. 請求項１又は２において、
    前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物中の油脂成分に対して、低級アルコール脂肪酸エステル化物の割合が４０質量％以上である、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の製造方法。
  4. ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物は、酸価が１２以下であり、
    前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物中の油脂成分に対して、グリセリド含量が２０質量％以上６０質量％以下であり、
    前記グリセリド中に構成脂肪酸としてＤＨＡとＥＰＡとを以下の質量比で含む、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物。
    ０．５≦（グリセリド中のＤＨＡ／ＥＰＡ）≦１０
  5. 請求項４において、
    前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物のグリセリド中に構成脂肪酸として含まれるＤＨＡの割合が２０質量％以上９０質量％以下である、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物。
  6. 請求項４又は５において、
    前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物中の油脂成分に対して、モノグリセリドの割合が１質量％以上５５質量％以下であり、
    ジグリセリドの割合が１質量％以上３５質量％以下である、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物。
  7. 請求項１乃至３のいずれか１項において、
    前記エステル化反応によって得られた組成物は、低級アルコール脂肪酸エステルをさらに含み、
    前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を分子蒸留により、グリセリドとそれ以外の成分とを分離する工程をさらに含み、
    グリセリド含量が７０質量％以上１００質量％以下である、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の製造方法。
  8. ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物は、酸価が１２以下であり
    前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物中の油脂成分に対して、グリセリド含量が７０質量％以上１００質量％以下であり、
    前記グリセリド中に構成脂肪酸としてＤＨＡとＥＰＡとを以下の質量比で含む、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物。
    ０．５≦（グリセリド中のＤＨＡ／ＥＰＡ）≦１０
  9. 請求項８において、
    前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物のグリセリド中に構成脂肪酸として含まれるＤＨＡの割合が２０質量％以上９０質量％以下である、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物。
  10. 請求項８又は９において、
    前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物中の油脂成分に対して、モノグリセリドの割合が５質量％以上４５質量％以下であり、
    ジグリセリドの割合が３０質量％以上９０質量％以下である、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物。
  11. 請求項７において、
    前記分子蒸留処理によって得られた組成物に対し、水存在下でリパーゼを作用させて加水分解反応を行った後、さらに分子蒸留により、グリセリドとそれ以外の成分とを分離する工程をさらに含み、
    得られたＤＨＡ含有グリセリド含有組成物のグリセリド中に構成脂肪酸として含まれるＤＨＡの割合が３０質量％以上８０質量％以下である、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物の製造方法。
  12. ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物は、酸価が０．１以上５以下であり
    前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物中の油脂成分に対して、グリセリド含量が８０質量％以上１００質量％以下であり、
    前記グリセリド中に構成脂肪酸としてＤＨＡとＥＰＡとを以下の質量比で含む、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物。
    ２≦（グリセリド中のＤＨＡ／ＥＰＡ）≦１５
  13. 請求項１２において、
    前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物中の油脂成分に対して、モノグリセリドの割合が０％以上２０質量％以下であり、
    ジグリセリドの割合が５質量％以上５０質量％以下である、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物。
  14. 請求項１２又は１３において、
    前記ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物中の油脂成分に対して、トリグリセリドの割合が４０％以上９５質量％以下である、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物。
  15. 請求項１乃至３、請求項７、及び請求項１１のいずれか１項に記載の製造方法によって得られる、ＤＨＡ含有グリセリド含有組成物。
  16. 請求項１乃至３、請求項７、及び請求項１１のいずれか１項に記載の製造方法により得られたＤＨＡ含有グリセリド含有組成物、又は請求項４乃至６、請求項８乃至１０、及び請求項１２乃至１５のいずれか１項に記載のＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を使用して食品組成物を得る工程を含む、食品組成物の製造方法。
  17. 請求項１乃至３、請求項７、及び請求項１１のいずれか１項に記載の製造方法により得られたＤＨＡ含有グリセリド含有組成物、又は請求項４乃至６、請求項８乃至１０、及び請求項１２乃至１５のいずれか１項に記載のＤＨＡ含有グリセリド含有組成物を使用してカプセル化剤を得る工程を含む、カプセル化剤の製造方法。
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