JPWO2014007398A1 - カチオン性脂質 - Google Patents
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Abstract
Description
特許文献1および2は、インビボにて核酸を細胞内に送達するために、および疾患の治療に好適な核酸-脂質粒子組成物に使用するために有利である陽イオン性脂質および該脂質を含む脂質粒子を開示している。特許文献1には、例えば、
DLin-KC2-DMA)等、特許文献2には、例えば、
(1) 式(A)
R2は炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニル、アルコキシエチル、アルコキシプロピル、アルケニルオキシエチル、アルケニルオキシプロピル、アルキニルオキシエチルまたはアルキニルオキシプロピルであり、
R3およびR4は、同一または異なって炭素数1〜3のアルキルであるか、または一緒になって炭素数2〜8のアルキレンを形成するか、またはR3はR5と一緒になって炭素数2〜8のアルキレンを形成し、
R5は、水素原子、炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、アミノ、モノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイルもしくはジアルキルカルバモイルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであるか、またはR3と一緒になって炭素数2〜8のアルキレンを形成し、
X1は、炭素数1〜6のアルキレンであり、
X2は、単結合であるか、または炭素数1〜6のアルキレンであり、ただし、X1とX2の炭素数の和は7以下であり、R5が、水素原子の場合、X2は単結合であり、R5がR3と一緒になって炭素数2〜6のアルキレンを形成する場合、X2は単結合であるか、またはメチレンもしくはエチレンである)、
式(B)
R7は炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニル、アルコキシエチル、アルコキシプロピル、アルケニルオキシエチル、アルケニルオキシプロピル、アルキニルオキシエチルまたはアルキニルオキシプロピルである)、または
式(C)
R9は炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニル、アルコキシエチル、アルコキシプロピル、アルケニルオキシエチル、アルケニルオキシプロピル、アルキニルオキシエチルまたはアルキニルオキシプロピルであり、
X3は、炭素数1〜3のアルキレンであり、
R10は、水素原子または炭素数1〜3のアルキルである)で表されるカチオン性脂質。
(2) R1、R2、R6、R7、R8およびR9が、それぞれテトラデシル、ヘキサデシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルまたは(Z)-ドコサ-13-エニルである前記(1)記載のカチオン性脂質。
(3) R1、R2、R6、R7、R8およびR9が、それぞれ(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルまたは(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルである前記(1)記載のカチオン性脂質。
(4) X1が、炭素数1〜3のアルキレンであり、X2が、単結合またはメチレンである前記(1)〜(3)のいずれかに記載のカチオン性脂質。
(5) X3が、メチレンまたはエチレンである前記(1)〜(4)のいずれかに記載のカチオン性脂質。
(6) R3およびR4が、同一もしくは異なってメチルもしくはエチル、または一緒になってn-ペンチレンまたはn-ヘキシレンを形成する前記(1)〜(5)のいずれかに記載のカチオン性脂質。
(7) R3およびR5が、一緒になってn-プロピレンまたはn-ブチレンを形成し、R4が、メチルまたはエチルである前記(1)〜(5)のいずれかに記載のカチオン性脂質。
(8) R5およびR10が、それぞれ水素原子またはメチルである前記(1)〜(7)のいずれかに記載のカチオン性脂質。
(9) 前記(1)〜(8)のいずれかに記載のカチオン性脂質および核酸を含有する組成物。
(10) 該カチオン性脂質と該核酸とが複合体を形成しているか、または該カチオン性脂質に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと該核酸とが複合体を形成している、前記(9)記載の組成物。
(11) 該カチオン性脂質と該核酸とが複合体を形成しているか、または該カチオン性脂質に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと該核酸とが複合体を形成しており、該複合体を封入する脂質膜を含有する前記(9)記載の組成物。
(12) 核酸がRNA干渉(RNAi)を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有する核酸である前記(9)〜(11)のいずれかに記載の組成物。
(13) 標的遺伝子が、肝臓、肺、腎臓または脾臓において発現する遺伝子である前記(12)記載の組成物。
(14) 前記(9)〜(13)のいずれかに記載の組成物を用いて該核酸を細胞内に導入する方法。
(15) 細胞が、ほ乳類の肝臓、肺、腎臓または脾臓にある細胞である前記(14)記載の方法。
(16) 細胞内に導入する方法が、該組成物の静脈内投与によって細胞内に導入する方法である前記(14)または(15)に記載の方法。
(17) 前記(13)に記載の組成物を哺乳動物に投与するする工程を含む、肝臓、肺、腎臓または脾臓に関連する疾患の治療方法。
(18) 投与する方法が、静脈内投与である前記(17)記載の方法。
(19) 前記(12)に記載の組成物を含む、疾患の治療に用いるための医薬。
(20) 静脈内投与用である前記(19)記載の医薬。
(21) 前記(13)に記載の組成物を含む、肝臓、肺、腎臓または脾臓に関連する疾患の治療剤。
(22) 静脈内投与用である前記(21)記載の肝臓、肺、腎臓または脾臓に関連する疾患の治療剤。
式(A)
R2は炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニル、アルコキシエチル、アルコキシプロピル、アルケニルオキシエチル、アルケニルオキシプロピル、アルキニルオキシエチルまたはアルキニルオキシプロピルであり、
R3およびR4は、同一または異なって炭素数1〜3のアルキルであるか、または一緒になって炭素数2〜8のアルキレンを形成するか、またはR3はR5と一緒になって炭素数2〜6のアルキレンを形成し、
R5は、水素原子、炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、アミノ、モノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイルもしくはジアルキルカルバモイルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであるか、またはR3と一緒になって炭素数2〜8のアルキレンを形成し、
X1は、炭素数1〜6のアルキレンであり、
X2は、単結合であるか、または炭素数1〜6のアルキレンであり、ただし、X1とX2の炭素数の和は7以下であり、R5が、水素原子の場合、X2は単結合であり、R5がR3と一緒になって炭素数2〜6のアルキレンを形成する場合、X2は単結合であるか、またはメチレンもしくはエチレンである)、
式(B)
R7は炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニル、アルコキシエチル、アルコキシプロピル、アルケニルオキシエチル、アルケニルオキシプロピル、アルキニルオキシエチルまたはアルキニルオキシプロピルである)、または
式(C)
R9は炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニル、アルコキシエチル、アルコキシプロピル、アルケニルオキシエチル、アルケニルオキシプロピル、アルキニルオキシエチルまたはアルキニルオキシプロピルであり、
X3は、炭素数1〜3のアルキレンであり、
R10は、水素原子または炭素数1〜3のアルキルである)で表されるカチオン性脂質である。
以下、式(A)で表される化合物を化合物(A)ということもある。他の式番号の化合物についても同様である。
炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルケニルとしては、1以上の2重結合を含む炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルケニルであればよく、例えば(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニル、3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニル、(Z)-ドコサ-13-エニル等があげられ、好ましくは(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、(Z)-ドコサ-13-エニル等があげられる。
炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルキニルとしては、1以上の3重結合を含む炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルキニルであればよく、例えばドデカ-11-イニル、テトラデカ-6-イニル、ヘキサデカ-7-イニル、ヘキサデカ-5,7-ジイニル、オクタデカ-9-イニル等があげられる。
アルケニルオキシエチルおよびアルケニルオキシプロピルにおけるアルケニル部分としては、例えば前記炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルケニルの例示であげた基等があげられる。
アルキニルオキシエチルおよびアルキニルオキシプロピルにおけるアルキニル部分としては、例えば前記炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルキニルの例示であげた基等があげられる。
R5における、アミノおよびモノアルキルアミノは、それぞれ、窒素原子上の孤立電子対に、水素イオンが配位して、アンモニオおよびモノアルキルアンモニオを形成していてもよく、アミノおよびモノアルキルアミノは、それぞれアンモニオおよびモノアルキルアンモニオを包含する。
本発明において、アミノおよびモノアルキルアミノの窒素原子上の孤立電子対に、水素イオンが配位したアンモニオおよびモノアルキルアンモニオは、製薬上許容し得る陰イオンと塩を形成していてもよい。
式(A)における酸素原子の1つを硫黄原子に置き換えた式(Aa)
本発明において、製薬上許容し得る陰イオンとしては、例えば塩化物イオン、臭化物イオン、硝酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン等の無機イオン、酢酸イオン、シュウ酸イオン、マレイン酸イオン、フマル酸イオン、クエン酸イオン、安息香酸イオン、メタンスルホン酸イオン等の有機酸イオン等があげられる。
化合物(A)のうち、R2が炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルまたはアルキニルである、化合物(Ia)は以下の方法によって製造することができる。
化合物(IIa)は、アンモニアと化合物(IIIa)を、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の塩基の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。さらに、化合物(IIb)は、化合物(IIa)と化合物(IIIb)を、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の塩基の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ピリジン、水等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えば炭酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、カリウム tert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン(DBU)等があげられる。
化合物(IIIa)および化合物(IIIb)は、市販品としてまたは公知の方法(例えば、「第5版 実験化学講座13 有機化合物の合成I」、第5版、p.374、丸善(2005年))もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
R1とR11が同一の場合の化合物(IIb)は、工程1において、2当量以上の化合物(IIIa)を用いることで得ることができる。
化合物(VI)は、化合物(IV)を、化合物(V)と、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の添加剤の存在下、および/または必要により好ましくは1〜10当量の塩基の存在下、-20℃と150℃の間の温度で、5分間〜72時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いることができる。
添加剤としては、例えば1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、4-ジメチルアミノピリジン等があげられる。
塩基としては、工程1および2で例示したものがあげられる。
化合物(IV)は、市販品として得ることができる。
化合物(V)は、市販品としてまたは公知の方法(例えば、「第5版 実験化学講座14 有機化合物の合成II」、第5版、p.1、丸善(2005年))もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
化合物(Ia)は、化合物(IIb)を、化合物(VI)と、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の添加剤の存在下、および/または必要により好ましくは1〜10当量の塩基の存在下、-20℃と150℃の間の温度で、5分間〜72時間反応させることにより製造することができる。
溶媒および添加剤としては、それぞれ工程3で例示したものがあげられる。
塩基としては、工程1および2で例示したものがあげられる。
化合物(IIb)は以下の方法によってもまた製造することができる。
化合物(IIc)は、N-(tert-ブトキシカルボニル)-2-ニトロベンゼンスルホンアミドと化合物(IIIa)を、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の添加剤の存在下、および/または必要により好ましくは1〜10当量の塩基の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、工程1および2で例示したものがあげられる。
添加剤としては、例えばヨウ化n-テトラブチルアンモニウム、ヨウ化ナトリウム等があげられる。
塩基としては、例えば炭酸セシウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、カリウム tert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、DBU等があげられる。
化合物(IId)は、化合物(IIc)を、1当量〜大過剰量の酸で、無溶媒または溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の添加剤の存在下、-20℃と150℃の間の温度で、5分間〜72時間処理することにより製造することができる。
溶媒としては、工程1および2で例示したものがあげられる。
酸としては、例えば塩酸、硫酸、リン酸、トリフルオロ酢酸等があげられる。
添加剤としては、例えばチオアニソール、ジメチルスルフィド、トリイソプロピルシラン等があげられる。
工程7
化合物(IIe)は、化合物(IIIb)と化合物(IId)を、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の添加剤の存在下、および/または必要により好ましくは1〜10当量の塩基の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、工程1および2で例示したものがあげられる。
添加剤および塩基としては、それぞれ工程5で例示したものがあげられる。
工程8
化合物(IIb)は、化合物(IIe)とチオール化合物を、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の塩基の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、工程1および2で例示したものがあげられる。
チオール化合物としては、例えばメタンチオール、エタンチオール、ドデカンチオール、チオフェノール、メルカプト酢酸等があげられる。
塩基としては、工程5で例示したものがあげられる。
化合物(IIf)は、化合物(IIa)と化合物(IIIc)を、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の塩基の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、工程1および2で例示したものがあげられる。
塩基としては、工程1および2で例示したものがあげられる。
化合物(Ib)は、化合物(IIf)を、化合物(VI)と、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の添加剤の存在下、および/または必要により好ましくは1〜10当量の塩基の存在下、-20℃と150℃の間の温度で、5分間〜72時間反応させることにより製造することができる。
溶媒および添加剤としては、それぞれ工程3で例示したものがあげられる。
塩基としては、工程1および2で例示したものがあげられる。
化合物(VIIb)は、化合物(VIIa)を、化合物(VIII)と、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の塩基の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、工程3で例示したものがあげられる。
塩基としては、工程1および2で例示したものがあげられる。
化合物(VIIa)は、市販品としてまたは公知の方法(例えば、「第5版 実験化学講座14 有機化合物の合成II」、第5版、p.1、丸善(2005年))もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
化合物(VIII)は、市販品として得ることができる。
化合物(IIIc)は、化合物(VIIb)を、メシル化試薬と、無溶媒でまたは溶媒中、好ましくは1〜10当量の塩基の存在下、-20℃と150℃の間の温度で、5分間〜72時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、工程3で例示したものがあげられる。
塩基としては、工程1および2で例示したものがあげられる。
メシル化試薬としては、例えば無水メシル酸、メシル酸クロリド等があげられる。
化合物(IIf)は以下の方法によってもまた製造することができる。
化合物(IIg)は、化合物(IIIc)と化合物(IId)を、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の添加剤の存在下、および/または必要により好ましくは1〜10当量の塩基の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、工程1および2で例示したものがあげられる。
添加剤および塩基としては、それぞれ工程5で例示したものがあげられる。
工程14
化合物(IIf)は、化合物(IIg)とチオール化合物を、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の塩基の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、工程1および2で例示したものがあげられる。
チオール化合物としては、工程8で例示したものがあげられる。
塩基としては、工程5で例示したものがあげられる。
化合物(B)のうち、R7がアルコキシエチル、アルコキシプロピル、アルケニルオキシエチル、アルケニルオキシプロピル、アルキニルオキシエチルまたはアルキニルオキシプロピルである化合物(Bc)は、化合物(IIf)の製造方法で得ることができる。
工程15
化合物(C)は、化合物(IIh)と化合物(Xa)を、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の添加剤の存在下、および/または必要により好ましくは1〜10当量の塩基の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒および塩基としては、それぞれ工程1および2で例示したものがあげられる。
添加剤としては、工程5で例示したものがあげられる。
化合物(IIh)は化合物(B)の製造方法で得ることができる。
化合物(Xa)は市販品としてまたは公知の方法(例えば、「第5版 実験化学講座13 有機化合物の合成I」、第5版、p.374、丸善(2005年))もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
化合物(IXa)は、化合物(IIh)と化合物(Xb)を、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の添加剤の存在下、および/または必要により好ましくは1〜10当量の塩基の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒および塩基としては、それぞれ工程1および2で例示したものがあげられる。
添加剤としては、工程5で例示したものがあげられる。
化合物(IIh)は化合物(B)の製造方法で得ることができる。
化合物(Xb)は市販品としてまたは公知の方法(例えば、「第5版 実験化学講座18 有機化合物の合成VI」、第5版、p.171-172、丸善(2005年))もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
化合物(Ca)は、化合物(IXa)と脱保護試薬を、無溶媒でまたは溶媒中、-20℃と150℃の間の温度で、5分間〜72時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、工程1および2で例示したものがあげられる。
脱保護試薬としては、例えばフッ化テトラブチルアンモニウム、フッ化水素ピリジン複合体、フッ化水素酸等のフッ素化合物等、酢酸、トリフルオロ酢酸、パラトルエンスルホン酸ピリジニウム、塩酸等の酸等があげられる。
化合物(IXb)は、化合物(IIh)を、好ましくは1〜大過剰量のアクリル酸エチルと、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の塩基の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、工程1で例示したものがあげられる。
塩基としては、例えば炭酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウム tert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、DBU等があげられる。
化合物(Cb)は、化合物(IXb)と、好ましくは1〜10当量の還元剤を、溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の添加剤の存在下、-20℃と150℃の間の温度で、5分間〜72時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばテトラヒドロフラン、ジオキサン、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、トルエン等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いることができる。
還元剤としては、例えば水素化アルミニウムリチウム、水素化アルミニウム、水素化ジイソブチルアルミニウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、シアン化水素化ホウ素ナトリウム、ボラン等があげられる。
添加剤としては、例えば塩化アルミニウム、塩化セリウム、塩化鉄、酢酸、塩酸等があげられる。
本発明のカチオン性脂質の中には、幾何異性体、光学異性体等の立体異性体、互変異性体等が存在し得るものもあるが、本発明のカチオン性脂質は、これらを含め、全ての可能な異性体およびそれらの混合物を包含する。
本発明のカチオン性脂質中の各原子の一部またはすべては、それぞれ対応する同位体原子で置き換わっていてもよく、化合物(A)、化合物(B)または化合物(C)は、これら同位体原子で置き換わった化合物も包含する。例えば、化合物(A)、化合物(B)または化合物(C)中の水素原子の一部またはすべては、原子量2の水素原子(重水素原子)であってもよい。
本発明のカチオン性脂質中の各原子の一部またはすべてが、それぞれ対応する同位体原子で置き換わった化合物は、市販のビルディングブロックを用いて、上記各製造法と同様な方法で製造することができる。また、化合物(A)、化合物(B)または化合物(C)中の水素原子の一部またはすべてが重水素原子で置き換わった化合物は、例えば、イリジウム錯体を触媒として用い、重水を重水素源として用いてアルコール、カルボン酸等を重水素化する方法[ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ(J.Am.Chem.Soc.), Vol.124,No.10,2092(2002)参照]等を用いて合成することもできる。
ヌクレオチド誘導体としては、例えばヌクレオチドに修飾を施した分子であればいかなる分子であってもよいが、例えばRNAまたはDNAと比較して、ヌクレアーゼ耐性を向上させるかもしくはその他の分解因子から安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため、細胞透過性をあげるため、または可視化させるために、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドに修飾を施した分子等が好適に用いられる。
ヌクレオチド誘導体としては、例えば糖部修飾ヌクレオチド、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド、塩基修飾ヌクレオチド等があげられる。
糖部修飾ヌクレオチドとしては、例えばヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよいが、2’-修飾ヌクレオチドが好ましく用いられる。
また、糖部修飾ヌクレオチドとして、例えば2’位の修飾基が4’位の炭素原子に架橋した構造を有する架橋構造型人工核酸(Bridged Nucleic Acid)(BNA)、より具体的には、2’位の酸素原子と4’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA)、およびエチレン架橋構造型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)[Nucleic Acid Research, 32, e175(2004)]等もあげられ、これらは2’-修飾ヌクレオチドに含まれる。
さらに糖部修飾ヌクレオチドとして、ペプチド核酸(PNA)[Acc. Chem. Res., 32, 624(1999)]、オキシペプチド核酸(OPNA)[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653(2001)]、ペプチドリボ核酸(PRNA)[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900(2000)]等もあげられる。
また、糖部修飾ヌクレオチドにおける修飾基は、その大きさから好ましい範囲を定義することもでき、フルオロの大きさから-O-ブチルの大きさに相当するものが好ましく、-O-メチルの大きさから-O-エチルの大きさに相当するものがより好ましい。
糖部修飾ヌクレオチドにおける修飾基におけるアルケニルとしては、炭素数3〜6のアルケニルがあげられ、例えばアリル、1-プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル等があげられる。
糖部修飾ヌクレオチドにおける修飾基におけるハロゲンとしては、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等があげられる。
アミノ酸残基におけるアミノ酸としては、例えば脂肪族アミノ酸(具体的には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン等)、ヒドロキシアミノ酸(具体的には、セリン、トレオニン等)、酸性アミノ酸(具体的には、アスパラギン酸、グルタミン酸等)、酸性アミノ酸アミド(具体的には、アスパラギン、グルタミン等)、塩基性アミノ酸(具体的には、リジン、ヒドロキシリジン、アルギニン、オルニチン等)、含硫アミノ酸(具体的には、システイン、シスチン、メチオニン等)、イミノ酸(具体的には、プロリン、4-ヒドロキシプロリン等)等があげられる。
糖部修飾ヌクレオチドにおける修飾基における置換アルキルおよび置換アルケニルにおける置換基としては、例えば、ハロゲン(前記と同義)、ヒドロキシ、スルファニル、アミノ、オキソ、-O-アルキル(該-O-アルキルのアルキル部分は前記アルキルと同義)、-S-アルキル(該-S-アルキルのアルキル部分は前記アルキルと同義)、-NH-アルキル(該-NH-アルキルのアルキル部分は前記アルキルと同義)、ジアルキルアミノオキシ(該ジアルキルアミノオキシの2つのアルキル部分は同一または異なって前記アルキルと同義)、ジアルキルアミノ(該ジアルキルアミノの2つのアルキル部分は同一または異なって前記アルキルと同義)、ジアルキルアミノアルキルオキシ(該ジアルキルアミノアルキルオキシの2つのアルキル部分は同一または異なって前記アルキルと同義であり、アルキレン部分は前記アルキルから水素原子が1つ除かれたものを意味する)等があげられ、置換数は好ましくは1〜3である。
塩基修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの塩基の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、塩基内の酸素原子が硫黄原子で置換されたもの、水素原子が炭素数1〜6のアルキル基で置換されたもの、メチル基が水素原子もしくは炭素数2〜6のアルキル基で置換されたもの、アミノ基が炭素数1〜6のアルキル基、炭素数1〜6のアルカノイル基等の保護基で保護されたもの等があげられる。
さらに、ヌクレオチド誘導体として、ヌクレオチドまたは糖部、リン酸ジエステル結合もしくは塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド誘導体に脂質、リン脂質、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、色素等、別の化学物質を付加したものもあげられ、具体的には、5’-ポリアミン付加ヌクレオチド誘導体、コレステロール付加ヌクレオチド誘導体、ステロイド付加ヌクレオチド誘導体、胆汁酸付加ヌクレオチド誘導体、ビタミン付加ヌクレオチド誘導体、緑色蛍光色素(Cy3)付加ヌクレオチド誘導体、赤色蛍光色素(Cy5)付加ヌクレオチド誘導体、フルオロセイン(6-FAM)付加ヌクレオチド誘導体、およびビオチン付加ヌクレオチド誘導体等があげられる。
また、本発明で用いられる核酸においては、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体が、該核酸内の他のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体とアルキレン構造、ペプチド構造、ヌクレオチド構造、エーテル構造、エステル構造、およびこれらの少なくとも一つを組み合わせた構造等の架橋構造を形成してもよい。
標的遺伝子のmRNAの一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸をアンチセンス鎖核酸といい、アンチセンス鎖核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸をセンス鎖核酸ともいう。センス鎖核酸は、標的遺伝子の一部の塩基配列からなる核酸そのもの等、アンチセンス鎖核酸と対合して二重鎖形成部ができる核酸をいう。
二本鎖核酸とは、二本の鎖が対合し二重鎖形成部を有する核酸をいう。二重鎖形成部とは、二本鎖核酸を構成するヌクレオチドまたはその誘導体が塩基対を構成して二重鎖を形成している部分をいう。二重鎖形成部を構成する塩基対は、通常15〜27塩基対であり、15〜25塩基対が好ましく、15〜23塩基対がより好ましく、15〜21塩基対がさらに好ましく、15〜19塩基対が特に好ましい。
二本鎖核酸を構成するアンチセンス鎖、センス鎖のいずれか一方、または両方の核酸は、二重鎖形成部に続く3’側または5’側に二重鎖を形成しない追加の核酸を有してもよい。この二重鎖を形成しない部分を突出部(オーバーハング)ともいう。
突出部を有する二本鎖核酸としては、例えば少なくとも一方の鎖の3’末端または5’末端に1〜4塩基、通常は1〜3塩基からなる突出部を有するものが用いられるが、2塩基からなる突出部を有するものが好ましく用いられ、dTdTまたはUUからなる突出部を有するものがより好ましく用いられる。突出部は、アンチセンス鎖のみ、センス鎖のみ、およびアンチセンス鎖とセンス鎖の両方に有することができるが、アンチセンス鎖とセンス鎖の両方に突出部を有する二本鎖核酸が好ましく用いられる。
また、二重鎖形成部に続いて標的遺伝子のmRNAの塩基配列と一部または全てが一致する配列、または、二重鎖形成部に続いて標的遺伝子のmRNAの相補鎖の塩基配列と一部または全てが一致する配列を用いてもよい。さらに、標的遺伝子の発現を抑制する核酸としては、例えばDicer等のリボヌクレアーゼの作用により前記の二本鎖核酸を生成する核酸分子(国際公開第2005/089287号パンフレット)や、3’末端や5’末端の突出部を有していない二本鎖核酸等を用いることもできる。
また、アンチセンス鎖およびセンス鎖の3’末端の塩基に結合する糖は、それぞれ3’位の水酸基が、リン酸基もしくは前記の修飾基、または生体内の核酸分解酵素等でリン酸基もしくは前記の修飾基に変換される基によって修飾されていてもよい。
一本鎖核酸として、上記の二本鎖核酸を構成するアンチセンス鎖およびセンス鎖を、スペーサー配列(スペーサーオリゴヌクレオチド)を介して連結したものを用いてもよい。スペーサーオリゴヌクレオチドとしては6〜12塩基の一本鎖核酸分子が好ましく、その5’末端側の配列は2個のUであるのが好ましい。スペーサーオリゴヌクレオチドの例として、UUCAAGAGAの配列からなる核酸があげられる。スペーサーオリゴヌクレオチドによってつながれるアンチセンス鎖およびセンス鎖の順番はどちらが5’側になってもよい。該一本鎖核酸としては、例えばステムループ構造によって二重鎖形成部を有するshRNA等の一本鎖核酸であることが好ましい。shRNA等の一本鎖核酸は、通常50〜70塩基長である。
リボヌクレアーゼ等の作用により、上記の一本鎖核酸または二本鎖核酸を生成するように設計した、70塩基長以下、好ましくは50塩基長以下、さらに好ましくは30塩基長以下の核酸を用いてもよい。
また、本発明の組成物としては、例えば本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質と核酸との複合体、または本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸との複合体ならびに該複合体を封入する脂質膜を含有し、該脂質膜に本発明のカチオン性脂質を含有する組成物等もあげられる。この場合の脂質膜も、脂質一重膜(脂質1分子膜)でも脂質二重膜(脂質2分子膜)であってもよい。また、該脂質膜に、本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質、中性脂質および/または高分子を含有していてもよい。
複合体および該複合体を封入する脂質膜を含有する組成物としては、例えば該複合体および該複合体を脂質二重膜で封入するリポソーム等があげられる。
なお、本発明の組成物には、本発明のカチオン性脂質を一種または複数種を使用してよく、また本発明のカチオン性脂質には、本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質を混合してもよい。
本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質としては、例えば、特開昭61-161246号公報(米国特許5049386号明細書)中で開示される、N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、N-(2,3-ジ-(9-(Z)-オクタデセノイルオキシ))-プロパ-1-イル-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTAP)等、国際公開第91/16024号パンフレットおよび国際公開第97/019675号パンフレット中で開示される、N-[1-(2,3-ジオレイルオキシプロピル)]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル臭化アンモニウム(DORIE)、2,3-ジオレイルオキシ-N-[2-(スペルミンカルボキシアミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパナミニウムトリフルオロ酢酸(DOSPA)等、国際公開第2005/121348号パンフレット中で開示される、DLinDMA等、国際公開第2009/086558号パンフレット中で開示される、DLin-K-DMA、国際公開第2011/136368号パンフレット中で開示される、(3R,4R)-3,4-ビス((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)-1-メチルピロリジン、N-メチル-N,N-ビス(2-((Z)-オクタデカ-6-エニルオキシ)エチル)アミン等があげられ、好ましくはDOTMA、DOTAP、DORIE、DOSPA、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-K-DMA)等の2つの非置換アルキル基を有する3級アミン部位または3つの非置換アルキル基を有する4級アンモニウム部位を有するカチオン性脂質があげられ、より好ましくは、該3級アミン部位を有するカチオン性脂質があげられる。該3級アミン部位および該4級アンモニウム部位の非置換アルキル基はメチル基であることがより好ましい。
なお、本発明の組成物は、核酸を含有することができるが、核酸と化学的に近似した化合物も含有することもできる。
なお、本発明において、本発明のカチオン性脂質と核酸との複合体、または本発明のカチオン性脂質に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸との複合体ならびに該複合体を封入した脂質膜を含有する組成物、本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質と核酸との複合体、または本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸との複合体ならびに該複合体を封入する脂質膜を含有し、該脂質膜に本発明のカチオン性脂質を含有する組成物等の製造中および製造後に、複合体中の核酸と脂質膜中のカチオン性脂質との静電相互作用や、複合体中のカチオン性脂質と脂質膜中のカチオン性脂質との融合によって、複合体および膜の構造が変位したものも、それぞれ本発明のカチオン性脂質と核酸との複合体、または本発明のカチオン性脂質に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸との複合体ならびに該複合体を封入した脂質膜を含有する組成物、または本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質と核酸との複合体、または本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸との複合体ならびに該複合体を封入する脂質膜を含有し、該脂質膜に本発明のカチオン性脂質を含有する組成物等に包含される。
また、本開示の該核酸と該リポソームとの複合体中のリポソームは、予め大きさを、平均粒子径10nm〜400nm、より好ましくは30nm〜110nm、さらに好ましくは40nm〜80nmに調節したリポソームが好ましい。また、該複合体および/または脂質膜に、中性脂質および/または高分子を含有していてもよい。また、A液は、リポソームと該核酸との複合体を形成させることができれば、エタノール濃度は、20〜40%であってもよい。
また、等量のA液とB液を混合する代わりに、A液とB液を混合後に複合体が溶解せず、かつB液中のカチオン性脂質が溶解しないエタノール濃度、好ましくは複合体が溶解せず、B液中のカチオン性脂質が溶解せず、かつエタノール濃度が30〜60%のエタノール水溶液になるような比でA液とB液を混合することに代えてもよく、あるいはA液とB液を混合後に複合体が溶解しないようなエタノール濃度になるような比でA液とB液を混合し、さらに水を加えることで、B液中のカチオン性脂質が溶解しなくなるエタノール濃度にすることにしてもよい。
本開示の該A液中での核酸とリポソームとの複合体は、A液とB液を混合し、さらに適宜に水を加えた後には、カチオン性脂質を含有する脂質一重層からなる膜(逆ミセル)と核酸との複合体に形態が変化している。本開示の製造方法で得られる該核酸と該カチオン性脂質を含有する組成物は、好ましくはカチオン性脂質と核酸との複合体および該複合体を封入する脂質膜を含有する組成物であり、より好ましくは、カチオン性脂質を含有する脂質一重層からなる膜(逆ミセル)と核酸との複合体および該複合体を封入する脂質膜を含有し、該脂質膜にカチオン性脂質を含有する組成物であり、その製造性(収率および/または均一性)は優れている。
本発明の組成物において、複合体および該複合体を封入する脂質膜を含有する組成物中の本発明のカチオン性脂質の分子の総数は、該核酸のリン原子の数に対して1〜10倍であるのが好ましく、2.5〜9倍であるのがより好ましく、3.5〜8倍であるのがさらに好ましい。また、該組成物中の本発明のカチオン性脂質および本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質の分子の総数は、該核酸のリン原子の数に対して1〜10倍であるのが好ましく、2.5〜9倍であるのがより好ましく、3.5〜8倍であるのがさらに好ましい。
本発明の組成物において中性脂質を含有する場合には、中性脂質の分子の総数は、本発明のカチオン性脂質および本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質の分子の総数に対して0.1〜1.8倍であるのが好ましく、0.3〜1.2倍であるのがより好ましく、0.4〜1.0倍であるのがさらに好ましい。本発明の組成物は、いずれも中性脂質を、複合体に含有してもよく、複合体を封入する脂質膜に含有していてもよく、少なくとも複合体を封入する脂質膜に含有していることがより好ましく、複合体および該複合体を封入する脂質膜のどちらにも含有していることがさらに好ましい。
本発明の組成物が、糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体を含有する場合には、糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1以上の物質の脂質誘導体および脂肪酸誘導体の分子の総数は、本発明のカチオン性脂質および本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質の分子の総数に対して0.05〜0.3倍であるのが好ましく、0.07〜0.25倍であるのがより好ましく、0.1〜0.2倍であるのがさらに好ましい。
また、標的化リガンドを、本発明の組成物の脂質成分の極性ヘッド残基に共有結合することにより本発明の組成物の表面に直接結合させることも任意に行うことができる(国際公開第2006/116107号パンフレット参照)。
本発明の組成物(複合体を封入する脂質膜)の大きさは、平均粒子径が約10nm〜300nmであるのが好ましく、約30nm〜200nmであるのがより好ましく、約50nm〜150nmであるのがさらに好ましい。
本発明の組成物中の複合体または複合体を封入する脂質膜の平均粒子径は、例えば動的光散乱法で測定することができる。
本発明の組成物中の核酸が、RNA干渉(RNAi)を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有する核酸であれば、インビボでほ乳類の細胞内に、標的遺伝子の発現を抑制する該核酸等を導入することができ、標的遺伝子の発現の抑制ができる。投与対象は、人であることが好ましい。
また、本発明における標的遺伝子が、例えば肝臓、肺、腎臓または脾臓において発現する遺伝子、好ましくは肝臓において発現する遺伝子であれば、本発明の組成物を、肝臓、肺、腎臓または脾臓に関連する疾患の治療剤または予防剤、好ましくは肝臓に関連する疾患の治療剤または予防剤として使用することができる。
即ち、本発明は、上記説明した本発明の組成物を哺乳動物に投与する肝臓、肺、腎臓または脾臓に関連する疾患の治療方法も提供する。投与対象は、人であることが好ましく、肝臓、肺、腎臓または脾臓に関連する疾患に罹患している人がより好ましい。
また、本発明の組成物は、肝臓、肺、腎臓または脾臓に関連する疾患の治療剤または予防剤に関するインビボの薬効評価モデルにおいて、標的遺伝子を抑制することの有効性を検証するためのツールとして使用することもできる。
投与量は、投与対象の病状や年齢、投与経路等によって異なるが、例えば核酸に換算した1日投与量が約0.1μg〜1000mgとなるように投与すればよい。
注射剤の場合、前記の組成物の分散液または前記の溶媒を除去または凍結乾燥した組成物に、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理食塩水またはアミノ酸輸液等を混合して注射剤を調製することが好ましい。また、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システインもしくはEDTA等の抗酸化剤またはグリセリン、ブドウ糖もしくは塩化ナトリウム等の等張化剤等を添加して注射剤を調製することも可能である。また、例えばグリセリン等の凍結保存剤を加えて凍結保存することもできる。
なお、実施例および参考例に示されたプロトン核磁気共鳴スペクトル(1H NMR)は、270MHz、300MHz、400MHzまたは500MHzで測定されたものであり、化合物および測定条件によっては交換性プロトンが明瞭には観測されないことがある。なお、シグナルの多重度の表記としては通常用いられるものを用いているが、brとは見かけ上幅広いシグナルであることを表す。
アンモニア(東京化成工業社製、約2 mol/Lメタノール溶液、18.0 mL、36.0 mmol)に、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート(ニューチェック・プレップ・インク(Nu-Chek Prep,Inc)社製、1.55 g、4.50 mmol)を加え、マイクロ波反応装置を用いて130℃で3時間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてクロロホルムで5回抽出した。有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮することで(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルアミンの粗生成物を得た。
得られた粗生成物に(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製、1.24 g、3.60 mmol)および50%水酸化ナトリウム水溶液(1.44 g、18.0 mmol)を加え、油浴上110℃で60分間攪拌した。室温まで冷却後、反応液を酢酸エチルで希釈し、水、ついで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=100/0〜95/5)で精製することにより、化合物B-1(0.838 g、収率36.2%)を得た。
ESI-MS m/z: 515(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 6.9Hz, 6H), 1.30(br s, 33H), 1.41-1.54(m, 4H), 2.01-2.09(m, 8H), 2.59(t, J= 7.2 Hz, 4H), 2.77(t, J= 5.6 Hz, 4H), 5.28-5.43(m, 8H).
参考例1と同様の方法で、アンモニア(東京化成工業社製、約2 mol/Lメタノール溶液、12.0 mL、24.0 mmol)および(Z)-オクタデカ-9-エニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製、1.87 g、5.40 mmol)を用い、化合物B-2(0.562 g、収率36.2%)を得た。
ESI-MS m/z: 519(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.88(t, J= 6.7 Hz, 6H), 1.29(br s, 45H), 1.41-1.52(m, 4H), 1.97-2.05(m, 8H), 2.58(t, J= 7.2 Hz, 4H), 5.28-5.40(m, 4H).
参考例1と同様の方法で、アンモニア(シグマ・アルドリッチ(SIGMA-ALDRICH)社製、約7 mol/Lメタノール溶液、1.66 mL、11.6 mmol)および(Z)-ヘキサデカ-9-エニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製、0.488 g、1.46 mmol)を用い、化合物B-3(0.243 g、収率36.0%)を得た。
1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 6.9 Hz, 6H), 1.24-1.37(m, 37H), 1.43-1.52(m, 4H), 1.98-2.05(m, 8H), 2.58(t, J= 7.2 Hz, 4H), 5.31-5.38(m, 4H).
参考例1と同様の方法で、アンモニア(SIGMA-ALDRICH社製、約7 mol/Lメタノール溶液、1.60 mL、11.2 mmol)および(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製、0.521 g、1.40 mmol)を用い、化合物B-4(0.292 g、収率36.6%)を得た。
1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 6.8 Hz, 6H), 1.24-1.39(m, 41H), 1.43-1.51(m, 4H), 2.02-2.08(m, 8H), 2.58(t, J= 7.3 Hz, 4H), 2.77(t, J= 6.7 Hz, 4H), 5.30-5.41(m, 8H).
実施例1で得られる化合物B-1(1.35 g、2.63 mmol)をクロロホルム(18 mL)に溶解させ、“ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー(J.Am.Chem.Soc.)”,1981年,第103巻,p.4194-4199記載の方法に準じた方法で合成した3-(ジメチルアミノ)プロピル 4-ニトロフェニル カルボナート塩酸塩(化合物VI-1)(1.20 g、3.94 mmol)およびトリエチルアミン(1.47 mL、10.5 mmol)を加え、マイクロ波反応装置を用いて110℃で60分間攪拌した。反応液に化合物VI-1(200 mg、0.658 mmol)を加え、マイクロ波反応装置を用いて110℃で20分間攪拌した。反応液に化合物VI-1(200 mg、0.658 mmol)を加え、マイクロ波反応装置を用いて110℃で20分間攪拌した。反応液に化合物VI-1(200 mg、0.658 mmol)を加え、マイクロ波反応装置を用いて110℃で20分間攪拌した。反応液をクロロホルムで希釈し、1 mol/L水酸化ナトリウム水溶液で3回洗浄し、ついで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣を少量のn-ヘキサン/酢酸エチル(1/4)に溶解してアミノ修飾シリカゲルのパッドに吸着させ、n-ヘキサン/酢酸エチル(1/4)で溶出し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=100/0〜95/5)で精製することで化合物A-1(1.39 g、収率82.2%)を得た。
ESI-MS m/z: 644(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 6.7 Hz, 6H), 1.29(br s, 32H), 1.45-1.56(m, 4H), 1.74-1.85(m, 2H), 2.00-2.09(m, 8H), 2.23(s, 6H), 2.35(t, J= 7.4 Hz, 2H), 2.77(t, J= 5.8 Hz, 4H), 3.13-3.23(m, 4H), 4.10(t, J= 6.4 Hz, 2H), 5.28-5.43(m, 8H).
(化合物A-2)
実施例5と同様の方法で、化合物B-1の代わりに実施例2で得られる化合物B-2(0.156 g、0.301 mmol)を用い、化合物A-2(0.267 g、収率88.7%)を得た。
ESI-MS m/z: 648(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.88(t, J= 6.6 Hz, 6H), 1.28(br s, 44H), 1.45-1.55(m, 4H), 1.75-1.85(m, 2H), 1.97-2.04(m, 8H), 2.23(s, 6H), 2.34(t, J= 7.6 Hz, 2H), 3.13-3.24(m, 4H), 4.10(t, J= 6.4 Hz, 2H), 5.28-5.40(m, 4H).
(化合物A-3)
実施例5と同様の方法で、化合物B-1の代わりに実施例3で得られる化合物B-3(0.164 g、0.355 mmol)を用い、化合物A-3(0.116 g、収率55.2%)を得た。
ESI-MS m/z: 592(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.88(t, J= 6.9 Hz, 6H), 1.21-1.38(m, 36H), 1.47-1.54(m, 4H), 1.75-1.83(m, 2H), 2.00-2.04(m, 8H), 2.22(s, 6H), 2.34(t, J= 7.4 Hz, 2H), 3.11-3.24(m, 4H), 4.10(t, J= 6.4 Hz, 2H), 5.30-5.38(m, 4H).
実施例5と同様の方法で、化合物B-1の代わりに実施例4で得られる化合物B-4(0.288 g、0.505 mmol)を用い、化合物A-4(0.290 g、収率82.2%)を得た。
ESI-MS m/z: 700(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 6.8 Hz, 6H), 1.21-1.40(m, 40H), 1.46-1.54(m, 4H), 1.76-1.83(m, 2H), 2.02-2.08(m, 8H), 2.23(s, 6H), 2.35(t, J= 7.6 Hz, 2H), 2.77(t, J= 6.7 Hz, 4H), 3.10-3.24(m, 4H), 4.10(t, J= 6.4 Hz, 2H), 5.30-5.41(m, 8H).
実施例5と同様の方法で、実施例1で得られる化合物B-1(0.215 g、0.418 mmol)および、化合物VI-1の代わりに2-(ジメチルアミノ)エチル 4-ニトロフェニル カルボナート塩酸塩(化合物VI-2)(0.162 g、0.557 mmol)を用いて、化合物A-5(0.184 g、収率70.0%)を得た。
ESI-MS m/z: 630(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 6.8 Hz, 6H), 1.12-1.39(m, 32H), 1.45-1.54(m, 4H), 2.00-2.07(m, 8H), 2.28(s, 6H), 2.57(t, J= 7.2 Hz, 2H), 2.77(t, J= 6.7 Hz, 4H), 3.11-3.24(m, 4H), 4.17(t, J= 6.7 Hz, 2H), 5.28-5.41(m, 8H).
実施例1で得られる化合物B-1(150 mg、0.292 mmol)をクロロホルム(4 mL)に溶解させ、5-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ペンタン酸(東京化成工業社製、95 mg、0.438 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン(0.255 mL、1.46 mmol)およびHATU(O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート)(アルドリッチ社製、222 mg、0.584 mmol)を加え、室温で4時間攪拌した。反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=100/0〜97/3)で精製することでtert-ブチル 5-(ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)アミノ)-5-オキソペンチルカルバマートを得た。
tert-ブチル 5-(ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)アミノ)-5-オキソペンチルカルバマートをジクロロメタン(4 mL)に溶解させ、トリフルオロ酢酸(0.450 mL、5.84 mmol)を加え室温で4時間攪拌した。反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、水層をクロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=100/0〜90/10)で精製することで化合物XI-1(124 mg、収率96.1%)を得た。
ESI-MS m/z: 614(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 6.8 Hz, 6H), 1.28-1.38(m, 32H), 1.43-1.57(m, 6H), 1.63-1.73(m, 2H), 2.05(q, J= 7.0 Hz, 8H), 2.30(t, J= 7.2 Hz, 2H), 2.71(t, J= 7.2 Hz, 2H), 2.77(t, J= 6.2 Hz, 4H), 3.19(t, J= 7.7 Hz, 2H), 3.28(t, J= 7.7 Hz, 2H), 5.28-5.43(m, 8H).
参考例1で得られる化合物XI-1(90.0 mg、0.147 mmol)を1,2-ジクロロエタン(2 mL)とメタノール(2 mL)に溶解させ、ホルムアルデヒド(0.219 mL、2.94 mmol)およびナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(アクロス・オーガニクス(Acros Organics)社製、311 mg、1.47 mmol)を加え室温で5時間攪拌した。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=100/0〜75/25)で精製することで化合物XI-2(88.2 mg、収率93.9%)を得た。
ESI-MS m/z: 642(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 7.0 Hz, 6H), 1.26-1.38(m, 32H), 1.46-1.71(m, 8H), 2.05(q, J= 7.0 Hz, 8H), 2.22(s, 6H), 2.29(q, J= 7.0 Hz, 4H), 2.77(t, J= 6.2 Hz, 4H), 3.19(t, J= 7.9 Hz, 2H), 3.28(t, J= 7.7 Hz, 2H), 5.28-5.42(m, 8H).
実施例1で得られる化合物B-1(146 mg、0.284 mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド(5 mL)に溶解させ、“ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー(J.Am.Chem.Soc.)”,1981年,第103巻,p.4194-4199記載の方法に準じた方法で合成したtert-ブチル 3-((4-ニトロフェノキシ)カルボニルオキシ)プロピルカルバマート(145 mg、0.426 mmol)およびトリエチルアミン(0.158 mL、1.14 mmol)を加え、室温で終夜攪拌した。反応混合物に水を加え、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=100/0〜98/2)で精製することで3-((N-ブトキシカルボニル)アミノ)プロピル ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)カルバマートを得た。
3-((N-ブトキシカルボニル)アミノ)プロピル ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)カルバマートをジクロロメタン(4 mL)に溶解させ、トリフルオロ酢酸(0.242 mL、3.13 mmol)を加え室温で8時間攪拌した。反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、水層をクロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(NHシリカゲル、クロロホルム/メタノール=100/0〜90/10)で精製することで化合物XI-3(75.6 mg、収率43.3%)を得た。
ESI-MS m/z: 616(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 6.8 Hz, 6H), 1.26-1.38(m, 32H), 1.46-1.54(m, 4H), 1.73-1.82(m, 2H), 2.05(q, J= 6.6 Hz, 8H), 2.76-2.80(m, 6H), 3.18(br s, 4H), 4.15(t, J= 6.2 Hz, 2H), 5.29-5.43(m, 8H).
クロロぎ酸4-ニトロフェニル(東京化成工業社製、1.761 g、8.56 mmol)のジエチルエーテル(20 mL)溶液に、2-(1-メチルピロリジン-2-イル)エタノール(東京化成工業社製、1.0 mL、7.13 mmol)のジエチルエーテル(20 mL)溶液を加え、室温にて終夜攪拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣をエタノール/ジエチルエーテル(1/1)より結晶化させ、濾取することで化合物VI-3(1.27 g、収率54%)を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ: 1.59-1.77(m, 2H), 1.82-2.09(m, 3H), 2.15-2.26(m, 1H), 2.76(s, 3H), 2.93-3.05(m, 2H), 3.61-3.20(m, 3H), 4.80(br s, 1H), 6.95(d, J= 9.2 Hz, 2H), 8.11(d, J= 9.2 Hz, 2H)
クロロぎ酸4-ニトロフェニル(1.58 g、7.67 mmol)のジエチルエーテル(32 mL)溶液に、3-(ピペリジン-1-イル)プロパン-1-オール(SIGMA-ALDRICH社製、1.00 mL、6.39 mmol)を加え、室温にて終夜攪拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣をエタノールより結晶化させ、濾取することで化合物VI-4(1.86 g、収率84%)を得た。
ESI-MS m/z: 309(M + H)+; 1H-NMR(DMSO-d6)δ: 1.28-1.49(m, 1H), 1.62-1.89(m, 5H), 2.10-2.26(m, 2H), 2.76-2.96(m, 2H), 3.04-3.19(m, 2H), 3.36-3.49(m, 2H), 4.33(t, J= 6.1 Hz, 2H), 7.58(d, J= 9.2 Hz, 2H), 8.33(d, J= 9.2 Hz, 2H), 10.37(br s, 1H).
クロロぎ酸4-ニトロフェニル(596 mg、2.84 mmol)のジエチルエーテル(10 mL)溶液に、3-(ピロリジン-1-イル)プロパン-1-オール(ABCR社製、386 mg、2.84 mmol)ジエチルエーテル(10 mL)溶液を加え、室温にて2時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣をエタノールより結晶化させ、濾取することで化合物VI-5(498 mg、収率53%)を得た。
1H-NMR(DMSO-d6)δ: 1.76-1.84(m, 2H), 1.85-2.00(m, 4H), 3.11-3.16(m, 2H), 3.30-3.44(m, 4H), 3.47(t, J= 6.0 Hz, 2H), 4,77(br s, 1H), 6.95(d, J= 9.2 Hz, 2H), 8.11(d, J= 9.2 Hz, 2H)
実施例1で得られる化合物B-1(0.161 g、0.314 mmol)をアセトニトリル(3.0 mL)に溶解させ、参考例4で得られる化合物VI-3(0.156 g、0.470 mmol)およびトリエチルアミン(0.219 mL、1.57 mmol)を加え、80℃で2時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル = 80/20)で精製することにより、化合物A-6(0.172 g、収率82%)を得た。
ESI-MS m/z: 670(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 6.9 Hz, 6H), 1.20-1.40(m, 32H), 1.45-1.57(m, 6H), 1.62-1.83(m, 2H), 1.94-2.18(m, 12H), 2.31(s, 3H), 2.77(t, J= 6.7 Hz, 4H), 3.03-3.26(m, 5H), 4.06-4.17(m, 2H), 5.29-5.42(m, 8H).
実施例5と同様の方法で、化合物VI-1の代わりに参考例5で得られる化合物VI-4を用いて、化合物A-7(0.387 g、収率81%)を得た。
ESI-MS m/z: 684(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 6.9 Hz, 6H), 1.21-1.62(m, 42H), 1.79-1.86(m, 2H), 2.02-2.08(m, 8H), 2.32-2.42(m, 6H), 2.77(t, J= 6.7 Hz, 4H), 3.10-3.43(m, 4H), 4.09(t, J= 6.4 Hz, 2H), 5.29-5.42(m, 8H).
実施例10と同様の方法で、化合物VI-3の代わりに参考例6で得られる化合物VI-5(0.168 g、0.508 mmol)を用い、化合物A-8(0.225 g、収率99%)を得た。
ESI-MS m/z: 670(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 6.9 Hz, 6H), 1.21-1.40(m, 32H), 1.46-1.55(m, 4H), 1.76-1.80(m, 4H), 1.82-1.89(m, 2H), 2.01-2.08(m, 8H), 2.47-2.55(m, 6H), 2.77(t, J= 6.7 Hz, 4H), 3.11-3.24(m, 4H), 4.11(t, J= 6.4 Hz, 2H), 5.29-5.42(m, 8H).
(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製、2.85 g、8.27 mmol)のアセトニトリル(30 ml)溶液に、炭酸セシウム(6.74 g、20.67 mmol)、ヨウ化テトラブチルアンモニウム(東京化成工業社製、3.05 g、8.27 mmol)およびN-(tert-ブトキシカルボニル)-2-ニトロベンゼンスルホンアミド(東京化成工業社製、2.50 g、8.27 mmol)を加え、3時間加熱還流下反応させた。反応液を室温まで冷却し、水を加えて酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル = 91/9〜70/30)で精製することにより、tert-ブチル(2-ニトロフェニル)スルホニル((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)カルバマート(3.21 g、収率70.5%)を得た。
tert-ブチル(2-ニトロフェニル)スルホニル((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)カルバマート(3.21 g、5.83 mmol)のジクロロメタン(22.5 ml)溶液にトリフルオロ酢酸(9.63 ml、126 mmol)を加え、室温で0.5時間攪拌した。反応液にジクロロメタンおよび水酸化ナトリウム水溶液(1 mol/L、100 mL)を加え、さらに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて水層のpHを8以上に調整した。得られた混合物をジクロロメタンで抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/クロロホルム = 50/50〜0/100)で精製し、化合物IId-1(2.48 g、収率94%)を得た。
ESI-MS m/z: 451(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 7.0 Hz, 3H), 1.22-1.39(m, 16H), 1.52(m, 2H), 2.01-2.05(m, 4H), 2.77(t, J= 6.6 Hz, 2H), 3.09(q, J= 6.7 Hz, 2H), 5.23(m, 1H), 5.31-5.42(m, 4H), 7.71-7.76(m, 2H), 7.78-7.87(1H), 8.13-8.15(m, 1H).
参考例7で得られる化合物IId-1(0.714 g、1.584 mmol)と1-ブロモドデカン(東京化成工業製、0.474 g、1.90 mmol)のアセトニトリル(6 ml)溶液にヨウ化テトラブチルアンモニウム(東京化成工業社製、0.585 g、1.58 mmol)および炭酸セシウム(1.03 g、3.17 mmol)を加え、60℃で1時間攪拌した。反応液に水を加え、n-ヘキサンで3回抽出した。抽出液をカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル = 94/6〜84/16)で精製してN-ドデシル-2-ニトロ-N-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)ベンゼンスルホンアミド(0.750 g、収率76%)を得た。
N-ドデシル-2-ニトロ-N-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)ベンゼンスルホンアミド(0.748 g、1.21 mmol)のアセトニトリル(7 ml)溶液に1-ドデカンチオール(東京化成工業社製、0.611 g、3.02 mmol)および1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン(ナカライテスク社製、0.460 g、3.02 mmol)を加え、60℃で1時間攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで2回抽出した。有機層を合わせ、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル=80:20、ついでクロロホルム/メタノール = 100/0〜88/12)で精製することで化合物B-5(0.534 g、定量的収率)を得た。
ESI-MS m/z: 434(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.88(t, J= 6.9 Hz, 3H), 0.89(t, J= 6.9 Hz, 3H), 1.24-1.38(m, 35H), 1.49-1.54(m, 4H), 2.05(q, J= 7.0 Hz, 4H), 2.62(t, J= 7.4 Hz, 4H), 2.77(t, J= 6.8 Hz, 2H), 5.30-5.41(m, 4H).
実施例13と同様の方法で、参考例7で得られる化合物IId-1(0.619 g、1.37 mmol)および、1-ブロモドデカンの代わりに1-ブロモデカン(東京化成工業社製、0.365 g、1.65 mmol)を用い、化合物B-6(0.423 g、収率76%)を得た。
ESI-MS m/z: 406(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.88(t, J= 7.1 Hz, 3H), 0.89(t, J= 6.9 Hz, 3H), 1.25-1.38(m, 31H), 1.46-1.50(m, 4H), 2.05(q, J= 7.0 Hz, 4H), 2.59(t, J= 7.2 Hz, 4H), 2.77(t, J= 6.9 Hz, 2H), 5.31-5.40(m, 4H).
実施例13と同様の方法で、参考例7で得られる化合物IId-1(0.714 g、1.58 mmol)および、1-ブロモドデカンの代わりに1-ブロモオクタン(東京化成工業社製、0.367 g、1.90 mmol)を用い、化合物B-7(0.519 g、収率87%)を得た。
ESI-MS m/z: 378(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.88(t, J= 7.1 Hz, 3H), 0.89(t, J= 6.9 Hz, 3H), 1.24-1.39(m, 27H), 1.48-1.54(m, 4H), 2.05(q, J= 7.0 Hz, 4H), 2.62(t, J= 7.4 Hz, 4H), 2.77(t, J= 6.6 Hz, 2H), 5.30-5.41(m, 4H).
実施例5と同様の方法で、化合物B-1の代わりに実施例13で得られる化合物B-5(0.260 g、0.600 mmol)を用い、化合物A-9(0.309 g、収率91%)を得た。
ESI-MS m/z: 563(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.88(t, J= 6.9 Hz, 3H), 0.89(t, J= 6.9 Hz, 3H), 1.23-1.38(m, 34H), 1.48-1.53(m, 4H), 1.77-1.82(m, 2H), 2.05(q, J= 7.1 Hz, 4H), 2.23(s, 6H), 2.34(t, J= 7.6 Hz, 2H), 2.77(t, J= 6.6 Hz, 2H), 3.13-3.22(m, 4H), 4.10(t, J= 6.5 Hz, 2H), 5.30-5.41(m, 4H).
実施例5と同様の方法で、化合物B-1の代わりに実施例14で得られる化合物B-6(0.185 g、0.456 mmol)を用い、化合物A-10(0.228 g、収率93%)を得た。
ESI-MS m/z: 535(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.88(t, J= 6.8 Hz, 3H), 0.89(t, J= 6.7 Hz, 3H), 1.24-1.38(m, 30H), 1.48-1.53(m, 4H), 1.77-1.82(m, 2H), 2.05(q, J= 7.0 Hz, 4H), 2.22(s, 6H), 2.34(t, J= 7.5 Hz, 2H), 2.77(t, J= 6.8 Hz, 2H), 3.14-3.22(m, 4H), 4.10(t, J= 6.4 Hz, 2H), 5.31-5.40(m, 4H).
実施例5と同様の方法で、化合物B-1の代わりに実施例15で得られる化合物B-7(0.227 g、0.600 mmol)を用い、化合物A-11(0.275 g、収率90%)を得た。
ESI-MS m/z: 507(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.88(t, J= 6.9 Hz, 3H), 0.89(t, J= 6.9 Hz, 3H), 1.22-1.39(m, 26H), 1.47-1.54(m, 4H), 1.76-1.82(m, 2H), 2.05(q, J= 6.0 Hz, 4H), 2.23(s, 6H), 2.34(t, J= 7.6 Hz, 2H), 2.77(t, J= 6.6 Hz, 2H), 3.12-3.22(m, 4H), 4.10(t, J= 6.5 Hz, 2H), 5.30-5.41(m, 4H).
(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル メタンスルホナート(983 mg、2.85 mmol)にエチレングリコール(3.16 ml、57.1 mmol)および1,4-ジオキサン(5 ml)を加え、1日間加熱還流下攪拌した。反応液を室温まで冷却後、水酸化ナトリウム水溶液(0.5 mol/L)を加えてn-ヘキサンで2回抽出した。有機層を合わせ、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー(クロロホルム100%)で精製することで2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)エタノール(668 mg、収率75%)を得た。
2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)エタノール(660 mg、2.13 mmol)とトリエチルアミン(0.444 mL、3.19 mmol)のジクロロメタン(9 ml)溶液に、0℃で無水メシル酸(SIGMA-ALDRICH社製、0.247 ml、3.19 mmol)を加え、室温で40分間攪拌した。反応液に水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を、塩酸(1 mol/L)、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮して化合物IIIc-1を得た。
実施例13と同様の方法で、参考例7で得られる化合物IId-1(0.798 g、1.77 mmol)および、1-ブロモドデカンの代わりに参考例8で得られる化合物IIIc-1(0.826 g、2.13 mmol)を用い、化合物B-8(0.676 g、収率68%)を得た。
ESI-MS m/z: 558(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 6.9 Hz, 6H), 1.27-1.38(m, 32H), 1.46-1.52(m, 2H), 1.54-1.60(m, 3H), 2.05(q, J= 7.0 Hz, 8H), 2.61(t, J= 7.3 Hz, 2H), 2.77(t, J= 5.5 Hz, 6H), 3.42(t, J= 6.8 Hz, 2H), 3.52(t, J= 5.4 Hz, 2H), 5.30-5.41(m, 8H).
実施例5と同様の方法で、化合物B-1の代わりに実施例19で得られる化合物B-8(0.184 g、0.330 mmol)を用い、化合物A-12(0.208 g、収率92%)を得た。
ESI-MS m/z: 687(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 6.9 Hz, 6H), 1.25-1.38(m, 32H), 1.50-1.57(m, 4H), 1.77-1.83(m, 2H), 2.05(q, J= 7.0 Hz, 8H), 2.22(s, 6H), 2.34(t, J= 7.4 Hz, 2H), 2.77(t, J= 6.6 Hz, 4H), 3.23-3.54(m, 8H), 4.11(t, J= 6.5 Hz, 2H), 5.30-5.41(m, 8H).
水素化ナトリウム(油性、60%、1.69 g、42.2 mmol)に、N-ベンジルジエタノールアミン(東京化成工業社製、1.65 g、8.44 mmol)のトルエン(10 mL)溶液を攪拌しながらゆっくりと添加した後、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製、6.69 g、19.4 mmol)のトルエン(10 mL)溶液を滴下した。得られた混合物を加熱還流下4時間攪拌した。室温まで冷却後、反応をエタノールで停止させた。得られた混合物に飽和食塩水を加え、酢酸エチルで2回抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール = 100/0〜99/1)で精製することによりN-ベンジル-N,N-ビス(2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)エチル)アミン(4.01 g、収率69%)を得た。
N-ベンジル-N,N-ビス(2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)エチル)アミン(4.01 g、5.89 mmol))を1,2-ジクロロエタン(29 mL)に溶解させ、クロロぎ酸1-クロロエチル(東京化成工業社製、1.90 mL、17.4 mmol)を加え130℃で1時間攪拌した。反応溶液にメタノール(29 mL)を加え、130℃でさらに1時間攪拌した。室温まで冷却後、反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、クロロホルムで2回抽出した。有機層を合わせ、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル = 90/10〜75/25)で精製することにより化合物XI-4(5.56 g、収率92%)を得た。
ESI-MS m/z: 621(M+ H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 7.0 Hz, 6H), 1.27-1.30(m, 33H), 1.53-1.59(m, 4H), 2.05(q, J= 7.1 Hz, 8H), 2.77(t, J= 6.8 Hz, 4H), 2.80(t, J= 5.4 Hz, 4H), 3.42(t, J= 6.8 Hz, 4H), 3.53(t, J= 5.4 Hz, 4H), 5.30-5.41(m, 8H).
(化合物XI-5)
実施例5と同様の方法で、化合物B-1の代わりに参考例9で得られる化合物XI-4(1.20 g、1.99 mmol)を用い、化合物XI-5(1.32 g、収率91%)を得た。
ESI-MS m/z: 732(M+ H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 7.0 Hz, 6H), 1.27-1.30(m, 30H), 1.51-1.57(m, 4H), 1.77-1.83(m, 4H), 2.05(q, J= 7.0 Hz, 8H), 2.23(s, 6H), 2.34(t, J= 7.5 Hz, 2H), 2.77(t, J= 6.7 Hz, 4H), 3.38-3.54(m, 12H), 4.12(t, J= 6.5 Hz, 2H), 5.30-5.41(m, 8H).
実施例1で得られる化合物B-1(0.788 g、1.53 mmol)をエタノール(8 mL)に溶解させ、アクリル酸エチル(東京化成工業社製、1.67 mL、15.3 mmol)およびナトリウムエトキシド(和光純薬工業社製、0.0520 g、0.767 mmol)を加え、加熱還流下、3時間攪拌した。反応液を減圧濃縮した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル = 85/15)で精製することにより、化合物XI-6(0.699 g、収率74%)を得た。
ESI-MS m/z: 615(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 6.9 Hz, 6H), 1.21-1.45(m, 39H), 2.02-2.08(m, 8H), 2.35-2.44(m, 6H), 2.75-2.80(m, 6H), 4.12(q, J= 7.0 Hz, 2H), 5.30-5.42(m, 8H).
参考例11で得られる化合物XI-6(0.199 g、0.324 mmol)をテトラヒドロフラン(2 mL)に溶解させ、氷冷下、水素化リチウムアルミニウム(純正化学社製、0.012 g、0.324 mmol)を加え、3時間攪拌した。反応液に水(0.0600 mL、3.33 mmol)およびフッ化ナトリウム(ナカライテスク社製、0.408 g、9.72 mmol)を加え、室温にて0.5時間攪拌した。不溶物をセライト濾過により除去した。ろ液を濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール = 98/2)で精製することにより、化合物C-1(0.181 g、収率98%)を得た。
ESI-MS m/z: 573(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 6.9 Hz, 6H), 1.21-1.40(m, 32H), 1.42-1.51(m, 4H), 1.64-1.71(m, 2H), 2.02-2.08(m, 8H), 2.40(t, J= 7.3 Hz, 4H), 2.64(t, J= 5.3 Hz, 2H), 2.77(t, J= 6.7 Hz, 4H), 3.79(t, J= 5.3 Hz, 2H), 5.30-5.42(m, 8H).
実施例1で得られる化合物B-1(0.228 g、0.444 mmol)をジクロロエタン(2 mL)に溶解させ、メタノール(2 mL)および2,3-ジヒドロキシプロパナール(ナカライテスク社製、0.400 g、4.44 mmol)を加え、室温にて0.5時間攪拌した。反応液にトリアセトキシ水素化ほう素ナトリウム(東京化成工業社製、0.470 g、2.22 mmol)を加え、室温にて終夜攪拌した。反応液に2,3-ジヒドロキシプロパナール(0.400 g、4.44 mmol)を加え、室温にて3時間攪拌した。反応液にトリアセトキシ水素化ほう素ナトリウム(0.470 g、2.22 mmol)を加え、室温にて終夜攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてクロロホルムで2回抽出した。有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル = 50/50)で精製することにより、化合物XI-7(0.0449 g、収率17%)を得た。
ESI-MS m/z: 589(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 6.9 Hz, 6H), 1.19-1.51(m, 36H), 2.02-2.08(m, 8H), 2.38-2.62(m, 6H), 2.77(t, J= 6.7 Hz, 4H), 3.46-3.50(m, 1H), 3.69-3.77(m, 2H), 5.30-5.42(m, 8H).
化合物XI-8は、国際公開第2011/136368号パンフレットに記載の方法で合成した。
工程1
クロロぎ酸4-ニトロフェニル(0.867 g、4.21 mmol) のジクロロメタン(20 mL) 溶液に、4-(tert-ブチルジメチルシリル)オキシ-1-ブタノール(SIGMA-ALDRICH社製、1.0 mL、4.21 mmol) とトリエチルアミン(0.881 mL, 6.32 mmol) を加え、室温にて1時間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてクロロホルムで2回抽出した。有機層を、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル = 90/10)で精製することにより、4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)ブチル 4-ニトロフェニル カルボナート(1. 44 g、収率92%) を得た。
工程2
実施例10と同様の方法で、化合物VI-3の代わりに工程1で得られる4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)ブチル 4-ニトロフェニル カルボナート(0.640 g、1.733 mmol) を用いて、4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)ブチル ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)カルバマートの粗精製物を得た。得られた 4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)ブチル ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)カルバマートの粗精製物をテトラヒドロフラン(10 mL) に溶解し、フッ化テトラブチルアンモニウム(東京化成工業社製、約
1 mol/L テトラヒドロフラン溶液、2.14 mL、2.14 mmol)を加え、室温にて1時間攪拌した。反応液にフッ化テトラ-n-ブチルアンモニウム(約 1 mol/L テトラヒドロフラン溶液、2.14 mL、2.14 mmol) を加え、室温で2時間攪拌後、50℃で1時間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて酢酸エチルで2回抽出した。有機層を、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール = 95/5)で精製することにより、4-ヒドロキシブチル ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)カルバマート(0.652 g、収率73%) を得た。
工程3
工程2で得られた 4-ヒドロキシブチル ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)カルバマート(0.193 g、0.306 mmol)のジクロロメタン(2 mL)溶液に、氷冷下、メシル酸クロリド(純正化学社製、0.0360 mL、0.460 mmol)とトリエチルアミン(0.0930 mL、0.919 mmol)を加え、0℃にて30分間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてクロロホルムで2回抽出した。有機層を、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をテトラヒドロフラン(1 mL)に溶解し、ジメチルアミン(アルドリッチ社製、約 2 mol/L テトラヒドロフラン溶液、1.53 mL、3.06 mmol)を加え、マイクロ波反応装置を用いて100℃で1時間攪拌後、マイクロ波反応装置を用いて130℃で1時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル = 80/20)で精製することにより、化合物A-13(0.159 g、収率79%)を得た。
ESI-MS m/z: 658(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.90(q, J= 6.5 Hz, 6H), 1.20-1.38(m, 32H), 1.45-1.56(m, 6H), 1.61-1.69(m, 2H), 2.01-2.08(m, 8H), 2.21(s, 6H), 2.28(t, J= 7.6 Hz, 2H), 2.77(t, J= 6.6 Hz, 4H), 3.12-3.23(m, 4H), 4.07(t, J= 6.6 Hz, 2H), 5.29-5.42(m, 8H).
クロロぎ酸4-ニトロフェニル(1.50 g、7.28 mmol)のテトラヒドロフラン(32 mL)溶液に、1-メチル-4-ピペリジンメタノール(東京化成工業社製、1.0 mL、7.28 mmol)を加え、室温にて2時間攪拌した。析出した結晶を濾取することで化合物VI-6(1.55 g、収率64%)を得た。
ESI-MS m/z: 295(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 1.93-2.19(m, 4H), 2.68-2.82(m, 3H), 3.51-3.62(m, 5H), 4.21(d, J= 6.0 Hz, 2H), 7.38(d, J= 9.1 Hz, 2H), 8.27(d, J= 9.1 Hz, 2H), 12.44(br s, 1H).
参考例14と同様の方法で、1-メチル-4-ピペリジンメタノールの代わりに 1-メチル-3-ピペリジンメタノール(東京化成工業社製、1.0 mL、7.21 mmol)を用い、化合物VI-7(2.32 g、収率97%)を得た。
ESI-MS m/z: 295(M + H)+.
参考例14と同様の方法で、1-メチル-4-ピペリジンメタノールの代わりに 1-メチル-2-ピペリジンメタノール(東京化成工業社製、1.0 mL、7.43 mmol)を用い、化合物VI-8(2.37 g、収率96%)を得た。
1H-NMR(CDCl3) δ: 1.51-1.63(m, 1H), 1.81-2.38(m, 5H), 2.85-2.99(m, 4H), 3.21-3.30(m, 1H), 3.49-3.60(m, 1H), 4.66(dd, J= 13.1, 2.4 Hz, 1H), 4.78-4.86(m, 1H), 7.47(d, J= 9.1 Hz, 2H), 8.28(d, J== 9.1 Hz, 2H), 12.40(br s, 1H).
参考例14と同様の方法で、1-メチル-4-ピペリジンメタノールの代わりに3-(アゼパン-1-イル)プロパノール(ケンブリッジ(CHEMBRIDGE)社製, 0.700 g, 4.45 mmol)を用いて、化合物VI-9(1.47 g、収率92%)を得た。
ESI-MS m/z: 323(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 1.60-1.75(m, 2H), 1.79-1.94(m, 5H), 2.15-2.27(m, 2H), 2.44-2.53(m, 2H), 2.90-3.02(m, 2H), 3.14-3.24(m, 2H), 3.55-3.65(m, 2H), 4.41(t, J= 5.9 Hz, 2H), 7.37-7.43(m, 2H), 8.25-8.32(m, 2H), 12.48(br s, 1H).
(化合物VI-10)
参考例14と同様の方法で、1-メチル-4-ピペリジンメタノールの代わりに1-メチルピペリジン-4-オール(シグマ・アルドリッチ(SIGMA-ALDRICH)社製, 0.300 g, 2.60 mmol)を用いて、化合物VI-10(0.740 g、収率90%)を得た。
ESI-MS m/z: 281(M + H)+ .
参考例14と同様の方法で、1-メチル-4-ピペリジンメタノールの代わりに1-メチルピペリジン-3-オール(シグマ・アルドリッチ(SIGMA-ALDRICH)社製, 0.305 g, 2.65 mmol)を用いて、化合物VI-11(0.410 g、収率49%)を得た。
ESI-MS m/z: 281(M + H)+ .
参考例14と同様の方法で、1-メチル-4-ピペリジンメタノールの代わりに(1-メチル-3-ピロリジニル)メタノール(マトリックス サイエンティフィック(Matrix Scientific)社製、0.500 g、7.43 mmol)を用い、化合物VI-12(0.943 g、収率69%)を得た。
ESI-MS m/z: 281(M + H)+ .
(化合物A-14)
実施例10と同様の方法で、化合物VI-3の代わりに参考例14で得られた化合物VI-6(0.228 g、0.689 mmol)を用い、化合物A-14(0.258 g、収率84%)を得た。
ESI-MS m/z: 670(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 6.9 Hz, 6H), 1.22-1.39(m, 32H), 1.46-1.54(m, 4H), 1.56-1.66(m, 3H), 1.67-1.74(m, 2H), 1.88-1.95(m, 2H), 2.05(q, J= 6.9 Hz, 8H), 2.26(s, 3H), 2.77(t, J= 6.8 Hz, 4H), 2.85(d, J= 11.7 Hz, 2H), 3.13-3.23(m, 4H), 3.92(d, J= 6.3 Hz, 2H), 5.30-5.42(m, 8H).
(化合物A-15)
実施例10と同様の方法で、化合物VI-3の代わりに参考例15で得られた化合物VI-7(0.238 g、0.719 mmol)を用い、化合物A-15(0.239 g、収率74%)を得た。
ESI-MS m/z: 670(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 6.9 Hz, 6H), 0.92-1.02(m, 1H), 1.22-1.39(m, 32H), 1.46-1.54(m, 4H), 1.55-1.65(m, 1H), 1.66-1.74(m, 3H), 1.82-1.89(m, 1H), 1.91-2.00(m, 1H), 2.05(q, J= 7.0 Hz, 8H), 2.26(s, 3H), 2.74-2.80(m, 5H), 2.84-2.89(m, 1H), 3.12-3.23(m, 4H), 3.87(dd, J= 10.7, 7.6 Hz, 1H), 3.97(dd, J= 10.7, 5.4 Hz, 1H), 5.30-5.41(m, 8H).
(化合物A-16)
実施例10と同様の方法で、化合物VI-3の代わりに参考例16で得られた化合物VI-8(0.256 g、0.774 mmol)を用い、化合物A-16(0.313 g、収率91%)を得た。
ESI-MS m/z: 670(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 6.9 Hz, 6H), 1.22-1.39(m, 32H), 1.46-1.64(m, 8H), 1.71-1.76(m, 2H), 2.02-2.12(m, 10H), 2.32(s, 3H), 2.77(t, J= 6.8 Hz, 4H), 2.79-2.84(m, 1H), 3.11-3.24(m, 4H), 4.05(dd, J= 11.1, 4.9 Hz, 1H), 4.17(dd, J= 11.1, 4.9 Hz, 1H), 5.30-5.42(m, 8H).
実施例10と同様の方法で、化合物B-1の代わりに実施例2で得られる化合物B-2(0.300 g、0.579 mmol)を用い、化合物A-17(0.360 g、収率92%)を得た。
ESI-MS m/z: 674(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.88(t, J= 6.9 Hz, 6H), 1.21-1.38(m, 44H), 1.45-1.85(m, 8H), 1.93-2.18(m, 12H), 2.32(s, 3H), 3.03-3.26(m, 5H), 4.05-4.18(m, 2H), 5.30-5.39(m, 4H).
実施例10と同様の方法で、化合物B-1の代わりに実施例2で得られる化合物B-2(0.300 g、0.579 mmol)および、化合物VI-3の代わりに参考例15で得られた化合物VI-7(0.287 g、0.896 mmol)を用い、化合物A-18(0.390 g、収率100%)を得た。
ESI-MS m/z: 674(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.85-1.04(m, 7H), 1.20-1.38(m, 44H), 1.46-1.74(m, 8H), 1.82-2.06(m, 10H), 2.26(s, 3H), 2.74-2.82(m, 1H), 2.83-2.89(m, 1H), 3.10-3.25(m, 4H), 3.87(dd, J= 10.5, 7.3 Hz, 1H), 3.98(dd, J= 10.5, 5.3 Hz, 1H), 5.30-5.39(m, 4H).
実施例10と同様の方法で、化合物B-1の代わりに実施例4で得られる化合物B-4(0.300 g、0.526 mmol)を用い、化合物A-19(0.369 g、収率97%)を得た。
ESI-MS m/z: 726(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 6.9 Hz, 6H), 1.21-1.40(m, 40H), 1.44-1.85(m, 8H), 1.93-2.18(m, 12H), 2.32(s, 3H), 2.77(t, J= 6.4 Hz, 4H), 3.04-3.27(m, 5H), 4.05-4.18(m, 2H), 5.29-5.42(m, 8H).
実施例10と同様の方法で、化合物B-1の代わりに実施例4で得られる化合物B-4(0.300 g、0.526 mmol)および、化合物VI-3の代わりに参考例15で得られた化合物VI-7(0.261 g、0.789 mmol)を用い、化合物A-20(0.374 g、収率98%)を得た。
ESI-MS m/z: 726(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.85-1.04(m, 7H), 1.21-1.40(m, 40H), 1.45-1.75(m, 8H), 1.82-2.09(m, 10H), 2.26(s, 3H), 2.74-2.90(m, 6H), 3.11-3.24(m, 4H), 3.87(dd, J= 10.5, 7.5 Hz, 1H), 3.98(dd, J= 10.5, 5.5 Hz, 1H), 5.29-5.43(m, 8H).
実施例1で得られる化合物B-1(0.0831 g、0.162 mmol)をジクロロエタン(1 mL)に溶解させ、1,1'-カルボニルジイミダゾール(ナカライテスク社製、0.0394g、0.243 mmol)を加え、室温で終夜攪拌した。反応液にヨードメタン(東京化成工業社製、0.101 mL、1.62 mmol)を加え、60℃で終夜攪拌した。反応液を減圧濃縮した。得られた残渣をテトラヒドロフラン(1 mL)に溶解し、1-メチルピロリジン-2-メタノール(和光純薬工業社製、0.0372 g、0.323 mmol)とトリエチルアミン(0.0563 mL、0.404 mmol)を加え、室温で終夜攪拌した後、反応液を60℃で3時間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてn-ヘキサンで2回抽出した。有機層を、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル = 90/10)で精製することにより、化合物A-21(0.0318 g、収率30%)を得た。
ESI-MS m/z: 656(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J= 6.9 Hz, 6H), 1.24-1.39(m, 32H), 1.46-1.67(m, 5H), 1.67-1.85(m, 2H), 1.89-2.00(m, 1H), 2.05(q, J= 7.0 Hz, 8H), 2.21-2.30(m, 1H), 2.42(s, 3H), 2.43-2.51(m, 1H), 2.77(t, J= 6.6 Hz, 4H), 3.03-3.08(m, 1H), 3.11-3.25(m, 4H), 4.00(dd, J= 10.5, 6.0 Hz, 1H), 4.08(dd, J= 10.5, 5.5 Hz, 1H), 5.29-5.42(m, 8H).
(化合物A-22)
実施例10と同様の方法で、化合物VI-3の代わりに参考例20で得られる化合物VI-12(0.277 g、0.876 mmol)を用い、化合物A-22(0.263 g、収率66%)を得た。
ESI-MS m/z: 656(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 6.9 Hz, 6H), 1.20-1.40(m, 32H), 1.44-1.78(m, 5H), 1.92-2.09(m, 9H), 2.24(dd, J= 9.4, 6.2 Hz, 1H), 2.34(s, 3H), 2.39-2.63(m, 3H), 2.68-2.80(m, 5H), 3.10-3.25(m, 4H), 3.95(dd, J= 10.5, 7.8 Hz, 1H), 4.03(dd, J= 10.5, 6.4 Hz, 1H), 5.28-5.42(m, 8H).
工程1
クロロぎ酸4-ニトロフェニル(0.844 g、7.19 mmol)のテトラヒドロフラン(12 mL)溶液に、2-(1-メチルピペリジン-2-イル)エタノール(Matrix Scientific社製、0.500 g、3.49 mmol)を加え、室温にて終夜攪拌した。反応液を減圧濃縮し、2-(1-メチルピペリジン-2-イル)エチル 4-ニトロフェニル カルボナート塩酸塩の粗精製物を得た。
工程2
実施例10と同様の方法で、化合物VI-3の代わりに工程1で得られた 2-(1-メチルピペリジン-2-イル)エチル 4-ニトロフェニル カルボナート塩酸塩の粗精製物(0.302 g、0.876 mmol)を用い、化合物A-23(0.299 g、収率75%)を得た。
ESI-MS m/z: 684(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J=6.9 Hz, 6H), 1.19-1.40(m, 32H), 1.45-1.75(m, 11H), 1.93-2.11(m, 11H), 2.27(s, 3H), 2.74-2.86(m, 5H), 3.10-3.24(m, 4H), 4.06-4.19(m, 2H), 5.29-5.42(m, 8H).
(化合物A-24)
実施例10と同様の方法で、化合物VI-3の代わりに参考例17で得られる化合物VI-9を用いて、化合物A-24(0.136 g、収率67%)を得た。
ESI-MS m/z: 698(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.86-0.94(m, 6H), 1.22-1.41(m, 36H), 1.45-1.67(m, 8H), 1.75-1.85(m, 2H), 2.00-2.11(m, 8H), 2.55(t, J= 7.5 Hz, 2H), 2.62(t, J= 5.1 Hz, 4H), 2.77(t, J= 5.9 Hz, 4H), 3.13-3.23(m, 4H), 4.10(t, J= 6.4 Hz, 2H), 5.28-5.45(m, 8H).
実施例10と同様の方法で、化合物B-1の代わりに実施例19で得られる化合物B-8(0.150 g、0.269 mmol)および、化合物VI-3の代わりに参考例5で得られる化合物VI-4(0.201 g、0.672 mmol)を用いて、化合物A-29(0.170 g、収率87%)を得た。
ESI-MS m/z: 728(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 6.8 Hz, 6H), 1.22-1.40(m, 32H), 1.40-1.63(m, 14H), 1.78-1.87(m, 2H), 2.05(q, J= 6.6 Hz, 8H), 2.33-2.41(m, 6H), 2.77(t, J= 6.0 Hz, 4H), 3.20-3.31(m, 2H), 3.40(t, J= 6.6 Hz, 4H), 3.46-3.57(m, 2H), 4.10(t, J= 6.4 Hz, 2H), 5.27-5.45(m, 8H).
実施例10と同様の方法で、化合物B-1の代わりに実施例19で得られる化合物B-8(0.120 g、0.215 mmol)を用いて、化合物A-30(0.140 g、収率91%)を得た。
ESI-MS m/z: 714(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 6.8 Hz, 6H), 1.21-1.40(m, 32H), 1.45-1.59(m, 6H), 1.64-1.82(m, 2H), 1.93-2.17(m, 12H), 2.31(s, 3H), 2.70-2.81(m, 4H), 3.06(t, J= 7.8 Hz, 1H), 3.20-3.31(m, 2H), 3.40(t, J= 5.9 Hz, 4H), 3.46-3.58(m, 2H), 4.06-4.17(m, 2H), 5.28-5.44(m, 8H).
(化合物A-31)
実施例10と同様の方法で、化合物B-1の代わりに実施例19で得られる化合物B-8(0.150 g、0.269 mmol)および、化合物VI-3の代わりに参考例17で得られる化合物VI-9(0.145 g、0.403 mmol)を用いて、化合物A-31(0.170 g、収率85%)を得た。
ESI-MS m/z: 742(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 6.8 Hz, 6H), 1.21-1.39(m, 32H), 1.48-1.65(m, 12H), 1.72-1.85(m, 2H), 2.05(q, J= 6.6 Hz, 8H), 2.55(t, J= 7.5 Hz, 2H), 2.61(t, J= 5.3 Hz, 4H), 2.77(t, J= 5.9 Hz, 4H), 3.21-3.30(m, 2H), 3.40(t, J= 6.8 Hz, 4H), 3.46-3.55(m, 2H), 4.10(t, J= 6.4 Hz, 2H), 5.26-5.42(m, 8H).
実施例10と同様の方法で、化合物B-1の代わりに実施例19で得られる化合物B-8(0.150 g、0.269 mmol)および、化合物VI-3の代わりに参考例15で得られる化合物VI-7(0.133 g、0.403 mmol)を用いて、化合物A-32(0.145 g、収率76%)を得た。
ESI-MS m/z: 714(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.91(t, J= 6.8 Hz, 6H), 1.23-1.45(m, 32H), 1.49-1.77(m, 9H), 1.83-2.03(m, 2H), 2.07(q, J= 6.6 Hz, 8H), 2.28(s, 3H), 2.76-2.91(m, 2H), 2.80(t, J= 5.9 Hz, 4H), 3.21-3.33(m, 2H), 3.43(t, J= 6.4 Hz, 4H), 3.48-3.58(m, 2H), 3.85-4.05(m, 2H), 5.30-5.47(m, 8H).
実施例8と同様の方法で、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル メタンスルホナートの代わりに(Z)-オクタデカ-9-エン-1-イル メタンスルホナート(2.00 g、5.77 mmol)を用いて、化合物IIIc-2(1.29 g、収率57%)を得た。
ESI-MS m/z: 391(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 6.6 Hz, 3H), 1.22-1.38(m, 22H), 1.50-1.62(m, 2H), 1.97-2.05(m, 4H), 3.06(s, 3H), 3.48(t, J= 6.8 Hz, 2H), 3.67-3.72(m, 2H), 4.36-4.39(m, 2H), 5.35(t, J= 5.5 Hz, 2H).
実施例8と同様の方法で、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル メタンスルホナートの代わりに(Z)-ヘキサデカ-9-エン-1-イル メタンスルホナート(2.00 g、6.28 mmol)を用いて、化合物IIIc-3(1.52 g、収率67%)を得た。
ESI-MS m/z: 363(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.90(t, J= 6.6 Hz, 3H), 1.25-1.38(m, 18H), 1.53-1.62(m, 2H), 1.98-2.06(m, 4H), 3.07(s, 3H), 3.49(t, J= 6.6 Hz, 2H), 3.68-3.72(m, 2H), 4.36-4.40(m, 2H), 5.36(t, J= 5.5 Hz, 2H).
実施例13と同様の方法で、参考例7で得られる化合物IId-1(0.800 g、1.78 mmol)および、1-ブロモドデカンの代わりに参考例21で得られる化合物IIIc-2(0.728 g、1.86 mmol)を用い、化合物B-9(0.600 g、収率60%)を得た。
ESI-MS m/z: 560(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.86-0.94(m, 6H), 1.24-1.39(m, 40), 1.51-1.62(m, 2H), 1.96-2.10(m, 8H), 2.68(t,
J= 7.3 Hz, 2H), 2.78(t, J= 6.0 Hz, 2H), 2.85(t, J= 5.1 Hz, 2H), 3.45(t, J= 6.8 Hz, 2H), 3.57(t, J= 5.1 Hz, 2H), 5.30-5.44(m, 6H).
実施例13と同様の方法で、参考例7で得られる化合物IId-1(0.610 g、1.35 mmol)および、1-ブロモドデカンの代わりに参考例22で得られる化合物IIIc-3(0.589 g、1.62 mmol)を用い、化合物B-10(0.550 g、収率76%)を得た。
ESI-MS m/z: 532(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.85-0.93(m, 6H), 1.23-1.38(m, 34H), 1.45-1.54(m, 4H), 1.94-2.11(m, 8H), 2.60(t, J= 7.3 Hz, 2H), 2.77(t, J= 5.4 Hz, 4H), 3.43(t, J= 6.8 Hz, 2H), 3.53(t, J= 5.4 Hz, 2H), 5.29-5.44(m, 6H).
実施例10と同様の方法で、化合物B-1の代わりに実施例38で得られる化合物B-9(0.130 g、0.232 mmol)および、化合物VI-3の代わりに参考例5で得られる化合物VI-4(0.120 g、0.348 mmol)を用いて、化合物A-33(0.137 g、収率81%)を得た。
ESI-MS m/z: 729(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.84-0.92(m, 6H), 1.20-1.36(m, 38H), 1.40-1.62(m, 10H), 1.77-1.87(m, 2H), 1.96-2.09(m, 8H), 2.37(t, J= 7.5 Hz, 6H), 2.77(t, J= 5.9 Hz, 2H), 3.20-3.31(m, 2H), 3.40(t, J= 6.6 Hz, 4H), 3.45-3.56(m, 2H), 4.10(t, J= 6.4 Hz, 2H), 5.28-5.44(m, 6H).
実施例10と同様の方法で、化合物B-1の代わりに実施例38で得られる化合物B-9(0.130 g、0.232 mmol)を用いて、化合物A-34(0.131 g、収率79%)を得た。
ESI-MS m/z: 716(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.85-0.92(m, 6H), 1.20-1.39(38H, m), 1.47-1.61(m, 8H), 1.66-1.83(m, 2H), 1.93-2.18(10H, m), 2.32(s, 3H), 2.78(t, J= 5.9 Hz, 2H), 3.07(t, J= 8.4 Hz, 1H), 3.21-3.31(m, 2H), 3.41(t, J= 6.6 Hz, 4H), 3.47-3.56(m, 2H), 4.08-4.19(m, 2H), 5.29-5.43(m, 6H).
実施例10と同様の方法で、化合物B-1の代わりに実施例38で得られる化合物B-9(0.130 g、0.232 mmol)および、化合物VI-3の代わりに化合物VI-1(0.106 g、0.348 mmol)を用いて、化合物A-35(0.100 g、収率63%)を得た。
ESI-MS m/z: 690(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.85-0.92(m, 6H), 1.20-1.39(m, 38H), 1.45-1.59(m, 4H), 1.74-1.84(m, 2H), 1.96-2.09(m, 8H), 2.23(s, 6H), 2.34(t, J= 7.5 Hz, 2H), 2.77(t, J= 5.7 Hz, 2H), 3.21-3.30(m, 2H), 3.35-3.44(m, 4H), 3.45-3.55(m, 2H), 4.11(t, J= 6.4 Hz, 2H), 5.26-5.44(m, 6H).
実施例10と同様の方法で、化合物B-1の代わりに実施例39で得られる化合物B-10(0.150 g、0.282 mmol)および、化合物VI-3の代わりに化合物VI-1( 0.095 g, 0.310 mmol)を用いて、化合物A-36(0.148 g、収率79%)を得た。
ESI-MS m/z: 662(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.85-0.94(m, 6H), 1.21-1.39(m, 34H), 1.47-1.59(m, 4H), 1.76-1.84(m, 2H), 1.94-2.09(m, 8H), 2.23(s, 6H), 2.34(t, J= 7.3 Hz, 2H), 2.77(t, J= 6.3 Hz, 2H), 3.20-3.31(m, 2H), 3.31-3.45(m, 4H), 3.45-3.57(m, 2H), 4.11(t, J= 6.3 Hz, 2H), 5.27-5.46(m, 6H).
実施例10と同様の方法で、化合物B-1の代わりに実施例39で得られる化合物B-10(0.150 g、0.282 mmol)および、化合物VI-3の代わりに参考例5で得られる化合物VI-4(0.107 g、0.310 mmol)を用いて、化合物A-37(0.148 g、収率75%)を得た。
ESI-MS m/z: 702(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.82-0.96(m, 6H), 1.23-1.39(m, 34H), 1.39-1.48(m, 2H), 1.49-1.61(m, 8H), 1.79-1.86(m, 2H), 1.95-2.09(m, 8H), 2.33-2.42(m, 6H), 2.78(t, J= 6.8 Hz, 2H), 3.21-3.32(m, 2H), 3.34-3.44(m, 4H), 3.46-3.56(m, 2H), 4.10(t, J= 6.3 Hz, 2H), 5.29-5.44(m, 6H).
工程1
参考例11と同様の方法で、化合物B-1の代わりに実施例2で得られる化合物B-2(500 mg、0.965 mmol)を用い、3-(ジ((Z)-オクタデカ-9-エニル)アミノ)プロピオン酸エチル(548 mg、収率92%)を得た。
工程2
実施例21と同様の方法で、化合物XI-6の代わりに3-(ジ((Z)-オクタデカ-9-エニル)アミノ)プロピオン酸エチル(548 mg、0.887 mmol)を用い、化合物C-2(0.445 g, 収率87%)を得た。
ESI-MS m/z: 577(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.88(t, J= 6.9 Hz, 6H), 1.24-1.42(m, 44H), 1.42-1.50(m, 4H), 1.65-1.70(m, 2H), 2.01(q, J= 6.4 Hz, 8H), 2.40(t, J= 7.5 Hz, 4H), 2.63(t, J= 5.5 Hz, 2H), 3.79(t, J= 5.3 Hz, 2H), 5.30-5.39(m, 4H).
工程1
参考例11と同様の方法で、化合物B-1の代わりに実施例4で得られる化合物B-4(400 mg、0.702 mmol)を用い、3-(ジ((11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル)アミノ)プロピオン酸エチル(548 mg、収率90%)を得た。
工程2
実施例21と同様の方法で、化合物XI-6の代わりに3-(ジ((11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル)アミノ)プロピオン酸エチル(424 mg、0.633 mmol)を用い、化合物C-3(352 mg, 収率88%)を得た。
ESI-MS m/z: 629(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 6.9 Hz, 6H), 1.24-1.40(m, 40H), 1.42-1.50(m, 4H), 1.64-1.70(m, 2H), 2.02-2.08(m, 8H), 2.40(t, J= 7.5 Hz, 4H), 2.63(t, J= 5.3 Hz, 2H), 2.78(t, J= 6.4 Hz, 4H), 3.79(t, J= 5.0 Hz, 2H), 5.29-5.42(m, 8H).
工程1
実施例1で得られる化合物B-1(600 mg, 1.17 mmol)の1,2-ジクロロエタン(2.0 mL)溶液に炭酸カリウム(243 mg, 1.76 mmol)およびブロモ酢酸エチル(195 μL, 1.76 mmol)を加え、85℃で終夜攪拌した。得られた混合物に水を加えてヘプタンで2回抽出した。有機層を合わせて、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘプタン/酢酸エチル = 100/0〜95/5)で精製することにより2-(ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)アミノ)酢酸エチル(527 mg, 収率75%)を得た。
工程2
実施例21と同様の方法で、化合物XI-6の代わりに2-(ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)アミノ)酢酸エチル(527 mg、0.878 mmol)を用い、化合物C-4(433 mg, 収率88%)を得た。
ESI-MS m/z: 559(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 6.9 Hz, 6H), 1.24-1.39(m, 32H), 1.39-1.46(m, 4H), 2.02-2.08(m, 8H), 2.43(t, J= 7.5 Hz, 4H), 2.57(t, J= 5.3 Hz, 2H), 2.77(t, J= 6.2 Hz, 4H), 3.52(t, J= 5.5 Hz, 2H), 5.29-5.41(m, 8H).
工程1
実施例1で得られる化合物B-1(500 mg, 0.973 mmol)の1,2-ジクロロエタン(2.0 mL)溶液に炭酸カリウム(202 mg, 1.46 mmol)およびtert-ブチル(4-ヨードブトキシ)ジメチルシラン(SIGMA-ALDRICH社製, 378 μL, 1.46 mmol)を加え、85℃で4時間攪拌した。得られた混合物に水を加えてヘプタンで2回抽出した。有機層を合わせて、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘプタン/酢酸エチル = 95/5〜80/20)で精製することにより(4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)ブチル)ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)アミン(233 mg, 収率34%)を得た。
工程2
(4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)ブチル)ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)アミン(233 mg, 0.333 mmol)のテトラヒドロフラン(5 mL)溶液に、フッ化テトラブチルアンモニウム(1 mol/L テトラヒドロフラン溶液, 0.666 mL, 0.666 mmol)を加え、室温で終夜攪拌した。得られた混合物に飽和食塩水を加えて酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘプタン/酢酸エチル=90/10)で精製し、さらにシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/メタノール = 100/0〜90/10)で精製することにより化合物C-5(160 mg, 収率82%)を得た。
ESI-MS m/z: 587(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3) δ: 0.89(t, J= 6.9 Hz, 6H), 1.23-1.40(m, 32H), 1.43-1.51(m, 4H), 1.62-1.68(m, 4H), 2.05(q, J= 7.0 Hz, 8H), 2.41-2.45(m, 6H), 2.77(t, J= 6.6 Hz, 4H), 3.53-3.56(m, 2H), 5.29-5.42(m, 8H).
工程1
国際公開第2009/129395号パンフレット記載の方法で合成した2,3-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルオキシ)プロパン-1-オール(0.303 g, 0.514 mmol)のジクロロメタン(4 ml)溶液に、0℃でトリエチルアミン(0.108 ml, 0.772 mmol)とメシル酸クロリド(0.060 ml, 0.772 mmol)を加え、室温で3時間攪拌した。反応液に飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。
得られた残渣をジクロロメタン(4 mL)に溶解し、メチルアミン(7 mol/L メタノール溶液, 2.20 mL)を加えて、マイクロ波反応装置を用いて110℃で5分間攪拌した。反応液に水を加え、n-ヘキサンで抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル = 95/5〜70/30)で精製して、N-メチル-2,3-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ)プロパン-1-アミン(0.278 g, 収率90%)を得た。
ESI-MS m/z: 603(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.27-1.39(m, 34H), 1.51-1.58(m, 3H), 2.05(q, J= 7.1 Hz, 8H), 2.44(s, 3H), 2.64-2.70(m, 2H), 2.77(t, J = 6.9 Hz, 4H), 3.41-3.50(m, 5H), 3.54-3.58(m, 1H), 3.61-3.65(m, 1H), 5.30-5.41(m, 8H).
工程2
N-メチル-2,3-ビス((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ)プロパン-1-アミン(0.220 g, 0.365 mmol)のアセトニトリル(2 mL)懸濁液に化合物VI-1(0.167 g, 0.548 mmol)とトリエチルアミン0.255 mL, 1.827 mmol)を加えて、80℃で終夜攪拌した。反応液を飽和重曹水で希釈して酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧濃縮した。残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル = 80/20〜65/35)で精製して化合物XI-9(0.178 g, 収率67%)を得た。
ESI-MS m/z: 732(M + H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J = 6.9 Hz, 6H), 1.26-1.38(m, 32H), 1.51-1.59(m, 4H), 1.77-1.83(m, 2H), 2.05(q, J = 7.0 Hz, 8H), 2.22(s, 6H), 2.34(t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.77(t, J = 6.8 Hz, 4H), 2.97(s, 3H), 3.19-3.25(m, 1H), 3.38-3.65(m, 8H), 4.12(t, J = 6.3 Hz, 2H), 5.30-5.41(m, 8H).
化合物A-1〜5のそれぞれ/1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000)ナトリウム塩(PEG-DMPE Na、N-(カルボニルメトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン=ナトリウム塩、日油社製)/ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、日油社製)/コレステロール(日油社製)=8.947/1.078/5.707/13.698 mmol/Lとなるように、各試料を秤量し90 vol%エタノールに溶解させ、脂質膜の構成成分の溶液を調製した。一方、apo-b siRNA/蒸留水(24 mg/mL)をTris-EDTA緩衝液(200 mM Tris-HCl、20 mM EDTA、インヴィトロジェン(Invitrogen)製)および、20 mMクエン酸緩衝液(pH5.0)で希釈し、1.5 mg/mLのapo-b siRNA水溶液(2 mM Tris-EDTA緩衝液、20 mMクエン酸緩衝液、pH5.0)を調製した。
得られた脂質溶液を37℃に加温した後、500 μLを製剤調製用の容器に移し、得られたapo-b siRNA水溶液500 μLを攪拌下で加えた。得られた脂質核酸混合懸濁液1000 μLに、20 mM クエン酸緩衝液(300 mM NaCl含有、pH6.0)1000 μLを攪拌下で加え、さらにDPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、Invitrogen製)3310 μLを滴下して粗製剤を得た。得られた粗製剤はアミコンウルトラ(Millipore社製)を用いて濃縮後、DPBSで希釈し、0.2 μmのフィルター(東洋濾紙社製)を用いてクリーンベンチ内でろ過した。得られた組成物のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.3または0.03 mg/mLとなるようにDPBSを用いて希釈することで、製剤(化合物A-1〜5のそれぞれ、および核酸を含有する組成物)を得た。
粒子径測定装置(Zetasizer Nano ZS、マルバーン(Malvern)社製、以下同じ)で製剤(組成物)の平均粒子径を測定した。結果を第8表に示す。
化合物1を、特許文献1記載の方法に準じた方法で合成したDLin-KC2-DMAおよび参考例1〜3で得られた化合物(化合物XI-1〜3)にした以外、実施例49と同様にして製剤を得た。
比較例で用いた化合物(DLin-KC2-DMAおよび化合物XI-1〜3)の構造式を第9表に示す。
粒子径測定装置で製剤(組成物)の平均粒子径を測定した。結果を第10表に示す。
実施例49で得られた各製剤(化合物A-1,3〜5のそれぞれ、および核酸を含有する組成物)および比較例1で得られた各製剤(DLin-KC2-DMAおよび化合物XI-1〜3のそれぞれ、ならびに核酸を含有する組成物)につき、それぞれ以下の方法により、ヒト肝がん由来細胞株HepG2細胞(HB-8065)に導入した。
核酸の最終濃度が3-100nMとなるように、オプティメム(Opti-MEM、ギブコ(GIBCO)社、31985)で希釈した各製剤を、96ウェルの培養プレートに、20μLずつ分注した後、1.25%ウシ胎仔血清(FBS、SAFCバイオサイエンス(SAFC Biosciences)社、12203C)を含むOpti- MEMに懸濁させたHepG2細胞を、細胞数6250/80μL/ウェルとなるように播種し、37℃、5%CO2条件下で培養することで、各製剤をHepG2細胞内に導入した。また陰性対照の群として何も処理しない細胞を播種した。
各製剤を導入した細胞を37℃の5%CO2インキュベーター内で24時間培養し、氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水(PBS、GIBCO社、14190)で洗浄し、Cells-to-Ct Kit(アプライドバイオサイエンス(ABI)社、AM1728)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、全RNAの回収と、得られた全RNAを鋳型とする逆転写反応によるcDNAの作製とを行った。
得られたcDNAを鋳型とし、ユニバーサルプローブライブラリ(Universal Probe Library、ロシュ アプライドサイエンス(Roche Applied Science)社、04683633001)をプローブとして、ABI7900HT Fast(ABI社製)を用い、添付された使用説明書に記載された方法に従ってPCR反応させることにより、apo-b遺伝子および構成的発現遺伝子であるグリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素(D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、以下gapdhと表す)遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、gapdhのmRNA増幅量を内部対照として、apo-bのmRNAの準定量値を算出した。同様に測定した陰性対照におけるapo-bのmRNAの準定量値を1として、apo-bのmRNAの準定量値から、apo-bのmRNAの発現率を求めた。得られたapo-bのmRNAの発現率の結果を、図1に示す。
実施例49で得られた各製剤(化合物A-1〜5のそれぞれ、および核酸を含有する組成物)および比較例1で得られた各製剤(DLin-KC2-DMAおよび化合物XI-1〜3のそれぞれ、ならびに核酸を含有する組成物)につき、それぞれ以下の方法によりインビボ薬効評価試験を実施した。なお、各製剤は、試験に合わせてDPBSで希釈して用いた。
マウス(Balb/c、日本クレアより入手)を馴化飼育後、各製剤を、siRNA濃度で3ないし0.3 mg/kgでマウスに静脈内投与した。投与から48時間後に採血し、採取した血液を小型冷却遠心機(05PR-22:日立社製)を用いて3000 rpm、20分間、4℃で遠心分離した。Cholesterol Assay Kit(Cayman Chemical社製、Cat#:10007640)を用いて、製品の説明書に記載された方法に従い、標準液および、血清サンプル中の蛍光度をARVO(530 nm/595 nm)もしくはEnVision(531 nm/595 nm)で測定した。得られた蛍光度から検量線を作成し、血清中のコレステロール濃度を算出した。
算出された血清中のコレステロール濃度の結果を、図2および3に示す。
よって、本発明の組成物は、核酸を細胞内等に導入することができ、本発明のカチオン性脂質は、インビボで細胞内に核酸を送達することを容易にするカチオン性脂質であることが明らかとなった。
化合物A-6/PEG-DMPE Na(日油社製)/DSPC(日油社製)/コレステロール(日油社製)=3.532/0.270/1.156/2.401 mmol/Lとなるように、各試料を秤量し100 vol%エタノールに溶解させ、脂質膜の構成成分の溶液を調製した。一方、f7 siRNA/蒸留水(24 mg/mL)をTris-EDTA緩衝液(200 mM Tris-HCl、20 mM EDTA、インヴィトロジェン(Invitrogen)製)および、20 mMクエン酸緩衝液(pH4.0)で希釈し、0.375 mg/mLのf7 siRNA水溶液(2 mM Tris-EDTA緩衝液、20 mMクエン酸緩衝液、pH4.0)を調製した。
得られた脂質溶液を37℃に加温した後、800 μLを製剤調製用の容器に移し、得られたf7 siRNA水溶液800 μLを攪拌下で加えた。得られた脂質核酸混合懸濁液1600 μLに、20 mM クエン酸緩衝液(300 mM NaCl含有、pH6.0)1600 μLを攪拌下で加え、さらにDPBS(Invitrogen製)7086 μLを滴下して粗製剤を得た。得られた粗製剤はアミコンウルトラ(Millipore社製)を用いて濃縮後、DPBSで希釈し、0.45 μmのフィルター(東洋濾紙社製)を用いてクリーンベンチ内でろ過した。得られた組成物のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.03 mg/mLとなるようにDPBSを用いて希釈することで、製剤(化合物A-6および核酸を含有する組成物)を得た。
粒子径測定装置で製剤(組成物)の平均粒子径を測定した。結果を第11表に示す。
粒子径測定装置で製剤(組成物)の平均粒子径を測定した。結果を第11表に示す。
化合物A-6を、参考例9〜13で得られた化合物(化合物XI-4〜8)にした以外、実施例50と同様にして製剤を得た。
比較例2で用いた化合物(化合物XI-4〜8)の構造式を第12表に示す。
粒子径測定装置で製剤(組成物)の平均粒子径を測定した。結果を第13表に示す。
実施例50および51で得られた各製剤(化合物A-1、A-5〜21、A-28〜36、B-1、B-8およびC-1〜5のそれぞれ、および核酸を含有する組成物)および比較例2で得られた各製剤(化合物XI-4〜8および核酸を含有する組成物)につき、それぞれ以下の方法によりインビボ薬効評価試験を実施した。なお、各製剤は、試験に合わせてDPBSまたは生理食塩水で希釈して用いた。
マウス(Balb/c、日本クレアより入手)を馴化飼育後、各製剤を、siRNA濃度で0.3、0.1および/または0.03mg/kgとでマウスに静脈内投与した。投与から48時間後に採血し、採取した血液を微量高速冷却遠心機(TOMY MX305:トミー精工社製)を用いて8000rpm、8分間、4℃で遠心分離した。BIOPHEN VII kit(ANIARA社製 cat#: A221304)を用いて、製品の説明書に記載された方法に従い、標準液および、血漿サンプル中の吸光度をARVO(405nm)で測定した。得られた吸光度から検量線を作成し、血漿中のFactor VIIタンパク濃度を算出した。なお例数は各群3匹とした。
算出された血漿中のFactor VIIタンパク濃度の結果を、図4〜9に示す。
よって、本発明の組成物は、核酸を細胞内等に導入することができ、本発明のカチオン性脂質は、インビボで細胞内に核酸を送達することを容易にするカチオン性脂質であることが明らかとなった。
核酸としては、実施例50で用いたものと同じ核酸を、蒸留水で24 mg/mLに調製して用いた。
化合物A-1/PEG-DMPE Na(日油社製)=57.3/5.52 mmol/Lとなるように、各試料を秤量し、塩酸およびエタノールを含有する水溶液に懸濁させ、vortex攪拌ミキサーで攪拌および、加温を繰り返して均一な懸濁液を得た。この懸濁液を室温下で、0.2 μmのポリカーボネートメンブランフィルターに通し、さらに0.05 μmのポリカーボネートメンブランフィルターに通し、化合物A-1/PEG-DMPE Naの粒子(リポソーム)の分散液を得た。粒子径測定装置で得られたリポソームの平均粒子径を測定し、30 nmから100 nmの範囲内であることを確認した。得られたリポソームの分散液と、f7 siRNA溶液を、リポソームの分散液:f7 siRNA 溶液=3:1の割合で混合し、さらに3倍量の蒸留水を加えて混合することで化合物A-1/PEG-DMPE Na/ f7 siRNA複合体の分散液を調製した。
一方、A-1/PEG-DMPE Na(日油社製)/DSPC(日油社製)/コレステロール(日油社製)= 8.947/1.078/5.707/13.698 mmol/Lとなるように、各試料を秤量し90 vol%エタノールに溶解させ、脂質膜構成成分の溶液を調製した。
得られた脂質膜構成成分の溶液を加温した後、得られた化合物A-1/PEG-DMPE Na/ f7 siRNA複合体の分散液と、1:1の割合で混合し、さらに数倍量の蒸留水を混合し、粗製剤を得た。
得られた粗製剤はアミコンウルトラ(Millipore社製)を用いて濃縮後、生理食塩水で希釈し、0.2 μmのフィルター(東洋濾紙社製)を用いてクリーンベンチ内でろ過した。得られた組成物のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.03、0.01または0.003 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤(化合物A-1および核酸を含有する組成物)を得た。
粒子径測定装置で製剤(組成物)の平均粒子径を測定した。結果を第14表に示す。
粒子径測定装置で製剤(組成物)の平均粒子径を測定した。結果を第14表に示す。
化合物A-1を、参考例23で得られた化合物XI-9にした以外、実施例52と同様にして製剤を得た。
比較例3で用いた化合物(化合物XI-9)の構造式を第12表に示す。
粒子径測定装置で製剤(組成物)の平均粒子径を測定した。結果を第13表に示す。
実施例52および53で得られた各製剤または実施例52もしくは53と同様にして得られた製剤(化合物A-1、A-5〜7、A-10、A-12〜21、A-28〜36、B-8およびC-1〜5のそれぞれ、および核酸を含有する組成物)、および比較例3で得られた製剤(化合物XI-9および核酸を含有する組成物)につき、試験例3と同様の方法によりインビボ薬効評価試験を実施した。算出された血漿中のFactor VIIタンパク濃度の結果を、図10〜13に示す。
化合物A-1、A-7またはA-10のそれぞれ/PEG-DMPE Na(日油社製)/DSPC(日油社製)/コレステロール(日油社製)=7.030/0.755/2.038/4.892 mmol/Lとなるように、各試料を秤量し100 vol%エタノールに溶解させ、脂質膜の構成成分の溶液を調製した。一方、f7 siRNA/蒸留水(24 mg/mL)をTris-EDTA緩衝液(200 mM Tris-HCl、20 mM EDTA、インヴィトロジェン(Invitrogen)製)および、20 mMクエン酸緩衝液(pH4.0)で希釈し、0.536 mg/mLのf7 siRNA水溶液(2 mM Tris-EDTA緩衝液、20 mMクエン酸緩衝液、pH4.0)を調製した。
得られた脂質溶液を37℃に加温した後、560 μLを製剤調製用の容器に移し、得られたf7 siRNA水溶液560 μLを攪拌下で加えた。得られた脂質核酸混合懸濁液1120 μLに、20 mM クエン酸緩衝液(300 mM NaCl含有、pH6.0)1120 μLを攪拌下で加え、さらにDPBS(Invitrogen製)4960 μLを滴下して粗製剤を得た。得られた粗製剤はアミコンウルトラ(Millipore社製)を用いて濃縮後、DPBSで希釈し、0.45 μmのフィルター(東洋濾紙社製)を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた組成物のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で0.03または0.01 mg/mLとなるようにDPBSを用いて希釈することで、製剤(化合物A-1、A-7およびA-10のそれぞれ、および核酸を含有する組成物)を得た。
粒子径測定装置で製剤(組成物)の平均粒子径を測定した。結果を第15表に示す。
実施例54で得られた各製剤(化合物A-1、A-7もしくはA-10のそれぞれ、および核酸を含有する組成物)につき、試験例3と同様の方法によりインビボ薬効評価試験を実施した。算出された血漿中のFactor VIIタンパク濃度の結果を、図14に示す。
配列番号2-アポリポプロテインB siRNA アンチセンス鎖
配列番号3-血液凝固第7因子 siRNA センス鎖
配列番号4-血液凝固第7因子 siRNA アンチセンス鎖
Claims (22)
- 式(A)
R2は炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニル、アルコキシエチル、アルコキシプロピル、アルケニルオキシエチル、アルケニルオキシプロピル、アルキニルオキシエチルまたはアルキニルオキシプロピルであり、
R3およびR4は、同一または異なって炭素数1〜3のアルキルであるか、または一緒になって炭素数2〜8のアルキレンを形成するか、またはR3はR5と一緒になって炭素数2〜8のアルキレンを形成し、
R5は、水素原子、炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、アミノ、モノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイルもしくはジアルキルカルバモイルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであるか、またはR3と一緒になって炭素数2〜8のアルキレンを形成し、
X1は、炭素数1〜6のアルキレンであり、
X2は、単結合であるか、または炭素数1〜6のアルキレンであり、ただし、X1とX2の炭素数の和は7以下であり、R5が、水素原子の場合、X2は単結合であり、R5がR3と一緒になって炭素数2〜6のアルキレンを形成する場合、X2は単結合であるか、またはメチレンもしくはエチレンである)、
式(B)
R7は炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニル、アルコキシエチル、アルコキシプロピル、アルケニルオキシエチル、アルケニルオキシプロピル、アルキニルオキシエチルまたはアルキニルオキシプロピルである)、または
式(C)
R9は炭素数8〜24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニル、アルコキシエチル、アルコキシプロピル、アルケニルオキシエチル、アルケニルオキシプロピル、アルキニルオキシエチルまたはアルキニルオキシプロピルであり、
X3は、炭素数1〜3のアルキレンであり、
R10は、水素原子または炭素数1〜3のアルキルである)で表されるカチオン性脂質。 - R1、R2、R6、R7、R8およびR9が、それぞれテトラデシル、ヘキサデシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルまたは(Z)-ドコサ-13-エニルである請求項1記載のカチオン性脂質。
- R1、R2、R6、R7、R8およびR9が、それぞれヘキサデシル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(Z)-イコサ-11-エニルまたは(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルである請求項1記載のカチオン性脂質。
- X1が、炭素数1〜3のアルキレンであり、X2が、単結合またはメチレンである請求項1〜3のいずれかに記載のカチオン性脂質。
- X3が、メチレンまたはエチレンである請求項1〜4のいずれかに記載のカチオン性脂質。
- R3およびR4が、同一もしくは異なってメチルもしくはエチル、または一緒になってn-ペンチレンまたはn-ヘキシレンを形成する請求項1〜5のいずれかに記載のカチオン性脂質。
- R3およびR5が、一緒になってn-プロピレンまたはn-ブチレンを形成し、R4が、メチルまたはエチルである請求項1〜6のいずれかに記載のカチオン性脂質。
- R5およびR10が、それぞれ水素原子またはメチルである請求項1〜7のいずれかに記載のカチオン性脂質。
- 請求項1〜8のいずれかに記載のカチオン性脂質および核酸を含有する組成物。
- 該カチオン性脂質と該核酸とが複合体を形成しているか、または該カチオン性脂質に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと該核酸とが複合体を形成している、請求項9記載の組成物。
- 該カチオン性脂質と該核酸とが複合体を形成しているか、または該カチオン性脂質に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと該核酸とが複合体を形成しており、該複合体を封入する脂質膜を含有する請求項9記載の組成物。
- 核酸がRNA干渉(RNAi)を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有する核酸である請求項9〜11のいずれかに記載の組成物。
- 標的遺伝子が、肝臓、肺、腎臓または脾臓において発現する遺伝子である請求項12記載の組成物。
- 請求項9〜13のいずれかに記載の組成物を用いて該核酸を細胞内に導入する方法。
- 細胞が、ほ乳類の肝臓、肺、腎臓または脾臓にある細胞である請求項14記載の方法。
- 細胞内に導入する方法が、該組成物の静脈内投与によって細胞内に導入する方法である請求項14または15に記載の方法。
- 請求項13に記載の組成物を哺乳動物に投与する工程を含む、肝臓、肺、腎臓または脾臓に関連する疾患の治療方法。
- 投与する方法が、静脈内投与である請求項17記載の方法。
- 請求項12に記載の組成物を含む、疾患の治療に用いるための医薬。
- 静脈内投与用である請求項19記載の医薬。
- 請求項13に記載の組成物を含む、肝臓、肺、腎臓または脾臓に関連する疾患の治療剤。
- 静脈内投与用である請求項21記載の肝臓、肺、腎臓または脾臓に関連する疾患の治療剤。
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