JPWO2014106957A1

JPWO2014106957A1 - 非対称Ｓｉローダミン及びロドールの合成

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Publication number: JPWO2014106957A1
Application number: JP2014555462A
Authority: JP
Inventors: 哲雄長野; 健二郎花岡; 尭寛江川; 優串田; 宏治沼澤; 琢也明珍; 文朴
Original assignee: University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 2013-01-07
Filing date: 2014-01-07
Publication date: 2017-01-19
Anticipated expiration: 2034-01-07
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Abstract

【解決課題】３位及び６位のアミノ基が非対称な構造を有するローダミンのキサンテン環部位の１０位の酸素原子を珪素原子に置換した化合物、及び該化合物の製造方法、並びに該化合物を利用した蛍光プローブの提供。【解決手段】下記一般式（Ｉ）：【化１】で表される化合物又はその塩。【選択図】なし

Description

本発明は、新規な蛍光プローブに関する。より具体的には、３位及び６位のアミノ基が非対称な構造を有するローダミンのキサンテン環部位の１０位の酸素原子を珪素原子に置換した化合物、及び該化合物の製造方法、並びに該化合物を利用した蛍光プローブに関る。また、本発明は、フルオレセインのキサンテン環の１０位の酸素原子を珪素原子に置換した化合物においてキサンテン環のヒドロキシ基をアミノ基に置換した化合物、及び該化合物の製造方法、並びに該化合物を利用した蛍光プローブにも関る。

ローダミンは、フルオレセインと同様に、古くから知られる蛍光色素である。両者はともに、水中で高い蛍光量子収率を持つことから、蛍光性のタグとして広く生物学領域に応用されてきた。また、近年、蛍光プローブを用いた生細胞イメージング技術が盛んに用いられているが、この手法で大きな役割を果たす蛍光プローブの母核としてもローダミンは広く用いられている。

ローダミン骨格を有する蛍光プローブとしては、一酸化窒素検出用（特許文献１）、次亜塩素酸検出用（特許文献２）などがこれまで報告されている。また、ローダミンの基本骨格であるパイロニンの酸素原子を珪素原子に置換した化合物（ＴＭＤＨＳ：２，７−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−９−ジメチル−１０−ヒドロ−９−シラアントラセン）及び当該化合物の蛍光プローブへの応用について既に報告されている（非特許文献１、２）。

このＴＭＤＨＳを基本骨格として有する蛍光プローブは、基本的に分子内光誘起電子移動（photoinduced electron transfer: PeT）およびスピロ環の開環や閉環を蛍光のＯｆｆ／ＯＮに利用するプローブである。しかしながら、ＴＭＤＨＳなどの従来報告されたパイロニンの酸素原子を珪素原子に置換した化合物はいずれも２位及び７位のアミノ基がメチル基等の水素原子以外の置換基で置換されている。また、ローダミンにおいて３位及び６位のアミノ基の置換基が非対称である化合物の酸素原子を珪素原子に置換したローダミン類縁体についての報告は未だなく、そのようなローダミン類縁体を用いた蛍光プローブについても未だ報告されていない。

一方、近赤外蛍光イメージングに用いる、活性酸素を検出対象にした蛍光プローブは幾つか開発されている。しかしながら、それらは活性酸素検出前後の蛍光増大の小ささや、活性酸素種に対する選択性の低さといった問題点が多かった。

国際公開ＷＯ１９９９／００１４４７国際公開ＷＯ２００７／１０００６１

Best, Qら、Pacifichem 2010、演題番号2335、2010年12月19日小出裕一郎ら、第４回日本分子イメージング学会、演題番号P8-9、2009年5月14日

本発明の課題は、新規な蛍光プローブを提供することにある。より具体的には、３位及び６位のアミノ基が非対称な構造を有するローダミンのキサンテン環部位の１０位の酸素原子を珪素原子に置換した化合物、及び該化合物の製造方法、並びに該化合物を利用した蛍光プローブを提供することが本発明の課題である。

また、本発明は、フルオレセインのキサンテン環の１０位の酸素原子を珪素原子に置換した化合物においてキサンテン環のヒドロキシ基をアミノ基に置換した化合物、及び該化合物の製造方法、並びに該化合物を利用した蛍光プローブを提供することも目的とする。

更に、本発明は、３位及び６位のアミノ基が非対称な構造を有するローダミンのキサンテン環部位の１０位の酸素原子を珪素原子に置換した化合物により、優れた活性酸素検出用近赤外蛍光プローブを提供することも目的とする。

本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を行なった結果、例えば、３−ブロモ−Ｎ，Ｎ−ジアリルアニリンを原料として３−ブロモベンゼンアミン化合物と反応させることにより、非対称なＮ，Ｎ−ジアリルアミノ−Ｎ’，Ｎ’−ジアルキルアミノ−Ｓｉ−キサントン化合物を製造し、当該化合物とハロゲン化ベンゼン誘導体とを反応させた後にアリル基を脱離させると、３位及び６位のアミノ基の置換基が非対称であるローダミンのキサンテン環部位の１０位の酸素原子を珪素原子に置換した化合物（以下、本明細書において「非対称Ｓｉローダミン」と呼ぶ場合がある）を製造できることを見出した。

また、本発明者らは、上記の製造方法では、３−ハロゲン化−Ｎ，Ｎ−ジアリルアニリンと３−ハロゲン化ベンゼンアミン化合物では反応性が違うために、対称な置換基を有する副生成物が生成するため、非対称な生成物（４−（２−ブロモ−４−（ジメチルアミノ）ベンジル）−Ｎ，Ｎ−ジアリル−３−ブロモベンゼンアミン）を高収率で得にくいことを知見した。そこで、更に鋭意検討したところ、３−ブロモ−Ｎ，Ｎ−ジアリルアニリンを３−ブロモ−Ｎ，Ｎ−ジアリル−４−ヒドロキシメチルアニリンに変換し、このものと３−ブロモベンゼンアミン化合物を反応させることで３−ブロモ−Ｎ，Ｎ−ジアリルー４−（２−ブロモ−４−（ジアルキルアミノ）ベンジルアニリンを経由することにより、非対称Ｓｉローダミンを高収率で製造できることを見出した。

また、本発明者らは、フルオレセインのキサンテン環の１０位の酸素原子を珪素原子に置換した化合物（ＴｏｋｙｏＭａｇｅｎｔａ）から出発して、キサンテン環のヒドロキシ基をアミノ基に置換した化合物（以下、本明細書において「ロドール」と呼ぶ場合がある）を効率的に合成できることも見出した。

また、本発明者らは、キサンテン環の窒素原子に芳香環を結合させることにより、優れた活性酸素検出用近赤外蛍光プローブを提供できることを見出した。

即ち、本発明は、
［１］下記一般式（Ｉ）：

（式中、
Ｒ^１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｒ^２は、一価の置換基を示し；
Ｒ^３及びＲ^４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、又はハロゲン原子を示し；
Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又はアリール基を示し；
Ｒ^７及びＲ^８は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ^９及びＲ^１０は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又は測定対象物質との接触により切断される一価の置換基を示し、
Ｒ^９又はＲ^１０は、Ｒ^３又はＲ^７と一緒になって、Ｒ^９又はＲ^１０が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
Ｙは、
（１）−ＮＲ^１１Ｒ^１２、
（２）−ＯＲ^１３又は
（３）−Ｎ＝Ｎ−Ｒ^１４
から選択され、
ここで、Ｒ^１１は、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又は測定対象物質との接触により切断される一価の置換基を示し、
Ｒ^１２は、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はアシル基を示し、
Ｒ^１１及びＲ^１２は、これらが結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリルは、炭素数１〜６個のアルキル基で置換されていてもよく、
Ｒ^１３は、水素原子又は測定対象物質との接触により切断される一価の置換基を示し、
Ｒ^１４は、アリール基を示し；
Ｘは、珪素原子、ゲルマニウム原子又はスズ原子を示し；
但し、Ｙが−ＮＲ^１１Ｒ^１２である場合は、（ｉ）Ｒ^９、Ｒ^１０は測定対象物質との接触により切断される一価の置換基ではなく、及び、（ｉｉ）Ｒ^１１及びＲ^１２が水素原子である場合には、Ｒ^９及びＲ^１０の両方が水素原子になることはなく、
また、Ｙが−ＯＲ^１３であってＲ^１３が水素原子の場合は、Ｒ^９あるいはＲ^１０は測定対象物質との接触により切断される一価の置換基であってもよく、
また、Ｙが−Ｎ＝Ｎ−Ｒ^１４である場合は、Ｒ^９、Ｒ^１０は測定対象物質との接触により切断される一価の置換基ではない）
で表される化合物又はその塩。

［２］Ｙが−ＮＲ^１１Ｒ^１２であって、以下の一般式（Ｉａ）：

（式中、Ｒ^１〜Ｒ^１２及びＸは、一般式（Ｉ）で定義したとおりであり、但し、（ｉ）Ｒ^９、Ｒ^１０は測定対象物質との接触により切断される一価の置換基ではなく、及び、（ｉｉ）Ｒ^１１及びＲ^１２が水素原子である場合には、Ｒ^９及びＲ^１０の両方が水素原子になることはない。）
で表される［１］に記載の化合物又はその塩。

［３］Ｒ^９又はＲ^１０は、Ｒ^３又はＲ^７と一緒になって、Ｒ^９又はＲ^１０が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成している（ここで、該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい）、［２］に記載の化合物又はその塩。

［４］Ｒ^９は、Ｒ^３と一緒になって、Ｒ^９が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成している、［３］に記載の化合物又はその塩。

［５］以下の一般式（Ｉａ−１）：

（式中、Ｒ^１〜Ｒ^２、Ｒ^４〜Ｒ^８、Ｒ^１０〜Ｒ^１２及びＸは、一般式（Ｉａ）で定義したとおりである。）
で表される［４］に記載の化合物又はその塩。

［６］Ｒ^１１及びＲ^１２は、これらが結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリルを形成している（ここで、該ヘテロシクリルは、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリルは、炭素数１〜６個のアルキル基で置換されていてもよい）、［２］〜［５］に記載の化合物又はその塩。

［７］Ｒ^１１及びＲ^１２は、これらが結合している窒素原子と共にピペラジン環を形成している、［６］に記載の化合物又はその塩。

［８］以下の一般式（Ｉａ−２）：

（式中、Ｒ^１〜Ｒ^１０及びＸは、一般式（Ｉａ）で定義したとおりであり、Ｒ^１５は、炭素数１〜６個のアルキル基を示す。）
で表される［７］に記載の化合物又はその塩。

［９］Ｒ^１１が、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、ラクタマーゼ、糖加水分解酵素、転移酵素、酸化還元酵素からなる群から選ばれる酵素との接触により切断される一価の置換基である、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。

［１０］Ｒ^１１が、ぺプチダーゼ、プロテアーゼ、及びラクタマーゼからなる群から選ばれる酵素との接触により切断される一価の置換基である、［９］に記載の化合物又はその塩。

［１１］ぺプチダーゼ又はプロテアーゼが、カスパーゼ、前立腺特異抗原、ロイシンアミノペプチダーゼ、γ-グルタミルトランスペプチターゼからなる群から選ばれる酵素である［９］又は［１０］に記載の化合物又はその塩。

［１２］Ｒ^１１としての置換基が芳香環であり、Ｒ^３とＲ^９が一緒になって、Ｒ^９が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成しており、Ｒ^１２が炭素数１〜６個のアルキル基である、［２］に記載の化合物又はその塩。

［１３］以下の一般式（Ｉａ−３）で表される、［１２］に記載の化合物又はその塩。

（式中、Ｒ^１〜Ｒ^２、Ｒ^４〜Ｒ^８、Ｒ^１０、Ｒ^１２及びＸは、一般式（Ｉａ）で定義したとおりである。）
［１４］以下の式（１）で表される、［１３］に記載の化合物又はその塩。

［１５］Ｙが−ＯＲ^１３であって、以下の一般式（Ｉｂ）：

（式中、Ｒ^１〜Ｒ^１０、Ｒ^１３及びＸは、式（Ｉ）で定義したとおりである。）
で表される［１］に記載の化合物又はその塩。

［１６］Ｒ^１３、Ｒ^９又はＲ^１０が、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、ラクタマーゼ、糖加水分解酵素、転移酵素、酸化還元酵素からなる群から選ばれる酵素との接触により切断される一価の置換基である、［１５］に記載の化合物又はその塩。

［１７］Ｒ^１３、Ｒ^９又はＲ^１０が、ぺプチダーゼ、プロテアーゼ、及びラクタマーゼからなる群から選ばれる酵素との接触により切断される一価の置換基である、［１６］に記載の化合物又はその塩。

［１８］ぺプチダーゼ又はプロテアーゼが、カスパーゼ、前立腺特異抗原、ロイシンアミノペプチダーゼ、γ-グルタミルトランスペプチターゼからなる群から選ばれる酵素である［１３］又は［１４］に記載の化合物又はその塩。

［１９］Ｙが−Ｎ＝Ｎ−Ｒ^１４であって、以下の一般式（Ｉｃ）：

（式中、Ｒ^１〜Ｒ^１０、Ｒ^１４及びＸは、式（Ｉ）で定義したとおりであり、但し、Ｒ^９、Ｒ^１０は測定対象物質との接触により切断される一価の置換基ではない）
で表される［１］に記載の化合物又はその塩。

［２０］Ｒ^１４のアリール基が、単環の芳香族基又は縮合芳香族基であり、該アリール基はアミノ基、ジメチルアミノ基から選択される置換基を有する、［１９］に記載の化合物又はその塩。
［２１］［１］〜［２０］のいずれか１項に記載の化合物を含む蛍光プローブ。
［２２］［１２］〜［１４］のいずれか１項に記載の化合物を含む活性酸素検出蛍光プローブ。
［２３］［１９］又は［２０］に記載の化合物を含む低酸素環境検出蛍光プローブ。

［２４］［２］に記載の一般式（Ｉａ）で表される化合物（Ｒ^１〜Ｒ^１２及びＸは、上記で定義した通りである）又はその塩の製造方法であって、下記の工程：
（ａ）３−ハロゲン化アニリンとアリルハライドから製造される一般式（ＩＩ）（式中、Ｒ^１６はハロゲン原子を示す）で表される３−ハロゲン化−Ｎ，Ｎ−ジアリルアニリンと式（ＩＩＩ）で表される３−ハロゲン化ベンゼンアミン化合物とをホルムアミドの存在下で反応させて下記の一般式（ＩＶ）で表される化合物を製造する工程、

（ｂ）上記の一般式（ＩＶ）で表される化合物とＸ（Ｈａｌｏ）_２（Ｒ^５）（Ｒ^６）（Ｈａｌｏは塩素原子又は臭素原子を示し、Ｘ、Ｒ^５、Ｒ^６は上記と同義である）とを反応させた後、酸化反応によって下記の一般式（Ｖ）で表される化合物を製造する工程、

（ｃ）上記の一般式（Ｖ）で表される化合物とハロゲン化ベンゼン誘導体から下記の一般式（ＶＩ）で表される化合物を製造する工程、及び

（ｄ）上記の一般式（ＶＩ）で表される化合物の脱アリル化を行い、一般式（Ｉａ）においてＲ^１１及びＲ^１２が水素原子である化合物を製造する工程（Ｒ^１及びＲ^２に上記の一般式（ＶＩ）の化合物を製造するために保護基を導入した場合には、該保護基の脱保護を工程（ｄ）の前後又は同時に行ってもよい）
を含む方法。

［２５］Ｒ^１１として、測定対象物質との接触により切断される一価の置換基を導入する工程を更に含む、［２４］に記載の方法。

［２６］［２］に記載の一般式（Ｉａ）で表される化合物（Ｒ^１〜Ｒ^１２及びＸは上記で定義した通りである）又はその塩の製造方法であって、下記の工程：
（１）３−ハロゲン化アニリンとアリルハライドから製造される一般式（ＶＩＩ）（式中、Ｒ^１６はハロゲン原子を示す）で表される３−ハロゲン化−Ｎ，Ｎ−ジアリルアニリンとを、オキシ塩化リンの存在下、塩基性条件下で反応させて一般式（ＶＩＩＩ）で表される３−ハロゲン化−Ｎ，Ｎ−ジアリル−４−ヒドロキシメチルアニリンを製造する工程、

（２）上記３−ハロゲン化−Ｎ，Ｎ−ジアリル−４−ヒドロキシメチルアニリンと式（ＩＸ）で表される３−ハロゲン化ベンゼンアミン化合物とを反応させて、一般式（Ｘ）で表される化合物を製造する工程、

（３）上記の一般式（Ｘ）で表される化合物とＸ（Ｈａｌｏ）_２（Ｒ^５）（Ｒ^６）（Ｈａｌｏは塩素原子又は臭素原子を示し、Ｘ、Ｒ^５、Ｒ^６は上記と同義である）とを反応させた後、酸化反応によって下記の式（Ｖ）で表されるＮ，Ｎ−ジアリルアミノ−Ｎ’，Ｎ’−ジアルキルアミノ−Ｘ−キサントンを製造する工程、

（４）前記Ｎ，Ｎ−ジアリルアミノ−Ｎ’，Ｎ’−ジアルキルアミノ−Ｘ−キサントンとハロゲン化ベンゼン誘導体から下記の一般式（ＶＩ）で表される化合物を製造する工程、及び

（５）上記の一般式（ＶＩ）で表される化合物の脱アリル化を行い、一般式（Ｉａ）においてＲ^１１及びＲ^１２が水素原子である化合物を製造する工程（Ｒ^１及びＲ^２に上記の一般式（ＶＩ）の化合物を製造するために保護基を導入した場合には、該保護基の脱保護を工程（４）の前後又は同時に行ってもよい）
を含む方法。

［２７］Ｒ^１１として、測定対象物質との接触により切断される一価の置換基を導入する工程を更に含む、［２６］に記載の方法。

［２８］［１５］に記載の一般式（Ｉｂ）で表される化合物又はその塩の製造方法であって、下記の工程：
（１）下記の一般式（ＸＩ）で表される化合物を、塩基性条件下で、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（Ｔｆ_２Ｏ）と反応させ、一般式（ＸＩＩ）で表される化合物を製造する工程、

（２）一般式（ＸＩＩ）で表される化合物をイミン化合物と反応させることにより、一般式（ＸＩＩＩ）で表される化合物を製造する工程、

（３）場合により、一般式（ＸＩＩＩ）で表される化合物をハロゲン化アルキルと反応させる工程
を含む方法。

［２９］［１３］に記載の一般式（Ｉａ−３）で表される化合物又はその塩の製造方法であって、下記の工程：
（１）一般式（ＸＩＶ）の化合物とヨウ化カリウムとを反応させることにより、一般式（ＸＶ）の化合物を製造する工程、

（２）一般式（ＸＶ）の化合物をアルキル基の炭素数が１〜６であるＮ−アルキル−ｐ−アニシジンと反応させることにより、一般式（ＸＶＩ）の化合物を製造する工程、

（３）一般式（ＸＶＩ）の化合物をｏ−トリル臭化マグネシウムと反応させ、その後、酸を添加して、一般式（ＸＶＩＩ）の化合物を製造する工程、及び

（４）一般式（ＸＶＩＩ）の化合物を三臭化ボロンと反応させることにより、一般式（Ｉａ−３）で表される化合物を製造する工程
を含む、該製造方法。
を、提供するものである。

本発明により、３位及び６位のアミノ基の置換基が非対称な構造を有するＳｉローダミン（以下「非対称Ｓｉローダミン」とも言う）を提供することができる。即ち、従来は、３位及び６位のアミノ基の置換基が対称な構造を有するＳｉローダミンしか得ることができなかったところ、本発明によれば、３位及び６位のアミノ基の置換基が非対称な構造であるため、様々な機能を有する置換基を一方のアミノ基のみに選択的に導入することが可能となる。これにより、優れたラベル化剤や、プロテアーゼ等の様々な酵素を効率的かつ定量的に検出することができる蛍光プローブを提供することが可能である。

更に、本発明においては、非対称Ｓｉローダミンの３位及び／又は６位のアミノ基の置換基を選択することにより、赤色領域で高い蛍光強度を示し、更に、６５０ｎｍから９００ｎｍにまで達する近赤外波長領域に吸収を有する蛍光色素も提供することが可能である。

また、本発明により、非対称Ｓｉローダミンを効率よく製造することができる。特に本発明の製造方法により、ローダミンの基本骨格であるパイロニンにヘテロ環構造を導入した非対称Ｓｉローダミンを提供することも可能である。

また、本発明により、ロドール及びその類縁体を効率よく製造することができる。

また、本発明の非対称Ｓｉローダミンは、吸収スペクトル及び蛍光スペクトルにおいて短波長と長波長に２つの明瞭なピークを有するという特徴を有する。このことから、本発明の非対称Ｓｉローダミンは、レシオ測定（異なる２波長での蛍光強度を同時に測定し、その比（レシオ）を計算する手法）に好適に使用することが可能である。

更に、本発明の非対称Ｓｉローダミン及びロドールにおいて、測定対象物質との接触により切断される一価の置換基を導入した化合物は、各種酵素などを高感度に測定可能な蛍光プローブとして有用である。

更に、本発明の非対称Ｓｉローダミンにおいてキサンテン環の窒素原子に芳香環を結合させることにより、優れた活性酸素検出用近赤外蛍光プローブを提供することが可能である。

更に、本発明の非対称Ｓｉローダミンの共役系にアリール基を有するアゾ基を組み込むことにより、優れた低酸素環境検出用近赤外蛍光プローブを提供することが可能である。

２−ＭｅＳｉＲ６２０（化合物１）および２−ＭｅＳｉＲ６２０−ａｌ（化合物２）の吸光プロファイルの測定結果２−ＭｅＳｉＲ６２０（化合物１）および２−ＭｅＳｉＲ６２０−ａｌ（化合物２）の蛍光プロファイルの測定結果２−ＭｅＳｉＲ６３０（化合物３）及び２−ＭｅＳｉＲ６３０−ａｌ（化合物４）の吸光プロファイル２−ＭｅＳｉＲ６３０（化合物３）及び２−ＭｅＳｉＲ６３０−ａｌ（化合物４）の蛍光プロファイル２ＭｅＩｎｄｏＳｉＲ（化合物５）の吸光及び蛍光スペクトル２ＭｅＩｎｄｏＳｉＲ（化合物５）のＦＢＳ中での吸光スペクトル２ＭｅＩｎｄｏＳｉＲ（化合物５）の吸光スペクトルのｐＨプロファイル２ＭｅＩｎｄｏＳｉＲ（化合物５）の蛍光スペクトルのｐＨプロファイルＡｃ−ＩｎｄｏＳｉＲ（化合物６）の吸光スペクトルのｐＨプロファイルＡｃ−ＩｎｄｏＳｉＲ（化合物６）の蛍光スペクトルのｐＨプロファイルＡｃ−ＩｎｄｏＳｉＲ（化合物６）の様々な溶媒における吸収スペクトルＡｃ−ＩｎｄｏＳｉＲ（化合物６）の様々な溶媒における蛍光スペクトルＡｃ−ＩｎｄｏＳｉＲ（化合物６）についてのＬｉｐｐｅｒｔ−ＭａｔａｇａプロットＳｉ−Ｒｈｏｄｏｌ（化合物７）の吸光スペクトルのｐＨプロファイルＳｉ−Ｒｈｏｄｏｌ（化合物７）の蛍光スペクトルのｐＨプロファイル（励起波長：５０７ｎｍ）Ｓｉ−Ｒｈｏｄｏｌ（化合物７）の蛍光スペクトルのｐＨプロファイル（励起波長：５８４ｎｍ）化合物８の吸光スペクトルのｐＨプロファイル化合物８の蛍光スペクトルのｐＨプロファイル化合物９の吸光スペクトルのｐＨプロファイル化合物９の蛍光スペクトルのｐＨプロファイル化合物１０、及び化合物１０が活性酸素と反応した後に生成することが予想される化合物についての吸収スペクトル及び蛍光スペクトル ⁻ＯＣｌと化合物１０との反応混合物、化合物１０、及び化合物１０と⁻ＯＣｌの反応後に予想される化合物についてのＨＰＬＣクロマトグラフ化合物１０と各活性酸素種との反応性の実験結果化合物１０と各活性酸素種との反応後の蛍光強度化合物１０によるＨＬ６０細胞を用いた細胞イメージング化合物５と化合物１３の吸収スペクトル及び蛍光スペクトル化合物１１と化合物１４の吸収スペクトル及び蛍光スペクトル化合物１１及び１４を用いた、ラット肝ミクロソームを用いたｉｎｖｉｔｒｏ実験の結果化合物１１、１４を用いた生細胞実験の結果化合物１４を用いたマウスによる虚血臓器可視化実験の結果

本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、特に言及しない場合には例えば炭素数１〜６個、好ましくは炭素数１〜４個、更に好ましくは炭素数１〜３個程度の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基などを挙げることができる。

本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。

本発明の１つの態様は、下記の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である。

一般式（Ｉ）において、Ｒ^１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示す。Ｒ^１がベンゼン環上に存在する一価の置換基を示す場合には、ベンゼン環上に同一又は異なる置換基が１ないし２個程度存在していることが好ましい。Ｒ^１が１個又は２個以上の一価の置換基を示す場合には、該置換基はベンゼン環上の任意の位置に置換することができる。好ましくはＲ^１は水素原子を示すか、１個の置換基が存在する場合である。

Ｒ^１が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数１〜６個のアルキル基、炭素数１〜６個のアルケニル基、炭素数１〜６個のアルキニル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基からなる群から選ばれることが好ましい。これらの一価の置換基は更に任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒ^１が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ^１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。また、例えばＲ^１が示すアミノ基には１個又は２個のアルキル基が存在していてもよく、Ｒ^１が示すアミノ基はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であってもよい。更に、Ｒ^１が示すアルコキシ基が置換基を有する場合としては、例えば、カルボキシ置換アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換アルコキシ基などが挙げられ、より具体的には４−カルボキシブトキシ基又は４−アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基などを挙げることができる。

一つの好ましい側面において、Ｒ^１が炭素数１〜６個のアルキル基などの一価の置換基であり、該置換基はベンゼン環上の６位に存在する。

一般式（Ｉ）において、Ｒ^２は一価の置換基を示す。Ｒ^２が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、Ｒ^１と同様に、例えば、炭素数１〜６個のアルキル基、炭素数１〜６個のアルケニル基、炭素数１〜６個のアルキニル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基からなる群から選ばれることが好ましい。

一般式（Ｉ）において、Ｒ^３及びＲ^４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示す。Ｒ^３又はＲ^４がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ^３又はＲ^４が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ^３及びＲ^４はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ^３及びＲ^４がともに水素原子である場合、又はＲ^３及びＲ^４がともにフッ素原子又は塩素原子である場合がより好ましい。

一般式（Ｉ）において、Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又はアリール基を示すが、Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立に、炭素数１〜３個のアルキル基であることが好ましく、Ｒ^５及びＲ^６がともにメチル基であることがより好ましい。Ｒ^５及びＲ^６が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ^５又はＲ^６が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ^５又はＲ^６がアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は１個又は２個以上の環構成ヘテロ原子（例えば窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子など）を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。

一般式（Ｉ）において、Ｒ^７及びＲ^８は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、又はハロゲン原子を示すが、Ｒ^３及びＲ^４について説明したものと同様である。Ｒ^７及びＲ^８が共に水素原子であるか、共に塩素原子であるか、又は共にフッ素原子であることが好ましい。

一般式（Ｉ）において、Ｒ^９及びＲ^１０は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又は測定対象物質との接触により切断される一価の置換基を示す。また、Ｒ^９又はＲ^１０は、Ｒ^３又はＲ^７と一緒になって、Ｒ^９又はＲ^１０が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基（ベンジル基、フェネチル基等）、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。このようにして形成されるヘテロシクリル又はヘテロアリールとしては、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ヘキサメチレンイミン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、チアゾールなどが挙げられるが、これらに限定されない。

一般式（Ｉ）において、
(１)−ＮＲ^１１Ｒ^１２、(２)−ＯＲ^１３又は(３)−Ｎ＝Ｎ−Ｒ^１４から選択される。

ここで、Ｒ^１１は、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又は測定対象物質との接触により切断される一価の置換基を示す。また、Ｒ^１２は、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はアシル基を示す。

Ｒ^１１又はＲ^１２がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ^１１又はＲ^１２が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。

また、Ｒ^１１及びＲ^１２が共にアルキル基の場合は、Ｒ^１１及びＲ^１２は、これらが結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよい。この場合、該ヘテロシクリルは、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリルは、炭素数１〜６個のアルキル基で置換されていてもよい。

Ｒ^１２のアシル基としては、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ベンゾイル基などが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｒ^１３は、水素原子又は測定対象物質との接触により切断される一価の置換基を示す。

Ｒ^１４は、アリール基を示す。アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよい。アリール基としては、フェニル基、ナフチル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、アミノ基（例えば、−ＮＨ_２基、炭素数１〜６のモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基）などが好ましい。また、置換位置としては、アゾ基に対してパラ位であることが好ましい。

一般式（Ｉ）において、Ｙが−ＮＲ^１１Ｒ^１２である場合は、Ｒ^９又はＲ^１０が測定対象物質との接触により切断される一価の置換基ではない。また、Ｙが−ＮＲ^１１Ｒ^１２である場合は、Ｒ^１１及びＲ^１２が水素原子である場合には、Ｒ^９及びＲ^１０の両方が水素原子になることはない。

また、Ｒ^１１及びＲ^１２が水素原子である場合には、Ｒ^９及びＲ^１０の少なくとも１つが水素原子になることはなく、但し、Ｒ^９及びＲ^１０のいずれか一方が水素原子の場合、他方は、炭素数１〜６個のアルキル基、又はＲ^３又はＲ^７と一緒になって、それが結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成しており、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。

また、一般式（Ｉ）において、Ｙが−ＯＲ^１３であってＲ^１３が水素原子の場合は、Ｒ^９あるいはＲ^１０は測定対象物質との接触により切断される一価の置換基であってもよい。

また、一般式（Ｉ）において、Ｙが−Ｎ＝Ｎ−Ｒ^１４である場合は、Ｒ^９、Ｒ^１０は測定対象物質との接触により切断される一価の置換基ではない。

一般式（Ｉ）において、Ｘは珪素原子、ゲルマニウム原子又はスズ原子を示すが、珪素原子又はゲルマニウム原子であることが好ましく、珪素原子であることが特に好ましい。

本発明の一つの態様は、以下の一般式（Ｉａ）で表される化合物又はその塩である。

式（Ｉａ）中、Ｒ^１〜Ｒ^１２は、式（Ｉ）で定義されたとおりであるが、Ｒ^９及びＲ^１０は測定対象物質との接触により切断される一価の置換基ではない。また、Ｒ^１１及びＲ^１２が水素原子である場合には、Ｒ^９及びＲ^１０の両方が水素原子になることはない。

１つの好ましい実施態様において、Ｒ^１１及びＲ^１２は水素原子であり、Ｒ^９及びＲ^１０は同一又は異なる炭素数１〜６個のアルキル基である。

１つの好ましい実施態様において、Ｒ^１１は水素原子であり、Ｒ^１２は炭素数１〜６個のアルキル基であり、Ｒ^９及びＲ^１０は同一又は異なる炭素数１〜６個のアルキル基である。

また、１つの好ましい実施態様において、Ｒ^１１は測定対象物質との接触により切断される一価の置換基であり、Ｒ^１２は水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基であり、Ｒ^９及びＲ^１０は同一又は異なる炭素数１〜６個のアルキル基である。

また、１つの好ましい実施態様において、Ｒ^９又はＲ^１０は、Ｒ^３又はＲ^７と一緒になって、Ｒ^９又はＲ^１０が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成している（ここで、該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい）。

また、１つの好ましい実施態様において、Ｒ^９は、Ｒ^３と一緒になって、Ｒ^９が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成している。

上記実施態様の１つの好ましい側面において、Ｒ^１１及びＲ^１２は水素原子である。

上記実施態様のもう１つの好ましい側面において、Ｒ^１１は水素原子であり、Ｒ^１２は炭素数１〜６個のアルキル基又はアシル基である。

上記実施態様のもう１つの好ましい側面において、Ｒ^１１は水素原子であり、Ｒ^１２はカルボキシアルキル基である。

上記実施態様のもう１つの好ましい側面において、Ｒ^１１は測定対象物質との接触により切断される一価の置換基であり、Ｒ^１２は水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基である。

更に、本発明の１つの好ましい実施態様は、以下の一般式（Ｉａ−１）で表される化合物又はその塩である。

一般式（Ｉａ−１）中、Ｒ^１〜Ｒ^８、Ｒ^１０〜Ｒ^１２及びＸは、一般式（Ｉａ）について上記で定義したとおりである。

上記実施態様のもう１つの好ましい側面において、Ｒ^１１は水素原子であり、Ｒ^１２は炭素数１〜６個のアルキル基である。

上記実施態様のもう１つの好ましい側面において、Ｒ^１１は水素原子であり、Ｒ^１２は炭素数１〜６個のアシル基、好ましくはアセチル基である。

また、１つの好ましい実施態様において、Ｒ^１１及びＲ^１２は、これらが結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリルを形成している（ここで、該ヘテロシクリルは、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリルは、炭素数１〜６個のアルキル基で置換されていてもよい）。

ここで、Ｒ^１１及びＲ^１２がこれらが結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリルは、好ましくは、環構成員として更に１個の窒素原子を含有する。このようなヘテロシクリルとしては、好ましくはピペラジン環が挙げられる。

更に、本発明の１つの好ましい実施態様は、以下の一般式（Ｉａ−２）で表される化合物又はその塩である。

一般式（Ｉａー２）中、Ｒ^１〜Ｒ^１０及びＸは、一般式（Ｉａ）について上記で定義したとおりである。Ｒ^１５は、炭素数１〜６個のアルキル基またはアルキルカルボキシ基を示し、アルキル基としては、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基などである。

本発明の非対称Ｓｉローダミンにおいて、ピペラジン環を導入することにより、細胞内酸性環境において蛍光特性を変化させることができる酸性環境検出蛍光プローブを提供することが可能である。

また、本発明のもう一つの好ましい態様は、以下の一般式（Ｉｂ）で表される化合物又はその塩である。

式（Ｉｂ）中、Ｒ^１〜Ｒ^１０、及びＲ^１３は、一般式（Ｉ）で定義されたとおりである。また、Ｒ^１３が水素原子の場合はＲ^９あるいはＲ^１０は測定対象物質との接触により切断される一価の置換基であってもよい。

１つの好ましい実施態様において、Ｒ^１３は水素原子であり、Ｒ^９及びＲ^１０は水素原子である。

また、１つの好ましい実施態様において、Ｒ^１３は水素原子であり、Ｒ^９及び／又はＲ^１０は炭素数１〜６個のアルキル基である。

１つの好ましい実施態様において、Ｒ^１３は水素原子であり、Ｒ^９又はＲ^１０は測定対象物質との接触により切断される一価の置換基である。

本発明において、測定対象物質の種類は特に限定されず、例えば、酵素、金属イオン（例えば、ナトリウムイオンやリチウムイオンなどのアルカリ金属イオン、カルシウムイオンなどのアルカリ土類金属イオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオンなど）、非金属イオン（炭酸イオンなど）、活性酸素種（例えば、ヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、次亜塩素酸、過酸化水素など）、低酸素環境などのいずれであってもよいが、好ましくは酵素、活性酸素種又は低酸素環境である。

測定対象物質との接触により切断される一価の置換基としては、例えば、以下の置換基が挙げられる。

ａ）プロトンをキレートする一価の置換基としては、−ＣＲ^２０−Ａ−ＮＲ^２１Ｒ^２２（式中Ｒ^２０、Ｒ^２１、Ｒ^２２はそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜６個のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、Ｒ^２０とＲ^２１またはＲ^２０とＲ^２２が結合した炭素数１〜３個のアルキレン基を示し；Ａは置換基を有していてもよい炭素数１〜３個のアルキレン基を示す）で表される捕捉基。

ｂ）金属イオンをキレートする一価の置換基としては、ナトリウムイオン、リチウムイオン、カリウムイオン、及びマグネシウムイオンは国際公開ＷＯ２００５／０８５８１１の８ページの［化４］に記載の置換基（ただし、国際公開ＷＯ２００５／０８５８１１の８Ｐの［化４］に示されたＲ^３が結合するベンゼン環は、本明細書中のＲ^１及びＲ^２が結合するベンゼン環に相当する）、カルシウムイオンは−Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＲ^２３）_２（式中、Ｒ^２３は水素原子を示すか金属イオン、又はエステルを示す）が５ないし８原子の距離で存在する置換基（例えば、−ＣＯＮ［ＣＨ_２−ＣＯＮ（ＣＨ_２ＣＯＯＲ^２３）_２］_２、特開２００５−２０１８４５の１０Ｐの３７行目からＰ１２の１９行目に記載の置換基）、亜鉛イオンは−ＮＨ−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＮＲ^２４Ｒ^２５（式中、Ｒ^２４及びＲ^２５は、それぞれ独立に水素原子、２−ピリジルメチル基、２−ピリジルエチル基、２−メチル−６−ピリジルメチル基、又は２−メチル−６−ピリジルエチル基を示すが同時に水素原子であることはない）で表される置換基。

ｃ）活性酸素種により切断される一価の置換基としては、パーオキシナイトライト、ヒドロキシルラジカル、次亜塩素酸はｐ−アミノフェニルオキシメチル基、ｐ−ヒドロキシフェニルオキシメチル基、ｐ−アミノフェニル基、ｐ−ヒドロキシフェニル基。

ｄ）低酸素環境としては−ＣＯ−Ｎ（Ｒ^２６）−Ｂ^１−Ｎ（Ｒ^２７）−Ｂ^２−（Ｂ^３）ｒ−ｐ−Ｃ_６Ｈ_４−Ｎ＝Ｎ−Ａｒ−Ｒ^２８（式中、Ｒ^２６及びＲ^２７はそれぞれ独立に水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し、Ｒ^２６及びＲ^２７は互いに結合して炭素数２〜６個のアルキレン基となってもよく；Ｂ^１は炭素数１〜６個のアルキレン基を示し；Ｂ^２は単結合、−ＣＯ−、又は−ＳＯ_２−を示し；Ｂ^３は−Ｏ−Ｇ−Ｎ（Ｒ^２９）−（式中、Ｇは炭素数１〜６個のアルキレン基を示し、Ｒ^２９は水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示す）を示し；ｒは０又は１を示し；ｐ−Ｃ_６Ｈ_４−はｐ−フェニレン基を示し；Ａｒはアリールジイル基を示し；Ｒ^２８はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基を示す。）で表される置換基。

酵素としては、例えば、還元酵素、酸化酵素、加水分解酵素などを挙げることができる。例えば、β−ラクタマーゼ、チトクロームＰ４５０酸化酵素、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ、ラクターゼ、アルカリホスファターゼ、マトリクスメタロプロテアーゼ、及びグルタミルトランスフェラーゼなど、感染症やがんなどの診断対象として有用な酵素を挙げることができるが、これらに限定されることはない。酵素のうち、特に加水分解酵素が好ましい。加水分解酵素の典型例として、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、アルカリフォスファターゼ、マトリクスメタロプロテアーゼ、及びグルタミルトランスフェラーゼなどを挙げることができるが、加水分解酵素は上記のものに限定されるわけではない。

測定対象物質として加水分解酵素を用いる場合には、該酵素の特異的基質となる化合物や官能基を選択して、該酵素による加水分解を受けてＲ^１１（Ｒ^９、Ｒ^１０又はＲ^１３）が水素原子である化合物を与えるように一般式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）の化合物を設計することができる。例えば、糖加水分解酵素を測定対象物質として用いる場合にはＲ^１１（Ｒ^９、Ｒ^１０、又はＲ^１３）としてその酵素の基質となる糖化合物の残基を用いることができる。糖化合物が有する水酸基やアミノ基などの官能基は必要に応じて適宜の保護基で保護されていてもよい。このような保護基を有する化合物もすべて本発明の範囲に包含される。

酵素と接触することで切断される一価の置換基の例としては、測定対象物質としてペプチダーゼ、プロテアーゼを用いる場合は、本明細書中の式（ａ）〜（ｇ）及びＧＧＴの蛍光プローブとして記載した置換基や国際公開ＷＯ２０１０／０９５４５０の１２頁の［化４］に記載されている（１）から（７）の化合物に置換したアミノ酸残基（アミノ酸残基とは、アミノ酸のアミノ基又はカルボキシ基から水素原子が一つ外れた基を示す）を含むたんぱく質を構成する２０種類のＬ−アミノ酸に由来するアシル残基（以上のアミノ酸残基は、本明細書の一般式（Ｉ）のＲ^１１、Ｒ^９、Ｒ^１０又はＲ^１３が結合しているアミノ基に結合してもよい）が挙げられる。また、測定対象物質として、ラクタマーゼを用いる場合は本明細書中の式（ｈ）に記載した置換基が、糖加水分解酵素を用いる場合はガラクトシル基、グルコシル基、グルクロノシル基が、グルクロン酸転移酵素を用いる場合は水酸基、アミノ基、カルボキシ基、チオール基が酵素と接触することで切断される一価の置換基の例として挙げられる。

測定対象物質としてグルタチオンを用いる場合は、測定対象物質と接触することで切断される一価の置換基としては、本明細書中の式（ｉ）に記載した置換基などを挙げることができる。

また、Ｒ^１１（Ｒ^９、Ｒ^１０又はＲ^１３）がｐ−アミノフェニル基、又はｐ−ヒドロキシフェニル基である場合には活性酸素種との接触により分解を受けてＲ^１１（Ｒ^９、Ｒ^１０又はＲ^１３）が水素原子である化合物が生成することから、活性酸素種を測定対象物質として用いることができる。ｐ−アミノフェニル基、又はｐ−ヒドロキシフェニル基を有する活性酸素蛍光プローブは、例えば、国際公開ＷＯ２００１／０６４６６４、国際公開ＷＯ２００４／０４０２９６、ＵＳ７３７８２８２などに記載されているので、本発明の蛍光プローブはこれらの文献に開示された蛍光プローブと同様に用いることができる。

これらの測定対象物質と接触することで切断される一価の置換基は直接一般式（Ｉ）で表される化合物、又はその塩に置換してもよく、あるいは、スペーサー（リンカー）を介して一般式（Ｉ）で表される化合物、又はその塩に置換してもよい。スペーサーとしては、例えば、置換又は無置換のアルキル基、エチレングリコール基、ジエチレングリコール基、トリエチレングリコール基などを挙げることができるが、これらに限定されない。

一般式（Ｉ）、（Ｉａ）又は（Ｉｂ）において、Ｒ^１１、Ｒ^９、Ｒ^１０又はＲ^１３が測定対象物質との接触により切断される一価の置換基である化合物は蛍光プローブとして好適に使用することができる。この場合、当該蛍光プローブが測定対象物質と接触することによりＲ^１１、Ｒ^９、Ｒ^１０又はＲ^１３の置換基が切断されて吸収波長が長波長にシフトした化合物（上記一般式（Ｉ）においてＲ^１１、Ｒ^９又はＲ^１０が無置換アミノ基になった化合物に相当する）を生成することができ、測定対象物質の測定のための蛍光プローブとして好適に用いることができる。測定対象物質としては、酵素（ペプチダーゼ、プロテアーゼ、ラクタマーゼ、糖加水分解酵素、転移酵素、酸化還元酵素など）、グルタチオンがあげられる。例えば、酵素としてはぺプチダーゼ、プロテアーゼ、又はラクタマーゼであることが好ましい。

ぺプチダーゼ又はプロテアーゼの種類は、Ｒ^１１、Ｒ^９、Ｒ^１０又はＲ^１３がアシル基である上記一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物において、該アシル基を加水分解できるものであればその種類は特に限定されず、ぺプチダーゼはエンドペプチダーゼ又はエキソペプチダーゼのいずれであってもよく、プロテアーゼはエンドプロテアーゼ又はエキソプロテアーゼのいずれであってもよい。例えば、特定のアミノ酸又はペプチドを基質とするペプチダーゼ又はプロテアーゼを測定するために、Ｒ^１１、Ｒ^９、Ｒ^１０又はＲ^１３に該アミノ酸又はペプチドに由来するアシル残基を用いることができ、このように設計された化合物を用いることによって、特定のペプチダーゼ又はプロテアーゼを特異的に測定することができる（アミノ酸又はペプチドに由来するアシル残基は、アミノ酸のカルボキシ基から水酸基を除去した残りの部分構造を示す）。このような観点から、ペプチダーゼ又はプロテアーゼに対する蛍光プローブとしては、Ｒ^１１、Ｒ^９、Ｒ^１０又はＲ^１３としてペプチダーゼ又はプロテアーゼにより加水分解可能なアミノ酸由来又はペプチド由来のアシル残基を用いることが好ましく、例えば、たんぱく質を構成する２０種類のＬ−アミノ酸に由来するアシル残基や、セレノシステイン、ピロリシン、シスチン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、チロキシン、Ｏ−ホスホセリン、デスモシン、β−アラニン、サルコシン、オルニチン、クレアチン、γアミノ酪酸、又はオパインなどに由来するアシル残基を用いることができる。

ペプチダーゼがＬＡＰ(leucine aminopeptidase：ロイシンアミノペプチダーゼ）である場合における好適なＲ^１１（Ｒ^９、Ｒ^１０又はＲ^１３）の例として、以下の置換基が挙げられる。

ペプチダーゼがＧＧＴ（γ-glutamyl transpeptidase：γ-グルタミルトランスペプチターゼ）である場合における好適なＲ^１１の例として、以下の置換基が挙げられる。例えば、Ｒ^１１として下記の置換基を有する化合物を国際公開ＷＯ２０１１／０８７０００に記載の方法に従ってγＧｌｕ−ＲｈｏＨＭの代わりに用いれば、がん細胞やがん組織を特異的に測定することが可能であり、がん診断薬として利用することができる。

プロテアーゼがＣａｓｐａｓｅ−３である場合における好適なＲ^１１（Ｒ^９、Ｒ^１０又はＲ^１３）の例として、以下の置換基が挙げられる。

プロテアーゼがＣａｌｐａｉｎである場合における好適なＲ^１１（Ｒ^９、Ｒ^１０又はＲ^１３）の例として、以下の置換基が挙げられる。

ラクタマーゼがβ-Ｌａｃｔａｍａｓｅ（β-ラクタマーゼ）である場合における好適なＲ^１１（Ｒ^９、Ｒ^１０又はＲ^１３）の例として、以下の置換基が挙げられる。

接触により切断する測定対象物質がグルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）である場合における好適なＲ^１１（Ｒ^９、Ｒ^１０又はＲ^１３）の例として、以下の置換基が挙げられる。

また、本発明のもう一つの好ましい態様は、以下の一般式（Ｉｃ）で表される化合物又はその塩である。

一般式（Ｉｃ）において、Ｒ^１〜Ｒ^１０、Ｒ^１４及びＸは、一般式（Ｉ）で定義したとおりである。

Ｒ^１４は、アリール基を示し、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよい。アリール基としては、フェニル基、ナフチル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、アミノ基（例えば、−ＮＨ_２基、炭素数１〜６のモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基）などが好ましい。また、置換位置としては、アゾ基に対してパラ位であることが好ましい。

一般式（Ｉｃ）の化合物は、非対称Ｓｉローダミンにおいて６位のアミノ基をアリール基を有するアゾ基に置換した構造を有する。このような構造を有することで、一般式（Ｉｃ）の化合物は、生体内における低酸素環境下において各種還元酵素により還元反応が促進され、また、非対称Ｓｉローダミンの共役系にアゾ基が組み込まれることで、無蛍光性になるという特徴を有する。これにより、一般式（Ｉｃ）の化合物は、低酸素環境検出蛍光プローブを提供することが可能である。

還元酵素としては、例えば、ＮＡＤＰＨシトクロムＰ４５０還元酵素、シトクロムＰ４５０、ＮＡＤＰＨ−フラビン還元酵素、ＮＡＤＨ−ｂ５還元酵素などが挙げられる。

また、本発明の１つの好ましい実施態様は、一般式（Ｉａ）においてＲ^１１は測定対象物質との接触により切断される一価の置換基であり、当該置換基は芳香環である化合物又はその塩である。Ｒ^１１が芳香環である場合は、芳香環と置換基の間の結合が活性酸素種により切断され、有用な近赤外光活性酸素検出プローブを提供することができる。

芳香環としては、フェノール基、アミノフェニル基、およびそれらのオルト位やメタ位にメチル基、エチル基、プロピル基、ハロゲン基、メトキシ基、アリル基、カルボキシ基等が結合したフェノール基およびアミノフェニル基が挙げられるが、好ましくは、フェノール基、アミノフェニル基である。

また、更に１つの好ましい実施態様において、Ｒ^１１は測定対象物質との接触により切断される一価の置換基であり、当該置換基は芳香環であって、Ｒ^３とＲ^９が一緒になって、Ｒ^９が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していることが好ましい。また、Ｒ^１２は、好ましくは炭素数１〜６個のアルキル基である。

１つの好ましい実施態様は、以下の一般式（Ｉａ−３）で表される化合物又はその塩である。

一般式（Ｉａ−３）において、Ｒ^１〜Ｒ^２、Ｒ^４〜Ｒ^８、Ｒ^１０、Ｒ^１２及びＸは、一般式（Ｉａ）で定義したとおりである。

このような化合物の非限定的な例として、以下の化合物を挙げることができる。

上記一般式（Ｉ）、（Ｉａ）（（Ｉａ−１）〜（Ｉａ−３）を含む。以下の記載において同様である。）〜（Ｉｃ）で表される化合物は塩として存在する場合がある。塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩を挙げることができ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などを例示することができる。もっとも、本発明の化合物の塩はこれらに限定されることはない。

一般式（Ｉ）、（Ｉａ）〜（Ｉｃ）で表される本発明の化合物は、置換基の種類に応じて１個または２個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。また、一般式（Ｉｃ）で表される本発明の化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。

本発明のもう一つの態様は、一般式（Ｉ）、（Ｉａ）〜（Ｉｃ）で表される化合物を含む蛍光プローブである。

上記した各種蛍光プローブを用いる測定対象物質の測定は、測定対象物質と接触することで切断される一価の置換基に関する上記刊行物に記載された方法など当業者に周知の方法に準じて行うことができるので、研究のための試薬としての使用のほか動物や人の診断のための試薬として使用することも出来る。例えば、上記した各種蛍光プローブを用いることにより、試験管中で測定対象物質の濃度や量を測定することが可能になり、あるいは生細胞や生体に取り込ませてバイオイメージングの手技により画像化して測定することができる。代表的な例として、下記の工程：（ａ）測定対象物質と接触することで切断される一価の置換基を有する一般式（Ｉ）、（Ｉａ）〜（Ｉｃ）で表される化合物又はその塩と測定対象物質とを接触させる工程、及び（ｂ）上記工程（ａ）で生成した測定対象物質と接触後の前記化合物の蛍光強度を測定する工程を含む方法をあげることができる。

上記したように、本発明の化合物ではＲ^１１、Ｒ^９、Ｒ^１０又はＲ^１３を周知の方法で容易に適宜な置換基とすることができる。例えば、ラベル化のための置換基、ケージド化合物とするための置換基など、捕捉基以外の機能性置換基を導入できることも当業者には容易に理解されよう。なお、本明細書において用いられる「測定」という用語は、定量、定性、又は診断などの目的で行われる測定、検査、検出などを含めて、最も広義に解釈しなければならない。

本発明の化合物の合成方法
本発明の一般式（Ｉａ）の化合物は下記の合成スキーム（以下「合成法１」ともいう）に従って合成することができる。

（１）工程（ａ）
一般式(II)（式中、Ｒ^１６はハロゲン原子を示す）で表される３−ハロゲン化−Ｎ，Ｎ−ジアリルアニリンは、３−ハロゲン化アニリンとアリルハライドから製造される。式(II)の化合物と式(III)で表される３−ハロゲン化ベンゼンアミン化合物とを、酢酸等の酸に溶解し、ホルムアミド液を添加して、２５〜８０℃で４５〜７２０分間加熱して合成することができる。式(II)の化合物と式(III)の化合物のモル比は、通常２：１〜５：１である。

（２）工程（ｂ）
一般式(IV)で表される化合物をＴＨＦ等の溶媒中、−７８℃に冷却後、２〜１００当量のｓｅｃ−ブチルリチウムを添加し、１．５〜１００当量のＸ（Ｈａｌｏ）_２（Ｒ^５）（Ｒ^６）（Ｈａｌｏは塩素原子又は臭素原子を示し、Ｘ、Ｒ^５、Ｒ^６は上記と同義である）を予め溶媒に溶解して添加する。室温に戻して、１〜２時間程度反応させる。溶媒除去後の残渣をアセトン等の溶媒中、０℃に冷却後、３〜１０当量の過マンガン酸カリウムを２時間程度かけて添加し、その後１〜５時間同温で撹拌することにより、式(V)で表される化合物を合成することができる。

（３）工程（ｃ）
２−ブロモトルエンとＴＨＦ等の溶媒を混合し−７８℃に冷却し、３０〜１００当量のｓｅｃ−ブチルリチウムを添加する。一般式(V)の化合物をＴＨＦ等の溶媒に溶解し、この溶液を上記混合液に添加して、室温に戻して、１〜２時間程度反応させた後、５０〜２００当量の２N塩酸で処理することにより、式(VI)で表される化合物を合成することができる。

（４）工程（ｄ）
一般式(VI)で表される化合物をメタノール等に溶解し、０℃に冷却後、３〜５当量の水素化ホウ素ナトリウムを添加し、その後２〜１０当量の１，３−ジメチルバルビツール酸で処理することにより脱アリル化を行う。脱アリル化して得られた化合物を溶媒に溶解し、２〜５当量のクロラニルを加えて、処理することにより、一般式（Ｉａ）においてＲ^１１及びＲ^１２が水素原子である化合物を得ることができる。

また、本発明においては、一般式（Ｉａ）の化合物は下記の合成スキーム（以下「合成法２」ともいう）によっても合成することができる。

（１）工程（ｅ）
一般式(VII)（式中、Ｒ^１６はハロゲン原子を示す）で表される３−ハロゲン化−Ｎ，Ｎ−ジアリルアニリンは、３−ハロゲン化アニリンとアリルハライドから製造される。３−ハロゲン化−Ｎ，Ｎ−ジアリルアニリンを溶媒に溶解し、１〜２当量のオキシ塩化リンを添加し、１〜２当量の水酸化ナトリウム等の塩基水溶液を加えて反応させ、１〜２当量の水素化ホウ素ナトリウムを加えて反応させることで一般式(VIII)で表される３−ハロゲン化−Ｎ，Ｎ−ジアリル−４−ヒドロキシメチルアニリンを合成することができる。

（２）工程（ｆ）
３−ハロゲン化−Ｎ，Ｎ−ジアリル−４−ヒドロキシメチルアニリンと式(IX)で表される３−ハロゲン化ベンゼンアミン化合物とを略等モル量で反応させて、一般式(X)で表される化合物を合成することができる。

（３）工程（ｇ）
一般式(X)で表される化合物をＴＨＦ等の溶媒中、−７８℃に冷却後、５〜１００当量のｓｅｃ−ブチルリチウムを添加し、５〜１００当量のＸ（Ｈａｌｏ）_２（Ｒ^５）（Ｒ^６）（Ｈａｌｏは塩素原子又は臭素原子を示し、Ｘ、Ｒ^５、Ｒ^６は上記と同義である）を予め溶媒に溶解して添加する。室温に戻して、１〜２時間程度反応させる。溶媒除去後の残渣をアセトン等の溶媒中、０℃に冷却後、３〜１０当量の過マンガン酸カリウムを2時間程度かけて添加し、その後１〜５時間同温で撹拌することにより、一般式(V)で表される化合物を合成することができる。

一般式(V)から一般式（Ｉａ）の化合物を得る方法は、スキーム１の方法と同様である。

（例えば、溶媒に溶解させたIaの化合物に１〜２当量の測定対象物に認識、切断されうるアミノ酸やペプチド、１〜２当量のＨＡＴＵ等の縮合剤、及び２〜４当量のＤＩＰＥＡ、ピリジン等の求核性の無い塩基を添加することで）従来公知の方法を用いることにより、Ｒ^１１として測定対象物質との接触により切断される一価の置換基を導入することができる。

また、合成法１又は合成法２で得られる一般式（Ｉａ）においてＲ^１１及びＲ^１２が水素原子である化合物について、例えば、２〜５当量の酸クロリドを用いてアミド化した後に１００〜１５０当量のボラン−テトラヒドロフラン錯体等によるヒドリド還元によりアミドを還元させてから２〜５当量のクロラニル等により酸化する方法、あるいは２〜１０当量のテトラヒドロホウ酸ナトリウム等のヒドリド還元を施した後に１０〜２０当量のパラホルムアルデヒド及び１０〜２０当量のテトラヒドロホウ酸ナトリウムを用いてメチル化を行い、その後１〜１．５当量の臭化アルキル等を用いたＳＮ２反応を行い、２〜５当量のクロラニル等により酸化する方法などによりＲ^１２としてアルキル基を導入することができる。

本発明の一般式（Ｉｂ）の化合物は下記の合成スキームに従って合成することができる。

（１）工程（ｈ）
一般式（XI）で表される化合物を溶媒に溶解し、ピリジンなどの塩基を添加し、１〜２当量のトリフルオロメタンスルホン酸無水物（Ｔｆ_２Ｏ）と反応させ、一般式（XII）で表される化合物を合成することができる。

（２）工程（ｉ）
一般式(XII)で表される化合物を溶媒に溶解し、触媒量のＰｄ_２（ｄｂａ）_３ＣＨＣｌ_３、触媒量のキサントフォス、１〜１．５当量のＣｓ_２ＣＯ_３、１〜１．５当量のベンゾフェノンイミン等のイミン化合物を添加して、希酸で加水分解することにより一般式(XIII)で表される化合物を合成することができる。一般式(XIII)で表される化合物は、一般式（１ｂ）においてＲ^１３が水素原子である化合物のケト体である。

一般式（XIII)の化合物をハロゲン化アルキルと反応させることにより、アミノ基にアルキル基を導入することができ、また、カルボニル基をアルコキシル基に変換することができる。

また、一般式(XII)の化合物と、アミド化合物（アセトアミド等）、ペプチド合成用レジンから切り出したペプチド（Ｃ末端のカルボン酸がＣＯＮＨ_２となっている）等を反応させることにより、アミド基などの測定対象物質との接触により切断される一価の置換基をキサンテン環部位に導入することにより、蛍光プローブを得ることができる。

本発明の一般式（Ｉａ−３）の化合物は下記の合成スキームに従って合成することができる。

（１）工程（ｊ）
一般式(XIV)の化合物を、塩酸等の酸性水溶液と有機溶媒の混合溶媒に溶解し、０℃程度に冷却し、そこへ、１〜２当量のＮａＮＯ_２水溶液を滴下し、所定時間撹拌後、１〜１０当量のヨウ化カリウムの水溶液を添加して反応させることにより、一般式(XV)の化合物を合成することができる。

（２）工程（ｋ）
式(XV)の化合物、アルキル基の炭素数が１〜６であるＮ−アルキル−Ｐ−アニシジンをトルエン等の有機溶媒に溶解し、Ｐｄ（ＯＡｃ）_２、ＢＩＮＡＰを添加してと反応させることにより、一般式(XVI)の化合物を合成することができる。

（３）工程（ｌ）
一般式(XVI)の化合物をＴＨＦ等の溶媒に溶解し、１〜５０当量のｏ−トリル臭化マグネシウムを加えて反応させ、その後、酸を添加して、一般式(XVII)の化合物を合成することができる。

（４）工程（ｍ）
一般式(XVII)の化合物を溶媒に溶解し、１〜３当量の三臭化ボロンを添加して反応させることにより、一般式（Ｉａ−３）で表される化合物を合成することができる。

本発明の一般式（Ｉｃ）の化合物は、上記の合成法１又は２で得た一般式（Ｉａ）においてＲ^１１及びＲ^１２が水素原子である化合物を、ＴＦＡを含む１：１、ＭｅＣＮ／ＣＨ_２Ｃｌ_２の混合溶媒に溶解し、亜硝酸ナトリウムの存在下で、０℃程度の温度で、例えば、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアニリンと反応させることにより合成することができる。

本発明の蛍光プローブの使用方法は特に限定されないが、例えば、単離精製した酵素、および細胞溶解液中に含まれる観察対象酵素の活性測定や、生細胞内での酵素活性の測定、長波長という光学特性を活かした生体組織中でのがんバイオマーカーとなる酵素の活性測定等が挙げられる。

また、本発明の一般式（Ｉａ−３）で表される化合物を含む蛍光プローブは、活性酸素種、例えば、Ｈ_２Ｏ_２、⁻ＯＣｌ、ＯＮＯＯ⁻、Ｏ_２ ⁻、ヒドロキシラジカルの測定に好適に用いることができる。

また、本発明の一般式（Ｉｃ）で表される化合物を含む蛍光プローブは、低酸素環境の検出に好適に用いることができる。

以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。実施例中、Ｍｅはメチル基、Ａｃはアセチル基を意味する。

［実施例１］
以下の合成スキームにより本発明の化合物１及び化合物２を合成した。

（１）工程（ａ）
Ｋ_２ＣＯ_３（４４．０ｇ、３１８ｍｍｏｌ）をアセトニトリルに懸濁し、３−ブロモアニリン（１７．４ｍＬ、１６０ｍｍｏｌ）、アリルブロミド（４７．５ｍＬ、５０１ｍｍｏｌ）を加えて８０℃で２０時間攪拌した。室温まで冷却した後にろ過を行い、酢酸エチルでよく洗った。溶媒を除去した後にカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１／３０酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、Ｎ，Ｎ−ジアリル−３−ブロモベンゼンアミン（３１．３ｇ、１２５ｍｍｏｌ、収率９１％）を得た。

（２）工程（ｂ）
Ｎ，Ｎ−ジアリル−３−ブロモベンゼンアミン（１０．０ｇ、３９．８ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジメチル−３−ブロモベンゼンアミン（２．７３ｇ、１３．６ｍｍｏｌ）を酢酸（１５０ｍＬ）に溶解し、３７％ホルムアルデヒド液（１０．９ｇ、３６３ｍｍｏｌ）を加えて８０℃で６０分間加熱した。室温まで冷却した後、飽和ＮａＯＨ水溶液で中和し、沈殿物をＨ_２Ｏで溶解させた。この混合物をジクロロメタンで抽出し、食塩水で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥して溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１／３０酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、４−（２−ブロモ−４−（ジメチルアミノ）ベンジル）−Ｎ，Ｎ−ジアリル−３−ブロモベンゼンアミン（３．６７ｇ、７．９１ｍｍｏｌ、収率５８％）を得た。

¹H-NMR (300.40 MHz, CDCl₃): δ2.93 (s, 6H), 3.87(d, 4H, J = 4.2 Hz), 3.98 (s, 2H), 5.13-5.19 (m, 4H), 5.73-5.88 (m, 2H), 6.53 (dd, 1H, J = 1.5 Hz, 8.7 Hz), 6.58 (dd, 1H, J = 1.5 Hz, 8.7 Hz), 6.79 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 6.86 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 6.90 (d, 1H, J = 1.5 Hz), 6.93 (d, 1H, J = 1.5 Hz).¹³C-NMR (75.45 MHz, CDCl₃): δ39.8, 40.5, 52.7, 111.7, 111.8, 116.0, 116.2, 125.5, 125.6, 126.9, 127.1, 130.7, 130.8, 133.5, 148.1, 150.0LRMS (ESI+): 465 for [M+H]⁺

（３）工程（ｃ）
乾燥させアルゴン置換したフラスコに４−（２−ブロモ−４−（ジメチルアミノ）ベンジル）−Ｎ，Ｎ−ジアリル−３−ブロモベンゼンアミン（１９．９ｇ、４３．０ｍｍｏｌ）と脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、１２０ｍＬ）を加えた。−７８℃に冷却後、１Ｍｓｅｃ−ブチルリチウム（１２０ｍＬ、１２０ｍｍｏｌ）を加え、２０分間攪拌した。そのままの温度でジメチルシリルジクロリド（５．８ｍＬ、６０ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦ４０ｍＬに溶解してゆっくりと加え、室温に戻して１時間攪拌した。２Ｎ塩酸で反応を停止してＮａＨＣＯ_３で中和した。この混合物をジクロロメタンで抽出して食塩水で洗浄し、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させた後に溶媒を除去した。残渣をアセトン（３００ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却してＫＭｎＯ_４（１９．４ｇ、１２３ｍｍｏｌ）を少量ずつ２時間かけて加え、更に同じ温度で１時間攪拌した。ジクロロメタンで洗いながらろ紙を用いて吸引ろ過した。溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ジクロロメタン）で精製してＮ，Ｎ−ジアリル−Ｎ’，Ｎ’−ジメチルジアミノ−Ｓｉ−キサントン（４．６８ｇ、１２．４ｍｍｏｌ、収率２９％）を得た。

¹H-NMR (300.40 MHz, CDCl₃): δ 0.44 (s, 6H), 3.09 (s, 6H), 4.03 (d, 4H, J = 4.4 Hz), 5.18-5.30 (m, 4H), 5.82-5.95 (m, 2H), 6.78-6.85 (m, 4H), 8.36 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 8.39 (d, 1H, J = 9.0 Hz)¹³C-NMR (75.45 MHz, CDCl₃): δ-1.1, 40.0, 52.6, 113.1, 113.4, 114.2, 114.7, 116.5, 129.6, 129.9, 131.6, 133.0, 140.4, 150.1, 151.4, 185.1HRMS (ESI+): Found: 377.2019, calculated 377.2049 for [M+H]⁺ (-3.0 mmu)

（４）工程（ｄ）
よく乾燥させアルゴン置換したフラスコに、２−ブロモトルエン（１４ｍＬ、１１０ｍｍｏｌ）と脱水ＴＨＦ（５０ｍＬ）を加えた。−７８℃に冷却後、１Ｍｓｅｃ−ブチルリチウム（１００ｍＬ、１００ｍｍｏｌ）を加えて２０分間攪拌した。そのままの温度でＮ，Ｎ−ジアリルアミノ−Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノ−Ｓｉ−キサントン（９３０ｍｇ、２．４７ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦ３０ｍＬに溶解してゆっくりと加え、室温に戻した。室温で１時間攪拌後、２Ｎ塩酸を８０ｍＬ加えて２０分間攪拌した。この混合物をジクロロメタンで抽出して食塩水で洗った。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１／１９→１／４メタノール／ジクロロメタン）で精製してＮ−［７−（ジアリルアミノ）−９，９−ジメチル−１０−（２−メチルフェニル）−９−シラアントラセン−２（９Ｈ）−イリデン］−Ｎ−メチル−メタンアミニウム（１．０７ｇ、２．２０ｍｍｏｌ、収率８９％）を得た。

¹H-NMR (300.40 MHz, CDCl₃): δ0.61 (s, 3H), 0.63 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 3.49 (s, 6H), 4.21 (d, 4H, J = 5.1 Hz), 5.19-5.32 (m, 4H), 5.82-5.95 (m, 2H), 6.11 (dd, 1H, J = 1.5 Hz, 9.6 Hz), 6.69 (dd, 1H, J = 1.5 Hz, 10.2 Hz), 7.07 (d, 1H, J = 9.6Hz), 7.11-7.14 (m, 2H), 7.29 (d, 1H, J = 3.0 Hz), 7.35-7.49 (m, 4H)
¹³C-NMR (100.40 MHz, CDCl₃): δ-1.1, -0.8, 19.4, 41.6, 53.6, 114.0, 114.5, 118.1, 120.6, 121.7, 125.6, 127.6, 128.0, 128.8, 128.9, 130.2, 130.4, 130.8, 135.6, 138.3, 141.0, 142.2, 147.7, 153.2, 154.7, 170.0
HRMS (ESI+): Found: 451.2541, calculated 451.2569 for [M]⁺ (-2.8 mmu)

（５）工程（ｅ）
Ｎ−［７−（ジアリルアミノ）−９，９−ジメチル−１０−（２−メチルフェニル）−９−シラアントラセン−２（９Ｈ）−イリデン］−Ｎ−メチル−メタンアミニウム（１．１５ｇ、２．３６ｍｍｏｌ）をメタノール（１００ｍＬ）に溶解させた。０℃に冷却後、水素化ホウ素ナトリウム（３６７ｍｇ、９．７２ｍｍｏｌ）を加えて３０分間撹拌した。反応溶液を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液で振り取った後、食塩水で洗浄し、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させた後に溶媒を除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１／４酢酸エチル／ヘキサン）で粗く精製し７−ジアリルアミノ−２−ジメチルアミノ−１０−（２−メチルフェニル）−９，１０−ジヒドロ−９，９−ジメチル−９−シラアントラセン混合物（７８５ｍｇ）を得た。乾燥させアルゴン置換したフラスコにＰｄ（ＰＰｈ_３）_４（２１３ｍｇ、０．１８４ｍｍｏｌ）と１、３−ジメチルバルビツール酸（９４３ｍｇ、６．０４ｍｍｏｌ）を加えた。ここに先ほど得られた混合物をジクロロメタン５０ｍＬに溶解して加え、３５℃で１１時間加熱攪拌した。溶媒を除去して飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液に懸濁し、ジクロロメタンで抽出した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させて溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１／９→１／４酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、７−アミノ−２−ジメチルアミノ−１０−（２−メチルフェニル）−９，１０−ジヒドロ−９，９−ジメチル−９−シラアントラセン（４５０ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ、収率５１％）を得た。

¹H-NMR (300.40 MHz, CD₃OD): δ0.37 (s, 3H), 0.54 (s, 3H), 2.17 (s, 3H), 2.88 (s, 6H), 5.50 (s, 1H), 6.60 (dd, J = 8.4 Hz, 2.6 Hz, 1H), 6.69 (dd, J = 8.8 Hz, 2.9 Hz, 1H), 6.78 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.86 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.97-7.09 (m, 6H)¹³C-NMR (75.45 MHz, CDCl₃): δ-1.0, -0.3, 20.5, 40.7, 49.9, 114.6, 116.3, 116.9, 119.0, 125.8, 126.1, 129.8, 130.1, 131.0, 131.1, 133.6, 134.4, 135.5, 137.2, 139.2, 143.3, 146.0, 147.9HRMS (ESI+): Found: 373.2071, calculated 373.2100 for [M+H]⁺ (-2.9 mmu)

（６）工程（ｆ）：２−ＭｅＳｉＲ６２０（化合物１）の合成
７−アミノ−２−ジメチルアミノ−１０−（２−メチルフェニル）−９，１０−ジヒドロ−９，９−ジメチル−９−シラアントラセン（１２１ｍｇ、０．３２４ｍｍｏｌ）とクロラニル（１５９ｍｇ、０．６４７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解させ、室温で３０分間撹拌した。溶媒を除去した後、ＨＰＬＣで生成して２−ＭｅＳｉＲ６２０トリフルオロ酢酸塩（化合物１）（１０３ｍｇ、０．２１３ｍｍｏｌ、収率６６％）を得た。

¹H-NMR (300.40 MHz, CD₃OD): δ0.55 (s, 3H), 0.56 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 3.34 (s, 6H), 6.58 (dd, 1H, J = 2.1 Hz, 9.6 Hz), 6.76 (dd, 1H, J = 3.0 Hz, 9.6 Hz), 7.02 (d, 1H, 9.6 Hz), 7.07-7.13 (m, 2H), 7.20 (d, 1H, J =2.1 Hz), 7.36-7.49 (m, 4H)¹³C-NMR (75.45 MHz, CDCl₃): δ-1.6, -1.3, 19.3, 40.4, 113.1, 117.5, 119.3, 125.5, 125.5, 127.4, 127.8, 128.7, 128.9, 130.1, 135.6, 138.6, 140.2, 143.5, 146.9, 150.1, 153.0, 158.1, 169.1HRMS (ESI+): Found: 371.1974, calculated371.1944 for [M]⁺ (3.1 mmu)

（７）工程（ｇ）
乾燥したフラスコに２−ＭｅＳｉＲ６２０トリフルオロ酢酸塩（１０３ｍｇ、０．２１３ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン（１４０μＬ、０．８２３ｍｍｏｌ）と脱水テトラヒドロフラン（１７ｍＬ）を加えた。０℃に冷却後４−クロロ−４−オキソ酪酸メチル（１００μＬ、０．８１２ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン置換をして室温で５時間撹拌した。溶媒を除去後、ＨＰＬＣで精製して４−オキソ−４−（２−ＭｅＳｉＲ６２０）−酪酸メチルトリフルオロ酢酸塩（８６．４ｍｇ、０．１４４ｍｍｏｌ、収率６８％）を得た。

¹H-NMR (300.40 MHz, CDCl₃): δ0.55 (s, 3H), 0.57 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 2.66 (t, 2H, J = 6.6 Hz), 2.95 (t, 2H, J = 6.6 Hz), 3.44 (s, 3H), 3.59 (s, 3H), 3.66 (s, 3H), 6.72-6.75 (m, 1H), 7.07 (d, 1H, J = 7.5 Hz), 7.12 (d, 1H, J = 9.0 Hz) 7.30-7.36 (m, 4H), 7.42-7.47 (m, 1H), 7.97 (dd, 1H, J = 2.1 Hz, 8.7 Hz), 8.29 (d, 1H, J = 2.1 Hz), 11.28 (s, 1H)¹³C-NMR (100.40 MHz, CDCl₃): δ -1.8, -1.4, 19.5, 28.8, 31.9, 41.6, 41.9, 51.7, 115.6, 121.1, 122.8, 125.6, 128.8, 129.3, 130.4, 133.3, 135.6, 137.8, 140.2, 144.6, 144.8, 146.3, 154.3, 156.1, 172.6, 173.1HRMS (ESI+): Found: 485.2242, calculated 485.2260 for [M]+ (-1.8 mmu)

（８）工程（ｈ）
アルゴン置換をしたよく乾燥したフラスコに４−オキソ−４−（２−ＭｅＳｉＲ６２０）−酪酸メチルトリフルオロ酢酸塩（２０．７ｍｇ、０．０３４６ｍｍｏｌ）と脱水テトラヒドロフラン（８ｍＬ）を加えて０℃に冷却した後、０．９Ｍボラン−テトラヒドロフランコンプレックス（５ｍＬ、４．５ｍｍｏＬ）を加えて室温に戻した。室温で２７０分撹拌した後、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液（２０ｍＬ）をゆっくり加えて反応を停止させた。この混合物からテトラヒドロフランを除去した後、ジクロロメタンで抽出して食塩水で洗浄し、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させた後に溶媒を除去した。残渣をジクロロメタン（４ｍＬ）に溶解させた後、クロラニル（４ｍｇ）を加えて１５分間室温で撹拌した。溶媒を除去し、得られた残渣をＨＰＬＣで精製して４−（２−ＭｅＳｉＲ６２０）−酪酸メチルトリフルオロ酢酸塩（８．１ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ、収率４０％）を得た。

¹H-NMR (300.40 MHz, CDCl₃): δ 0.54 (s, 3H), 0.56 (s, 3H), 1.99-2.06 (m, 5H), 2.46 (t, 2H, J = 6.2 Hz), 3.25 (s, 6H), 3.51 (br, 2H), 3.67 (s, 3H), 6.54 (dd, 1H, J = 3.0 Hz, 9.0 Hz), 6.65 (br, 1H), 7.01 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 7.03 (d, 1H, J = 3.0 Hz),7.07 (d, 2H, J = 7.2 Hz), 7.30-7.44 (m, 4H), 9.98 (br, 1H)¹³C-NMR (75.45 MHz, CDCl₃): δ-1.5, -1.2, 19.3, 23.8, 30.6, 40.3, 42.6, 51.7, 113.0, 119.2, 125.6, 127.5, 127.8, 128.7, 128.9, 130.2, 135.7, 138.6, 139.6, 152.8, 156.4, 168.6, 173.6HRMS (ESI+): Found: 471.2477, calculated 471.2468 for [M]+ (0.9 mmu)

（９）工程（ｉ）：２−ＭｅＳｉＲ６２０−ａｌ（化合物２）の合成
４−（２−ＭｅＳｉＲ６２０）−酪酸メチルトリフルオロ酢酸塩（３７．４ｍｇ、０．０６４０ｍｍｏｌ）をメタノール（３０ｍＬ）と２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）の混合液に溶解させ、４０℃で２７０分間加熱撹拌した。２Ｎ塩酸で中和した後、ジクロロメタンで抽出し、食塩水で洗浄した。溶媒除去後、残渣をＨＰＬＣで精製して２−ＭｅＳｉＲ６２０−ａｌトリフルオロ酢酸塩（化合物２）（２０．２ｍｇ、０．０３５４ｍｍｏｌ，収率５５％）を得た。

¹H-NMR (300.40 MHz, CDCl₃): δ0.54 (s, 3H), 0.56 (s, 3H), 2.03 (m, 5H), 2.60 (br, 2H), 3.26 (s, 6H), 3.49 (br, 2H), 6.54 (dd, 2H, J = 3.0 Hz, 9.0 Hz), 7.00-7.08 (m, 4H), 7.29-7.44 (m, 4H), 9.47 (br, 1H)HRMS (ESI+): Found: 457.2278, calculated 457.2311 for [M]+ (-3.3 mmu)

上記工程（ｆ）で得られた２−ＭｅＳｉＲ６２０（化合物１）および工程（ｉ）で得られた２−ＭｅＳｉＲ６２０−ａｌ（化合物２）の吸光および蛍光プロファイルを測定した。結果を図１ａ及び１ｂに示す。測定は０．１％のＤＭＳＯを含むｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸ナトリウム水溶液中で行った。蛍光プロファイル測定における励起光の波長は２−ＭｅＳｉＲ６２０では６２０ｎｍで、２−ＭｅＳｉＲ６２０−ａｌでは６３５ｎｍである。

２−ＭｅＳｉＲ６２０および２−ＭｅＳｉＲ６２０−ａｌの光学特性データを表１にまとめた。アルキルリンカーを結合させることでＡｂｓ_ｍａｘとＥｍ_ｍａｘ ^ａはともに長波長化し、モル吸光係数や蛍光量子収率が上昇することがわかった。

［実施例２］
以下の合成スキームにより本発明の化合物３を合成した。

（１）工程（ａ）
７−アミノ−２−ジメチルアミノ−１０−（２−メチルフェニル）−９，１０−ジヒドロ−９，９−ジメチル−９−シラアントラセン（２４３ｍｇ，０．６５３ｍｍｏｌ）、ナトリウムメトキシド（２４５ｍｇ、４．５３ｍｍｏｌ）およびパラホルムアルデヒド（２６６ｍｇ、８．８７ｍｍｏｌ）をメタノール（１０ｍＬ）に加え、懸濁液を室温で１５時間撹拌した後、水素化ホウ素ナトリウム（４１０ｍｇ、１０．８ｍｍｏｌ）を加え８０℃で２時間撹拌した。反応溶液に１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えたのちジクロルメタンで抽出し食塩水で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥して溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１／４酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、７−メチルアミノ−２−ジメチルアミノ−１０−（２−メチルフェニル）−９，１０−ジヒドロ−９，９−ジメチル−９−シラアントラセン（１７１．７ｍｇ、０．４４４ｍｍｏｌ、収率６８％）を得た。

¹H-NMR (300.40 MHz, CD₃OD): δ 0.38 (s, 3H), 0.55 (s, 3H), 2.17 (s, 3H), 2.75 (s, 3H), 2.88 (s, 6H), 5.51 (s, 1H), 6.53 (dd, J = 8.4 Hz, 2.6 Hz, 1H), 6.68 (dd, J = 8.8 Hz, 2.9 Hz, 1H), 6.80 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.85-6.87 (m, 2H), 6.98-7.08 (m, 5H)¹³C-NMR (75.45 MHz, CDCl₃): δ -0.9, -0.3, 20.5, 30.8, 40.7, 49.8, 114.3, 114.6, 116.1, 116.3, 125.7, 126.1, 129.8, 130.0, 131.0, 131.2, 133.8, 134.1, 135.5, 137.3, 137.9, 146.1, 146.4, 147.9 HRMS (ESI+): Found: 387.2221, Calculated 387.2257 for [M+H]⁺ (-3.6 mmu)

（２）工程（ｂ）：２−ＭｅＳｉＲ６３０(化合物３）の合成
７−メチルアミノ−２−ジメチルアミノ−１０−（２−メチルフェニル）−９，１０−ジヒドロ−９，９−ジメチル−９−シラアントラセン（１８．４ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）をジクロルメタン（２ｍＬ）に溶解させたのち、クロラニル（３２．０ｍｇ、０．１３０ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間撹拌した。溶媒除去後、残渣をＨＰＬＣで精製し、２−ＭｅＳｉＲ６３０トリフルオロ酢酸塩(化合物３）（４．８ｍｇ、９．６３μｍｏｌ、収率２０％）を得た。

¹H-NMR (300.40 MHz, CDCl₃): δ 0.54 (s, 3H), 0.56 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 3.12 (s, 3H), 3.23 (s, 6H), 6.53 (dd, J = 3.0 Hz, 6.6 Hz, 1H), 6.91-7.09 (m, 4H), 7.30-7.44 (m, 5H)HRMS (ESI+): Found: 385.2107, Calculated 385.2100 for [M]⁺ (0.7 mmu)

また、以下の合成スキームにより本発明の化合物４を合成した。

（３）工程（ｃ）
よく乾燥させアルゴン置換したフラスコに７−メチルアミノ−２−ジメチルアミノ−１０−（２−メチルフェニル）−９，１０−ジヒドロ−９，９−ジメチル−９−シラアントラセン（９５．３ｍｇ、０．２４７ｍｍｏｌ）、Ｋ_２ＣＯ_３（７８．２ｍｇ、０．５６６ｍｍｏｌ）、ヨウ化カリウム（５０．０ｍｇ、０．３０１ｍｍｏｌ）、４−ブロモ酪酸メチル（５０μＬ、０．３９７ｍｍｏｌ）、脱水アセトニトリル（１０ｍＬ）を加え、１００℃で２日間撹拌した。反応溶液を室温まで冷やした後ろ過を行い、酢酸エチルでよく洗った。ろ液から溶媒を除去後にカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１／４ヘキサン／ジクロルメタン→ジクロルメタン）で精製し、４−（２−ジメチルアミノ−１０−（２−メチルフェニル）−９，１０−ジヒドロ−９，９−ジメチル−９−シラ−７−アントラセニル）メチルアミノ酪酸メチル（４０．４ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ、収率３４％）を得た。

¹H-NMR (300.40 MHz, CDCl₃): δ 0.44 (s, 3H), 0.60 (s, 3H), 1.85-1.95 (m, 2H), 2.24 (s, 3H), 2.35 (t, 2H, J = 7.0 Hz), 2.91 (s, 3H), 2.93 (s, 6H), 3.33 (t, 2H, J = 7.3 Hz), 3.65 (s, 3H), 5.56 (s, 1H), 6.59-6.67 (m, 2H), 6.87 (dd, 2H, J = 8.8 Hz, 4.4 Hz), 6.92 (dd, 2H, J = 9.9 Hz, 2.6 Hz), 7.03-7.14 (m, 4H). ¹³C-NMR (75.45 MHz, CDCl₃): δ -0.9, -0.3, 20.5, 22.3, 31.3, 38.3, 40.7, 49.7, 51.6, 52.0, 114.2, 114.6, 115.9, 116.4, 125.7, 126.1, 129.8, 129.9, 131.0, 131.2, 133.9, 134.0, 135.6, 137.0, 137.4, 146.1, 146.6, 147.9, 173.7. HRMS (ESI+): Found: 487.2759 Calculated 487.2781 for [M+H]⁺ (-2.2 mmu)

（４）工程（ｄ）
４−（２−ジメチルアミノ−１０−（２−メチルフェニル）−９，１０−ジヒドロ−９，９−ジメチル−９−シラ−７−アントラセニル）メチルアミノ酪酸メチル（３０．３ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）と２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）の混合溶液に溶解させて、４０℃で４時間加熱撹拌した。２Ｎ塩酸で中和した後、ジクロルメタンで抽出し、食塩水で洗浄した。溶媒除去後、残渣をジクロルメタン（５ｍＬ）に溶かし、クロラニル（２９．６ｍｇ、０．１２０ｍｍｏｌ）を加えて室温で１００分撹拌した。溶媒を除去後、ＨＰＬＣで精製し、２−ＭｅＳｉＲ６３０−ａｌトリフルオロ酢酸塩（化合物４）（１７．８ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ収率４９％）を得た。

¹H-NMR (300.40 MHz, CDCl₃): δ 0.62 (s, 3H), 0.64 (s, 3H), 2.04 (m, 5H), 2.66 (br, 2H), 3.30 (m, 9H), 3.80 (br, 2H), 6.57 (dd, J = 3.0 Hz, 6.6 Hz, 1H), 7.06-7.12 (m, 6H), 7.31-7.43 (m, 3H)¹³C-NMR (100.40 MHz, CDCl₃): δ -1.4, -1.1, 19.4, 22.4, 30.5, 39.1, 40.7, 52.7, 113.5, 114.0, 120.2, 125.6, 127.7, 127.7, 128.9, 128.9, 130.3, 135.7, 138.4, 141.3, 142.3, 149.5, 153.8, 154.2, 170.6HRMS (ESI+): Found: 471.2425 Calculated 471.2468 for [M]⁺ (-4.3 mmu)

上記工程（ｂ）で合成した２−ＭｅＳｉＲ６３０（化合物３）および工程（ｄ）で合成した２−ＭｅＳｉＲ６３０−ａｌ（化合物４）について、吸光および蛍光スペクトルを測定した。結果を図２ａ及び２ｂに示す。測定は０．１％のＤＭＳＯを含むｐＨ７．４の０．１リン酸ナトリウム水溶液中で行った。蛍光スペクトル測定における励起光は２−ＭｅＳｉＲ６３０では６３３ｎｍで、２−ＭｅＳｉＲ６３０−ａｌでは６４８ｎｍである。

化合物３及び化合物４について、表２に光学特性データをまとめた。

［実施例３］
以下の合成スキームにより本発明の化合物５を合成した。

（１）工程（ａ）
Ｎ，Ｎ−ジアリル−３−ブロモアニリン（１．２１ｇ、４．８０ｍｍｏｌ）をトルエンに溶解させ、ＤＭＦ（４５６μＬ、６．２４ｍｍｏｌ）オキシ塩化リン（５３４μＬ、５．７６ｍｍｏｌ）を加えて８０℃で２１時間攪拌した。水浴に浸けて冷却しながら２規定水酸化ナトリウム水溶液を加えて５分間攪拌し、この混合物をジクロロメタンで抽出し、食塩水で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥して溶媒を減圧留去した後、エタノール（１０ｍＬ）、水素化ホウ素ナトリウム（１８２ｍｇ、４．８０ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間攪拌した。溶媒を減圧留去した後、残差に水を加え、この混合物をジクロロメタンで抽出した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、溶媒を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、３０％酢酸エチル／ｎ−ヘキサン）で精製してＮ，Ｎ−ジアリル−３−ブロモ−４−ヒドロキシメチルアニリン（１．１５ｇ、４．０８ｍｍｏｌ、８５％ｙｉｅｌｄ）を得た。

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 3.89-3.91 (m, 4H), 4.62 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 5.12-5.19 (m, 4H), 5.76-5.88 (m, 2H), 6.60 (dd, J = 2.3, 8.6 Hz, 1H), 6.86 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.20 (d, J = 8.6 Hz, 1H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 52.69, 65.04, 111.31, 115.86, 116.31, 124.43, 136.95, 130.45, 133.02, 149.35; LRMS (ESI⁺) 264 [M-OH]⁺

（２）工程（ｂ）
６−ブロモ−１−メチルインドリン（１０５ｍｇ、０．４９５ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジアリル−３−ブロモ−４−ヒドロシキメチルアニリン（１３７ｍｇ、０．４８８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１５ｍＬ）に溶解させ、ＢＦ_３ＯＥｔ_２（１２３μＬ、０．９７６ｍｍｏｌ）を加えて３５℃で２３時間攪拌した。室温まで冷却した後、水を加え、この混合物をジクロロメタンで抽出し、食塩水で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥して溶媒を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１０％酢酸エチル／ｎ−ヘキサン）で精製し、Ｎ，Ｎ−ジアリル−３−ブロモ−４−（（６−ブロモ−１−メチルインドリン−５−イル）メチル）アニリン（２０７ｍｇ、０．４３４ｍｍｏｌ、収率９０％）を得た。

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 2.73 (s, 3H), 2.83 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 3.28 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 3.87-3.88 (m, 4H), 3.97 (s, 2H), 5.14-5.20 (m, 4H), 5.76-5.89 (m, 2H), 6.64 (dd, J = 2.5, 8.2 Hz, 1H), 6.65 (s, 1H), 6.73 (s, 1H), 6.80 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 2.5 Hz, 1H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 28.36, 36.03, 40.14, 52.72, 56.28, 110.85, 111.64, 115.92, 116.27, 123.06, 125.49, 126.11, 127.05, 128.05, 130.17, 130.68, 133.52, 148.13, 153.03; LRMS (ESI⁺) 477 [M+H]⁺

（３）工程（ｃ）
乾燥させアルゴン置換したフラスコにＮ，Ｎ−ジアリル−３−ブロモ−４−（（６−ブロモ−１−メチルインドリン−５−イル）メチル）アニリン（２０７ｍｇ、０．４３４ｍｍｏｌ）と脱水テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）を加えた。−７８℃に冷却後、１Ｍｓｅｃ−ブチルリチウム（０．９１ｍＬ、０．９１ｍｍｏｌ）を加え、２０分間攪拌した。そのままの温度でジクロロジメチルシラン（１１２ｍｇ、０．８６８ｍｍｏｌ）を脱水テトラヒドロフラン３ｍＬに溶解してゆっくりと加え、室温に戻して１時間攪拌した。２Ｎ塩酸で反応を停止してＮａＨＣＯ_３で中和した。この混合物をジクロロメタンで抽出して食塩水で洗浄し、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させた後に溶媒を減圧留去した。残渣をアセトン（３０ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却してＫＭｎＯ_４（２９５ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ）を少量ずつ２時間かけて加え、更に同じ温度で１時間攪拌した。ジクロロメタンを加え、ろ紙を用いて吸引ろ過した後、水を加え、この混合物をジクロロメタンで抽出し、食塩水で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥して溶媒を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、３０％酢酸エチル／ｎ−ヘキサン）で精製し、８−（ジアリルアミノ）−１，１０，１０−トリメチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［５，６］シリノ［３，２−ｆ］インドール−５（１０Ｈ）−オン（３０ｍｇ、０．０７７３ｍｍｏｌ、収率１８％）を得た。

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 0.43 (s, 6H), 2.90 (s, 3H), 3.05 (t, J = 8.5 Hz, 2H), 3.47 (t, J = 8.5 Hz, 2H), 4.02-4.03 (m, 4H), 5.18-5.23 (m, 4H), 5.82-5.94 (m, 2H), 6.50 (s, 1H), 6.80-6.86 (m, 2H), 8.21 (s, 1H), 8.34 (d, J = 9.0 Hz, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ -1.17, 28.03, 34.55, 52.65, 54.79, 107.89, 107.93, 113.37, 114.65, 116.52, 120.40, 126.03, 129.98, 131.47, 131.59, 132.12, 133.04, 140.12, 140.27, 150.00, 154.80, 185.05; HRMS (ESI⁺) Calcd for [M+H]⁺, 389.2049 Found, 389.2069 (+2.0 mmu)

（４）工程（ｄ）
８−（ジアリルアミノ）−１，１０，１０−トリメチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［５，６］シリノ［３，２−ｆ］インドール−５（１０Ｈ）−オン（１４ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解させ、ｏ−トリル臭化マグネシウム（１９％ＴＨＦ中）（３．６ｍＬ、３．６ｍｍｏｌ）を加えて２時間半加熱還流した。その後、反応液に２規定塩酸水溶液を加えてクエンチし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて中和した後、混合物をジクロロメタンで抽出し、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、溶媒を減圧留去した。残渣をＭｅＯＨ（１５ｍＬ）に溶解させ、ＮａＢＨ_４（１．５ｍｇ、４０μｍｏｌ）を加え、室温で５分攪拌した。溶媒を減圧留去した後、水を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機層を食塩水で洗い、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、溶媒を減圧留去した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、１，３−ジメチルバルビツール酸（２８ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（５．７ｍｇ、５．４μｍｏｌ）を加えて３５℃でアルゴン雰囲気下に１１時間攪拌した。混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、溶媒を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、２０％酢酸エチル／ｎ−ヘキサン）で精製し１，１０，１０−トリメチル−５−（ｏ−トリル）−２，３，５，１０−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［５，６］シリノ［３，２−ｆ］インドール−８−アミン（２．０ｍｇ、５．１９μｍｏｌ、１４％）を得た。

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 0.41 (s, 3H), 0.56 (s, 3H), 2.29 (s, 3H), 2.81-2.85 (m, 5H), 3.26 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 5.56, (s, 1H), 6.56 (dd, J = 2.7, 8.1 Hz,1H), 6.71 (s, 1H), 6.77 (s, 1H), 6.81 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.05-7.13 (m, 4H)

（５）工程（ｅ）
１，１０，１０−トリメチル−５−（ｏ−トリル）−２，３，５，１０−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［５，６］シリノ［３，２−ｆ］インドール−８−アミン（２．０ｍｇ、５．２μｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解させ、ｐ−クロラニル（２．６ｍｇ、１０．４μｍｏｌ）を加えて室温で２時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、残渣を中性分取ＨＰＬＣで精製し、目的の蛍光色素（化合物５）（１．２ｍｇ、２．５μｍｏｌ、４８％）を得た。

¹H NMR (300 MHz, CD₂Cl₂): δ 0.54 (s, 3H), 0.56 (s, 3H). 2.03 (s, 3H), 2.96 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 3.21 (s, 3H), 3.83 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 6.58 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.79 (s, 1H), 6.91 (s, 1H), 6.95 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.29-7.43 (m, 4H); HRMS (ESI⁺) Calcd for [M]⁺, 383.1944 Found, 383.1484 (+4.0 mmu)

実施例３で得た蛍光色素２ＭｅＩｎｄｏＳｉＲ（化合物５）の吸光および蛍光スペクトルを測定した。結果を図３に示す。蛍光波長は６６５ｎｍで、励起光波長は６３７ｎｍであった。

化合物５の光学特性データを表３にまとめた。測定は０．３％のＤＭＳＯを含むｐＨ７．４の０．１リン酸ナトリウム水溶液中で行った。蛍光量子収率の決定には、蛍光標準として水中のＣｙ５．５（Φ_Ｆｌ＝０．２３）を用いた。

次に、化合物５のＦＢＳ（ウシ胎児血清）中での吸光スペクトルを測定した結果を図４に示す。

測定は、０．１Ｍリン酸ナトリウム水溶液、ＦＢＳ溶液、及び１％ＤＭＳＯを含む２０％ＦＢＳリン酸ナトリウム水溶液中で行った。

また、２ＭｅＩｎｄｏＳｉＲの種々の溶媒中での蛍光量子収率を表４に示す。蛍光量子収率の決定には、蛍光標準として水中のＣｙ５．５（Φ_Ｆｌ＝０．２３）を用いた。

更に、化合物５の吸光及び蛍光スペクトルのｐＨプロファイルを調べた。その結果を図５及び６に示す。測定は、１％ＤＭＳＯを含有する０．１Ｍリン酸ナトリウム溶液中において種々のｐＨで行った。励起波長は６３７ｎｍであった。

［実施例４］
本発明の化合物５を以下の別の合成ルートで合成した。

（１）工程（ａ）
８−（ジアリルアミノ）−１，１０，１０−トリメチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［５，６］シリノ［３，２−ｆ］インドール−５（１０Ｈ）−オン（１０２ｍｇ、０．２６３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１５ｍＬ）に溶解させ、１，３−ジメチルバルビツール酸（２０６ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（４２ｍｇ、０．０３９５ｍｍｏｌ）を加えて３５℃でアルゴン雰囲気下に１２時間攪拌した。混合物に飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、溶媒を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、４０％酢酸エチル／ｎ−ヘキサン）で精製し、８−アミノ−１，１０，１０−トリメチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［５，６］シリノ［３，２−ｆ］インドール−５（１０Ｈ）−オン（７８ｍｇ、０．２５３ｍｍｏｌ、９６％）を得た。

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 0.43 (s, 6H), 2.90 (s, 3H), 3.04 (t, J = 8.2 Hz, 2H), 3.47 (t, J = 8.2 Hz, 2H), 6.49 (s, 1H), 6.76-6.82 (m, 2H), 8.20 (s, 1H), 8.31 (d, J = 8.1 Hz, 1H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ -1.28, 27.96, 34.44, 54.73, 107.79, 107.84, 116.12, 117.51, 126.10, 131.15, 131.84, 132.20, 140.12, 140.80, 148.83, 154.91, 185.13; HRMS (ESI⁺) Calcd for [M+H]⁺, 309.1423 Found, 389.1426 (+0.3 mmu)

（２）工程（ｂ）
８−アミノ−１，１０，１０−トリメチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［５，６］シリノ［３，２−ｆ］インドール−５（１０Ｈ）−オン（８．７ｍｇ、０．０２８２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解させ、ｏ−トリル臭化マグネシウム（１９％ＴＨＦ中）（２．８２ｍｍｏｌ、２．８ｍＬ）を加えて２時間加熱還流した。反応液に２規定塩酸水溶液を加えてクエンチし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて中和した後、混合物をジクロロメタンで抽出し、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、溶媒を減圧留去した。残渣をＨＰＬＣで精製して目的の蛍光色素（化合物５）（５．３ｍｇ、３８％）を得た。

［実施例５］
本発明の化合物６（Ａｃ−ＩｎｄｏＳｉＲ）を以下のスキームで合成した。

実施例３又は４で得られた化合物５（０．７ｍｇ、１．４１μｍｏｌ）をアセトニトリル（３ｍＬ）に溶解させ、そこに無水酢酸（５μＬ、４９μｍｏｌ）、ピリジン（５μＬ、６３．３μｍｏｌ）を加え、室温で７１時間攪拌した。反応溶液に２規定塩酸水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、溶媒を減圧留去した。残渣を中性分取ＨＰＬＣで精製し、Ａｃ−ＩｎｄｏＳｉＲ（化合物６）（０．５ｍｇ、１．０３μｍｏｌ、７３％）を得た。

¹H NMR (300 MHz, CD₂Cl₂): δ 0.43 (s, 3H), 0.48 (s, 3H). 2.12 (s, 3H), 2.67 (s, 3H) 2.76-2.81 (m, 5H), 3.24 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 6.53 (s, 1H), 6.78 (s, 1H), 6.87 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 8.7 Hz, 1H) 7.12-7.39 (m, 3H), 7.69 (s, J = 1.8 Hz, 1H), 8.33 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H); HRMS (ESI⁺) Calcd for [M]⁺, 425.2049 Found, 425.2090 (+4.1 mmu)

化合物６の吸光及び蛍光スペクトルのｐＨプロファイルを調べた。その結果を図７及び８に示す。測定は、１％ＤＭＳＯを含有する０．１Ｍリン酸ナトリウム溶液中において種々のｐＨで行った。励起波長は５００ｎｍであった。

次に、Ａｃ−ＩｎｄｏＳｉＲ（化合物６）の様々な溶媒における吸収、蛍光スペクトルを測定した。その結果を図９及び１０に示す。測定溶媒として、ｐＨ７．４のＮａＰｉバッファー、クロロホルム、ジクロロメタン、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、ベンゼンを用い、全ての溶媒は０．１％ＤＭＳＯを含有する。励起波長は５４０ｎｍであった。

また、化合物６の種々の溶媒中での最大吸収蛍光波長、モル吸光係数、蛍光量子収率を表５に示す。種々の溶媒中における蛍光量子収率の決定には、クロロホルム中の化合物６の蛍光量子収率（Φ_Ｆｌ＝０．４４；絶対蛍光量子収率計測器を用いて決定）を蛍光標準として用いた。

表５に示したそれぞれの溶媒の配向分極率Δfに対し、その溶媒中における化合物６のストークスシフトΔνをプロットしたＬｉｐｐｅｒｔ−Ｍａｔａｇａプロットを作成したところ、両者に直線関係が見られた（図１１；εは溶媒の誘電率であり、nは溶媒の屈折率である）。従って、化合物６のスペクトルシフトには溶媒効果が重要であると判明した。すなわち、化合物６は環境感受性を示す蛍光色素である。

化合物６は、極性溶媒である水中において吸収極大波長が５００ｎｍであり、その蛍光量子収率は０．０６と低い。一方で低極性溶媒であるトルエン中において吸収極大波長は６４４ｎｍと長波長化し、その蛍光量子収率は０．３１と大きく上昇する（表５）。このように、化合物６は疎水性環境において、吸収波長の長波長化、および蛍光量子収率の上昇を生じる。そのため、６００ｎｍ以上の長波長の励起光を照射することで、疎水性環境下にある化合物６のみが励起され、発した蛍光の検出により、疎水性環境の可視化が可能となる。

疎水性環境において蛍光性となる環境感受性色素は、タンパク質と基質の結合やタンパク質間相互作用の簡便な検出するために利用されている。この手法では、研究対象タンパク質内に環境感受性色素を導入し、基質の結合やタンパク質相互作用に伴う色素近傍の疎水性の変化を蛍光検出する。本手法は生きたままの細胞内に存在するタンパク質をリアルタイムに観測可能という利点を有しており、近年多くの利用例が報告されている（総説：Trends in Biothechnology, 2009, 28, 73-83）。化合物６もこれまでの報告されている環境感受性色素同様に、タンパク質と基質の結合、タンパク質間相互作用の検出への応用が期待される。

一般に利用されている環境感受性蛍光色素の吸収波長は３５０〜５００ｎｍと比較的短波長である。一方で、Ａｃ−ＩｎｄｏＳｉＲは長波長蛍光団Ｓｉローダミンを母核としており、その吸収波長は５００〜６５０ｎｍである（図９，１０、表５）。そのためＡｃ−ＩｎｄｏＳｉＲを生細胞イメージングに利用する場合に、既存の環境感受性蛍光色素と比較して２つの利点が挙げられる。１つは、励起光による細胞障害の低減である。生細胞イメージングにおいて、短波長励起光による細胞障害がしばしば問題となるが、Ａｃ−ＩｎｄｏＳｉＲの吸収波長は細胞傷害性の低い５００ｎｍ以上の波長域にある。従って、細胞傷害性の低い長波長励起光を用いたイメージングが可能となる。２つ目に、生体分子による自家蛍光を抑制した高感度なイメージングが挙げられる。生体組織は励起光照射により蛍光性生体分子由来の自家蛍光を発するが、自家蛍光は励起波長が長波長化するほど低減される。そのため、既存の環境感受性色素と比較して長波長であるＡｃ−ＩｎｄｏＳｉＲを用いることで自家蛍光を抑制したより高感度なイメージングが期待される。

［実施例６］
以下のスキームにより、本発明の化合物７（Ｓｉ−Ｒｈｏｄｏｌ）を合成した。

（１）工程（ａ）
２−ＭｅＴＭ（５２ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解させ、そこにピリジンを加え−３０℃まで冷却した。Ｔｆ_２Ｏ（４９μｌ、０．３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３ｍＬ）に溶かした溶液を反応液に滴下し、室温で１０分間攪拌した。混合物に水を加えてジクロロメタンで抽出し、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥して溶媒を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、３０％酢酸エチル／ｎ−ヘキサン）で精製し、ＴＭ−ＯＴｆ（７３ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、ｑｕａｎｔ．）を得た。

¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 0.52 (s, 3H), 0.54 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 6.27 (d, J = 5.1 Hz 2H), 6.86 (s, 1H), 6.96-6.98 (m, 2H), 7.11-7.13 (m, 2H), 7.34-7.49 (m, 4H) :¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃) δ -1.78, -1.50, 19.47, 116.52, 122.61, 126.11, 126.31, 128.69, 128.81, 129.27, 130.45, 131.02, 134.54, 136.01, 137.93, 138.38, 140.84, 141.01, 141.18, 145.83, 149.52, 152.47, 184.18; HRMS (ESI⁺) Calcd for [M+H]⁺, 477.0804 Found, 477.0770 (-3.4 mmu).

（２）工程（ｂ）
ＴＭ−ＯＴｆ（７．３ｍｇ、１５．６７μｍｏｌ）をトルエン（８ｍＬ）に溶解させ、そこにＰｄ_２（ｄｂａ）_３ＣＨＣｌ_３（１．６ｍｇ、１．５７μｍｏｌ）、キサントフォス（２．４ｍｇ、４．１４μｍｏｌ）、Ｃｓ_２ＣＯ_３（７．１ｍｇ、２１．９μｍｏｌ）、ベンゾフェノンイミン（３．４μＬ、１８．８μｍｏｌ）を加えアルゴン雰囲気下に１００℃で２０時間攪拌した。反応液を室温まで冷却した後、ジクロロメタンを加えてセライト濾過を行い、溶媒を減圧留去した。残渣にＴＨＦ（１０ｍＬ）、２規定塩酸水溶液（１０ｍＬ）を加えて室温で３０分攪拌した。そこに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて中和し、ジクロロメタンで抽出した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥して溶媒を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、３％メタノール／ジクロロメタン）で精製し、Ｓｉ−Ｒｈｏｄｏｌ（化合物７）（６．９ｍｇ、ｑｕａｎｔ．）を得た。

¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 0.37 (s, 3H), 0.38 (s, 3H), 1.94 (s, 3H), 6.12 (dd, J = 9.4, 1.9 Hz, 1H), 6.36 (dd, J = 9.6, 2.4 Hz, 1H), 6.66 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.98 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.21-7.33 (m, 3H) :¹³C-NMR (100 MHz, CD₃OD) δ -1.47, -1.24, 19.49, 115.75, 122.20, 125.67, 126.68, 127.23, 128.91, 129.51, 130.21, 131.12, 134.43, 137.02, 139.42, 140.89, 144.17, 144.99, 150.26, 154.42, 164.99, 184.72: HRMS (ESI⁺) Calcd for [M]⁺, 477.0804 Found, 477.0770 (-3.4 mmu)

Ｓｉ−Ｒｈｏｄｏｌ（化合物７）の吸光および蛍光スペクトルのｐＨプロファイルを調べた。結果を図１２〜１４に示す。測定は、１％ＤＭＳＯを含有する０．１Ｍリン酸ナトリウム溶液中において種々のｐＨで行った。励起波長は５０７ｎｍ（図１３）と５８４ｎｍ（図１４）であった。

また、化合物７の光学特性を以下の表にまとめる。

［実施例７］
以下のスキームによりＳｉ−Ｒｈｏｄｏｌの類縁体を合成した。

工程（ａ）
Ｓｉ−Ｒｈｏｄｏｌ（化合物７）（６．９ｍｇ、２０μｍｏｌ）をＤＭＦ（６ｍＬ）に溶解させ、そこにＭｅＩ（１．７５μＬ、２８μｍｏｌ）、ｔ−ＢｕＯＫ（３．４ｍｇ、３０μｍｏｌ）を加え、室温で２８時間攪拌した。混合物に２規定水酸化ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、溶媒を減圧留去した後にＨＰＬＣで精製し、Ｎ−ＭｅＳｉ−Ｒｈｏｄｏｌ（１．２ｍｇ、３．４μｍｏｌ、１７％）、Ｎ−ｄｉＭｅＳｉ−Ｒｈｏｄｏｌ（０．９ｍｇ、２．４μｍｏｌ、１２％）、Ｏ−ＭｅＳｉ−Ｒｈｏｄｏｌ（０．２ｍｇ、０．５６μｍｏｌ、３％）を得た。

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 0.45 (s, 3H), 0.46 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 3.12 (s, 3H), 6.54 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 6.66 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 6.98 (s, 1H), 7.00 (s, 1H), 7.07 (m, 2H), 7.19 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.41 (t, J = 7.8 Hz, 2H) : HRMS (ESI⁺) Calcd for [M+H]⁺, 358.1627 Found, 358.1580 (+4.6 mmu)

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 0.52 (s, 3H), 0.53 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 3.23 (s, 6H), 6.54-6.60 (m, 2H), 7.01 (m, 4H), 7.13 (m, 1H), 7.33-7.52 (m, 3H): HRMS (ESI⁺) Calcd for [M+H]⁺, 372.1784 Found, 372.1768 (-1.5 mmu)

HRMS (ESI⁺) Calcd for [M]⁺, 358.1627 Found, 358.1640 (+1.3 mmu)
上記で合成したＳｉ−Ｒｈｏｄｏｌ類縁体の光学特性は以下の通りである。

上記から、Ｓｉ−Ｒｈｏｄｏｌ類はアミノ基をアルキル化することにより、吸収、蛍光波長を長波長化可能であることが分かる。

また、Ｏ−Ｍｅ−Ｓｉ−Ｒｈｏｄｏｌ（化合物８）の吸光および蛍光スペクトルのｐＨプロファイルを調べた。結果を図１５〜１６に示す。測定は、１０％ＤＭＳＯを含有する０．１Ｍリン酸ナトリウム溶液中において種々のｐＨで行った。励起波長は５０３ｎｍであった。

また、化合物８の光学特性を以下にまとめる。

［実施例８］
以下のスキームにより、本発明の化合物９（Ｎ−ＡｃＳｉ−Ｒｈｏｄｏｌ）を合成した。

工程（ａ）
ＴＭ−ＯＴｆ（１８ｍｇ、３８．６μｍｏｌ）をトルエン（１０ｍＬ）に溶解させ、そこにＰｄ_２（ｄｂａ）_３ＣＨＣｌ_３（６ｍｇ、５．８μｍｏｌ）、キサントフォス（８ｍｇ、１３．８μｍｏｌ）、Ｃｓ_２ＣＯ_３（１７．６ｍｇ、５４μｍｏｌ）、アセトアミド（５ｍｇ、８４．７μｍｏｌ）を加えアルゴン雰囲気下に１００℃で１８時間攪拌した。反応液を室温まで冷却した後、ジクロロメタンを加えてセライト濾過を行い、溶媒を減圧留去した。その後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、６０％酢酸エチル／ｎ−ヘキサンで精製し、更にＨＰＬＣで精製し、Ｎ−ＡｃＳｉ−Ｒｈｏｄｏｌ（３．４ｍｇ、８．８μｍｏｌ、２３％）を得た。

¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 0.49 (s, 3H), 0.50 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.21 (s, 3H), 6.28 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 6.86-6.89 (m, 2H), 6.99 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 7.5 Hz ,1H), 7.32-7.34 (m, 2H), 7.37-7.45 (m, 3H) : HRMS (ESI⁺) Calcd for [M+H]⁺, 415.1478 Found, 415.1453 (-2.5 mmu)
Ｎ−ＡｃＳｉ−Ｒｈｏｄｏｌ（化合物９）の吸光および蛍光スペクトルのｐＨプロファイルを調べた。結果を図１７〜１８に示す。測定は、１０％ＤＭＳＯを含有する０．１Ｍリン酸ナトリウム溶液中において種々のｐＨで行った。励起波長は５０３ｎｍであった。

また、化合物９の光学特性を以下にまとめる。

［実施例９］
以下のスキームにより、本発明の化合物１０（２ＭｅＩｎｄｏ−Ｎ−エチルーフェノールーＳｉＲ）を合成した。

８−ヨード−１，１０，１０−トリメチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［５，６］シリノ［３，２−ｆ］インドール−５（１０Ｈ）−オンの合成

８−アミノ−１，１０，１０−トリメチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［５，６］シリノ［３，２−ｆ］インドール−５（１０Ｈ）−オン（３０８ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を２ＮＨＣｌ水溶液４ｍＬとアセトニトリル４ｍＬに溶解し、氷浴上で０°Ｃに冷却した。そこに、水１ｍＬに溶解させたＮａＮＯ_２（９０ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）を撹拌しながら滴下した。３０分間撹拌後、水２ｍＬに溶解させたＫＩ（８００ｍｇ、５．０ｍｍｏｌ）を激しく撹拌しながら滴下した。１時間撹拌後、飽和亜硫酸ナトリウム水溶液を加え、ＣＨ_２Ｃｌ_２を用いて化合物を抽出し、有機層の溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ_２Ｃｌ_２）で精製し、８−ヨード−１，１０，１０−トリメチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［５，６］シリノ［３，２−ｆ］インドール−５（１０Ｈ）−オン（６０ｍｇ、収率１４％）を得た。

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ0.47 (s, 6H), 2.93 (s, 3H), 3.07 (t, J = 8.70 Hz, 2H), 3.53 (t, J = 8.10 Hz, 2H), 6.47 (s, 1H), 7.88 (dd, J = 2.10, 8.70 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 2.40 Hz, 1H), 8.14 (d, J = 8.70 Hz, 1H), 8.17 (s, 1H). ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃): d -1.41, 27.8, 34.1, 54.5, 100.2, 107.4, 107.5, 126.3, 130.2, 131.3, 132.5, 138.9, 140.2, 140.6, 141.4, 155.4, 185.3; HRMS (ESI⁺): Calcd for [M+H]⁺, 420.0281; found, 420.0329 (+4.8 mmu).

８−（エチル-p-メトキシフェニル）−１，１０，１０−トリメチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［５，６］シリノ［３，２−ｆ］インドール−５（１０Ｈ）−オンの合成

８−ヨード−１，１０，１０−トリメチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［５，６］シリノ［３，２−ｆ］インドール−５（１０Ｈ）−オン（１２０ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）、Ｎ−エチル−ｐ−アニシジン（２１ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）をトルエンに溶解しシュレンク管に添加し、Ｃｓ_２ＣＯ_３（２６０ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ）を添加し、Ａｒ置換下脱気を行った。Ｐｄ（ＯＡｃ）_２（５．６ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）とＢＩＮＡＰ（１５．５ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）をＡｒ雰囲気下添加し、１００°Ｃで一晩加熱撹拌した。濾過後、溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ_２Ｃｌ_２）にて精製し、８−（エチル-ｐ-メトキシフェニル）−１，１０，１０−トリメチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［５，６］シリノ［３，２−ｆ］インドール−５（１０Ｈ）−オン（１１ｍｇ，収率５０％）を得た。

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ0.43 (s, 6H), 1.31 (t, J = 6.60 Hz, 3H), 2.95 (s, 3H), 3.10 (t, J = 7.80 Hz, 2H), 3.52 (t, J = 7.80 Hz, 2H), 3.84 (q, J = 6.60 Hz, 2H), 3.91 (s, 3H), 6.53 (s, 1H), 6.79 (dd, J = 3.00, 6.30 Hz, 1H), 6.83 (d, J = 3.00 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 9.00 H, 2H), 7.21 (d, J = 9.00 Hz, 2H), 8.25 (s, 1H), 8.33 (d, J = 8.70 Hz, 1H). HRMS (ESI⁺): Calcd for [M+H]⁺, 443.2155; found, 443.2109 (-4.6 mmu).

２ＭｅＩｎｄｏ−Ｎ−エチルーアニソールＳｉＲの合成

８−（エチル-p-メトキシフェニル）−１，１０，１０−トリメチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［５，６］シリノ［３，２−ｆ］インドール−５（１０Ｈ）−オン（１０ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦ５ｍＬに溶解させ、Ａｒ置換し、８０°Ｃで加熱還流した。１Ｍｏ−トリル臭化マグネシウムＴＨＦ溶液１ｍＬ（１ｍｍｏｌ）を添加し、８０°Ｃで３時間加熱還流した。その後、室温に戻し、２ＮＨＣｌ溶液を加え、１５分撹拌した。ＣＨ_２Ｃｌ_２で溶出後、溶媒を除去し、ＨＰＬＣにて精製し、２ＭｅＩｎｄｏ−Ｎ−エチルーアニソールＳｉＲ（８ｍｇ、収率６４％）を得た。

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ0.49 (s, 3H), 0.51 (s, 3H), 1.30 (t, J = 7.50 Hz, 3H), 2.06 (s, 3H), 2.98 (br, 2H), 3.37 (br, 2H), 3.82-3.96 (m, 8H), 6.42 (dd, J = 2.10, 9.00 Hz, 1H), 6.75 (s, 1H), 6.86 (d, 9.00 Hz, 1H), 6.95-7.13 (m, 7H) 7.31-7.40 (m, 3H). HRMS (ESI⁺): Calcd for [M]⁺, 516.2675; found, 516.2630 (-4.6 mmu).

化合物１０：２ＭｅＩｎｄｏ−Ｎ−エチルーフェノールーＳｉＲの合成

２ＭｅＩｎｄｏ−Ｎ−エチルーアニソールＳｉＲ（８ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）をＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解させ、１ＭＢＢｒ_３ＣＨ_２Ｃｌ_２溶液を１６μＬ添加し、２時間撹拌した。水を添加後、分液操作により有機層を回収し、溶媒を除去後、ＨＰＬＣにて精製し、２ＭｅＩｎｄｏ−Ｎ−エチルーフェノールーＳｉＲ（６ｍｇ、収率７５％）を得た。

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ0.45 (s, 3H), 0.47 (s, 3H), 1.27 (t, J = 6.60 Hz, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.99 (br, 2H), 3.29 (s, 3H), 3.82-3.91 (m, 4H), 6.52 (d, J = 9.00 Hz, 1H), 6.76 (s, 1H), 6.91-6.96 (m, 5H), 7.04-7.09 (m, 3H), 7.33-7.44 (m, 3H); HRMS (ESI⁺): Calcd for [M]⁺, 503.2519; found, 503.2483 (-3.5 mmu)

（１）化合物１０及び活性酸素と反応後の予想化合物の光学特性
共溶媒として０．１％ＤＭＦを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）中での１μＭの化合物１０の吸収スペクトル及び蛍光スペクトル（図１９左）、及び化合物１０と１μＭの活性酸素と反応後に生成することが予想される化合物の吸収スペクトル及び蛍光スペクトル（図１９右）、並びに各化合物の光学特性を測定した（表９）。

化合物１０の蛍光量子収率は０．００１以下であり、無蛍光性である。一方、ＲＯＳとの反応により生じる反応物の蛍光量子収率は０．２４と近赤外光領域においては十分大きい。これにより、既存の活性酸素プローブよりも優れた蛍光増大を示すことが期待される。

次に、活性酸素種による反応のＨＰＬＣを用いた解析を行った。
⁻ＯＣｌと化合物１０との反応混合物（上段）、化合物１０、及び化合物１０と⁻ＯＣｌの反応後に予想される化合物（下段）についてのＨＰＬＣクロマトグラフを図２０に示す。試料は、ＨＰＬＣ線形勾配溶出（溶出液：Ａ／Ｂ＝６０／４０−１０分−０／１００；流速＝１．０ｍＬ／分）で行った。結果を図２０に示す。
化合物１０は⁻ＯＣｌと反応し、予想通りの反応物が生成し、蛍光が増大した。ＨＰＬＣにより解析すると、反応液からは予想される反応物と同じ保持時間の化合物が観察された。また、ＥＳＩ−ＭＳで測定し、予想通りの反応物の質量のスペクトルが観察されることも確認した。

（２）活性酸素種選択性
次に、化合物１０の活性酸素種選択性を調べた。各種活性酸素種の条件は以下の通りである。
Ｈ_２Ｏ_２：Ｈ_２Ｏ_２を最終濃度０、１、２、３μＭになるように添加。
⁻ＯＣｌ：⁻ＯＣｌを最終濃度０、１、２．５、５μＭになるように添加。
ＯＮＯＯ⁻：ＯＮＯＯ⁻を最終濃度０、１、２．５、５μＭになるように添加。
Ｏ_２ ⁻：ＫＯ_２溶液を最終濃度０、１、２．５、５μＭになるように添加。
ヒドロキシラジカル：Ｈ_２Ｏ_２（ｆｉｎａｌ１ｍＭ）とＦｅＣｌＯ_４（ｆｉｎａｌ１００μＭ）を添加。
化合物１０と各活性酸素種との反応性を調べた結果を図２１に示す。各図の左側は吸収スペクトルを、右側は蛍光スペクトルである。また、各活性酸素種について蛍光強度を図２２にまとめた。
化合物１０は、⁻ＯＣｌ、ＯＮＯＯ⁻と選択的に反応し蛍光上昇を示した。蛍光増大は１００倍以上の値を示し、既存の近赤外光活性酸素プローブよりも大きい蛍光増大を示している。

（３）ＨＬ６０細胞を用いた細胞イメージング実験
以下の要領で、化合物１０によるＨＬ６０細胞を用いた細胞イメージング実験を行った。
ＨＬ６０細胞を培養した。培養した試料に、化合物１０（共溶媒として０．１％ＤＭＦを含有し、最終濃度が１μＭ）を添加し、１５分間培養した。試料に１ｍＭのＨ_２Ｏ_２を添加し、４５分間培養した。その後、蛍光像を観察した。その結果を図２３に示す。図２３の左側はＤＩＣを右側は蛍光像を示す。
ＨＬ６０細胞にプローブを投与し、Ｈ_２Ｏ_２で刺激したところ、細胞内から蛍光上昇が観察された。刺激無と比較して刺激後４５分では４倍程度の蛍光上昇を示した。これはＨＬ６０細胞内の酵素であるＭＰＯが⁻ＯＣｌを産生し、それと化合物１０が反応して蛍光上昇が観察されたと考えられる。これより、本発明のプローブが細胞内でも活性酸素検出可能であることが示唆された。

［実施例１０］
以下のスキームにより、本発明の化合物１１（２ＭｅａｚｏＳｉＲ６５０）を合成した。

実施例３又は４で得られた化合物５（１２．３ｍｇ、２４．８μｍｏｌ）を１％ＴＦＡを含む１：１ＭｅＣＮ／ＣＨ_２Ｃｌ_２の混合溶媒（１０ｍＬ）に溶解し、ＮａＮＯ_２（３．４ｍｇ、４９．３μｍｏｌ）を加え、０℃にてアルゴン雰囲気下２分撹拌した。その後ＭｅＣＮ（１ｍＬ）に溶解させたＮ，Ｎ−ジメチルアニリン（５８μＬ、７４７μｍｏｌ）を加えた。徐々に室温に戻しながらで一時間半撹拌した後、反応液に水を加え、ＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させて溶媒を除去した後、ＨＰＬＣ精製にて２ＭｅａｚｏＳｉＲ６５０（６．３ｍｇ、１０．０μｍｏｌ、４０％）を得た。

¹H NMR (300 MHz, CD₃OD): δ 0.64 (s, 3H), 0.69 (s, 3H), 2.07 (s, 3 H), 3.04 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.15 (s, 6H), 3.57 (s, 3H), 4.14 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 6.86 (d, J = 9.6, 2H), 6.92 (s, 1H), 7.13 (d, J = 8.7, 1H), 7.19 (d, J = 7.2, 1H), 7.40 - 7.51 (m, 3H), 7.66 - 7.70 (m, 2H), 7.88 (d, 9.6H), 8.22 (d, J = 2.1, 1H).¹³C NMR (75 MHz, CD₃OD): -1.8, -1.4, 19.6, 26.4, 35.4, 40.4, 58.1, 112.8, 122.1, 124.7, 127.1, 127.3, 129.7, 130.3, 130.3, 131.7, 134.0, 135.1, 137.1, 137.1, 139.3, 140.1, 141.5, 141.9, 145.5, 154.7, 155.2, 159.0, 161.4, 163.4.HRMS (ESI⁺): Calcd for [M]⁺, 515.2646, Found, 515.2631 (1.6 mmu).

［実施例１１］
以下のスキームにより化合物１４（ｄｉＭｅａｚｏＳｉＲ６５０）を合成した。

８−（ジアリルアミノ）−１，１０，１０−トリメチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［５，６］シリノ［３，２−ｆ］インドール−５（１０Ｈ）−オン（１６０ｍｇ、０．４１２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解させ、２，６−ジメチルフェニルマグネシウムブロマイド（ＴＨＦ中１．０Ｍ）（４．１ｍＬ、４．１ｍｍｏｌ）を加えて２時間加熱還流後、更に２，６−ジメチルフェニルマグネシウムブロマイド（ＴＨＦ中１．０Ｍ）（２．０ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）を加えて５時間加熱還流した。その後、反応液に２規定塩酸水溶液を加えてクエンチし、混合物をジクロロメタンで抽出し、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、溶媒を減圧留去した。残渣をＨＰＬＣにて精製し、化合物１２（２０６．２ｍｇ、３４９．０μｍｏｌ、８５％）を得た。

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 0.55 (s, 6H), 1.99 (s, 6H), 2.99 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.21 (s, 3H), 3.97 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 4.10 (d, J = 4.8 Hz, 4H), 5.20 (d, J = 17.2 Hz, 2H), 5.29 (d, J = 10.4 Hz, 2H), 5.85 (m, 2H), 6.52 (dd, J = 9.6, 2.8 Hz, 1H), 6.75 (s, 1H), 6.93 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.14 (s, 1H), 7.17 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.32 (t, J = 7.6 Hz, 1H).
¹³C NMR (75 MHz, CD₃OD): -1.5, 19.7, 25.9, 34.2, 53.2, 55.3, 113.8, 116.6, 117.8, 119.6, 127.4, 127.6, 128.5, 128.9, 131.1, 132.9, 134.5, 135.6, 138.3, 138.6, 145.3, 151.9, 154.4, 158.6, 167.2.
LRMS (ESI⁺): [M]⁺, 477.

化合物１２（８３．６ｍｇ、０．１４２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２０ｍＬに溶解させ、１，３−ジメチルバルビツール酸（８１．９ｍｇ、０．５２５ｍｍｏｌ）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（２０２．０ｍｇ、０．１７５μｍｏｌ）を加えて４０℃でアルゴン雰囲気下に１７時間半攪拌した。混合物に水を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、溶媒を減圧留去した後、ＨＰＬＣで精製しｄｉＭｅＳｉＲ６５０（２４．２ｍｇ、４７．４μｍｏｌ、３４％）を得た。

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 0.53 (s, 6H), 1.98 (s, 6H), 2.97 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 3.24 (s, 3H), 3.85 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 6.53 (dd, J = 9.0, 2.4 Hz, 1H), 6.75 (s, 1H), 6.89 (s, 1H), 6.92 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.16 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.22 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.32 (t, J = 7.6 Hz, 1H).
¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃): -1.7, 19.6, 26.3, 33.7, 54.7, 114.3, 116.7, 123.8, 127.4, 127.6, 128.4, 128.5, 132.4, 133.2, 135.5, 138.7, 140.9, 147.7, 152.7, 155.6, 157.6, 168.8.
HRMS (ESI⁺): Calcd for [M]⁺, 397.2100, Found, 397.2055 (-4.5 mmu).

化合物１３（１３．０ｍｇ、２５．４μｍｏｌ）を１％ＴＦＡを含む１：１ＭｅＣＮ／ＣＨ_２Ｃｌ_２の混合溶媒（１０ｍＬ）に溶解し、ＮａＮＯ_２（３．６ｍｇ、５２．２μｍｏｌ）を加え、０℃にてアルゴン雰囲気下２分撹拌した。その後ＭｅＣＮ（１ｍＬ）に溶解させたＮ，Ｎ−ジメチルアニリン（５８．８μＬ、７５６．８μｍｏｌ）を加えた。徐々に室温に戻しながら１時間半撹拌した後、反応液に水を加え、ＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させて溶媒を除去した後、ＨＰＬＣ精製にてｄｉＭｅａｚｏＳｉＲ６５０（８．９ｍｇ、１４．２μｍｏｌ、５６％）を得た。

¹H NMR (300 MHz, CD₃OD): δ 0.67 (s, 6H), 2.02 (s, 6H), 3.06 (m, 2H), 3.15 (s, 6H), 3.58 (s, 3H), 4.15 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 6.87 (d, J = 9.6 Hz, 2H), 6.91 (s, 1H), 7.15 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.40 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.68 - 7.72 (m, 2H), 7.89 (d, J = 9.6 Hz, 2H), 8.25 (d, J = 2.1 Hz, 1H).HRMS (ESI⁺): Calcd for [M]⁺, 529.2788, Found, 529.2743 (-4.4 mmu).
［実施例１２］
（１）化合物１１、１３及び１４の光学特性
化合物５と化合物１３の吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを図２４に示す。また、化合物１１と化合物１４の吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを図２５に示す。測定は、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水中で行った。

また、これら化合物の光学特性を以下の表にまとめる。

（２）ラット肝ミクロソームを用いたｉｎｖｉｔｒｏ実験。

３ｍＬのカリウムリン酸溶液中にラット肝ミクロソーム２２６μｇと化合物１１又は１４を１μＭ加え、５分後に電子供与体であるＮＡＤＰＨを５０μＭを添加（矢頭）した際の蛍光上昇変化を観察した。結果を図２６に示す。

励起波長は６４０ｎｍ、蛍光波長は６６０ｎｍであった。図２６中、Ｈｙｐは低酸素を、Ｎｏｒは常酸素で行った測定結果である。化合物１１、１４いずれにおいても、低酸素環境で蛍光強度の著しい上昇が見られた。

（３）蛍光プローブを用いた生細胞実験
Ａ５４９細胞に化合物１１、１４を夫々１μＭ添加し、各酸素濃度条件下で６時間培養した後に共焦点蛍光顕微鏡にて観察した。結果を図２７に示す。
励起波長は６４０ｎｍ、検出波長は６６０−７５０ｎｍであった。

（４）マウスを用いた虚血臓器可視化実験
化合物１４を１００μＭマウスに静脈内投与した後に開腹し３２分後までイメージングを行った。その後門脈及び腎静脈・腎動脈の結紮により肝臓と腎臓の虚血状態を作成し、結紮１８分後までをイメージングした。Ｍａｅｓｔｒｏ（登録商標）を用いて以下の条件で撮像した。
レッドフィルター使用、露光時間：３００ｍｓ、検出波長：７００ｎｍ。
結果を図２８に示す。

（応用例）
（１）キサンテン環の水酸基を機能化

Ｓｉ−Ｒｈｏｄｏｌのフェノール性水酸基をメチル化したＯ−ＭｅＳｉ−Ｒｈｏｄｏｌが５００ｎｍ付近に吸収極大を持ち（図１５）、Ｓｉ−Ｒｈｏｄｏｌが５８０ｎｍ付近に吸収極大を持っている（図１２）。また、どちらの化合物も６００ｎｍ付近に蛍光極大を有している（図１４、図１６）。そのため、βガラクトシダーゼの基質であるβＧａｌをＳｉ−Ｒｈｏｄｏｌの水酸基に結合させれば、二波長励起一波長蛍光のβガラクトシダーゼプローブとして機能すると予想される。

（２）キサンテン環のアミノ基を機能化

また、Ｎ−ＡｃＳｉ−Ｒｈｏｄｏｌ（化合物９）は４５０ｎｍ付近に吸収極大を有しており、Ｓｉ−Ｒｈｏｄｏｌの５８０ｎｍの吸収極大と大きく離れているため、励起波長を選択することにより、選択的にＳｉ−Ｒｈｏｄｏｌのみを励起することが可能である。そのため、Ｓｉ−Ｒｈｏｄｏｌのアミノ基にプロテアーゼの基質となる特異的なペプチド配列、βラクタマーゼの基質となるβラクタム環、生体内チオールと反応するジスルフィド等を結合することにより、Ｏｆｆ／ＯＮ型のプロテアーゼプローブ、βラクタマーゼプローブ、チオールプローブとして機能すると予想される。

Claims

下記一般式（Ｉ）：

（式中、
Ｒ^１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｒ^２は、一価の置換基を示し；
Ｒ^３及びＲ^４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、又はハロゲン原子を示し；
Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又はアリール基を示し；
Ｒ^７及びＲ^８は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ^９及びＲ^１０は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又は測定対象物質との接触により切断される一価の置換基を示し、
Ｒ^９又はＲ^１０は、Ｒ^３又はＲ^７と一緒になって、Ｒ^９又はＲ^１０が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
Ｙは、
（１）−ＮＲ^１１Ｒ^１２、
（２）−ＯＲ^１３又は
（３）−Ｎ＝Ｎ−Ｒ^１４
から選択され、
ここで、Ｒ^１１は、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又は測定対象物質との接触により切断される一価の置換基を示し、
Ｒ^１２は、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はアシル基を示し、
Ｒ^１１及びＲ^１２は、これらが結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリルは、炭素数１〜６個のアルキル基で置換されていてもよく、
Ｒ^１３は、水素原子又は測定対象物質との接触により切断される一価の置換基を示し、
Ｒ^１４は、アリール基を示し；
Ｘは、珪素原子、ゲルマニウム原子又はスズ原子を示し；
但し、Ｙが−ＮＲ^１１Ｒ^１２である場合は、（ｉ）Ｒ^９、Ｒ^１０は測定対象物質との接触により切断される一価の置換基ではなく、及び、（ｉｉ）Ｒ^１１及びＲ^１２が水素原子である場合には、Ｒ^９及びＲ^１０の両方が水素原子になることはなく、
また、Ｙが−ＯＲ^１３であってＲ^１３が水素原子の場合は、Ｒ^９あるいはＲ^１０は測定対象物質との接触により切断される一価の置換基であってもよく、
また、Ｙが−Ｎ＝Ｎ−Ｒ^１４である場合は、Ｒ^９、Ｒ^１０は測定対象物質との接触により切断される一価の置換基ではない）
で表される化合物又はその塩。
Ｙが−ＮＲ^１１Ｒ^１２であって、以下の一般式（Ｉａ）：

（式中、Ｒ^１〜Ｒ^１２及びＸは、一般式（Ｉ）で定義したとおりであり、但し、（ｉ）Ｒ^９、Ｒ^１０は測定対象物質との接触により切断される一価の置換基ではなく、及び、（ｉｉ）Ｒ^１１及びＲ^１２が水素原子である場合には、Ｒ^９及びＲ^１０の両方が水素原子になることはない。）
で表される請求項１に記載の化合物又はその塩。
Ｒ^９又はＲ^１０は、Ｒ^３又はＲ^７と一緒になって、Ｒ^９又はＲ^１０が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成している（ここで、該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい）、請求項２に記載の化合物又はその塩。
Ｒ^９は、Ｒ^３と一緒になって、Ｒ^９が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成している、請求項３に記載の化合物又はその塩。
以下の一般式（Ｉａ−１）：

（式中、Ｒ^１〜Ｒ^２、Ｒ^４〜Ｒ^８、Ｒ^１０〜Ｒ^１２及びＸは、一般式（Ｉａ）で定義したとおりである。）
で表される請求項４に記載の化合物又はその塩。
Ｒ^１１及びＲ^１２は、これらが結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリルを形成している（ここで、該ヘテロシクリルは、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリルは、炭素数１〜６個のアルキル基で置換されていてもよい）、請求項２〜５に記載の化合物又はその塩。
Ｒ^１１及びＲ^１２は、これらが結合している窒素原子と共にピペラジン環を形成している、請求項６に記載の化合物又はその塩。
以下の一般式（Ｉａ−２）：

（式中、Ｒ^１〜Ｒ^１０及びＸは、一般式（Ｉａ）で定義したとおりであり、Ｒ^１５は、炭素数１〜６個のアルキル基を示す。）
で表される請求項７に記載の化合物又はその塩。
Ｒ^１１が、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、ラクタマーゼ、糖加水分解酵素、転移酵素、酸化還元酵素からなる群から選ばれる酵素との接触により切断される一価の置換基である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
Ｒ^１１が、ぺプチダーゼ、プロテアーゼ、及びラクタマーゼからなる群から選ばれる酵素との接触により切断される一価の置換基である、請求項９に記載の化合物又はその塩。
ぺプチダーゼ又はプロテアーゼが、カスパーゼ、前立腺特異抗原、ロイシンアミノペプチダーゼ、γ-グルタミルトランスペプチターゼからなる群から選ばれる酵素である請求項９又は１０に記載の化合物又はその塩。
Ｒ^１１としての置換基が芳香環であり、Ｒ^３とＲ^９が一緒になって、Ｒ^９が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成しており、Ｒ^１２が炭素数１〜６個のアルキル基である、請求項２に記載の化合物又はその塩。
以下の一般式（Ｉａ−３）で表される、請求項１２に記載の化合物又はその塩。

（式中、Ｒ^１〜Ｒ^２、Ｒ^４〜Ｒ^８、Ｒ^１０、Ｒ^１２及びＸは、一般式（Ｉａ）で定義したとおりである。）
以下の式（１）で表される、請求項１３に記載の化合物又はその塩。
Ｙが−ＯＲ^１３であって、以下の一般式（Ｉｂ）：

（式中、Ｒ^１〜Ｒ^１０、Ｒ^１３及びＸは、式（Ｉ）で定義したとおりである。）
で表される請求項１に記載の化合物又はその塩。
Ｒ^１３、Ｒ^９又はＲ^１０が、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、ラクタマーゼ、糖加水分解酵素、転移酵素、酸化還元酵素からなる群から選ばれる酵素との接触により切断される一価の置換基である、請求項１５に記載の化合物又はその塩。
Ｒ^１３、Ｒ^９又はＲ^１０が、ぺプチダーゼ、プロテアーゼ、及びラクタマーゼからなる群から選ばれる酵素との接触により切断される一価の置換基である、請求項１６に記載の化合物又はその塩。
ぺプチダーゼ又はプロテアーゼが、カスパーゼ、前立腺特異抗原、ロイシンアミノペプチダーゼ、γ-グルタミルトランスペプチターゼからなる群から選ばれる酵素である請求項１３又は１４に記載の化合物又はその塩。
Ｙが−Ｎ＝Ｎ−Ｒ^１４であって、以下の一般式（Ｉｃ）：

（式中、Ｒ^１〜Ｒ^１０、Ｒ^１４及びＸは、式（Ｉ）で定義したとおりであり、但し、Ｒ^９、Ｒ^１０は測定対象物質との接触により切断される一価の置換基ではない）
で表される請求項１に記載の化合物又はその塩。
Ｒ^１４のアリール基が、単環の芳香族基又は縮合芳香族基であり。該アリール基はアミノ基、ジメチルアミノ基から選択される置換基を有する、請求項１９に記載の化合物又はその塩。
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の化合物を含む蛍光プローブ。
請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の化合物を含む活性酸素検出蛍光プローブ。
請求項１９又は２０に記載の化合物を含む低酸素環境検出蛍光プローブ。
請求項２に記載の一般式（Ｉａ）で表される化合物（Ｒ^１〜Ｒ^１２及びＸは、上記で定義した通りである）又はその塩の製造方法であって、下記の工程：
（ａ）３−ハロゲン化アニリンとアリルハライドから製造される一般式（ＩＩ）（式中、Ｒ^１６はハロゲン原子を示す）で表される３−ハロゲン化−Ｎ，Ｎ−ジアリルアニリンと式（ＩＩＩ）で表される３−ハロゲン化ベンゼンアミン化合物とをホルムアミドの存在下で反応させて下記の一般式（ＩＶ）で表される化合物を製造する工程、

（ｂ）上記の一般式（ＩＶ）で表される化合物とＸ（Ｈａｌｏ）_２（Ｒ^５）（Ｒ^６）（Ｈａｌｏは塩素原子又は臭素原子を示し、Ｘ、Ｒ^５、Ｒ^６は上記と同義である）とを反応させた後、酸化反応によって下記の一般式（Ｖ）で表される化合物を製造する工程、

（ｃ）上記の一般式（Ｖ）で表される化合物とハロゲン化ベンゼン誘導体から下記の一般式（ＶＩ）で表される化合物を製造する工程、及び

（ｄ）上記の一般式（ＶＩ）で表される化合物の脱アリル化を行い、一般式（Ｉａ）においてＲ^１１及びＲ^１２が水素原子である化合物を製造する工程（Ｒ^１及びＲ^２に上記の一般式（ＶＩ）の化合物を製造するために保護基を導入した場合には、該保護基の脱保護を工程（ｄ）の前後又は同時に行ってもよい）
を含む方法。
Ｒ^１１として、測定対象物質との接触により切断される一価の置換基を導入する工程を更に含む、請求項２４に記載の方法。
請求項２に記載の一般式（Ｉａ）で表される化合物（Ｒ^１〜Ｒ^１２及びＸは上記で定義した通りである）又はその塩の製造方法であって、下記の工程：
（１）３−ハロゲン化アニリンとアリルハライドから製造される一般式（ＶＩＩ）（式中、Ｒ^１６はハロゲン原子を示す）で表される３−ハロゲン化−Ｎ，Ｎ−ジアリルアニリンとを、オキシ塩化リンの存在下、塩基性条件下で反応させて一般式（ＶＩＩＩ）で表される３−ハロゲン化−Ｎ，Ｎ−ジアリル−４−ヒドロキシメチルアニリンを製造する工程、

（２）上記３−ハロゲン化−Ｎ，Ｎ−ジアリル−４−ヒドロキシメチルアニリンと式（ＸＩ）で表される３−ハロゲン化ベンゼンアミン化合物とを反応させて、一般式（Ｘ）で表される化合物を製造する工程、

（３）上記の一般式（Ｘ）で表される化合物とＸ（Ｈａｌｏ）_２（Ｒ^５）（Ｒ^６）（Ｈａｌｏは塩素原子又は臭素原子を示し、Ｘ、Ｒ^５、Ｒ^６は上記と同義である）とを反応させた後、酸化反応によって下記の式（Ｖ）で表されるＮ，Ｎ−ジアリルアミノ−Ｎ’，Ｎ’−ジアルキルアミノ−Ｘ−キサントンを製造する工程、

（４）前記Ｎ，Ｎ−ジアリルアミノ−Ｎ’，Ｎ’−ジアルキルアミノ−Ｘ−キサントンとハロゲン化ベンゼン誘導体から下記の一般式（ＶＩ）で表される化合物を製造する工程、及び

（５）上記の一般式（ＶＩ）で表される化合物の脱アリル化を行い、一般式（Ｉａ）においてＲ^１１及びＲ^１２が水素原子である化合物を製造する工程（Ｒ^１及びＲ^２に上記の一般式（ＶＩ）の化合物を製造するために保護基を導入した場合には、該保護基の脱保護を工程（４）の前後又は同時に行ってもよい）
を含む方法。
Ｒ^１１として、測定対象物質との接触により切断される一価の置換基を導入する工程を更に含む、請求項２６に記載の方法。
請求項１５に記載の一般式（Ｉｂ）で表される化合物又はその塩の製造方法であって、下記の工程：
（１）下記の一般式（ＸＩ）で表される化合物を、塩基性条件下で、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（Ｔｆ_２Ｏ）と反応させ、一般式（ＸＩＩ）で表される化合物を製造する工程、

（２）一般式（ＸＩＩ）で表される化合物をイミン化合物と反応させることにより、一般式（ＸＩＩＩ）で表される化合物を製造する工程、

（３）場合により、一般式（ＸＩＩＩ）で表される化合物をハロゲン化アルキルと反応させる工程
を含む方法。
請求項１３に記載の一般式（Ｉａ−３）で表される化合物又はその塩の製造方法であって、下記の工程：
（１）一般式（ＸＩＶ）の化合物とヨウ化カリウムとを反応させることにより、一般式（ＸＶ）の化合物を製造する工程、

（２）一般式（ＸＶ）の化合物をアルキル基の炭素数が１〜６であるＮ−アルキル−ｐ−アニシジンと反応させることにより、一般式（ＸＶＩ）の化合物を製造する工程、

（３）一般式（ＸＶＩ）の化合物をｏ−トリル臭化マグネシウムと反応させ、その後、酸を添加して、一般式（ＸＶＩＩ）の化合物を製造する工程、及び

（４）一般式（ＸＶＩＩ）の化合物を三臭化ボロンと反応させることにより、一般式（Ｉｃ）で表される化合物を製造する工程
を含む、該製造方法。