JPWO2014054389A1 - 表面プラズモンを利用した免疫測定方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、全血測定を可能とし、全血処理時の測定値のばらつきが少なく、極めて正確な測定結果を得ることができるとともに、全血、血清、及び血漿を同じ装置内で測定することができるＳＰＲ又はＳＰＦＳ免疫測定方法を提供することを課題とする。本発明は、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴法）又はＳＰＦＳ（表面プラズモン励起増強蛍光分光法）を利用する免疫測定方法であって、試料の吸光度を測定する吸光度測定工程と、該吸光度測定工程で測定した吸光度の結果に対応したモードを設定するモード設定工程と、該モード設定工程で設定したモードに応じて処理条件が設定された一または複数の工程と、を含むＳＰＲ又はＳＰＦＳ免疫測定方法により、上記課題を解決する。

Description

本発明は、全血測定を可能とする、表面プラズモンを利用した免疫測定方法に関する。

血液の生化学的検査は、通常、血漿又は血清を対象として行われている。血漿は、約１０ｍＬ程度の静脈血を注射器で採血し、遠心分離機にかけることにより調製されている。感染症関連項目の免疫検査では、測定試料に血清を使用しているが、全血から血清を得るまでには、血液凝固時間と、その後の遠心分離時間を合わせ、血清分離に少なくとも約３０分の処理時間が必要となる。

このため、医療従事者に手間と時間がかかり、特に、心疾患等の緊急性を有する場合には、患者の生命に危険を及ぼすこともあり、さらに、肝炎やＨＩＶ等の感染症患者か否かを早急に判断したい緊急手術では、採血後からの検査時間を短縮したより迅速な測定方法の開発が望まれていた。

また、免疫測定法には、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、粒子凝集法、カウンティングイムノアッセイ等があるが、ＲＩＡやＥＩＡでは、抗原抗体反応を行った後、Ｂ／Ｆ分離を行う必要があり、測定結果が出るまでに手間と時間がかかる。

この要望に応える手法として、ラテックス粒子比濁法において強制的に溶血させることにより全血測定を可能とする測定方法がある。例えば、特許文献１には、全血免疫測定法において、抗原抗体反応に影響を及ぼさずに、血球の影響を除去することを課題とした全血免疫測定方法が提案されている。この免疫測定方法は、全血試料と、免疫感作した不溶性担体粒子とを混合して免疫凝集反応を行わせ、得られた凝集反応混合物を、赤血球溶解剤を含む水溶液で希釈することにより赤血球を溶解して測定用試料を調製し、測定用試料の凝集度を測定する方法である。また、特許文献２には、遠心分離器等によって血液を前処理しなくても簡便にしかも短時間で測定を行うことができるとともに、免疫反応に影響しない方法によって血球を故意かつ強制的に溶血させた試料を用い、各種の定量試薬と組み合わせて、精度のよいデータを得ることができることを課題とした免疫測定方法が提案されている。この免疫測定方法は、被検体試料中の抗原あるいは抗体と特異的に反応する抗体あるいは抗原を固定化した不溶性粒子と被検体試料中の抗原あるいは抗体とを凝集反応させ、生じた凝集混合液に対する光照射による吸光度変化または散乱光変化を測定する方法であって、被検体試料として全血を用い、この全血を強制的に溶血させる方法である。

特開２００２−１０７３６５号公報 特開２００１−２９６２９２号公報 特開平１１−２３５７５号公報

従来提案されているラテックス粒子比濁法では、溶血の際に高濃度の界面活性剤を使用することによる免疫反応への影響や、高感度測定が求められる検査項目においては市場により要求される感度レベルに達していないという問題がある。

こうした高感度化の要求が高まりつつある免疫測定領域において、有効な測定方法として注目されているのが、表面プラズモンを利用するＳＰＲ（Surface Plasmon Resonance）又はＳＰＦＳ（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）である。例えば、特許文献３には、全血を対象としたＳＰＲ又はＳＰＦＳを用いた免疫測定システムについて提案されている。具体的には、透明基板、透明基板上に配置される金属膜、金属膜上に固定される、心筋梗塞マーカーに対する抗体を備える表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップに全血を投与する、心筋梗塞マーカーを測定する方法である。

しかしながら、特許文献３には、ＳＰＲ又はＳＰＦＳを用いた免疫測定システムの具体的処理方法については記載されておらず、よって同文献に基づいた処理方法では具体的に実施することが不可能であり、実用化することができない。

本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的は、全血測定を可能とし、全血処理時の測定値のばらつきが少なく、極めて正確な測定結果を得ることができるとともに、全血、血清、及び血漿を同じ装置内で測定することができるＳＰＲ又はＳＰＦＳ免疫測定方法を提供することにある。

本発明者は、全血測定を対象とした、表面プラズモンを利用した（ＳＰＲ又はＳＰＦＳ）免疫測定方法について検討してきた。その過程で、処理条件を種々変化させることにより、全血、血清、及び血漿を同じ装置内で測定することができ、また全血処理時の測定値のばらつきが少ないＳＰＲ又はＳＰＦＳ免疫測定方法を見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明の一側面では、上記課題を解決するための本発明に係る免疫測定方法は、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴法）又はＳＰＦＳ（表面プラズモン励起増強蛍光分光法）を利用する免疫測定方法であって、試料の吸光度を測定する吸光度測定工程と、該吸光度測定工程で測定した吸光度の結果に対応したモードを設定するモード設定工程と、を含む。

具体的には、試料を吸光度によって分類し、それに応じて各処理のモードを設定する。たとえば、全血は血球成分を含むが、血清又は血漿は実質的に血球成分を含まない。そのため、血球成分に吸収される波長の吸光度と、基準として血球成分に吸収されない波長の吸光度とを測定することにより、試料が全血であるか、血清又は血漿であるかを判別することが可能となる。

続いて行われるモード設定工程では、吸光度測定工程で得られた測定結果に基づいてその試料を分類し（たとえば、全血試料か血清又は血漿試料かを分類し）、その分類に応じたモードを選択する処理が行われる。なお、後述するように、モード設定工程で設定したモードに応じて一または複数の工程の処理条件が設定（変更）される場合は、そのようなシステム上の処理もこのモード設定工程において行うことができる。

これによれば、一つの装置で複数のモードに対応した測定を行うことができ、試料の種類によらず安定的にＳＰＲまたはＳＰＦＳによる免疫測定法を実施することが可能となる。

なお、モード設定工程で設定されるモードの数は特に限定されるものではなく、以下に述べるような「全血モード」および「血清・血漿モード」の２つのモードであってもよいし、３つ以上のモードであってもよい。たとえば、吸光度測定工程の測定結果から試料をより細かく分類し、それぞれにふさわしいものとなるよう、処理条件をより精密に調整するようにすることも可能である。

また、本発明の一側面では、本発明に係る免疫測定方法は、前記モード設定工程の後に、該モード設定工程で設定した処理モードに応じて処理条件が異なる、一または複数の工程を含むことができる。

すなわち、前記モード設定工程において特定のモードが選択された場合に、一または複数の工程を、選択された特定のモードに応じて、頻用される他のモード（通常モード）とは異なる処理条件、すなわち、より適した処理条件の下で実施することができるようになる。特定のモードを選択しない場合の各工程、あるいは特定のモードであっても通常モードと同様の処理条件で実施すればよい工程については、あらかじめ設定された処理条件のまま実施することができる。

また、本発明の一側面では、本発明に係る免疫測定方法は、前記モード設定工程で、全血を試料とする測定モード（全血モード）と、血清又は血漿を試料とする測定モード（血清・血漿モード）を設定することが好ましい。

モード設定工程で全血モードと血清・血漿モードとを切り替え、続く測定系を前記の各モードに適した実施形態とすることにより、同じ装置内で全血、血清、及び血漿を測定することができ、試料によって装置を使い分ける必要がなくなる。
なお、吸光度の違いは血球成分含量の違いを反映しており、血球成分含量の違いにより、センサー基板への血球成分や夾雑物の付着量、あるいは測定対象物質とセンサー基板との接触の効率性が異なるため、吸光度の違いに応じて、これ以降の工程の処理条件を調整し、ＳＰＲ又はＳＰＦＳによる測定が適切に行われるようにすることが適切である。

以下、たとえば前記モード設定工程において全血モードが選択された場合に、続く測定系において、通常の血清・血漿モードの処理条件を変更して測定すること（すなわち、設定したモードに応じて変更した異なる処理条件で測定すること）が好適な例をいくつか例示する。
前記の設定したモードに応じて異なる処理条件としての好ましい例は、一次反応工程後に標識反応工程が行われる際には、該標識反応工程前に行われる洗浄工程における洗浄回数である（第１実施形態）。

これによれば、一次反応工程後、標識反応工程前に行われるセンサー基板の洗浄について、試料に応じて適した洗浄回数を選択することにより、血清・血漿モードにおいて余分な洗浄が追加されることを抑制しつつ、全血モードにおいて全血中の血球成分や血中夾雑物がセンサー基板へ付着することが抑制できる。

また、前記の設定したモードに応じて異なる処理条件としての好ましい別の例は、希釈工程における試料の希釈率である（第２実施形態）。

これによれば、測定試料に応じてその希釈率を調節することにより、たとえば全血モードにおいて反応液中の血球含量および夾雑物含量を低下させ、血清・血漿モード（通常モード）と同等の洗浄条件によっても、センサー基板への血球成分や血中夾雑物の付着が抑制できる。また、全血は血球成分含量が多いので、試料の見かけ粘度が高くなり、拡散係数が小さくなり、その結果、全血中の測定対象物質の反応率は、血清又は血漿中の測定対象物質の反応率よりも低下すると考えられる。したがって、いずれの試料においても測定対象物質と固相化リガンドとの反応率（抗原捕捉率）を均一化するために、全血モードの場合には、血清・血漿モードよりも希釈率を高めることが好ましい。

また、前記の設定したモードに応じて異なる処理条件としての好ましい別の例は、一次反応工程の時間（「一次反応時間」ということもある。）である（第３実施形態）。

試料の性状によって、同量の測定対象物質を含有する場合であっても、異なる測定結果が出る可能性がある。たとえば、全血は血球成分含量が多いので、試料の見かけ粘度が高くなり、拡散係数が小さくなり、その結果、全血中の測定対象物質の反応率は、血清又は血漿中の測定対象物質の反応率よりも低下すると考えられる。したがって、いずれの試料においても測定対象物質と固相化リガンドとの反応率（抗原捕捉率）を均一化するために、全血モードの場合には、血清・血漿モードよりも一次反応時間を長くすることが好ましい。ここで、一次反応工程とは、ＳＰＲ又はＳＰＦＳにおける一般的な免疫測定方法と同様、固相化されたリガンド（たとえば抗体）を備えたセンサー基板の表面に、測定対象物質（たとえば抗原）を含有する試料を接触させる工程をいう。

本発明の一側面では、本発明に係る免疫測定方法は、前記モード設定工程で、全血試料用のモードと、血清試料又は血漿試料用のモードとを設定することが好ましい。
また、前記モード設定工程が、全血試料用の全血モードと、血清試料又は血漿試料用の通常モードとを設定する工程であり、全血モードは通常モードよりも前記洗浄回数が多いことが好ましい。
また、前記モード設定工程が、全血試料用の全血モードと、血清試料又は血漿試料用の通常モードとを設定する工程であり、全血モードは通常モードよりも前記希釈率が高いことが好ましい。
さらに、前記モード設定工程が、全血試料用の全血モードと、血清試料又は血漿試料用の通常モードとを設定する工程であり、全血モードは通常モードよりも前記一次反応工程の時間が長いことが好ましい。

本発明の一側面では、本発明に係る免疫測定方法は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法を利用した免疫測定方法であることが好ましい。

上記課題を解決するための本発明に係る免疫測定システムは、上記記載のＳＰＲ又はＳＰＦＳ免疫測定方法を利用することを特徴とする。すなわち、本発明に係るＳＰＲ又はＳＰＦＳ免疫測定方法を実施するための手段（装置、プログラム等）を連動可能なように接続することにより、当該システムを構築することができる。

本発明に係る表面プラズモンを利用した免疫測定方法およびそれを利用するシステムによれば、血清又は血漿に用いる免疫測定装置を全血測定に利用でき、ＰＯＣＴの迅速診断のニーズに応えることができる。たとえば、血清又は血漿を試料とすることを前提とした測定装置に全血を試料としてアプライすると、測定値がばらつくなどの問題が起きるが、本発明により、モード設定工程で全血用のモードを設定し、続く処理条件設定工程で、全血を試料とする場合の測定に適した各種の処理条件を設定し、その処理後に測定を行うようにすれば、測定値のばらつきを少なくし、極めて正確な測定結果を得ることができる。一方、血清又は血漿を試料とする場合も、モード設定工程で血清又は血漿用のモードが設定されるので、同一装置内で従来と同様な処理迅速性が維持でき、用いる試薬も少量で済む。

設定したモードに応じて異なる処理条件が洗浄回数である評価フローチャートである。 設定したモードに応じて異なる処理条件が希釈率である評価フローチャートである。 設定したモードに応じて異なる処理条件が一次反応時間である評価フローチャートである。 設定したモードに応じて異なる処理条件が洗浄回数および希釈率である評価フローチャートである。 各図において、斜線の網掛けで示した工程は、全血モードを選択した場合の、血清・血漿モード（通常モード）とは異なる処理条件の工程を示す。

以下に、本発明に係る免疫測定方法について、特に試料として全血、血清、血漿などの血液由来試料を用いて、ＳＰＦＳに基づく測定を行う場合を例にとり、詳細に説明する。本発明は以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。

まず、吸光度によって試料を分類し、好適な処理条件を適用するようモードを設定することが必要であり、処理条件は、様々な実施形態に適用できるように設定することが可能である。また、ＳＰＦＳの代わりにＳＰＲにより測定を行う場合に適用するよう処理条件を設定することも可能である。

本発明の一側面では、本発明に係る免疫測定方法は、試料の吸光度を測定する吸光度測定工程と、吸光度測定工程で測定した吸光度の結果に対応したモードを設定するモード設定工程と、試料の処理条件を設定する処理条件設定工程を含む。以下、処理条件設定工程における処理条件をそれぞれ変えた場合について説明する。

＜試料の免疫測定方法＞
［第１実施形態：設定したモードに応じて異なる処理条件が洗浄回数の場合］
本実施の形態に係る表面プラズモンを利用した免疫測定方法は、図１に示すように、まず、試料の吸光度測定工程、処理モード（全血モードと血清・血漿モード）を設定するモード設定工程を行う。このモード設定工程では処理モードの切り分けを行う。ここで、吸光度測定結果に応じて処理モードが「全血モード」に設定された場合、通常の希釈率で試料を希釈する希釈工程、一次反応工程、通常の第１洗浄工程よりも洗浄回数が追加された第１洗浄工程、標識反応工程、第２洗浄工程、測定工程を順次行う。尚、ＳＰＲ免疫測定方法に実施する際には、一般に上述のフローから標識反応工程と第２洗浄工程とを省略したフローとして考えればよい。
一方、処理モードが「血清・血漿モード」に設定された場合については後述する。

（吸光度測定工程）
吸光度測定工程は、試料の吸光度を測定する工程である。吸光度の測定方法は特に限定されるものではなく、公知の各種の手段を用いることができるが、たとえば、一般的な分光光度計と同様のユニット（試料を収納する容器、白色光源ランプ、プリズム、スリット、光検出器など）を用いて測定することができる。吸光度測定工程は、通常、試料によって条件が変更される可能性のある各種の処理（たとえば希釈処理）の前に行われるが、試料希釈工程の直前でなくてもよく、また、各試料に共通の処理を行った後に行ってもよい。

（モード設定工程）
モード設定工程とは、全血を対象とする全血モードと、血清または血漿を対象とする血清及び血漿モードとを選択して試料を自動的に判別する工程である。全血とは、ヒト又はその他の動物から採取した血液であり、血清や血漿を分離する処理を行っていないものを意味する。血漿とは、血液から血球成分を除いたものをいい、血清とは、血漿から線維素原と凝固因子を（凝固によって）除いたものをいう。

このモード設定工程では、吸光度の測定結果を利用して、適切にモードを切り替えることができるようであれば、その具体的な実施形態は特に限定されるものではない。たとえば、全血モードおよび血清・血漿モードを設定する場合は、赤血球成分に吸収される波長（たとえば５４０ｎｍ）の吸光度を求め、ある閾値以上である場合に試料が全血であると判定して全血モードを設定する、逆にそれがある閾値未満である場合に試料が血清または血漿であると判定して血清・血漿モード（通常モード）を設定するという実施形態が挙げられる。

また、さらに好ましくは赤血球成分に吸収される波長（たとえば５４０ｎｍ）の吸光度と、血球成分に吸収されない波長（たとえば７００ｎｍ）の吸光度の差分や比を求め、全血モードもしくは血清・血漿モード（通常モード）の判定・設定を行なってもよい。後者の場合、血漿の色調がキャンセルさせるため、各試料（検体ごと）の影響を受けにくく高い精度で測定が行なえる。

（希釈工程）
希釈工程とは、ＳＰＦＳの測定に関する各工程を適切に行えるよう、試料を希釈する工程である。試料の希釈率は特に限定されるものではなく、測定システムの実施形態、採取される試料の量、センサー基板に送液する際の流量、試料の粘度（全血中の血球成分の量）などに応じて適宜設定することができるが、通常２〜１０倍、好ましくは２〜６倍である。希釈方法も特に限定されるものではないが、常法に従って、適量の溶媒（ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）など）を試料に添加すればよい。

（一次反応工程）
一次反応工程とは、試料をセンサー基板に接触させる工程である。この工程により、試料中の測定対象物質であるアナライト（抗原）とセンサー基板表面に固相化されたリガンド（抗体）との複合体が形成される。
一次反応工程の時間、すなわち試料をセンサー基板に接触させる時間は、試料中に含まれる測定対象物質の量などによって調整される場合もあるが、通常３〜３０分間、好ましくは通常５〜２０分間である。

（第１洗浄工程）
第１洗浄工程とは、一次反応工程の後、標識反応工程の前に、洗浄液を送液等により供給してセンサー基板を洗浄する工程である。第１洗浄工程を行うことにより、一次反応工程においてセンサー基板表面に非特異的に吸着した、血中夾雑物（測定対象物質以外のタンパク質、糖脂質など）や血球成分を除去することができる。これにより、標識反応工程の際に用いる標識抗体が前記非特異的吸着物質にさらに非特異的に結合して、測定工程の際にノイズとなって表れることを抑制することができる。

洗浄液としては、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）などの溶媒に、必要に応じて適量の界面活性剤（たとえば、Polyoxyethylene (20) Sorbitan Monostearate（商品名：Tween20）、Tween80、TritonX-100、 Digitonin）を添加した溶液などを用いることができる。添加する界面活性剤の量は用いる界面活性剤の種類に応じて適宜調整することができるが、たとえば「Tween20」であれば、通常０．０１wt％〜０．５wt％である。

また、センサー基板表面上に流路が形成され、試料や洗浄液等をその流路内で往復送液するように構成されたシステムにあっては、洗浄液を流路内に往復送液させる際の液量、時間などの諸条件は、試料として血漿・血清を用いる場合の条件（通常モード）を基準として、またＳＰＦＳ測定系の実施形態（センサー基板およびフローセルのサイズ等）を考慮しながら、適宜設定することができる。洗浄液の液量は、通常５０〜５００μＬ、好ましくは１００〜２００μＬ、より好ましくは１５０μＬである。また、１回の洗浄処理につき洗浄液を往復送液させる時間は、通常０．５〜２０分間、好ましくは３〜１０分間である。

第１洗浄工程には、１回または複数回の洗浄処理が含まれていてもよい。ここで、洗浄液をセンサー基板に接触させている間、言い換えれば往復送液を行うシステムにおいては洗浄液を往復送液させ続けている間、つまりその洗浄液がセンサー基板に送液されてから、往復送液を終了してその洗浄液を排出するまでを、１回の洗浄処理と数える。洗浄処理同士の間には、洗浄液以外の溶媒（反応に影響を与えない溶媒）を送液する時間が挟まれていてもよいし、そのような時間を挟まずに洗浄処理を連続的に行うようにしてもよい。

第１実施形態では、全血モードが選択された場合に、洗浄処理の回数が追加される。本発明者が得た知見では、１回あたりの洗浄処理で洗浄液を長時間往復送液させるより、洗浄液を交換して複数回の洗浄処理を行う方が洗浄の効果に優れる。
第１洗浄工程に含まれる洗浄処理の回数は、洗浄の効果を考慮しながら適宜調節することができるが、血清・血漿モード（通常モード）では、通常２〜６回、好ましくは３〜４回、より好ましくは３回含まれる。
これに対して、全血モードの第１実施形態では、洗浄回数を血清・血漿モード（通常モード）にさらに1〜３回、より好ましくは２回追加洗浄を行なう。

（標識反応工程）
標識反応工程とは、蛍光体で標識化された標識抗体をセンサー基板に接触させる工程である。一次反応工程において、センサー基板表面の固相化抗体に抗原が結合して複合体を形成している場合、その捕捉された抗原にさらに標識抗体が結合し、固相化抗体−抗原−標識抗体からなる複合体が形成される。この工程は、一般的なＳＰＦＳ測定系にしたがって行うことができる。

（第２洗浄工程）
第２洗浄工程とは、標識反応工程の後、測定工程の前に、洗浄液を送液する工程である。第２洗浄工程を行うことにより、標識反応工程においてセンサー基板表面に非特異的に吸着した標識抗体を除去することができ、測定の際にノイズとなって表れることを抑制することができる。
第２洗浄工程において洗浄液を往復送液等により供給する際の界面活性剤の種類および濃度、液量、時間などの諸条件は、第１洗浄工程と同様とすることもできるが、必要に応じて異なる条件を設定してもよい。

（測定工程）
ＳＰＦＳ測定系において、測定工程とは、センサー基板の裏面から特定の励起波長を有する光を照射し、それにより発生する特定の蛍光波長を有する光の強度を、センサー基板の上面に設けられたＰＭＴ（光電子倍増管）などの光量検知センサーにより測定する工程である。試料中に所定の測定対象物質（抗原）が存在し、標識反応工程において固相化抗体−抗原−標識抗体が形成されていれば、その複合体中の蛍光体がＳＰＦＳによる増強されたエバネッセント波で励起されて発する蛍光を、ＰＭＴなどで測定することができる。この工程は、一般的なＳＰＦＳ測定系にしたがって行うことができる。蛍光量の測定結果は適切な情報処理手段により出力、解析され、測定結果に基づいて試料中の測定対象物質の定量的または定性的な分析を行うことができる。

なお、全血を試料とする場合、その全血試料中の一定の体積は血球成分で占められるため、測定対象物質（抗原）が含まれる体積はその試料の一部となる（全体積×（１００−ヘマトクリット値（％））で概算される）。また、後述する実施形態に示されるように、全血を試料とする場合は、血清又は血漿を試料とする場合と異なる希釈率が用いられることもある。このような違いを考慮して、全血を試料とする場合、血清又は血漿を試料とする場合それぞれ、適切な算術的処理を行った上で、測定対象物質の濃度を算出する必要がある。

一方、モード設定工程（処理モードの切り分け）において処理モードが「血清・血漿モード」に設定された場合、図１に示すように、通常の希釈率で試料を希釈する希釈工程、一次反応工程、洗浄回数が通常である第１洗浄工程、標識反応工程、洗浄工程、測定工程を順次行う。
各工程についての説明は、上記の「全血モード」の場合と同様であるので、ここでは説明を省略する。

［第２実施形態：設定したモードに応じて異なる処理条件が希釈率の場合］
本実施の形態に係る表面プラズモンを利用した免疫測定方法は、図２に示すように、まず、試料の吸光度測定工程、処理モード（全血モードと血清・血漿モード）を設定するモード設定工程を行う。このモード設定工程では処理モードの切り分けを行う。

ここで、吸光度測定結果に応じて処理モードが「全血モード」に設定された場合、希釈率を上げて試料を希釈する希釈工程を行う。「全血モード」における希釈率は、血清・血漿モード（通常モード）に対して、１．５〜５倍、より好ましくは２〜３倍である。全血モードにおいて通常モードよりも希釈率を上げて試料を希釈することにより、センサー基板への血球成分や血中夾雑物の非特異的吸着を抑制し、固相化リガンド（抗体）と測定対象物質であるアナライト（抗原）との反応効率（抗原捕捉率）を保持することができる。つまり、第２実施形態において希釈率を向上させることは、第１実施形態において洗浄処理の回数を増やしたり、第３実施形態において一次反応時間を延長する代わりとなり、迅速性を保てるという効果が得られる。

その後、一次反応工程、第１洗浄工程、標識反応工程、第２洗浄工程、測定工程を順次行う。各工程については、第１実施形態と同様であるので、ここでは説明を省略する。

一方、吸光度測定結果に応じて、モード設定工程（処理モードの切り分け）における処理モードが「血清・血漿モード」に設定された場合、図２に示すように、通常の希釈率で試料を希釈する希釈工程、一次反応工程、第１洗浄工程、標識反応工程、第２洗浄工程、測定工程を順次行う。各工程については、第１実施形態と同様であるので、ここでは説明を省略する。

［第３実施形態：設定したモードに応じて異なる処理条件が一次反応時間の場合］
本実施の形態に係る表面プラズモンを利用した免疫測定方法は、図３に示すように、まず、試料の吸光度測定工程、処理モード（全血モードと血清・血漿モード）を設定するモード設定工程を行う。このモード設定工程では処理モードの切り分けを行う。

ここで、吸光度測定結果に応じて処理モードが「全血モード」に設定された場合、通常の希釈率で試料を希釈する希釈工程、一次反応時間を延長させる一次反応工程を行う。第３実施形態における時間延長された一次反応工程の時間は、血清・血漿モード（通常モード）に対して、１．２倍〜４倍、より好ましくは１．５倍〜２倍である。一次反応工程の時間を通常モードより延長することにより、全血モードにおいても固相化リガンド（抗体）と測定対象物質であるアナライト（抗原）との反応効率（抗原捕捉率）を保持することができるという効果が得られる。その後、第１洗浄工程、標識反応工程、第２洗浄工程、測定工程を順次行う。これらの各工程については、第１実施形態と同様であるので、ここでは説明を省略する。

一方、吸光度測定結果に応じて、モード設定工程（処理モードの切り分け）における処理モードが「血清・血漿モード」に設定された場合、図３に示すように、通常の希釈率で試料を希釈する希釈工程、一次反応工程、第１洗浄工程、標識反応工程、第２洗浄工程、測定工程を順次行う。各工程については、第１実施形態と同様であるので、ここでは説明を省略する。

［第４実施形態：設定したモードに応じて異なる処理条件が洗浄回数および希釈率の場合］
本実施の形態に係る表面プラズモンを利用した免疫測定方法は、図４に示すように、まず、試料の吸光度測定工程、処理モード（全血モードと血清及び血漿モード）を設定するモード設定工程を行う。このモード設定工程では処理モードの切り分けを行う。

ここで、吸光度測定結果に応じて処理モードが「全血モード」に設定された場合、希釈率を上げて試料を希釈する希釈工程、一次反応工程、通常の第１洗浄工程よりも洗浄回数が追加された第１洗浄工程、標識反応工程、第２洗浄工程、測定工程を順次行う。希釈率を上げて試料を希釈する希釈工程および洗浄回数が追加された第１洗浄工程の諸条件は、第１実施形態および第２実施形態と同様とすることができるが、２つの特別な工程が組み合わされることにより効果が増強されることを考慮して、第４実施形態で総合的に得られる効果が第１実施形態および第２実施形態で得られる効果と同程度の十分なものとなる範囲で、それぞれの工程の諸条件を第１実施形態および第２実施形態より緩和する（通常モードに近づける、たとえば、希釈率の増加率を低くし、追加される洗浄工程の回数を少なくする）ことが可能である。「全血モード」と「血清・血漿モード」とで異なる処理を行う工程を除いた各工程については、第１実施形態と同様であるので、ここでは説明を省略する。

一方、吸光度測定結果に応じて、モード設定工程（処理モードの切り分け）における処理モードが「血清・血漿モード」に設定された場合、図４に示すように、通常の希釈率で試料を希釈する希釈工程、一次反応工程、第１洗浄工程、標識反応工程、第２洗浄工程、測定工程を順次行う。各工程については、第１実施形態と同様であるので、ここでは説明を省略する。

［その他の実施形態］
異なる処理条件を「洗浄回数の変更（追加）」と「一次反応時間の変更（延長）」との組み合わせ、「希釈率の変更（増加）」と「一次反応時間の変更（延長）」との組み合わせ、「洗浄回数の変更（追加）」と「希釈率の変更（増加）」と「一次反応時間の変更（延長）」との組み合わせ等いずれの実施形態でも試料の免疫測定を行うことができる。

＜表面プラズモンセンサー（センサー基板）＞
表面プラズモンセンサーは、少なくとも誘電体部材（プリズムまたは透明平面基板）と、当該誘電体部材の上層に形成された金属薄膜と、当該金属薄膜の上層に形成された固定化リガンドを含む層（反応層）とにより構成される、ＳＰＦＳ等によるシグナルを測定するための構造をいう。

金属薄膜等は、プリズムの水平面に直接形成されていてもよいが、多数のサンプルを分析するための利便性などを考慮すると、プリズムの水平面上に着脱可能な透明平面基板の一方の表面に形成されていることが望ましい。また、反応層は金属薄膜の表面に直接形成されていてもよいが、必要に応じて、金属薄膜上に誘電体からなるスペーサ層及び／又はＳＡＭを形成し、その上に形成するようにしてもよい。

表面プラズモンセンサーは、ＳＰＦＳ等の測定に用いられる各種の流体（試料液、標識リガンド溶液、測定液など）を貯留したり各領域を連通して送液が行えるようにしたりするための「流路」を形成する部材（流路の側壁を形成するシート、天板等）と組み合わせて用いることができる。これらは一体化され、チップ状の構造体（「センサーチップ」ということもある。）の態様をとることもできる。また、表面プラズモンセンサーには、流体を導入または排出するための開口が設けられ、ポンプや、例えば柔軟な部材（シリコーンゴム等）で形成された断面が略円形のチューブなどを用いて、外部と流体を行き来させるように用いることができる。このときの送液の条件（流速、時間、温度、検体や標識リガンドの濃度等）は、適宜調整することができる。

表面プラズモンセンサーないしセンサーチップは、小規模ロット（実験室レベル）では、例えば、あらかじめ金属薄膜等が形成されたセンサー基板を作製しておき、その金属薄膜等が形成されている側の表面上に、一定の厚さ（流路の高さ）を有する、中央部に任意の形状および大きさを有する穴が開けられたシリコーンゴム製シートまたはＯリングを載せて流路の側面構造を形成する。次いでその上に送液導入口及び送液排出口を設けてある光透過性の天板を載せて流路の天井面を形成した後、これらを圧着してビス等の留め具により固定することによって作製することができる。また、工業的に製造される大ロット（工場レベル）では、例えば、透明平面基板の所定の領域に金属薄膜、反応層等を形成してセンサー基板とし、一方でプラスチックの成形加工やフォトリソグラフィ等により微細な凹凸を形成して天板・側壁部材とし、これらを組み合わせることによりセンサーチップを作製することができる。

（誘電体部材）
センサーチップに用いられる誘電体部材は、ガラス製や、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などのプラスチック製のもの、好ましくはｄ線（５８８ｎｍ）における屈折率〔ｎ_d〕が１．４０〜２．２０の範囲にある材質のものを用いることができる。誘電体部材に透明平面基板を用いる場合の厚さは、例えば０．０１〜１０ｍｍの範囲で調整することができる。また、金属薄膜を形成する前に、誘電体部材の表面は酸またはプラズマによる洗浄処理がなされていることが好ましい。

（金属薄膜）
表面プラズモンセンサーの金属薄膜は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強効果が大きい、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなる（合金の形態であってもよい）ことが好ましく、特に金からなることが好ましい。透明平面基板としてガラス製平面基板を用いる場合には、ガラスと上記金属薄膜とをより強固に接着するため、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を形成することが好ましい。

金属薄膜を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法によりクロムの薄膜および金属薄膜を形成することが好ましい。

表面プラズモンが発生し易いよう、金、銀、アルミニウム、銅、白金、またはそれらの合金からなる金属薄膜の厚さはそれぞれ５〜５００ｎｍが好ましく、クロム薄膜の厚さは１〜２０ｎｍが好ましい。電場増強効果の観点からは、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍがより好ましく、クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍがより好ましい。

（スペーサ層）
表面プラズモンセンサーには、必要に応じて、金属薄膜による蛍光色素の金属消光を防止するため、金属薄膜と反応層（またはＳＡＭ）の間に誘電体からなるスペーサ層を形成してもよい。

誘電体としては、光学的に透明な各種無機物や、天然または合成ポリマーを用いることができる。これらの中でも、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性に優れていることから、二酸化ケイ素（ＳｉＯ₂）または二酸化チタン（ＴｉＯ₂）を用いることが好ましい。

スペーサ層の厚さは、通常１０ｎｍ〜１ｍｍであり、共鳴角安定性の観点からは、好ましくは３０ｎｍ以下、より好ましくは１０〜２０ｎｍである。一方、電場増強効果の観点から、好ましくは２００ｎｍ〜１ｍｍであり、さらに電場増強効果の安定性から、４００ｎｍ〜１，６００ｎｍがより好ましい。

誘電体からなるスペーサ層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、電子線蒸着法、熱蒸着法、ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法、またはスピンコータによる塗布などが挙げられる。

（ＳＡＭ）
表面プラズモンセンサーには、必要に応じて、金属薄膜（またはスペーサー層）と反応層の間にＳＡＭ（Self-Assembled Monolayer：自己組織化単分子膜）を形成してもよい。

ＳＡＭを構成する分子としては、分子の一方の末端に金属薄膜等と結合可能な官能基（シラノール基、チオール基等）を、もう一方の末端に反応層を構成する分子と結合可能な反応性官能基（アミノ基、カルボキシル基、グリシジル基等）を有する化合物が用いられる。このような化合物はシランカップリング剤やＳＡＭ形成試薬として容易に入手できる。例えば、炭素原子数４〜２０程度のカルボキシアルカンチオール（１０−カルボキシ−１−デカンチオールなど）は、光学的な影響が少ない、つまり透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いＳＡＭを形成することができるため好適である。ＳＡＭ構成分子の溶液（エタノール溶液等）を金属薄膜等に接触させ、当該分子の一方の官能基を金属薄膜等に結合させることにより、ＳＡＭを形成することができる。

＜測定装置＞
表面プラズモンセンサー（特にセンサーチップの態様をとるもの）は、公知のＳＰＦＳ等用の測定装置に装着して使用することができる。この測定装置は、基本的に光源、プリズム、光検出器などを備え、通常はさらに集光レンズ、カットフィルターなどを備える。各種の流体を所定の流速、タイミング等で所定の領域に送液するための手段（送液ポンプなど）や、各種の操作や情報処理を制御するコンピュータなどが上記測定装置に一体化されていてもよい。

また、光検出器で測定されたシグナルを記憶し、検量線に基づいて最終的に各サンプルの測定対象物質の濃度を算出決定してその情報も記憶するといった情報処理手段を備えていてもよい。さらに、検出すべき蛍光と異なる波長成分を有するノイズ光、例えばプラズモン散乱光のうちのそのような波長成分、外光（装置外の照明光）、励起光（励起光の透過成分）、迷光（各所での励起光の散乱成分）、各種部材が発する自家蛍光などを除去するためのカットフィルターを備えていることが好ましい。

＜測定方法 ＞
（試料）
試料とは、ＳＰＦＳ等に供される物質であり、代表的な試料としては、ヒト、ヒト以外のほ乳類（モデル動物、ペット等）、その他の動物から採取される血液検体（全血、血清、血漿など）に由来する試料が挙げられる。分析の際、試料は必要に応じて、純水、生理食塩水、緩衝液、試薬溶液等の各種の溶媒、あるいは血液検体については抗凝固剤（ヘパリン等）などと混合して用いてもよい。このような混合液または試料そのもの、あるいは所定の目的のために調製した測定対象物質を含有する溶液など、ＳＰＦＳ等によるシグナルを測定するために表面プラズモンセンサーの所定の領域に送液される流体（溶液、懸濁液、ゾル、その他流動性を有する物質を含む。）のいずれもが、試料に含まれる。

（測定対象物質）
ＳＰＦＳ等により定量ないし検出すべき対象となる物質を「測定対象物質」という。センサー表面に捕捉することのできる物体であれば特に限定されることなく測定対象物質となり得るが、代表的な測定対象物質としては、例えば腫瘍マーカーとなるような、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等を含む）またはその複合体が挙げられる。また、リガンドに認識される部位（エピトープ等）を表面に有する細胞やウイルス等も測定対象物質となり得る。
また、抗原抗体反応を用いる免疫測定法に限らず、測定対象物質およびリガンドの間におきる同様の反応を利用して、核酸（一本鎖または二本鎖の、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等を含む）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等を含む）、脂質などのその他の分子を、必要に応じてビオチン化等の処理をした上で、測定対象物質とする測定方法に拡張することも可能である。

（リガンド）
測定対象物質と特異的に結合し得る分子を「リガンド」という。特に、センサー表面に固相化された、測定対象物質をセンサー表面に捕捉するためのリガンドを「固相化リガンド」（リガンドが抗体であれば「固相化抗体」）、測定対象物質を標識するために液中に存在する、蛍光体と結合したリガンドを「標識リガンド」（リガンドが抗体であれば「標識抗体」）という。なお、固相化リガンドと標識リガンドのリガンド部分は、同じでもよいし、異なっていてもよい。ただし、固相化リガンドがポリクローナル抗体である場合、標識リガンドはモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、固相化リガンドがモノクローナル抗体である場合、標識リガンドはその固相化リガンドが認識しないエピトープを認識するモノクローナル抗体であるか、またはポリクローナル抗体であることが望ましい。

リガンドは捕捉しようとする測定対象物質に応じて適切なものを選択すればよく、測定対象物質の所定の部位と特異的に結合しうる抗体、受容体、その他の特定の分子（例えばビオチン化した測定対象物質を捕捉するためのアビジン）などをリガンドとすることができる。

リガンドをセンサー表面に設ける方法は特に限定されるものではないが、典型的には、リガンドが有する官能基とＳＡＭ形成分子（シランカップリング剤等）が有する官能基とを、アミンカップリング法、チオールカップリング法、間接的捕捉法（キャプチャー法）等、公知の手法に従って結合させることにより、ＳＡＭ形成分子を介して金属薄膜（またはスペーサ層）にリガンドを連結するような方法が用いられる。例えば、アミンカップリング法では、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）などの水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）とを反応させてＳＡＭのカルボキシル基を活性化（ＮＨＳを導入）した後、アミノ基を有するリガンドを反応させ、ＮＨＳを介してリガンドをＳＡＭに結合させる。

なお、測定対象物質の非特異的吸着を防止するため、上記リガンドをセンサー表面に固相化して固相化リガンドを形成した後に、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等のブロッキング剤によりセンサー表面、流路の側壁・天板等を処理することが好ましい。

一方、標識リガンドは、一般的な免疫染色法でも用いられているリガンドと蛍光体との複合体（コンジュゲート）と同様にして作製することができる。例えば、リガンドとアビジン（ストレプトアビジン等を含む）との複合体、および蛍光体とビオチンとの複合体をそれぞれ作製し、これらを反応させることにより、アビジン／ビオチンを介してリガンドに蛍光体が結合した複合体（１のアビジンに対し最大４のビオチンが結合しうる）が得られる。上述のようなビオチンとアビジンの反応以外にも、蛍光標識法で用いられている一次抗体−二次抗体の反応様式や、カルボキシル基とアミノ基、イソチオシアネートとアミノ基、スルホニルハライドとアミノ基、ヨードアセトアミドおよびチオール基などの反応を用いてもよい。

以下の実験例によりさらに具体的に説明する。なお、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実験例の記載に限定されるものではない。

（実施例１）
処理モードの選択により、一次反応後の第１洗浄工程における洗浄回数を変更して免疫測定反応を行った。図１に示すフローチャートに沿って測定を行った。
健常人Ａの全血サンプルを準備し、その一部を遠心分離（微量高速遠心機：himac CF15RXII,日立工機社製、１６００ｇ×１５分）することにより血漿を得た。同健常人の全血および血漿サンプル１００ｕｌをミオグロビン測定用の試薬カートリッジ（免疫反応１回分の各種試薬が充填されているカートリッジ）のサンプルウエルに分注した後、該試薬カートリッジをＳＰＦＳ免疫測定システムにセットし、測定を開始した。全血測定および血漿測定を各６回繰り返し測定し、ＣＶ値（変動係数：測定値の標準偏差／平均、単位％）を算出した。
なお、ＣＶ値＜１０％の場合、精度、確度の高い測定であり、臨床的価値を有する測定値である。

吸光度は、測定開始直後に、ＳＰＦＳ免疫測定システムにセットされた試薬カートリッジのサンプルウエルに測定光（キセノン光源、分光器、スリットより構成）を照射して測定した。ヒトの血球溶血液に吸収をもつ波長５４０ｎｍと、ヒトの血球溶血液に吸収をもたない波長７００ｎｍの吸光度を測定し、その差分が閾値１．０より小さい場合には、通常モード（血清・血漿モード）で反応を行い、閾値１．０以上の場合は全血モードにて一次反応後の洗浄回数を追加して反応を行った。その結果を表１に示す。
本実施例では、試料として、全血、血清、ヘパリンナトリウム血漿を用いた。
表１より、全血を処理する際に、一次反応後の洗浄回数を追加した本実施例においては、ＣＶが４．２％と低値であることから十分に安定した測定が行なわれていることが判る。

（比較例１）
比較例１では、全血を強制的に通常モード条件下で処理した。その結果を表１に示す。
全血を通常モードで処理した場合は、測定平均値が低値となり、またＣＶは１３．０％と高値であることから、全血の洗浄が不十分であり安定した測定を行なえていないことが判った。

（実施例２）
処理モードの選択により、試料の希釈率を通常の２倍に変更して免疫測定反応を行った。図２に示すフローチャートに沿って測定を行った。
健常人Ｂの全血サンプルを準備し、その一部を遠心分離（微量高速遠心機：himac CF15RXII，日立工機社製、１６００ｇ×１５分）することにより血漿を得た。本ＳＰＦＳ免疫測定システムでは、通常モード処理の場合は装置内でサンプルと希釈液を１：１で混合し、２倍希釈された液を用いて免疫反応を行なっている。本実施例では装置内におけるサンプルと希釈液の混合比率を変化させることにより、サンプルの４倍希釈を実現した。実施例１と同様に、処理モード切替基準により、同健常人の全血及び血漿サンプルをＳＰＦＳ免疫測定システムにおいてミオグロビン濃度を６回繰り返して測定した。その結果を表２に示す。

表２より、全血を処理する際に、サンプルの希釈率を通常モードより高くした本実施例においては、ＣＶが７．２％と、１０％以下の低値であることから十分に安定した測定が行なわれていることが判る。

（実施例３）
処理モードの選択により、試料の希釈率を通常の３倍に変更し、サンプルを６倍希釈にして免疫測定反応を行った他は、実施例２と同様にして測定を行った。その結果を表３に示す。
表３より、全血を処理する際に、サンプルの希釈率を通常モードより高くした本実施例においては、ＣＶが５．０％と、１０％以下の低値であることから十分に安定した測定が行われていることが判る。

（比較例２）
比較例２では、全血を強制的に通常モード条件下で処理した。その結果を表２、３に示す。全血を通常モードで処理した場合は、測定平均値が低値となり、またＣＶは１５．７％と高値であることから、全血の希釈が不十分なことから安定した測定を行なえていないことが判った。

本実施の態様では、「全血モード」と「通常モード（血清・血漿モード）」との２つの処理モードに切り分けた例を挙げて詳述したが、これら２つのモードだけでなく、吸光度に応じて処理モードを３つ以上に切り分けて、多段階の異なる処理条件に設定しても良いことは勿論である。

Claims (11)

1. 表面プラズモンを利用する免疫測定方法であって、
   試料の吸光度を測定する吸光度測定工程と、該吸光度測定工程で測定した吸光度の結果に対応して異なる処理モードを設定するモード設定工程と、を含む表面プラズモンを利用した免疫測定方法。
2. 前記モード設定工程の後に、該モード設定工程で設定した処理モードに応じて処理条件が異なる、一または複数の工程を含む、請求項１に記載の表面プラズモンを利用した免疫測定方法。
3. 前記処理条件が、一次反応工程後であって、標識反応工程が行われる際には該標識反応工程前に行われる洗浄工程における洗浄回数である、請求項２に記載の表面プラズモンを利用した免疫測定方法。
4. 前記処理条件が、希釈工程における試料の希釈率である、請求項２又は３に記載の表面プラズモンを利用した免疫測定方法。
5. 前記処理条件が、一次反応工程の時間である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の表面プラズモンを利用した免疫測定方法。
6. 前記モード設定工程が、全血試料用のモードと、血清試料又は血漿試料用のモードとを設定する請求項１〜５のいずれか１項に記載の表面プラズモンを利用した免疫測定方法。
7. 前記モード設定工程が、全血試料用の全血モードと、血清試料又は血漿試料用の通常モードとを設定する工程であり、全血モードは通常モードよりも前記洗浄回数が多い、請求項３に記載の表面プラズモンを利用した免疫測定方法。
8. 前記モード設定工程が、全血試料用の全血モードと、血清試料又は血漿試料用の通常モードとを設定する工程であり、全血モードは通常モードよりも前記希釈率が高い、請求項４に記載の表面プラズモンを利用した免疫測定方法。
9. 前記モード設定工程が、全血試料用の全血モードと、血清試料又は血漿試料用の通常モードとを設定する工程であり、全血モードは通常モードよりも前記一次反応工程の時間が長い、請求項５に記載の表面プラズモンを利用した免疫測定方法。
10. 表面プラズモン励起増強蛍光分光法を利用した免疫測定方法である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の表面プラズモンを利用した免疫測定方法。
11. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の免疫測定方法を行うことを特徴とする表面プラズモンを利用した免疫測定システム。

Images