CN110643347A - 一种适配体封装铁卟啉的介孔二氧化硅的制备及其传感应用 - Google Patents

一种适配体封装铁卟啉的介孔二氧化硅的制备及其传感应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适配体封装铁卟啉的介孔二氧化硅的制备及其传感应用技术。主要技术特征是：制备了适配体封装羟化高铁血红素/介孔二氧化硅复合材料，制备过程简单，条件易于控制，可明显提高该复合材料的特异性识别能力和封装能力；本发明同时提供了一种检测凝血酶的新方法，将适配体封装羟化高铁血红素/介孔二氧化硅复合材料与流动注射‑化学发光技术联用，构建了检测凝血酶的化学发光传感器，该传感器具有灵敏度高、选择性好、操作方便等优点，并且成功用于血清样品中凝血酶的检测，表现出高的准确度，为应用于实际检测提供了可能，提供了一种可替代的检测凝血酶的新方法，在人类健康、医学研究等领域具有重要意义。

Description

一种适配体封装铁卟啉的介孔二氧化硅的制备及其传感应用
技术领域
本发明涉及的是一种适配体封装铁卟啉的介孔二氧化硅复合材料的制备及其在化学发光传感器中的应用技术，属于功能化复合材料的制备和传感器的构建领域，具体涉及用适配体将铁卟啉封装于介孔二氧化硅孔道中的介孔二氧化硅复合材料的制备及该复合材料在化学发光传感器检测凝血酶中的应用。
背景技术
有序介孔材料，作为一种新型纳米结构材料，自上世纪90年代兴起一直受到科研工作者们的广泛关。有序介孔材料是以表面活性剂形成的超分子结构为模板，利用溶胶-凝胶工艺，通过有机物和无机物界面间的定向作用，组装成孔径在 2 ~ 30nm 之间孔径分布窄且有规则孔道结构的无机多孔材料。介孔材料的特点与结构优势体现为较大的比表面积和孔道体积，这为其在环境污染物处理、能源储存、生物医学等领域的应用提供了可能。其中，硅基介孔材料由于其孔径分布狭窄、孔道结构规则、制备技术相对成熟，研究和应用较多。硅基介孔材料已经广泛用于催化、分离提纯、药物包埋缓释、气体传感等领域。在申请号为2016100525460的专利中公开了一种纳米金星负载的介孔二氧化硅的制备方法及其在US/CT/PA成像和光热治疗中的应用。在申请号为2016100525460的专利中公开了一种中空介孔二氧化硅纳米药物胶囊的合成方法及其在药物的装载、纳米胶囊的封装中的应用。
金属卟啉化合物是卟啉化合物与金属离子形成配合物的总称，当母体卟啉中的2个吡咯质子（N-H）被金属离子取代后即形成了金属卟啉化合物，其在生命过程及科学研究中起着重要作用。而当卟啉空腔被铁原子取代后，我们将之称其铁卟啉化合物，即铁卟啉。铁卟啉在自然界中广泛存在，如血红素，细胞素P450等等，因其特殊的结构特点和功能作用，在生物、医药、能源及催化等方面有着广泛的应用。辣根过氧化酶的辅基 — 氯化血红素（Hemin），作为铁卟啉的一种，能够像辣根过氧化物酶（HRP）一样催化鲁米诺的化学发光反应，并且已用于传感分析领域。据报道，羟化高铁血红素催化活性明显高于HRP，以单位重量计算，活性比HRP高400倍。
循环血液中的凝血酶是以无活性的凝血酶原形式存在，正常人体内仅存在极微量有活性的凝血酶。凝血酶是血栓与止血的关键环节，如果机体受到某种疾病的损害引起凝血和抗凝平衡失调，体内凝血酶活性即有所改变。凝血酶不但参与凝血过程，还作为一种重要的细胞外信号分子，通过激活凝血酶受体，参与一系列病理过程。因此，血浆凝血酶浓度的检测对临床疾病的诊断，病程发展、愈后以及疗效的监测和评估等都具有非常重要的意义。传统的检测凝血酶的方法是免疫法，但是仍然存在许多缺点，如抗体只可以与抗原结合，酶只与其底物结合，而且稳定性差等，不能满足临床的检测要求。因此快速、有效地检测凝血酶对临床诊断非常重要。
流动注射-化学发光分析技术集合了流动注射的可自动进样、操作方便和化学发光分析的灵敏度高、仪器简单、线性范围宽、分析速度快等优点，在分析化学领域中应用广泛。但是化学发光分析存在着两处缺点，其一，化学发光体系自身的化学发光强度较弱，需要引入一些具有催化功能的物质来提高其发光强度，目前常用于化学发光体系的催化剂有酶（包含生物酶、模拟酶）、金属纳米粒子、量子点等；其二，化学发光方法的选择性较差，检测体系中的共存物质容易引起化学发光体系中化学发光强度的变化，通常可以引用一些特异性识别材料来提高该方法的选择性，常用的特异性识别材料一般包含分子印迹材料、抗原-抗体材料和适配体材料。
本发明旨在制备具有高识别能力和催化能力的适配体封装羟化高铁血红素的介孔二氧化硅复合材料，并将该复合材料用于流动注射-化学发光检测中，构建检测凝血酶的化学发光传感器。其优点在于制备的功能化复合材料同时具有了高识别能力和催化能力；将该复合材料与流动注射-化学发光联用，发明了一种简单、高灵敏、高选择性地检测凝血酶的新方法。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种适配体封装羟化高铁血红素/介孔二氧化硅复合材料的制备方法，主要是制备接孔二氧化硅，并用适配体在其孔道中封装羟化高铁血红素，得到对凝血酶分子有高特异性识别能力的功能化介孔二氧化硅复合材料。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
（1）氨基化介孔二氧化硅的制备：将0.4 ~ 0.6 g 介孔二氧化硅加入到3 ~ 5 mL氨丙基三乙氧基硅烷与15 ~ 25 mL无水甲苯的混合液中；将该反应溶液在N2保护下，75 ~ 85 ˚C加热回流10 ~ 16 h；将产物离心收集并用乙醇洗涤至中性，置于50 ~ 60 ˚C真空干燥箱中干燥；
（2）适配体封装羟化高铁血红素/介孔二氧化硅复合材料的制备：以PH = 7.0 ~ 7.4的磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.2mol/L）为溶剂配制100 mL 0.05 ~ 0.15 g/L的氨基化介孔二氧化硅分散液；用移液管移取3 ~ 8 mL该分散液放入10 mL离心管中，然后向该离心管中加入400 ~ 600 uL 0.1 g/L的羟化高铁血红素，将该离心管在室温下振荡1 ~ 3 h；接着向该离心管中加入1.0 ~ 2.5 mL的2.5 × 10-6 mol/L 凝血酶适配体溶液，0.02 ~ 0. 05 g N-羟基琥珀酰亚胺和0.02 ~ 0. 05 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，随后将该离心管在室温振荡1 ~ 3 h；振荡完成后，将该离心管离心分离以除去未被封装的羟化高铁血红素和多余的凝血酶适配体，并用紫外-可见光分光光度计测得上清液的吸收光谱以确定羟化高铁血红素的封装量；将离心后的适配体封装羟化高铁血红素/介孔二氧化硅复合材料用上述的PBS定容到100 mL容量瓶中并置于4 ˚C冰箱中备用。
本发明的另一个目的是将适配体封装羟化高铁血红素/介孔二氧化硅复合材料用于构建化学发光传感器，实现对凝血酶的高灵敏、高选择性检测。将制备好的适配体封装羟化高铁血红素/介孔二氧化硅复合材料置于样品管中，当凝血酶存在时，凝血酶分子与其适配体特异性识别并结合在一起，使得羟化高铁血红素得到释放，释放的羟化高铁血红素催化鲁米诺-过氧化氢化学发光反应，使得化学发光强度增强，实现对凝血酶的高灵敏、高选择性检测。该化学发光化学传感器检测凝血酶的特征为：灵敏度高、选择性好、操作方便、仪器简单。在该化学发光化学传感器的构建中，优化了化学发光条件，绘制了工作曲线，研究了该传感器的抗干扰能力，最后用于血清样品中凝血酶的检测。
本发明的优点及效果是：
（1）本发明制备了适配体封装羟化高铁血红素/介孔二氧化硅复合材料，通过适配体和氨基化介孔二氧化硅间的酰胺键和氢键作用将羟化高铁血红素封装在介孔二氧化硅的孔道中，得到适配体、羟化高铁血红素双功能化的介孔二氧化硅复合材料。该复合材料有强的靶特异性识别能力、基于目标物的可控释放催化剂能力和优异的生物相容性，通过紫外光谱及朗伯比尔定律算得实际封装羟化高铁血红素的量为2.0×10-4 ~ 3.2×10-4 g/L；
（2）本发明制备了适配体封装羟化高铁血红素/介孔二氧化硅复合材料，制备过程简单，条件易于控制，可明显提高该复合材料的特异性识别能力和封装能力；
（3）本发明制备的适配体封装羟化高铁血红素/介孔二氧化硅复合材料应用于化学发光传感器检凝血酶中，该方法检测凝血酶表现出无需样品前处理、操作简单，抗干扰能力强，和灵敏度高等优点，并成功用于血清样品中凝血酶的检测，为应用于实际检测提供了可能，提供了一种可替代的检测凝血酶的新方法，在人类健康、医学研究等领域具有重要意义。
具体实施方式
实施例1
（1）氨基化介孔二氧化硅的制备：将0.4 g 介孔二氧化硅加入到3 mL氨丙基三乙氧基硅烷与15 mL无水甲苯的混合液中；将该反应溶液在N2保护下，80 ˚C加热回流12 h；将产物离心收集并用乙醇洗涤至中性，置于50 ˚C真空干燥箱中干燥；
（2）适配体封装羟化高铁血红素/介孔二氧化硅复合材料的制备：以PH = 7.0的磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.2mol/L）为溶剂配制100 mL 0.05 g/L的氨基化介孔二氧化硅分散液；用移液管移取5 mL该分散液放入10 mL离心管中，然后向该离心管中加入400 uL 0.1 g/L的羟化高铁血红素，将该离心管在室温下振荡1.5 h；接着向该离心管中加入1.0 mL的2.5 ×10-6 mol/L 凝血酶适配体溶液，0.03 g N-羟基琥珀酰亚胺和0.03 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，随后将该离心管在室温振荡2 h；振荡完成后，将该离心管离心分离以除去未被封装的羟化高铁血红素和多余的凝血酶适配体，并用紫外-可见光分光光度计测得上清液的吸收光谱以确定羟化高铁血红素的封装量；将离心后的适配体封装羟化高铁血红素/介孔二氧化硅复合材料用上述的PBS定容到100 mL容量瓶中并置于4 ˚C冰箱中备用。
实施例2
（1）氨基化介孔二氧化硅的制备：将0.5 g 介孔二氧化硅加入到5 mL氨丙基三乙氧基硅烷与20 mL无水甲苯的混合液中；将该反应溶液在N2保护下，85 ˚C加热回流14 h；将产物离心收集并用乙醇洗涤至中性，置于60 ˚C真空干燥箱中干燥；
（2）适配体封装羟化高铁血红素/介孔二氧化硅复合材料的制备：以PH = 7.4的磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.2mol/L）为溶剂配制100 mL 0.10 g/L的氨基化介孔二氧化硅分散液；用移液管移取6 mL该分散液放入10 mL离心管中，然后向该离心管中加入600 uL 0.1 g/L的羟化高铁血红素，将该离心管在室温下振荡2 h；接着向该离心管中加入2.5 mL的2.5 ×10-6 mol/L 凝血酶适配体溶液， 0. 04 g N-羟基琥珀酰亚胺和0. 05 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，随后将该离心管在室温振荡1 ~ 3 h；振荡完成后，将该离心管离心分离以除去未被封装的羟化高铁血红素和多余的凝血酶适配体，并用紫外-可见光分光光度计测得上清液的吸收光谱以确定羟化高铁血红素的封装量；将离心后的适配体封装羟化高铁血红素/介孔二氧化硅复合材料用上述的PBS定容到100 mL容量瓶中并置于4 ˚C冰箱中备用。
实施例3
适配体封装羟化高铁血红素/介孔二氧化硅复合材料应用于化学发光传感器检测凝血酶的方法：将该复合材料放置于流动注射-化学发光仪的样品管中，样品管中不同浓度的凝血酶将引起复合材料内部羟化高铁血红素的不同释放量，进而催化鲁米诺-过氧化氢化学发光反应的进行，得到不同强度的化学发光强度值，以此实现凝血酶的定量检测，该化学发光传感器检测凝血酶的过程如下：
（1）空白对照组检测：启动主泵和副泵，进样阀处于进样位置，氢氧化钠、过氧化氢、鲁米诺溶及PBS缓冲液合并流动311 s，产生弱的化学发光I 0；
（2）凝血酶样品检测：启动主泵和副泵，进样阀处于进样位置，氢氧化钠、过氧化氢、鲁米诺溶液及样品液合并流动311 s，产生化学发光I，所测最终化学发光差值为ΔI = I -I 0，即为一定浓度凝血酶对应的化学发光强度；其中样品管中放置有一定量的适配体封装羟化高铁血红素/介孔二氧化硅复合材料。
适配体封装羟化高铁血红素/介孔二氧化硅复合材料应用于化学发光传感器检测凝血酶中，得到最佳的实验条件为：25 r/min的主泵泵速，30 r/min的副泵泵速，0.04 mol/L的NaOH溶液，0.03 mol/L的H2O2溶液和1.0 × 10-5 mol/L的鲁米诺溶液；工作曲线的线性方程为ΔI = 25793.16 + 1673.28 lgc THR（R = 0.9980），线性范围为7.5 × 10-16 ~ 2.5× 10-10 mol/L，检出限为2.2 × 10-16 mol/L；同时表现出强的抗干扰能力；进行血清样品中凝血酶的检测，回收率为99.4% ~ 102.9%，相对标准偏差小于3.63%，说明该方法具有较高的准确度和精密度，说明了该方法的可实用性。

Claims (4)

1.一种适配体封装铁卟啉的介孔二氧化硅复合材料的制备方法，其特征是，在于该方法具有以下工艺步骤：
（1）氨基化介孔二氧化硅的制备：将0.4 ~ 0.6 g 介孔二氧化硅加入到3 ~ 5 mL氨丙基三乙氧基硅烷与15 ~ 25 mL无水甲苯的混合液中；将该反应溶液在N2保护下，75 ~ 85 ˚C加热回流10 ~ 16 h；将产物离心收集并用乙醇洗涤至中性，置于50 ~ 60 ˚C真空干燥箱中干燥；
（2）适配体封装羟化高铁血红素/介孔二氧化硅复合材料的制备：以PH = 7.0 ~ 7.4的磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.2mol/L）为溶剂配制100 mL 0.05 ~ 0.15 g/L的氨基化介孔二氧化硅分散液；用移液管移取3 ~ 8 mL该分散液放入10 mL离心管中，然后向该离心管中加入400 ~ 600 uL 0.1 g/L的羟化高铁血红素，将该离心管在室温下振荡1 ~ 3 h；接着向该离心管中加入1.0 ~ 2.5 mL的2.5 × 10-6 mol/L 凝血酶适配体溶液，0.02 ~ 0. 05 g N-羟基琥珀酰亚胺和0.02 ~ 0. 05 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，随后将该离心管在室温振荡1 ~ 3 h；振荡完成后，将该离心管离心分离以除去未被封装的羟化高铁血红素和多余的凝血酶适配体，并用紫外-可见光分光光度计测得上清液的吸收光谱以确定羟化高铁血红素的封装量；将离心后的适配体封装羟化高铁血红素/介孔二氧化硅复合材料用上述的PBS定容到100 mL容量瓶中并置于4 ˚C冰箱中备用。
2.根据权利要求1所述的适配体封装铁卟啉的介孔二氧化硅复合材料的制备方法，其特征是：在步骤（1）中反应液在无氧无水的环境下，通过加入适量氨丙基三乙氧基硅烷来引入氨基官能团。
3.根据权利要求1所述的适配体封装铁卟啉的介孔二氧化硅复合材料的制备方法，其特征是：在步骤（2）中直接用适配体对羟化高铁血红素进行孔道封装，得到了同时具有高特异性识别能力和催化能力的介孔二氧化硅复合材料。
4.根据权利要求1制备的适配体封装铁卟啉的介孔二氧化硅复合材料用于构建检测凝血酶化的学发光传感器，其特征是采用流动注射-化学发光法，该化学发光传感器检测凝血酶的过程如下：
（1）空白对照组检测：启动主泵和副泵，进样阀处于进样位置，氢氧化钠、过氧化氢、鲁米诺溶及PBS缓冲液合并流动311 s，产生弱的化学发光I 0；
（2）凝血酶样品检测：启动主泵和副泵，进样阀处于进样位置，氢氧化钠、过氧化氢、鲁米诺溶液及样品液合并流动311 s，产生化学发光I，所测最终化学发光差值为ΔI = I -I 0，即为一定浓度凝血酶对应的化学发光强度；其中样品管中放置有一定量的适配体封装羟化高铁血红素/介孔二氧化硅复合材料。
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