CN106796225A - 固相载体、配体键合固相载体、靶物质的检测或分离方法以及上述固相载体的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种固相载体，具有高的水分散性，配体容易键合于反应性官能团，非特异吸附被抑制，在将配体键合而使用时能够以高灵敏度且低噪音进行靶物质的检测等。所述固相载体是含有下述式(1)所示的结构单元和下述式(2)所示的结构单元的聚合物键合而成的。〔式(1)中，R1表示氢原子或甲基，R2表示具有两性离子结构的有机基团。〕〔式(2)中，R3表示氢原子或甲基，R4表示－(C＝O)－O－*、－(C＝O)－NR6－*(R6表示氢原子或甲基，*表示与式(2)中的R5键合的位置)或亚苯基，R4为－(C＝O)－O－*时，R5表示氢原子或具有反应性官能团的有机基团，R4为－(C＝O)－NR6－*或亚苯基时，R5表示具有反应性官能团的有机基团。但是，R5不是具有两性离子结构的有机基团〕。

Description

固相载体、配体键合固相载体、靶物质的检测或分离方法以及 上述固相载体的制造方法
技术领域
本发明涉及固相载体、配体键合固相载体、靶物质的检测或分离方法以及上述固相载体的制造方法。
背景技术
出于从血液等试样中检测·分离蛋白质、核酸、细胞等靶物质的目的，利用固相载体。作为使用固相载体的检测·分离方法，通常是将配体固定于固相载体，使试样与其接触，由此使靶物质与配体反应的方法，但在上述接触时，试样中的靶物质、杂质有时未与配体反应而是非特异性地吸附于固相载体的表面，其成为噪音。
因此，出于抑制上述非特异吸附的目的，提出了在磁性生物传感器的金膜芯片表面上导入一定量的原子转移自由基聚合引发基团(ATRP引发基团)，将该ATRP引发基团作为起点使特定的羧基甜菜碱单体聚合，由此形成聚合物刷的技术(专利文献1)。
然而，具备上述聚合物刷的金膜芯片有时存在配体难以键合，靶物质的捕捉变得不充分，难以检测靶物质的信号。
另一方面，作为临床检查的酶免疫测定法的诊断药、以细胞治疗为代表的细胞分离、核酸提取等中使用的固相载体，磁性粒子近年来受到瞩目。虽然磁性粒子从检体试样等的分离较容易，但存在在水中容易凝聚的趋势，因此，要求开发一种改善磁性粒子的水分散性的技术。
另外，由于存在疾病的早期发现等要求，因此，对诊断药中使用的磁性粒子也要求能够充分捕捉靶物质。另外，对细胞分离中使用的磁性粒子也要求仅能够特异性地捕捉靶细胞。在这样的背景下，提出了通过利用ATRP使聚(羟基乙基甲基丙烯酰胺)·聚(甲基丙烯酸)嵌段共聚物等键合于表面而形成聚合物刷的磁性粒子(专利文献2)，但对于该磁性粒子，试样中的靶物质、杂质容易非特异性地吸附于粒子表面，在该方面存在改善的余地。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2009－69141号公报
专利文献2：日本特表2009－542862号公报
发明内容
本发明所要解决的课题在于提供一种固相载体，具有高的水分散性，配体容易键合于反应性官能团，非特异吸附被抑制，在将配体键合而使用时能够以高灵敏度且低噪音进行靶物质的检测等。
因此，本发明人进行了深入研究，结果发现含有具有两性离子结构的特定的结构单元和具有反应性官能团的特定的结构单元的聚合物键合而成的固相载体具有高的水分散性，配体容易键合于反应性官能团，非特异吸附被抑制，在将配体键合而使用时能够以高灵敏度且低噪音进行靶物质的检测等，完成了本发明。
即，本发明提供＜1＞一种固相载体，是含有下述式(1)所示的结构单元(以下，也称为结构单元(1))和下述式(2)所示的结构单元(以下，也称为结构单元(2))的聚合物键合而成的。
〔式(1)中，
R1表示氢原子或甲基，
R2表示具有两性离子结构的有机基团。〕
〔式(2)中，
R3表示氢原子或甲基，
R4表示－(C＝O)－O－*、－(C＝O)－NR6－*(R6表示氢原子或甲基，*表示与式(2)中的R5键合的位置)或亚苯基，
R4为－(C＝O)－O－*时，R5表示氢原子或具有反应性官能团的有机基团，R4为－(C＝O)－NR6－*或亚苯基时，R5表示具有反应性官能团的有机基团。
但是，R5不是具有两性离子结构的有机基团。〕
另外，本发明提供＜2＞一种配体键合固相载体，是使配体键合于上述＜1＞的固相载体而成的。
另外，本发明提供＜3＞一种检测或分离试样中的靶物质的方法，其特征在于，使用上述＜2＞的配体键合固相载体。
进而，本发明提供＜4＞一种制造方法，是含有结构单元(1)和结构单元(2)的聚合物键合而成的固相载体的制造方法，其特征在于，包含以下工序：
(工序1)准备具有聚合引发基团的载体的工序；以及
(工序2)将所述聚合引发基团作为起点使单体聚合的工序。
本发明的固相载体具有高的水分散性，配体容易键合于反应性官能团，非特异吸附被抑制，在将配体键合而使用时能够以高灵敏度且低噪音进行靶物质的检测等。
另外，根据本发明的制造方法，能够简便制造上述本发明的固相载体。
具体实施方式
＜固相载体＞
本发明的固相载体是含有下述式(1)所示的结构单元和下述式(2)所示的结构单元的聚合物键合而成的。首先，对本发明的固相载体进行详细说明。
〔式(1)中，
R1表示氢原子或甲基，
R2表示具有两性离子结构的有机基团。〕
〔式(2)中，
R3表示氢原子或甲基，
R4表示－(C＝O)－O－*、－(C＝O)－NR6－*(R6表示氢原子或甲基，*表示与式(2)中的R5键合的位置)或亚苯基，
R4为－(C＝O)－O－*时，R5表示氢原子或具有反应性官能团的有机基团，R4为－(C＝O)－NR6－*或亚苯基时，R5表示具有反应性官能团的有机基团。
但是，R5不是具有两性离子结构的有机基团。〕
(结构单元(1))
式(1)中，R2表示具有两性离子结构的有机基团。该有机基团是指具有阳离子性官能团和阴离子性官能团的有机基团。作为具有两性离子结构的有机基团，优选具有季铵盐型阳离子性官能团和阴离子性官能团的有机基团，更优选具有季铵盐型阳离子性官能团以及选自－(C＝O)O-、－SO3 -和－O－(O＝P－O-)－O－中的1价或2价的阴离子性官能团的有机基团。其中，作为R2，从抑制非特异吸附的观点出发，更优选下述式(3)或(4)所示的有机基团，从单体合成容易的观点等出发，特别优选下述式(3)所示的有机基团。
〔式(3)中，
R7表示－(C＝O)－O－*、－(C＝O)－NR13－*(R13表示氢原子或甲基，*表示与式(3)中的R8键合的位置)或亚苯基，
R8和R9各自独立地表示单键或碳原子数1～10的2价的有机基团，
R10表示－(C＝O)O-或－SO3 -，
R11和R12各自独立地表示甲基或乙基。〕
〔式(4)中，
R14表示－(C＝O)－O－*、－(C＝O)－NR20－*(R20表示氢原子或甲基，*表示与式(4)中的R15键合的位置)或亚苯基，
R15和R16各自独立地表示单键或碳原子数1～10的2价的有机基团，
R17、R18和R19各自独立地表示甲基或乙基。〕
式(3)中，作为R7，从提高与水的亲和性、抑制非特异吸附的观点出发，优选－(C＝O)－O－*、－(C＝O)－NR13－*，更优选－(C＝O)－O－*。
R10表示－(C＝O)O-或－SO3 -，从兼具检测的高灵敏度化和低噪音化的观点出发，优选－(C＝O)O-。
R13表示氢原子或甲基，优选氢原子。
式(3)中的R8和R9、式(4)中的R15和R16各自独立地表示单键或碳原子数1～10的2价的有机基团，从抑制非特异吸附的观点出发，优选碳原子数1～10的2价的有机基团，更优选碳原子数1～10的2价的烃基、碳原子数2～10的2价的烃基的碳－碳原子间具有选自醚键、亚氨基、酰胺键和酯键中的1种以上的基团，特别优选碳原子数1～10的2价的烃基。
2价的有机基团为2价的烃基时，作为其碳原子数，优选1～8，更优选1～6，进一步优选1～4，特别优选1～3。另一方面，2价的有机基团为2价的烃基的碳－碳原子间具有选自醚键、亚氨基、酰胺键和酯键中的1种以上的基团时，作为该基团中的2价的烃基的碳原子数，优选2～8，更优选2～6，进一步优选2～4，特别优选2或3。
作为R8、R9、R15和R16中的“2价的烃基”，优选2价的脂肪族烃基。该2价的脂肪族烃基可以为直链状，也可以为支链状。
作为上述2价的脂肪族烃基，优选链烷二基，具体而言，可举出甲烷－1,1－二基、乙烷－1,1－二基、乙烷－1,2－二基、丙烷－1,1－二基、丙烷－1,2－二基、丙烷－1,3－二基、丙烷－2,2－二基、丁烷－1,2－二基、丁烷－1,3－二基、丁烷－1,4－二基、戊烷－1,4－二基、戊烷－1,5－二基、己烷－1,5－二基、己烷－1,6－二基等。
作为式(3)中的R11和R12、式(4)中的R17、R18和R19，优选甲基。
式(4)中，作为R14，从提高与水的亲和性、抑制非特异吸附的观点出发，优选－(C＝O)－O－*、－(C＝O)－NR20－*，更优选－(C＝O)－O－*。R20表示氢原子或甲基，优选氢原子。
(结构单元(2))
式(2)中，作为R4，从提高与水的亲和性、抑制非特异吸附的观点出发，优选－(C＝O)－O－*、－(C＝O)－NR6－*。R6表示氢原子或甲基，优选氢原子。
另外，R4为－(C＝O)－O－*时，R5表示氢原子或具有反应性官能团的有机基团，R4为－(C＝O)－NR6－*或亚苯基时，R5表示具有反应性官能团的有机基团。R4为－(C＝O)－O－*、且R5为氢原子时，R4和R5的组合为反应性官能团(羧基)。但是，R5不是R2所示这样的具有两性离子结构的有机基团，本说明书中，R5中的反应性官能团是不含两性离子结构的概念。
作为反应性官能团，可举出羧基、甲苯磺酰基、氨基、环氧基、酰基、叠氮基，上述有机基团可以具有它们中的1种，也可以具有2种以上。其中，从键合的配体难以脱离的观点、使用蛋白质、核酸等分子作为配体时，能够使用配体本来具有的官能团与固相载体键合的方面出发，优选羧基、甲苯磺酰基、氨基、环氧基，从容易简便且迅速地使配体与固相载体键合的方面等出发，更优选羧基。
另外，结构单元(2)中所含的反应性官能团的含量从配体键合量的观点、兼具检测的高灵敏度化和低噪音化的观点、细胞分离性能的观点出发，相对于固相载体的固体成分1g，优选为1μmol以上，更优选为5μmol以上，进一步优选为10μmol以上，进一步优选为15μmol以上，进一步优选为20μmol以上，进一步优选为25μmol以上，特别优选为30μmol以上，另外，从抑制非特异吸附的观点、兼具检测的高灵敏度化和低噪音化的观点出发，优选为300μmol以下，更优选为200μmol以下，进一步优选为190μmol以下，特别优选为180μmol以下。
例如，反应性官能团为羧基时，反应性官能团的含量可通过电导率测定法等来测定，具体而言，可依照后述的实施例中记载的方法来测定。另外，反应性官能团为甲苯磺酰基时，可对导入于固相载体的甲苯磺酰基的紫外可见光吸收进行测定等而求出，反应性官能团为氨基时，可使N－琥珀酰亚胺基－3－(2－吡啶基二硫)丙酸酯与氨基进行反应，然后进行还原，对游离的硫代吡啶基的吸光度进行测定等而求出。
另外，作为R5所示的具有反应性官能团的有机基团，优选下述式(5)所示的有机基团。
R21-Y(5)
〔式(5)中，
R21表示2价的有机基团，
Y表示反应性官能团。〕
作为R21所示的2价的有机基团，可举出2价的烃基、碳原子数2以上的2价的烃基的碳－碳原子间具有选自醚键、亚氨基、酰胺键和酯键中的1种以上的基团。
2价的有机基团为2价的烃基时，作为其碳原子数，优选1～10，更优选1～8，特别优选1～6。另一方面，2价的有机基团为碳原子数2以上的2价的烃基的碳－碳原子间具有选自醚键、亚氨基、酰胺键和酯键中的1种以上的基团时，作为该基团中的2价的烃基的碳原子数，优选2～10，更优选2～8，特别优选2～6。
作为R21中“2价的烃基”，优选2价的脂肪族烃基。该2价的脂肪族烃基可以为直链状，也可以为支链状。
作为上述2价的脂肪族烃基，优选链烷二基，具体而言，可举出甲烷－1,1－二基、乙烷－1,1－二基、乙烷－1,2－二基、丙烷－1,1－二基、丙烷－1,2－二基、丙烷－1,3－二基、丙烷－2,2－二基、丁烷－1,2－二基、丁烷－1,3－二基、丁烷－1,4－二基、戊烷－1,4－二基、戊烷－1,5－二基、己烷－1,5－二基、己烷－1,6－二基等。
另外，作为碳原子数2以上的2价的烃基的碳－碳原子间具有选自醚键、亚氨基、酰胺键和酯键中的1种以上的基团，从可简便地得到聚合物的观点等出发，优选碳原子数2以上的2价的烃基的碳－碳原子间具有酯键的基团，更优选－Ra－O(C＝O)－Rb－*所示的2价的基团(Ra和Rb各自独立地表示碳原子数2～4的链烷二基，*表示与式(5)中的Y的键合位置)。作为链烷二基的碳原子数，优选2或3，更优选2。链烷二基可以为直链状，也可以为支链状，例如可举出乙烷－1,2－二基、丙烷－1,2－二基、丙烷－1,3－二基。
作为Y所示的反应性官能团，与上述同样地，可举出羧基、甲苯磺酰基、氨基、环氧基、酰基、叠氮基。其中，从键合的配体难以脱离的观点、使用蛋白质、核酸等分子作为配体时，能够使用配体本来具有的官能团与固相载体键合的方面出发，优选羧基、甲苯磺酰基、氨基、环氧基，从使配体容易简便且迅速地与固相载体键合的方面等出发，更优选羧基。
作为上述R4和R5的组合，优选R4为－(C＝O)－O－*、R5为氢原子或具有反应性官能团的有机基团的组合、R4为－(C＝O)－NR6－*、R5为具有反应性官能团的有机基团的组合，更优选R4为－(C＝O)－O－*或－(C＝O)－NR6－*、R5为具有反应性官能团的有机基团的组合。
另外，聚合物也可以具有上述结构单元(1)和(2)以外的结构单元(以下，也称为其它结构单元)。作为其它结构单元，可举出来自(甲基)丙烯酸酯类、苯乙烯类、(甲基)丙烯腈类、乙酸乙烯酯等的结构单元。
结构单元(1)和(2)可以包含在键合于固相载体的相同的聚合物中，另外，也可以包含在不同的聚合物中，优选包含在相同的聚合物中。
另外，每1条聚合物的结构单元(1)的平均聚合度n优选为1以上，更优选为3以上，进一步优选为5以上，特别优选为10以上，另外，从配体键合量的观点、兼具检测的高灵敏度化和低噪音化的观点、细胞分离性能的观点出发，优选为500以下，更优选为300以下，进一步优选为200以下，进一步优选为100以下，进一步优选为70以下，特别优选为62以下。
从配体键合量的观点出发，每1条聚合物的结构单元(2)的平均聚合度m优选为1以上，更优选为3以上，进一步优选为5以上，特别优选为10以上，另外，从抑制非特异吸附的观点、兼具检测的高灵敏度化和低噪音化的观点出发，优选为500以下，更优选为300以下，进一步优选为200以下，进一步优选为100以下，进一步优选为70以下，特别优选为65以下。
另外，从抑制非特异吸附的观点和配体键合量的观点出发，由平均聚合度n和平均聚合度m算出的聚合比例〔m/(m+n)〕优选为0.01以上，更优选为0.03以上，进一步优选为0.05以上，进一步优选为0.1以上，特别优选为0.15以上，另外，从抑制非特异吸附的观点和配体键合量的观点出发，优选为0.75以下，更优选为0.74以下，特别优选为0.7以下。聚合物为嵌段聚合物时，从抑制非特异吸附的观点、配体键合量的观点和兼具检测的高灵敏度化和低噪音化、特别是制成适于诊断药用途的物质的聚合物的观点出发，进一步优选为0.1～0.5，进一步优选为0.1～0.35，特别优选为0.15～0.3。另一方面，聚合物为无规聚合物时，从兼具检测的高灵敏度化和低噪音化，特别是制成适于诊断药用途的聚合物的观点出发，进一步优选为0.2～0.7，特别优选为0.35～0.7。
平均聚合度n、m分别是指每1条聚合物的结构单元(1)、(2)的平均聚合度，可由X射线光电子光谱分析、键合于每1g固相载体的聚合物的重量、聚合物的分子量和反应性官能团量等算出。具体而言，可依照后述的实施例中记载的方法来测定。
另外，作为聚合物，优选链状聚合物。链状聚合物是指具有线状的分子结构的聚合物，其包含具有由长的直链状的主链和与其键合的较短的侧链构成的结构的聚合物的概念。
另外，作为聚合物，优选乙烯基聚合物。另外，聚合物中的结构单元的排列的样态没有特别限定，可以为无规共聚物、嵌段共聚物、具有无规共聚单元和嵌段共聚单元的共聚物、交替共聚物中的任一者，从能够简便地形成聚合物的方面等出发，优选无规共聚物、嵌段共聚物。聚合物为无规共聚物时，细胞等的非特异吸附容易被抑制。另外，聚合物为嵌段共聚物时，抗体等的配体容易键合，容易兼具利用抗原抗体反应的检测中的高灵敏度化和低噪音化。得到这样的效果的理由未必明确，但本发明人推测是因为在嵌段共聚物的情况下，反应性官能团局部存在，因此，抗体容易键合，容易得到夹层结构(一次抗体－抗原－二次抗体)等高次结构。
另外，聚合物为嵌段共聚物时，该嵌段共聚物含有由结构单元(1)的重复而构成的第1嵌段和由结构单元(2)的重复而构成的第2嵌段。作为这样的嵌段共聚物，从进一步容易键合配体的观点、兼具检测的高灵敏度化和低噪音化的观点出发，优选下述式(6)所示的嵌段共聚物。
〔式(6)中，**表示固相载体侧的键合位置，其它符号与上述符号同义。〕
另外，聚合物的一侧的末端只要键合于固相载体就没有特别限定，优选介由含有聚合引发基团的残基的2价的连接基团键合于固相载体。作为聚合引发基团，优选可活性聚合的聚合引发基团，更优选活性自由基聚合引发基团，进一步优选原子转移自由基聚合引发基团、可逆加成裂解链转移聚合引发基团，特别优选原子转移自由基聚合引发基团。作为含有原子转移自由基聚合引发基团的残基的2价的连接基团，可举出下述式(7－1)或(7－2)所示的2价的基团。
〔上述式中，
R25和R29表示－O－或－NH－，
R26和R30各自独立地表示单键或亚苯基，
R27和R28各自独立地表示氢原子或烷基，
**表示与聚合物的末端键合的位置。〕
作为R25和R29，优选－O－，作为R26和R30，优选单键，作为R27和R28，优选烷基。
作为R27和R28所示的烷基的碳原子数，优选1～8，更优选1～4，特别优选1或2。烷基可以为直链状，也可以为支链状，具体而言，可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基等。
另一方面、聚合物的另一侧的末端没有特别限定，优选卤原子。作为卤原子，可举出溴原子、氯原子、氟原子等。
聚合物优选在固相载体表面上形成聚合物刷。从抑制非特异吸附的观点、配体键合量的观点、兼具检测的高灵敏度化和低噪音化的观点出发，相对于本发明的固相载体的表面，上述聚合物占有的密度优选为0.01条/nm2以上，更优选为0.05条/nm2以上，进一步优选为0.1条/nm2以上，进一步优选为0.3条/nm2以上，进一步优选为0.4条/nm2以上，进一步优选为0.5条/nm2以上，进一步优选为0.6条/nm2以上，特别优选为0.7条/nm2以上，另外，从聚合物刷的形成简便的方面出发，优选为2条/nm2以下，更优选为1.6条/nm2以下，进一步优选为1.2条/nm2以下。
上述聚合物的密度例如可由下述式算出。具体而言，可通过水解等使聚合物从固相载体游离，依照后述的实施例中记载的方法来测定。
聚合物的密度(条/nm2)＝键合于1g载体的聚合物的条数(条)/1g载体的总表面积(nm2)
另外，作为聚合物的数均分子量(Mn)，优选1000～100000，更优选3000～50000，进一步优选5000～30000。
另外，作为聚合物的重均分子量(Mw)，优选1000～100000，更优选3000～50000，特别优选为5000～30000。
另外，作为分子量分布(Mw/Mn)，从抑制非特异吸附和提高键合于固相载体的配体的活性的观点出发，优选1.0～2.5，更优选1.0～2.0，进一步优选1.0～1.5。
应予说明，数均分子量、重均分子量是指通过水解等使聚合物从固相载体游离，通过凝胶渗透色谱测得的换算为聚乙二醇的平均分子量。例如，预先通过后述的实施例中记载的这样的方法测定反应性官能团导入前的聚合物的分子量，由该分子量、导入有反应性官能团的结构单元的摩尔数和用于反应性官能团的导入的化合物的结构进行计算等而算出。
构成本发明的固相载体的上述聚合物以外的部分可以为有机物，也可以为金属、金属氧化物等无机物，没有特别限定，本发明的固相载体优选除上述聚合物以外还含有树脂。作为树脂，可以为由琼脂糖、葡聚糖、纤维素等多糖类构成的天然高分子，也可以为合成高分子。
另外，本发明的固相载体的形态没有特别限定，可以为粒子、整块(monolith)、膜、纤维、屑片(chip)等中的任一者，从靶物质的检测或分离的容易性的观点出发，优选粒子，更优选磁性粒子。
本说明书中“磁性粒子”是指具有磁性体的粒子。本发明的固相载体即使在磁性粒子的形态下也具有高的水分散性。另外，制成磁性粒子时，可在不使用离心分离器等的情况下使用磁石等进行分离，因此，能够将自试样的固相载体的分离简化或自动化。
另外，磁性体可以为强磁性、顺磁性、超顺磁性中的任一者，从使利用磁场的分离和去除磁场后的再分散容易的观点出发，优选为超顺磁性。作为磁性体，可举出铁素体、氧化铁、铁、氧化锰、锰、氧化镍、镍、氧化钴、钴等金属或合金。
另外，作为磁性粒子，具体而言，可举出将上述聚合物键合于以下的(i)～(iv)中的任一粒子而成的磁性粒子。优选为多孔或非多孔的磁性聚合物粒子。
(i)磁性体微粒在含有树脂等非磁性体的连续相中分散的粒子
(ii)将磁性体微粒的2次凝聚物作为核、将树脂等非磁性体作为壳的粒子
(iii)将具有由树脂等非磁性体构成的核粒子和设置于该核粒子的表面的含有磁性体微粒的磁性体层(2次凝聚物层)的母粒子作为核，在该母粒子的最外层设有树脂等非磁性体层作为壳(以下，也称为最外层壳)的粒子
(iv)可以在粒子的最外层设置树脂等非磁性体层作为壳的、磁性体微粒在由树脂、二氧化硅等构成的多孔的粒子的孔内分散的粒子
应予说明，(i)～(iv)的粒子均是公知的，可依照常规方法来制造。
作为上述(iii)的核粒子和(iv)的多孔粒子中的树脂，可举出来自选自单官能性单体和交联性单体中的1种或2种以上的树脂。
作为上述单官能性单体，例如可举出苯乙烯、α－甲基苯乙烯、卤化苯乙烯等单官能性芳香族乙烯基系单体；(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸硬脂酯、(甲基)丙烯酸环己酯、(甲基)丙烯酸异冰片酯等单官能性(甲基)丙烯酸酯系单体。
作为上述交联性单体，例如可举出二乙烯基苯等多官能性芳香族乙烯基系单体；乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇六(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸烯丙酯等多官能性(甲基)丙烯酸酯系单体；丁二烯、异戊二烯等共轭二烯烃等。
另外，作为上述(i)和(ii)中的树脂以及上述(iii)和(iv)的最外层壳中的树脂，优选具有选自缩水甘油基、氨基和羟基中的1种或2种以上的官能团的树脂。上述官能团可以通过对树脂的化学修饰来导入，也可以通过至少含有具有上述官能团的单体1种或2种以上的单体组成的聚合来导入。作为上述化学修饰，例如可举出通过缩水甘油基的水解的羟基的生成、通过硝基的还原的氨基的生成。作为具有上述官能团的单体组成，更优选至少含有含缩水甘油基单体的单体组成(以下，也将上述最外层壳中的树脂为由至少含有含缩水甘油基单体的单体组成形成的树脂的粒子称为含缩水甘油基磁性粒子)。应予说明，也可以进一步含有选自上述单官能性单体和交联性单体中的1种或2种以上。
作为含缩水甘油基单体，可举出(甲基)丙烯酸缩水甘油酯、烯丙基缩水甘油醚等。作为含氨基单体，可举出(甲基)丙烯酸－2－氨基乙酯等。作为含羟基单体，可举出1,4－环己烷二甲醇单(甲基)丙烯酸酯等。
另外，本发明的固相载体为粒子时的平均粒径(体积平均粒径)优选为0.1～500μm，更优选为0.2～50μm，进一步优选为0.3～10μm。通过为这样的范围，固相载体为磁性粒子时，聚磁速度(集磁速度)变快，操作性得到改善，另外，配体键合量变大，检测灵敏度等变得良好。另外，平均粒径的变动系数只要为20％以下左右即可。
另外，比表面积只要为1.0～2.0m2/g左右即可。
应予说明，上述平均粒径和比表面积可通过激光衍射·散射粒径分布测定等来测定。
＜固相载体的制造方法＞
本发明的固相载体可将常规方法适当组合而进行制造，作为本发明的固相载体的制造方法，从将相对于固相载体的表面的聚合物占有的密度高密度化且进一步抑制非特异吸附的观点、将分子量分布窄的聚合物键合于固相载体键合且进一步抑制非特异吸附的观点、提高键合于固相载体的配体的作用的观点等出发，优选包含以下工序的方法：(工序1)准备具有聚合引发基团的载体(以下，也称为含聚合引发基团载体)的工序；以及(工序2)将上述聚合引发基团作为起点使单体聚合的工序。
作为上述制造方法，具体而言，可举出以下的方法＜PR－1＞和＜PR－2＞。以下，关于这些方法，例举结构单元(2)中所含的反应性官能团为羧基、氨基或甲苯磺酰基的情况进行说明。
＜PR－1＞(工序1)准备含聚合引发基团载体，(工序2－1－1)使构成结构单元(1)的单体(11)和具有可导入羧基、氨基或甲苯磺酰基的官能团(例如，羟基、环氧基、酯基、氨基、羧酸保护基等)的单体(12)以上述聚合引发基团作为起点进行聚合，(工序2－1－2)通过加成反应、取代反应、缩合反应或脱保护反应对导入于固相载体的聚合物(14)导入羧基、氨基或甲苯磺酰基的方法。
＜PR－2＞(工序1)准备含聚合引发基团载体，(工序2－2－1)通过加成反应、取代反应、缩合反应或脱保护反应对具有可导入羧基、氨基或甲苯磺酰基的官能团的单体(12)导入羧基、氨基或甲苯磺酰基而得到构成结构单元(2)的单体(13)，(工序2－2－2)使该单体(13)和单体(11)以上述聚合引发基团作为起点进行聚合的方法。应予说明，使用具有羧基、氨基或甲苯磺酰基的单体时，可不进行(工序2－2－1)地进行制造。作为具有羧基、氨基或甲苯磺酰基的单体，可举出(甲基)丙烯酸、(甲基)丙烯酸盐、(甲基)丙烯酸氨基乙酯等。
(工序1)
含聚合引发基团载体可以使用市售品，也可以合成来使用。例如可通过使具有聚合引发基团的化合物与具有选自羟基、氨基、环氧基和羧基中的1种或2种以上(以下，也将其总称为羟基等)的原料载体(以下，也称为原料载体)接触，将上述羟基等中所含的氢原子转换为聚合引发基团而得到(以下，也将该反应称为聚合引发基团导入反应)。应予说明，上述原料载体中，具有羟基的原料载体例如可通过使上述含缩水甘油基磁性粒子与无机酸、有机酸等酸接触，将缩水甘油基开环等而得到。
另外，含聚合引发基团载体也可将含有具有聚合引发基团的单体的单体组成进行聚合而得到。作为具有聚合引发基团的单体，可举出甲基丙烯酸－2－(2－溴异丁酰氧基)乙酯等。
作为上述具有聚合引发基团的化合物，优选具有可活性聚合的聚合引发基团的化合物，更优选具有活性自由基聚合引发基团的化合物，进一步优选具有原子转移自由基聚合引发基团的化合物、具有可逆加成裂解链转移聚合引发基团的化合物，特别优选具有原子转移自由基聚合引发基团的化合物。作为具有原子转移自由基聚合引发基团的化合物，例如可举出2－溴异丁酰溴、4－(溴甲基)苯甲酸、2－溴异丁酸乙酯、2－溴丙酰溴、对甲苯磺酰氯等。
聚合引发基团导入反应中，具有聚合引发基团的化合物的合计使用量相对于原料载体，通常为0.001～100质量倍左右，优选为0.01～50质量倍左右。
聚合引发基团导入反应优选在三乙胺、N,N－二甲基－4－氨基吡啶、二异丙基乙基胺、吡啶等碱性催化剂存在下进行。应予说明，可单独使用这些碱性催化剂中的1种或组合使用2种以上。
碱性催化剂的合计使用量相对于具有聚合引发基团的化合物，通常为1～10摩尔当量左右，优选为1～5摩尔当量左右。
另外，聚合引发基团导入反应优选在溶剂存在下进行。作为溶剂，可举出四氢呋喃、1,4－二烷、1,3－二烷等醚系溶剂；二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等质子性溶剂，这些溶剂可单独使用1种或组合使用2种以上。
另外，聚合引发基团导入反应的反应时间通常为30分钟～24小时左右，反应温度只要在溶剂的沸点以下适当选择即可。
(工序2－1－1)
工序2－1－1中的聚合反应的聚合法只要根据聚合引发基团的种类选择即可，从简便且容易得到目的物的观点出发，优选活性聚合，更优选活性自由基聚合，进一步优选原子转移自由基聚合(ATRP聚合)、可逆加成裂解链转移聚合(RAFT聚合)，特别优选原子转移自由基聚合。通过利用原子转移自由基聚合进行聚合，能够使聚合物简便地键合于种类繁多的载体，而且，由于对得到的固相载体赋予生物相容性、高压缩弹性、低摩擦特性、尺寸排阻特性，且使相对于固相载体的表面的聚合物占有的密度高密度化，因此，难以非特异吸附。
应予说明，通过在使单体(11)聚合后，将形成的聚合物的末端的聚合引发基团作为起点使单体(12)聚合或者在使单体(12)聚合后，将形成的聚合物末端的聚合引发基团作为起点使单体(11)聚合，能够将嵌段共聚物导入于固相载体。
作为单体(11)，可举出[2－((甲基)丙烯酰氧基)乙基](氧负离子羰基甲基)二甲基铵、[2－((甲基)丙烯酰氧基)乙基](氧负离子羰基乙基)二甲基铵、[2－((甲基)丙烯酰氧基)乙基](氧负离子羰基丙基)二甲基铵、[2－((甲基)丙烯酰氧基)乙基]二甲基－(3－磺甲基)氢氧化铵、[2－((甲基)丙烯酰氧基)乙基]二甲基－(3－磺乙基)氢氧化铵、[2－((甲基)丙烯酰氧基)乙基]二甲基－(3－磺丙基)氢氧化铵、(O－[2－((甲基)丙烯酰氧基)乙基磷酸]胆碱等。应予说明，可以单独使用这些单体中的1种或组合使用2种以上。
作为单体(12)，可举出2－羟基乙基(甲基)丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸－2－羟基乙酯、(甲基)丙烯酸缩水甘油酯、(甲基)丙烯酸氨基乙酯、(甲基)丙烯酸叔丁酯等。应予说明，可以单独使用这些单体中的1种或组合使用2种以上。
单体(11)、(12)的各合计使用量各自相对于键合于载体的聚合引发基团，通常为5～10000摩尔当量左右，优选为10～5000摩尔当量左右。
另外，通过原子转移自由基聚合进行工序2－1－1中的聚合反应时，从反应效率的观点出发，优选在过渡金属化合物和配位体的存在下进行反应。
作为过渡金属化合物，优选铜化合物。作为铜化合物，除溴化亚铜(I)、溴化铜(II)、氯化亚铜(I)、氯化铜(II)等卤化铜之外，还可举出三氟甲磺酸亚铜(I)、三氟甲磺酸铜(II)等。应予说明，可以单独使用这些过渡金属化合物中的1种或组合使用2种以上。过渡金属化合物的合计使用量在反应体系中，通常为1～10000ppm左右。
作为配位体，优选在同一分子内含有2个以上的氮原子的配位体。作为在同一分子内含有2个以上的氮原子的配位体，可举出三(2－吡啶基甲基)胺、联吡啶、联吡啶衍生物、三[2－(二甲基氨基)乙基]胺等。应予说明，这可以单独使用些配位体中的1种或组合使用2种以上。配位体的合计使用量相对于过渡金属化合物，通常为0.5～10摩尔当量左右。
另外，从反应效率的观点出发，工序2－1－1中的聚合反应优选在还原剂、溶剂存在下进行。
作为还原剂，可举出抗坏血酸、葡萄糖、肼、铜等，这些还原剂可单独使用1种或组合使用2种以上。
作为溶剂，可举出水；二甲基甲酰胺等酰胺系溶剂；甲醇、乙醇等醇系溶剂等，这些溶剂可单独使用1种或组合使用2种以上。
另外，作为聚合反应的反应体系的pH，优选为3～10。聚合反应的反应时间通常为30分钟～12小时左右，反应温度只要在溶剂的沸点以下适当选择即可。聚合反应在25～60℃左右的温和的条件下也能进行。
(工序2－1－2)
工序2－1－2是通过加成反应、取代反应、缩合反应或脱保护反应对导入于固相载体的聚合物(14)导入羧基、氨基或甲苯磺酰基的工序。
作为导入羧基的方法，可举出使用具有羟基或氨基的单体作为单体(12)，使羧酸酐与得到的聚合物(14)进行加成反应的方法；使用具有环氧基的单体作为单体(12)，将得到的聚合物(14)水解而生成羟基，然后使羧酸酐进行加成反应的方法；使用具有环氧基的单体作为单体(12)，使具有巯基、氨基等亲核基团和羧基的化合物与得到的聚合物(14)进行加成反应的方法；使用羧基被保护的单体作为单体(12)，将得到的聚合物(14)进行脱保护的方法等。
作为羧酸酐，例如可举出琥珀酸酐、马来酸酐、戊二酸酐、邻苯二甲酸酐、六氢邻苯二甲酸酐等。其中，从与羟基、氨基的反应容易进行的观点出发，优选琥珀酸酐。羧酸酐等的合计使用量，相对于来自单体(12)的结构单元，通常为0.1～2000摩尔当量左右，优选为1～1000摩尔当量。
作为具有巯基、氨基等亲核基团和羧基的化合物，可举出巯基丙酸、氨基酸。作为羧基被保护的单体，可举出(甲基)丙烯酸叔丁酯、(甲基)丙烯酸－N－羟基琥珀酰亚胺酯。应予说明，脱保护方法可根据保护基以众所周知的方法实施，可举出水解等。
作为导入氨基的方法，可举出使用具有环氧基的单体作为单体(12)，使氨或具有2个以上的氨基的化合物与得到的聚合物(14)进行加成反应的方法。作为具有2个以上的氨基的化合物，可举出乙二胺。
作为导入甲苯磺酰基的方法，可举出使用具有羟基或氨基的单体作为单体(12)，使对甲苯磺酰氯与得到的聚合物(14)进行加成的方法；使用具有环氧基的单体作为单体(12)，将得到的聚合物(14)水解而生成羟基，然后使对甲苯磺酰氯进行加成的方法等。
另外，工序2－1－2优选在与工序1同样的碱性催化剂、溶剂存在下进行。工序2－1－2的反应时间通常为30分钟～24小时左右，反应温度只要在溶剂的沸点以下适当选择即可。
应予说明，工序2－2－1只要按照工序2－1－2进行即可，工序2－2－2只要按照工序2－1－1进行即可。
而且，如上得到的本发明的固相载体具有高的水分散性，配体容易键合于反应性官能团，非特异吸附被抑制。而且，在将配体键合而使用时，能够提高靶物质的检测等中的S/N(信号/噪音)比，能够使检测等高灵敏度且低噪音化。另外，能够将靶物质的分离高纯度化。另外，将配体键合而使用时，能够以高的比例特异性地捕捉靶细胞。
因此，通过将本发明的固相载体作为亲和载体，能够广泛利用于以酶免疫测定、放射免疫测定、化学发光免疫测定等利用了抗原抗体反应的免疫测定；蛋白质、核酸等的检测；细胞、蛋白质、核酸等生物体相关物质的生物分离；药物探索；生物传感器等为代表的体外诊断、生物化学领域中的研究等。本发明的固相载体特别适合用于免疫测定、用于生物分离(特别是细胞分离)以及用于核酸检测。
＜配体键合固相载体＞
本发明的配体键合固相载体是使配体键合于本发明的固相载体而成的。
上述配体只要是与靶物质键合的分子即可，例如可举出抗体；抗原；DNA、RNA等核酸；核苷酸；核苷；蛋白A、蛋白G、(链霉)亲和素、酶、凝集素等蛋白质；胰岛素等肽；氨基酸；肝素等糖或多糖；脂质；生物素等维生素；药物；基质；激素；神经递质；合成分子等。
这些配体中，从制成适合于诊断药用等的配体键合固相载体的观点出发，优选抗体、抗原。抗体、抗原只要与靶物质键合即可，例如可举出抗(抗纤溶酶)抗体、抗D二聚体抗体、抗FDP抗体、抗tPA抗体、抗(凝血酶·抗凝血酶复合物)抗体、抗FPA抗体等凝血纤溶相关检查用抗体或与其对应的抗原；抗BFP抗体、抗CEA抗体、抗AFP抗体、抗TSH抗体、抗铁蛋白抗体、抗CA19－9抗体等肿瘤相关检查用抗体或与其对应的抗原；抗载脂蛋白抗体、抗β2－微球蛋白抗体、抗α1－微球蛋白抗体、抗免疫球蛋白抗体、抗CRP抗体、抗EpCAM抗体等血清蛋白相关检查用抗体或与其对应的抗原；抗HCG抗体等内分泌功能检查用抗体或与其对应的抗原；抗地高辛抗体、抗利多卡因抗体等药物分析用抗体或与其对应的抗原；HBs抗原、HCV抗原、HIV－1抗原、HIV－2抗原、HTLV－1抗原、支原体抗原、弓形虫抗原、链球菌溶血素O抗原等感染病相关检查用抗原或与其对应的抗体；DNA抗原、人热变性IgG等自身免疫相关检查用抗原或与其对应的抗体等。应予说明、抗体可以为多克隆抗体，也可以为单克隆抗体。
配体的键合只要依照常规方法进行即可，优选以共价键法进行。例如，反应性官能团为羧基、配体具有氨基时，可以使用脱水缩合剂使其键合。
本发明的配体键合固相载体能够广泛利用于体外诊断、生物化学领域中的研究等。本发明的配体键合固相载体特别适合用于免疫测定、用于生物分离(特别是细胞分离)以及用于核酸检测。
＜靶物质的检测或分离方法＞
本发明的检测或分离试样中的靶物质的方法的特征在于，使用本发明的配体键合固相载体。
靶物质只要与配体键合即可，具体而言，可举出抗原；单克隆抗体、多克隆抗体等抗体；细胞(正常细胞和大肠癌细胞、血中循环癌细胞等癌细胞)；DNA、RNA等核酸；蛋白质、肽、氨基酸、糖、多糖、脂质、维生素等生物体相关物质，也可以为成为创新药物目标的药物、生物素等小分子化合物。应予说明，靶物质可以被荧光物质等标记。
应予说明，试样只要是含有上述靶物质或具有含有靶物质的可能性的物质即可，具体而言为血液、血浆、血清、含有靶物质的缓冲溶液等。
本发明的检测或分离方法除使用本发明的配体键合固相载体以外，只要依照常规方法进行即可。例如，可举出包含以下工序的方法：将含有本发明的配体键合固相载体和靶物质的试样进行混合等使其接触的工序(接触工序)；以及使用磁石等将捕捉了靶物质的配体键合固相载体从试样分离的工序(分离工序)。应予说明，在该分离工序之后，也可以包含检测靶物质的工序或使配体与靶物质解离的工序。
实施例
以下，举出实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不限定于这些实施例。实施例中的各分析条件如以下所示。
＜链状聚合物的分子量测定＞
链状聚合物的分子量通过使用氢氧化钠水溶液进行水解，使链状聚合物从粒子游离之后进行测定。
即，在4g氢氧化钠水溶液(1N，pH14)中分散1g粒子，在25℃下搅拌3小时，使链状聚合物从粒子游离。使用磁力分离粒子，回收溶解有链状聚合物的上清。接下来，在该链状聚合物溶液中加入1M的盐酸进行中和直至溶液的pH成为7。为了用于算出链状聚合物的重量，预先由加入的1M盐酸的重量计算生成的氯化钠的重量，通过将中和后的溶液冷冻干燥而制成粉末，得到含有氯化钠的链状聚合物。另外，为了用于算出链状聚合物的重量，预先测定粉末的重量。
将上述粉体作为检体，使用TOSOH公司制的TSKgel G3000PWXL柱和日本分光公司制的Chrom NAV色谱数据工作站程序，利用凝胶渗透色谱(Gel PermeationChromatography：GPC)在以下的条件下测定，由此测定在粒子表面形成的链状聚合物的Mn和Mw。
(测定条件)
流量：0.8mL/分钟
洗脱溶剂：0.2M磷酸钠缓冲液(pH7.0)
柱温：25℃
标准物质：TOSOH公司制的TSK gel标准聚(环氧乙烷)SE－试剂盒及和光纯药工业公司制的聚乙二醇4000
＜链状聚合物在粒子表面所占的聚合物密度＞
通过下述式由从粒子游离的链状聚合物的重量、链状聚合物的数均分子量和粒子的表面积算出聚合物密度。
〔链状聚合物在粒子表面所占的密度(条/nm2)〕＝〔与粒子1g键合的链状聚合物的条数(条)〕/〔每1g粒子的总表面积(nm2)〕
应予说明，键合于1g粒子的链状聚合物的条数和1g粒子的总表面积的算出方法如以下所示。
(键合于1g粒子的链状聚合物的条数)
通过下述式(α)算出键合于每1g粒子的链状聚合物重量，通过下述式(β)和(γ)由得到的值算出键合于每1g粒子的链状聚合物的条数。
(α)：键合于每1g粒子的链状聚合物重量(mg)＝冷冻干燥后的粉末的重量(mg)－氯化钠的重量(mg)
(β)：键合于每1g粒子的链状聚合物的条数(mol)＝{键合于每1g粒子的链状聚合物重量(mg)÷链状聚合物的数均分子量(g/mol)}÷1000
(γ)：键合于每1g粒子的链状聚合物的条数(条)＝键合于每1g粒子的链状聚合物的条数(mol)×6.02×1023(阿伏伽德罗常数)
(每1g粒子的总表面积)
通过下述式(δ)～(θ)算出。应予说明，式(ε)中的粒子的比重由聚合物的比重、磁性体的比重和聚合物和磁性体在粒子中所占的比率计算。
(δ)：每1个粒子的体积(μm3)＝4/3×π×{粒子的体积平均半径(μm)}3
(ε)：每1个粒子的质量(g)＝每1个粒子的体积(μm3)×粒子的比重(g/μm3)
(ζ)：每1个粒子的粒子数(个)＝1g/每1个粒子的质量(g)
(η)：每1个粒子的表面积(nm2)＝4×π×{粒子的半径(nm)}2
(θ)：每1g粒子的总表面积(nm2)＝每1个粒子的表面积(nm2)×每1g粒子的粒子数(个)
＜反应性官能团含量＞
使用电导率测定法(Metrohm公司，794Basic Titrino)测定从粒子游离的链状聚合物中所含的反应性官能团(羧基)的含量，由此求出每1g粒子固体成分的反应性官能团的含量。
＜聚合比例〔m/(m+n)〕＞
m/(m+n)的值根据由下述式(A)、(B)和(C)得到的平均聚合度n和由下述式(D)得到的平均聚合度m算出。
(A)：每1g粒子的结构单元(2)的重量(g)＝每1g粒子的反应性官能团量(mol)×结构单元(2)的分子量(g/mol)
(B)：每1g粒子的结构单元(1)的重量(g)＝每1g粒子的链状聚合物的重量(g)－每1g粒子的结构单元(2)的重量(g)
(C)：n＝{每1g粒子的结构单元(1)的重量(g)/结构单元(1)的分子量(g/mol)}/每1g粒子的聚合物条数(条)
(D)：m＝每1g粒子的反应性官能团量(mol)/每1g粒子的聚合物条数(条)
＜体积平均粒径＞
各粒子的体积平均粒径利用激光衍射·散射粒径分布测定装置(BeckmanCoulter LS13320)测定。
〔合成例1表面具有羟基的磁性粒子的合成〕
将过氧化二(3,5,5-三甲基己酰)75％溶液(“PEROYL 355－75(S)”，日油株式会社制)2g与十二烷基硫酸钠1质量％水溶液20g混合，利用超声波分散机进行微细乳化。将其放入装有聚苯乙烯粒子(数均粒径：0.77μm)13g和水41g的反应器，在25℃下搅拌12小时。
接下来，在另一容器容器中，利用十二烷基硫酸钠0.1质量％水溶液400g使苯乙烯96g和二乙烯基苯4g乳化，将其放入上述反应器，在40℃下搅拌2小时后，升温至75℃聚合8小时。冷却至室温后，通过离心分离仅取出粒子，将该粒子水洗、干燥。将该粒子作为核粒子(数均粒径：1.5μm)。
接下来，在另一容器中，在油性磁性流体(“EXP Series，EMG”，株式会社Ferrotec制)中加入丙酮使粒子析出沉淀后，将其干燥，由此得到具有经疏水化处理的表面的铁素体系的磁性体微粒(平均一次粒径：0.01μm)。
接下来，利用混合机将上述核粒子15g和上述经疏水化处理的磁性体微粒15g充分混合，将该混合物使用Hybridization System NHS－0型(株式会社奈良机械制作所制)以叶片(搅拌叶片)的圆周速度100m/秒(16200rpm)处理5分钟，得到在表面具有由磁性体微粒构成的磁性体层的母粒子(数均粒径：2.0μm)。
接下来，将十二烷基硫酸钠0.50质量％水溶液250g投入500mL可分离式烧瓶，接下来，添加上述具有磁性体层的母粒子10g，利用均质机分散后，加热至60℃并保持温度。
接下来，在另一容器中，放入十二烷基硫酸钠0.50质量％水溶液75g、甲基丙烯酸甲酯(以下，称为“MMA”。)13.5g、三羟甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯(以下，称为“TMP”。)1.5g和过氧化二(3,5,5-三甲基己酰)75％溶液(“PEROYL 355－75(S)”，日油株式会社制)0.3g，使其分散而得到预乳液。将该预乳液经2小时全部滴加于保持在60℃的上述500mL可分离式烧瓶。滴加结束后，保持在60℃并搅拌1小时。
然后，在另一容器中，放入十二烷基硫酸钠0.50质量％水溶液37.5g、甲基丙烯酸缩水甘油酯(以下称为“GMA”。)6.56g、TMP 0.94g和过氧化二(3,5,5-三甲基己酰)75％溶液(“PEROYL 355－75(S)”，日油株式会社制)0.15g，使其分散而得到预乳液。将该预乳液经1小时20分钟全部滴加于保持在60℃的上述500mL可分离式烧瓶。然后，升温至75℃后，进一步持续聚合2小时，使反应结束。接着，向该500mL可分离式烧瓶放入1mol/L的硫酸水溶液10mL，在60℃下搅拌6小时。接下来，使用磁力将上述500mL可分离式烧瓶中的粒子分离后，使用蒸馏水反复清洗。
通过以上操作，得到表面具有羟基的磁性粒子。
〔合成例2表面具有原子转移自由基聚合引发基团的磁性粒子的合成(1)〕
将合成例1中得到的表面具有羟基的磁性粒子10g投入烧瓶，在氮气流下加入脱水四氢呋喃32mL和三乙胺7.5mL并搅拌。将该烧瓶浸入冰浴中，经30分钟滴加2－溴异丁酰溴6.3mL。在室温下反应6小时后，使用磁力将烧瓶内的粒子分离后，将粒子再分散于丙酮。进一步进行多次磁力分离和再分散后，将粒子分散于十二烷基硫酸钠0.10质量％水溶液。通过荧光X射线分析，检测原子转移自由基聚合引发基团(2－溴异丁酰基)中所含的Br。
通过以上操作，得到表面具有原子转移自由基聚合引发基团(2－溴异丁酰基)的磁性粒子。将该粒子作为粒子(A)。
〔合成例3表面具有原子转移自由基聚合引发基团的磁性粒子的合成(2)〕
将合成例1中得到的表面具有羟基的磁性粒子10g投入烧瓶，在氮气流下加入脱水四氢呋喃32mL和三乙胺0.4mL并搅拌。将该烧瓶浸入冰浴中，加入2－溴异丁酰溴0.2mL。在室温下反应6小时后，使用磁力将烧瓶内的粒子分离后，将粒子再分散于丙酮。进一步进行多次磁力分离和再分散后，将粒子分散于十二烷基硫酸钠0.10质量％水溶液。通过荧光X射线分析，检测原子转移自由基聚合引发基团(2－溴异丁酰基)中所含的Br。
通过以上操作，得到表面具有原子转移自由基聚合引发基团(2－溴异丁酰基)的磁性粒子。将该粒子作为粒子(B)。
〔合成例4表面具有原子转移自由基聚合引发基团的磁性粒子的合成(3)〕
将合成例1中得到的表面具有羟基的磁性粒子10g投入烧瓶，在氮气流下加入脱水四氢呋喃32mL和三乙胺0.2mL并搅拌。将该烧瓶浸入冰浴中，经30分钟滴加2－溴异丁酰溴0.1mL。在室温下反应6小时后，使用磁力将烧瓶内的粒子分离后，将粒子再散于丙酮。进一步进行多次磁力分离和再分散后，将粒子分散于十二烷基硫酸钠0.10质量％水溶液。通过荧光X射线分析，检测原子转移自由基聚合引发基团(2－溴异丁酰基)中所含的Br。
通过以上操作，得到表面具有原子转移自由基聚合引发基团(2－溴异丁酰基)的磁性粒子。将该粒子作为粒子(C)。
〔实施例1〕
(链状聚合物伸长反应(1))
依照以下的合成路线进行链状聚合物伸长反应。
即，使合成例2中得到的粒子(A)2g分散于磷酸钠缓冲液(50mM，pH7.8)6mL，向其中加入[2－(甲基丙烯酰氧基)乙基](氧负离子羰基甲基)二甲基铵(以下称为“CBMA”。)0.5g和0.05mol/L的三(2－吡啶基甲基)胺与0.05mol/L的溴化铜(II)的混合水溶液0.40mL。接着，加入L－抗坏血酸0.2mol/L水溶液1.0mL，密闭并开始反应。在45℃下搅拌4小时后，开封暴露于空气中使反应停止。使用磁力分离粒子，将未反应的单体、催化剂等除去。
(链状聚合物伸长反应(2))
接下来，依照以下的合成路线进行链状聚合物伸长反应。
即，使上述得到的粒子分散于磷酸钠缓冲液(50mM，pH7.8)6mL，向其中加入2－羟基乙基丙烯酰胺(以下，称为“HEAA”。)0.5g和0.05mol/L的三(2－吡啶基甲基)胺与0.05mol/L的溴化铜(II)的混合水溶液0.40mL。接着，加入L－抗坏血酸0.2mol/L水溶液1.0mL，密闭并开始反应。在45℃下搅拌3小时后，开封暴露于空气中使反应停止。使用磁力分离粒子，除去未反应的单体、催化剂等，由此得到CBMA和HEAA的嵌段共聚物键合于表面的磁性粒子。体积平均粒径为3.0μm。测定CBMA和HEAA的嵌段共聚物的Mn、Mw、Mw/Mn和嵌段共聚物的聚合物密度。测定结果示于表1。
(缩合反应)
接下来，依照以下的合成路线进行缩合反应。
即，使上述得到的粒子1.5g分散于二甲基亚砜(DMSO)8mL，向其中加入溶解了琥珀酸酐1.5g的DMSO溶液7.2mL和三乙胺0.3mL开始反应。在25℃下搅拌4小时后，使用磁力分离粒子，将过量的原料除去。
通过以上操作，得到将HEAA末端的羟基转换为反应性官能团(羧基)的磁性粒子1。测定羧基含量和聚合比例〔m/(m+n)〕。测定结果示于表1。
〔实施例2〕
将利用HEAA使链状聚合物伸长的链状聚合物伸长反应(2)的反应时间由3小时变更为1小时，除此以外，进行与实施例1同样的操作，得到将HEAA末端的羟基转换为反应性官能团(羧基)的磁性粒子2。体积平均粒径为3.0μm。
应予说明，与实施例1同样地进行的体积平均粒径以外的各测定结果示于表1。
〔实施例3〕
将利用HEAA使链状聚合物伸长的链状聚合物伸长反应(2)的反应时间由3小时变更为30分钟，除此以外，进行与实施例1同样的操作，得到将HEAA末端的羟基转换为反应性官能团(羧基)的磁性粒子3。体积平均粒径为3.0μm。
应予说明，与实施例1同样地进行的体积平均粒径以外的各测定结果示于表1。
〔实施例4〕
将利用HEAA使链状聚合物伸长的链状聚合物伸长反应(2)的反应时间由3小时变更为15分钟，除此以外，进行与实施例1同样的操作，得到将HEAA末端的羟基转换为反应性官能团(羧基)的磁性粒子4。体积平均粒径为3.0μm。
应予说明，与实施例1同样地进行的体积平均粒径以外的各测定结果示于表1。
〔实施例5〕
使合成例2中得到的粒子(A)2g分散于磷酸钠缓冲液(50mM，pH7.8)6mL，向其中加入CBMA 0.5g、HEAA 0.5g和0.05mol/L的三(2－吡啶基甲基)胺与0.05mol/L的溴化铜(II)的混合水溶液0.40mL。接着，加入L－抗坏血酸0.2mol/L水溶液1.0mL，密闭并开始反应。在45℃下搅拌4小时后，开封暴露于空气使反应停止。使用磁力分离粒子，将未反应的单体、催化剂等除去，由此得到CBMA和HEAA的无规共聚物键合于表面的磁性粒子。测定CBMA和HEAA的无规共聚物的Mn、Mw、Mw/Mn和无规共聚物的聚合物密度。测定结果示于表1。
使上述得到的粒子1.5g分散于二甲基亚砜(DMSO)8mL，向其中加入溶解了琥珀酸酐1.5g的DMSO溶液7.2mL和三乙胺0.3mL开始反应。在25℃下搅拌4小时后，使用磁力分离粒子，将过量的原料除去。
通过以上操作，得到将HEAA末端的羟基转换为反应性官能团(羧基)的磁性粒子5。体积平均粒径为3.0μm。测定羧基含量和聚合比例〔m/(m+n)〕。测定结果示于表1。
〔实施例6〕
分别将CBMA的使用量由0.5g变更为0.8g，将HEAA的使用量由0.5g变更为0.2g，除此以外，进行与实施例5同样的操作，得到将HEAA末端的羟基转换为反应性官能团(羧基)的磁性粒子6。体积平均粒径为3.0μm。
应予说明，与实施例5同样地进行的体积平均粒径以外的各测定结果示于表1。
〔实施例7〕
将粒子(A)变更为合成例3中得到的粒子(B)，除此以外，进行与实施例2同样的操作，得到将HEAA末端的羟基转换为反应性官能团(羧基)的磁性粒子7。体积平均粒径为3.0μm。
应予说明，与实施例1同样地进行的体积平均粒径以外的各测定结果示于表1。
〔实施例8〕
(链状聚合物链伸长反应(1))
使合成例2中得到的粒子(A)2g分散于磷酸钠缓冲液(50mM，pH7.8)6mL，向其中加入[2－(甲基丙烯酰氧基)乙基]二甲基－(3－磺丙基)氢氧化铵(以下称为“SBMA”。)0.5g和0.05mol/L的三(2－吡啶基甲基)胺与0.05mol/L的溴化铜(II)的混合水溶液0.40mL。接着，加入L－抗坏血酸0.2mol/L水溶液1.0mL，密闭并开始反应。在45℃下搅拌4小时后，开封暴露于空气使反应停止。使用磁力分离粒子，除去未反应的单体、催化剂等。
(链状聚合物伸长反应(2))
接下来，使上述得到的粒子分散于磷酸钠缓冲液(50mM，pH7.8)6mL，向其中加入HEAA0.5g和0.05mol/L的三(2－吡啶基甲基)胺与0.05mol/L的溴化铜(II)的混合水溶液0.40mL。接着，加入L－抗坏血酸0.2mol/L水溶液1.0mL，密闭并开始反应。在45℃下搅拌30分钟后，开封暴露于空气，由此使反应停止。使用磁力分离粒子，将未反应的单体、催化剂等除去，由此得到SBMA和HEAA的嵌段共聚物键合于表面的磁性粒子。体积平均粒径为3.0μm。测定SBMA和HEAA的嵌段共聚物的Mn、Mw、Mw/Mn和嵌段共聚物的聚合物密度。测定结果示于表1。
(缩合反应)
接下来，使上述得到的粒子1.5g分散于二甲基亚砜(DMSO)8mL，向其中加入溶解了琥珀酸酐1.5g的DMSO溶液7.2mL和三乙胺0.3mL并开始反应。在25℃下搅拌4小时后，使用磁力分离粒子，将过量的原料除去。
通过以上操作，得到将HEAA末端的羟基转换为反应性官能团(羧基)的磁性粒子8。测定羧基含量和聚合比例〔m/(m+n)〕。测定结果示于表1。
〔比较例1〕
使合成例2中得到的粒子(A)2g分散于磷酸钠缓冲液(50mM，pH7.8)6mL，向其中加入甲基丙烯酸－2－羟基乙酯(以下，称为“HEMA”。)0.5g和0.05mol/L的三(2－吡啶基甲基)胺与0.05mol/L的溴化铜(II)的混合水溶液0.40mL。接着，加入L－抗坏血酸0.2mol/L水溶液1.0mL，密闭并开始反应。在45℃下搅拌4小时后，开封暴露于空气，由此使反应停止。使用磁力分离粒子，除去未反应的单体、催化剂等。通过以上操作，得到HEMA的均聚物键合于表面的磁性粒子9。体积平均粒径为3.0μm。
〔比较例2〕
将CBMA变更为甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯季化物(Light Ester DQ－100共荣社化学株式会社制(利用氯甲烷将甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯季化而成的物质))，除此以外，进行与实施例2同样的操作，得到将HEAA末端的羟基转换为反应性官能团(羧基)的磁性粒子10。体积平均粒径为3.0μm。
应予说明，与实施例1同样地进行的体积平均粒径以外的各测定结果示于表1。
〔比较例3〕
将CBMA变更为甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯季铵化物(Light Ester DQ－100共荣社化学株式会社制造(利用氯甲烷将甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯季铵化的物质))，除此以外，进行与实施例6同样的操作，得到将HEAA末端的羟基转换为反应性官能团(羧基)的磁性粒子11。体积平均粒径为3.0μm。
应予说明，与实施例5同样地进行的体积平均粒径以外的各测定结果示于表1。
〔比较例4〕
使合成例1中得到的表面具有羟基的磁性粒子1g分散于1,3－二氧戊环4.8mL，向其中加入使三乙胺0.2mL和琥珀酸酐0.08g溶解于1,3－二氧戊环4.8mL而成的溶液。在25℃下反应4小时后，使用磁力分离粒子，将粒子分散于水。通过以上操作，得到不具有链状聚合物的含反应性官能团磁性粒子12。测定羧基含量。测定结果示于表1。
〔比较例5〕
使合成例2中得到的粒子(A)2g分散于磷酸钠缓冲液(50mM，pH7.8)6mL，向其中加入CBMA0.5g和0.05mol/L的三(2－吡啶基甲基)胺与0.05mol/L的溴化铜(II)的混合水溶液0.40mL。接着，加入L－抗坏血酸0.2mol/L水溶液1.0mL，密闭并开始反应。在45℃下搅拌4小时后，开封暴露于空气，由此，使反应停止。使用磁力分离粒子，除去未反应的单体、催化剂等。通过以上操作，得到CBMA的均聚物键合于表面的磁性粒子13。体积平均粒径为3.0μm。
〔试验例1(水分散性)〕
使各实施例和比较例中得到的磁性粒子100mg分别分散于水1mL。比较例1中得到的磁性粒子在水中分散性差、凝聚。关于其它磁性粒子，没有凝聚而分散。评价结果示于表2。
〔试验例2(非特异吸附抑制效果)〕
使各实施例和比较例2～5中得到的磁性粒子1mg分别分散于水2mL。将该水分散液投入Eppendorf管，使用磁力分离粒子，除去上清液。接下来，向粒子加入Jurkat细胞破碎液(含有蛋白质夹杂物100μg)100μL，培养30分钟，然后使用磁力分离粒子，除去上清液，利用TBS－T(0.05质量％Tween20)缓冲液将粒子清洗5次。进一步使用磁力分离粒子，除去上清液后，加入十二烷基苯磺酸钠水溶液(0.5质量％)，从粒子剥离非特异吸附的蛋白质夹杂物。将该剥离溶液进行SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳，将凝胶进行CBB染色，通过目视确认非特异吸附于粒子的蛋白质的量，通过以下的基准进行评价。蛋白质的量越少的粒子越可以说是非特异吸附少的良好的粒子。评价结果示于表2。
(评价标准)
◎：基本没有发现蛋白质的吸附，非常良好
○：没怎么发现蛋白质的吸附，良好
Δ：稍微发现蛋白质的吸附，略微良好
×：明显确认到蛋白质的吸附，不良
〔试验例3(抗体键合量)〕
使各实施例和比较例2～5中得到的磁性粒子1mg分别分散于水2mL。将该水分散液投入Eppendorf管，使用磁力分离粒子，除去上清液。接下来，使粒子分散于MES缓冲液(100mM，pH5.0)990μL，加入1－乙基－3－(3－二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(10mg/mL)10μL，在室温下培养30分钟。使用磁力分离粒子，除去上清液，使其分散于MES缓冲液(100mM，pH5.0)1mL，加入抗TSH抗体(Funakoshi公司制)15μg。在室温下培养12小时后，使用磁力分离粒子，除去上清液。利用TBS－T(0.05质量％Tween20)缓冲液清洗5次，得到抗体键合粒子。
接下来，通过BCA测定求出抗体键合量。即，使抗体键合粒子1mg分散于BCA蛋白测定试剂试剂盒(BCA Assay Reagent Kit)(Thermo Fisher制)的A/B混合液1mL，在37℃下颠倒混合30分钟。使用磁力分离粒子，除去上清液，测定570nm处的吸光度。另外，分别混合溶解了抗TSH抗体0μg、2μg、4μg、8μg、16μg的抗体溶液和上述A/B混合液1mL，在37℃下颠倒混合30分钟后，测定反应溶液的570nm处的吸光度。由得到的标准曲线求出键合于磁性粒子的抗体键合量。将结果示于表2。
〔试验例4(CLEIA)〕
在试管中取试验例3中得到的抗体键合粒子的分散液5μL(相当于粒子50μg)，混合添加有胎牛血清(FCS)50μL的200μIU/mL的TSH抗原溶液(FUJIREBIO公司制的LUMIPULSETSH－III标准TSH溶液)50μL，在25℃下反应10分钟。使用磁力分离粒子，除去上清液后，作为2次抗体添加用碱性磷酸酶标记的抗TSH抗体(FUJIREBIO公司制的LUMIPULSE TSH－III免疫反应盒附属)40μL，在25℃下反应10分钟。使用磁力分离粒子，除去上清液后，使利用PBS重复3次清洗而得到的粒子分散于50μL的0.01％TritonX－100，转移至新的管。加入碱性磷酸酶的基质液(FUJIREBIO公司制的LUMIPULSE基质液)100μL，在37℃下反应10分钟后，作为信号测定化学发光量。化学发光的测定使用Berthold Japan公司制的化学发光测定装置(Lumat LB9507)。另外，采用0μIU/mL的TSH校准器代替上述中的200μIU/mL的TSH抗原溶液，除此以外，同样地作为噪音测定化学发光量。进而，算出信号(S)除以噪音(N)的值S/N。将结果示于表2。
〔试验例5(细胞捕捉率)〕
使各实施例和比较例2～5中得到的磁性粒子1mg分别分散于水2mL。将该水分散液投入Eppendorf管，使用磁力分离粒子，除去上清液。接下来，使粒子分散于MES缓冲液(100mM，pH5.0)990μL，加入1－乙基－3－(3－二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(10mg/mL)10μL，在室温下培养30分钟。使用磁力分离粒子，除去上清液，使其分散于MES缓冲液(100mM，pH5.0)1mL，加入抗EpCAM抗体5μg。在室温下培养12小时后，使用磁力分离粒子，除去上清液。利用TBS－T(0.05质量％Tween20)缓冲液清洗5次，得到抗体键合粒子。
将该抗体键合粒子利用PBS(－)缓冲液清洗4次后，使其分散于PBS(－)缓冲液250μL。接下来，将分散于Dulbecco’s PBS(－)缓冲液50μL的大肠癌细胞(HT－29)90000cells与抗体键合粒子混合，在4℃下搅拌30分钟进行细胞捕捉。使用磁力分离粒子，除去上清液，利用PBS(－)缓冲液清洗4次，由此得到细胞捕捉粒子。接下来，将Proteinase K 50μL加入于细胞捕捉粒子在55℃下反应15分钟，接着在100℃下反应20分钟，由此将细胞内部的DNA洗脱。使用磁力分离粒子，回收上清液后，加入将β－珠蛋白作为靶的PCR鸡尾酒(PCRCocktail)实施PCR，根据由Ct值求出的捕捉细胞数算出特异性细胞捕捉率。将结果示于表2。
另外，不使EpCAM抗体键合于粒子，除此以外，进行与上述同样的操作，由捕捉细胞数算出非特异性细胞捕捉率。将结果示于表2。
[表1]
[表2]
如表1和2所示，实施例1～8的磁性粒子具有高的水分散性，非特异吸附被抑制，且配体容易键合于反应性官能团。另外，S/N(信号/噪音)比高，能够以高灵敏度且低噪音化检测抗原。另外，实施例1～8的磁性粒子能够以高的比例特异性地捕捉靶细胞，且能够抑制非特异性吸附。

Claims (21)

1.一种固相载体，是含有下述式(1)所示的结构单元和下述式(2)所示的结构单元的聚合物键合而成的，
式(1)中，
R1表示氢原子或甲基，
R2表示具有两性离子结构的有机基团，
式(2)中，
R3表示氢原子或甲基，
R4表示－(C＝O)－O－*、－(C＝O)－NR6－*或亚苯基，其中，R6表示氢原子或甲基，*表示与式(2)中的R5键合的位置，
R4为－(C＝O)－O－*时，R5表示氢原子或具有反应性官能团的有机基团，R4为－(C＝O)－NR6－*或亚苯基时，R5表示具有反应性官能团的有机基团，
但是，R5不是具有两性离子结构的有机基团。
2.根据权利要求1所述的固相载体，其中，R2是具有季铵盐型阳离子性官能团以及选自－(C＝O)O-、－SO3 -和－O－(O＝P－O-)－O－中的1价或2价的阴离子性官能团的有机基团。
3.根据权利要求1或2所述的固相载体，其中，R2是下述式(3)或(4)所示的有机基团，
式(3)中，
R7表示－(C＝O)－O－*、－(C＝O)－NR13－*或亚苯基，其中，R13表示氢原子或甲基，*表示与式(3)中的R8键合的位置，
R8和R9各自独立地表示单键或碳原子数1～10的2价的有机基团，
R10表示－(C＝O)O-或－SO3 -，
R11和R12各自独立地表示甲基或乙基，
式(4)中，
R14表示－(C＝O)－O－*、－(C＝O)－NR20－*或亚苯基，其中，R20表示氢原子或甲基，*表示与式(4)中的R15键合的位置，
R15和R16各自独立地表示单键或碳原子数1～10的2价的有机基团，
R17、R18和R19各自独立地表示甲基或乙基。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的固相载体，其中，所述固相载体是粒子。
5.根据权利要求4所述的固相载体，其中，所述固相载体是磁性粒子。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的固相载体，其中，相对于所述固相载体的表面，所述聚合物占有的密度为0.1～1.2条/nm2。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的固相载体，其中，所述聚合物的重均分子量为1000～100000。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的固相载体，其中，所述聚合物的分子量分布为1.0～2.5。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的固相载体，其中，所述式(1)所示的结构单元的平均聚合度n和所述式(2)所示的结构单元的平均聚合度m均为1以上，且聚合比例〔m/(m+n)〕为0.01～0.75。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的固相载体，其中，所述聚合物是含有由所述式(1)所示的结构单元的重复而构成的第1嵌段和由所述式(2)所示的结构单元的重复而构成的第2嵌段的嵌段聚合物。
11.根据权利要求1～9中任一项所述的固相载体，其中，所述聚合物是无规聚合物。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的固相载体，其中，所述反应性官能团是羧基、甲苯磺酰基、氨基、环氧基、酰基或叠氮基。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的固相载体，其中，所述反应性官能团的含量相对于固相载体的固体成分1g为1～200μmol。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的固相载体，是通过固相载体的制造方法而得到的，所述固相载体的制造方法至少包含准备具有聚合引发基团的载体的工序和将所述聚合引发基团作为起点使单体聚合的工序。
15.根据权利要求14所述的固相载体，其中，所述聚合引发基团是原子转移自由基聚合引发基团。
16.一种配体键合固相载体，是使配体键合于权利要求1～15中任一项所述的固相载体而成的。
17.根据权利要求16所述的配体键合固相载体，其中，所述配体是抗体、抗原、核酸、核苷酸、核苷、蛋白质、肽、氨基酸、多糖、糖、脂质、维生素、药物、基质、激素、神经递质或合成分子。
18.根据权利要求1～17中任一项所述的固相载体或配体键合固相载体，其中，所述固相载体或配体键合固相载体为免疫测定用、细胞分离用或核酸检测用。
19.一种检测或分离试样中的靶物质的方法，其特征在于，使用权利要求16或17所述的配体键合固相载体。
20.一种制造方法，是含有下述式(1)所示的结构单元和下述式(2)所示的结构单元的聚合物键合而成的固相载体的制造方法，其特征在于，包含以下工序：
工序1，准备具有聚合引发基团的载体的工序；以及
工序2，将所述聚合引发基团作为起点使单体聚合的工序，
式(1)中，
R1表示氢原子或甲基，
R2表示具有两性离子结构的有机基团，
式(2)中，
R3表示氢原子或甲基,
R4表示－(C＝O)－O－*、－(C＝O)－NR6－*或亚苯基,其中，R6表示氢原子或甲基,*表示与式(2)中的R5键合的位置，
R4为－(C＝O)－O－*时，R5表示氢原子或具有反应性官能团的有机基团，R4为－(C＝O)－NR6－*或亚苯基时，R5表示具有反应性官能团的有机基团，
但是，R5不是具有两性离子结构的有机基团。
21.根据权利要求20所述的制造方法，其中，所述聚合引发基团是原子转移自由基聚合引发基团。
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