JPWO2016039293A1 - 固相担体、リガンド結合固相担体、標的物質の検出又は分離方法、及び前記固相担体の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
しかしながら、上記ポリマーブラシを備えた金膜チップはリガンドが結合しにくく、標的物質の捕捉が不充分となり、標的物質のシグナルが検出されにくい場合がある。
また、疾病の早期発見等の要求があるため、診断薬に用いる磁性粒子には標的物質を充分に捕捉できることも求められる。また、細胞分離に用いる磁性粒子においても標的細胞のみを特異的に捕捉できることが要求される。斯様な背景の下、ポリ(ヒドロキシエチルメタクリルアミド)・ポリ(メタクリル酸)ブロックコポリマー等をATRPにより表面に結合させることでポリマーブラシを形成させた磁性粒子が提案されているが(特許文献2)、当該磁性粒子は、試料中の標的物質や不純物が粒子表面に非特異的に吸着しやすく、この点で改善の余地があった。
R1は、水素原子又はメチル基を示し、
R2は、双性イオン構造を有する有機基を示す。〕
R3は、水素原子又はメチル基を示し、
R4は、−(C=O)−O−*、−(C=O)−NR6−*(R6は、水素原子又はメチル基を示し、*は、式(2)中のR5と結合する位置を示す)又はフェニレン基を示し、
R4が−(C=O)−O−*である場合、R5は、水素原子、又は反応性官能基を有する有機基を示し、R4が−(C=O)−NR6−*又はフェニレン基である場合、R5は、反応性官能基を有する有機基を示す。
但し、R5は、双性イオン構造を有する有機基でない。〕
(工程1)重合開始基を有する担体を準備する工程と、
(工程2)前記重合開始基を起点としてモノマーを重合させる工程を含むことを特徴とする、製造方法を提供するものである。
また、本発明の製造方法によれば、上記本発明の固相担体を簡便に製造できる。
本発明の固相担体は、下記式(1)で表される構造単位と下記式(2)で表される構造単位とを含むポリマーが結合してなるものである。まず、本発明の固相担体について詳細に説明する。
R1は、水素原子又はメチル基を示し、
R2は、双性イオン構造を有する有機基を示す。〕
R3は、水素原子又はメチル基を示し、
R4は、−(C=O)−O−*、−(C=O)−NR6−*(R6は、水素原子又はメチル基を示し、*は、式(2)中のR5と結合する位置を示す)又はフェニレン基を示し、
R4が−(C=O)−O−*である場合、R5は、水素原子、又は反応性官能基を有する有機基を示し、R4が−(C=O)−NR6−*又はフェニレン基である場合、R5は、反応性官能基を有する有機基を示す。
但し、R5は、双性イオン構造を有する有機基でない。〕
式(1)中、R2は、双性イオン構造を有する有機基を示す。斯かる有機基は、カチオン性官能基とアニオン性官能基とを有する有機基を意味する。双性イオン構造を有する有機基としては、第4級アンモニウム塩型カチオン性官能基とアニオン性官能基とを有する有機基が好ましく、第4級アンモニウム塩型カチオン性官能基と、−(C=O)O-、−SO3 -及び−O−(O=P−O-)−O−から選ばれる1価又は2価のアニオン性官能基とを有する有機基がより好ましい。中でも、R2としては、非特異吸着を抑制する観点から、下記式(3)又は(4)で表される有機基がより好ましく、モノマー合成が容易である観点等から、下記式(3)で表される有機基が特に好ましい。
R7は、−(C=O)−O−*、−(C=O)−NR13−*(R13は、水素原子又はメチル基を示し、*は、式(3)中のR8と結合する位置を示す)又はフェニレン基を示し、
R8及びR9は、それぞれ独立して、単結合又は炭素数1〜10の2価の有機基を示し、
R10は、−(C=O)O-又は−SO3 -を示し、
R11及びR12は、それぞれ独立して、メチル基又はエチル基を示す。〕
R14は、−(C=O)−O−*、−(C=O)−NR20−*(R20は、水素原子又はメチル基を示し、*は、式(4)中のR15と結合する位置を示す)又はフェニレン基を示し、
R15及びR16は、それぞれ独立して、単結合又は炭素数1〜10の2価の有機基を示し、
R17、R18及びR19は、それぞれ独立して、メチル基又はエチル基を示す。〕
R10は、−(C=O)O-又は−SO3 -を示すが、検出の高感度化と低ノイズ化を両立する観点から、−(C=O)O-が好ましい。
R13は、水素原子又はメチル基を示すが、水素原子が好ましい。
2価の有機基が2価の炭化水素基である場合、その炭素数としては、1〜8が好ましく、1〜6がより好ましく、1〜4がさらに好ましく、1〜3が特に好ましい。一方、2価の有機基が2価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、イミノ基、アミド結合及びエステル結合から選ばれる1種以上を有する基である場合、斯かる基における2価の炭化水素基の炭素数としては、2〜8が好ましく、2〜6がより好ましく、2〜4がさらに好ましく、2又は3が特に好ましい。
上記2価の脂肪族炭化水素基としては、アルカンジイル基が好ましく、具体的には、メタン−1,1−ジイル基、エタン−1,1−ジイル基、エタン−1,2−ジイル基、プロパン−1,1−ジイル基、プロパン−1,2−ジイル基、プロパン−1,3−ジイル基、プロパン−2,2−ジイル基、ブタン−1,2−ジイル基、ブタン−1,3−ジイル基、ブタン−1,4−ジイル基、ペンタン−1,4−ジイル基、ペンタン−1,5−ジイル基、ヘキサン−1,5−ジイル基、ヘキサン−1,6−ジイル基等が挙げられる。
式(2)中、R4としては、水との親和性を高め、非特異吸着を抑制する観点から、−(C=O)−O−*、−(C=O)−NR6−*が好ましい。R6は、水素原子又はメチル基を示すが、水素原子が好ましい。
反応性官能基としては、カルボキシ基、トシル基、アミノ基、エポキシ基、アシル基、アジド基が挙げられ、上記有機基は、これらのうち1種を有していてもよく、2種以上を有していてもよい。これらの中でも、結合したリガンドが外れにくくする観点や、リガンドとしてタンパク質や核酸等の分子を使用する場合に、リガンドが元来有している官能基を使用して固相担体と結合できる点から、カルボキシ基、トシル基、アミノ基、エポキシ基が好ましく、固相担体に対しリガンドを簡便且つ迅速に結合させやすい点等から、カルボキシ基がより好ましい。
反応性官能基の含有量は、例えば、反応性官能基がカルボキシ基の場合、電気伝導度測定法等により測定可能であり、具体的には、後述する実施例に記載の方法に従い測定できる。また、反応性官能基がトシル基の場合は、固相担体に導入されたトシル基の紫外可視光吸収を測定するなどして求めることができ、反応性官能基がアミノ基の場合は、アミノ基にN−スクシイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオナートを反応させた後、還元し、遊離のチオピリジル基の吸光度を測定するなどして求めることができる。
R21は、2価の有機基を示し、
Yは、反応性官能基を示す。〕
2価の有機基が2価の炭化水素基である場合、その炭素数としては、1〜10が好ましく、1〜8がより好ましく、1〜6が特に好ましい。一方、2価の有機基が炭素数2以上の2価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、イミノ基、アミド結合及びエステル結合から選ばれる1種以上を有する基である場合、斯かる基における2価の炭化水素基の炭素数としては、2〜10が好ましく、2〜8がより好ましく、2〜6が特に好ましい。
上記2価の脂肪族炭化水素基としては、アルカンジイル基が好ましく、具体的には、メタン−1,1−ジイル基、エタン−1,1−ジイル基、エタン−1,2−ジイル基、プロパン−1,1−ジイル基、プロパン−1,2−ジイル基、プロパン−1,3−ジイル基、プロパン−2,2−ジイル基、ブタン−1,2−ジイル基、ブタン−1,3−ジイル基、ブタン−1,4−ジイル基、ペンタン−1,4−ジイル基、ペンタン−1,5−ジイル基、ヘキサン−1,5−ジイル基、ヘキサン−1,6−ジイル基等が挙げられる。
ポリマー1本あたりの構造単位(2)の平均重合度mは、リガンド結合量の観点からは、好ましくは1以上、より好ましくは3以上、さらに好ましくは5以上、特に好ましくは10以上であり、また、非特異吸着を抑制する観点や検出の高感度化と低ノイズ化を両立する観点からは、好ましくは500以下、より好ましくは300以下、さらに好ましくは200以下、さらに好ましくは100以下、さらに好ましくは70以下、特に好ましくは65以下である。
また、平均重合度n及び平均重合度mから算出される重合割合〔m/(m+n)〕は、非特異吸着を抑制する観点及びリガンド結合量の観点から、好ましくは0.01以上、より好ましくは0.03以上、さらに好ましくは0.05以上、さらに好ましくは0.1以上、特に好ましくは0.15以上であり、また、非特異吸着を抑制する観点及びリガンド結合量の観点から、好ましくは0.75以下、より好ましくは0.74以下、特に好ましくは0.7以下である。ポリマーがブロックポリマーである場合、非特異吸着を抑制する観点、リガンド結合量の観点及び検出の高感度化と低ノイズ化を両立させ、特に診断薬用途に適したものとする観点からは、さらに好ましくは0.1〜0.5、さらに好ましくは0.1〜0.35、特に好ましくは0.15〜0.3である。一方、ポリマーがランダムポリマーである場合、検出の高感度化と低ノイズ化を両立させ、特に診断薬用途に適したものとする観点からは、さらに好ましくは0.2〜0.7、特に好ましくは0.35〜0.7である。
平均重合度n、mは、ポリマー1本あたりの構造単位(1)、(2)の平均重合度をそれぞれ意味し、X線光電子分光分析や、固相担体1gあたりに結合したポリマーの重量、ポリマーの分子量及び反応性官能基量等から算出可能である。具体的には、後述する実施例に記載の方法に従い測定できる。
また、ポリマーとしては、ビニルポリマーが好ましい。また、ポリマー中の構造単位の配列の態様は特に限定されず、ランダム共重合体、ブロック共重合体、ランダム共重合ユニットとブロック共重合ユニットを有する共重合体、交互共重合体のいずれであってもよいが、ポリマーを簡便に形成できる点等から、ランダム共重合体、ブロック共重合体が好ましい。ポリマーがランダム共重合体である場合、細胞等の非特異吸着が抑制されやすくなる。また、ポリマーがブロック共重合体である場合、抗体等のリガンドが結合しやすくなり、抗原抗体反応を利用した検出における高感度化と低ノイズ化を両立しやすくなる。斯様な効果が得られる理由は必ずしも明らかではないが、ブロック共重合体の場合は、反応性官能基が局所的に存在するため抗体が結合しやすく、サンドイッチ構造(一次抗体−抗原―二次抗体)等の高次構造をとりやすくなるためであると、本発明者は推察する。
また、ポリマーがブロック共重合体である場合、このブロック共重合体は、構造単位(1)の繰り返しから構成される第1のブロックと、構造単位(2)の繰り返しから構成される第2のブロックとを含むものである。斯様なブロック共重合体としては、リガンドをさらに結合しやすくする観点や検出の高感度化と低ノイズ化を両立させる観点から、下記式(6)で表されるブロック共重合体が好ましい。
R25及びR29は、−O−又は−NH−を示し、
R26及びR30は、それぞれ独立して、単結合又はフェニレン基を示し、
R27及びR28は、それぞれ独立して、水素原子又はアルキル基を示し、
**は、ポリマーの末端と結合する位置を示す。〕
R27及びR28で示されるアルキル基の炭素数としては、1〜8が好ましく、1〜4がより好ましく、1又は2が特に好ましい。アルキル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、具体的には、メチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基、n−ブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、tert−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基等が挙げられる。
上記ポリマーの密度は、例えば、下記式で算出可能である。具体的には、加水分解等により固相担体からポリマーを遊離させ、後述する実施例に記載の方法に従い測定できる。
ポリマーの密度(本/nm2)=担体1gに結合したポリマーの本数(本)/担体1gの総表面積(nm2)
また、ポリマーの重量平均分子量(Mw)としては、1,000〜100,000が好ましく、3,000〜50,000がより好ましく、5,000〜30,000が特に好ましい。
また、分子量分布(Mw/Mn)としては、非特異吸着の抑制及び固相担体に結合されたリガンドの活性を高める観点から、1.0〜2.5が好ましく、1.0〜2.0がより好ましく、1.0〜1.5がさらに好ましい。
なお、数平均分子量、重量平均分子量は、加水分解等により固相担体からポリマーを遊離させ、ゲル浸透クロマトグラフィーで測定したポリエチレングリコール換算の平均分子量を意味する。例えば、後述する実施例に記載のような方法で反応性官能基導入前のポリマーの分子量を測定しておき、斯かる分子量と、反応性官能基が導入される構造単位のモル数と、反応性官能基の導入に用いる化合物の構造から計算するなどして算出可能である。
また、本発明の固相担体の形態は特に限定されるものではなく、粒子、モノリス、膜、繊維、チップ等のいずれでもよいが、標的物質の検出又は分離の容易性の観点から、粒子が好ましく、磁性粒子がより好ましい。
本明細書において「磁性粒子」とは、磁性体を有する粒子を意味する。本発明の固相担体は、磁性粒子の形態でも高い水分散性を有する。また、磁性粒子とした場合には、遠心分離器等を用いずに磁石等を用いて分離することができるため、試料からの固相担体の分離を簡素化又は自動化することができる。
また、磁性体は、強磁性、常磁性、超常磁性のいずれであってもよいが、磁場による分離と磁場を取り除いた後の再分散を容易にする観点から、超常磁性であることが好ましい。磁性体としては、フェライト、酸化鉄、鉄、酸化マンガン、マンガン、酸化ニッケル、ニッケル、酸化コバルト、コバルト等の金属、又は合金が挙げられる。
また、磁性粒子としては、具体的には、以下の(i)〜(iv)のいずれかの粒子に、上記ポリマーを結合してなるものが挙げられる。好ましくは多孔質又は非多孔質の磁性ポリマー粒子である。
(ii)磁性体微粒子の2次凝集体をコアとし、樹脂等の非磁性体をシェルとする粒子
(iii)樹脂等の非磁性体で構成される核粒子と、該核粒子の表面に設けられた磁性体微粒子を含む磁性体層(2次凝集体層)とを有する母粒子をコアとし、該母粒子の最外層に、樹脂等の非磁性体層がシェル(以下、最外層シェルとも称する)として設けられた粒子
(iv)粒子の最外層に樹脂等の非磁性体層がシェルとして設けられていてもよい、樹脂やシリカ等からなる多孔質粒子の孔内に磁性体微粒子が分散している粒子
なお、(i)〜(iv)の粒子はいずれも公知であり、常法に従い製造可能である。
上記単官能性モノマーとしては、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレン等の単官能性芳香族ビニル系モノマー;メチル(メタ)アクリレート、エチル(メタ)アクリレート、ステアリル(メタ)アクリレート、シクロヘキシル(メタ)アクリレート、イソボルニル(メタ)アクリレート等の単官能性(メタ)アクリレート系モノマーが挙げられる。
上記架橋性モノマーとしては、例えば、ジビニルベンゼン等の多官能性芳香族ビニル系モノマー;エチレングリコールジ(メタ)アクリレート、トリメチロールプロパントリ(メタ)アクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサ(メタ)メタクリレート、アリル(メタ)アクリレート等の多官能性(メタ)アクリレート系モノマー;ブタジエン、イソプレン等の共役ジオレフィン等が挙げられる。
また、比表面積は、1.0〜2.0m2/g程度であればよい。
なお、上記平均粒径及び比表面積は、レーザー回析・散乱粒子径分布測定等により測定できる。
本発明の固相担体は常法を適宜組み合わせて製造することができるが、本発明の固相担体の製造方法としては、固相担体の表面に対するポリマーが占有する密度を高密度化しさらに非特異吸着が抑制されたものとする観点や、分子量分布の狭いポリマーを固相担体に結合しさらに非特異吸着が抑制されたものとする観点、固相担体に結合するリガンドの働きを高める観点等から、(工程1)重合開始基を有する担体(以下、重合開始基含有担体とも称する)を準備する工程と、(工程2)前記重合開始基を起点としてモノマーを重合させる工程を含む方法が好ましい。
上記製造方法としては、具体的には、以下の方法<PR−1>及び<PR−2>が挙げられる。以下、これら方法について、構造単位(2)に含まれる反応性官能基がカルボキシ基、アミノ基又はトシル基である場合を例に挙げて説明する。
<PR−1>(工程1)重合開始基含有担体を準備し、(工程2−1−1)構造単位(1)を構成するモノマー(11)と、カルボキシ基、アミノ基又はトシル基を導入可能な官能基(例えば、水酸基、エポキシ基、エステル基、アミノ基、カルボン酸保護基等)を有するモノマー(12)とを、前記重合開始基を起点として重合させ、(工程2−1−2)固相担体に導入されたポリマー(14)に、付加反応、置換反応、縮合反応又は脱保護反応によってカルボキシ基、アミノ基又はトシル基を導入する方法。
<PR−2>(工程1)重合開始基含有担体を準備し、(工程2−2−1)カルボキシ基、アミノ基又はトシル基を導入可能な官能基を有するモノマー(12)に、付加反応、置換反応、縮合反応又は脱保護反応によってカルボキシ基、アミノ基又はトシル基を導入して構造単位(2)を構成するモノマー(13)を得て、(工程2−2−2)このモノマー(13)とモノマー(11)とを、前記重合開始基を起点として重合させる方法。なお、カルボキシ基、アミノ基又はトシル基を有するモノマーを使用する際は、(工程2−2−1)を行わずに製造できる。カルボキシ基、アミノ基又はトシル基を有するモノマーとしては、(メタ)アクリル酸、(メタ)アクリル酸塩、アミノエチル(メタ)アクリレート等が挙げられる。
重合開始基含有担体は、市販品を用いても合成して用いてもよい。例えば、水酸基、アミノ基、エポキシ基及びカルボキシ基から選ばれる1種又は2種以上(以下、これを総称して水酸基等とも称する)を有する原料担体(以下、原料担体とも称する)に、重合開始基を有する化合物を接触させ、上記水酸基等に含まれる水素原子を重合開始基に変換することで得ることができる(以下、この反応を重合開始基導入反応とも称する)。なお、上記原料担体のうち、水酸基を有する原料担体は、例えば、上記グリシジル基含有磁性粒子と無機酸、有機酸等の酸とを接触させ、グリシジル基を開環するなどして得ることができる。
また、重合開始基含有担体は、重合開始基を有するモノマーを含むモノマー組成を重合しても得ることもできる。重合開始基を有するモノマーとしては、2−(2−ブロモイソブチリルオキシ)エチルメタクリレート等が挙げられる。
重合開始基導入反応において、重合開始基を有する化合物の合計使用量は、原料担体に対し、通常0.001〜100質量倍程度であり、好ましくは0.01〜50質量倍程度である。
塩基性触媒の合計使用量は、重合開始基を有する化合物に対し、通常1〜10モル当量程度であり、好ましくは1〜5モル当量程度である。
また、重合開始基導入反応は、溶媒存在下で行うのが好ましい。溶媒としては、テトラヒドロフラン、1,4−ジオキサン、1,3−ジオキサン等のエーテル系溶媒;ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等のプロトン性溶媒が挙げられ、これら溶媒は1種を単独で又は2種以上を組み合わせて使用できる。
また、重合開始基導入反応の反応時間は、通常30分〜24時間程度であり、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよい。
工程2−1−1における重合反応の重合法は、重合開始基の種類に応じて選択すればよいが、目的物を簡便且つ容易に得る観点から、リビング重合が好ましく、リビングラジカル重合がより好ましく、原子移動ラジカル重合(ATRP重合)、可逆的付加開裂連鎖移動重合(RAFT重合)がさらに好ましく、原子移動ラジカル重合が特に好ましい。原子移動ラジカル重合で重合させることにより、幅広い種類の担体にポリマーを簡便に結合させることができ、しかも、生体適合性や高圧縮弾性、低摩擦特性、サイズ排除特性が、得られる固相担体に付与され、且つ固相担体の表面に対するポリマーが占有する密度を高密度化されるため非特異吸着しにくくなる。
なお、モノマー(11)を重合させた後に、形成されたポリマーの末端の重合開始基を起点としてモノマー(12)を重合させること、或いはモノマー(12)を重合させた後に、形成されたポリマー末端の重合開始基を起点としてモノマー(11)を重合させることにより、固相担体にブロック共重合体を導入することができる。
モノマー(12)としては、2−ヒドロキシエチル(メタ)アクリルアミド、2−ヒドロキシエチル(メタ)アクリレート、グリシジル(メタ)アクリレート、アミノエチル(メタ)アクリレート、tert−ブチル(メタ)アクリレート等が挙げられる。なお、これらのうち1種を単独で又は2種以上を組み合わせて使用してよい。
モノマー(11)、(12)の各合計使用量は、それぞれ、担体に結合している重合開始基に対し、通常5〜10000モル当量程度であり、好ましくは10〜5000モル当量程度である。
遷移金属化合物としては、銅化合物が好ましい。銅化合物としては、臭化銅(I)、臭化銅(II)、塩化銅(I)、塩化銅(II)等のハロゲン化銅の他、銅(I)トリフレート、銅(II)トリフレート等が挙げられる。なお、これらのうち1種を単独で又は2種以上を組み合わせて使用してよい。遷移金属化合物の合計使用量は、反応系中、通常1〜10,000ppm程度である。
配位子としては、同一分子内に2つ以上の窒素原子を含む配位子が好ましい。同一分子内に2つ以上の窒素原子を含む配位子としては、トリス(2−ピリジルメチル)アミン、ビピリジン、ビピリジン誘導体、トリス[2−(ジメチルアミノ)エチル]アミン等が挙げられる。なお、これらのうち1種を単独で又は2種以上を組み合わせて使用してよい。配位子の合計使用量は、遷移金属化合物に対し、通常0.5〜10モル当量程度である。
還元剤としては、アスコルビン酸、グルコース、ヒドラジン、銅等が挙げられ、これら還元剤は1種を単独で又は2種以上を組み合わせて使用できる。
溶媒としては、水;ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒;メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒等が挙げられ、これら溶媒は1種を単独で又は2種以上を組み合わせて使用できる。
また、重合反応の反応系のpHとしては、3〜10が好ましい。重合反応の反応時間は、通常30分〜12時間程度であり、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよい。重合反応は、25〜60℃程度の温和な条件でも進行する。
工程2−1−2は、固相担体に導入されたポリマー(14)に、付加反応、置換反応、縮合反応又は脱保護反応によってカルボキシ基、アミノ基又はトシル基を導入する工程である。
カルボキシ基を導入する方法としては、モノマー(12)として水酸基又はアミノ基を有するモノマーを使用し、得られたポリマー(14)にカルボン酸無水物を付加反応させる方法や、モノマー(12)としてエポキシ基を有するモノマーを使用し、得られたポリマー(14)を加水分解し水酸基を生成した後に、カルボン酸無水物を付加反応させる方法、モノマー(12)としてエポキシ基を有するモノマーを使用し、得られたポリマー(14)にメルカプト基やアミノ基等の求核基及びカルボキシ基を有する化合物を付加反応させる方法、モノマー(12)としてカルボキシ基が保護されたモノマーを使用し、得られたポリマー(14)を脱保護する方法等が挙げられる。
カルボン酸無水物としては、例えば、無水コハク酸、無水マレイン酸、無水グルタル酸、無水フタル酸、ヘキサヒドロ無水フタル酸等が挙げられる。中でも、水酸基やアミノ基との反応が容易に進行する観点から、無水コハク酸が好ましい。カルボン酸無水物等の合計使用量は、モノマー(12)由来の構造単位に対し、通常0.1〜2000モル当量程度であり、好ましくは1〜1000モル当量である。
メルカプト基やアミノ基等の求核基及びカルボキシ基を有する化合物としては、メルカプトプロピオン酸やアミノ酸が挙げられる。カルボキシ基が保護されたモノマーとしては、tert−ブチル(メタ)アクリレート、N−ヒドロキシスクシンイミド(メタ)アクリレートが挙げられる。なお、脱保護方法は、保護基に応じて周知の方法で実施でき、加水分解等が挙げられる。
アミノ基を導入する方法としては、モノマー(12)としてエポキシ基を有するモノマーを使用し、得られたポリマー(14)にアンモニア又は2つ以上のアミノ基を有する化合物を付加反応させる方法が挙げられる。2つ以上のアミノ基を有する化合物としては、エチレンジアミンが挙げられる。
トシル基を導入する方法としては、モノマー(12)として水酸基又はアミノ基を有するモノマーを使用し、得られたポリマー(14)にトシルクロライドを付加させる方法や、モノマー(12)としてエポキシ基を有するモノマーを使用し、得られたポリマー(14)を加水分解し水酸基を生成した後にトシルクロライドを付加させる方法等が挙げられる。
したがって、本発明の固相担体をアフィニティー担体とすることで、酵素免疫測定、放射免疫測定、化学発光免疫測定等の抗原抗体反応を利用したイムノアッセイ;タンパク質、核酸等の検出;細胞、タンパク質、核酸等の生体関連物質のバイオセパレーション;薬物探索;バイオセンサー等をはじめとする、体外診断や生化学分野における研究等に広く利用できる。本発明の固相担体は、イムノアッセイのため、バイオセパレーション(特に細胞分離)のため、及び核酸検出のための使用に特に適する。
本発明のリガンド結合固相担体は、本発明の固相担体にリガンドを結合させてなるものである。
上記リガンドは、標的物質と結合する分子であればよいが、例えば、抗体;抗原;DNA、RNA等の核酸;ヌクレオチド;ヌクレオシド;プロテインA、プロテインG、(ストレプト)アビジン、酵素、レクチン等のタンパク質;インシュリン等のペプチド;アミノ酸;ヘパリン等の糖又は多糖;脂質;ビオチン等のビタミン;薬物;基質;ホルモン;神経伝達物質;合成分子等が挙げられる。
これらの中でも、診断薬用等に適したリガンド結合固相担体とする観点からは、抗体、抗原が好ましい。抗体、抗原は標的物質と結合するものであればよいが、例えば、抗アンチプラスミン抗体、抗Dダイマー抗体、抗FDP抗体、抗tPA抗体、抗トロンビン・アンチトロンビン複合体抗体、抗FPA抗体等の凝固線溶関連検査用抗体又はこれに対する抗原;抗BFP抗体、抗CEA抗体、抗AFP抗体、抗TSH抗体、抗フェリチン抗体、抗CA19−9抗体等の腫瘍関連検査用抗体又はこれに対する抗原;抗アポリポタンパク抗体、抗β2−ミクロブロブリン抗体、抗α1―ミクログロブリン抗体、抗免疫グロブリン抗体、抗CRP抗体、抗EpCAM抗体等の血清蛋白関連検査用抗体又はこれに対する抗原;抗HCG抗体等の内分泌機能検査用抗体又はこれに対する抗原;抗ジゴキシン抗体、抗リドカイン抗体等の薬物分析用抗体又はこれに対する抗原;HBs抗原、HCV抗原、HIV−1抗原、HIV−2抗原、HTLV−1抗原、マイコプラズマ抗原、トキソプラズマ抗原、ストレプトリジンO抗原等の感染症関連検査用抗原又はこれに対する抗体;DNA抗原、熱変成ヒトIgG等の自己免疫関連検査用抗原又はこれに対する抗体等が挙げられる。なお、抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。
本発明の試料中の標的物質を検出又は分離する方法は、本発明のリガンド結合固相担体を用いることを特徴とするものである。
なお、試料は、上記標的物質を含むもの又は標的物質を含む可能性があるものであればよく、具体的には、血液、血漿、血清、標的物質を含有するバッファー溶液等である。
鎖状ポリマーの分子量は、水酸化ナトリウム水溶液を用いて加水分解することで、鎖状ポリマーを粒子から遊離させてから測定した。
すなわち、水酸化ナトリウム水溶液(1N、pH14)4gに粒子1gを分散し、25℃で3時間撹拌して、鎖状ポリマーを粒子から遊離した。磁気を用いて粒子を分離し、鎖状ポリマーが溶解した上清を回収した。次に、この鎖状ポリマー溶液に、溶液のpHが7になるまで1Mの塩酸を加え中和した。鎖状ポリマーの重量の算出に用いるために、加えた1M塩酸の重量から、生成する塩化ナトリウムの重量を計算しておき、中和後の溶液を凍結乾燥することで、粉末として、塩化ナトリウムを含む鎖状ポリマーを得た。また、鎖状ポリマーの重量の算出に用いるために、粉末の重量を測定しておいた。
上記粉体を検体とし、東ソー社製 TSKgel G3000PWXLカラム及び日本分光社製 Chrom NAV クロマトグラフィデータステーションプログラムを使用して、ゲル浸透クロマトグラフィー(Gel PermeationChromatography: GPC)により以下の条件で測定することで、粒子表面に形成された鎖状ポリマーのMn及びMwを測定した。
(測定条件)
流量:0.8mL/分
溶出溶媒:0.2M りん酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)
カラム温度:25℃
標準物質:東ソー社製 TSKgel standard Poly(ethylene oxide) SE−kit 及び和光純薬工業社製 PolyethyleneGlycol 4,000
粒子から遊離させた鎖状ポリマーの重量、鎖状ポリマーの数平均分子量、及び粒子の表面積から、下記式よりポリマー密度を算出した。
〔粒子表面を占める鎖状ポリマーの密度(本/nm2)〕=〔粒子1gに結合した鎖状ポリマーの本数(本)〕/〔粒子1gあたりの総表面積(nm2)〕
なお、粒子1gに結合した鎖状ポリマーの本数と粒子1gの総表面積の算出法は以下のとおりである。
(粒子1gに結合した鎖状ポリマーの本数)
粒子1gあたりに結合した鎖状ポリマー重量を下記式(α)により算出し、得られた値から、粒子1gあたりに結合した鎖状ポリマーの本数を下記式(β)及び(γ)により算出した。
(α): 粒子1gあたりに結合した鎖状ポリマー重量(mg) = 凍結乾燥後の粉末の重量(mg) − 塩化ナトリウムの重量(mg)
(β): 粒子1gあたりに結合した鎖状ポリマーの本数(mol) = {粒子1gあたりに結合した鎖状ポリマー重量(mg) ÷ 鎖状ポリマーの数平均分子量(g/mol)}÷1000
(γ): 粒子1gあたりに結合した鎖状ポリマーの本数(本) = 粒子1gあたりに結合した鎖状ポリマーの本数(mol) × 6.02×1023(アボガドロ数)
(粒子1gあたりの総表面積)
下記式(δ)〜(θ)により算出した。なお、式(ε)中の粒子の比重は、ポリマーの比重、磁性体の比重及び粒子に占めるポリマーと磁性体の比率から計算した。
(δ): 粒子1個あたりの体積(μm3) = 4/3 × π × {粒子の体積平均半径(μm)}3
(ε): 粒子1個あたりの質量(g) = 粒子1個あたりの体積(μm3)×粒子の比重(g/μm3)
(ζ): 粒子1gあたりの粒子数(個) = 1g / 粒子1個あたりの質量(g)
(η): 粒子1個あたりの表面積(nm2) = 4 × π × {粒子の半径(nm)}2
(θ): 粒子1gあたりの総表面積(nm2) = 粒子1個あたりの表面積(nm2) × 粒子1gあたりの粒子数(個)
粒子から遊離させた鎖状ポリマーに含まれる反応性官能基(カルボキシ基)の含有量を、電気伝導度測定法(Metrohm社、794 Basic Titrino)を用いて測定することで、粒子固形分1gあたりの反応性官能基の含有量を求めた。
m/(m+n)の値は、下記式(A)、(B)及び(C)から得られる平均重合度nと、下記式(D)から得られる平均重合度mから算出した。
(A): 粒子1gあたりの構造単位(2)の重量(g) = 粒子1gあたりの反応性官能基量(mol) × 構造単位(2)の分子量(g/mol)
(B): 粒子1gあたりの構造単位(1)の重量(g) = 粒子1gあたりの鎖状ポリマーの重量(g) ― 粒子1gあたりの構造単位(2)の重量(g)
(C): n = {粒子1gあたりの構造単位(1)の重量(g) / 構造単位(1)の分子量(g/mol)} / 粒子1gあたりのポリマー本数(本)
(D): m = 粒子1gあたりの反応性官能基量(mol) / 粒子1gあたりのポリマー本数(本)
各粒子の体積平均粒径は、レーザー回析・散乱粒子径分布測定装置(Beckman Coulter LS13 320)にて測定した。
ジ(3,5,5−トリメチルヘキサノイル)パーオキサイド75%溶液(「パーロイル355−75(S)」、日油(株)製)2gをドデシル硫酸ナトリウム1質量%水溶液20gと混合し、超音波分散機にて微細乳化した。これを、ポリスチレン粒子(数平均粒子径:0.77μm)13g及び水41gの入った反応器に入れ、25℃で12時間撹拌した。
次いで別の容器にて、スチレン96g及びジビニルベンゼン4gをドデシル硫酸ナトリウム0.1質量%水溶液400gで乳化させ、これを上記反応器に入れ、40℃で2時間撹拌した後、75℃に昇温して8時間重合した。室温まで冷却した後、遠心分離により粒子のみ取り出したものを水洗し、乾燥した。この粒子を核粒子(数平均粒径:1.5μm)とする。
次いで別の容器に、ドデシル硫酸ナトリウム0.50質量%水溶液75g、メタクリル酸メチル(以下、「MMA」という。)13.5g、トリメチロールプロパントリメタクリレート(以下、「TMP」という。)1.5g及びジ(3,5,5−トリメチルヘキサノイル)パーオキサイド75%溶液(「パーロイル355−75(S)」、日油(株)製)0.3gを入れて分散させプレエマルジョンを得た。このプレエマルジョンを、60℃に保持した上記500mLセパラブルフラスコに2時間かけて全量滴下した。滴下終了後、60℃に保持し1時間撹拌した。
その後別の容器に、ドデシル硫酸ナトリウム0.50質量%水溶液37.5g、グリシジルメタクリレート(以下、「GMA」という。)6.56g、TMP0.94g及びジ(3,5,5−トリメチルヘキサノイル)パーオキサイド75%溶液(「パーロイル355−75(S)」、日油(株)製)0.15gを入れて分散させプレエマルジョンを得た。このプレエマルジョンを、60℃に保持した上記500mLセパラブルフラスコに1時間20分かけて全量滴下した。その後75℃に昇温した後さらに2時間重合を続けて、反応を完了させた。続けて、この500mLセパラブルフラスコに1mol/Lの硫酸水溶液10mLを入れ、60℃で6時間撹拌した。次いで、上記500mLセパラブルフラスコ中の粒子を、磁気を用いて分離した後、蒸留水を用いて繰り返し洗浄した。
以上により、水酸基を表面に有する磁性粒子を得た。
合成例1で得た水酸基を表面に有する磁性粒子10gをフラスコに投入し、窒素フロー下、脱水テトラヒドロフラン32mLとトリエチルアミン7.5mLとを加え、撹拌した。このフラスコを氷浴に浸し、2−ブロモイソブチリルブロミド6.3mLを30分かけて滴下した。室温で6時間反応後、フラスコ内の粒子を、磁気を用いて分離した後、粒子をアセトンに再分散させた。磁気分離と再分散をさらに複数回行った後、ドデシル硫酸ナトリウム0.10質量%水溶液に粒子を分散した。蛍光X線分析により、原子移動ラジカル重合開始基(2−ブロモイソブチリル基)に含まれるBrを検出した。
以上により、原子移動ラジカル重合開始基(2−ブロモイソブチリル基)を表面に有する磁性粒子を得た。この粒子を、粒子(A)とする。
合成例1で得た水酸基を表面に有する磁性粒子10gをフラスコに投入し、窒素フロー下、脱水テトラヒドロフラン32mLとトリエチルアミン0.4mLとを加え、撹拌した。このフラスコを氷浴に浸し、2−ブロモイソブチリルブロミド0.2mLを加えた。室温で6時間反応後、フラスコ内の粒子を、磁気を用いて分離した後、粒子をアセトンに再分散させた。磁気分離と再分散をさらに複数回行った後、ドデシル硫酸ナトリウム0.10質量%水溶液に粒子を分散した。蛍光X線分析により、原子移動ラジカル重合開始基(2−ブロモイソブチリル基)に含まれるBrを検出した。
以上により、原子移動ラジカル重合開始基(2−ブロモイソブチリル基)を表面に有する磁性粒子を得た。この粒子を、粒子(B)とする。
合成例1で得た水酸基を表面に有する磁性粒子10gをフラスコに投入し、窒素フロー下、脱水テトラヒドロフラン32mLとトリエチルアミン0.2mLとを加え、撹拌した。このフラスコを氷浴に浸し、2−ブロモイソブチリルブロミド0.1mLを30分かけて滴下した。室温で6時間反応後、フラスコ内の粒子を、磁気を用いて分離した後、粒子をアセトンに再分散させた。磁気分離と再分散をさらに複数回行った後、ドデシル硫酸ナトリウム0.10質量%水溶液に粒子を分散した。蛍光X線分析により、原子移動ラジカル重合開始基(2−ブロモイソブチリル基)に含まれるBrを検出した。
以上により、原子移動ラジカル重合開始基(2−ブロモイソブチリル基)を表面に有する磁性粒子を得た。この粒子を、粒子(C)とする。
(鎖状ポリマー伸長反応(1))
以下の合成経路に従い、鎖状ポリマー伸長反応を行った。
次いで、以下の合成経路に従い鎖状ポリマー伸長反応を行った。
次に、以下の合成経路に従い、縮合反応を行った。
以上で、HEAA末端の水酸基が反応性官能基(カルボキシ基)に変換された磁性粒子1を得た。カルボキシ基含有量と重合割合〔m/(m+n)〕を測定した。測定結果は表1に示す。
HEAAで鎖状ポリマーを伸長させる鎖状ポリマー伸長反応(2)の反応時間を、3時間から1時間に変更した以外は実施例1と同様の操作を行い、HEAA末端の水酸基が反応性官能基(カルボキシ基)に変換された磁性粒子2を得た。体積平均粒径は、3.0μmであった。
なお、実施例1と同様にして行った体積平均粒径以外の各測定結果は表1に示す。
HEAAで鎖状ポリマーを伸長させる鎖状ポリマー伸長反応(2)の反応時間を、3時間から30分間に変更した以外は実施例1と同様の操作を行い、HEAA末端の水酸基が反応性官能基(カルボキシ基)に変換された磁性粒子3を得た。体積平均粒径は、3.0μmであった。
なお、実施例1と同様にして行った体積平均粒径以外の各測定結果は表1に示す。
HEAAで鎖状ポリマーを伸長させる鎖状ポリマー伸長反応(2)の反応時間を、3時間から15分間に変更した以外は実施例1と同様の操作を行い、HEAA末端の水酸基が反応性官能基(カルボキシ基)に変換された磁性粒子4を得た。体積平均粒径は、3.0μmであった。
なお、実施例1と同様にして行った体積平均粒径以外の各測定結果は表1に示す。
合成例2で得た粒子(A)2gを、りん酸ナトリウム緩衝液(50mM、pH7.8)6mLに分散させ、これに、CBMA0.5g、HEAA0.5g、及び0.05mol/Lのトリス(2−ピリジルメチル)アミンと0.05mol/Lの臭化銅(II)との混合水溶液0.40mLを加えた。続いて、L−アスコルビン酸0.2mol/L水溶液1.0mLを加え、密栓し反応を開始した。45℃で4時間撹拌後、開封し空気にばく露することで反応を停止させた。磁気を用いて粒子を分離し、未反応のモノマーや触媒等を除去することで、CBMAとHEAAのランダム共重合体が表面に結合した磁性粒子を得た。CBMAとHEAAのランダム共重合体のMn、Mw、Mw/Mn、及びランダム共重合体のポリマー密度を測定した。測定結果は表1に示す。
上記で得られた粒子1.5gを、ジメチルスルホキシド(DMSO)8mLに分散させ、これに、無水コハク酸1.5gを溶解したDMSO溶液7.2mL、及びトリエチルアミン0.3mLを加え反応を開始した。25℃で4時間撹拌後、磁気を用いて粒子を分離し、過剰の原料を除去した。
以上で、HEAA末端の水酸基が反応性官能基(カルボキシ基)に変換された磁性粒子5を得た。体積平均粒径は、3.0μmであった。カルボキシ基含有量と重合割合〔m/(m+n)〕を測定した。測定結果は表1に示す。
CBMAの使用量を0.5gから0.8gに、HEAAの使用量を0.5gから0.2gに、それぞれ変更した以外は実施例5と同様の操作を行い、HEAA末端の水酸基が反応性官能基(カルボキシ基)に変換された磁性粒子6を得た。体積平均粒径は、3.0μmであった。
なお、実施例5と同様にして行った体積平均粒径以外の各測定結果は表1に示す。
粒子(A)を合成例3で得た粒子(B)に変更した以外は実施例2と同様の操作を行い、HEAA末端の水酸基が反応性官能基(カルボキシ基)に変換された磁性粒子7を得た。体積平均粒径は、3.0μmであった。
なお、実施例1と同様にして行った体積平均粒径以外の各測定結果は表1に示す。
(鎖状ポリマー鎖伸長反応(1))
合成例2で得た粒子(A)2gを、りん酸ナトリウム緩衝液(50mM、pH7.8)6mLに分散させ、これに2−(メタクリロイルオキシ)エチル]ジメチル−(3−スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシド(以下、「SBMA」という。)0.5g、及び0.05mol/Lのトリス(2−ピリジルメチル)アミンと0.05mol/Lの臭化銅(II)との混合水溶液0.40mLを加えた。続いて、L−アスコルビン酸0.2mol/L水溶液1.0mLを加え、密栓し反応を開始した。45℃で4時間撹拌後、開封し空気にばく露することで反応を停止させた。磁気を用いて粒子を分離し、未反応のモノマーや触媒等を除去した。
次に、上記で得られた粒子を、りん酸ナトリウム緩衝液(50mM、pH7.8)6mLに分散させ、これに、HEAA0.5g、及び0.05mol/Lのトリス(2−ピリジルメチル)アミンと0.05mol/Lの臭化銅(II)との混合水溶液0.40mLを加えた。続いて、L−アスコルビン酸0.2mol/L水溶液1.0mLを加え、密栓し反応を開始した。45℃で30分間撹拌後、開封し空気にばく露することで反応を停止させた。磁気を用いて粒子を分離し、未反応のモノマーや触媒等を除去することで、SBMAとHEAAのブロック共重合体が表面に結合した磁性粒子を得た。体積平均粒径は、3.0μmであった。SBMAとHEAAのブロック共重合体のMn、Mw、Mw/Mn、及びブロック共重合体のポリマー密度を測定した。測定結果は表1に示す。
次に、上記で得られた粒子1.5gを、ジメチルスルホキシド(DMSO)8mLに分散させ、これに、無水コハク酸1.5gを溶解したDMSO溶液7.2mL、及びトリエチルアミン0.3mLを加え反応を開始した。25℃で4時間撹拌後、磁気を用いて粒子を分離し、過剰の原料を除去した。
以上で、HEAA末端の水酸基が反応性官能基(カルボキシ基)に変換された磁性粒子8を得た。カルボキシ基含有量と重合割合〔m/(m+n)〕を測定した。測定結果は表1に示す。
合成例2で得た粒子(A)2gを、りん酸ナトリウム緩衝液(50mM、pH7.8)6mLに分散させ、これに、2−ヒドロキシエチルメタクリレート(以下、「HEMA」という。)0.5g、及び0.05mol/Lのトリス(2−ピリジルメチル)アミンと0.05mol/Lの臭化銅(II)との混合水溶液0.40mLを加えた。続いて、L−アスコルビン酸0.2mol/L水溶液1.0mLを加え、密栓し反応を開始した。45℃で4時間撹拌後、開封し空気にばく露することで反応を停止させた。磁気を用いて粒子を分離し、未反応のモノマーや触媒等を除去した。以上で、HEMAのホモポリマーが表面に結合した磁性粒子9を得た。体積平均粒径は、3.0μmであった。
CBMAをジメチルアミノエチルメタクリレート四級化物(ライトエステルDQ−100 共栄社化学(株)製(ジメチルアミノエチルメタクリレートをメチルクロライドで四級化したもの))に変更した以外は実施例2と同様の操作を行い、HEAA末端の水酸基が反応性官能基(カルボキシ基)に変換された磁性粒子10を得た。体積平均粒径は、3.0μmであった。
なお、実施例1と同様にして行った体積平均粒径以外の各測定結果は表1に示す。
CBMAをジメチルアミノエチルメタクリレート四級化物(ライトエステルDQ−100 共栄社化学(株)製(ジメチルアミノエチルメタクリレートをメチルクロライドで四級化したもの))に変更した以外は実施例6と同様の操作を行い、HEAA末端の水酸基が反応性官能基(カルボキシ基)に変換された磁性粒子11を得た。体積平均粒径は、3.0μmであった。
なお、実施例5と同様にして行った体積平均粒径以外の各測定結果は表1に示す。
合成例1で得た水酸基を表面に有する磁性粒子1gを1,3−ジオキソラン4.8mLに分散させ、これに、トリエチルアミン0.2mLと無水コハク酸0.08gを1,3−ジオキソラン4.8mLに溶解させた溶液を加えた。25℃で4時間反応後、磁気を用いて粒子を分離し、粒子を水に分散した。以上により、鎖状ポリマーを有さない反応性官能基含有磁性粒子12を得た。カルボキシ基含有量を測定した。測定結果は表1に示す。
合成例2で得た粒子(A)2gを、りん酸ナトリウム緩衝液(50mM、pH7.8)6mLに分散させ、これに、CBMA0.5g、及び0.05mol/Lのトリス(2−ピリジルメチル)アミンと0.05mol/Lの臭化銅(II)との混合水溶液0.40mLを加えた。続いて、L−アスコルビン酸0.2mol/L水溶液1.0mLを加え、密栓し反応を開始した。45℃で4時間撹拌後、開封し空気にばく露することで反応を停止させた。磁気を用いて粒子を分離し、未反応のモノマーや触媒等を除去した。以上で、CBMAのホモポリマーが表面に結合した磁性粒子13を得た。体積平均粒径は、3.0μmであった。
各実施例及び比較例で得られた磁性粒子100mgを、水1mLにそれぞれ分散させた。比較例1で得られた磁性粒子は水への分散性が悪く、凝集した。他の磁性粒子については凝集することなく分散された。評価結果を表2に示す。
各実施例及び比較例2〜5で得られた磁性粒子1mgを、水2mLにそれぞれ分散させた。この水分散液をエッペンドルフチューブに投入し、磁気を用いて粒子を分離して上清を除去した。次いで、粒子にJurkat細胞破砕液(タンパク質夾雑物100μgが含まれる)100μLを加え、30分間インキュベートした後、磁気を用いて粒子を分離して上清を除去し、粒子をTBS−T(0.05質量%Tween20)緩衝液で5回洗浄した。さらに磁気を用いて粒子を分離して上清を除去した後、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム水溶液(0.5質量%)を加え、非特異吸着したタンパク質夾雑物を粒子から剥離した。この剥離溶液をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ゲルをCBB染色して粒子に非特異吸着したタンパク質の量を目視にて確認し、以下の基準により評価した。タンパク質の量が少ない粒子ほど非特異吸着の少ない良好な粒子といえる。評価結果は表2に示す。
(評価基準)
◎:タンパク質の吸着がほとんどみられず、非常に良好
○:タンパク質の吸着があまりみられず、良好
△:タンパク質の吸着がわずかにみられるが、やや良好
×:タンパク質の吸着がはっきりと確認され、不良
各実施例及び比較例2〜5で得られた磁性粒子1mgを、水2mLにそれぞれ分散させた。この水分散液をエッペンドルフチューブに投入し、磁気を用いて粒子を分離して上清を除去した。次いで、粒子をMES緩衝液(100mM、pH5.0)990μLに分散させ、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(10mg/mL)10μLを加え、室温で30分間インキュベートした。磁気を用いて粒子を分離して上清を除去し、MES緩衝液(100mM、pH5.0)1mLに分散させ、抗TSH抗体(フナコシ社製)15μgを加えた。室温で12時間インキュベートした後、磁気を用いて粒子を分離して上清を除去した。TBS−T(0.05質量%Tween20)緩衝液で5回洗浄し、抗体結合粒子を得た。
次に、抗体結合量をBCA Assayにより求めた。すなわち、抗体結合粒子1mgをBCA Protein Assay Reagent Kit(Thermo Fisher製)のA/B混合液1mLに分散させ、37℃で30分間転倒混和させた。磁気を用いて粒子を分離して上清を除去し、570nmにおける吸光度を測定した。別途、抗TSH抗体0μg、2μg、4μg、8μg、16μgが溶解した抗体溶液と、上記A/B混合液1mLとをそれぞれ混合し、37℃で30分間転倒混和させた後、反応溶液の570nmにおける吸光度を測定した。得られた検量線から磁性粒子に結合した抗体結合量を求めた。結果を表2に示す。
試験例3で得られた抗体結合粒子の分散液5μL(粒子50μg相当)をテストチューブに取り、ウシ胎児血清(FCS)50μLが添加された200μIU/mLのTSH抗原溶液(富士レビオ社製ルミパルスTSH−III標準TSH溶液)50μLを混合し、25℃で10分間反応させた。磁気を用いて粒子を分離し上清を除いた後、2次抗体としてアルカリフォスフォターゼで標識した抗TSH抗体(富士レビオ社製ルミパルスTSH−III免疫反応カートリッジ付属)40μLを添加し、25℃で10分間反応させた。磁気を用いて粒子を分離し上清を除いた後、PBSで3回洗浄を繰り返して得られた粒子を、50μLの0.01%TritonX−100に分散させ、新しいチューブに移し替えた。アルカリフォスフォターゼの基質液(富士レビオ社製ルミパルス基質液)100μLを加え、37℃で10分間反応させた後、シグナルとして化学発光量を測定した。化学発光の測定には、ベルトールジャパン社製の化学発光測定装置(Lumat LB9507)を用いた。また上記で、200μIU/mLのTSH抗原溶液の代わりに、0μIU/mLのTSHキャリブレータとした以外は同様にして、ノイズとして化学発光量を測定した。さらに、シグナル(S)をノイズ(N)で割った値S/Nを算出した。結果を表2に示す。
各実施例及び比較例2〜5で得られた磁性粒子1mgを、水2mLにそれぞれ分散させた。この水分散液をエッペンドルフチューブに投入し、磁気を用いて粒子を分離して上清を除去した。次いで、粒子をMES緩衝液(100mM、pH5.0)990μLに分散させ、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(10mg/mL)10μLを加え、室温で30分間インキュベートした。磁気を用いて粒子を分離して上清を除去し、MES緩衝液(100mM、pH5.0)1mLに分散させ、抗EpCAM抗体5μgを加えた。室温で12時間インキュベートした後、磁気を用いて粒子を分離して上清を除去した。TBS−T(0.05質量%Tween20)緩衝液で5回洗浄し、抗体結合粒子を得た。
この抗体結合粒子をPBS(−)緩衝液で4回洗浄した後、PBS(−)緩衝液250μLに分散させた。次いで、Dulbecco’s PBS(−)緩衝液50μLに分散した大腸がん細胞(HT−29)90000cellsを抗体結合粒子と混合し、4℃で30分間撹拌して細胞捕捉を行った。磁気を用いて粒子を分離して上清を除去し、PBS(−)緩衝液で4回洗浄することで、細胞捕捉粒子を得た。次に、Proteinase K 50μLを細胞捕捉粒子に加え55℃で15分間、続いて100℃で20分間反応させることで細胞内部のDNAを溶出した。磁気を用いて粒子を分離して上清を回収後、β−グロビンを標的としたPCRカクテルを加えPCRを実施し、Ct値から求められる捕捉細胞数から特異的細胞捕捉率を算出した。結果を表2に示す。
また、粒子にEpCAM抗体を結合させない以外は上記と同様の操作を行い、捕捉細胞数から非特異的細胞捕捉率を算出した。結果を表2に示す。
Claims (21)
- 下記式(1)で表される構造単位と下記式(2)で表される構造単位とを含むポリマーが結合してなる固相担体。
R1は、水素原子又はメチル基を示し、
R2は、双性イオン構造を有する有機基を示す。〕
R3は、水素原子又はメチル基を示し、
R4は、−(C=O)−O−*、−(C=O)−NR6−*(R6は、水素原子又はメチル基を示し、*は、式(2)中のR5と結合する位置を示す)又はフェニレン基を示し、
R4が−(C=O)−O−*である場合、R5は、水素原子、又は反応性官能基を有する有機基を示し、R4が−(C=O)−NR6−*又はフェニレン基である場合、R5は、反応性官能基を有する有機基を示す。
但し、R5は、双性イオン構造を有する有機基でない。〕 - R2が、第4級アンモニウム塩型カチオン性官能基と、−(C=O)O-、−SO3 -及び−O−(O=P−O-)−O−から選ばれる1価又は2価のアニオン性官能基とを有する有機基である、請求項1に記載の固相担体。
- R2が、下記式(3)又は(4)で表される有機基である、請求項1又は2に記載の固相担体。
R7は、−(C=O)−O−*、−(C=O)−NR13−*(R13は、水素原子又はメチル基を示し、*は、式(3)中のR8と結合する位置を示す)又はフェニレン基を示し、
R8及びR9は、それぞれ独立して、単結合又は炭素数1〜10の2価の有機基を示し、
R10は、−(C=O)O-又は−SO3 -を示し、
R11及びR12は、それぞれ独立して、メチル基又はエチル基を示す。〕
R14は、−(C=O)−O−*、−(C=O)−NR20−*(R20は、水素原子又はメチル基を示し、*は、式(4)中のR15と結合する位置を示す)又はフェニレン基を示し、
R15及びR16は、それぞれ独立して、単結合又は炭素数1〜10の2価の有機基を示し、
R17、R18及びR19は、それぞれ独立して、メチル基又はエチル基を示す。〕 - 粒子である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の固相担体。
- 磁性粒子である、請求項4に記載の固相担体。
- 前記固相担体の表面に対して前記ポリマーが占有する密度が、0.1〜1.2本/nm2である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の固相担体。
- 前記ポリマーの重量平均分子量が、1,000〜100,000である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の固相担体。
- 前記ポリマーの分子量分布が、1.0〜2.5である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の固相担体。
- 前記式(1)で表される構造単位の平均重合度n、及び前記式(2)で表される構造単位の平均重合度mが、いずれも1以上であり、且つ重合割合〔m/(m+n)〕が、0.01〜0.75である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の固相担体。
- 前記ポリマーが、前記式(1)で表される構造単位の繰り返しから構成される第1のブロックと、前記式(2)で表される構造単位の繰り返しから構成される第2のブロックとを含むブロックポリマーである、請求項1〜9のいずれか1項に記載の固相担体。
- 前記ポリマーが、ランダムポリマーである、請求項1〜9のいずれか1項に記載の固相担体。
- 前記反応性官能基が、カルボキシ基、トシル基、アミノ基、エポキシ基、アシル基又はアジド基である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の固相担体。
- 前記反応性官能基の含有量が、固相担体の固形分1gあたり1〜200μmolである、請求項1〜12のいずれか1項に記載の固相担体。
- 重合開始基を有する担体を準備する工程と、前記重合開始基を起点としてモノマーを重合させる工程とを少なくとも含む固相担体の製造方法により得られるものである、請求項1〜13のいずれか1項に記載の固相担体。
- 前記重合開始基が、原子移動ラジカル重合開始基である、請求項14に記載の固相担体。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載の固相担体にリガンドを結合させてなる、リガンド結合固相担体。
- 前記リガンドが、抗体、抗原、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、多糖、糖、脂質、ビタミン、薬物、基質、ホルモン、神経伝達物質又は合成分子である、請求項16に記載のリガンド結合固相担体。
- イムノアッセイ用、細胞分離用又は核酸検出用である、請求項1〜17のいずれか1項に記載の固相担体又はリガンド結合固相担体。
- 請求項16又は17に記載のリガンド結合固相担体を用いることを特徴とする、試料中の標的物質を検出又は分離する方法。
- 下記式(1)で表される構造単位と下記式(2)で表される構造単位とを含むポリマーが結合してなる固相担体の製造方法であって、
(工程1)重合開始基を有する担体を準備する工程と、
(工程2)前記重合開始基を起点としてモノマーを重合させる工程を含むことを特徴とする、製造方法。
R1は、水素原子又はメチル基を示し、
R2は、双性イオン構造を有する有機基を示す。〕
R3は、水素原子又はメチル基を示し、
R4は、−(C=O)−O−*、−(C=O)−NR6−*(R6は、水素原子又はメチル基を示し、*は、式(2)中のR5と結合する位置を示す)又はフェニレン基を示し、
R4が−(C=O)−O−*である場合、R5は、水素原子、又は反応性官能基を有する有機基を示し、R4が−(C=O)−NR6−*又はフェニレン基である場合、R5は、反応性官能基を有する有機基を示す。
但し、R5は、双性イオン構造を有する有機基でない。〕 - 前記重合開始基が、原子移動ラジカル重合開始基である、請求項20に記載の製造方法。
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