JPWO2017183733A1 - ウエスタンブロット法用非特異的吸着防止剤、ウエスタンブロット法用試薬およびブロッキング方法 - Google Patents

ウエスタンブロット法用非特異的吸着防止剤、ウエスタンブロット法用試薬およびブロッキング方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、種々の抗原抗体反応を利用したウエスタンブロット法用のブロッキング剤として適用でき、良好なＳ／Ｎ比で高感度かつ精度の高い分析を行うことができる非特異的吸着防止剤、該非特異的吸着防止剤を含有するウエスタンブロット法用試薬、および該非特異的吸着防止剤でブロッキング処理を行うブロッキング方法を提供することを目的とする。
本発明は、下記一般式［１］で示される繰り返し単位と下記一般式［２］で示される繰り返し単位を有する共重合体を含有するウエスタンブロット法用非特異的吸着防止剤、該非特異的吸着防止剤を含有するウエスタンブロット法用試薬、ならびに該非特異的吸着防止剤でブロッキング処理を行うブロッキング方法に関する。
一般式［１］および［２］：
Figure 2017183733

（式中、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立して、酸素原子または−ＮＨ−基を表し、Ｒ１〜Ｒ２はそれぞれ独立して、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｒ３およびＲ５はそれぞれ独立して、水素原子または炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｒ４は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数６〜１０のアリール基または炭素数７〜１２のアリールアルキル基を表し、ｍは、１〜６の整数を表し、ｎは、１〜３の整数を表す。）

Description

本発明は、ウエスタンブロット法における非特異的吸着防止剤、該非特異的吸着防止剤を含有するウエスタンブロット法用試薬、および該非特異的吸着防止剤でブロッキング処理を行うブロッキング方法に関する。
生化学の分野では、タンパク質またはポリペプチド等の識別と分子量の測定を目的として、ウエスタンブロット法（イムノブロット法）が広く用いられている。ウエスタンブロット法において、検出感度を左右する要因の一つとして、測定に使用される抗体やタンパク質等の基材への非特異的吸着が挙げられ、検出感度の低下や再現性の低下の原因となっている。
このような非特異的吸着を防止するために、従来より、例えば、Tween-20を含有するトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ-Ｔ）にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはスキムミルクを溶解させたブロッキング溶液等が用いられている（例えば、非特許文献１）。また、その他のブロッキング溶液としては、例えば、ゼラチン等のタンパク質を用いたブロッキング溶液、乳タンパク質を有効成分とする非特異的吸着防止剤（例えば、特許文献１）等が知られている。
しかしながら、スキムミルクは、カゼインまたは／およびリン酸化カゼインを多く含んでいるため、抗リン酸化タンパク質（認識）抗体を用いてウエスタンブロット法を行う場合には、抗体がスキムミルクを誤認識し非特異的に反応する可能性があり、スキムミルクの使用は適さないという問題点がある。また、スキムミルクは、ビオチンを含んでいるため、ビオチンと反応するペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識ストレプトアビジンを使用する場合にも、スキムミルクの使用は適さないという問題点がある。更に、スキムミルクは、しばしば抗原のマスキングとそれによるシグナルの低下が見られるという問題点がある。
一方で、免疫測定法に適用可能なタンパク質を含まない非特異的吸着防止剤としては、例えば、２-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体または／および２-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン含有成分の共重合体を含むタンパク質吸着防止剤が提案されている（例えば、特許文献２）。
しかしながら、ウエスタンブロット法において、基材としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜、ニトロセルロース膜等を用いた場合に、例えば、特許文献２等に記載の共重合体を主成分とする非特異的吸着防止剤では、スキムミルクと比べると抗体の非特異的吸着の防止効果が十分ではないという問題点がある。
特開平１−２１７２６６号公報 特開平７−８３９２３号公報
David L. Spector, Robert D. Goldman, Leslie A. Leinwand (1998). Cells, a laboratory manual, culture and biochemical analysis of cells. CSHL Press, pp.73.6-73.7. ISBN 0-87969-512-8
このような状況から、種々の抗原抗体反応を利用したウエスタンブロット法用のブロッキング剤として適用でき、良好なＳ／Ｎ比で高感度な測定が可能な非特異的吸着防止剤の開発が望まれている。
本発明は、種々の抗原抗体反応を利用したウエスタンブロット法用のブロッキング剤として適用でき、良好なＳ／Ｎ比で高感度かつ精度の高い分析を行うことができる非特異的吸着防止剤、該非特異的吸着防止剤を含有するウエスタンブロット法用試薬、および該非特異的吸着防止剤でブロッキング処理を行うブロッキング方法を提供することを目的とする。本発明者らは、このような非特異的吸着防止剤について鋭意研究を重ねた結果、特定のベタイン構造を有する繰り返し単位を有する共重合体を用いることにより、ウエスタンブロット法において、高感度で精度の高い分析を行うことができる非特異的吸着防止剤を提供できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明は、以下の構成よりなる。
（１）下記一般式［１］で示される繰り返し単位と下記一般式［２］で示される繰り返し単位を有する共重合体を含有する、ウエスタンブロット法用非特異的吸着防止剤。
一般式［１］：
Figure 2017183733
（式中、Ｘ１は、酸素原子または−ＮＨ−基を表し、Ｒ１〜Ｒ２はそれぞれ独立して、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｒ３は、水素原子または炭素数１〜３のアルキル基を表し、ｍは、１〜６の整数を表し、ｎは、１〜３の整数を表す。）
一般式［２］：
Figure 2017183733
（式中、Ｘ２は、酸素原子または−ＮＨ−基を表し、Ｒ４は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数６〜１０のアリール基または炭素数７〜１２のアリールアルキル基を表し、Ｒ５は、水素原子または炭素数１〜３のアルキル基を表す。）
（２）上記一般式［１］で示される繰り返し単位と上記一般式［２］で示される繰り返し単位を有する共重合体を含有する非特異的吸着防止剤を含有する、ウエスタンブロット法用試薬。
（３）ウエスタンブロット法において、基材に対して上記一般式［１］で示される繰り返し単位と上記一般式［２］で示される繰り返し単位を有する共重合体を含有する非特異的吸着防止剤でブロッキング処理を行う、ブロッキング方法。
本発明の非特異的吸着防止剤は、ウエスタンブロット法において、測定対象物質であるタンパク質またはポリペプチド等の特異的なシグナルを減ずることなく、非特異的なバックグラウンド・シグナルを低減させることができる。故に、ウエスタンブロット法において、本発明の非特異的吸着防止剤でブロッキング処理を行うことにより、良好なＳ／Ｎ比で高感度かつ精度の高い分析を行うことができるという効果を奏する。
本発明の非特異的吸着防止剤は、リン酸基を含まない共重合体からなるため、抗リン酸化タンパク質（認識）抗体を用いるウエスタンブロットのブロッキングにも用いることができる。また、本発明の非特異的吸着防止剤は、ビオチンを含まないため、二次抗体としてビオチン標識二次抗体を用いるウエスタンブロットのブロッキングにも用いることができる。
本発明の非特異的吸着防止剤は、長期間安定であるため、長期間の保存にも耐え、用時調製することなく、精度よく分析することが可能である。
実施例１において、FLAG-BAPをウエスタンブロット法により検出した結果を示す電気泳動図である。図１において、（Ａ）は非特異的吸着防止剤を用いない場合の結果を、（Ｂ）は非特異的吸着防止剤として４ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体を用いた場合の結果を、（Ｃ）は非特異的吸着防止剤として５ｗ／ｖ％のスキムミルクを用いた場合の結果をそれぞれ示す。 実施例２において、FLAG-BAPをウエスタンブロット法により検出した結果を示す電気泳動図である。図２において、（Ａ）は非特異的吸着防止剤として４ｗ／ｖ％のＰＭＰＣを用いた場合の結果を、（Ｂ）は非特異的吸着防止剤として４ｗ／ｖ％の単独重合体（ホモポリマー）を用いた場合の結果を、（Ｃ）は非特異的吸着防止剤として５ｗ／ｖ％のスキムミルクを用いた場合の結果を、（Ｄ）は非特異的吸着防止剤として４ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体を用いた場合の結果をそれぞれ示す。 実施例１１において、FLAG-BAPをウエスタンブロット法により検出した結果を示す電気泳動図である。図３において、（Ａ）は非特異的吸着防止剤として０．５ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体を用いた場合の結果を、（Ｂ）は非特異的吸着防止剤として０．２ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体を用いた場合の結果を、（Ｃ）は非特異的吸着防止剤として５ｗ／ｖ％のスキムミルクを用いた場合の結果をそれぞれ示す。
−本発明のウエスタンブロット法用非特異的吸着防止剤−
本発明のウエスタンブロット法用非特異的吸着防止剤は、下記一般式［１］で示される繰り返し単位と下記一般式［２］で示される繰り返し単位を有する共重合体（以下、本発明にかかる共重合体と略記する場合がある。）を含有することを特徴とするものである。
一般式［１］：
Figure 2017183733
（式中、Ｘ１は、酸素原子または−ＮＨ−基を表し、Ｒ１〜Ｒ２はそれぞれ独立して、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｒ３は、水素原子または炭素数１〜３のアルキル基を表し、ｍは、１〜６の整数を表し、ｎは、１〜３の整数を表す。）
一般式［２］：
Figure 2017183733
（式中、Ｘ２は、酸素原子または−ＮＨ−基を表し、Ｒ４は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数６〜１０のアリール基または炭素数７〜１２のアリールアルキル基を表し、Ｒ５は、水素原子または炭素数１〜３のアルキル基を表す。）
一般式［１］におけるＲ１およびＲ２で示される炭素数１〜６のアルキル基としては、炭素数１〜３のアルキル基が好ましく、なかでも、炭素数１のアルキル基がより好ましい。また、該アルキル基としては、直鎖状、分枝状または環状のいずれであってもよく、なかでも、直鎖状または分枝状のアルキル基が好ましい。このようなアルキル基の具体例としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ-プロピル基、イソプロピル基、ｎ-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、シクロブチル基、ｎ-ペンチル基、イソペンチル基、sec-ペンチル基、tert-ペンチル基、ネオペンチル基、２-メチルブチル基、１，２-ジメチルプロピル基、１-エチルプロピル基、シクロペンチル基、ｎ-ヘキシル基、イソヘキシル基、sec-ヘキシル基、tert-ヘキシル基、ネオヘキシル基、２-メチルペンチル基、１，２-ジメチルブチル基、２，３-ジメチルブチル基、１-エチルブチル基、シクロヘキシル基等が挙げられ、なかでも、例えば、メチル基、エチル基、ｎ-プロピル基、イソプロピル基等の炭素数１〜３の直鎖状または分枝状のアルキル基が好ましく、そのなかでも、メチル基がより好ましい。
一般式［１］におけるＲ３で示される炭素数１〜３のアルキル基としては、炭素数１のアルキル基が好ましい。また、該アルキル基としては、直鎖状または分枝状のいずれであってもよい。このようなアルキル基の具体例としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ-プロピル基、イソプロピル基等が挙げられ、なかでも、メチル基が好ましい。
一般式［１］におけるＸ１としては、酸素原子が好ましい。
一般式［１］におけるＲ１およびＲ２としては、炭素数１〜６のアルキル基が好ましい。
一般式［１］におけるＲ３としては、炭素数１〜３のアルキル基が好ましい。
一般式［１］におけるｍとしては、２〜４の整数が好ましく、なかでも、２がより好ましい。
一般式［１］におけるｎとしては、１が好ましい。
一般式［２］におけるＲ４で示される炭素数１〜１０のアルキル基としては、炭素数４〜６のアルキル基が好ましい。また、該アルキル基としては、直鎖状、分枝状または環状のいずれであってもよい。このようなアルキル基の具体例としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ-プロピル基、イソプロピル基、ｎ-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、シクロブチル基、ｎ-ペンチル基、イソペンチル基、sec-ペンチル基、tert-ペンチル基、ネオペンチル基、２-メチルブチル基、１，２-ジメチルプロピル基、１-エチルプロピル基、シクロペンチル基、ｎ-ヘキシル基、イソヘキシル基、sec-ヘキシル基、tert-ヘキシル基、ネオヘキシル基、２-メチルペンチル基、１，２-ジメチルブチル基、２，３-ジメチルブチル基、１-エチルブチル基、シクロヘキシル基、ｎ-ヘプチル基、イソヘプチル基、sec-ヘプチル基、tert-ヘプチル基、ネオヘプチル基、シクロヘプチル基、ｎ-オクチル基、イソオクチル基、sec-オクチル基、tert-オクチル基、ネオオクチル基、２-エチルヘキシル基、シクロオクチル基、ｎ-ノニル基、イソノニル基、sec-ノニル基、tert-ノニル基、ネオノニル基、シクロノニル基、ｎ-デシル基、イソデシル基、sec-デシル基、tert-デシル基、ネオデシル基、シクロデシル基、ノルボルニル基（ノルボルナン-χ-イル基）、ボルニル基（ボルナン-χ-イル基）、メンチル基（メンタ-χ-イル基）、アダマンチル基、デカヒドロナフチル基等が挙げられ、なかでも、例えば、ｎ-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、シクロブチル基、ｎ-ペンチル基、イソペンチル基、sec-ペンチル基、tert-ペンチル基、ネオペンチル基、２-メチルブチル基、１，２-ジメチルプロピル基、１-エチルプロピル基、シクロペンチル基、ｎ-ヘキシル基、イソヘキシル基、sec-ヘキシル基、tert-ヘキシル基、ネオヘキシル基、２-メチルペンチル基、１，２-ジメチルブチル基、２，３-ジメチルブチル基、１-エチルブチル基、シクロヘキシル基等の炭素数４〜６の直鎖状、分枝状または環状のアルキル基が好ましく、そのなかでも、tert-ブチル基、ｎ-ヘキシル基およびシクロヘキシル基がより好ましく、シクロヘキシル基が特に好ましい。
一般式［２］におけるＲ４で示される炭素数６〜１０のアリール基としては、炭素数６のアリール基が好ましい。また、該アリール基としては、単環式または縮合多環式のいずれであってもよい。このようなアリール基の具体例としては、例えば、フェニル基、ナフチル基等が挙げられ、なかでも、フェニル基が好ましい。
一般式［２］におけるＲ４で示される炭素数７〜１２のアリールアルキル基としては、炭素数７〜９のアリールアルキル基が好ましく、なかでも、炭素数７のアリールアルキル基がより好ましい。また、該アリールアルキル基としては、単環式または縮合多環式のいずれであってもよい。このようなアリールアルキル基の具体例としては、例えば、ベンジル基、フェネチル基、メチルベンジル基、フェニルプロピル基、１-メチルフェニルエチル基、フェニルブチル基、２-メチルフェニルプロピル基、テトラヒドロナフチル基、ナフチルメチル基、ナフチルエチル基、インデニル基等が挙げられ、なかでも、例えば、ベンジル基、フェネチル基、メチルベンジル基、フェニルプロピル基、１-メチルフェニルエチル基等の炭素数７〜９のアリールアルキル基が好ましく、そのなかでも、ベンジル基がより好ましい。
一般式［２］におけるＲ５で示される炭素数１〜３のアルキル基としては、一般式［１］におけるＲ３で示される炭素数１〜３のアルキル基の具体例と同様のものが挙げられ、好ましい具体例も同様である。
一般式［２］におけるＸ２としては、酸素原子が好ましい。
一般式［２］におけるＲ４としては、炭素数１〜１０のアルキル基および炭素数７〜１２のアリールアルキル基が好ましく、なかでも、炭素数７〜１２のアリールアルキル基がより好ましい。
一般式［２］におけるＲ５としては、炭素数１〜３のアルキル基が好ましい。
本発明にかかる共重合体を構成する上記一般式［１］で示される繰り返し単位のなかでも、下記一般式［１'］で示される繰り返し単位が好ましい。
一般式［１'］：
Figure 2017183733
（式中、Ｒ１'〜Ｒ２'はそれぞれ独立して、炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｒ３'は、水素原子またはメチル基を表し、ｍ'は、２〜４の整数を表す。）
一般式［１'］におけるＲ１'およびＲ２'で示される炭素数１〜３のアルキル基としては、炭素数１のアルキル基が好ましい。また、該アルキル基としては、直鎖状または分枝状のいずれであってもよい。このようなアルキル基の具体例としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ-プロピル基、イソプロピル基等が挙げられ、なかでも、メチル基が好ましい。
一般式［１'］におけるＲ１'およびＲ２'としては、メチル基が好ましい。
一般式［１'］におけるＲ３'としては、メチル基が好ましい。
一般式［１'］におけるｍ'としては、２が好ましい。
このような一般式［１'］で示される繰り返し単位の具体例としては、例えば、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジメチルアミノ）エチル〕アクリル酸由来の繰り返し単位、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジメチルアミノ）エチル〕メタクリル酸由来の繰り返し単位、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジエチルアミノ）エチル〕アクリル酸由来の繰り返し単位、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジエチルアミノ）エチル〕メタクリル酸由来の繰り返し単位、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジプロピルアミノ）エチル〕アクリル酸由来の繰り返し単位、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジプロピルアミノ）エチル〕メタクリル酸由来の繰り返し単位、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジメチルアミノ）プロピル〕アクリル酸由来の繰り返し単位、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジメチルアミノ）プロピル〕メタクリル酸由来の繰り返し単位、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジメチルアミノ）ブチル〕アクリル酸由来の繰り返し単位、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジメチルアミノ）ブチル〕メタクリル酸由来の繰り返し単位、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジエチルアミノ）プロピル〕アクリル酸由来の繰り返し単位、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジエチルアミノ）プロピル〕メタクリル酸由来の繰り返し単位、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジエチルアミノ）ブチル〕アクリル酸由来の繰り返し単位、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジエチルアミノ）ブチル〕メタクリル酸由来の繰り返し単位、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジプロピルアミノ）プロピル〕アクリル酸由来の繰り返し単位、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジプロピルアミノ）プロピル〕メタクリル酸由来の繰り返し単位、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジプロピルアミノ）ブチル〕アクリル酸由来の繰り返し単位、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジプロピルアミノ）ブチル〕メタクリル酸由来の繰り返し単位等が挙げられる。
上述した一般式［１'］で示される繰り返し単位としては、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジメチルアミノ）エチル〕アクリル酸由来の繰り返し単位およびＮ-〔２-（カルボキシメチルジメチルアミノ）エチル〕メタクリル酸由来の繰り返し単位がより好ましく、そのなかでも、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジメチルアミノ）エチル〕メタクリル酸由来の繰り返し単位が特に好ましい。
本発明にかかる共重合体を構成する上記一般式［２］で示される繰り返し単位のなかでも、下記一般式［２'］で示される繰り返し単位が好ましい。
一般式［２'］：
Figure 2017183733
（式中、Ｒ４'は、炭素数４〜６のアルキル基または炭素数７〜９のアリールアルキル基を表し、Ｒ５'は、水素原子またはメチル基を表す。）
一般式［２'］におけるＲ４'で示される炭素数４〜６のアルキル基としては、直鎖状、分枝状または環状のいずれであってもよい。このようなアルキル基の具体例としては、例えば、ｎ-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、シクロブチル基、ｎ-ペンチル基、イソペンチル基、sec-ペンチル基、tert-ペンチル基、ネオペンチル基、２-メチルブチル基、１，２-ジメチルプロピル基、１-エチルプロピル基、シクロペンチル基、ｎ-ヘキシル基、イソヘキシル基、sec-ヘキシル基、tert-ヘキシル基、ネオヘキシル基、２-メチルペンチル基、１，２-ジメチルブチル基、２，３-ジメチルブチル基、１-エチルブチル基、シクロヘキシル基等が挙げられ、なかでも、tert-ブチル基、ｎ-ヘキシル基およびシクロヘキシル基が好ましく、そのなかでも、シクロヘキシル基が特に好ましい。
一般式［２'］におけるＲ４'で示される炭素数７〜９のアリールアルキル基としては、炭素数７のアリールアルキル基が好ましい。また、該アリールアルキル基としては、単環式または縮合多環式のいずれであってもよい。このようなアリールアルキル基の具体例としては、例えば、ベンジル基、フェネチル基、メチルベンジル基、フェニルプロピル基、１-メチルフェニルエチル基等が挙げられ、なかでも、ベンジル基が好ましい。
一般式［２'］におけるＲ４'としては、炭素数７〜１２のアリールアルキル基が好ましい。
一般式［２'］におけるＲ５'としては、メチル基が好ましい。
このような一般式［２'］で示される繰り返し単位の具体例としては、例えば、アクリル酸ｎ-ブチル由来の繰り返し単位、メタクリル酸ｎ-ブチル由来の繰り返し単位、アクリル酸イソブチル由来の繰り返し単位、メタクリル酸イソブチル由来の繰り返し単位、アクリル酸sec-ブチル由来の繰り返し単位、メタクリル酸sec-ブチル由来の繰り返し単位、アクリル酸tert-ブチル由来の繰り返し単位、メタクリル酸tert-ブチル由来の繰り返し単位、アクリル酸シクロブチル由来の繰り返し単位、メタクリル酸シクロブチル由来の繰り返し単位、アクリル酸ｎ-ペンチル由来の繰り返し単位、メタクリル酸ｎ-ペンチル由来の繰り返し単位、アクリル酸イソペンチル由来の繰り返し単位、メタクリル酸イソペンチル由来の繰り返し単位、アクリル酸sec-ペンチル由来の繰り返し単位、メタクリル酸sec-ペンチル由来の繰り返し単位、アクリル酸tert-ペンチル由来の繰り返し単位、メタクリル酸tert-ペンチル由来の繰り返し単位、アクリル酸ネオペンチル由来の繰り返し単位、メタクリル酸ネオペンチル由来の繰り返し単位、アクリル酸２-メチルブチル由来の繰り返し単位、メタクリル酸２-メチルブチル由来の繰り返し単位、アクリル酸１，２-ジメチルプロピル由来の繰り返し単位、メタクリル酸１，２-ジメチルプロピル由来の繰り返し単位、アクリル酸１-エチルプロピル由来の繰り返し単位、メタクリル酸１-エチルプロピル由来の繰り返し単位、アクリル酸シクロペンチル由来の繰り返し単位、メタクリル酸シクロペンチル由来の繰り返し単位、アクリル酸ｎ-ヘキシル由来の繰り返し単位、メタクリル酸ｎ-ヘキシル由来の繰り返し単位、アクリル酸イソヘキシル由来の繰り返し単位、メタクリル酸イソヘキシル由来の繰り返し単位、アクリル酸sec-ヘキシル由来の繰り返し単位、メタクリル酸sec-ヘキシル由来の繰り返し単位、アクリル酸tert-ヘキシル由来の繰り返し単位、メタクリル酸tert-ヘキシル由来の繰り返し単位、アクリル酸ネオヘキシル由来の繰り返し単位、メタクリル酸ネオヘキシル由来の繰り返し単位、アクリル酸２-メチルペンチル由来の繰り返し単位、メタクリル酸２-メチルペンチル由来の繰り返し単位、アクリル酸１，２-ジメチルブチル由来の繰り返し単位、メタクリル酸１，２-ジメチルブチル由来の繰り返し単位、アクリル酸２，３-ジメチルブチル由来の繰り返し単位、メタクリル酸２，３-ジメチルブチル由来の繰り返し単位、アクリル酸１-エチルブチル由来の繰り返し単位、メタクリル酸１-エチルブチル由来の繰り返し単位、アクリル酸シクロヘキシル由来の繰り返し単位、メタクリル酸シクロヘキシル由来の繰り返し単位等のアクリル酸またはメタクリル酸のアルキルエステル由来の繰り返し単位；例えば、アクリル酸ベンジル由来の繰り返し単位、メタクリル酸ベンジル由来の繰り返し単位、アクリル酸フェネチル由来の繰り返し単位、メタクリル酸フェネチル由来の繰り返し単位、アクリル酸メチルベンジル由来の繰り返し単位、メタクリル酸メチルベンジル由来の繰り返し単位、アクリル酸フェニルプロピル由来の繰り返し単位、メタクリル酸フェニルプロピル由来の繰り返し単位、アクリル酸１-メチルフェニルエチル由来の繰り返し単位、メタクリル酸１-メチルフェニルエチル由来の繰り返し単位等のアクリル酸またはメタクリル酸のアリールアルキルエステル由来の繰り返し単位が挙げられる。
上述した一般式［２'］で示される繰り返し単位としては、アクリル酸tert-ブチル由来の繰り返し単位、メタクリル酸tert-ブチル由来の繰り返し単位、アクリル酸ｎ-ヘキシル由来の繰り返し単位、メタクリル酸ｎ-ヘキシル由来の繰り返し単位、アクリル酸シクロヘキシル由来の繰り返し単位、メタクリル酸シクロヘキシル由来の繰り返し単位、アクリル酸ベンジル由来の繰り返し単位およびメタクリル酸ベンジル由来の繰り返し単位が好ましく、なかでも、メタクリル酸tert-ブチル由来の繰り返し単位、メタクリル酸ｎ-ヘキシル由来の繰り返し単位、メタクリル酸シクロヘキシル由来の繰り返し単位およびメタクリル酸ベンジル由来の繰り返し単位がより好ましく、そのなかでも、メタクリル酸シクロヘキシル由来の繰り返し単位が特に好ましい。
上述した一般式［１］で示される繰り返し単位と一般式［２］で示される繰り返し単位の好ましい組み合わせとしては、下記の表１で示される組み合わせが挙げられ、本発明にかかる共重合体は、下記の表１で示される繰り返し単位の組み合わせからなるものが好ましく、なかでも、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジメチルアミノ）エチル〕メタクリル酸由来の繰り返し単位とメタクリル酸tert-ブチル由来の繰り返し単位とからなる共重合体、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジメチルアミノ）エチル〕メタクリル酸由来の繰り返し単位とメタクリル酸ｎ-ヘキシル由来の繰り返し単位とからなる共重合体およびＮ-〔２-（カルボキシメチルジメチルアミノ）エチル〕メタクリル酸由来の繰り返し単位とメタクリル酸シクロヘキシル由来の繰り返し単位とからなる共重合体がより好ましく、そのなかでも、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジメチルアミノ）エチル〕メタクリル酸由来の繰り返し単位とメタクリル酸シクロヘキシル由来の繰り返し単位とからなる共重合体が特に好ましい。なお、表中の（メタ）アクリル酸とは、アクリル酸またはメタクリル酸を意味する。
Figure 2017183733
本発明にかかる共重合体は、構成成分として、上述した一般式［１］で示される繰り返し単位と一般式［２］で示される繰り返し単位以外の構成成分Ｚ（繰り返し単位Ｚ）を含んでいてもよいが、本発明にかかる共重合体は、上述した一般式［１］で示される繰り返し単位と一般式［２］で示される繰り返し単位のみからなるものが好ましい。
本発明にかかる共重合体における一般式［１］で示される繰り返し単位と一般式［２］で示される繰り返し単位は、該共重合体中に以下のモル比で含まれていることが望ましい。通常、一般式［１］で示される繰り返し単位１モルに対し、一般式［２］で示される繰り返し単位のモル比が１〜５０モル％である。好ましくは、一般式［１］で示される繰り返し単位１モルに対し、一般式［２］で示される繰り返し単位のモル比が３〜４０モル％である。より好ましくは、一般式［１］で示される繰り返し単位１モルに対し、一般式［２］で示される繰り返し単位のモル比が５〜３０モル％である。一般式［２］で示される繰り返し単位のモル比が１モル％未満の場合には、本発明の非特異的吸着防止剤のブロッキング能が低下するおそれがある。一般式［２］で示される繰り返し単位のモル比が５０モル％を越える場合には、本発明にかかる共重合体の疎水性が高すぎて、本発明の非特異的吸着防止剤のブロッキング能に悪影響を及ぼすおそれがある。
本発明にかかる共重合体の重量平均分子量（Ｍｗ）は、通常１０，０００〜２，０００，０００、好ましくは１５，０００〜１８０，０００、より好ましくは２０，０００〜１５０，０００である。
なお、本発明にかかる共重合体の重量平均分子量（Ｍｗ）は、例えば、ＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィ）により求めればよく、例えば、ＧＰＣに用いられる溶離液の具体例としては、例えば、塩化ナトリウム水溶液、塩化ナトリウム水溶液とメタノールとの混合溶液等が挙げられ、標準試料の具体例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）等が挙げられる。
本発明にかかる共重合体における、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比で表される多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）は、特に限定されず、通常１〜１０、好ましくは１〜５である。
本発明にかかる共重合体は、ランダム共重合体、ブロック共重合体および交互共重合体のいずれであってもよく、なかでもランダム共重合体が好ましい。
上述した本発明にかかる共重合体を製造する方法としては、特に限定されず、例えば、以下に示す方法等が挙げられる。
本発明にかかる共重合体は、上述した一般式［１］で示される繰り返し単位の原料である下記一般式［１Ａ］で示される化合物と、上述した一般式［２］で示される繰り返し単位の原料である下記一般式［２Ａ］で示される化合物と、要すれば構成成分Ｚ（繰り返し単位Ｚ）の原料とを反応（重合）させることにより、製造することができる。
一般式［１Ａ］：
Figure 2017183733
（式中、Ｘ１、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、ｍおよびｎは、上記に同じ。）
一般式［２Ａ］：
Figure 2017183733
（式中、Ｘ２、Ｒ４およびＲ５は、上記に同じ。）
−一般式［１Ａ］で示される化合物の製造方法−
上記一般式［１Ａ］で示される化合物は、市販のものを用いてもよいし、以下のスキームに示す方法によって適宜合成したものを用いてもよい。
Figure 2017183733
（式中、Ｘ３およびＸ４はそれぞれ独立して、ハロゲン原子を表し、Ｘ１、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、ｍおよびｎは、上記に同じ。）
一般式［３］におけるＸ３および一般式［６］におけるＸ４で示されるハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられ、なかでも、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子が好ましく、そのなかでも、塩素原子がより好ましい。
一般式［３］で示されるハロゲン化アクリル誘導体の具体例としては、例えば、塩化アクリル、臭化アクリル、ヨウ化アクリル、塩化メタクリル、臭化メタクリル、ヨウ化メタクリル、塩化２-エチルアクリル、臭化２-エチルアクリル、ヨウ化２-エチルアクリル、塩化２-プロピルアクリル、臭化２-プロピルアクリル、ヨウ化２-プロピルアクリル等が挙げられ、なかでも、塩化アクリル、臭化アクリル、ヨウ化アクリル、塩化メタクリル、臭化メタクリルおよびヨウ化メタクリルが好ましく、そのなかでも、塩化アクリルおよび塩化メタクリルがより好ましく、塩化メタクリルが特に好ましい。なお、一般式［３］で示されるハロゲン化アクリル誘導体は、市販のものを用いてもよいし、自体公知の方法によって適宜合成したものを用いてもよい。
一般式［４］で示される化合物の具体例としては、例えば、ジメチルアミノメタノール、ジエチルアミノメタノール、ジプロピルアミノメタノール、２-（ジメチルアミノ）エタノール、２-（ジエチルアミノ）エタノール、２-（ジプロピルアミノ）エタノール、３-（ジメチルアミノ）プロパン-１-オール、３-（ジエチルアミノ）プロパン-１-オール、３-（ジプロピルアミノ）プロパン-１-オール、４-（ジメチルアミノ）ブタン-１-オール、４-（ジエチルアミノ）ブタン-１-オール、４-（ジプロピルアミノ）ブタン-１-オール、５-（ジメチルアミノ）ペンタン-１-オール、５-（ジエチルアミノ）ペンタン-１-オール、５-（ジプロピルアミノ）ペンタン-１-オール、６-（ジメチルアミノ）ヘキサン-１-オール、６-（ジエチルアミノ）ヘキサン-１-オール、６-（ジプロピルアミノ）ヘキサン-１-オール、２-（ジメチルアミノ）エチルアミン、２-（ジエチルアミノ）エチルアミン、２-（ジプロピルアミノ）エチルアミン等が挙げられ、なかでも、２-（ジメチルアミノ）エタノール、２-（ジエチルアミノ）エタノール、２-（ジプロピルアミノ）エタノール、３-（ジメチルアミノ）プロパン-１-オール、３-（ジエチルアミノ）プロパン-１-オール、３-（ジプロピルアミノ）プロパン-１-オール、４-（ジメチルアミノ）ブタン-１-オール、４-（ジエチルアミノ）ブタン-１-オールおよび４-（ジプロピルアミノ）ブタン-１-オールが好ましく、そのなかでも、２-（ジメチルアミノ）エタノールがより好ましい。なお、一般式［４］で示される化合物は、市販のものを用いてもよいし、自体公知の方法によって適宜合成したものを用いてもよい。
一般式［６］で示される化合物の具体例としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、３-クロロプロピオン酸、３-ブロモプロピオン酸、３-ヨードプロピオン酸、４-クロロ酪酸、４-ブロモ酪酸、４-ヨード酪酸等が挙げられ、なかでも、クロロ酢酸、ブロモ酢酸およびヨード酢酸が好ましく、そのなかでも、クロロ酢酸がより好ましい。なお、一般式［６］で示される化合物は、市販のものを用いてもよいし、自体公知の方法によって適宜合成したものを用いてもよい。
上述したスキームによる一般式［１Ａ］で示される化合物の具体的な製造方法は以下のとおりである。例えば、適当な溶媒中で、上述した一般式［３］で示されるハロゲン化アクリル誘導体と、上述した一般式［４］で示される化合物を塩基存在下で反応させ、一般式［５］で示される化合物を得た後、得られた一般式［５］で示される化合物と上述した一般式［６］で示される化合物とを、必要に応じて塩基の存在下で反応させることにより、一般式［１Ａ］で示される化合物を製造することができる。
一般式［３］で示されるハロゲン化アクリル誘導体と一般式［４］で示される化合物との反応に使用される塩基の具体例としては、例えば、水素化ナトリウム、水素化カリウム等のアルカリ金属水素化物；例えば、ナトリウムメトキシド、カリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムエトキシド、リチウムtert-ブトキシド、ナトリウムtert-ブトキシド、カリウムtert-ブトキシド等のアルカリ金属アルコキシド；例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物；例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム等の炭酸のアルカリ金属塩；例えば、トリエチルアミン、ピリジン、１，８-ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ-７-エン（ＤＢＵ）、１，５-ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ-５-エン（ＤＢＮ）等の３級アミン等が挙げられ、なかでも、例えば、トリエチルアミン、ピリジン、１，８-ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ-７-エン（ＤＢＵ）、１，５-ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ-５-エン（ＤＢＮ）等の３級アミンが好ましく、そのなかでも、トリエチルアミンがより好ましい。なお、上述した塩基は、１種類の塩基を単独で用いてもよいし、２種以上の塩基を組み合わせて用いてもよい。また、上述した塩基は、市販のものを用いればよい。
一般式［５］で示される化合物と一般式［６］で示される化合物との反応に使用される塩基の具体例としては、例えば、水素化ナトリウム、水素化カリウム等のアルカリ金属水素化物；例えば、ナトリウムメトキシド、カリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムエトキシド、リチウムtert-ブトキシド、ナトリウムtert-ブトキシド、カリウムtert-ブトキシド等のアルカリ金属アルコキシド；例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物；例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム等の炭酸のアルカリ金属塩；例えば、トリエチルアミン、ピリジン、１，８-ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ-７-エン（ＤＢＵ）、１，５-ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ-５-エン（ＤＢＮ）等の３級アミン等が挙げられ、なかでも、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物が好ましく、そのなかでも、水酸化カリウムがより好ましい。なお、上述した塩基は、１種類の塩基を単独で用いてもよいし、２種以上の塩基を組み合わせて用いてもよい。また、上述した塩基は、市販のものを用いればよい。
溶媒は、一般式［３］で示されるハロゲン化アクリル誘導体、一般式［４］で示される化合物、一般式［５］で示される化合物および一般式［６］で示される化合物と反応せず、かつこれらの反応を阻害しないものであれば特に限定されない。このような溶媒の具体例としては、例えば、ｎ-ヘキサン、シクロヘキサン、ｎ-ヘプタン、ｎ-オクタン、イソオクタン等の脂肪族炭化水素系溶媒；例えば、ジクロロメタン、トリクロロメタン（クロロホルム）、テトラクロロメタン（四塩化炭素）等のハロゲン化脂肪族炭化水素系溶媒；例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒；例えば、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチル-tert-ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、２-メチルテトラヒドロフラン、１，４-ジオキサン等のエーテル系溶媒；例えば、エチレングリコールジメチルエーテル、プロピレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、プロピレングリコールジエチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジプロピレングリコールジメチルエーテル、ジプロピレングリコールジエチルエーテル等のグリコールエーテル系溶媒；例えば、エチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、ジエチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、ジエチレングリコールモノブチルエーテルアセテート、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、プロピレングリコールモノエチルエーテルアセテート、ジプロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、ジプロピレングリコールモノエチルエーテルアセテート等のグリコールエーテルアセテート系溶媒；例えば、２-プロパノン（アセトン）、２-ブタノン（エチルメチルケトン）、４-メチル-２-ペンタノン（メチルイソブチルケトン）等のケトン系溶媒；例えば、酢酸エチル、酢酸-ｎ-プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸イソブチル、酢酸-sec-ブチル、酢酸-tert-ブチル、酪酸エチル、酪酸イソアミル等のエステル系溶媒；例えば、Ｎ，Ｎ-ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ-ジメチルアセトアミド、１-メチル-２-ピロリジノン（Ｎ-メチルピロリドン）、１，３-ジメチル-２-イミダゾリジノン（ジメチルエチレン尿素）等のアミド系溶媒等が挙げられる。なお、上述した溶媒は、１種類の溶媒を単独で用いてもよいし、２種以上の溶媒を組み合わせて用いてもよい。また、上述した溶媒は、市販のものを用いればよい。
一般式［３］で示されるハロゲン化アクリル誘導体の使用量としては、特に制限されず、例えば、一般式［４］で示される化合物のモル数に対して、通常０．８〜１０当量、好ましくは０．９〜５当量、より好ましくは１〜２当量である。
一般式［６］で示される化合物の使用量としては、特に制限されず、例えば、一般式［５］で示される化合物のモル数に対して、通常０．８〜１０当量、好ましくは０．９〜５当量、より好ましくは１〜２当量である。
一般式［３］で示されるハロゲン化アクリル誘導体と一般式［４］で示される化合物との反応に使用される塩基の使用量としては、特に制限されず、例えば、一般式［３］で示されるハロゲン化アクリル誘導体のモル数に対して、通常０．８〜３当量、好ましくは０．９〜２当量、より好ましくは０．９〜１．２当量である。
一般式［５］で示される化合物と一般式［６］で示される化合物との反応に使用される塩基の使用量としては、特に制限されず、例えば、一般式［６］で示される化合物のモル数に対して、通常０．８〜３当量、好ましくは０．９〜２当量、より好ましくは０．９〜１．２当量である。
上述した溶媒の使用量としては、特に制限されず、例えば、一般式［３］で示されるハロゲン化アクリル誘導体と一般式［４］で示される化合物との反応においては、一般式［３］で示されるハロゲン化アクリル誘導体のモル数に対して、通常０．０１〜５０Ｌ、好ましくは０．１〜１０Ｌであり、例えば、一般式［５］で示される化合物と一般式［６］で示される化合物との反応においては、一般式［６］で示される化合物のモル数に対して、通常０．０１〜５０Ｌ、好ましくは０．１〜１０Ｌである。
一般式［３］で示されるハロゲン化アクリル誘導体と一般式［４］で示される化合物との反応における反応温度は、一般式［３］で示されるハロゲン化アクリル誘導体と一般式［４］で示される化合物とが効率よく反応し、一般式［５］で示される化合物が収率よく得られる温度に設定することが望ましい。具体的には、例えば、通常０〜１００℃、好ましくは２０〜６０℃である。
一般式［５］で示される化合物と一般式［６］で示される化合物との反応における反応温度は、一般式［５］で示される化合物と一般式［６］で示される化合物とが効率よく反応し、一般式［１Ａ］で示される化合物が収率よく得られる温度に設定することが望ましい。具体的には、例えば、通常０〜２００℃、好ましくは２０〜１５０℃である。
上述したスキームで表される一連の反応における反応時の圧力は、一連の反応が滞りなく実施されれば特に制限されず、例えば、常圧で一連の反応を行えばよい。
一般式［３］で示されるハロゲン化アクリル誘導体と一般式［４］で示される化合物との反応における反応時間は、一般式［３］で示されるハロゲン化アクリル誘導体の使用量、塩基の種類およびその使用量、反応温度等にもよるが、例えば、通常０．１〜２４時間、好ましくは０．２〜１２時間である。
一般式［５］で示される化合物と一般式［６］で示される化合物との反応における反応時間は、一般式［６］で示される化合物の使用量、塩基の種類およびその使用量、反応温度等にもよるが、例えば、通常０．１〜４８時間、好ましくは０．２〜２４時間である。
上述したスキームにおいて、合成中間体の一般式［５］で示される化合物および目的物の一般式［１Ａ］で示される化合物は、通常この分野で行われる一般的な後処理方法および精製方法により単離すればよい。例えば、抽出操作等の後処理方法、再結晶、蒸留、カラムクロマトグラフィー等の精製方法等が挙げられる。
このようにして得られる一般式［５］で示される化合物の具体例としては、例えば、Ｎ-〔２-（ジメチルアミノ）エチル〕アクリル酸、Ｎ-〔２-（ジメチルアミノ）エチル〕メタクリル酸、Ｎ-〔２-（ジエチルアミノ）エチル〕アクリル酸、Ｎ-〔２-（ジエチルアミノ）エチル〕メタクリル酸、Ｎ-〔２-（ジプロピルアミノ）エチル〕アクリル酸、Ｎ-〔２-（ジプロピルアミノ）エチル〕メタクリル酸、Ｎ-〔２-（ジメチルアミノ）プロピル〕アクリル酸、Ｎ-〔２-（ジメチルアミノ）プロピル〕メタクリル酸、Ｎ-〔２-（ジメチルアミノ）ブチル〕アクリル酸、Ｎ-〔２-（ジメチルアミノ）ブチル〕メタクリル酸、Ｎ-〔２-（ジエチルアミノ）プロピル〕アクリル酸、Ｎ-〔２-（ジエチルアミノ）プロピル〕メタクリル酸、Ｎ-〔２-（ジエチルアミノ）ブチル〕アクリル酸、Ｎ-〔２-（ジエチルアミノ）ブチル〕メタクリル酸、Ｎ-〔２-（ジプロピルアミノ）プロピル〕アクリル酸、Ｎ-〔２-（ジプロピルアミノ）プロピル〕メタクリル酸、Ｎ-〔２-（ジプロピルアミノ）ブチル〕アクリル酸、Ｎ-〔２-（ジプロピルアミノ）ブチル〕メタクリル酸等が挙げられる。なお、一般式［５］で示される化合物が市販されている場合には、市販のものを用いてもよい。
また、一般式［１Ａ］で示される化合物の具体例としては、例えば、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジメチルアミノ）エチル〕アクリル酸、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジメチルアミノ）エチル〕メタクリル酸、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジエチルアミノ）エチル〕アクリル酸、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジエチルアミノ）エチル〕メタクリル酸、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジプロピルアミノ）エチル〕アクリル酸、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジプロピルアミノ）エチル〕メタクリル酸、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジメチルアミノ）プロピル〕アクリル酸、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジメチルアミノ）プロピル〕メタクリル酸、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジメチルアミノ）ブチル〕アクリル酸、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジメチルアミノ）ブチル〕メタクリル酸、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジエチルアミノ）プロピル〕アクリル酸、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジエチルアミノ）プロピル〕メタクリル酸、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジエチルアミノ）ブチル〕アクリル酸、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジエチルアミノ）ブチル〕メタクリル酸、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジプロピルアミノ）プロピル〕アクリル酸、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジプロピルアミノ）プロピル〕メタクリル酸、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジプロピルアミノ）ブチル〕アクリル酸、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジプロピルアミノ）ブチル〕メタクリル酸等が挙げられる。なお、一般式［１Ａ］で示される化合物が市販されている場合には、市販のものを用いてもよい。
上述した一般式［２］で示される繰り返し単位の原料である上記一般式［２Ａ］で示される化合物は、市販のものを用いてもよいし、自体公知の方法によって適宜合成したものを用いてもよい。
このような一般式［２Ａ］で示される化合物の具体例としては、例えば、アクリル酸ｎ-ブチル、メタクリル酸ｎ-ブチル、アクリル酸イソブチル、メタクリル酸イソブチル、アクリル酸sec-ブチル、メタクリル酸sec-ブチル、アクリル酸tert-ブチル、メタクリル酸tert-ブチル、アクリル酸シクロブチル、メタクリル酸シクロブチル、アクリル酸ｎ-ペンチル、メタクリル酸ｎ-ペンチル、アクリル酸イソペンチル、メタクリル酸イソペンチル、アクリル酸sec-ペンチル、メタクリル酸sec-ペンチル、アクリル酸tert-ペンチル、メタクリル酸tert-ペンチル、アクリル酸ネオペンチル、メタクリル酸ネオペンチル、アクリル酸２-メチルブチル、メタクリル酸２-メチルブチル、アクリル酸１，２-ジメチルプロピル、メタクリル酸１，２-ジメチルプロピル、アクリル酸１-エチルプロピル、メタクリル酸１-エチルプロピル、アクリル酸シクロペンチル、メタクリル酸シクロペンチル、アクリル酸ｎ-ヘキシル、メタクリル酸ｎ-ヘキシル、アクリル酸イソヘキシル、メタクリル酸イソヘキシル、アクリル酸sec-ヘキシル、メタクリル酸sec-ヘキシル、アクリル酸tert-ヘキシル、メタクリル酸tert-ヘキシル、アクリル酸ネオヘキシル、メタクリル酸ネオヘキシル、アクリル酸２-メチルペンチル、メタクリル酸２-メチルペンチル、アクリル酸１，２-ジメチルブチル、メタクリル酸１，２-ジメチルブチル、アクリル酸２，３-ジメチルブチル、メタクリル酸２，３-ジメチルブチル、アクリル酸１-エチルブチル、メタクリル酸１-エチルブチル、アクリル酸シクロヘキシル、メタクリル酸シクロヘキシル等のアクリル酸またはメタクリル酸のアルキルエステル；例えば、アクリル酸ベンジル、メタクリル酸ベンジル、アクリル酸フェネチル、メタクリル酸フェネチル、アクリル酸メチルベンジル、メタクリル酸メチルベンジル、アクリル酸フェニルプロピル、メタクリル酸フェニルプロピル、アクリル酸１-メチルフェニルエチル、メタクリル酸１-メチルフェニルエチル等のアクリル酸またはメタクリル酸のアリールアルキルエステルが挙げられる。
−本発明にかかる共重合体の製造方法−
本発明にかかる共重合体は、上述した一般式［１Ａ］で示される化合物と、上述した一般式［２Ａ］で示される化合物と、要すれば構成成分Ｚ（繰り返し単位Ｚ）の原料とを不活性ガス雰囲気下、溶媒中で攪拌し、重合開始剤を用いて重合させることにより、製造することができる。
不活性ガス雰囲気を得るための不活性ガスとしては、例えば、窒素ガス、アルゴンガス等が挙げられる。
溶媒は、一般式［１Ａ］で示される化合物、一般式［２Ａ］で示される化合物および要すれば構成成分Ｚ（繰り返し単位Ｚ）の原料と反応せず、かつこれらの重合反応を阻害しないものであれば特に限定されない。このような溶媒の具体例としては、例えば、蒸留水、脱イオン水等の精製水、例えば、超純水等の水類；例えば、ｎ-ヘキサン、シクロヘキサン、ｎ-ヘプタン、ｎ-オクタン、イソオクタン等の脂肪族炭化水素系溶媒；例えば、ジクロロメタン、トリクロロメタン（クロロホルム）、テトラクロロメタン（四塩化炭素）等のハロゲン化脂肪族炭化水素系溶媒；例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒；例えば、メタノール、エタノール、ｎ-プロパノール、イソプロパノール、ｎ-ブタノール、tert-ブタノール等のアルコール系溶媒；例えば、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチル-tert-ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、２-メチルテトラヒドロフラン、１，４-ジオキサン等のエーテル系溶媒；例えば、エチレングリコールジメチルエーテル、プロピレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、プロピレングリコールジエチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジプロピレングリコールジメチルエーテル、ジプロピレングリコールジエチルエーテル等のグリコールエーテル系溶媒；例えば、エチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、ジエチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、ジエチレングリコールモノブチルエーテルアセテート、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、プロピレングリコールモノエチルエーテルアセテート、ジプロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、ジプロピレングリコールモノエチルエーテルアセテート等のグリコールエーテルアセテート系溶媒；例えば、２-プロパノン（アセトン）、２-ブタノン（エチルメチルケトン）、４-メチル-２-ペンタノン（メチルイソブチルケトン）等のケトン系溶媒；例えば、酢酸エチル、酢酸-ｎ-プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸イソブチル、酢酸-sec-ブチル、酢酸-tert-ブチル、酪酸エチル、酪酸イソアミル等のエステル系溶媒；例えば、Ｎ，Ｎ-ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ-ジメチルアセトアミド、１-メチル-２-ピロリジノン（Ｎ-メチルピロリドン）、１，３-ジメチル-２-イミダゾリジノン（ジメチルエチレン尿素）等のアミド系溶媒等が挙げられる。なお、上述した溶媒は、１種類の溶媒を単独で用いてもよいし、２種以上の溶媒を組み合わせて用いてもよい。また、上述した溶媒は、市販のものを用いればよい。
上述した溶媒の使用量は、実用性の観点および経済性の観点から、一般式［１Ａ］で示される化合物１００重量部に対して、通常１００〜５０００ｍＬ、好ましくは３００〜３０００ｍＬである。
重合開始剤は、通常この分野で用いられる重合開始剤であれば特に制限されない。このような重合開始剤の具体例としては、例えば、過硫酸、過硫酸ナトリウム、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、ペルオキソ二硫酸、ペルオキソ二硫酸ナトリウム、ペルオキソ二硫酸カリウム、ペルオキソ二硫酸アンモニウム等の過硫酸類；例えば、過酸化水素、tert-ブチルハイドロパーオキシド等のハイドロパーオキシド類；例えば、ジ（４-tert-ブチルシクロヘキシル）パーオキシジカーボネート等のパーオキシジカーボネート類；例えば、２，２'-アゾビス（２-メチルプロピオニトリル）、２，２'-アゾビス（２-メチルブチロニトリル）、２，２'-アゾビス（２，４-ジメチルバレロニトリル）、２，２'-アゾビス（Ｎ-ブチル-２-メチルプロピオンアミド）等のアゾ系化合物類等のラジカル重合開始剤が挙げられる。なお、上述した重合開始剤は、市販のものを用いてもよいし、自体公知の方法によって適宜合成したものを用いてもよい。
上述した重合開始剤の使用量は、一般式［１Ａ］で示される化合物のモル数に対して、通常０．００１〜０．０５モル、好ましくは０．００２〜０．０３モルである。重合開始剤の使用量が少なすぎると、反応速度が遅くなるため経済的でなくなるおそれがある。また、重合開始剤の使用量が多すぎると、重合反応が急激に進行し、重合反応の制御が困難になるおそれがある。
本発明にかかる共重合体を製造する際の重合反応は、加熱条件下で行うことが望ましい。
重合反応時の反応温度は、例えば、通常４０〜１００℃、好ましくは４５〜９０℃、より好ましくは５０〜８０℃である。反応温度が４０℃未満の場合には、反応溶液の粘度が上昇し、均一に攪拌することが困難になるおそれがある。また、反応温度が１００℃を超える場合には、重合反応が急激に進行し、重合反応の制御が困難になるおそれがある。反応時間は、反応温度にもよるが、通常０．１〜６時間である。
本発明にかかる共重合体を製造する際の後処理方法および精製方法は、通常この分野で行われる一般的な方法でよい。例えば、重合終了後、必要に応じて反応溶液を冷却し、溶液中に析出した共重合体を濾取し、濾取した共重合体を乾燥する方法等を採用することによって、本発明にかかる共重合体を得ることができる。また、必要に応じて、反応溶液または濾取した共重合体をアセトン等の適当な沈殿剤中に投入して共重合体を精製してもよい。
このようにして得られた本発明にかかる共重合体は、リン酸基を含まないため、抗リン酸化タンパク質（認識）抗体を用いてウエスタンブロットを行う場合でも、抗リン酸化タンパク質（認識）抗体が本発明にかかる共重合体を誤認識しない。故に、本発明にかかる共重合体を含有する本発明の非特異的吸着防止剤は、抗リン酸化タンパク質（認識）抗体を用いるウエスタンブロットのブロッキングにも用いることができる。
本発明の非特異的吸着防止剤は、上述した本発明にかかる共重合体１種を含有するものであってもよいし、本発明にかかる共重合体を２種以上含有するものであってもよい。また、本発明の非特異的吸着防止剤は、通常水または緩衝液等に溶解または懸濁（分散）させて、溶液状態で使用される。
上述した水または緩衝液の具体例としては、例えば、精製水等の水；炭酸緩衝液；酢酸緩衝液；クエン酸緩衝液；酒石酸緩衝液；ホウ酸緩衝液；ベロナール緩衝液；例えば、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等のリン酸系緩衝液；例えば、トリス塩酸緩衝液、ＴＥ緩衝液、ＴＡＥ緩衝液、ＴＢＥ緩衝液、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）等のトリス系緩衝液；例えば、２-（Ｎ-モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、３-（Ｎ-モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液、２-［４-（２-ヒドロキシエチル）-１-ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、Ｎ，Ｎ-ビス（２-ヒドロキシエチル）グリシン（Bicine）緩衝液等のグッド緩衝液等の緩衝液が挙げられる。
本発明の非特異的吸着防止剤を含む溶液中には、その効果を妨げない範囲で、例えば、トレハロース等の糖類；例えば、塩化ナトリウム等の塩類；例えば、非イオン性界面活性剤等の界面活性剤；例えば、アジ化ナトリウム、チアゾリン系化合物等の防腐剤；例えば、ポリビニルピロリドン、ポリ（１-ビニルピロリドン-コ-ビニルアセテート）等の補助剤；例えば、シリコーン系消泡剤等の消泡剤；例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等のタンパク質成分；例えば、エタノール等のアルコール類、グリセロール等のポリオール類等の補助成分等を含有させてもよい。
−本発明のウエスタンブロット法用試薬−
本発明のウエスタンブロット法用試薬は、上記一般式［１］で示される繰り返し単位と上記一般式［２］で示される繰り返し単位を有する共重合体を含有する非特異的吸着防止剤を含有することを特徴とするものである。
本発明のウエスタンブロット法用試薬は、本発明の非特異的吸着防止剤（本発明にかかる共重合体）を溶解または懸濁（分散）させるための水または緩衝液等を含んでいてもよい。なお、水または緩衝液の具体例としては、本発明の非特異的吸着防止剤に含まれる（添加される）水または緩衝液の具体例と同様のものが挙げられる。
本発明のウエスタンブロット法用試薬において、本発明の非特異的吸着防止剤（本発明にかかる共重合体）は、通常０．０５〜１０ｗ／ｖ％（重量／体積％）、好ましくは０．１〜７．３ｗ／ｖ％、より好ましくは０．１５〜４．５ｗ／ｖ％となるように、水または緩衝液に溶解または懸濁（分散）させて用いられる。また、本発明のウエスタンブロット法用試薬のｐＨとしては、通常５．６〜９．２、好ましくは５．８〜９．０である。
本発明のウエスタンブロット法用試薬は、基材に対してブロッキング処理を行う際には、該試薬をそのまま使用してもよいし、水または緩衝液等で希釈して使用してもよい。例えば、基材に対してブロッキング処理を行う際の本発明の非特異的吸着防止剤（本発明にかかる共重合体）の濃度（終濃度）が、通常０．０５〜５．０ｗ／ｖ％（重量／体積％）、好ましくは０．１〜４．８ｗ／ｖ％、より好ましくは０．１５〜４．５ｗ／ｖ％となるように、通常１〜２００倍、好ましくは１〜７５倍に希釈して用いればよい。なお、希釈液として用いられる水または緩衝液の具体例としては、本発明の非特異的吸着防止剤に含まれる（添加される）水または緩衝液の具体例と同様のものが挙げられる。
本発明のウエスタンブロット法用試薬は、本発明の非特異的吸着防止剤に含まれていてもよい成分として挙げられる、糖類、塩類、界面活性剤、防腐剤、補助剤、タンパク質成分、消泡剤等を含有していてもよい。また、その濃度範囲は、通常この分野で用いられる濃度範囲と上述した希釈倍率を勘案して適宜設定すればよい。
−本発明のブロッキング方法−
本発明のブロッキング方法は、ウエスタンブロット法において、基材に対して、上記一般式［１］で示される繰り返し単位と上記一般式［２］で示される繰り返し単位を有する共重合体を含有する非特異的吸着防止剤でブロッキング処理を行うことを特徴とするものである。
本発明のブロッキング方法は、ウエスタンブロット法において、SDS-PAGE等の電気泳動によりタンパク質またはポリペプチド等を分離した後のゲル中のタンパク質またはポリペプチド等を基材に転写（移動・固定化）させた後の基材に対して行う方法であり、一次抗体、二次抗体または／および余分なタンパク質等の非特異吸着を抑制するために行うものである。
本発明の非特異的吸着防止剤（本発明のウエスタンブロット法用試薬）を用いてブロッキング処理を行う際には、通常、本発明の非特異的吸着防止剤を水または緩衝液等に溶解または懸濁（分散）させた溶液状態のもの（以下、本発明にかかるブロッキング溶液と略記する場合がある。）を用いるのが一般的である。すなわち、本発明の非特異的吸着防止剤が、本発明にかかる共重合体からなる固体状態のものである場合には、ブロッキング処理時に、水または緩衝液で本発明の非特異的吸着防止剤（本発明にかかる共重合体）を溶解または懸濁（分散）させて溶液状態としたもの（本発明にかかるブロッキング溶液）を用いればよい。また、本発明の非特異的吸着防止剤が、本発明にかかる共重合体と水または緩衝液等を含む溶液状態のもの（本発明にかかるブロッキング溶液）である場合には、そのまま、あるいは水または緩衝液等で更に希釈して所望の濃度に調整したものを用いればよい。
上述した水または緩衝液の具体例としては、本発明の非特異的吸着防止剤に含まれる（添加される）水または緩衝液の具体例と同様のものが挙げられる。
本発明のブロッキング方法において、ブロッキング処理を行う際の本発明の非特異的吸着防止剤（本発明にかかる共重合体）の濃度（終濃度）は、通常０．０５〜５．０ｗ／ｖ％（重量／体積％）、好ましくは０．１〜４．８ｗ／ｖ％、より好ましくは０．１５〜４．５ｗ／ｖ％である。
本発明のブロッキング方法において、ブロッキング処理を行う際の本発明にかかるブロッキング溶液のｐＨとしては、通常５．６〜９．２、好ましくは５．８〜９．０である。
本発明のブロッキング方法において、本発明の非特異的吸着防止剤を用いて基材をブロッキング処理する方法としては、通常この分野で行われる方法であれば特に制限されず、例えば、基材を本発明にかかるブロッキング溶液に浸漬してインキュベートする方法等が挙げられる。インキュベートにあたっては、基材を静置してもよいし、振とうしてもよい。
本発明にかかる基材としては、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜、ニトロセルロース膜等の膜状の担体が挙げられ、なかでも、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜が好ましい。ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜を、本発明の非特異的吸着防止剤を用いてブロッキング処理することにより、測定対象物質（タンパク質またはポリペプチド等）を感度よく検出および測定することができる。
インキュベート温度は、通常この分野で行われる温度であれば特に制限されず、例えば、０〜７０℃が挙げられ、なかでも、タンパク質またはポリペプチド等の測定対象物質の免疫活性に対して影響の少ない４〜３７℃が好ましい。
インキュベート時間は、本発明にかかるブロッキング溶液の濃度、インキュベート時間等にもよるが、例えば、３分〜６時間が挙げられ、なかでも、十分な非特異的吸着防止効果が得られる１０分〜２時間が好ましい。
ブロッキング処理方法の具体例として、基材を本発明にかかるブロッキング溶液に浸漬してインキュベートする方法を述べたが、例えば、本発明にかかるブロッキング溶液を基材に塗布する方法等を採用してもよい。
ブロッキング処理を行った後の、余分な本発明の非特異的吸着防止剤（本発明にかかるブロッキング溶液）は、通常この分野で行われる一般的な方法により除去すればよい。
上述した方法でブロッキング処理を行うことにより、本発明の非特異的吸着防止剤でブロッキング処理された基材を得ることができる。このような基材をウエスタンブロット法に適用することにより、例えば、抗体、酵素、受容体等のタンパク質またはポリペプチドのほか、組換えタンパク質、リン酸化タンパク質、糖タンパク質等の種々のタンパク質またはポリペプチドを高感度かつ精度よく検出および測定することができる。
なお、ウエスタンブロット法において、例えば、タンパク質またはポリペプチド等の電気泳動および転写（移動・固定化）、一次抗体反応、例えば、酵素標識抗体、蛍光標識抗体等を用いた二次抗体反応、（発光）検出等の本発明のブロッキング方法以外の手法は、通常この分野で一般的に行われる方法を適宜採用すればよく、また、これらに用いられる試薬等は自体公知のものを用いればよい。
以下、実施例および比較例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例によって何ら限定されるものではない。
合成例１ Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジメチルアミノ）エチル〕メタクリル酸（一般式［１Ａ］で示される化合物）の合成
水酸化カリウム２９７ｇ（４．５ｍｏｌ）をエタノール１．６Ｌに溶解させ、クロロ酢酸４２６ｇ（４．５ｍｏｌ；和光純薬工業株式会社製）を添加した後、室温で２時間攪拌した。次いで、析出した結晶を濾取し、イソプロパノールで洗浄した。得られた結晶をイソプロパノール１Ｌに懸濁させ、Ｎ-〔２-（ジメチルアミノ）エチル〕メタクリル酸４７５ｇ（３．０ｍｏｌ；和光純薬工業株式会社製）を添加した後、還流下で１２時間攪拌した。反応終了後、反応液中の不溶物を濾別し、該不溶物をイソプロパノールで洗浄した。濾液と洗浄液を合わせた溶液を減圧濃縮した後、得られた残渣にアセトンを投入し、析出した結晶を濾取して減圧乾燥することにより、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジメチルアミノ）エチル〕メタクリル酸４２０ｇ（１．９ｍｏｌ；収率６３％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．８９（３Ｈ，ｓ），３．１８（６Ｈ，ｓ），３．６３（２Ｈ，ｓ），３．９８（２Ｈ，ｔ），４．４８（２Ｈ，ｔ），５．７３（１Ｈ，ｓ），６．０９（１Ｈ，ｓ）．
合成例２ Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジメチルアミノ）エチル〕メタクリル酸由来の繰り返し単位／メタクリル酸シクロヘキシル由来の繰り返し単位からなる共重合体（本発明にかかる共重合体（１））の合成
合成例１で得られたＮ-〔２-（カルボキシメチルジメチルアミノ）エチル〕メタクリル酸３３０ｇ（１．５ｍｏｌ）とメタクリル酸シクロへキシル７５．６ｇ（０．４５ｍｏｌ；和光純薬工業株式会社製）をイオン交換水６００ｍＬとメタノール２１００ｍＬの混合溶媒に溶解させ、反応容器をアルゴンガスで置換し、アルゴンガス雰囲気条件下とした。この溶液に、１０％ペルオキソ二硫酸アンモニウム溶液（０．０１７ｍｏｌ；和光純薬工業株式会社製）を添加した後、６０℃で１時間攪拌した。反応終了後、反応液をアセトンに投入し、析出した結晶を濾取して減圧乾燥することにより、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジメチルアミノ）エチル〕メタクリル酸由来の繰り返し単位／メタクリル酸シクロヘキシル由来の繰り返し単位からなる共重合体（本発明にかかる共重合体（１））３８０ｇを得た。
得られた共重合体の物性は、ＧＰＣにより、標準試料としてポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）を用いて、以下の条件で評価した。その結果、得られた共重合体の重量平均分子量は６２，６４５、数平均分子量は３０，７８４、多分散度は２．０３５であった。
カラム：SB-806M-HQ、８．０ｍｍ×３００ｍｍ（Shodex社製）
溶離液：１００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液／メタノール＝４／１
インジェクション量：溶離液に対し共重合体１重量％
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、３５℃
装置：HLC-8320GPC（東ソー）
検出器：Refracitive Index（東ソー）
合成例２で得られた本発明にかかる共重合体（１）における繰り返し単位のモル数および該共重合体（１）の物性値を表２に示す。
合成例３〜１３ 一般式［１］で示される繰り返し単位／一般式［２］で示される繰り返し単位からなる共重合体（２）〜（１２）（本発明にかかる共重合体（２）〜（１２））の合成
合成例３〜１３では、表２に記載の繰り返し単位の原料を、各繰り返し単位のモル数が表２となるように使用した以外は、合成例２と同様の方法に準じて、一般式［１］で示される繰り返し単位／一般式［２］で示される繰り返し単位からなる共重合体（２）〜（１２）（本発明にかかる共重合体（２）〜（１２））を得た。合成例３〜１３で得られた本発明にかかる共重合体（２）〜（１２）における各繰り返し単位の名称および各繰り返し単位のモル数、ならびに該共重合体（２）〜（１２）の物性値を表２に示す。
合成例１４ 一般式［１］で示される繰り返し単位からなる重合体（１）（比較用の重合体（１））の合成
合成例１４では、表２に記載の繰り返し単位の原料を、該繰り返し単位のモル数が表２となるように使用した以外は、合成例２と同様の方法に準じて、一般式［１］で示される繰り返し単位からなる重合体（１）（比較用の重合体（１））を得た。合成例１４で得られた比較用の重合体（１）における繰り返し単位の名称および該繰り返し単位のモル数、ならびに該重合体（１）の物性値を表２に示す。
Figure 2017183733
実施例１ ウエスタンブロット法における非特異的吸着防止剤（ブロッキング溶液）として、本発明にかかる共重合体（２）（本発明の非特異的吸着防止剤）を用いた場合のＳ／Ｎ比と、スキムミルクを用いた場合のＳ／Ｎ比との比較
抗原には、Amino-terminal FLAG-BAP Fusion Protein（Ｎ末端にFLAGタグ配列：DYKDDDDK配列を有する；SIGMA-ALDRICH社製）（以下、FLAG-BAPと略記する場合がある。）を用いた。
FLAG-BAPタンパク質溶液を試料用緩衝液（３-メルカプト-１，２-プロパンジオール含有）（×２）（和光純薬工業株式会社製）と混合して加熱し、FLAG-BAPタンパク質をＳＤＳ化して、１レーンあたりのFLAG-BAPのロード量が１０ｎｇ、５ｎｇ、２．５ｎｇとなるように上記試料用緩衝液で希釈した。
それぞれのFLAG-BAPおよびタンパク質サイズマーカーをプレキャストゲルSuper Sep Ace １０-２０％（和光純薬工業株式会社製）に供し、２５ｍＡで、６０分間電気泳動を行った。その後、電気泳動後のゲルをiBlotドライブロッティングシステム（Life technologies社製）およびiBlot Transfer Stack, PVDF Regularを用いてプログラム３でポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写し、転写後のＰＶＤＦ膜をＴＢＳでリンスした。
次いで、（Ａ）（非特異的吸着防止剤を含まない）２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、（Ｂ）４ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体（２）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、および（Ｃ）５ｗ／ｖ％のスキムミルクを含有するＴＢＳ-Ｔ（０．１ｗ／ｖ％のTween-20を含有）溶液の３種類のブロッキング溶液をそれぞれ用いて、１時間オービタルシェーカーで振とうさせながらＰＶＤＦ膜をインキュベートし、ブロッキング処理を行った。
ブロッキング処理後の３種類のＰＶＤＦ膜をＴＢＳ-Ｔで洗浄し、Anti DYKDDDDK tag, Monoclonal Antibody（０．４〜０．６ｍｇ／ｍＬ；和光純薬工業株式会社製）をＴＢＳ-Ｔに１５００倍に希釈した溶液を用い、低温室で終夜反応させて一次抗体反応を行った。
一次抗体反応後の３種類のＰＶＤＦ膜をＴＢＳ-Ｔで洗浄し、Anti Mouse IgG(H+L), Rabbit, IgG Whole, Peroxidase Conjugated（１．０〜１．２ｍｇ／ｍＬ；和光純薬工業株式会社製）をＴＢＳ-Ｔに１５０００倍に希釈した溶液を用い、室温で４時間反応させて二次抗体反応を行った。
二次抗体反応後の３種類のＰＶＤＦ膜をＴＢＳ-Ｔで洗浄し、該ＰＶＤＦ膜を発光検出試薬イムノスター ゼータ（和光純薬工業株式会社製）と反応させ、ルミノ・イメージアナライザー、LAS-4000（富士フイルム株式会社製）により発光像を得た。得られた画像を画像解析ソフトMulti Gauge（富士フイルム株式会社製）により数値化し、各々の膜についてバックグラウンド（Ｎ）およびシグナル（Ｓ）から、Ｓ／Ｎ比を求めた。
その結果を表３および図１に示す。
Figure 2017183733
表３および図１の結果から明らかなように、（Ａ）非特異的吸着防止剤を用いない場合では、抗体の非特異的吸着により膜一面にシグナルが出てしまい、ブロッキング効果が得られなかった。一方、（Ｂ）非特異的吸着防止剤として本発明にかかる共重合体（２）（本発明の非特異的吸着防止剤）を用いた場合には、（Ｃ）従来の非特異的吸着防止剤であるスキムミルクを用いた場合と比べて、Ｓ／Ｎ比が良好で（大きく）、より高い感度での検出が可能であった。この結果から、本発明の非特異的吸着防止剤は、従来の非特異的吸着防止剤であるスキムミルクよりも、ブロッキング能の高い非特異的吸着防止剤であることが分かった。
実施例２ ウエスタンブロット法における非特異的吸着防止剤（ブロッキング溶液）として、本発明にかかる共重合体（２）（本発明の非特異的吸着防止剤）を用いた場合のＳ／Ｎ比と、単独重合体（ホモポリマー）を用いた場合のＳ／Ｎ比との比較
単独重合体（ホモポリマー）として、メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）の単独重合体であるＰＭＰＣ（Pure ＭＰＣ）（重量平均分子量８４，１０６；日油株式会社製）と、合成例１４で得られたＮ-〔２-（カルボキシメチルジメチルアミノ）エチル〕メタクリル酸由来の繰り返し単位のみからなる比較用の重合体（１）を使用した。
実施例１と同様に、FLAG-BAP；１０ｎｇ、５ｎｇ、２．５ｎｇをSDS-PAGEにより分離および転写した後、（Ａ）４ｗ／ｖ％のＰＭＰＣを含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、（Ｂ）４ｗ／ｖ％の比較用の重合体（１）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、（Ｃ）５ｗ／ｖ％のスキムミルクを含有するＴＢＳ-Ｔ（０．１ｗ／ｖ％のTween-20を含有）溶液、および（Ｄ）４ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体（２）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）の４種類のブロッキング溶液をそれぞれ用いて、１時間オービタルシェーカーで振とうさせながらＰＶＤＦ膜をインキュベートし、ブロッキング処理を行った。
ブロッキング処理後の４種類のＰＶＤＦ膜をＴＢＳ-Ｔで洗浄した後、一次抗体反応、二次抗体反応および発光イメージの検出については実施例１と同様に行った。４種類のＰＶＤＦ膜に基づいて得られた画像を実施例１と同様に画像解析ソフトにより数値化し、各々の膜についてバックグラウンド（Ｎ）およびシグナル（Ｓ）から、Ｓ／Ｎ比を求めた。
その結果を表４および図２に示す。
Figure 2017183733
表４および図２の結果から明らかなように、単独重合体（ホモポリマー）である（Ａ）ＰＭＰＣを非特異的吸着防止剤として用いた場合および（Ｂ）比較用の重合体（１）を非特異的吸着防止剤として用いた場合には、抗体の非特異的吸着によりバックグラウンド・シグナルが強く出てしまい、シグナルを判別することができなかった。一方、（Ｄ）非特異的吸着防止剤として本発明にかかる共重合体（２）（本発明の非特異的吸着防止剤）を用いた場合には、（Ｃ）従来の非特異的吸着防止剤であるスキムミルクを用いた場合と比べて、Ｓ／Ｎ比が良好で（大きく）、より高い感度での検出が可能であった。この結果から、単独重合体（ホモポリマー）ではブロッキング効果が認められず、共重合体（コポリマー）でなければブロッキング効果が得られないことが分かった。
実施例３ ウエスタンブロット法における非特異的吸着防止剤（ブロッキング溶液）として、本発明にかかる共重合体（２）〜（６）（本発明の非特異的吸着防止剤）を用いた場合のＳ／Ｎ比と、スキムミルクを用いた場合のＳ／Ｎ比との比較
実施例１と同様に、FLAG-BAP；１０ｎｇ、５ｎｇ、２．５ｎｇをSDS-PAGEにより分離および転写した後、（Ａ）４ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体（２）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、（Ｂ）４ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体（３）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、（Ｃ）４ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体（４）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、（Ｄ）４ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体（５）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、（Ｅ）４ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体（６）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、および（Ｆ）５ｗ／ｖ％のスキムミルクを含有するＴＢＳ-Ｔ（０．１ｗ／ｖ％のTween-20を含有）溶液の６種類のブロッキング溶液をそれぞれ用いて、１時間オービタルシェーカーで振とうさせながらＰＶＤＦ膜をインキュベートし、ブロッキング処理を行った。
ブロッキング処理後の６種類のＰＶＤＦ膜をＴＢＳ-Ｔで洗浄した後、一次抗体反応、二次抗体反応および発光イメージの検出については実施例１と同様に行った。６種類のＰＶＤＦ膜に基づいて得られた画像を実施例１と同様に画像解析ソフトにより数値化し、各々の膜についてバックグラウンド（Ｎ）およびシグナル（Ｓ）から、Ｓ／Ｎ比を求めた。
その結果を表５に示す。
Figure 2017183733
実施例４ ウエスタンブロット法における非特異的吸着防止剤（ブロッキング溶液）として、本発明にかかる共重合体（３）および（７）〜（８）（本発明の非特異的吸着防止剤）を用いた場合のＳ／Ｎ比と、スキムミルクを用いた場合のＳ／Ｎ比との比較
実施例１と同様に、FLAG-BAP；１０ｎｇ、５ｎｇ、２．５ｎｇをSDS-PAGEにより分離および転写した後、（Ａ）１ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体（３）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、（Ｂ）１ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体（７）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、（Ｃ）１ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体（８）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、および（Ｄ）５ｗ／ｖ％のスキムミルクを含有するＴＢＳ-Ｔ（０．１ｗ／ｖ％のTween-20を含有）溶液の４種類のブロッキング溶液をそれぞれ用いて、１時間オービタルシェーカーで振とうさせながらＰＶＤＦ膜をインキュベートし、ブロッキング処理を行った。
ブロッキング処理後の４種類のＰＶＤＦ膜をＴＢＳ-Ｔで洗浄した後、一次抗体反応、二次抗体反応および発光イメージの検出については実施例１と同様に行った。４種類のＰＶＤＦ膜に基づいて得られた画像を実施例１と同様に画像解析ソフトにより数値化し、各々の膜についてバックグラウンド（Ｎ）およびシグナル（Ｓ）から、Ｓ／Ｎ比を求めた。
その結果を表６に示す。
Figure 2017183733
表５および表６の結果から明らかなように、本発明にかかる共重合体中の一般式［２］で示される繰り返し単位におけるＲ４が、ベンジル基、シクロヘキシル基、ｎ-ヘキシル基およびtert-ブチル基のいずれの非特異的吸着防止剤を用いた場合であっても、ブロッキング効果が得られ、従来の非特異的吸着防止剤であるスキムミルクを用いた場合と比べて、Ｓ／Ｎ比が良好で（大きく）、より高い感度での検出が可能であった。この結果から、種々の構造の一般式［２］で示される繰り返し単位を有する共重合体が、本発明の非特異的吸着防止剤として適用できることが分かった。
実施例５ ウエスタンブロット法における非特異的吸着防止剤（ブロッキング溶液）として、種々の濃度の本発明にかかる共重合体（２）（本発明の非特異的吸着防止剤）を用いた場合のＳ／Ｎ比と、スキムミルクを用いた場合のＳ／Ｎ比との比較
実施例１と同様に、FLAG-BAP；１０ｎｇ、５ｎｇ、２．５ｎｇをSDS-PAGEにより分離および転写した後、（Ａ）４ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体（２）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、（Ｂ）１ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体（２）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、（Ｃ）０．５ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体（２）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、および（Ｄ）５ｗ／ｖ％のスキムミルクを含有するＴＢＳ-Ｔ（０．１ｗ／ｖ％のTween-20を含有）溶液の４種類のブロッキング溶液をそれぞれ用いて、１時間オービタルシェーカーで振とうさせながらＰＶＤＦ膜をインキュベートし、ブロッキング処理を行った。
ブロッキング処理後の４種類のＰＶＤＦ膜をＴＢＳ-Ｔで洗浄した後、一次抗体反応、二次抗体反応および発光イメージの検出については実施例１と同様に行った。４種類のＰＶＤＦ膜に基づいて得られた画像を実施例１と同様に画像解析ソフトにより数値化し、各々の膜についてバックグラウンド（Ｎ）およびシグナル（Ｓ）から、Ｓ／Ｎ比を求めた。
その結果を表７に示す。
Figure 2017183733
表７の結果から明らかなように、（Ａ）４ｗ／ｖ％、（Ｂ）１ｗ／ｖ％および（Ｃ）０．５ｗ／ｖ％のいずれの濃度の非特異的吸着防止剤を用いた場合であっても、（Ｄ）従来の非特異的吸着防止剤であるスキムミルクを用いた場合と比べて、Ｓ／Ｎ比が同等または良好である（大きい）ことが確認された。この結果から、本発明の非特異的吸着防止剤は、種々の濃度においてブロッキング効果を有することが分かった。
実施例６ ウエスタンブロット法における非特異的吸着防止剤（ブロッキング溶液）として、種々の重量平均分子量を有する本発明にかかる共重合体（２）、（７）および（９）〜（１２）（本発明の非特異的吸着防止剤）を用いた場合のＳ／Ｎ比と、スキムミルクを用いた場合のＳ／Ｎ比との比較
実施例１と同様に、FLAG-BAP；１０ｎｇ、５ｎｇ、２．５ｎｇをSDS-PAGEにより分離および転写した後、（Ａ）１ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体（７）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、（Ｂ）１ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体（９）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、（Ｃ）１ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体（２）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、（Ｄ）１ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体（１０）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、（Ｅ）１ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体（１１）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、（Ｆ）１ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体（１２）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、および（Ｇ）５ｗ／ｖ％のスキムミルクを含有するＴＢＳ-Ｔ（０．１ｗ／ｖ％のTween-20を含有）溶液の７種類のブロッキング溶液をそれぞれ用いて、１時間オービタルシェーカーで振とうさせながらＰＶＤＦ膜をインキュベートし、ブロッキング処理を行った。
ブロッキング処理後の７種類のＰＶＤＦ膜をＴＢＳ-Ｔで洗浄した後、一次抗体反応、二次抗体反応および発光イメージの検出については実施例１と同様に行った。７種類のＰＶＤＦ膜に基づいて得られた画像を実施例１と同様に画像解析ソフトにより数値化し、各々の膜についてバックグラウンド（Ｎ）およびシグナル（Ｓ）から、Ｓ／Ｎ比を求めた。
その結果を表８に示す。
Figure 2017183733
表８の結果から明らかなように、共重合体の重量平均分子量が７０，０００〜１，２００，０００である非特異的吸着防止剤（Ａ）〜（Ｆ）を用いた場合には、（Ｇ）従来の非特異的吸着防止剤であるスキムミルクを用いた場合と比べて、Ｓ／Ｎ比が良好で（大きく）、より高い感度での検出が可能であった。この結果から、本発明の非特異的吸着防止剤は、共重合体の重量平均分子量が低いものから高いものまでいずれの範囲でも、ブロッキング効果を有することが分かった。
実施例７ ウエスタンブロット法における非特異的吸着防止剤（ブロッキング溶液）として、本発明にかかる共重合体（２）（本発明の非特異的吸着防止剤）を用いた場合のＳ／Ｎ比と、従来の共重合体からなる非特異的吸着防止剤を用いた場合のＳ／Ｎ比との比較
従来の共重合体（コポリマー）からなる非特異的吸着防止剤として、メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）由来の繰り返し単位とベンジルメタクリレート由来の繰り返し単位からなる共重合体（重量平均分子量２４４，８６２；比較用の重合体（２））を使用した。
実施例１と同様に、FLAG-BAP；１０ｎｇ、５ｎｇ、２．５ｎｇをSDS-PAGEにより分離および転写した後、（Ａ）４ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体（２）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、および（Ｂ）４ｗ／ｖ％の比較用の重合体（２）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）の２種類のブロッキング溶液をそれぞれ用いて、１時間オービタルシェーカーで振とうさせながらＰＶＤＦ膜をインキュベートし、ブロッキング処理を行った。
ブロッキング処理後の２種類のＰＶＤＦ膜をＴＢＳ-Ｔで洗浄した後、一次抗体反応、二次抗体反応および発光イメージの検出については実施例１と同様に行った。２種類のＰＶＤＦ膜に基づいて得られた画像を実施例１と同様に画像解析ソフトにより数値化し、各々の膜についてバックグラウンド（Ｎ）およびシグナル（Ｓ）から、Ｓ／Ｎ比を求めた。
その結果を表９に示す。
Figure 2017183733
表９の結果から明らかなように、（Ａ）非特異的吸着防止剤として本発明にかかる共重合体（２）（本発明の非特異的吸着防止剤）を用いた場合には、（Ｂ）従来の共重合体（コポリマー）からなる非特異的吸着防止剤を用いた場合と比べて、Ｓ／Ｎ比が良好で（大きく）、より高い感度での検出が可能であった。この結果から、一般式［１］で示される繰り返し単位と一般式［２］で示される繰り返し単位を有する共重合体を含有する本発明の非特異的吸着防止剤は、従来の共重合体（コポリマー）からなる非特異的吸着防止剤よりも、ブロッキング能の高い非特異的吸着防止剤であることが分かった。
実施例８ ウエスタンブロット法における非特異的吸着防止剤（ブロッキング溶液）として、本発明にかかる共重合体（２）（本発明の非特異的吸着防止剤）を用いた場合のＳ／Ｎ比と、従来のタンパク質からなる非特異的吸着防止剤を用いた場合のＳ／Ｎ比との比較
従来のタンパク質からなる非特異的吸着防止剤として、アルブミンおよびカゼインを含有する非特異的吸着防止剤（Blocking One；ナカライテスク株式会社製）、アルブミンを含有する非特異的吸着防止剤（Blocking One-P；ナカライテスク株式会社製）、ならびにスキムミルクを使用した。
実施例１と同様に、FLAG-BAP；１０ｎｇ、５ｎｇ、２．５ｎｇをSDS-PAGEにより分離および転写した後、（Ａ）１ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体（２）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、（Ｂ）アルブミンおよびカゼインを含有する非特異的吸着防止剤、（Ｃ）アルブミンを含有する非特異的吸着防止剤、および（Ｄ）５ｗ／ｖ％のスキムミルクを含有するＴＢＳ-Ｔ（０．１ｗ／ｖ％のTween-20を含有）溶液の４種類のブロッキング溶液をそれぞれ用いて、１時間オービタルシェーカーで振とうさせながらＰＶＤＦ膜をインキュベートし、ブロッキング処理を行った。
ブロッキング処理後の４種類のＰＶＤＦ膜をＴＢＳ-Ｔで洗浄した後、一次抗体反応、二次抗体反応および発光イメージの検出については実施例１と同様に行った。４種類のＰＶＤＦ膜に基づいて得られた画像を実施例１と同様に画像解析ソフトにより数値化し、各々の膜についてバックグラウンド（Ｎ）およびシグナル（Ｓ）から、Ｓ／Ｎ比を求めた。
その結果を表１０に示す。
Figure 2017183733
表１０の結果から明らかなように、（Ａ）非特異的吸着防止剤として本発明にかかる共重合体（２）（本発明の非特異的吸着防止剤）を用いた場合には、従来のタンパク質からなる非特異的吸着防止剤（Ｂ）〜（Ｄ）を用いた場合と比べて、Ｓ／Ｎ比が良好で（大きく）、より高い感度での検出が可能であった。この結果から、本発明の非特異的吸着防止剤は、従来のタンパク質からなる非特異的吸着防止剤よりも、ブロッキング能の高い非特異的吸着防止剤であることが分かった。
実施例９ ウエスタンブロット法における非特異的吸着防止剤（ブロッキング溶液）として、本発明にかかる共重合体（３）（本発明の非特異的吸着防止剤）とスキムミルクとを用い、ゲルから基材への転写方式を変えた場合におけるＳ／Ｎ比の比較
実施例１と同様に、FLAG-BAP；１０ｎｇ、５ｎｇ、２．５ｎｇをSDS-PAGEにより分離した。電気泳動後のゲルを２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシンおよび２０ｖ／ｖ％メタノールからなる溶液に浸漬し、１５分間オービタルシェーカーで振とうさせながら平衡化処理を行った。
次いで、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜の一種であるImmobilon-PSQ膜（Merck Millipore社製）を一旦メタノールで親水化させた後、２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシンおよび２０ｖ／ｖ％メタノールからなる溶液に浸漬し、１５分間オービタルシェーカーで振とうさせながら平衡化処理を行った。
平衡化処理したゲルをSemi-Dry Blotter（ATTO社製）を用いて、定電流０．８ｍＡ／ｃｍ２を流し、平衡化処理したＰＶＤＦ膜に１時間かけて転写し、転写後のＰＶＤＦ膜をＴＢＳでリンスした。なお、転写の方式は３種類の緩衝液を用いたセミドライ式で、緩衝液の組成は陽極側から順に、陽極液１：０．３Ｍのトリスおよび２０ｖ／ｖ％メタノールからなる溶液、陽極液２：０．０２５Ｍのトリスおよび２０ｖ／ｖ％メタノールからなる溶液、陰極液１：０．０２５Ｍのトリス、０．０４Ｍのアミノカプロン酸および２０ｖ／ｖ％メタノールからなる溶液を用いた。
次いで、（Ａ）１ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体（３）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、および（Ｂ）５ｗ／ｖ％のスキムミルクを含有するＴＢＳ-Ｔ（０．１ｗ／ｖ％のTween-20を含有）溶液の２種類のブロッキング溶液をそれぞれ用いて、１時間オービタルシェーカーで振とうさせながらＰＶＤＦ膜をインキュベートし、ブロッキング処理を行った。
ブロッキング処理後の２種類のＰＶＤＦ膜をＴＢＳ-Ｔで洗浄した後、一次抗体反応、二次抗体反応および発光イメージの検出については実施例１と同様に行った。２種類のＰＶＤＦ膜に基づいて得られた画像を実施例１と同様に画像解析ソフトにより数値化し、各々の膜についてバックグラウンド（Ｎ）およびシグナル（Ｓ）から、Ｓ／Ｎ比を求めた。
その結果を表１１に示す。
Figure 2017183733
表１１の結果から明らかなように、電気泳動後のゲルから基材への転写方式がセミドライ式であっても、（Ａ）非特異的吸着防止剤として本発明にかかる共重合体（３）（本発明の非特異的吸着防止剤）を用いた場合には、（Ｂ）従来の非特異的吸着防止剤であるスキムミルクを用いた場合と比べて、Ｓ／Ｎ比が良好で（大きく）、より高い感度での検出が可能であった。この結果から、本発明の非特異的吸着防止剤は、電気泳動後のゲルから基材への転写方式によらず、高いブロッキング効果が得られることが分かった。
実施例１０ ウエスタンブロット法における非特異的吸着防止剤（ブロッキング溶液）として、本発明にかかる共重合体（３）および（７）〜（８）（本発明の非特異的吸着防止剤）とスキムミルクとを、ニトロセルロース膜およびナイロン膜に適用した場合におけるＳ／Ｎ比の比較
実施例１と同様に、FLAG-BAP；１０ｎｇ、５ｎｇ、２．５ｎｇをSDS-PAGEにより分離した。電気泳動後のゲルを２５ｍＭのトリスおよび１９２ｍＭのグリシンからなる溶液に浸漬し、１５分間オービタルシェーカーで振とうさせながら平衡化処理を行った。
次いで、ニトロセルロース膜の一種であるHybond-ECL（GE Healthcare社製）およびナイロン膜の一種であるHybond-N+（GE Healthcare社製）を一旦蒸留水で親水化させた後、２５ｍＭのトリスおよび１９２ｍＭのグリシンからなる溶液に浸漬し、平衡化処理を行った。
平衡化処理したゲルをSemi-Dry Blotter（ATTO社製）を用いて、定電流０．８ｍＡ／ｃｍ２を流し、平衡化処理したニトロセルロース膜およびナイロン膜にそれぞれ１時間かけて転写し、転写後のニトロセルロース膜およびナイロン膜をそれぞれＴＢＳでリンスした。なお、転写の方式は３種類の緩衝液を用いたセミドライ式で、緩衝液の組成は陽極側から順に、陽極液１：０．３Ｍのトリスおよび２０ｖ／ｖ％メタノールからなる溶液、陽極液２：０．０２５Ｍのトリスおよび２０ｖ／ｖ％メタノールからなる溶液、陰極液１：０．０２５Ｍのトリス、０．０４Ｍのアミノカプロン酸および２０ｖ／ｖ％メタノールからなる溶液を用いた。
次いで、（Ａ）１ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体（３）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、（Ｂ）１ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体（７）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、（Ｃ）１ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体（８）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、および（Ｄ）５ｗ／ｖ％のスキムミルクを含有するＴＢＳ-Ｔ（０．１ｗ／ｖ％のTween-20を含有）溶液の４種類のブロッキング溶液をそれぞれ用いて、１時間オービタルシェーカーで振とうさせながらニトロセルロース膜およびナイロン膜をそれぞれインキュベートし、ブロッキング処理を行った。
ブロッキング処理後の４種類のニトロセルロース膜およびナイロン膜をＴＢＳ-Ｔで洗浄した後、一次抗体反応、二次抗体反応および発光イメージの検出については実施例１と同様に行った。４種類のニトロセルロース膜およびナイロン膜に基づいて得られた画像を実施例１と同様に画像解析ソフトにより数値化し、各々の膜についてバックグラウンド（Ｎ）およびシグナル（Ｓ）から、Ｓ／Ｎ比を求めた。
その結果を表１２に示す。
Figure 2017183733
表１２の結果から明らかなように、ニトロセルロース膜を用いたウエスタンブロットにおいて、本発明の非特異的吸着防止剤（Ａ）〜（Ｃ）を用いた場合には、（Ｄ）従来の非特異的吸着防止剤であるスキムミルクを用いた場合と比べて、同等のＳ／Ｎ比が得られることが確認された。一方で、ナイロン膜を用いたウエスタンブロットの場合において、本発明の非特異的吸着防止剤（Ａ）〜（Ｃ）を用いた場合には、抗体の非特異的吸着により膜一面にシグナルが出てしまい、ブロッキング効果が得られなかった。
実施例１１ ウエスタンブロット法における非特異的吸着防止剤（ブロッキング溶液）として、種々の濃度の本発明にかかる共重合体（３）（本発明の非特異的吸着防止剤）を用いた場合のＳ／Ｎ比と、スキムミルクを用いた場合のＳ／Ｎ比との比較
実施例１と同様に、FLAG-BAP；１０ｎｇ、５ｎｇ、２．５ｎｇをSDS-PAGEにより分離および転写した後、（Ａ）０．５ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体（３）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、（Ｂ）０．２ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体（３）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、および（Ｃ）５ｗ／ｖ％のスキムミルクを含有するＴＢＳ-Ｔ（０．１ｗ／ｖ％のTween-20を含有）溶液の３種類のブロッキング溶液をそれぞれ用いて、１時間オービタルシェーカーで振とうさせながらＰＶＤＦ膜をインキュベートし、ブロッキング処理を行った。
ブロッキング処理後の３種類のＰＶＤＦ膜をＴＢＳ-Ｔで洗浄した後、一次抗体反応、二次抗体反応および発光イメージの検出については実施例１と同様に行った。３種類のＰＶＤＦ膜に基づいて得られた画像を実施例１と同様に画像解析ソフトにより数値化し、各々の膜についてバックグラウンド（Ｎ）およびシグナル（Ｓ）から、Ｓ／Ｎ比を求めた。
その結果を表１３および図３に示す。
Figure 2017183733
表１３および図３の結果から明らかなように、（Ａ）０．５ｗ／ｖ％および（Ｂ）０．２ｗ／ｖ％のいずれの濃度の非特異的吸着防止剤を用いた場合であっても、（Ｃ）従来の非特異的吸着防止剤であるスキムミルクを用いた場合と比べて、Ｓ／Ｎ比が良好である（大きい）ことが確認された。この結果から、本発明の非特異的吸着防止剤は、種々の濃度においてブロッキング効果を有することが分かった。
合成例１５ Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジメチルアミノ）エチル〕メタクリル酸由来の繰り返し単位／ウンデセン酸由来の繰り返し単位からなる共重合体（比較用の共重合体（３））の合成
繰り返し単位の原料として、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジメチルアミノ）エチル〕メタクリル酸０．０５ｍｏｌとウンデセン酸０．０２ｍｏｌを使用し、国際公開第２０１２／１６９４５３号に記載の方法に準じて、Ｎ-〔２-（カルボキシメチルジメチルアミノ）エチル〕メタクリル酸由来の繰り返し単位／ウンデセン酸由来の繰り返し単位からなる共重合体（比較用の共重合体（３））を合成した。
得られた共重合体の物性を合成例２と同様の方法に準じて評価した。その結果、得られた共重合体の重量平均分子量は３１９，５６５、数平均分子量は１３１，９６１、多分散度は２．４２２であった。
実施例１２ ウエスタンブロット法における非特異的吸着防止剤（ブロッキング溶液）として、本発明にかかる共重合体（２）（本発明の非特異的吸着防止剤）を用いた場合のＳ／Ｎ比と、比較用の共重合体（３）を用いた場合のＳ／Ｎ比と、スキムミルクを用いた場合のＳ／Ｎ比との比較
実施例１と同様に、FLAG-BAP；１０ｎｇ、５ｎｇ、２．５ｎｇをSDS-PAGEにより分離および転写した後、（Ａ）４ｗ／ｖ％の本発明にかかる共重合体（２）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、（Ｂ）４ｗ／ｖ％の比較用の共重合体（３）を含有する２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、および（Ｃ）５ｗ／ｖ％のスキムミルクを含有するＴＢＳ-Ｔ（０．１ｗ／ｖ％のTween-20を含有）溶液の３種類のブロッキング溶液をそれぞれ用いて、１時間オービタルシェーカーで振とうさせながらＰＶＤＦ膜をインキュベートし、ブロッキング処理を行った。
ブロッキング処理後の３種類のＰＶＤＦ膜をＴＢＳ-Ｔで洗浄した後、一次抗体反応、二次抗体反応および発光イメージの検出については、一次抗体を８００倍に希釈した以外は、実施例１と同様に行った。３種類のＰＶＤＦ膜に基づいて得られた画像を実施例１と同様に画像解析ソフトにより数値化し、各々の膜についてバックグラウンド（Ｎ）およびシグナル（Ｓ）から、Ｓ／Ｎ比を求めた。
その結果を表１４に示す。
Figure 2017183733
表１４の結果から明らかなように、本発明にかかる一般式［２］で示される繰り返し単位の代わりにウンデセン酸由来の繰り返し単位を用いた（Ｂ）比較用の重合体（３）を非特異的吸着防止剤として用いた場合には、（Ｃ）従来の非特異的吸着防止剤であるスキムミルクを用いた場合と比べて、Ｓ／Ｎ比が不良で（小さく）、ブロッキング効果がほとんど認められなかった。その一方で、（Ａ）非特異的吸着防止剤として本発明にかかる共重合体（２）（本発明の非特異的吸着防止剤）を用いた場合には、（Ｃ）従来の非特異的吸着防止剤であるスキムミルクを用いた場合と比べて、Ｓ／Ｎ比が良好で（大きく）、より高い感度での検出が可能であった。この結果から、本発明にかかる一般式［２］で示される繰り返し単位を有さない共重合体ではブロッキング効果が認められず、本発明にかかる一般式［２］で示される繰り返し単位を有する共重合体でなければブロッキング効果は得られないことが分かった。
以上の結果から明らかなように、一般式［１］で示される繰り返し単位と一般式［２］で示される繰り返し単位を有する共重合体を含有する本発明の非特異的吸着防止剤は、従来の非特異的吸着防止剤と比較して、Ｓ／Ｎ比が同等または良好で（大きく）、従来の非特異的吸着防止剤であるスキムミルクと同等以上のブロッキング効果が得られることが分かった。特に基材としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜を用いたウエスタンブロットにおいて、本発明の非特異的吸着防止剤を用いた場合には、従来の非特異的吸着防止剤よりも、高いブロッキング効果が得られることが分かった。
本発明の非特異的吸着防止剤は、リン酸基を含まない共重合体であり、かつビオチンを含まないため、種々の抗原抗体反応を利用したウエスタンブロット法の非特異的吸着防止剤として適用することができ、従来の非特異的吸着防止剤であるスキムミルクよりも高感度で精度の高い分析を行うことができる。

Claims (12)

  1. 下記一般式［１］で示される繰り返し単位と下記一般式［２］で示される繰り返し単位を有する共重合体を含有する、ウエスタンブロット法用非特異的吸着防止剤。
    一般式［１］：
    Figure 2017183733
    （式中、Ｘ１は、酸素原子または−ＮＨ−基を表し、Ｒ１〜Ｒ２はそれぞれ独立して、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｒ３は、水素原子または炭素数１〜３のアルキル基を表し、ｍは、１〜６の整数を表し、ｎは、１〜３の整数を表す。）
    一般式［２］：
    Figure 2017183733
    （式中、Ｘ２は、酸素原子または−ＮＨ−基を表し、Ｒ４は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数６〜１０のアリール基または炭素数７〜１２のアリールアルキル基を表し、Ｒ５は、水素原子または炭素数１〜３のアルキル基を表す。）
  2. 前記ウエスタンブロット法が、ポリフッ化ビニリデン膜またはニトロセルロース膜を用いるものである、請求項１に記載の非特異的吸着防止剤。
  3. 前記一般式［１］で示される繰り返し単位１モルに対する前記一般式［２］で示される繰り返し単位のモル比が、１〜５０モル％である、請求項１または２に記載の非特異的吸着防止剤。
  4. 前記共重合体の重量平均分子量が、１０，０００〜２，０００，０００である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の非特異的吸着防止剤。
  5. 前記一般式［１］におけるＸ１が、酸素原子である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の非特異的吸着防止剤。
  6. 前記一般式［１］におけるＲ１およびＲ２が、メチル基である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の非特異的吸着防止剤。
  7. 前記一般式［１］におけるｍが２〜４の整数であり、ｎが１である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の非特異的吸着防止剤。
  8. 前記一般式［２］におけるＸ２が、酸素原子である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の非特異的吸着防止剤。
  9. 請求項１に記載の非特異的吸着防止剤を含有する、ウエスタンブロット法用試薬。
  10. ウエスタンブロット法において、基材に対して請求項１に記載の非特異的吸着防止剤でブロッキング処理を行う、ブロッキング方法。
  11. 前記一般式［１］で示される繰り返し単位と前記一般式［２］で示される繰り返し単位を有する共重合体を０．０５〜５．０ｗ／ｖ％含む前記非特異的吸着防止剤を用いて処理する、請求項１０に記載のブロッキング方法。
  12. 前記基材が、ポリフッ化ビニリデン膜またはニトロセルロース膜である、請求項１０または１１に記載のブロッキング方法。
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