KR20150036316A - 양이온성 지질 - Google Patents

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nucleic acid
mmol
lipid
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다케시 구보야마
도모히로 에라
도모유키 나오이
가오리 야기
신타로 호소에
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교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤
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Abstract

핵산을, 예컨대, 세포 내 등에 도입하는 것을 용이하게 하는, 식(A)(식에서, R1은 알케닐 등이고, R2는 알케닐 등이고, R3 및 R4는, 알킬이거나, 또는 함께 결합하여 알킬렌을 형성하거나, 또는 R3은 R5와 함께 결합하여 알킬렌을 형성하고, R5는, 수소 원자 등이거나, 또는 R3과 함께 결합하여 알킬렌을 형성하고, X1은 알킬렌이고, X2는 단결합이거나, 또는 알킬렌이다)으로 나타내어지는 양이온성 지질 등, 상기 양이온성 지질 및 핵산을 함유하는 조성물, 상기 양이온성 지질 및 핵산을 함유하는 조성물을 이용하여 핵산을 세포 내에 도입하는 방법 등을 제공한다.
Figure pct00038

Description

양이온성 지질{CATIONIC LIPID}
본 발명은, 핵산을, 예컨대, 세포 내 등에 도입하는 것을 용이하게 하는 양이온성 지질, 이 양이온성 지질을 함유하는 조성물 등에 관한 것이다.
양이온성 지질은, 하나 또는 복수의 탄화수소기를 포함하는 지질 친화성 영역과, 적어도 하나의 플러스로 대전한 극성 헤드 그룹을 포함하는 친수성 영역을 갖는 양친매성 분자이다. 양이온성 지질과 핵산 등의 거대 분자가, 총 하전으로서 플러스로 대전하는 복합체를 형성함으로써, 핵산 등의 거대 분자가 세포의 원형질막을 통과하여 세포질에 들어가기 쉽게 되기 때문에, 양이온성 지질은 유용하다. 인비트로 및 인비보에 있어서 행할 수 있는 이 프로세스는 트랜스펙션으로서 알려져 있다.
특허문헌 1 및 2는, 인비보로 핵산을 세포 내에 송달하기 위해서, 그리고 질환의 치료에 적합한 핵산-지질 입자 조성물에 사용하기 위해서 유리한 양이온성 지질 및 이 지질을 포함하는 지질 입자를 개시하고 있다. 특허문헌 1에는, 예컨대,
Figure pct00001
2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(2,2-dilinoleyl-4-(2-dimethylaminoethyl)-[1,3]-dioxolane; DLin-KC2-DMA) 등, 특허문헌 2에는, 예컨대,
Figure pct00002
(6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트((6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-yl 4-(dimethylamino)butanoate; DLin-MC3-DMA) 등의 양이온성 지질이 개시되어 있다.
특허문헌 1: 국제공개 제2010/042877호 팜플렛 특허문헌 2: 국제공개 제2010/054401호 팜플렛
본 발명의 목적은, 핵산을, 예컨대, 세포 내 등에 도입하는 것을 용이하게 하는 양이온성 지질, 이 양이온성 지질을 함유하는 조성물 등을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 이하의 (1)~(22)에 관한 것이다.
(1) 식(A)
Figure pct00003
(식에서, R1은, 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐이고,
R2는, 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐, 알콕시에틸, 알콕시프로필, 알케닐옥시에틸, 알케닐옥시프로필, 알키닐옥시에틸 또는 알키닐옥시프로필이고,
R3 및 R4는, 동일하거나 또는 상이하며 탄소수 1~3의 알킬이거나, 또는 함께 결합하여 탄소수 2~8의 알킬렌을 형성하거나, 또는 R3은 R5와 함께 결합하여 탄소수 2~8의 알킬렌을 형성하고,
R5는, 수소 원자, 탄소수 1~6의 알킬, 탄소수 3~6의 알케닐, 아미노, 모노알킬아미노, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일 또는 동일하거나 혹은 상이한 1~3개의 아미노, 모노알킬아미노, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일 혹은 디알킬카르바모일로 치환된 탄소수 1~6의 알킬 혹은 탄소수 3~6의 알케닐이거나, 또는 R3과 함께 결합하여 탄소수 2~8의 알킬렌을 형성하고,
X1은 탄소수 1~6의 알킬렌이고,
X2는 단결합이거나, 또는 탄소수 1~6의 알킬렌이고, 단, X1과 X2의 탄소수의 합은 7 이하이고, R5가 수소 원자인 경우, X2는 단결합이고, R5가 R3과 함께 결합하여 탄소수 2~6의 알킬렌을 형성하는 경우, X2는 단결합이거나, 또는 메틸렌 혹은 에틸렌이다),
식(B)
Figure pct00004
(식에서, R6은 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐이고,
R7은 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐, 알콕시에틸, 알콕시프로필, 알케닐옥시에틸, 알케닐옥시프로필, 알키닐옥시에틸 또는 알키닐옥시프로필이다), 또는
식(C)
Figure pct00005
(식에서, R8은, 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐이고,
R9는, 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐, 알콕시에틸, 알콕시프로필, 알케닐옥시에틸, 알케닐옥시프로필, 알키닐옥시에틸 또는 알키닐옥시프로필이고,
X3은 탄소수 1~3의 알킬렌이고,
R10은 수소 원자 또는 탄소수 1~3의 알킬이다)으로 나타내어지는 양이온성 지질.
(2) R1, R2, R6, R7, R8 및 R9가, 각각 테트라데실, 헥사데실, (Z)-테트라데카-9-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (E)-옥타데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-11-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (9Z,12Z,15Z)-옥타데카-9,12,15-트리에닐, (Z)-이코사-11-에닐, (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐 또는 (Z)-도코사-13-에닐인 상기 (1)에 기재한 양이온성 지질.
(3) R1, R2, R6, R7, R8 및 R9가, 각각 (Z)-옥타데카-9-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐 또는 (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐인 상기 (1)에 기재한 양이온성 지질.
(4) X1이 탄소수 1~3의 알킬렌이고, X2가 단결합 또는 메틸렌인 상기 (1)~(3) 중 어느 것에 기재한 양이온성 지질.
(5) X3이 메틸렌 또는 에틸렌인 상기 (1)~(4) 중 어느 것에 기재한 양이온성 지질.
(6) R3 및 R4가, 동일하거나 혹은 상이하며 메틸 혹은 에틸, 또는 함께 결합하여 n-펜틸렌 또는 n-헥실렌을 형성하는 상기 (1)~(5) 중 어느 것에 기재한 양이온성 지질.
(7) R3 및 R5가 함께 결합하여 n-프로필렌 또는 n-부틸렌을 형성하고, R4가 메틸 또는 에틸인 상기 (1)~(5) 중 어느 것에 기재한 양이온성 지질.
(8) R5 및 R10이 각각 수소 원자 또는 메틸인 상기 (1)~(7) 중 어느 것에 기재한 양이온성 지질.
(9) 상기 (1)~(8) 중 어느 것에 기재한 양이온성 지질 및 핵산을 함유하는 조성물.
(10) 상기 양이온성 지질과 상기 핵산이 복합체를 형성하고 있거나, 또는 상기 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 상기 핵산이 복합체를 형성하고 있는 상기 (9)에 기재한 조성물.
(11) 상기 양이온성 지질과 상기 핵산이 복합체를 형성하고 있거나, 또는 상기 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 상기 핵산이 복합체를 형성하고 있고, 상기 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하는 상기 (9)에 기재한 조성물.
(12) 핵산이 RNA 간섭(RNAi)을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 작용을 갖는 핵산인 상기 (9)~(11) 중 어느 것에 기재한 조성물.
(13) 표적 유전자가, 간장, 폐, 신장 또는 비장에서 발현되는 유전자인 상기 (12)에 기재한 조성물.
(14) 상기 (9)~(13) 중 어느 것에 기재한 조성물을 이용하여 상기 핵산을 세포 내에 도입하는 방법.
(15) 세포가 포유류의 간장, 폐, 신장 또는 비장에 있는 세포인 상기 (14)에 기재한 방법.
(16) 세포 내에 도입하는 방법이, 상기 조성물의 정맥내 투여에 의해서 세포 내에 도입하는 방법인 상기 (14) 또는 (15)에 기재한 방법.
(17) 상기 (13)에 기재한 조성물을 포유동물에게 투여하는 공정을 포함하는, 간장, 폐, 신장 또는 비장에 관련된 질환의 치료 방법.
(18) 투여하는 방법이 정맥내 투여인 상기 (17)에 기재한 방법.
(19) 상기 (12)에 기재한 조성물을 포함하는, 질환의 치료에 이용하기 위한 의약.
(20) 정맥내 투여용인 상기 (19)에 기재한 의약.
(21) 상기 (13)에 기재한 조성물을 포함하는, 간장, 폐, 신장 또는 비장에 관련된 질환의 치료제.
(22) 정맥내 투여용인 상기 (21)에 기재한 간장, 폐, 신장 또는 비장에 관련된 질환의 치료제.
본 발명의 양이온성 지질 및 핵산을 함유하는 조성물을 포유류 등에 투여함으로써, 그 핵산을 예컨대 세포 내 등에 용이하게 도입할 수 있다.
도 1은 실시예 49에서 얻어진 제제(화합물 A-1, 3~5의 각각을 이용한 제제) 및 비교예 1에서 얻어진 제제(DLin-KC2-DMA 및 화합물 XI-1~3의 각각을 이용한 제제)를, 인간 간암 유래 세포주 HepG2 세포 내에 도입한 후의, 표적 유전자의 mRNA의 발현율을 나타낸다. 종축은 음성 대조를 1로 한 경우의 표적 유전자의 mRNA의 발현율을 나타내고, 횡축은 핵산 농도(nM), 사용한 양이온성 지질의 화합물 번호를 나타낸다.
도 2는 실시예 49에서 얻어진 제제(화합물 A-1~5의 각각을 이용한 제제) 및 비교예 1에서 얻어진 제제(DLin-KC2-MDA를 이용한 제제)에 관해서, 각각 마우스에게 siRNA 0.3 mg/kg 상당량을 투여한 48시간 후의 혈청 중 콜레스테롤의 값을 나타낸다. 종축은 생리식염수 투여군을 100으로 한 경우의 혈청 중 콜레스테롤치의 상대치를 나타낸다.
도 3은 실시예 49에서 얻어진 제제(화합물 A-1~5의 각각을 이용한 제제) 및 비교예 1에서 얻어진 제제(DLin-KC2-MDA 및 화합물 XI-1~3의 각각을 이용한 제제)에 관해서, 각각 마우스에게 siRNA 3 mg/kg 상당량을 투여한 48시간 후의 혈청 중의 콜레스테롤의 값을 나타낸다. 종축은 생리식염수 투여군을 100으로 한 경우의 혈청 중의 콜레스테롤치의 상대치를 나타낸다.
도 4는 실시예 50 혹은 51에서 얻어진 제제(화합물 A-6, A-1, A-7 및 A-8의 각각을 이용한 제제)에 관해서, 각각 마우스에게 siRNA 0.3 mg/kg 상당량을 투여한 48시간 후의 혈장 중 인자 VII 단백질의 농도를 나타낸다. 종축은 생리식염수 투여군을 100으로 한 경우의 혈장 중 인자 VII 단백질의 농도의 상대치를 나타낸다.
도 5는 실시예 51에서 얻어진 제제(화합물 A-9~12, B-1, B-8 및 C-1의 각각을 이용한 제제)에 관해서, 각각 마우스에게 siRNA 0.3 mg/kg 상당량을 투여한 48시간 후의 혈장 중 인자 VII 단백질의 농도를 나타낸다. 종축은 생리식염수 투여군을 100으로 한 경우의 혈장 중 인자 VII 단백질의 농도의 상대치를 나타낸다.
도 6은 실시예 51에서 얻어진 제제(화합물 A-5 및 A-13~21의 각각을 이용한 제제)에 관해서, 각각 마우스에게 siRNA 0.3 mg/kg 상당량을 투여한 48시간 후의 혈장 중 인자 VII 단백질의 농도를 나타낸다. 종축은 생리식염수 투여군을 100으로 한 경우의 혈장 중 인자 VII 단백질의 농도의 상대치를 나타낸다.
도 7은 실시예 51에서 얻어진 제제(화합물 A-28~36의 각각을 이용한 제제)에관해서, 각각 마우스에게 siRNA 0.3 mg/kg 상당량을 투여한 48시간 후의 혈장 중 인자 VII 단백질의 농도를 나타낸다. 종축은 생리식염수 투여군을 100으로 한 경우의 혈장 중 인자 VII 단백질의 농도의 상대치를 나타낸다.
도 8은 실시예 51에서 얻어진 제제(화합물 C-2~5의 각각을 이용한 제제)에 관해서, 각각 마우스에게 siRNA 0.3 mg/kg 상당량을 투여한 48시간 후의 혈장 중 인자 VII 단백질의 농도를 나타낸다. 종축은 생리식염수 투여군을 100으로 한 경우의 혈장 중 인자 VII 단백질의 농도의 상대치를 나타낸다.
도 9는 비교예 2에서 얻어진 제제(화합물 XI-4~8의 각각을 이용한 제제)에 관해서, 각각 마우스에게 siRNA 0.3 mg/kg 상당량을 투여한 48시간 후의 혈장 중 인자 VII 단백질의 농도를 나타낸다. 종축은 생리식염수 투여군을 100으로 한 경우의 혈장 중 인자 VII 단백질의 농도의 상대치를 나타낸다.
도 10은 실시예 52 혹은 53에서 얻어진 제제(화합물 A-1, A-6, A-7, A-10, A-12, B-8 및 C-1의 각각을 이용한 제제)에 관해서, 각각 마우스에게 siRNA 0.3 또는 0.1 mg/kg 상당량을 투여한 48시간 후의 혈장 중 인자 VII 단백질의 농도를 나타낸다. 종축은 생리식염수 투여군을 100으로 한 경우의 혈장 중 인자 VII 단백질의 농도의 상대치를 나타낸다. ■는 0.3 mg/kg 투여군, □은 0.1 mg/kg 투여군을 나타낸다.
도 11은 실시예 53에서 얻어진 제제(화합물 A-5 및 A-13~21의 각각을 이용한 제제)에 관해서, 각각 마우스에게 siRNA 0.3 또는 0.03 mg/kg 상당량을 투여한 48시간 후의 혈장 중 인자 VII 단백질의 농도를 나타낸다. 종축은 생리식염수 투여군을 100으로 한 경우의 혈장 중 인자 VII 단백질의 농도의 상대치를 나타낸다. ■는 0.3 mg/kg 투여군, □은 0.03 mg/kg 투여군을 나타낸다.
도 12는 실시예 53에서 얻어진 제제(화합물 A-28~36의 각각을 이용한 제제)에 관해서, 각각 마우스에게 siRNA 0.3 또는 0.03 mg/kg 상당량을 투여한 48시간 후의 혈장 중 인자 VII 단백질의 농도를 나타낸다. 종축은 생리식염수 투여군을 100으로 한 경우의 혈장 중 인자 VII 단백질의 농도의 상대치를 나타낸다. ■는 0.3 mg/kg 투여군, □은 0.03 mg/kg 투여군을 나타낸다.
도 13은 실시예 53에서 얻어진 제제 또는 실시예 52 혹은 53과 같은 식으로 하여 얻어진 제제(화합물 A-1, A-6, A-10 및 C-1~5의 각각을 이용한 제제) 및 비교예 3에서 얻어진 제제(화합물 XI-9를 이용한 제제)에 관해서, 각각 마우스에게 siRNA 0.3 또는 0.03 mg/kg 상당량을 투여한 48시간 후의 혈장 중 인자 VII 단백질의 농도를 나타낸다. 종축은 생리식염수 투여군을 100으로 한 경우의 혈장 중 인자 VII 단백질의 농도의 상대치를 나타낸다. ■는 0.3 mg/kg 투여군, □은 0.03 mg/kg 투여군을 나타낸다.
도 14는 실시예 54에서 얻어진 제제(화합물 A-1, A-7 및 A-10의 각각을 이용한 제제)에 관해서, 각각 마우스에게 siRNA 0.3 또는 0.1 mg/kg 상당량을 투여한 48시간 후의 혈장 중 인자 VII 단백질의 농도를 나타낸다. 종축은 생리식염수 투여군을 100으로 한 경우의 혈장 중 인자 VII 단백질의 농도의 상대치를 나타낸다. ■는 0.3 mg/kg 투여군, □은 0.1 mg/kg 투여군을 나타낸다.
본 발명의 양이온성 지질은,
식(A)
Figure pct00006
(식에서, R1은, 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐이고,
R2는, 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐, 알콕시에틸, 알콕시프로필, 알케닐옥시에틸, 알케닐옥시프로필, 알키닐옥시에틸 또는 알키닐옥시프로필이고,
R3 및 R4는, 동일하거나 또는 상이하며 탄소수 1~3의 알킬이거나, 또는 함께 결합하여 탄소수 2~8의 알킬렌을 형성하거나, 또는 R3은 R5와 함께 결합하여 탄소수 2~6의 알킬렌을 형성하고,
R5는, 수소 원자, 탄소수 1~6의 알킬, 탄소수 3~6의 알케닐, 아미노, 모노알킬아미노, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일 또는 동일하거나 혹은 상이한 1~3개의 아미노, 모노알킬아미노, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일 혹은 디알킬카르바모일로 치환된 탄소수 1~6의 알킬 혹은 탄소수 3~6의 알케닐이거나, 또는 R3과 함께 결합하여 탄소수 2~8의 알킬렌을 형성하고,
X1은 탄소수 1~6의 알킬렌이고,
X2는 단결합이거나 또는 탄소수 1~6의 알킬렌이고, 단, X1과 X2의 탄소수의 합은 7 이하이고, R5가 수소 원자인 경우, X2는 단결합이고, R5가 R3과 함께 결합하여 탄소수 2~6의 알킬렌을 형성하는 경우, X2는 단결합이거나, 또는 메틸렌 혹은 에틸렌이다),
식(B)
Figure pct00007
(식에서, R6은, 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐이고,
R7은, 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐, 알콕시에틸, 알콕시프로필, 알케닐옥시에틸, 알케닐옥시프로필, 알키닐옥시에틸 또는 알키닐옥시프로필이다), 또는
식(C)
Figure pct00008
(식에서, R8은, 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐이고,
R9는, 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐, 알콕시에틸, 알콕시프로필, 알케닐옥시에틸, 알케닐옥시프로필, 알키닐옥시에틸 또는 알키닐옥시프로필이고,
X3은 탄소수 1~3의 알킬렌이고,
R10은 수소 원자 또는 탄소수 1~3의 알킬이다)으로 나타내어지는 양이온성 지질이다.
이하, 식(A)으로 나타내어지는 화합물을 화합물(A)이라고 하는 경우도 있다. 다른 식 번호의 화합물에 관해서도 마찬가지이다.
탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬로서는, 예컨대 옥틸, 데실, 도데실, 트리데실, 테트라데실, 2,6,10-트리메틸운데실, 펜타데실, 3,7,11-트리메틸도데실, 헥사데실, 헵타데실, 옥타데실, 6,10,14-트리메틸펜타데칸-2-일, 노나데실, 2,6,10,14-테트라메틸펜타데실, 이코실, 3,7,11,15-테트라메틸헥사데실, 헤니코실, 도코실, 트리코실, 테트라코실 등을 들 수 있다.
탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알케닐로서는, 1 이상의 이중 결합을 포함하는 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알케닐이면 되고, 예컨대 (Z)-테트라데카-9-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (E)-옥타데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-11-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (9Z,12Z,15Z)-옥타데카-9,12,15-트리에닐, (Z)-이코사-11-에닐, (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐, 3,7,11-트리메틸도데카-2,6,10-트리에닐, 3,7,11,15-테트라메틸헥사데카-2-에닐, (Z)-도코사-13-에닐 등을 들 수 있고, 바람직하게는 (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (Z)-이코사-11-에닐, (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐, (Z)-도코사-13-에닐 등을 들 수 있다.
탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알키닐로서는, 1 이상의 삼중 결합을 포함하는 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알키닐이면 되고, 예컨대 도데카-11-이닐, 테트라데카-6-이닐, 헥사데카-7-이닐, 헥사데카-5,7-디이닐, 옥타데카-9-이닐 등을 들 수 있다.
알콕시에틸 및 알콕시프로필에 있어서의 알킬 부분으로서는, 예컨대 상기 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬의 예시에서 예로 든 기 등을 들 수 있다.
알케닐옥시에틸 및 알케닐옥시프로필에 있어서의 알케닐 부분으로서는, 예컨대 상기 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알케닐의 예시에서 예로 든 기 등을 들 수 있다.
알키닐옥시에틸 및 알키닐옥시프로필에 있어서의 알키닐 부분으로서는, 예컨대 상기 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알키닐의 예시에서 예로 든 기 등을 들 수 있다.
한편, R1 및 R2는, 동일하거나 또는 상이하며 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬 또는 알케닐인 것이 보다 바람직하고, 동일하거나 또는 상이하며 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알케닐인 것이 더욱 바람직하고, 동일하거나 또는 상이하며 탄소수 8~24의 직쇄상의 알케닐인 것이 더욱 바람직하다. 또한, R1 및 R2는, 동일한 것이 보다 바람직하고, 그 경우에는, 탄소수 12~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬, 알케닐 또는 알키닐인 것이 보다 바람직하고, 탄소수 12~24의 직쇄상의 알케닐인 것이 더욱 바람직하다.
R1 및 R2가 상이한 경우에는, R1이 탄소수 16~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, R2가 탄소수 8~12의 직쇄상 또는 분기상의 알킬, 알케닐 또는 알키닐인 것도 본 발명의 바람직한 형태의 하나이다. 이 경우, R1이 탄소수 16~24의 직쇄상의 알케닐이고, R2가 탄소수 8~12의 직쇄상의 알킬인 것이 보다 바람직하고, R1이 (Z)-옥타데카-9-에닐 또는 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐이고, R2가 옥틸, 데실 또는 도데실인 것이 가장 바람직하다. 또한, R1 및 R2가 상이한 경우에는, R1이 탄소수 12~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, R2가 알콕시에틸, 알콕시프로필, 알케닐옥시에틸, 알케닐옥시프로필, 알키닐옥시에틸 또는 알키닐옥시프로필인 것도 본 발명의 바람직한 형태의 하나이다. 이 경우, R1이 탄소수 16~24의 직쇄상의 알케닐이고, R2가 알케닐옥시에틸인 것이 보다 바람직하고, R1이 (Z)-옥타데카-9-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐 또는 (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐이고, R2가 (Z)-옥타데카-9-에닐옥시에틸, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐옥시에틸 또는 (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐옥시에틸인 것이 더욱 바람직하고, R1이 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐이고, R2가 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐옥시에틸인 것이 가장 바람직하다.
R1 및/또는 R2가, 동일하거나 또는 상이하며 탄소수 8~24의 직쇄상 혹은 분기상의 알킬, 알케닐인 경우에는, 동일하거나 또는 상이하며 테트라데실, 헥사데실, (Z)-테트라데카-9-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (E)-옥타데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-11-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (9Z,12Z,15Z)-옥타데카-9,12,15-트리에닐, (Z)-이코사-11-에닐, (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐 또는 (Z)-도코사-13-에닐인 것이 바람직하고, 동일하거나 또는 상이하며 헥사데실, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (Z)-이코사-11-에닐 또는 (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐인 것이 보다 바람직하고, 동일하거나 또는 상이하며 (Z)-옥타데카-9-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐 또는 (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐인 것이 더욱 바람직하고, 마찬가지로 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐인 것이 가장 바람직하다.
R6 및 R7은 각각 R1 및 R2와 동의이다. 단, R7이 탄소수 16~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬, 알케닐 또는 알키닐인 경우, R6 및 R7은 마찬가지로 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐인 것이 바람직하다.
R8 및 R9는 각각 R1 및 R2와 동의이다. 단, R8 및 R9는 마찬가지로 탄소수 16~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬, 알케닐 또는 알키닐인 것이 바람직하고, 마찬가지로 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐인 것이 보다 바람직하다.
R3 및 R4에 있어서의, 탄소수 1~3의 알킬로서는, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 및 시클로프로필을 들 수 있고, 바람직하게는 메틸 및 에틸을 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 메틸을 들 수 있다.
R3과 R4가 함께 결합하여 형성하는, 탄소수 2~8의 알킬렌으로서는, 예컨대 에틸렌, n-프로필렌, n-부틸렌, n-펜틸렌, n-헥실렌, n-헵틸렌, n-옥틸렌 등을 들 수 있고, 바람직하게는 n-펜틸렌, n-헥실렌, n-헵틸렌 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 n-펜틸렌, n-헥실렌 등을 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 n-헥실렌을 들 수 있다.
한편, R3은, 메틸 혹은 에틸이거나, R4와 함께 결합하여 탄소수 5~7의 알킬렌을 형성하거나, 또는 R5와 함께 결합하여 탄소수 3~5의 알킬렌을 형성하는 것이 바람직하고, 단, R3이 R4와 함께 결합하여 탄소수 5~7의 알킬렌을 형성하지 않는 경우에는, R4는 메틸 또는 에틸인 것이 바람직하고, 메틸인 것이 보다 바람직하다. 또한, R3은, 메틸이거나, R4와 함께 결합하여 n-펜틸렌 혹은 n-헥실렌을 형성하거나, 또는 R3이 R5와 함께 결합하여 에틸렌, n-프로필렌을 형성하는 것이 보다 바람직하고, 단, R3이 R4와 함께 결합하여 n-펜틸렌 혹은 n-헥실렌을 형성하지 않는 경우에는, R4는 메틸인 것이 보다 바람직하다.
R5에 있어서의, 탄소수 1~6의 알킬로서는, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 시클로프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 시클로부틸, 시클로프로필메틸, 펜틸, 이소펜틸, sec-펜틸, 네오펜틸, tert-펜틸, 시클로펜틸, 헥실, 시클로헥실 등을 들 수 있고, 바람직하게는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소펜틸, sec-펜틸, tert-펜틸, 네오펜틸, 헥실 등을 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 메틸, 에틸, 프로필 등을 들 수 있다.
R5에 있어서의, 탄소수 3~6의 알케닐로서는, 예컨대 알릴, 1-프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐 등을 들 수 있고, 바람직하게는 알릴 등을 들 수 있다.
R5에 있어서의, 모노알킬아미노로서는, 하나의, 예컨대 탄소수 1~6의 알킬(상기와 동의)로 치환된 아미노이면 되며, 예컨대 메틸아미노, 에틸아미노, 프로필아미노, 부틸아미노, 펜틸아미노, 헥실아미노 등을 들 수 있고, 바람직하게는 메틸아미노, 에틸아미노 등을 들 수 있다.
R5에 있어서의, 아미노 및 모노알킬아미노는, 각각 질소 원자 상의 고립 전자쌍에, 수소 이온이 배위하여, 암모니오 및 모노알킬암모니오를 형성하고 있어도 좋으며, 아미노 및 모노알킬아미노는 각각 암모니오 및 모노알킬암모니오를 포함한다.
본 발명에서, 아미노 및 모노알킬아미노의 질소 원자 상의 고립 전자쌍에, 수소 이온이 배위된 암모니오 및 모노알킬암모니오는, 제약상 허용할 수 있는 음이온과 염을 형성하고 있어도 좋다.
R5에 있어서의, 알콕시로서는, 예컨대 탄소수 1~6의 알킬(상기와 동의)로 치환된 히드록시이면 되며, 예컨대 메톡시, 에톡시, 프로필옥시, 부틸옥시, 펜틸옥시, 헥실옥시 등을 들 수 있고, 바람직하게는 메톡시, 에톡시 등을 들 수 있다.
R5에 있어서의, 모노알킬카르바모일 및 디알킬카르바모일로서는, 각각 하나 및 동일하거나 또는 상이한 2개의, 예컨대 탄소수 1~6의 알킬(상기와 동의)로 치환된 카르바모일을 들 수 있고, 보다 구체적으로는 메틸카르바모일, 에틸카르바모일, 프로필카르바모일, 부틸카르바모일, 펜틸카르바모일, 헥실카르바모일, 디메틸카르바모일, 디에틸카르바모일, 에틸메틸카르바모일, 메틸프로필카르바모일, 부틸메틸카르바모일, 메틸펜틸카르바모일, 헥실메틸카르바모일 등을 들 수 있고, 바람직하게는 메틸카르바모일, 에틸카르바모일, 디메틸카르바모일 등을 들 수 있다.
R5와 R3이 함께 결합하여 형성하는, 탄소수 2~6의 알킬렌으로서는, 예컨대 에틸렌, n-프로필렌, n-부틸렌, n-펜틸렌, n-헥실렌 등을 들 수 있고, 바람직하게는 n-프로필렌, n-부틸렌, n-펜틸렌 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 n-프로필렌, n-부틸렌 등을 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 n-프로필렌을 들 수 있다.
한편, R5는, 수소 원자, 탄소수 1~6의 알킬, 모노알킬아미노, 히드록시, 알콕시 또는 동일하거나 혹은 상이한 1~3개의 아미노, 모노알킬아미노, 또는 히드록시 혹은 알콕시로 치환된 탄소수 1~6의 알킬이거나, 또는 R3과 함께 결합하여 탄소수 2~6의 알킬렌을 형성하는 것이 바람직하고, 수소 원자, 메틸, 아미노, 메틸아미노, 히드록시, 메톡시, 또는 동일하거나 혹은 상이한 1~3개의 아미노 혹은 히드록시로 치환된 메틸이거나, 또는 R3과 함께 결합하여 탄소수 3~5의 알킬렌을 형성하는 것이 보다 바람직하고, 수소 원자, 탄소수 1~3의 알킬, 또는 히드록시이거나, 또는 R3과 함께 결합하여 n-프로필렌 또는 n-부틸렌을 형성하는 것이 더욱 바람직하고, 수소 원자 또는 R3과 함께 결합하여 n-프로필렌을 형성하는 것이 가장 바람직하다.
R10에 있어서의, 탄소수 1~3의 알킬로서는, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 시클로프로필 등을 들 수 있고, 바람직하게는 메틸, 에틸, 이소프로필, 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 메틸, 에틸 등을 들 수 있다. 한편, R10으로서는, 수소 원자 또는 메틸이 보다 바람직하고, 수소 원자가 가장 바람직하다.
X1 및 X2에 있어서의, 탄소수 1~6의 알킬렌으로서는, 예컨대 메틸렌, 에틸렌, n-프로필렌, n-부틸렌, n-펜틸렌, n-헥실렌 등을 들 수 있다.
또한, X1은 탄소수 1~3의 알킬렌인 것이 바람직하고, 메틸렌 또는 에틸렌인 것이 가장 바람직하며, X2는 단결합, 메틸렌 또는 에틸렌인 것이 바람직하고, 단결합 또는 메틸렌인 것이 보다 바람직하다. X1과 X2의 탄소수의 합은 1~3이 바람직하고, 2가 가장 바람직하다. 이들 어느 경우에도, R3 및 R4는, 동일하거나 또는 상이하며 메틸 혹은 에틸이고, R5는, 수소 원자, 메틸, 아미노, 메틸아미노, 히드록시, 메톡시, 또는 동일하거나 혹은 상이한 1~3개의 아미노 혹은 히드록시로 치환된 메틸이거나, R3과 R4는 함께 결합하여 탄소수 5~7의 알킬렌을 형성하고, R5는, 수소 원자, 메틸, 아미노, 메틸아미노, 히드록시, 메톡시, 또는 동일하거나 혹은 상이한 1~3개의 아미노 혹은 히드록시로 치환된 메틸이거나, 또는 R3과 R5는 함께 결합하여 탄소수 3~5의 알킬렌을 형성하고, R4는 메틸 또는 에틸인 것이 바람직하고, R3 및 R4는 메틸이고, R5는 수소 원자이거나, R3과 R4는 함께 결합하여 n-펜틸렌 혹은 n-헥실렌을 형성하고, R5는 수소 원자이거나, 또는 R3과 R5는 함께 결합하여 n-프로필렌을 형성하고, R4는 메틸인 것이 보다 바람직하다.
X3에 있어서의, 탄소수 1~3의 알킬렌으로서는, 예컨대 메틸렌, 에틸렌, n-프로필렌 등을 들 수 있고, 바람직하게는 메틸렌, 에틸렌 등을 들 수 있다.
식(A)에서의 산소 원자는 각각 유황 원자로 치환되어 있어도 좋다.
식(A)에서의 산소 원자의 하나를 유황 원자로 치환한 식(Aa)
Figure pct00009
(식에서, R1, R2, R3, R4, R5, X1 및 X2는 각각 상기와 동의)로 나타내어지는 화합물 Aa는, 대응하는 화합물 A에 로손 시약(Lawesson's Reagent, 2,4-비스(4-메톡시페닐)-1,3,2,4-디티아디포스페탄-2,4-디술피드) 등의 1,3,2,4-디티아디포스페탄-2,4-디술피드 유도체를 작용시킴으로써 얻을 수 있다.
본 발명의 양이온성 지질은, 어느 한 질소 원자 상의 고립 전자쌍에, 수소 이온이 배위된 경우에, 제약상 허용할 수 있는 음이온과 염을 형성하고 있어도 좋다.
본 발명에서, 제약상 허용할 수 있는 음이온으로서는, 예컨대 염화물 이온, 브롬화물 이온, 질산 이온, 황산 이온, 인산 이온 등의 무기 이온, 아세트산 이온, 옥살산 이온, 말레산 이온, 푸마르산 이온, 시트르산 이온, 안식향산 이온, 메탄술폰산 이온 등의 유기산 이온 등을 들 수 있다.
이어서 본 발명의 양이온성 지질의 제조법에 관해서 설명한다. 한편, 이하에 나타내는 제조법에서, 정의한 기가 그 제조법의 조건 하에서 변화되거나 또는 그 제조법을 실시하는 데에 부적절한 경우, 유기 합성 화학에서 상용되는 보호기의 도입 및 제거 방법[예컨대, 프로텍티브 그룹스 인 오가닉 신세시스 제3판(Protective Groups in Organic Synthesis, third edition), 그린(T. W. Greene) 저, John Wiley & Sons Inc.(1999년) 등에 기재된 방법] 등을 이용함으로써 목적 화합물을 제조할 수 있다. 또한, 필요에 따라서 치환기 도입 등의 반응 공정의 순서를 바꿀 수도 있다.
제조법
화합물(A) 중, R2가 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬, 알케닐 또는 알키닐인 화합물(Ia)은 이하의 방법에 의해서 제조할 수 있다.
Figure pct00010
(식에서, R1, R3, R4, R5, X1 및 X2는 각각 상기와 동의이고, R11은 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, Y는, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자, 트리플루오로메탄술포닐옥시, 메탄술포닐옥시, 벤젠술포닐옥시, p-톨루엔술포닐옥시 등의 탈리기를 나타내고, Ar은 p-니트로페닐, o-니트로페닐, p-클로로페닐 등의 치환 페닐기 또는 무치환 페닐기를 나타낸다)
공정 1 및 2
화합물(IIa)은, 암모니아와 화합물(IIIa)을, 무용매로 또는 용매 중, 필요에 따라서 바람직하게는 1~10 당량의 염기의 존재 하에, 실온과 200℃ 사이의 온도에서, 5분간~100시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 또한, 화합물(IIb)은, 화합물(IIa)과 화합물(IIIb)을, 무용매로 또는 용매 중, 필요에 따라서 바람직하게는 1~10 당량의 염기의 존재 하에, 실온과 200℃ 사이의 온도에서, 5분간~100시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로서는, 예컨대 메탄올, 에탄올, 디클로로메탄, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄, 톨루엔, 아세트산에틸, 아세토니트릴, 디에틸에테르, 테트라히드로푸란, 1,2-디메톡시에탄, 디옥산, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈, 피리딘, 물 등을 들 수 있고, 이들은 단독으로 또는 혼합하여 이용된다.
염기로서는, 예컨대 탄산칼륨, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 나트륨메톡시드, 칼륨 tert-부톡시드, 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, N-메틸모르폴린, 피리딘, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센(DBU) 등을 들 수 있다.
화합물(IIIa) 및 화합물(IIIb)은, 시판 제품으로서 또는 공지된 방법(예컨대, 「제5판 실험 화학 강좌 13 유기 화합물의 합성 I」, 제5판, p.374, 마루젠(2005년)) 혹은 그것에 준한 방법으로 얻을 수 있다.
R1과 R11이 동일한 경우의 화합물(IIb)은, 공정 1에서, 2 당량 이상의 화합물(IIIa)을 이용함으로써 얻을 수 있다.
공정 3
화합물(VI)은, 화합물(IV)을, 화합물(V)과, 무용매로 또는 용매 중, 필요에 따라서 바람직하게는 1~10 당량의 첨가제의 존재 하에, 및/또는 필요에 따라서 바람직하게는 1~10 당량의 염기의 존재 하에, -20℃와 150℃ 사이의 온도에서, 5분간~72시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로서는, 예컨대 디클로로메탄, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄, 톨루엔, 아세트산에틸, 아세토니트릴, 디에틸에테르, 테트라히드로푸란, 1,2-디메톡시에탄, 디옥산, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈, 디메틸설폭시드 등을 들 수 있고, 이들은 단독으로 또는 혼합하여 이용할 수 있다.
첨가제로서는, 예컨대 1-히드록시벤조트리아졸, 4-디메틸아미노피리딘 등을 들 수 있다.
염기로서는 공정 1 및 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
화합물(IV)은 시판 제품으로서 얻을 수 있다.
화합물(V)은 시판 제품으로서 또는 공지된 방법(예컨대, 「제5판 실험 화학 강좌 14 유기 화합물의 합성 II」, 제5판, p.1, 마루젠(2005년)) 혹은 그것에 준한 방법으로 얻을 수 있다.
공정 4
화합물(Ia)은, 화합물(IIb)을, 화합물(VI)과, 무용매로 또는 용매 중, 필요에 따라서 바람직하게는 1~10 당량의 첨가제의 존재 하에, 및/또는 필요에 따라서 바람직하게는 1~10 당량의 염기의 존재 하에, -20℃와 150℃ 사이의 온도에서, 5분간~72시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매 및 첨가제로서는 각각 공정 3에서 예시한 것을 들 수 있다.
염기로서는 공정 1 및 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
화합물(IIb)은 이하의 방법에 의해서도 또한 제조할 수 있다.
Figure pct00011
(식에서, R1, R11 및 Y는 각각 상기와 동의이고, Boc는 tert-부톡시카르보닐기를 나타내고, Ns는 2-니트로벤젠술포닐기를 나타낸다)
공정 5
화합물(IIc)은, N-(tert-부톡시카르보닐)-2-니트로벤젠술폰아미드와 화합물(IIIa)을, 무용매로 또는 용매 중, 필요에 따라서 바람직하게는 1~10 당량의 첨가제의 존재 하에, 및/또는 필요에 따라서 바람직하게는 1~10 당량의 염기의 존재 하에, 실온과 200℃ 사이의 온도에서, 5분간~100시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로서는 공정 1 및 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
첨가제로서는, 예컨대 요오드화n-테트라부틸암모늄, 요오드화나트륨 등을 들 수 있다.
염기로서는, 예컨대 탄산세슘, 탄산칼륨, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 나트륨메톡시드, 칼륨 tert-부톡시드, 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, N-메틸모르폴린, 피리딘, DBU 등을 들 수 있다.
공정 6
화합물(IId)은, 화합물(IIc)을, 1 당량~대과잉량의 산으로, 무용매 또는 용매 중, 필요에 따라서 바람직하게는 1~10 당량의 첨가제의 존재 하에, -20℃와 150℃ 사이의 온도에서, 5분간~72시간 처리함으로써 제조할 수 있다.
용매로서는 공정 1 및 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
산으로서는, 예컨대 염산, 황산, 인산, 트리플루오로아세트산 등을 들 수 있다.
첨가제로서는, 예컨대 티오아니솔, 디메틸술피드, 트리이소프로필실란 등을 들 수 있다.
공정 7
화합물(IIe)은, 화합물(IIIb)과 화합물(IId)을, 무용매로 또는 용매 중, 필요에 따라서 바람직하게는 1~10 당량의 첨가제의 존재 하에, 및/또는 필요에 따라서 바람직하게는 1~10 당량의 염기의 존재 하에, 실온과 200℃ 사이의 온도에서, 5분간~100시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로서는 공정 1 및 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
첨가제 및 염기로서는 각각 공정 5에서 예시한 것을 들 수 있다.
공정 8
화합물(IIb)은, 화합물(IIe)과 티올 화합물을, 무용매로 또는 용매 중, 필요에 따라서 바람직하게는 1~10 당량의 염기의 존재 하에, 실온과 200℃ 사이의 온도에서, 5분간~100시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로서는 공정 1 및 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
티올 화합물로서는, 예컨대 메탄티올, 에탄티올, 도데칸티올, 티오페놀, 메르캅토아세트산 등을 들 수 있다.
염기로서는 공정 5에서 예시한 것을 들 수 있다.
화합물(A) 중, R2가 알콕시에틸, 알콕시프로필, 알케닐옥시에틸, 알케닐옥시프로필, 알키닐옥시에틸 또는 알키닐옥시프로필인 화합물(Ib)은 이하의 방법에 의해서 제조할 수 있다.
Figure pct00012
(식에서, R1, R3, R4, R5, X1, X2, Y 및 Ar은 각각 상기와 동의이고, R12는 알콕시에틸, 알콕시프로필, 알케닐옥시에틸, 알케닐옥시프로필, 알키닐옥시에틸 또는 알키닐옥시프로필이고, Ms는 메탄술포닐기를 나타낸다)
공정 9
화합물(IIf)은, 화합물(IIa)과 화합물(IIIc)을, 무용매로 또는 용매 중, 필요에 따라서 바람직하게는 1~10 당량의 염기의 존재 하에, 실온과 200℃ 사이의 온도에서, 5분간~100시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로서는 공정 1 및 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
염기로서는 공정 1 및 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
공정 10
화합물(Ib)은, 화합물(IIf)을, 화합물(VI)과, 무용매로 또는 용매 중, 필요에 따라서 바람직하게는 1~10 당량의 첨가제의 존재 하에, 및/또는 필요에 따라서 바람직하게는 1~10 당량의 염기의 존재 하에, -20℃와 150℃ 사이의 온도에서, 5분간~72시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매 및 첨가제로서는 각각 공정 3에서 예시한 것을 들 수 있다.
염기로서는 공정 1 및 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
화합물(IIIc)은 이하의 방법에 의해서 제조할 수 있다.
Figure pct00013
(식에서, R13은 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, X4는 에틸렌 또는 n-프로필렌을 나타내고, Ms는 메탄술포닐기를 나타낸다)
공정 11
화합물(VIIb)은, 화합물(VIIa)을, 화합물(VIII)과, 무용매로 또는 용매 중, 필요에 따라서 바람직하게는 1~10 당량의 염기의 존재 하에, 실온과 200℃ 사이의 온도에서, 5분간~100시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로서는 공정 3에서 예시한 것을 들 수 있다.
염기로서는 공정 1 및 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
화합물(VIIa)은, 시판 제품으로서 또는 공지된 방법(예컨대, 「제5판 실험 화학 강좌 14 유기 화합물의 합성 II」, 제5판, p.1, 마루젠(2005년)) 혹은 그것에 준한 방법으로 얻을 수 있다.
화합물(VIII)은 시판 제품으로서 얻을 수 있다.
공정 12
화합물(IIIc)은, 화합물(VIIb)을, 메실화 시약과, 무용매로 또는 용매 중, 바람직하게는 1~10 당량의 염기의 존재 하에, -20℃와 150℃ 사이의 온도에서, 5분간~72시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로서는 공정 3에서 예시한 것을 들 수 있다.
염기로서는 공정 1 및 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
메실화 시약으로서는, 예컨대 무수메실산, 메실산클로리드 등을 들 수 있다.
화합물(IIf)은 이하의 방법에 의해서도 또한 제조할 수 있다.
Figure pct00014
(식에서, R1, R12, Y, Ns 및 Ms는 각각 상기와 동의이다)
공정 13
화합물(IIg)은, 화합물(IIIc)과 화합물(IId)을, 무용매로 또는 용매 중, 필요에 따라서 바람직하게는 1~10 당량의 첨가제의 존재 하에, 및/또는 필요에 따라서 바람직하게는 1~10 당량의 염기의 존재 하에, 실온과 200℃ 사이의 온도에서, 5분간~100시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로서는 공정 1 및 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
첨가제 및 염기로서는 각각 공정 5에서 예시한 것을 들 수 있다.
공정 14
화합물(IIf)은, 화합물(IIg)과 티올 화합물을, 무용매로 또는 용매 중, 필요에 따라서 바람직하게는 1~10 당량의 염기의 존재 하에, 실온과 200℃ 사이의 온도에서, 5분간~100시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로서는 공정 1 및 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
티올 화합물로서는 공정 8에서 예시한 것을 들 수 있다.
염기로서는 공정 5에서 예시한 것을 들 수 있다.
식(A)에서의 산소 원자가 유황 원자인 식(Aa)~식(Ac)
Figure pct00015
(식에서, R1, R2, R3, R4, R5, X1 및 X2는 각각 상기와 동의이다)로 나타내어지는 화합물 Aa~Ac는, 각각 공정 4 및 공정 10에 있어서, 식(VI)에서의 산소 원자가 유황 원자인 식(VIa)~식(VIc)
Figure pct00016
(식에서, R3, R4, R5, X1, X2 및 Ar은 각각 상기와 동의이다)로 나타내어지는 화합물 VIa~VIc를 이용함으로써 얻을 수 있다.
화합물(B) 중, R7이 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬, 알케닐 또는 알키닐인 화합물(Ba)은 화합물(IIb)의 제조 방법으로 얻을 수 있다.
화합물(B) 중, R7이 알콕시에틸, 알콕시프로필, 알케닐옥시에틸, 알케닐옥시프로필, 알키닐옥시에틸 또는 알키닐옥시프로필인 화합물(Bc)은 화합물(IIf)의 제조 방법으로 얻을 수 있다.
화합물(C)은 이하의 방법에 의해서 제조할 수 있다.
Figure pct00017
(식에서, R8, R9, R10, X3 및 Y는 각각 상기와 동의이다)
공정 15
화합물(C)은, 화합물(IIh)과 화합물(Xa)을, 무용매로 또는 용매 중, 필요에 따라서 바람직하게는 1~10 당량의 첨가제의 존재 하에, 및/또는 필요에 따라서 바람직하게는 1~10 당량의 염기의 존재 하에, 실온과 200℃ 사이의 온도에서, 5분간~100시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매 및 염기로서는 각각 공정 1 및 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
첨가제로서는 공정 5에서 예시한 것을 들 수 있다.
화합물(IIh)은 화합물(B)의 제조 방법으로 얻을 수 있다.
화합물(Xa)은 시판 제품으로서 또는 공지된 방법(예컨대, 「제5판 실험 화학 강좌 13 유기 화합물의 합성 I」, 제5판, p.374, 마루젠(2005년)) 혹은 그것에 준한 방법으로 얻을 수 있다.
화합물(C) 중, R10이 수소 원자인 화합물(Ca)은 이하의 방법에 의해서도 제조할 수 있다.
Figure pct00018
(식에서, R8, R9, X3 및 Y는 각각 상기와 동의이고, Pro는 트리메틸실릴, 트리에틸실릴, 트리tert-부틸실릴, tert-부틸디메틸실릴, tert-부틸디페닐실릴 또는 트리페닐실릴 등의 실릴형 보호기를 나타낸다)
공정 16
화합물(IXa)은, 화합물(IIh)과 화합물(Xb)을, 무용매로 또는 용매 중, 필요에 따라서 바람직하게는 1~10 당량의 첨가제의 존재 하에, 및/또는 필요에 따라서 바람직하게는 1~10 당량의 염기의 존재 하에, 실온과 200℃ 사이의 온도에서, 5분간~100시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매 및 염기로서는 각각 공정 1 및 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
첨가제로서는 공정 5에서 예시한 것을 들 수 있다.
화합물(IIh)은 화합물(B)의 제조 방법으로 얻을 수 있다.
화합물(Xb)은 시판 제품으로서 또는 공지된 방법(예컨대, 「제5판 실험 화학 강좌 18 유기 화합물의 합성 VI」, 제5판, p.171-172, 마루젠(2005년)) 혹은 그것에 준한 방법으로 얻을 수 있다.
공정 17
화합물(Ca)은, 화합물(IXa)과 탈보호 시약을, 무용매로 또는 용매 중, -20℃와 150℃ 사이의 온도에서, 5분간~72시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로서는 공정 1 및 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
탈보호 시약으로서는, 예컨대 불화테트라부틸암모늄, 불화수소피리딘 복합체, 불화수소산 등의 불소 화합물 등, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 파라톨루엔술폰산피리디늄, 염산 등의 산 등을 들 수 있다.
화합물(C) 중, R10이 수소 원자이고, X3이 탄소수 2의 알킬렌인 화합물(Cb)은 이하의 방법에 의해서도 제조할 수 있다.
Figure pct00019
(식에서, R8 및 R9는 각각 상기와 동의이다)
공정 18
화합물(IXb)은, 화합물(IIh)을, 바람직하게는 1~대과잉량의 아크릴산에틸과, 무용매로 또는 용매 중, 필요에 따라서 바람직하게는 1~10 당량의 염기의 존재 하에, 실온과 200℃ 사이의 온도에서, 5분간~100시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로서는 공정 1에서 예시한 것을 들 수 있다.
염기로서는, 예컨대 탄산칼륨, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 나트륨메톡시드, 나트륨에톡시드, 칼륨 tert-부톡시드, 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, N-메틸모르폴린, 피리딘, DBU 등을 들 수 있다.
공정 19
화합물(Cb)은, 화합물(IXb)과, 바람직하게는 1~10 당량의 환원제를, 용매 중, 필요에 따라서 바람직하게는 1~10 당량의 첨가제의 존재 하에, -20℃와 150℃ 사이의 온도에서, 5분간~72시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로서는, 예컨대 테트라히드로푸란, 디옥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 톨루엔 등을 들 수 있고, 이들은 단독으로 또는 혼합하여 이용할 수 있다.
환원제로서는, 예컨대 수소화알루미늄리튬, 수소화알루미늄, 수소화디이소부틸알루미늄, 트리아세톡시수소화붕소나트륨, 시안화수소화붕소나트륨, 보란 등을 들 수 있다.
첨가제로서는, 예컨대 염화알루미늄, 염화세륨, 염화철, 아세트산, 염산 등을 들 수 있다.
상기 각 제조법에 있어서의 중간체 및 목적 화합물은, 유기 합성 화학에서 상용되는 분리 정제법, 예컨대, 여과, 추출, 세정, 건조, 농축, 재결정, 각종 크로마토그래피 등에 부쳐 단리 정제할 수 있다. 또한, 중간체에 있어서는 특별히 정제하지 않고서 다음 반응에 제공하는 것도 가능하다.
본 발명의 양이온성 지질에 있어서, 구조 중의 질소 원자 상의 고립 전자쌍에 수소 이온이 배위되어도 좋으며, 그 경우에는, 제약상 허용할 수 있는 음이온(상기와 동의)과 염을 형성하고 있어도 좋고, 본 발명의 양이온성 지질에는, 상기 질소 원자 상의 고립 전자쌍에 수소 이온이 배위된 화합물도 포함된다.
본 발명의 양이온성 지질 중에는, 기하 이성체, 광학 이성체 등의 입체 이성체, 호변 이성체 등이 존재할 수 있는 것도 있는데, 본 발명의 양이온성 지질은, 이들을 포함하며, 모든 가능한 이성체 및 이들의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 양이온성 지질 중의 각 원자의 일부 또는 전부는, 각각 대응하는 동위체 원자로 치환되어 있어도 좋으며, 화합물(A), 화합물(B) 또는 화합물(C)은 이들 동위체 원자로 치환된 화합물도 포함한다. 예컨대, 화합물(A), 화합물(B) 또는 화합물(C) 중의 수소 원자의 일부 또는 전부는 원자량 2의 수소 원자(중수소 원자)라도 좋다.
본 발명의 양이온성 지질 중의 각 원자의 일부 또는 전부가 각각 대응하는 동위체 원자로 치환된 화합물은, 시판되는 빌딩 블록을 이용하여, 상기 각 제조법과 같은 방법으로 제조할 수 있다. 또한, 화합물(A), 화합물(B) 또는 화합물(C) 중 수소 원자의 일부 또는 전부가 중수소 원자로 치환된 화합물은, 예컨대, 이리듐 착체를 촉매로서 이용하고, 중수를 중수소원으로서 이용하여 알코올, 카르복실산 등을 중수소화하는 방법[저널 오브 아메리칸 케미컬 소사이어티(J. Am. Chem. Soc.), Vol.124, No.10,2092(2002) 참조] 등을 이용하여 합성할 수도 있다.
본 발명에 의해서 얻어지는 본 발명의 양이온성 지질의 구체예를 제1~제7의 표에 나타낸다. 단, 본 발명의 양이온성 지질은 이들에 한정되는 것은 아니다.
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
또한, 본 발명에서 이용되는 핵산으로서는, 예컨대 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드와 동등한 기능을 갖는 분자가 중합된 분자라면, 어떠한 분자라도 좋으며, 예컨대 리보뉴클레오티드의 중합체인 리보핵산(RNA), 데옥시리보뉴클레오티드의 중합체인 데옥시리보핵산(DNA), RNA와 DNA로 이루어지는 키메라 핵산, 및 이들 핵산의 적어도 하나의 뉴클레오티드가 상기 뉴클레오티드와 동등한 기능을 갖는 분자로 치환된 뉴클레오티드 중합체 등을 들 수 있다. 또한, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드와 동등한 기능을 갖는 분자가 중합된 분자의 구조를 적어도 일부에 포함하는 유도체도 본 발명의 핵산에 포함된다. 한편, 본 발명에서, 우라실 U와 티민 T는 각각 바꿔 읽을 수 있다.
뉴클레오티드와 동등한 기능을 갖는 분자로서는, 예컨대 뉴클레오티드 유도체 등을 들 수 있다.
뉴클레오티드 유도체로서는, 예컨대 뉴클레오티드에 수식을 한 분자라면 어떠한 분자라도 좋지만, 예컨대 RNA 또는 DNA와 비교하여, 뉴클레아제 내성을 향상시키거나 혹은 그 밖의 분해 인자로부터 안정화시키기 위해서, 상보쇄 핵산과의 어피니티를 올리기 위해서, 세포 투과성을 올리기 위해서, 또는 가시화시키기 위해서, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드에 수식을 한 분자 등이 적합하게 이용된다.
뉴클레오티드 유도체로서는, 예컨대 당부 수식 뉴클레오티드, 인산디에스테르 결합 수식 뉴클레오티드, 염기 수식 뉴클레오티드 등을 들 수 있다.
당부 수식 뉴클레오티드로서는, 예컨대 뉴클레오티드의 당의 화학 구조의 일부 혹은 전부에 대하여, 임의의 치환기로 수식하거나 혹은 치환한 것, 또는 임의의 원자로 치환한 것이면 어떠한 것이라도 좋지만, 2'-수식 뉴클레오티드가 바람직하게 이용된다.
당부 수식 뉴클레오티드에 있어서의 수식기로서는, 예컨대, 2'-시아노, 2'-알킬, 2'-치환 알킬, 2'-알케닐, 2'-치환 알케닐, 2'-할로겐, 2'-O-시아노, 2'-O-알킬, 2'-O-치환 알킬, 2'-O-알케닐, 2'-O-치환 알케닐, 2'-S-알킬, 2'-S-치환 알킬, 2'-S-알케닐, 2'-S-치환 알케닐, 2'-아미노, 2'-NH-알킬, 2'-NH-치환 알킬, 2'-NH-알케닐, 2'-NH-치환 알케닐, 2'-SO-알킬, 2'-SO-치환 알킬, 2'-카르복시, 2'-CO-알킬, 2'-CO-치환 알킬, 2'-Se-알킬, 2'-Se-치환 알킬, 2'-SiH2-알킬, 2'-SiH2-치환 알킬, 2'-ONO2, 2'-NO2, 2'-N3, 2'-아미노산 잔기(아미노산의 카르복실산에서 수산기가 제거된 것), 2'-O-아미노산 잔기(상기 아미노산 잔기와 동의) 등을 들 수 있다.
또한, 당부 수식 뉴클레오티드로서, 예컨대 2' 위치의 수식기가 4' 위치의 탄소 원자에 가교된 구조를 갖는 가교 구조형 인공 핵산(Bridged Nucleic Acid)(BNA), 보다 구체적으로는, 2' 위치의 산소 원자와 4' 위치의 탄소 원자가 메틸렌을 통해 가교된 록트 인공 핵산(Locked Nucleic Acid)(LNA) 및 에틸렌 가교 구조형 인공 핵산(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)[Nucleic Acid Research, 32, e175(2004)] 등도 들 수 있고, 이들은 2'-수식 뉴클레오티드에 포함된다.
또한 당부 수식 뉴클레오티드로서, 펩티드 핵산(PNA)[Acc. Chem. Res., 32, 624(1999)], 옥시펩티드 핵산(OPNA)[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653(2001)], 펩티드리보핵산(PRNA)[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900(2000)] 등도 들 수 있다.
당부 수식 뉴클레오티드에 있어서의 수식기로서, 2'-시아노, 2'-할로겐, 2'-O-시아노, 2'-알킬, 2'-치환 알킬, 2'-O-알킬, 2'-O-치환 알킬, 2'-O-알케닐, 2'-O-치환 알케닐, 2'-Se-알킬, 2'-Se-치환 알킬 등이 바람직하고, 2'-시아노, 2'-플루오로, 2'-클로로, 2'-브로모, 2'-트리플루오로메틸, 2'-O-메틸, 2'-O-에틸, 2'-O-이소프로필, 2'-O-트리플루오로메틸, 2'-O-[2-(메톡시)에틸], 2'-O-(3-아미노프로필), 2'-O-[2-(N,N-디메틸아미노옥시)에틸], 2'-O-[3-(N,N-디메틸아미노)프로필], 2'-O-{2-[2-(N,N-디메틸아미노)에톡시]에틸}, 2'-O-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸], 2'-Se-메틸 등이 보다 바람직하고, 2'-O-메틸, 2'-O-에틸, 2'-플루오로 등이 더욱 바람직하고, 2'-O-메틸 및 2'-O-에틸이 가장 바람직하다.
또한, 당부 수식 뉴클레오티드에 있어서의 수식기는, 그 크기로 바람직한 범위를 정의할 수도 있으며, 플루오로의 크기부터 -O-부틸의 크기에 상당하는 것이 바람직하고, -O-메틸의 크기부터 -O-에틸의 크기에 상당하는 것이 보다 바람직하다.
당부 수식 뉴클레오티드에 있어서의 수식기에서의 알킬은, 본 발명의 양이온성 지질의 정의에서의 탄소수 1~6의 알킬과 동의이다.
당부 수식 뉴클레오티드에 있어서의 수식기에서의 알케닐로서는, 탄소수 3~6의 알케닐을 들 수 있고, 예컨대 알릴, 1-프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐 등을 들 수 있다.
당부 수식 뉴클레오티드에 있어서의 수식기에서의 할로겐으로서는, 예컨대 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자 등을 들 수 있다.
아미노산 잔기에 있어서의 아미노산으로서는, 예컨대 지방족 아미노산(구체적으로는, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신 등), 히드록시아미노산(구체적으로는, 세린, 트레오닌 등), 산성 아미노산(구체적으로는, 아스파라긴산, 글루타민산 등), 산성 아미노산아미드(구체적으로는, 아스파라긴, 글루타민 등), 염기성 아미노산(구체적으로는, 리신, 히드록시리신, 아르기닌, 오르니틴 등), 황함유 아미노산(구체적으로는, 시스테인, 시스틴, 메티오닌 등), 이미노산(구체적으로는, 프롤린, 4-히드록시프롤린 등) 등을 들 수 있다.
당부 수식 뉴클레오티드에 있어서의 수식기에서의 치환 알킬 및 치환 알케닐에 있어서의 치환기로서는, 예컨대, 할로겐(상기와 동의), 히드록시, 술파닐, 아미노, 옥소, -O-알킬(이 -O-알킬의 알킬 부분은 상기 알킬과 동의), -S-알킬(이 -S-알킬의 알킬 부분은 상기 알킬과 동의), -NH-알킬(이 -NH-알킬의 알킬 부분은 상기 알킬과 동의), 디알킬아미노옥시(이 디알킬아미노옥시의 2개의 알킬 부분은 동일하거나 또는 상이하며 상기 알킬과 동의), 디알킬아미노(이 디알킬아미노의 2개의 알킬 부분은 동일하거나 또는 상이하며 상기 알킬과 동의), 디알킬아미노알킬옥시(이 디알킬아미노알킬옥시의 2개의 알킬 부분은 동일하거나 또는 상이하며 상기 알킬과 동의이고, 알킬렌 부분은 상기 알킬에서 수소 원자가 하나 제외된 것을 의미함) 등을 들 수 있고, 치환수는 바람직하게는 1~3이다.
인산디에스테르 결합 수식 뉴클레오티드로서는, 뉴클레오티드의 인산디에스테르 결합의 화학 구조의 일부 혹은 전부에 대하여, 임의의 치환기로 수식 혹은 치환한 것, 또는 임의의 원자로 치환한 것이라면 어떠한 것이라도 좋으며, 예컨대, 인산디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 뉴클레오티드, 인산디에스테르 결합이 포스포로디티오에이트 결합으로 치환된 뉴클레오티드, 인산디에스테르 결합이 알킬포스포네이트 결합으로 치환된 뉴클레오티드, 인산디에스테르 결합이 포스포로아미데이트 결합으로 치환된 뉴클레오티드 등을 들 수 있다.
염기 수식 뉴클레오티드로서는, 뉴클레오티드의 염기의 화학 구조의 일부 혹은 전부에 대하여, 임의의 치환기로 수식하거나 혹은 치환한 것, 또는 임의의 원자로 치환한 것이라면 어떠한 것이라도 좋으며, 예컨대, 염기 내의 산소 원자가 유황 원자로 치환된 것, 수소 원자가 탄소수 1~6의 알킬기로 치환된 것, 메틸기가 수소 원자 혹은 탄소수 2~6의 알킬기로 치환된 것, 아미노기가 탄소수 1~6의 알킬기, 탄소수 1~6의 알카노일기 등의 보호기로 보호된 것 등을 들 수 있다.
또한, 뉴클레오티드 유도체로서, 뉴클레오티드 또는 당부, 인산디에스테르 결합 혹은 염기의 적어도 하나가 수식된 뉴클레오티드 유도체에 지질, 인지질, 페나진, 폴레이트, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 쿠마린, 색소 등, 다른 화학 물질을 부가한 것도 들 수 있고, 구체적으로는, 5'-폴리아민 부가 뉴클레오티드 유도체, 콜레스테롤 부가 뉴클레오티드 유도체, 스테로이드 부가 뉴클레오티드 유도체, 담즙산 부가 뉴클레오티드 유도체, 비타민 부가 뉴클레오티드 유도체, 녹색 형광 색소(Cy3) 부가 뉴클레오티드 유도체, 적색 형광 색소(Cy5) 부가 뉴클레오티드 유도체, 플루오로세인(6-FAM) 부가 뉴클레오티드 유도체 및 비오틴 부가 뉴클레오티드 유도체 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명에서 이용되는 핵산에 있어서는, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체가, 그 핵산 내의 다른 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체와 알킬렌 구조, 펩티드 구조, 뉴클레오티드 구조, 에테르 구조, 에스테르 구조 및 이들의 적어도 하나를 조합시킨 구조 등의 가교 구조를 형성하여도 좋다.
본 발명에서 이용되는 핵산으로서는, 바람직하게는 표적 유전자의 발현을 억제하는 핵산을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 RNA 간섭(RNAi)을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 작용을 갖는 핵산을 들 수 있다.
본 발명에서의 표적 유전자로서는, mRNA를 산생하여 발현하는 유전자라면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 종양 또는 염증에 관련된 유전자가 바람직하고, 예컨대 혈관 내피 증식 인자(vascular endothelial growth factor, 이하 VEGF라고 함), 혈관 내피 증식 인자 수용체(vascular endothelial growth factor receptor, 이하 VEGFR라고 함), 섬유아세포 증식 인자, 섬유아세포 증식 인자 수용체, 혈소판 유래 증식 인자, 혈소판 유래 증식 인자 수용체, 간 세포 증식 인자, 간 세포 증식 인자 수용체, 크뤼펠 유사 인자(Kruppel-like factor, 이하 KLF라고 함), 익스프레스드 시퀀스 태그(Ets) 전사 인자, 핵 인자, 저산소 유도 인자, 세포 주기 관련 인자, 염색체 복제 관련 인자, 염색체 수복 관련 인자, 미소관 관련 인자, 증식 시그널 경로 관련 인자, 증식 관련 전사 인자, 아폽토시스 관련 인자 등의 단백질을 코드하는 유전자 등을 들 수 있고, 구체적으로는 VEGF 유전자, VEGFR 유전자, 섬유아세포 증식 인자 유전자, 섬유아세포 증식 인자 수용체 유전자, 혈소판 유래 증식 인자 유전자, 혈소판 유래 증식 인자 수용체 유전자, 간 세포 증식 인자 유전자, 간 세포 증식 인자 수용체 유전자, KLF 유전자, Ets 전사 인자 유전자, 핵 인자 유전자, 저산소 유도 인자 유전자, 세포 주기 관련 인자 유전자, 염색체 복제 관련 인자 유전자, 염색체 수복 관련 인자 유전자, 미소관 관련 인자 유전자(예컨대, CKAP5 유전자 등), 증식 시그널 경로 관련 인자 유전자(예컨대, KRAS 유전자 등), 증식 관련 전사 인자 유전자, 아폽토시스 관련 인자(예컨대, BCL-2 유전자 등) 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명에서의 표적 유전자로서는, 예컨대, 간장, 폐, 신장 또는 비장에서 발현되는 유전자가 바람직하고, 간장에서 발현되는 유전자가 보다 바람직하고, 예컨대 상기한 종양 또는 염증에 관련된 유전자, B형간염 바이러스 게놈, C형간염 바이러스 게놈, 아포리포단백질(APO), 히드록시메틸글루타릴(HMG) CoA 환원 효소, 켁신9형 세린 프로테아제(PCSK9), 제12인자, 글루카곤 수용체, 글루코코르티코이드 수용체, 류코트리엔 수용체, 트롬복산 A2 수용체, 히스타민 H1 수용체, 탄산 탈수 효소, 안지오텐신 변환 효소, 레닌, p53, 티로신포스파타아제(PTP), 나트륨 의존성 글루코오스 수송 담체, 종양 괴사 인자, 인터류킨, 헵시딘, 트랜스티레틴, 안티트롬빈, 프로테인 C, 매트립타아제 효소(예컨대, TMPRSS6 유전자 등) 등의 단백질을 코드하는 유전자 등을 들 수 있다.
표적 유전자의 발현을 억제하는 핵산으로서는, 예컨대 단백질 등을 코드하는 유전자(표적 유전자)의 mRNA의 일부의 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열을 포함하면서 또 표적 유전자의 발현을 억제하는 핵산이라면, 예컨대 siRNA(짧은 간섭(short interference) RNA), miRNA(마이크로(micro) RNA) 등의 이중쇄 핵산, shRNA(짧은 헤어핀(short hairpin) RNA), 안티센스 핵산, 리보자임 등의 단일쇄 핵산 등, 어느 핵산을 이용하여도 좋지만, 이중쇄 핵산이 바람직하다.
표적 유전자의 mRNA의 일부의 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열을 포함하는 핵산을 안티센스쇄 핵산이라고 하고, 안티센스쇄 핵산의 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열을 포함하는 핵산을 센스쇄 핵산이라고도 한다. 센스쇄 핵산은, 표적 유전자의 일부의 염기 서열로 이루어지는 핵산 그 자체 등, 안티센스쇄 핵산과 접합하여 이중쇄 형성부가 생기는 핵산을 말한다.
이중쇄 핵산이란, 2 가닥의 쇄가 접합하여 이중쇄 형성부를 갖는 핵산을 말한다. 이중쇄 형성부란, 이중쇄 핵산을 구성하는 뉴클레오티드 또는 그 유도체가 염기쌍을 구성하여 이중쇄를 형성하고 있는 부분을 말한다. 이중쇄 형성부를 구성하는 염기쌍은, 통상 15~27 염기쌍이고, 15~25 염기쌍이 바람직하고, 15~23 염기쌍이 보다 바람직하고, 15~21 염기쌍이 더욱 바람직하고, 15~19 염기쌍이 특히 바람직하다.
이중쇄 형성부의 안티센스쇄 핵산으로서는, 예컨대 표적 유전자의 mRNA의 일부 서열로 이루어지는 핵산, 또는 이 핵산에 있어서 1~3 염기, 바람직하게는 1~2 염기, 보다 바람직하게는 1 염기가 치환, 결실 혹은 부가되고, 또 표적 단백질의 발현 억제 활성을 갖는 핵산이 적합하게 이용된다. 이중쇄 핵산을 구성하는 단일쇄의 핵산은, 통상 15~30 염기(뉴클레오시드)의 연속으로 이루어지는데, 15~29 염기가 바람직하고, 15~27 염기가 보다 바람직하고, 15~25 염기가 더욱 바람직하고, 17~23 염기가 특히 바람직하고, 19~21 염기가 가장 바람직하다.
이중쇄 핵산을 구성하는 안티센스쇄, 센스쇄 중 어느 한쪽 또는 양쪽의 핵산은, 이중쇄 형성부에 계속되는 3' 측 또는 5' 측에 이중쇄를 형성하지 않는 추가의 핵산을 갖더라도 좋다. 이 이중쇄를 형성하지 않는 부분을 돌출부(오버행)라고도 한다.
돌출부를 갖는 이중쇄 핵산으로서는, 예컨대 적어도 한쪽의 쇄의 3' 말단 또는 5' 말단에 1~4 염기, 통상은 1~3 염기로 이루어지는 돌출부를 갖는 것이 이용되지만, 2 염기로 이루어지는 돌출부를 갖는 것이 바람직하게 이용되고, dTdT 또는 UU로 이루어지는 돌출부를 갖는 것이 보다 바람직하게 이용된다. 돌출부는, 안티센스쇄만, 센스쇄만 및 안티센스쇄와 센스쇄 양쪽에 가질 수 있지만, 안티센스쇄와 센스쇄의 양쪽에 돌출부를 갖는 이중쇄 핵산이 바람직하게 이용된다.
또한, 이중쇄 형성부에 이어서 표적 유전자의 mRNA의 염기 서열과 일부 또는 모두가 일치하는 서열, 또는 이중쇄 형성부에 이어서 표적 유전자의 mRNA의 상보쇄의 염기 서열과 일부 또는 모두가 일치하는 서열을 이용하여도 좋다. 또한, 표적 유전자의 발현을 억제하는 핵산으로서는, 예컨대 Dicer 등의 리보뉴클레아제의 작용에 의해 상기한 이중쇄 핵산을 생성하는 핵산 분자(국제공개 제2005/089287호 팜플렛)나, 3' 말단이나 5' 말단의 돌출부를 갖고 있지 않은 이중쇄 핵산 등을 이용할 수도 있다.
또한, 상기한 이중쇄 핵산이 siRNA인 경우, 바람직하게는 안티센스쇄는, 5' 말단 측에서 3' 말단 측으로 향해 적어도 1~17번째 염기(뉴클레오시드)의 서열이, 표적 유전자의 mRNA의 연속되는 17 염기의 서열과 상보적인 염기의 서열이고, 보다 바람직하게는, 상기 안티센스쇄는, 5' 말단 측에서 3' 말단 측을 향해 1~19번째의 염기의 서열이, 표적 유전자의 mRNA의 연속되는 19 염기의 서열과 상보적인 염기의 서열이거나, 1~21번째의 염기의 서열이, 표적 유전자의 mRNA의 연속되는 21 염기의 서열과 상보적인 염기의 서열이거나, 1~25번째의 염기의 서열이, 표적 유전자의 mRNA의 연속되는 25 염기의 서열과 상보적인 염기의 서열이다.
또한, 본 발명에서 이용되는 핵산이 siRNA인 경우, 바람직하게는 상기 핵산 중의 당의 10~70%, 보다 바람직하게는 15~60%, 더욱 바람직하게는 20~50%가, 2' 위치에 있어서 수식기로 치환된 리보오스이다. 본 발명에서의 2' 위치에 있어서 수식기로 치환된 리보오스란, 리보오스의 2' 위치의 수산기가 수식기로 치환되어 있는 것을 의미하고, 리보오스의 2' 위치의 수산기와 입체 배치가 동일하더라도 다르더라도 좋지만, 바람직하게는 리보오스의 2' 위치의 수산기와 입체 배치가 동일하다. 2' 위치에서 수식기로 치환된 리보오스에 있어서의 수식기로서는, 당부 수식 뉴클레오티드에 있어서의 2'-수식 뉴클레오티드에 있어서의 수식기의 정의에서 예시한 것 및 수소 원자를 들 수 있고, 2'-시아노, 2'-할로겐, 2'-O-시아노, 2'-알킬, 2'-치환 알킬, 2'-O-알킬, 2'-O-치환 알킬, 2'-O-알케닐, 2'-O-치환 알케닐, 2'-Se-알킬, 2'-Se-치환 알킬 등이 바람직하고, 2'-시아노, 2'-플루오로, 2'-클로로, 2'-브로모, 2'-트리플루오로메틸, 2'-O-메틸, 2'-O-에틸, 2'-O-이소프로필, 2'-O-트리플루오로메틸, 2'-O-[2-(메톡시)에틸], 2'-O-(3-아미노프로필), 2'-O-[2-(N,N-디메틸)아미노옥시]에틸, 2'-O-[3-(N,N-디메틸아미노)프로필], 2'-O-{2-[2-(N,N-디메틸아미노)에톡시]에틸}, 2'-O-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸], 2'-Se-메틸, 수소 원자 등이 보다 바람직하고, 2'-O-메틸, 2'-O-에틸, 2'-플루오로, 수소 원자 등이 더욱 바람직하고, 2'-O-메틸 및 2'-O-플루오로가 가장 바람직하다.
본 발명에서 이용되는 핵산에는, 핵산 구조 중의 인산부, 에스테르부 등에 포함되는 산소 원자 등이, 예컨대 유황 원자 등의 다른 원자로 치환된 유도체를 포함한다.
또한, 안티센스쇄 및 센스쇄의 5' 말단의 염기에 결합하는 당은, 각각 5' 위치의 수산기가, 인산기 혹은 상기한 수식기, 또는 생체 내의 핵산 분해 효소 등으로 인산기 혹은 상기한 수식기로 변환되는 기에 의해 수식되어 있어도 좋다.
또한, 안티센스쇄 및 센스쇄의 3' 말단의 염기에 결합하는 당은, 각각 3' 위치의 수산기가, 인산기 혹은 상기한 수식기, 또는 생체 내의 핵산 분해 효소 등으로 인산기 혹은 상기한 수식기로 변환되는 기에 의해 수식되어 있어도 좋다.
단일쇄의 핵산으로서는, 예컨대 표적 유전자의 연속되는 15~27 염기(뉴클레오시드), 바람직하게는 15~25 염기, 보다 바람직하게는 15~23 염기, 더욱 바람직하게는 15~21 염기, 특히 바람직하게는 15~19 염기로 이루어지는 서열의 상보 서열로 이루어지는 핵산, 또는 이 핵산에 있어서 1~3 염기, 바람직하게는 1~2 염기, 보다 바람직하게는 1 염기가 치환, 결실 혹은 부가되고, 또 표적 단백질의 발현 억제 활성을 갖는 핵산이라면 어느 것이라도 좋다. 이 단일쇄의 핵산은, 15~30 염기(뉴클레오시드)의 연속으로 이루어지는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 15~27 염기, 더욱 바람직하게는 15~25 염기, 특히 바람직하게는 15~23 염기의 단일쇄 핵산이 적합하게 이용된다.
단일쇄 핵산으로서, 상기한 이중쇄 핵산을 구성하는 안티센스쇄 및 센스쇄를, 스페이서 서열(스페이서 올리고 뉴클레오티드)를 통해 연결한 것을 이용하여도 좋다. 스페이서 올리고 뉴클레오티드로서는 6~12 염기의 단일쇄 핵산 분자가 바람직하고, 그 5' 말단 측의 서열은 2개의 U인 것이 바람직하다. 스페이서 올리고 뉴클레오티드의 예로서, UUCAAGAGA의 서열로 이루어지는 핵산을 들 수 있다. 스페이서 올리고 뉴클레오티드에 의해서 이어지는 안티센스쇄 및 센스쇄의 순서는 어느 쪽이 5' 측으로 되어도 좋다. 상기 단일쇄 핵산으로서는, 예컨대 스템 루프 구조에 의해서 이중쇄 형성부를 갖는 shRNA 등의 단일쇄 핵산인 것이 바람직하다. shRNA 등의 단일쇄 핵산은 통상 50~70 염기 길이이다.
리보뉴클레아제 등의 작용에 의해, 상기한 단일쇄 핵산 또는 이중쇄 핵산을 생성하도록 설계한, 70 염기 길이 이하, 바람직하게는 50 염기 길이 이하, 더욱 바람직하게는 30 염기 길이 이하의 핵산을 이용하여도 좋다.
한편, 본 발명에서 이용되는 핵산은, 이미 알려진 RNA 또는 DNA 합성법 및 RNA 또는 DNA 수식법을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 본 발명의 양이온성 지질 및 핵산을 함유하는 조성물이고, 예컨대 본 발명의 양이온성 지질과 핵산과의 복합체, 또는 본 발명의 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산과의 복합체를 함유하는 조성물, 상기 복합체 및 상기 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하는 조성물 등을 들 수 있다. 상기 지질막은, 지질 단일막(지질 1 분자막)이라도 지질 이중막(지질 2 분자막)이라도 좋다. 한편, 상기 지질막에, 본 발명의 양이온성 지질, 중성 지질 및/또는 고분자를 함유하고 있어도 좋다. 또한, 상기 복합체 및/또는 상기 지질막에, 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질을 함유하고 있어도 좋다.
또한, 본 발명의 조성물로서는, 예컨대 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질과 핵산과의 복합체, 또는 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하고, 이 지질막에 본 발명의 양이온성 지질을 함유하는 조성물 등도 들 수 있다. 이 경우의 지질막도, 지질 단일막(지질 1 분자막)이라도 지질 이중막(지질 2 분자막)이라도 좋다. 또한, 상기 지질막에, 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질, 중성 지질 및/또는 고분자를 함유하고 있더라도 좋다.
본 발명의 조성물에 있어서, 본 발명의 양이온성 지질과 핵산과의 복합체를 함유하는 조성물, 본 발명의 양이온성 지질과 핵산과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하고, 상기 지질막에 본 발명의 양이온성 지질을 함유하는 조성물, 그리고 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질과 핵산과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하고, 상기 지질막에 본 발명의 양이온성 지질을 함유하는 조성물이 보다 바람직하고, 본 발명의 양이온성 지질과 핵산과의 복합체를 함유하는 조성물, 그리고 본 발명의 양이온성 지질과 핵산과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하고, 상기 지질막에 본 발명의 양이온성 지질을 함유하는 조성물이 보다 바람직하고, 본 발명의 양이온성 지질과 핵산과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하고, 상기 지질막에 본 발명의 양이온성 지질을 함유하는 조성물이 가장 바람직하다. 한편, 어느 경우나 상기 지질막에, 중성 지질 및/또는 고분자를 함유하고 있어도 좋다. 또한, 상기 복합체 및/또는 상기 지질막에, 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질을 함유하고 있어도 좋다.
복합체의 형태로서는, 예컨대 핵산과 지질 단일(1 분자)층으로 이루어지는 막(역미셀)과의 복합체, 핵산과 리포좀과의 복합체, 핵산과 미셀과의 복합체 등을 들 수 있고, 바람직하게는 핵산과 지질 단일층으로 이루어지는 막과의 복합체 또는 핵산과 리포좀과의 복합체를 들 수 있다.
복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하는 조성물로서는, 예컨대 상기 복합체 및 상기 복합체를 지질 이중막으로 봉입하는 리포좀 등을 들 수 있다.
한편, 본 발명의 조성물에는, 본 발명의 양이온성 지질을 1종 또는 복수 종을 사용하여도 좋고, 또한 본 발명의 양이온성 지질에는, 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질을 혼합하여도 좋다.
본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질로서는, 예컨대, 일본 특허공개 소61-161246호 공보(미국 특허 5049386호 명세서) 중에 개시된, N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄클로리드(DOTMA), N-(2,3-디-(9-(Z)-옥타데세노일옥시))-프로파-1-일-N,N,N-트리메틸암모늄클로리드(DOTAP) 등, 국제공개 제91/16024호 팜플렛 및 국제공개 제97/019675호 팜플렛 중에 개시된, N-[1-(2,3-디올레일옥시프로필)]-N,N-디메틸-N-히드록시에틸브롬화암모늄(DORIE), 2,3-디올레일옥시-N-[2-(스페르민카르복시아미드)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄트리플루오로아세트산(DOSPA) 등, 국제공개 제2005/121348호 팜플렛 중에 개시된, DLinDMA 등, 국제공개 제2009/086558호 팜플렛 중에 개시된, DLin-K-DMA, 국제공개 제2011/136368호 팜플렛 중에 개시된, (3R,4R)-3,4-비스((Z)-헥사데카-9-에닐옥시)-1-메틸피롤리딘, N-메틸-N,N-비스(2-((Z)-옥타데카-6-에닐옥시)에틸)아민 등을 들 수 있고, 바람직하게는 DOTMA, DOTAP, DORIE, DOSPA, 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-DMA) 등의 2개의 비치환 알킬기를 갖는 3급 아민 부위 또는 3개의 비치환 알킬기를 갖는 4급 암모늄 부위를 갖는 양이온성 지질을 들 수 있고, 보다 바람직하게는, 상기 3급 아민 부위를 갖는 양이온성 지질을 들 수 있다. 상기 3급 아민 부위 및 상기 4급 암모늄 부위의 비치환 알킬기는 메틸기인 것이 보다 바람직하다.
한편, 본 발명의 조성물은, 핵산을 함유할 수 있는데, 핵산과 화학적으로 근사한 화합물도 함유할 수도 있다.
본 발명의 조성물은, 공지된 제조 방법 또는 그것에 준하여 제조할 수 있으며, 어떠한 제조 방법으로 제조된 것이라도 좋다. 예컨대, 조성물의 하나인 리포좀을 함유하는 조성물의 제조에는 공지된 리포좀의 조제 방법을 적용할 수 있다. 공지된 리포좀의 조제 방법으로서는, 예컨대 반감(Bangham) 등의 리포좀 조제법 ["저널 오브 몰레큘러 바이올로지(J. Mol. Biol.)", 1965년, 제13권, p.238-252 참조], 에탄올 주입법["저널 오브 셀 바이올로지(J. Cell Biol.)", 1975년, 제66권, p.621-634 참조], 프렌치프레스법["에프이비에스 레터즈(FEBS Lett.)", 1979년, 제99권, p.210-214 참조], 동결융해법["아카이브스 오브 바이오케미스트리 앤드 바이오피직스(Arch. Biochem. Biophys.)", 1981년, 제212권, p.186-194 참조], 역상증발법["프로시딩즈 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)", 1978년, 제75권, p.4194-4198 참조] 또는 pH 구배법(예컨대 일본 특허 제2572554호 공보, 일본 특허 제2659136호 공보 등 참조) 등을 들 수 있다. 리포좀을 제조할 때에 리포좀을 분산시키는 용액으로서는, 예컨대 물, 산, 알칼리, 여러 가지 완충액, 생리식염수 또는 아미노산 수액 등을 이용할 수 있다. 또한, 리포좀을 제조할 때는, 예컨대 시트르산, 아스코르빈산, 시스테인 또는 에틸렌디아민사아세트산(EDTA) 등의 항산화제, 예컨대 글리세린, 포도당 또는 염화나트륨 등의 등장화제등의 첨가도 가능하다. 또한, 예컨대, 본 발명의 양이온성 지질, 또는 본 발명의 양이온성 지질과 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질과의 혼합물 등을 예컨대 에탄올 등의 유기 용매에 용해하고, 용매를 유거한 후, 생리식염수 등을 첨가, 진탕 교반하여, 리포좀을 형성시킴에 의해서도 리포좀을 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은, 예컨대, 본 발명의 양이온성 지질, 또는 본 발명의 양이온성 지질과 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질과의 혼합물을 클로로포름에 미리 용해하고, 이어서 핵산의 수용액과 메탄올을 가하여 혼합하여 양이온성 지질/핵산의 복합체를 형성시키고, 또한 클로로포름층을 추출하고, 이것에 폴리에틸렌글리콜화 인지질과 중성의 지질과 물을 가하여 유중수형(W/O) 에멀젼을 형성하고, 역상증발법으로 처리하여 제조하는 방법(일본 특허공표 2002-508765호 공보 참조)이나, 핵산을, 산성의 전해질 수용액에 용해하여, 예컨대, 본 발명의 양이온성 지질, 또는 본 발명의 양이온성 지질과 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질과의 혼합물(에탄올 속)을 가하고, 에탄올 농도를 20 v/v%까지 내려 상기 핵산 내포 리포좀을 조제하고, 사이징 여과하고, 투석에 의해서 과잉의 에탄올을 제거한 후, 시료를 pH를 더욱 올려 투석하여 조성물 표면에 부착된 핵산을 제거하여 제조하는 방법(일본 특허공표 2002-501511호 공보 및 바이오케미카 엣트 바이오피지카 악타(Biochimica et Biophysica Acta), 2001년, 제1510권, p.152-166 참조) 등에 의해서 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물 중, 본 발명의 양이온성 지질과 핵산과의 복합체, 또는 본 발명의 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산과의 복합체 및 이 복합체를 봉입한 지질 이중막을 함유하는 리포좀을 함유하는 조성물은, 예컨대, 국제공개 제02/28367호 팜플렛 및 국제공개 제2006/080118호 팜플렛 등에 기재된 제조 방법에 따라서 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물 중, 예컨대 본 발명의 양이온성 지질과 핵산과의 복합체, 또는 본 발명의 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산과의 복합체 및 이 복합체를 봉입한 지질막을 함유하는 조성물, 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질과 핵산과의 복합체, 또는 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하고, 상기 지질막에 본 발명의 양이온성 지질을 함유하는 조성물 등은, 국제공개 제02/28367호 팜플렛 및 국제공개 제2006/080118호 팜플렛 등에 기재된 제조 방법에 따라서, 각각의 복합체를 제조하고, 물 또는 0~20% 에탄올 수용액 속에, 상기 복합체를 용해시키지 않고서 분산시키고(A액), 별도로 각각의 지질막 성분을, 예컨대 에탄올 수용액 속에 용해시키고(B액), 등량의 A액과 B액을 혼합하고, 또한 적절히 물을 가함으로써 얻을 수 있다. 한편, A액 및 B액 중의 양이온성 지질로서는, 1종 또는 복수 종의 본 발명의 양이온성 지질 또는 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질을 사용하여도 좋고, 또한 본 발명의 양이온성 지질과 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질을 조합시켜 혼합하여 사용하여도 좋다.
한편, 본 발명에서, 본 발명의 양이온성 지질과 핵산과의 복합체, 또는 본 발명의 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산과의 복합체 및 이 복합체를 봉입한 지질막을 함유하는 조성물, 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질과 핵산과의 복합체, 또는 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산과의 복합체 그리고 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하고, 상기 지질막에 본 발명의 양이온성 지질을 함유하는 조성물 등의 제조 중 및 제조 후에, 복합체 중의 핵산과 지질막 중의 양이온성 지질과의 정전 상호 작용이나, 복합체 중의 양이온성 지질과 지질막 중의 양이온성 지질과의 융합에 의해서, 복합체 및 막의 구조가 변위된 것도, 각각 본 발명의 양이온성 지질과 핵산과의 복합체, 또는 본 발명의 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산과의 복합체 및 이 복합체를 봉입한 지질막을 함유하는 조성물, 또는 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질과 핵산과의 복합체, 또는 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 핵산과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하고, 상기 지질막에 본 발명의 양이온성 지질을 함유하는 조성물 등에 포함된다.
국제공개 제02/28367호 및 국제공개 제2006/080118호 등에 기재된 제조 방법에 따라서, 핵산(상기와 동의), 바람직하게는 이중쇄 핵산과 본 발명의 양이온성 지질 및/또는 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질을 함유하는 리포좀과의 복합체를 제조하고, 물 또는 0~20% 에탄올 수용액 속에, 상기 복합체를 용해시키지 않고서 분산시키고(A액), 별도로 본 발명의 양이온성 지질 및/또는 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질을, 에탄올 수용액 속에 용해시키고(B액), 등량 또는 체적비 1:1의 A액과 B액을 혼합하는 것, 또는 적절히 물을 더 가함에 의해서도, 상기 핵산과 상기 양이온성 지질을 함유하는 조성물을 얻을 수 있다. 상기 조성물은, 바람직하게는 양이온성 지질과 핵산과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하는 조성물이고, 보다 바람직하게는 상기 핵산과 상기 양이온성 지질을 함유하는 지질 단일층으로 이루어지는 막(역미셀)과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하는 조성물이다. 이들 경우의 지질막은, 지질 단일막(지질 1 분자막)이라도 지질 이중막(지질 2 분자막)이라도 좋다.
또한, 이 개시하는 상기 핵산과 상기 리포좀과의 복합체 중의 리포좀은, 미리 크기를, 평균 입자경 10 nm~400 nm, 보다 바람직하게는 30 nm~110 nm, 더욱 바람직하게는 40 nm~80 nm로 조절한 리포좀이 바람직하다. 또한, 상기 복합체 및/또는 지질막에, 중성 지질 및/또는 고분자를 함유하고 있어도 좋다. 또한, A액은, 리포좀과 상기 핵산과의 복합체를 형성시킬 수 있으면, 에탄올 농도는 20~40%라도 좋다.
또한, 등량의 A액과 B액을 혼합하는 대신에, A액과 B액을 혼합 후에 복합체가 용해되지 않으면서, 또 B액 중의 양이온성 지질이 용해되지 않는 에탄올 농도, 바람직하게는 복합체가 용해되지 않고, B액 중의 양이온성 지질이 용해되지 않으면서, 또 에탄올 농도가 30~60%의 에탄올 수용액으로 되는 비로 A액과 B액을 혼합하는 것으로 바꿔도 좋고, 혹은 A액과 B액을 혼합 후에 복합체가 용해되지 않는 에탄올 농도가 되는 비로 A액과 B액을 혼합하고, 물을 또 가함으로써, B액 중의 양이온성 지질이 용해되지 않게 되는 에탄올 농도로 하는 것으로 하여도 좋다.
이 개시하는 상기 A액 속에서의 핵산과 리포좀과의 복합체는, A액과 B액을 혼합하고, 또 적절히 물을 가한 후에는, 양이온성 지질을 함유하는 지질 단일층으로 이루어지는 막(역미셀)과 핵산과의 복합체로 형태가 변화하고 있다. 이 개시하는 제조 방법으로 얻어지는 상기 핵산과 상기 양이온성 지질을 함유하는 조성물은, 바람직하게는 양이온성 지질과 핵산과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하는 조성물이고, 보다 바람직하게는, 양이온성 지질을 함유하는 지질 단일층으로 이루어지는 막(역미셀)과 핵산과의 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하고, 상기 지질막에 양이온성 지질을 함유하는 조성물이며, 그 제조성(수율 및/또는 균일성)은 우수하다.
본 발명의 조성물에 있어서, 복합체 중의 본 발명의 양이온성 지질의 분자의 총수는, 상기 핵산의 인 원자의 수에 대하여 0.5~4배인 것이 바람직하고, 1.5~3.5배인 것이 보다 바람직하고, 2~3배인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 복합체 중의 본 발명의 양이온성 지질 및 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질의 분자의 총수는, 상기 핵산의 인 원자의 수에 대하여 0.5~4배인 것이 바람직하고, 1.5~3.5배인 것이 보다 바람직하고, 2~3배인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 조성물에 있어서, 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하는 조성물 중의 본 발명의 양이온성 지질의 분자의 총수는, 상기 핵산의 인 원자의 수에 대하여 1~10배인 것이 바람직하고, 2.5~9배인 것이 보다 바람직하고, 3.5~8배인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 조성물 중의 본 발명의 양이온성 지질 및 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질의 분자의 총수는, 상기 핵산의 인 원자의 수에 대하여 1~10배인 것이 바람직하고, 2.5~9배인 것이 보다 바람직하고, 3.5~8배인 것이 더욱 바람직하다.
중성 지질로서는, 단순 지질, 복합 지질 또는 유도 지질의 어떠한 것이라도 좋고, 예컨대 인지질, 글리세로 당 지질, 스핑고 당 지질, 스핑고이드 또는 스테롤 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물에 있어서 중성 지질을 함유하는 경우에는, 중성 지질의 분자의 총수는, 본 발명의 양이온성 지질 및 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질의 분자의 총수에 대하여 0.1~1.8배인 것이 바람직하고, 0.3~1.2배인 것이보다 바람직하고, 0.4~1.0배인 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 조성물은, 어느 것이나 중성 지질을, 복합체에 함유하여도 좋고, 복합체를 봉입하는 지질막에 함유하고 있어도 좋으며, 적어도 복합체를 봉입하는 지질막에 함유하고 있는 것이 보다 바람직하고, 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막의 어느 쪽에나 함유하고 있는 것이 보다 바람직하다.
중성 지질에 있어서의 인지질로서는, 예컨대 포스파티딜콜린(구체적으로는 대두포스파티딜콜린, 난황포스파티딜콜린(EPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC) 등), 포스파티딜에탄올아민(구체적으로는 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 16-0-모노메틸PE, 16-0-디메틸PE, 18-1-트랜스PE, 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE), 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민(SOPE) 등), 글리세로 인지질(구체적으로는 포스파티딜세린, 포스파티딘산, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 리조포스파티딜콜린 등), 스핑고 인지질(구체적으로는 스핑고미엘린, 세라미드포스포에탄올아민, 세라미드포스포글리세롤, 세라미드포스포글리세로인산 등), 글리세로포스포노 지질, 스핑고포스포노 지질, 천연 레시틴(구체적으로는 난황 레시틴, 대두 레시틴 등) 또는 수소 첨가 인지질(구체적으로는 수소 첨가 대두포스파티딜콜린 등) 등의 천연 또는 합성의 인지질을 들 수 있다.
중성 지질에 있어서의 글리세로 당 지질로서는, 예컨대 술폭시리보실글리세리드, 디글리코실디글리세리드, 디갈락토실디글리세리드, 갈락토실디글리세리드 또는 글리코실디글리세리드 등을 들 수 있다.
중성 지질에 있어서의 스핑고 당 지질로서는, 예컨대 갈락토실세레브로시드, 락토실세레브로시드 또는 강글리오시드 등을 들 수 있다.
중성 지질에 있어서의 스핑고이드로서는, 예컨대 스핑간, 이코사스핑간, 스핑고신 또는 이들의 유도체 등을 들 수 있다. 유도체로서는, 예컨대 스핑간, 이코사스핑간 또는 스핑고신 등의 -NH2를 -NHCO(CH2)xCH3(식에서, x는 0~18의 정수이고, 그 중에서도 6, 12 또는 18이 바람직하다)으로 변환한 것 등을 들 수 있다.
중성 지질에 있어서의 스테롤로서는, 예컨대 콜레스테롤, 디히드로콜레스테롤, 라노스테롤, β-시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤, 에르고카스테롤, 푸코스테롤 또는 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에틸)카르바모일]콜레스테롤(DC-Chol) 등을 들 수 있다.
고분자로서는, 예컨대 단백질, 알부민, 덱스트란, 폴리펙트(polyfect), 키토산, 덱스트란황산, 예컨대 폴리-L-리신, 폴리에틸렌이민, 폴리아스파라긴산, 스티렌말레산 공중합체, 이소프로필아크릴아미드-아크릴피롤리돈 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 수식 덴드리머, 폴리젖산, 폴리젖산폴리글리콜산 또는 폴리에틸렌글리콜화폴리젖산 등의 고분자 또는 이들 염의 하나 이상으로 이루어지는 미셀 등을 들 수 있다.
여기서, 고분자의 염은, 예컨대 금속염, 암모늄염, 산 부가염, 유기아민 부가염, 아미노산 부가염 등을 포함한다. 금속염으로서는, 예컨대 리튬염, 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염, 마그네슘염, 칼슘염 등의 알칼리 토류 금속염, 알루미늄염 또는 아연염 등을 들 수 있다. 암모늄염으로서는, 예컨대 암모늄 또는 테트라메틸암모늄 등의 염을 들 수 있다. 산 부가염으로서는, 예컨대 염산염, 황산염, 질산염 또는 인산염 등의 무기산염, 및 아세트산염, 말레산염, 푸마르산염 또는 시트르산염 등의 유기산염을 들 수 있다. 유기아민 부가염으로서는, 예컨대 모르폴린 또는 피페리딘 등의 부가염을 들 수 있다. 아미노산 부가염으로서는, 예컨대 글리신, 페닐알라닌, 아스파라긴산, 글루타민산 또는 리신 등의 부가염을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 모두, 예컨대 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자에서 선택되는 하나 이상의 물질의 지질 유도체 혹은 지방산 유도체, 또는 계면활성제 등을 함유하는 것이 바람직하며, 복합체에 함유하고 있어도 좋고, 복합체를 봉입하는 지질막에 함유하고 있어도 좋고, 복합체 및 이 복합체를 봉입하는 지질막 함께 함유하고 있는 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 조성물이, 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자에서 선택되는 하나 이상 물질의 지질 유도체 혹은 지방산 유도체를 함유하는 경우에는, 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자에서 선택되는 하나 이상 물질의 지질 유도체 및 지방산 유도체의 분자의 총수는, 본 발명의 양이온성 지질 및 본 발명의 양이온성 지질 이외의 양이온성 지질의 분자의 총수에 대하여 0.05~0.3배인 것이 바람직하고, 0.07~0.25배인 것이 보다 바람직하고, 0.1~0.2배인 것이 더욱 바람직하다.
당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자에서 선택되는 하나 이상 물질의 지질 유도체 혹은 지방산 유도체, 또는 계면활성제로서는, 바람직하게는, 당 지질, 또는 수용성 고분자의 지질 유도체 혹은 지방산 유도체를 들 수 있고, 보다 바람직하게는, 수용성 고분자의 지질 유도체 또는 지방산 유도체를 들 수 있다. 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자에서 선택되는 하나 이상 물질의 지질 유도체 혹은 지방산 유도체, 또는 계면활성제는, 분자의 일부가 조성물의 다른 구성 성분과 예컨대 소수성 친화력, 정전적 상호 작용 등으로 결합하는 성질을 지니고, 다른 부분이 조성물 제조시의 용매와 예컨대 친수성 친화력, 정전적 상호 작용 등으로 결합하는 성질을 갖는, 이면성(二面性)을 지닌 물질인 것이 바람직하다.
당, 펩티드 또는 핵산의 지질 유도체 또는 지방산 유도체로서는, 예컨대 자당, 소르비톨, 젖당 등의 당, 예컨대 카제인 유래 펩티드, 난백 유래 펩티드, 대두 유래 펩티드, 글루타치온 등의 펩티드, 또는 예컨대 DNA, RNA, 플라스미드, siRNA, ODN 등의 핵산과, 상기 조성물의 정의 중에서 예로 든 중성 지질 혹은 본 발명의 양이온성 지질 또는 예컨대 스테아린산, 팔미틴산, 미리스틴산, 라우린산 등의 지방산이 결합하여 이루어지는 것 등을 들 수 있다.
또한, 당의 지질 유도체 또는 지방산 유도체로서는, 예컨대 상기 조성물의 정의 중에서 예로 든 글리세로 당 지질 또는 스핑고 당 지질 등도 포함된다.
수용성 고분자의 지질 유도체 또는 지방산 유도체로서는, 예컨대 폴리에틸렌글리콜, 폴리글리세린, 폴리에틸렌이민, 폴리비닐알코올, 폴리아크릴산, 폴리아크릴아미드, 올리고당, 덱스트린, 수용성 셀룰로오스, 덱스트란, 콘드로이친황산, 폴리글리세린, 키토산, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아스파라긴산아미드, 폴리-L-리신, 만난, 풀루란, 올리고글리세롤 등 또는 이들의 유도체와, 상기 조성물의 정의 중에서 예로 든 중성 지질 혹은 본 발명의 양이온성 지질, 또는 예컨대 스테아린산, 팔미틴산, 미리스틴산 또는 라우린산 등의 지방산이 결합하여 이루어지는 것, 이들의 염 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는, 폴리에틸렌글리콜 또는 폴리글리세린 등의 지질 유도체 또는 지방산 유도체 및 이들의 염을 들 수 있고, 더욱 바람직하게는, 폴리에틸렌글리콜의 지질 유도체 또는 지방산 유도체 및 이들의 염을 들 수 있다.
폴리에틸렌글리콜의 지질 유도체 또는 지방산 유도체로서는, 예컨대 폴리에틸렌글리콜화 지질[구체적으로는 폴리에틸렌글리콜-포스파티딜에탄올아민(보다 구체적으로는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000](PEG-DSPE), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000](PEG-DMPE) 등), 폴리옥시에틸렌경화피마자유60, 크레모포아 이엘(CREMOPHOR EL) 등], 폴리에틸렌글리콜소르비탄지방산에스테르류(구체적으로는 모노올레인산폴리옥시에틸렌소르비탄 등) 또는 폴리에틸렌글리콜지방산에스테르류 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜화 지질을 들 수 있다.
폴리글리세린의 지질 유도체 또는 지방산 유도체로서는, 예컨대 폴리글리세린화 지질(구체적으로는 폴리글리세린-포스파티딜에탄올아민 등) 또는 폴리글리세린지방산에스테르류 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 폴리글리세린화 지질을 들 수 있다.
계면활성제로서는, 예컨대 모노올레인산폴리옥시에틸렌소르비탄(구체적으로는 폴리솔베이트 80 등), 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜(구체적으로는 플루로닉 F68 등), 소르비탄지방산에스테르(구체적으로는 소르비탄모노라우레이트, 소르비탄모노올레에이트 등), 폴리옥시에틸렌 유도체(구체적으로는 폴리옥시에틸렌경화피마자유60, 폴리옥시에틸렌라우릴알코올 등), 글리세린지방산에스테르 또는 폴리에틸렌글리콜알킬에테르 등을 들 수 있고, 바람직하게는, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜, 글리세린지방산에스테르 또는 폴리에틸렌글리콜알킬에테르 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물 중의 복합체 및 지질막에는, 예컨대 수용성 고분자 등에 의한 표면 개질도 임의로 행할 수 있다[라직(D. D. Lasic), 마틴(F. Martin) 편, "스텔스 리포좀즈(Stealth Liposomes)"(미국), 씨알씨 프레스 잉크(CRC Press Inc), 1995년, p.93-102 참조]. 표면 개질에 사용할 수 있는 수용성 고분자로서는, 예컨대 폴리에틸렌글리콜, 폴리글리세린, 폴리에틸렌이민, 폴리비닐알코올, 폴리 아크릴산, 폴리아크릴아미드, 올리고당, 덱스트린, 수용성 셀룰로오스, 덱스트란, 콘드로이친황산, 폴리글리세린, 키토산, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아스파라긴산아미드, 폴리-L-리신, 만난, 풀루란, 올리고글리세롤 등을 들 수 있고, 바람직하게는 덱스트란, 풀루란, 만난, 아밀로펙틴 또는 히드록시에틸 전분 등을 들 수 있다. 또한, 표면 개질에는, 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자에서 선택되는 하나 이상 물질의 지질 유도체 또는 지방산 유도체(상기와 동의) 등을 이용할 수 있다. 상기 표면 개질은, 본 발명의 조성물 중의 복합체 및 지질막에 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 고분자에서 선택되는 하나 이상 물질의 지질 유도체 혹은 지방산 유도체, 또는 계면활성제를 함유시키는 방법의 하나이다.
또한, 표적화 리간드를, 본 발명 조성물의 지질 성분의 극성 헤드 잔기에 공유 결합함으로써 본 발명 조성물의 표면에 직접 결합시키는 것도 임의로 행할 수 있다(국제공개 제2006/116107호 팜플렛 참조).
본 발명 조성물 중의 복합체 또는 복합체를 봉입하는 지질막의 평균 입자경은, 원하는 바에 따라 자유롭게 선택할 수 있지만, 하기하는 평균 입자경으로 하는 것이 바람직하다. 평균 입자경을 조절하는 방법으로서는, 예컨대 익스트루젼법, 큰 다중막 리포좀(MLV) 등을 기계적으로 분쇄(구체적으로는 맨튼-가울린, 마이크로플루이다이저 등을 사용)하는 방법[뮬러(R. H. Muller), 베니타(S. Benita), 봄(B. Bohm) 편저, "에멀젼 앤드 나노서스펜젼즈 포 더 포뮬레이션 오브 포얼리 솔러블 드러그스(Emulsion and Nanosuspensions for the Formulation of Poorly Soluble Drugs)", 독일, 사이엔티픽 퍼블리셔즈 스튜트가르트(Scientific Publishers Stuttgart), 1998년, p.267-294 참조] 등을 들 수 있다.
본 발명 조성물 중의 복합체의 크기는, 평균 입자경이 약 5 nm~200 nm인 것이 바람직하고, 약 20 nm~150 nm인 것이 보다 바람직하고, 약 30 nm~100 nm인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 조성물(복합체를 봉입하는 지질막)의 크기는, 평균 입자경이 약 10 nm~300 nm인 것이 바람직하고, 약 30 nm~200 nm인 것이 보다 바람직하고, 약 50 nm~150 nm인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명 조성물 중의 복합체 또는 복합체를 봉입하는 지질막의 평균 입자경은 예컨대 동적광산란법으로 측정할 수 있다.
본 발명의 조성물을, 포유류의 세포에 도입함으로써, 본 발명 조성물 중의 핵산을 세포 내에 도입할 수 있다.
인비보에 있어서의 본 발명 조성물의 포유류의 세포에의 도입은, 인비보에 있어서 행할 수 있는 공지된 트랜스펙션 순서에 따라서 행하면 된다. 예컨대, 본 발명의 조성물을, 사람을 포함하는 포유동물에게 정맥내 투여함으로써, 예컨대 종양 또는 염증이 생긴 장기 또는 부위에 송달되어, 송달 장기 또는 부위의 세포 내에 본 발명 조성물 중의 핵산을 도입할 수 있다. 종양 또는 염증이 생긴 장기 또는 부위로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 위, 대장, 간장, 폐, 비장, 췌장, 신장, 방광, 피부, 혈관, 안구 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물을, 사람을 포함하는 포유동물에게 정맥내 투여함으로써, 예컨대 간장, 폐, 비장 및/또는 신장에 송달되어, 송달 장기 또는 부위의 세포 내에 본 발명 조성물 중의 핵산을 도입할 수 있다. 간장, 폐, 비장 및/또는 신장의 세포는, 정상 세포, 종양 혹은 염증에 관련된 세포 또는 그 밖의 질환에 관련된 세포의 어느 것이라도 좋다.
본 발명 조성물 중의 핵산이, RNA 간섭(RNAi)을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 작용을 갖는 핵산이라면, 인비보로 포유류의 세포 내에, 표적 유전자의 발현을 억제하는 상기 핵산 등을 도입할 수 있어, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 투여 대상은 사람인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서의 표적 유전자가, 예컨대 간장, 폐, 신장 또는 비장에서 발현되는 유전자, 바람직하게는 간장에서 발현되는 유전자라면, 본 발명의 조성물을, 간장, 폐, 신장 또는 비장에 관련된 질환의 치료제 또는 예방제, 바람직하게는 간장에 관련된 질환의 치료제 또는 예방제로서 사용할 수 있다.
즉, 본 발명은, 상기 설명한 본 발명의 조성물을 포유동물에게 투여하는 간장, 폐, 신장 또는 비장에 관련된 질환의 치료 방법도 제공한다. 투여 대상은 사람인 것이 바람직하고, 간장, 폐, 신장 또는 비장에 관련된 질환을 앓고 있는 사람이 보다 바람직하다.
또한, 본 발명의 조성물은, 간장, 폐, 신장 또는 비장에 관련된 질환의 치료제 또는 예방제에 관한 인비보의 약효 평가 모델에 있어서, 표적 유전자를 억제하는 것의 유효성을 검증하기 위한 툴로서 사용할 수도 있다.
본 발명의 조성물은, 예컨대 혈액 성분 등의 생체 성분(예컨대 혈액, 소화관 등) 속에서의 상기 핵산의 안정화, 부작용의 저감 또는 표적 유전자의 발현 부위를 포함하는 조직 또는 장기에의 약제 집적성의 증대 등을 목적으로 하는 제제로서도 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물을, 의약품의 간장, 폐, 신장 또는 비장에 관련된 질환 등의 치료제 또는 예방제로서 사용하는 경우, 투여 경로로서는, 치료할 때 가장 효과적인 투여 경로를 사용하는 것이 바람직하고, 예컨대 구강내, 기도내, 직장내, 피하, 근육내 또는 정맥내 등의 비경구 투여 또는 경구 투여를 들 수 있고, 바람직하게는 정맥내 투여 또는 근육내 투여를 들 수 있고, 보다 바람직하게는 정맥내 투여를 들 수 있다.
투여량은, 투여 대상의 병의 상태나 연령, 투여 경로 등에 따라 다르지만, 예컨대 핵산으로 환산한 1일 투여량이 약 0.1 μg~1000 mg이 되도록 투여하면 된다.
정맥내 투여 또는 근육내 투여에 적당한 제제로서는, 예컨대 주사제를 들 수 있고, 상술한 방법에 의해 조제한 조성물의 분산액을 그대로 예컨대 주사제 등의 형태로서 이용하는 것도 가능하지만, 상기 분산액으로부터 예컨대 여과, 원심분리 등에 의해서 용매를 제거하여 사용하는 것도, 그 분산액을 동결 건조하여 사용하는 것, 및/또는 예컨대 만니톨, 락토오스, 트레할로스, 말토스 혹은 글리신 등의 부형제를 가한 분산액을 동결 건조하여 사용할 수도 있다.
주사제의 경우, 상기한 조성물의 분산액 또는 상기한 용매를 제거 또는 동결건조한 조성물에, 예컨대 물, 산, 알칼리, 여러 가지 완충액, 생리식염수 또는 아미노산 수액 등을 혼합하여 주사제를 조제하는 것이 바람직하다. 또한, 예컨대 시트르산, 아스코르빈산, 시스테인 혹은 EDTA 등의 항산화제 또는 글리세린, 포도당 혹은 염화나트륨 등의 등장화제 등을 첨가하여 주사제를 조제하는 것도 가능하다. 또한, 예컨대 글리세린 등의 동결보존제를 가하여 동결 보존할 수도 있다.
이어서, 실시예, 참고예 및 시험예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예, 참고예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.
한편, 실시예 및 참고예에 기재된 프로톤 핵자기 공명 스펙트럼(1H NMR)은, 270 MHz, 300 MHz, 400 MHz 또는 500 MHz에서 측정된 것이며, 화합물 및 측정조건에 따라서는 교환성 프로톤이 명료하게 관측되지 않는 경우가 있다. 한편, 시그널의 다중도의 표기로서는 통상 이용되는 것을 이용하고 있는데, br은 외관상 폭넓은 시그널임을 나타낸다.
실시예 1
디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)아민(화합물 B-1)
암모니아(도쿄가세이고교사 제조, 약 2 mol/L 메탄올 용액, 18.0 mL, 36.0 mmol)에, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐 메탄술포네이트(뉴-체크 프렙 잉크(Nu-Chek Prep, Inc)사 제조, 1.55 g, 4.50 mmol)를 가하고, 마이크로파 반응 장치를 이용하여 130℃에서 3시간 교반했다. 반응액에 포화탄산수소나트륨 수용액을 가하여 클로로포름으로 5회 추출했다. 유기층을 합쳐서 포화식염수로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조 후 여과하여, 감압 농축함으로써 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐아민의 조생성물(粗生成物)을 얻었다.
얻어진 조생성물에 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐 메탄술포네이트(Nu-Chek Prep, Inc사 제조, 1.24 g, 3.60 mmol) 및 50% 수산화나트륨 수용액(1.44 g, 18.0 mmol)을 가하여, 유욕(油浴) 상 110℃에서 60분간 교반했다. 실온까지 냉각 후, 반응액을 아세트산에틸로 희석하고, 물, 이어서 포화식염수로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조 후 여과하여, 감압 농축했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름/메탄올=100/0~95/5)로 정제함으로써, 화합물 B-1(0.838 g, 수율 36.2%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 515(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.9 Hz, 6H), 1.30(br s, 33H), 1.41-1.54(m, 4H), 2.01-2.09(m, 8H), 2.59(t, J=7.2 Hz, 4H), 2.77(t, J=5.6 Hz, 4H), 5.28-5.43(m, 8H).
실시예 2
디((Z)-옥타데카-9-에닐)아민(화합물 B-2)
참고예 1과 같은 방법으로, 암모니아(도쿄가세이고교사 제조, 약 2 mol/L 메탄올 용액, 12.0 mL, 24.0 mmol) 및 (Z)-옥타데카-9-에닐 메탄술포네이트(Nu-Chek Prep, Inc사 제조, 1.87 g, 5.40 mmol)를 이용하여, 화합물 B-2(0.562 g, 수율 36.2%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 519(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.88(t, J=6.7 Hz, 6H), 1.29(br s, 45H), 1.41-1.52(m, 4H), 1.97-2.05(m, 8H), 2.58(t, J=7.2 Hz, 4H), 5.28-5.40(m, 4H).
실시예 3
디((Z)-헥사데카-9-에닐)아민(화합물 B-3)
참고예 1과 같은 방법으로, 암모니아(시그마-알드리치(SIGMA-ALDRICH)사 제조, 약 7 mol/L 메탄올 용액, 1.66 mL, 11.6 mmol) 및 (Z)-헥사데카-9-에닐 메탄술포네이트(Nu-Chek Prep, Inc사 제조, 0.488 g, 1.46 mmol)를 이용하여, 화합물 B-3(0.243 g, 수율 36.0%)을 얻었다.
1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.9 Hz, 6H), 1.24-1.37(m, 37H), 1.43-1.52(m, 4H), 1.98-2.05(m, 8H), 2.58(t, J=7.2 Hz, 4H), 5.31-5.38(m, 4H).
실시예 4
디((11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐)아민(화합물 B-4)
참고예 1과 같은 방법으로, 암모니아(SIGMA-ALDRICH사 제조, 약 7 mol/L 메탄올 용액, 1.60 mL, 11.2 mmol) 및 (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐 메탄술포네이트(Nu-Chek Prep, Inc사 제조, 0.521 g, 1.40 mmol)를 이용하여, 화합물 B-4(0.292 g, 수율 36.6%)를 얻었다.
1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.8 Hz, 6H), 1.24-1.39(m, 41H), 1.43-1.51(m, 4H), 2.02-2.08(m, 8H), 2.58(t, J=7.3 Hz, 4H), 2.77(t, J=6.7 Hz, 4H), 5.30-5.41(m, 8H).
실시예 5
3-(디메틸아미노)프로필 디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)카바메이트(화합물 A-1)
실시예 1에서 얻어지는 화합물 B-1(1.35 g, 2.63 mmol)을 클로로포름(18 mL)에 용해시키고, "저널 오브 아메리칸 케미컬 소사이어티(J. Am. Chem. Soc.)", 1981년, 제103권, p.4194-4199에 기재된 방법에 준한 방법으로 합성한 3-(디메틸아미노)프로필 4-니트로페닐 카보네이트염산염(화합물 VI-1)(1.20 g, 3.94 mmol) 및 트리에틸아민(1.47 mL, 10.5 mmol)을 가하고, 마이크로파 반응 장치를 이용하여 110℃에서 60분간 교반했다. 반응액에 화합물 VI-1(200 mg, 0.658 mmol)을 가하고, 마이크로파 반응 장치를 이용하여 110℃에서 20분간 교반했다. 반응액에 화합물 VI-1(200 mg, 0.658 mmol)을 가하고, 마이크로파 반응 장치를 이용하여 110℃에서 20분간 교반했다. 반응액에 화합물 VI-1(200 mg, 0.658 mmol)을 가하고, 마이크로파 반응 장치를 이용하여 110℃에서 20분간 교반했다. 반응액을 클로로포름으로 희석하고, 1 mol/L 수산화나트륨 수용액으로 3회 세정하고, 이어서 포화식염수로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조 후 여과하여, 감압 농축했다. 얻어진 잔사를 소량의 n-헥산/아세트산에틸(1/4)에 용해하여 아미노 수식 실리카겔의 패드에 흡착시키고, n-헥산/아세트산에틸(1/4)로 용출하여, 감압 농축했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름/메탄올=100/0~95/5)로 정제함으로써 화합물 A-1(1.39 g, 수율 82.2%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 644(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.7 Hz, 6H), 1.29(br s, 32H), 1.45-1.56(m, 4H), 1.74-1.85(m, 2H), 2.00-2.09(m, 8H), 2.23(s, 6H), 2.35(t, J=7.4 Hz, 2H), 2.77(t, J=5.8 Hz, 4H), 3.13-3.23(m, 4H), 4.10(t, J=6.4 Hz, 2H), 5.28-5.43(m, 8H).
실시예 6
3-(디메틸아미노)프로필 디((Z)-옥타데카-9-에닐)카바메이트(화합물 A-2)
실시예 5와 같은 방법으로, 화합물 B-1 대신에 실시예 2에서 얻어지는 화합물 B-2(0.156 g, 0.301 mmol)를 이용하여, 화합물 A-2(0.267 g, 수율 88.7%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 648(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.88(t, J=6.6 Hz, 6H), 1.28(br s, 44H), 1.45-1.55(m, 4H), 1.75-1.85(m, 2H), 1.97-2.04(m, 8H), 2.23(s, 6H), 2.34(t, J=7.6 Hz, 2H), 3.13-3.24(m, 4H), 4.10(t, J=6.4 Hz, 2H), 5.28-5.40(m, 4H).
실시예 7
3-(디메틸아미노)프로필 디((Z)-헥사데카-9-에닐)카바메이트(화합물 A-3)
실시예 5와 같은 방법으로, 화합물 B-1 대신에 실시예 3에서 얻어지는 화합물 B-3(0.164 g, 0.355 mmol)을 이용하여, 화합물 A-3(0.116 g, 수율 55.2%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 592(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.88(t, J=6.9 Hz, 6H), 1.21-1.38(m, 36H), 1.47-1.54(m, 4H), 1.75-1.83(m, 2H), 2.00-2.04(m, 8H), 2.22(s, 6H), 2.34(t, J=7.4 Hz, 2H), 3.11-3.24(m, 4H), 4.10(t, J=6.4 Hz, 2H), 5.30-5.38(m, 4H).
실시예 8
3-(디메틸아미노)프로필 디((11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐)카바메이트(화합물 A-4)
실시예 5와 같은 방법으로, 화합물 B-1 대신에 실시예 4에서 얻어지는 화합물 B-4(0.288 g, 0.505 mmol)를 이용하여, 화합물 A-4(0.290 g, 수율 82.2%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 700(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.8 Hz, 6H), 1.21-1.40(m, 40H), 1.46-1.54(m, 4H), 1.76-1.83(m, 2H), 2.02-2.08(m, 8H), 2.23(s, 6H), 2.35(t, J=7.6 Hz, 2H), 2.77(t, J=6.7 Hz, 4H), 3.10-3.24(m, 4H), 4.10(t, J=6.4 Hz, 2H), 5.30-5.41(m, 8H).
실시예 9
2-(디메틸아미노)에틸 디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)카바메이트(화합물 A-5)
실시예 5와 같은 방법으로, 실시예 1에서 얻어지는 화합물 B-1(0.215 g, 0.418 mmol), 및 화합물 VI-1 대신에 2-(디메틸아미노)에틸 4-니트로페닐 카보네이트염산염(화합물 VI-2)(0.162 g, 0.557 mmol)을 이용하여, 화합물 A-5(0.184 g, 수율 70.0%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 630(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.8 Hz, 6H), 1.12-1.39(m, 32H), 1.45-1.54(m, 4H), 2.00-2.07(m, 8H), 2.28(s, 6H), 2.57(t, J=7.2 Hz, 2H), 2.77(t, J=6.7 Hz, 4H), 3.11-3.24(m, 4H), 4.17(t, J=6.7 Hz, 2H), 5.28-5.41(m, 8H).
참고예 1: 5-아미노-N,N-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)펜탄아미드(화합물 XI-1)
실시예 1에서 얻어지는 화합물 B-1(150 mg, 0.292 mmol)을 클로로포름(4 mL)에 용해시키고, 5-(tert-부톡시카르보닐아미노)펜탄산(도쿄가세이고교사 제조, 95 mg, 0.438 mmol), 디이소프로필에틸아민(0.255 mL, 1.46 mmol) 및 HATU(O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트)(알드리치사 제조, 222 mg, 0.584 mmol)를 가하여, 실온에서 4시간 교반했다. 반응 혼합물에 포화탄산수소나트륨 수용액을 가하고, 수층을 아세트산에틸로 추출했다. 유기층을 물, 포화식염수로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조 후 여과하여, 감압 농축했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름/메탄올=100/0~97/3)로 정제함으로써 tert-부틸 5-(디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)아미노)-5-옥소펜틸카바메이트를 얻었다.
tert-부틸 5-(디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)아미노)-5-옥소펜틸카바메이트를 디클로로메탄(4 mL)에 용해시키고, 트리플루오로아세트산(0.450 mL, 5.84 mmol)을 가하여 실온에서 4시간 교반했다. 반응 혼합물에 포화탄산수소나트륨 수용액을 가하고, 수층을 클로로포름으로 추출했다. 유기층을 포화식염수로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조 후 여과하여, 감압 농축했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름/메탄올=100/0~90/10)로 정제함으로써 화합물 XI-1(124 mg, 수율 96.1%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 614(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.8 Hz, 6H), 1.28-1.38(m, 32H), 1.43-1.57(m, 6H), 1.63-1.73(m, 2H), 2.05(q, J=7.0 Hz, 8H), 2.30(t, J=7.2 Hz, 2H), 2.71(t, J=7.2 Hz, 2H), 2.77(t, J=6.2 Hz, 4H), 3.19(t, J=7.7 Hz, 2H), 3.28(t, J=7.7 Hz, 2H), 5.28-5.43(m, 8H).
참고예 2: 5-(디메틸아미노)-N,N-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)펜탄아미드(화합물 XI-2)
참고예 1에서 얻어지는 화합물 XI-1(90.0 mg, 0.147 mmol)을 1,2-디클로로에탄(2 mL)과 메탄올(2 mL)에 용해시키고, 포름알데히드(0.219 mL, 2.94 mmol) 및 나트륨트리아세톡시보로히드리드(아크로스 오가닉스(Acros Organics)사 제조, 311 mg, 1.47 mmol)를 가하여 실온에서 5시간 교반했다. 반응 용액에 포화탄산수소나트륨 수용액을 가하여, 수층을 아세트산에틸로 추출했다. 유기층을 포화염화나트륨 수용액으로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조 후 여과하여, 감압 농축했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름/메탄올=100/0~75/25)로 정제함으로써 화합물 XI-2(88.2 mg, 수율 93.9%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 642(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=7.0 Hz, 6H), 1.26-1.38(m, 32H), 1.46-1.71(m, 8H), 2.05(q, J=7.0 Hz, 8H), 2.22(s, 6H), 2.29(q, J=7.0 Hz, 4H), 2.77(t, J=6.2 Hz, 4H), 3.19(t, J=7.9 Hz, 2H), 3.28(t, J=7.7 Hz, 2H), 5.28-5.42(m, 8H).
참고예 3: 3-아미노프로필 디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)카바메이트(화합물 XI-3)
실시예 1에서 얻어지는 화합물 B-1(146 mg, 0.284 mmol)을 N,N-디메틸포름아미드(5 mL)에 용해시키고, "저널 오브 아메리칸 케미컬 소사이어티(J. Am. Chem. Soc.)", 1981년, 제103권, p.4194-4199에 기재된 방법에 준한 방법으로 합성한 tert-부틸 3-((4-니트로페녹시)카르보닐옥시)프로필카바메이트(145 mg, 0.426 mmol) 및 트리에틸아민(0.158 mL, 1.14 mmol)을 가하여, 실온에서 밤새 교반했다. 반응 혼합물에 물을 가하고, 수층을 아세트산에틸로 추출했다. 유기층을 물, 포화식염수로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조 후 여과하여, 감압 농축했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름/메탄올=100/0~98/2)로 정제함으로써 3-((N-부톡시카르보닐)아미노)프로필 디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)카바메이트를 얻었다.
3-((N-부톡시카르보닐)아미노)프로필 디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)카바메이트를 디클로로메탄(4 mL)에 용해시키고, 트리플루오로아세트산(0.242 mL, 3.13 mmol)을 가하여 실온에서 8시간 교반했다. 반응 혼합물에 포화탄산수소나트륨 수용액을 가하고, 수층을 클로로포름으로 추출했다. 유기층을 포화식염수로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조 후 여과하여, 감압 농축했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(NH 실리카겔, 클로로포름/메탄올=100/0~90/10)로 정제함으로써 화합물 XI-3(75.6 mg, 수율 43.3%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 616(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.8 Hz, 6H), 1.26-1.38(m, 32H), 1.46-1.54(m, 4H), 1.73-1.82(m, 2H), 2.05(q, J=6.6 Hz, 8H), 2.76-2.80(m, 6H), 3.18(br s, 4H), 4.15(t, J=6.2 Hz, 2H), 5.29-5.43(m, 8H).
참고예 4: 2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에틸 4-니트로페닐 카보네이트염산염(화합물 VI-3)
클로로포름산4-니트로페닐(도쿄가세이고교사 제조, 1.761 g, 8.56 mmol)의 디에틸에테르(20 mL) 용액에, 2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에탄올(도쿄가세이고교사 제조, 1.0 mL, 7.13 mmol)의 디에틸에테르(20 mL) 용액을 가하여, 실온에서 밤새 교반했다. 반응액을 감압 농축하고, 얻어진 잔사를 에탄올/디에틸에테르(1/1)로부터 결정화시키고, 여과하여 취함으로써 화합물 VI-3(1.27 g, 수율 54%)을 얻었다.
1H-NMR(DMSO-d6)δ: 1.59-1.77(m, 2H), 1.82-2.09(m, 3H), 2.15-2.26(m, 1H), 2.76(s, 3H), 2.93-3.05(m, 2H), 3.61-3.20(m, 3H), 4.80(br s, 1H), 6.95(d, J=9.2 Hz, 2H), 8.11(d, J=9.2 Hz, 2H)
참고예 5: 4-니트로페닐 3-(피페리딘-1-일)프로필 카보네이트염산염(화합물 VI-4)
클로로포름산4-니트로페닐(1.58 g, 7.67 mmol)의 디에틸에테르(32 mL) 용액에, 3-(피페리딘-1-일)프로판-1-올(SIGMA-ALDRICH사 제조, 1.00 mL, 6.39 mmol)을 가하여, 실온에서 밤새 교반했다. 반응액을 감압 농축하고, 얻어진 잔사를 에탄올로부터 결정화시키고, 여과하여 취함으로써 화합물 VI-4(1.86 g, 수율 84%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 309(M+H)+; 1H-NMR(DMSO-d6)δ: 1.28-1.49(m, 1H), 1.62-1.89(m, 5H), 2.10-2.26(m, 2H), 2.76-2.96(m, 2H), 3.04-3.19(m, 2H), 3.36-3.49(m, 2H), 4.33(t, J=6.1 Hz, 2H), 7.58(d, J=9.2 Hz, 2H), 8.33(d, J=9.2 Hz, 2H), 10.37(br s, 1H).
참고예 6: 4-니트로페닐 3-(피롤리딘-1-일)프로필 카보네이트염산염(화합물 VI-5)
클로로포름산4-니트로페닐(596 mg, 2.84 mmol)의 디에틸에테르(10 mL) 용액에, 3-(피롤리딘-1-일)프로판-1-올(ABCR사 제조, 386 mg, 2.84 mmol)디에틸에테르(10 mL) 용액을 가하여, 실온에서 2시간 교반했다. 반응액을 감압 농축하고, 얻어진 잔사를 에탄올로부터 결정화시키고, 여과하여 취함으로써 화합물 VI-5(498 mg, 수율 53%)를 얻었다.
1H-NMR(DMSO-d6)δ: 1.76-1.84(m, 2H), 1.85-2.00(m, 4H), 3.11-3.16(m, 2H), 3.30-3.44(m, 4H), 3.47(t, J=6.0 Hz, 2H), 4,77(br s, 1H), 6.95(d, J=9.2 Hz, 2H), 8.11(d, J=9.2 Hz, 2H)
실시예 10
2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에틸 디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)카바메이트(화합물 A-6)
실시예 1에서 얻어지는 화합물 B-1(0.161 g, 0.314 mmol)을 아세토니트릴(3.0 mL)에 용해시키고, 참고예 4에서 얻어지는 화합물 VI-3(0.156 g, 0.470 mmol) 및 트리에틸아민(0.219 mL, 1.57 mmol)을 가하여, 80℃에서 2시간 교반했다. 반응액을 아세트산에틸로 희석하여, 물로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조 후 여과하여, 감압 농축했다. 얻어진 잔사를 아미노 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(n-헥산/아세트산에틸=80/20)로 정제함으로써, 화합물 A-6(0.172 g, 수율 82%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 670(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.9 Hz, 6H), 1.20-1.40(m, 32H), 1.45-1.57(m, 6H), 1.62-1.83(m, 2H), 1.94-2.18(m, 12H), 2.31(s, 3H), 2.77(t, J=6.7 Hz, 4H), 3.03-3.26(m, 5H), 4.06-4.17(m, 2H), 5.29-5.42(m, 8H).
실시예 11
3-(피페리딘-1-일)프로필 디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)카바메이트(화합물 A-7)
실시예 5와 같은 방법으로, 화합물 VI-1 대신에 참고예 5에서 얻어지는 화합물 VI-4를 이용하여, 화합물 A-7(0.387 g, 수율 81%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 684(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.9 Hz, 6H), 1.21-1.62(m, 42H), 1.79-1.86(m, 2H), 2.02-2.08(m, 8H), 2.32-2.42(m, 6H), 2.77(t, J=6.7 Hz, 4H), 3.10-3.43(m, 4H), 4.09(t, J=6.4 Hz, 2H), 5.29-5.42(m, 8H).
실시예 12
3-(피롤리딘-1-일)프로필 디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)카바메이트(화합물 A-8)
실시예 10과 같은 방법으로, 화합물 VI-3 대신에 참고예 6에서 얻어지는 화합물 VI-5(0.168 g, 0.508 mmol)를 이용하여, 화합물 A-8(0.225 g, 수율 99%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 670(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.9 Hz, 6H), 1.21-1.40(m, 32H), 1.46-1.55(m, 4H), 1.76-1.80(m, 4H), 1.82-1.89(m, 2H), 2.01-2.08(m, 8H), 2.47-2.55(m, 6H), 2.77(t, J=6.7 Hz, 4H), 3.11-3.24(m, 4H), 4.11(t, J=6.4 Hz, 2H), 5.29-5.42(m, 8H).
참고예 7: 2-니트로-N-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)벤젠술폰아미드(화합물 IId-1)
(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐 메탄술포네이트(Nu-Chek Prep, Inc사 제조, 2.85 g, 8.27 mmol)의 아세토니트릴(30 ml) 용액에, 탄산세슘(6.74 g, 20.67 mmol), 요오드화테트라부틸암모늄(도쿄가세이고교사 제조, 3.05 g, 8.27 mmol) 및 N-(tert-부톡시카르보닐)-2-니트로벤젠술폰아미드(도쿄가세이고교사 제조, 2.50 g, 8.27 mmol)를 가하여, 3시간 가열 환류 하에 반응시켰다. 반응액을 실온까지 냉각하고, 물을 가하여 아세트산에틸로 추출했다. 유기층을 무수황산마그네슘으로 건조 후 여과하여, 감압 농축했다. 잔사를 컬럼 크로마토그래피(n-헥산/아세트산에틸=91/9~70/30)로 정제함으로써, tert-부틸(2-니트로페닐)술포닐((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)카바메이트(3.21 g, 수율 70.5%)를 얻었다.
tert-부틸(2-니트로페닐)술포닐((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)카바메이트(3.21 g, 5.83 mmol)의 디클로로메탄(22.5 ml) 용액에 트리플루오로아세트산(9.63 ml, 126 mmol)을 가하여, 실온에서 0.5시간 교반했다. 반응액에 디클로로메탄 및 수산화나트륨 수용액(1 mol/L, 100 mL)을 가하고, 또한 포화탄산수소나트륨 수용액을 가하여 수층의 pH를 8 이상으로 조정했다. 얻어진 혼합물을 디클로로메탄으로 추출하여, 포화식염수로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조 후 여과하여, 감압 농축했다. 잔사를 컬럼 크로마토그래피(n-헥산/클로로포름=50/50~0/100)으로 정제하여, 화합물 IId-1(2.48 g, 수율 94%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 451(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=7.0 Hz, 3H), 1.22-1.39(m, 16H), 1.52(m, 2H), 2.01-2.05(m, 4H), 2.77(t, J=6.6 Hz, 2H), 3.09(q, J=6.7 Hz, 2H), 5.23(m, 1H), 5.31-5.42(m, 4H), 7.71-7.76(m, 2H), 7.78-7.87(1H), 8.13-8.15(m, 1H).
실시예 13
도데실((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)아민(화합물 B-5)
참고예 7에서 얻어지는 화합물 IId-1(0.714 g, 1.584 mmol)과 1-브로모도데칸(도쿄가세이고교 제조, 0.474 g, 1.90 mmol)의 아세토니트릴(6 ml) 용액에 요오드화테트라부틸암모늄(도쿄가세이고교사 제조, 0.585 g, 1.58 mmol) 및 탄산세슘(1.03 g, 3.17 mmol)을 가하여, 60℃에서 1시간 교반했다. 반응액에 물을 가하여, n-헥산으로 3회 추출했다. 추출액을 컬럼 크로마토그래피(n-헥산/아세트산에틸=94/6~84/16)로 정제하여 N-도데실-2-니트로-N-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)벤젠술폰아미드(0.750 g, 수율 76%)를 얻었다.
N-도데실-2-니트로-N-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)벤젠술폰아미드(0.748 g, 1.21 mmol)의 아세토니트릴(7 ml) 용액에 1-도데칸티올(도쿄가세이고교사 제조, 0.611 g, 3.02 mmol) 및 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센(나카라이테스크사 제조, 0.460 g, 3.02 mmol)를 가하여, 60℃에서 1시간 교반했다. 반응액에 물을 가하여, 아세트산에틸로 2회 추출했다. 유기층을 합쳐, 포화식염수로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조 후 여과하여, 감압 농축했다. 잔사를 컬럼 크로마토그래피(n-헥산/아세트산에틸=80:20, 이어서 클로로포름/메탄올=100/0~88/12)로 정제함으로써 화합물 B-5(0.534 g, 정량적 수율)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 434(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.88(t, J=6.9 Hz, 3H), 0.89(t, J=6.9 Hz, 3H), 1.24-1.38(m, 35H), 1.49-1.54(m, 4H), 2.05(q, J=7.0 Hz, 4H), 2.62(t, J=7.4 Hz, 4H), 2.77(t, J=6.8 Hz, 2H), 5.30-5.41(m, 4H).
실시예 14
데실((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)아민(화합물 B-6)
실시예 13과 같은 방법으로, 참고예 7에서 얻어지는 화합물 IId-1(0.619 g, 1.37 mmol), 및 1-브로모도데칸 대신에 1-브로모데칸(도쿄가세이고교사 제조, 0.365 g, 1.65 mmol)을 이용하여, 화합물 B-6(0.423 g, 수율 76%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 406(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.88(t, J=7.1 Hz, 3H), 0.89(t, J=6.9 Hz, 3H), 1.25-1.38(m, 31H), 1.46-1.50(m, 4H), 2.05(q, J=7.0 Hz, 4H), 2.59(t, J=7.2 Hz, 4H), 2.77(t, J=6.9 Hz, 2H), 5.31-5.40(m, 4H).
실시예 15
((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)(옥틸)아민(화합물 B-7)
실시예 13과 같은 방법으로, 참고예 7에서 얻어지는 화합물 IId-1(0.714 g, 1.58 mmol), 및 1-브로모도데칸 대신에 1-브로모옥탄(도쿄가세이고교사 제조, 0.367 g, 1.90 mmol)을 이용하여, 화합물 B-7(0.519 g, 수율 87%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 378(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.88(t, J=7.1 Hz, 3H), 0.89(t, J=6.9 Hz, 3H), 1.24-1.39(m, 27H), 1.48-1.54(m, 4H), 2.05(q, J=7.0 Hz, 4H), 2.62(t, J=7.4 Hz, 4H), 2.77(t, J=6.6 Hz, 2H), 5.30-5.41(m, 4H).
실시예 16
3-(디메틸아미노)프로필 도데실((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)카바메이트(화합물 A-9)
실시예 5와 같은 방법으로, 화합물 B-1 대신에 실시예 13에서 얻어지는 화합물 B-5(0.260 g, 0.600 mmol)를 이용하여, 화합물 A-9(0.309 g, 수율 91%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 563(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.88(t, J=6.9 Hz, 3H), 0.89(t, J=6.9 Hz, 3H), 1.23-1.38(m, 34H), 1.48-1.53(m, 4H), 1.77-1.82(m, 2H), 2.05(q, J=7.1 Hz, 4H), 2.23(s, 6H), 2.34(t, J=7.6 Hz, 2H), 2.77(t, J=6.6 Hz, 2H), 3.13-3.22(m, 4H), 4.10(t, J=6.5 Hz, 2H), 5.30-5.41(m, 4H).
실시예 17
3-(디메틸아미노)프로필 데실((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)카바메이트(화합물 A-10)
실시예 5와 같은 방법으로, 화합물 B-1 대신에 실시예 14에서 얻어지는 화합물 B-6(0.185 g, 0.456 mmol)을 이용하여, 화합물 A-10(0.228 g, 수율 93%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 535(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.88(t, J=6.8 Hz, 3H), 0.89(t, J=6.7 Hz, 3H), 1.24-1.38(m, 30H), 1.48-1.53(m, 4H), 1.77-1.82(m, 2H), 2.05(q, J=7.0 Hz, 4H), 2.22(s, 6H), 2.34(t, J=7.5 Hz, 2H), 2.77(t, J=6.8 Hz, 2H), 3.14-3.22(m, 4H), 4.10(t, J=6.4 Hz, 2H), 5.31-5.40(m, 4H).
실시예 18
3-(디메틸아미노)프로필 ((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)(옥틸)카바메이트(화합물 A-11)
실시예 5와 같은 방법으로, 화합물 B-1 대신에 실시예 15에서 얻어지는 화합물 B-7(0.227 g, 0.600 mmol)을 이용하여, 화합물 A-11(0.275 g, 수율 90%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 507(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.88(t, J=6.9 Hz, 3H), 0.89(t, J=6.9 Hz, 3H), 1.22-1.39(m, 26H), 1.47-1.54(m, 4H), 1.76-1.82(m, 2H), 2.05(q, J=6.0 Hz, 4H), 2.23(s, 6H), 2.34(t, J=7.6 Hz, 2H), 2.77(t, J=6.6 Hz, 2H), 3.12-3.22(m, 4H), 4.10(t, J=6.5 Hz, 2H), 5.30-5.41(m, 4H).
참고예 8: 2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐옥시)에틸 메탄술포네이트(화합물 IIIc-1)
(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일 메탄술포네이트(983 mg, 2.85 mmol)에 에틸렌글리콜(3.16 ml, 57.1 mmol) 및 1,4-디옥산(5 ml)을 가하여, 하루 동안 가열 환류 하에 교반했다. 반응액을 실온까지 냉각 후, 수산화나트륨 수용액(0.5 mol/L)을 가하여 n-헥산으로 2회 추출했다. 유기층을 합쳐, 포화식염수로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조 후 여과하여, 감압 농축했다. 잔사를 컬럼 크로마토그래피(클로로포름 100%)로 정제함으로써 2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐옥시)에탄올(668 mg, 수율 75%)을 얻었다.
2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐옥시)에탄올(660 mg, 2.13 mmol)과 트리에틸아민(0.444 mL, 3.19 mmol)의 디클로로메탄(9 ml) 용액에, 0℃에서 무수메실산(SIGMA-ALDRICH사 제조, 0.247 ml, 3.19 mmol)을 가하여, 실온에서 40분간 교반했다. 반응액에 물을 가하여, 클로로포름으로 추출했다. 유기층을, 염산(1 mol/L), 포화탄산수소나트륨 수용액, 포화식염수로 세정하여, 무수황산마그네슘으로 건조 후 여과하고, 감압 농축하여 화합물 IIIc-1을 얻었다.
실시예 19
(9Z,12Z)-N-(2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐옥시)에틸)옥타데카-9,12-디엔-1-아민(화합물 B-8)
실시예 13과 같은 방법으로, 참고예 7에서 얻어지는 화합물 IId-1(0.798 g, 1.77 mmol), 및 1-브로모도데칸 대신에 참고예 8에서 얻어지는 화합물 IIIc-1(0.826 g, 2.13 mmol)을 이용하여, 화합물 B-8(0.676 g, 수율 68%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 558(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.9 Hz, 6H), 1.27-1.38(m, 32H), 1.46-1.52(m, 2H), 1.54-1.60(m, 3H), 2.05(q, J=7.0 Hz, 8H), 2.61(t, J=7.3 Hz, 2H), 2.77(t, J=5.5 Hz, 6H), 3.42(t, J=6.8 Hz, 2H), 3.52(t, J=5.4 Hz, 2H), 5.30-5.41(m, 8H).
실시예 20
3-(디메틸아미노)프로필 ((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)(2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐옥시)에틸)카바메이트(화합물 A-12)
실시예 5와 같은 방법으로, 화합물 B-1 대신에 실시예 19에서 얻어지는 화합물 B-8(0.184 g, 0.330 mmol)을 이용하여, 화합물 A-12(0.208 g, 수율 92%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 687(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.9 Hz, 6H), 1.25-1.38(m, 32H), 1.50-1.57(m, 4H), 1.77-1.83(m, 2H), 2.05(q, J=7.0 Hz, 8H), 2.22(s, 6H), 2.34(t, J=7.4 Hz, 2H), 2.77(t, J=6.6 Hz, 4H), 3.23-3.54(m, 8H), 4.11(t, J=6.5 Hz, 2H), 5.30-5.41(m, 8H).
참고예 9: N,N-비스(2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐옥시)에틸)아민(화합물 XI-4)
수소화나트륨(유성, 60%, 1.69 g, 42.2 mmol)에, N-벤질디에탄올아민(도쿄가세이고교사 제조, 1.65 g, 8.44 mmol)의 톨루엔(10 mL) 용액을 교반하면서 천천히 첨가한 후, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐 메탄술포네이트(Nu-Chek Prep, Inc사 제조, 6.69 g, 19.4 mmol)의 톨루엔(10 mL) 용액을 적하했다. 얻어진 혼합물을 가열 환류 하에 4시간 교반했다. 실온까지 냉각 후, 반응을 에탄올로 정지시켰다. 얻어진 혼합물에 포화식염수를 가하여, 아세트산에틸로 2회 추출했다. 유기층을 합쳐, 무수황산마그네슘으로 건조 후, 감압 농축했다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름/메탄올=100/0~99/1)로 정제함으로써 N-벤질-N,N-비스(2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐옥시)에틸)아민(4.01 g, 수율 69%)을 얻었다.
N-벤질-N,N-비스(2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐옥시)에틸)아민(4.01 g, 5.89 mmol))을 1,2-디클로로에탄(29 mL)에 용해시키고, 클로로포름산1-클로로에틸(도쿄가세이고교사 제조, 1.90 mL, 17.4 mmol)을 가하여 130℃에서 1시간 교반했다. 반응 용액에 메탄올(29 mL)을 가하고, 130℃에서 더욱 1시간 교반했다. 실온까지 냉각 후, 반응액에 포화탄산수소나트륨 수용액을 가하여, 클로로포름으로 2회 추출했다. 유기층을 합쳐, 포화식염수로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조 후, 감압 농축했다. 잔사를 아미노 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(n-헥산/아세트산에틸=90/10~75/25)로 정제함으로써 화합물 XI-4(5.56 g, 수율 92%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 621(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=7.0 Hz, 6H), 1.27-1.30(m, 33H), 1.53-1.59(m, 4H), 2.05(q, J=7.1 Hz, 8H), 2.77(t, J=6.8 Hz, 4H), 2.80(t, J=5.4 Hz, 4H), 3.42(t, J=6.8 Hz, 4H), 3.53(t, J=5.4 Hz, 4H), 5.30-5.41(m, 8H).
참고예 10: 3-(디메틸아미노)프로필 비스(2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐옥시)에틸)카바메이트(화합물 XI-5)
실시예 5와 같은 방법으로, 화합물 B-1 대신에 참고예 9에서 얻어지는 화합물 XI-4(1.20 g, 1.99 mmol)를 이용하여, 화합물 XI-5(1.32 g, 수율 91%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 732(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=7.0 Hz, 6H), 1.27-1.30(m, 30H), 1.51-1.57(m, 4H), 1.77-1.83(m, 4H), 2.05(q, J=7.0 Hz, 8H), 2.23(s, 6H), 2.34(t, J=7.5 Hz, 2H), 2.77(t, J=6.7 Hz, 4H), 3.38-3.54(m, 12H), 4.12(t, J=6.5 Hz, 2H), 5.30-5.41(m, 8H).
참고예 11: 3-(디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)아미노)프로피온산에틸(화합물 XI-6)
실시예 1에서 얻어지는 화합물 B-1(0.788 g, 1.53 mmol)을 에탄올(8 mL)에 용해시키고, 아크릴산에틸(도쿄가세이고교사 제조, 1.67 mL, 15.3 mmol) 및 나트륨에톡시드(와코쥰야쿠고교사 제조, 0.0520 g, 0.767 mmol)를 가하여, 가열 환류 하에 3시간 교반했다. 반응액을 감압 농축한 후, 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(n-헥산/아세트산에틸=85/15)로 정제함으로써, 화합물 XI-6(0.699 g, 수율 74%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 615(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.9 Hz, 6H), 1.21-1.45(m, 39H), 2.02-2.08(m, 8H), 2.35-2.44(m, 6H), 2.75-2.80(m, 6H), 4.12(q, J=7.0 Hz, 2H), 5.30-5.42(m, 8H).
실시예 21
3-(디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)아미노)프로판-1-올(화합물 C-1)
참고예 11에서 얻어지는 화합물 XI-6(0.199 g, 0.324 mmol)을 테트라히드로푸란(2 mL)에 용해시키고, 빙냉 하에, 수소화리튬알루미늄(쥰세이가가쿠사 제조, 0.012 g, 0.324 mmol)을 가하여, 3시간 교반했다. 반응액에 물(0.0600 mL, 3.33 mmol) 및 불화나트륨(나카라이테스크사 제조, 0.408 g, 9.72 mmol)을 가하여, 실온에서 0.5시간 교반했다. 불용물을 셀라이트 여과에 의해 제거했다. 여과액을 농축한 후, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름/메탄올=98/2)로 정제함으로써, 화합물 C-1(0.181 g, 수율 98%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 573(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.9 Hz, 6H), 1.21-1.40(m, 32H), 1.42-1.51(m, 4H), 1.64-1.71(m, 2H), 2.02-2.08(m, 8H), 2.40(t, J=7.3 Hz, 4H), 2.64(t, J=5.3 Hz, 2H), 2.77(t, J=6.7 Hz, 4H), 3.79(t, J=5.3 Hz, 2H), 5.30-5.42(m, 8H).
참고예 12: 3-(디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)아미노)프로판-1,2-디올(화합물 XI-7)
실시예 1에서 얻어지는 화합물 B-1(0.228 g, 0.444 mmol)을 디클로로에탄(2 mL)에 용해시키고, 메탄올(2 mL) 및 2,3-디히드록시프로판알(나카라이테스크사 제조, 0.400 g, 4.44 mmol)를 가하여, 실온에서 0.5시간 교반했다. 반응액에 트리아세톡시수소화붕소나트륨(도쿄가세이고교사 제조, 0.470 g, 2.22 mmol)을 가하여, 실온에서 밤새 교반했다. 반응액에 2,3-디히드록시프로판알(0.400 g, 4.44 mmol)을 가하여, 실온에서 3시간 교반했다. 반응액에 트리아세톡시수소화붕소나트륨(0.470 g, 2.22 mmol)을 가하여, 실온에서 밤새 교반했다. 반응액에 포화탄산수소나트륨 수용액을 가하여 클로로포름으로 2회 추출했다. 유기층을 합쳐서 포화식염수로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조 후 여과하여, 감압 농축했다. 얻어진 잔사를 아미노 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(n-헥산/아세트산에틸=50/50)로 정제함으로써, 화합물 XI-7(0.0449 g, 수율 17%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 589(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.9 Hz, 6H), 1.19-1.51(m, 36H), 2.02-2.08(m, 8H), 2.38-2.62(m, 6H), 2.77(t, J=6.7 Hz, 4H), 3.46-3.50(m, 1H), 3.69-3.77(m, 2H), 5.30-5.42(m, 8H).
참고예 13: 3-((3R,4R)-3,4-비스((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐옥시)피롤리딘-1-일)프로판-1-올(화합물 XI-8)
화합물 XI-8은 국제공개 제2011/136368호 팜플렛에 기재된 방법으로 합성했다.
실시예 22
4-(디메틸아미노)부틸 디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)카바메이트(화합물 A-13)
공정 1
클로로포름산4-니트로페닐(0.867 g, 4.21 mmol)의 디클로로메탄(20 mL) 용액에, 4-(tert-부틸디메틸실릴)옥시-1-부탄올(SIGMA-ALDRICH사 제조, 1.0 mL, 4.21 mmol)과 트리에틸아민(0.881 mL, 6.32 mmol)을 가하여, 실온에서 1시간 교반했다. 반응액에 포화탄산수소나트륨 수용액을 가하여 클로로포름으로 2회 추출했다. 유기층을, 무수황산마그네슘으로 건조 후 여과하여, 감압 농축했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(n-헥산/아세트산에틸=90/10)로 정제함으로써, 4-(tert-부틸디메틸실릴옥시)부틸 4-니트로페닐 카보네이트(1. 44 g, 수율 92%)를 얻었다.
공정 2
실시예 10과 같은 방법으로, 화합물 VI-3 대신에 공정 1에서 얻어지는 4-(tert-부틸디메틸실릴옥시)부틸 4-니트로페닐 카보네이트(0.640 g, 1.733 mmol)를 이용하여, 4-(tert-부틸디메틸실릴옥시)부틸 디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)카바메이트의 조정제물(粗精製物)을 얻었다. 얻어진 4-(tert-부틸디메틸실릴옥시)부틸 디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)카바메이트의 조정제물을 테트라히드로푸란(10 mL)에 용해하고, 불화테트라부틸암모늄(도쿄가세이고교사 제조, 약 1 mol/L 테트라히드로푸란 용액, 2.14 mL, 2.14 mmol)을 가하여, 실온에서 1시간 교반했다. 반응액에 불화테트라-n-부틸암모늄(약 1 mol/L 테트라히드로푸란 용액, 2.14 mL, 2.14 mmol)을 가하여, 실온에서 2시간 교반 후, 50℃에서 1시간 교반했다. 반응액에 포화탄산수소나트륨 수용액을 가하여 아세트산에틸로 2회 추출했다. 유기층을, 무수황산마그네슘으로 건조 후 여과하여, 감압 농축했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름/메탄올=95/5)로 정제함으로써, 4-히드록시부틸 디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)카바메이트(0.652 g, 수율 73%)를 얻었다.
공정 3
공정 2에서 얻어진 4-히드록시부틸 디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)카바메이트(0.193 g, 0.306 mmol)의 디클로로메탄(2 mL) 용액에, 빙냉 하에, 메실산클로리드(쥰세이가가쿠사 제조, 0.0360 mL, 0.460 mmol)와 트리에틸아민(0.0930 mL, 0.919 mmol)을 가하여, 0℃에서 30분간 교반했다. 반응액에 포화탄산수소나트륨 수용액을 가하여 클로로포름으로 2회 추출했다. 유기층을, 무수황산마그네슘으로 건조 후 여과하여, 감압 농축했다. 얻어진 잔사를 테트라히드로푸란(1 mL)에 용해하고, 디메틸아민(알드리치사 제조, 약 2 mol/L 테트라히드로푸란 용액, 1.53 mL, 3.06 mmol)을 가하고, 마이크로파 반응 장치를 이용하여 100℃에서 1시간 교반 후, 마이크로파 반응 장치를 이용하여 130℃에서 1시간 교반했다. 반응액을 감압 농축하여, 얻어진 잔사를 아미노 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(n-헥산/아세트산에틸=80/20)로 정제함으로써, 화합물 A-13(0.159 g, 수율 79%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 658(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.90(q, J=6.5 Hz, 6H), 1.20-1.38(m, 32H), 1.45-1.56(m, 6H), 1.61-1.69(m, 2H), 2.01-2.08(m, 8H), 2.21(s, 6H), 2.28(t, J=7.6 Hz, 2H), 2.77(t, J=6.6 Hz, 4H), 3.12-3.23(m, 4H), 4.07(t, J=6.6 Hz, 2H), 5.29-5.42(m, 8H).
참고예 14: (1-메틸피페리딘-4-일)메틸 4-니트로페닐 카보네이트염산염(화합물 VI-6)
클로로포름산4-니트로페닐(1.50 g, 7.28 mmol)의 테트라히드로푸란(32 mL) 용액에, 1-메틸-4-피페리딘메탄올(도쿄가세이고교사 제조, 1.0 mL, 7.28 mmol)을 가하여, 실온에서 2시간 교반했다. 석출된 결정을 여과하여 취함으로써 화합물 VI-6(1.55 g, 수율 64%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 295(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 1.93-2.19(m, 4H), 2.68-2.82(m, 3H), 3.51-3.62(m, 5H), 4.21(d, J=6.0 Hz, 2H), 7.38(d, J=9.1 Hz, 2H), 8.27(d, J=9.1 Hz, 2H), 12.44(br s, 1H).
참고예 15: (1-메틸피페리딘-3-일)메틸 4-니트로페닐 카보네이트염산염(화합물 VI-7)
참고예 14와 같은 방법으로, 1-메틸-4-피페리딘메탄올 대신에 1-메틸-3-피페리딘메탄올(도쿄가세이고교사 제조, 1.0 mL, 7.21 mmol)을 이용하여, 화합물 VI-7(2.32 g, 수율 97%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 295(M+H)+.
참고예 16: (1-메틸피페리딘-2-일)메틸 4-니트로페닐 카보네이트염산염(화합물 VI-8)
참고예 14와 같은 방법으로, 1-메틸-4-피페리딘메탄올 대신에 1-메틸-2-피페리딘메탄올(도쿄가세이고교사 제조, 1.0 mL, 7.43 mmol)을 이용하여, 화합물 VI-8(2.37 g, 수율 96%)을 얻었다.
1H-NMR(CDCl3)δ: 1.51-1.63(m, 1H), 1.81-2.38(m, 5H), 2.85-2.99(m, 4H), 3.21-3.30(m, 1H), 3.49-3.60(m, 1H), 4.66(dd, J=13.1, 2.4 Hz, 1H), 4.78-4.86(m, 1H), 7.47(d, J=9.1 Hz, 2H), 8.28(d, J==9.1 Hz, 2H), 12.40(br s, 1H).
참고예 17: 3-(아제판-1-일)프로필 4-니트로페닐 카보네이트염산염(화합물 VI-9)
참고예 14와 같은 방법으로, 1-메틸-4-피페리딘메탄올 대신에 3-(아제판-1-일)프로판올(캠브릿지(CHEMBRIDGE)사 제조, 0.700 g, 4.45 mmol)을 이용하여, 화합물 VI-9(1.47 g, 수율 92%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 323(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 1.60-1.75(m, 2H), 1.79-1.94(m, 5H), 2.15-2.27(m, 2H), 2.44-2.53(m, 2H), 2.90-3.02(m, 2H), 3.14-3.24(m, 2H), 3.55-3.65(m, 2H), 4.41(t, J=5.9 Hz, 2H), 7.37-7.43(m, 2H), 8.25-8.32(m, 2H), 12.48(br s, 1H).
참고예 18: 1-메틸피페리딘-4-일 4-니트로페닐 카보네이트염산염(화합물 VI-10)
참고예 14와 같은 방법으로, 1-메틸-4-피페리딘메탄올 대신에 1-메틸피페리딘-4-올(시그마-알드리치(SIGMA-ALDRICH)사 제조, 0.300 g, 2.60 mmol)을 이용하여, 화합물 VI-10(0.740 g, 수율 90%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 281(M+H)+.
참고예 19: 1-메틸피페리딘-3-일 4-니트로페닐 카보네이트염산염(화합물 VI-11)
참고예 14와 같은 방법으로, 1-메틸-4-피페리딘메탄올 대신에 1-메틸피페리딘-3-올(시그마-알드리치(SIGMA-ALDRICH)사 제조, 0.305 g, 2.65 mmol)을 이용하여, 화합물 VI-11(0.410 g, 수율 49%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 281(M+H)+.
참고예 20: (1-메틸피롤리딘-3-일)메틸 4-니트로페닐 카보네이트염산염(화합물 VI-12)
참고예 14와 같은 방법으로, 1-메틸-4-피페리딘메탄올 대신에 (1-메틸-3-피롤리디닐)메탄올(매트릭스 사이엔티픽(Matrix Scientific)사 제조, 0.500 g, 7.43 mmol)을 이용하여, 화합물 VI-12(0.943 g, 수율 69%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 281(M+H)+.
실시예 23
(1-메틸피페리딘-4-일)메틸 디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)카바메이트(화합물 A-14)
실시예 10과 같은 방법으로, 화합물 VI-3 대신에 참고예 14에서 얻어진 화합물 VI-6(0.228 g, 0.689 mmol)을 이용하여, 화합물 A-14(0.258 g, 수율 84%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 670(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.9 Hz, 6H), 1.22-1.39(m, 32H), 1.46-1.54(m, 4H), 1.56-1.66(m, 3H), 1.67-1.74(m, 2H), 1.88-1.95(m, 2H), 2.05(q, J=6.9 Hz, 8H), 2.26(s, 3H), 2.77(t, J=6.8 Hz, 4H), 2.85(d, J=11.7 Hz, 2H), 3.13-3.23(m, 4H), 3.92(d, J=6.3 Hz, 2H), 5.30-5.42(m, 8H).
실시예 24
(1-메틸피페리딘-3-일)메틸 디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)카바메이트(화합물 A-15)
실시예 10과 같은 방법으로, 화합물 VI-3 대신에 참고예 15에서 얻어진 화합물 VI-7(0.238 g, 0.719 mmol)을 이용하여, 화합물 A-15(0.239 g, 수율 74%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 670(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.9 Hz, 6H), 0.92-1.02(m, 1H), 1.22-1.39(m, 32H), 1.46-1.54(m, 4H), 1.55-1.65(m, 1H), 1.66-1.74(m, 3H), 1.82-1.89(m, 1H), 1.91-2.00(m, 1H), 2.05(q, J=7.0 Hz, 8H), 2.26(s, 3H), 2.74-2.80(m, 5H), 2.84-2.89(m, 1H), 3.12-3.23(m, 4H), 3.87(dd, J=10.7, 7.6 Hz, 1H), 3.97(dd, J=10.7, 5.4 Hz, 1H), 5.30-5.41(m, 8H).
실시예 25
(1-메틸피페리딘-2-일)메틸 디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)카바메이트(화합물 A-16)
실시예 10과 같은 방법으로, 화합물 VI-3 대신에 참고예 16에서 얻어진 화합물 VI-8(0.256 g, 0.774 mmol)을 이용하여, 화합물 A-16(0.313 g, 수율 91%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 670(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.9 Hz, 6H), 1.22-1.39(m, 32H), 1.46-1.64(m, 8H), 1.71-1.76(m, 2H), 2.02-2.12(m, 10H), 2.32(s, 3H), 2.77(t, J=6.8 Hz, 4H), 2.79-2.84(m, 1H), 3.11-3.24(m, 4H), 4.05(dd, J=11.1, 4.9 Hz, 1H), 4.17(dd, J=11.1, 4.9 Hz, 1H), 5.30-5.42(m, 8H).
실시예 26
2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에틸 디((Z)-옥타데카-9-에닐)카바메이트(화합물 A-17)
실시예 10과 같은 방법으로, 화합물 B-1 대신에 실시예 2에서 얻어지는 화합물 B-2(0.300 g, 0.579 mmol)를 이용하여, 화합물 A-17(0.360 g, 수율 92%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 674(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.88(t, J=6.9 Hz, 6H), 1.21-1.38(m, 44H), 1.45-1.85(m, 8H), 1.93-2.18(m, 12H), 2.32(s, 3H), 3.03-3.26(m, 5H), 4.05-4.18(m, 2H), 5.30-5.39(m, 4H).
실시예 27
(1-메틸피페리딘-3-일)메틸 디((Z)-옥타데카-9-에닐)카바메이트(화합물 A-18)
실시예 10과 같은 방법으로, 화합물 B-1 대신에 실시예 2에서 얻어지는 화합물 B-2(0.300 g, 0.579 mmol), 및 화합물 VI-3 대신에 참고예 15에서 얻어진 화합물 VI-7(0.287 g, 0.896 mmol)을 이용하여, 화합물 A-18(0.390 g, 수율 100%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 674(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.85-1.04(m, 7H), 1.20-1.38(m, 44H), 1.46-1.74(m, 8H), 1.82-2.06(m, 10H), 2.26(s, 3H), 2.74-2.82(m, 1H), 2.83-2.89(m, 1H), 3.10-3.25(m, 4H), 3.87(dd, J=10.5, 7.3 Hz, 1H), 3.98(dd, J=10.5, 5.3 Hz, 1H), 5.30-5.39(m, 4H).
실시예 28
2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에틸 디((11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐)카바메이트(화합물 A-19)
실시예 10과 같은 방법으로, 화합물 B-1 대신에 실시예 4에서 얻어지는 화합물 B-4(0.300 g, 0.526 mmol)를 이용하여, 화합물 A-19(0.369 g, 수율 97%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 726(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.9 Hz, 6H), 1.21-1.40(m, 40H), 1.44-1.85(m, 8H), 1.93-2.18(m, 12H), 2.32(s, 3H), 2.77(t, J=6.4 Hz, 4H), 3.04-3.27(m, 5H), 4.05-4.18(m, 2H), 5.29-5.42(m, 8H).
실시예 29
(1-메틸피페리딘-3-일)메틸 디((11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐)카바메이트(화합물 A-20)
실시예 10과 같은 방법으로, 화합물 B-1 대신에 실시예 4에서 얻어지는 화합물 B-4(0.300 g, 0.526 mmol), 및 화합물 VI-3 대신에 참고예 15에서 얻어진 화합물 VI-7(0.261 g, 0.789 mmol)을 이용하여, 화합물 A-20(0.374 g, 수율 98%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 726(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.85-1.04(m, 7H), 1.21-1.40(m, 40H), 1.45-1.75(m, 8H), 1.82-2.09(m, 10H), 2.26(s, 3H), 2.74-2.90(m, 6H), 3.11-3.24(m, 4H), 3.87(dd, J=10.5, 7.5 Hz, 1H), 3.98(dd, J=10.5, 5.5 Hz, 1H), 5.29-5.43(m, 8H).
실시예 30
(1-메틸피롤리딘-2-일)메틸 디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)카바메이트(화합물 A-21)
실시예 1에서 얻어지는 화합물 B-1(0.0831 g, 0.162 mmol)을 디클로로에탄(1 mL)에 용해시키고, 1,1'-카르보닐디이미다졸(나카라이테스크사 제조, 0.0394 g, 0.243 mmol)을 가하여, 실온에서 밤새 교반했다. 반응액에 요오드메탄(도쿄가세이고교사 제조, 0.101 mL, 1.62 mmol)을 가하여, 60℃에서 밤새 교반했다. 반응액을 감압 농축했다. 얻어진 잔사를 테트라히드로푸란(1 mL)에 용해하고, 1-메틸피롤리딘-2-메탄올(와코쥰야쿠고교사 제조, 0.0372 g, 0.323 mmol)과 트리에틸아민(0.0563 mL, 0.404 mmol)을 가하여, 실온에서 밤새 교반한 후, 반응액을 60℃에서 3시간 교반했다. 반응액에 포화탄산수소나트륨 수용액을 가하여 n-헥산으로 2회 추출했다. 유기층을, 무수황산마그네슘으로 건조 후 여과하여, 감압 농축했다. 얻어진 잔사를 아미노 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(n-헥산/아세트산에틸=90/10)로 정제함으로써, 화합물 A-21(0.0318 g, 수율 30%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 656(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.9 Hz, 6H), 1.24-1.39(m, 32H), 1.46-1.67(m, 5H), 1.67-1.85(m, 2H), 1.89-2.00(m, 1H), 2.05(q, J=7.0 Hz, 8H), 2.21-2.30(m, 1H), 2.42(s, 3H), 2.43-2.51(m, 1H), 2.77(t, J=6.6 Hz, 4H), 3.03-3.08(m, 1H), 3.11-3.25(m, 4H), 4.00(dd, J=10.5, 6.0 Hz, 1H), 4.08(dd, J=10.5, 5.5 Hz, 1H), 5.29-5.42(m, 8H).
실시예 31
(1-메틸피롤리딘-3-일)메틸 디(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐카바메이트(화합물 A-22)
실시예 10과 같은 방법으로, 화합물 VI-3 대신에 참고예 20에서 얻어지는 화합물 VI-12(0.277 g, 0.876 mmol)를 이용하여, 화합물 A-22(0.263 g, 수율 66%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 656(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.9 Hz, 6H), 1.20-1.40(m, 32H), 1.44-1.78(m, 5H), 1.92-2.09(m, 9H), 2.24(dd, J=9.4, 6.2 Hz, 1H), 2.34(s, 3H), 2.39-2.63(m, 3H), 2.68-2.80(m, 5H), 3.10-3.25(m, 4H), 3.95(dd, J=10.5, 7.8 Hz, 1H), 4.03(dd, J=10.5, 6.4 Hz, 1H), 5.28-5.42(m, 8H).
실시예 32
2-(1-메틸피페리딘-2-일)에틸 디(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐카바메이트(화합물 A-23)
공정 1
클로로포름산4-니트로페닐(0.844 g, 7.19 mmol)의 테트라히드로푸란(12 mL) 용액에, 2-(1-메틸피페리딘-2-일)에탄올(Matrix Scientific사 제조, 0.500 g, 3.49 mmol)을 가하여, 실온에서 밤새 교반했다. 반응액을 감압 농축하여, 2-(1-메틸피페리딘-2-일)에틸 4-니트로페닐 카보네이트염산염의 조정제물을 얻었다.
공정 2
실시예 10과 같은 방법으로, 화합물 VI-3 대신에 공정 1에서 얻어진 2-(1-메틸피페리딘-2-일)에틸 4-니트로페닐 카보네이트염산염의 조정제물(0.302 g, 0.876 mmol)을 이용하여, 화합물 A-23(0.299 g, 수율 75%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 684(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.9 Hz, 6H), 1.19-1.40(m, 32H), 1.45-1.75(m, 11H), 1.93-2.11(m, 11H), 2.27(s, 3H), 2.74-2.86(m, 5H), 3.10-3.24(m, 4H), 4.06-4.19(m, 2H), 5.29-5.42(m, 8H).
실시예 33
3-(아제판-1-일)프로필 디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)카바메이트(화합물 A-24)
실시예 10과 같은 방법으로, 화합물 VI-3 대신에 참고예 17에서 얻어지는 화합물 VI-9을 이용하여, 화합물 A-24(0.136 g, 수율 67%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 698(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.86-0.94(m, 6H), 1.22-1.41(m, 36H), 1.45-1.67(m, 8H), 1.75-1.85(m, 2H), 2.00-2.11(m, 8H), 2.55(t, J=7.5 Hz, 2H), 2.62(t, J=5.1 Hz, 4H), 2.77(t, J=5.9 Hz, 4H), 3.13-3.23(m, 4H), 4.10(t, J=6.4 Hz, 2H), 5.28-5.45(m, 8H).
실시예 34
3-(피페리딘-1-일)프로필 ((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)(2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐옥시)에틸)카바메이트(화합물 A-29)
실시예 10과 같은 방법으로, 화합물 B-1 대신에 실시예 19에서 얻어지는 화합물 B-8(0.150 g, 0.269 mmol), 및 화합물 VI-3 대신에 참고예 5에서 얻어지는 화합물 VI-4(0.201 g, 0.672 mmol)를 이용하여, 화합물 A-29(0.170 g, 수율 87%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 728(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.8 Hz, 6H), 1.22-1.40(m, 32H), 1.40-1.63(m, 14H), 1.78-1.87(m, 2H), 2.05(q, J=6.6 Hz, 8H), 2.33-2.41(m, 6H), 2.77(t, J=6.0 Hz, 4H), 3.20-3.31(m, 2H), 3.40(t, J=6.6 Hz, 4H), 3.46-3.57(m, 2H), 4.10(t, J=6.4 Hz, 2H), 5.27-5.45(m, 8H).
실시예 35
2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에틸 ((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)(2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐옥시)에틸)카바메이트(화합물 A-30)
실시예 10과 같은 방법으로, 화합물 B-1 대신에 실시예 19에서 얻어지는 화합물 B-8(0.120 g, 0.215 mmol)을 이용하여, 화합물 A-30(0.140 g, 수율 91%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 714(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.8 Hz, 6H), 1.21-1.40(m, 32H), 1.45-1.59(m, 6H), 1.64-1.82(m, 2H), 1.93-2.17(m, 12H), 2.31(s, 3H), 2.70-2.81(m, 4H), 3.06(t, J=7.8 Hz, 1H), 3.20-3.31(m, 2H), 3.40(t, J=5.9 Hz, 4H), 3.46-3.58(m, 2H), 4.06-4.17(m, 2H), 5.28-5.44(m, 8H).
실시예 36
3-(아제판-1-일)프로필 ((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)(2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐옥시)에틸)카바메이트(화합물 A-31)
실시예 10과 같은 방법으로, 화합물 B-1 대신에 실시예 19에서 얻어지는 화합물 B-8(0.150 g, 0.269 mmol), 및 화합물 VI-3 대신에 참고예 17에서 얻어지는 화합물 VI-9(0.145 g, 0.403 mmol)를 이용하여, 화합물 A-31(0.170 g, 수율 85%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 742(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.8 Hz, 6H), 1.21-1.39(m, 32H), 1.48-1.65(m, 12H), 1.72-1.85(m, 2H), 2.05(q, J=6.6 Hz, 8H), 2.55(t, J=7.5 Hz, 2H), 2.61(t, J=5.3 Hz, 4H), 2.77(t, J=5.9 Hz, 4H), 3.21-3.30(m, 2H), 3.40(t, J=6.8 Hz, 4H), 3.46-3.55(m, 2H), 4.10(t, J=6.4 Hz, 2H), 5.26-5.42(m, 8H).
실시예 37
(1-메틸피페리딘-3-일)메틸 ((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)(2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐옥시)에틸)카바메이트(화합물 A-32)
실시예 10과 같은 방법으로, 화합물 B-1 대신에 실시예 19에서 얻어지는 화합물 B-8(0.150 g, 0.269 mmol), 및 화합물 VI-3 대신에 참고예 15에서 얻어지는 화합물 VI-7(0.133 g, 0.403 mmol)을 이용하여, 화합물 A-32(0.145 g, 수율 76%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 714(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.91(t, J=6.8 Hz, 6H), 1.23-1.45(m, 32H), 1.49-1.77(m, 9H), 1.83-2.03(m, 2H), 2.07(q, J=6.6 Hz, 8H), 2.28(s, 3H), 2.76-2.91(m, 2H), 2.80(t, J=5.9 Hz, 4H), 3.21-3.33(m, 2H), 3.43(t, J=6.4 Hz, 4H), 3.48-3.58(m, 2H), 3.85-4.05(m, 2H), 5.30-5.47(m, 8H).
참고예 21: 2-((Z)-옥타데카-9-에닐옥시)에틸 메탄술포네이트(화합물 IIIc-2)
실시예 8과 같은 방법으로, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일 메탄술포네이트 대신에 (Z)-옥타데카-9-엔-1-일 메탄술포네이트(2.00 g, 5.77 mmol)를 이용하여, 화합물 IIIc-2(1.29 g, 수율 57%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 391(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.6 Hz, 3H), 1.22-1.38(m, 22H), 1.50-1.62(m, 2H), 1.97-2.05(m, 4H), 3.06(s, 3H), 3.48(t, J=6.8 Hz, 2H), 3.67-3.72(m, 2H), 4.36-4.39(m, 2H), 5.35(t, J=5.5 Hz, 2H).
참고예 22: 2-((Z)-헥사데카-9-에닐옥시)에틸 메탄술포네이트(화합물 IIIc-3)
실시예 8과 같은 방법으로, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일 메탄술포네이트 대신에 (Z)-헥사데카-9-엔-1-일 메탄술포네에트(2.00 g, 6.28 mmol)를 이용하여, 화합물 IIIc-3(1.52 g, 수율 67%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 363(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.90(t, J=6.6 Hz, 3H), 1.25-1.38(m, 18H), 1.53-1.62(m, 2H), 1.98-2.06(m, 4H), 3.07(s, 3H), 3.49(t, J=6.6 Hz, 2H), 3.68-3.72(m, 2H), 4.36-4.40(m, 2H), 5.36(t, J=5.5 Hz, 2H).
실시예 38
(9Z,12Z)-N-(2-((Z)-옥타데카-9-에닐옥시)에틸)옥타데카-9,12-디엔-1-아민(화합물 B-9)
실시예 13과 같은 방법으로, 참고예 7에서 얻어지는 화합물 IId-1(0.800 g, 1.78 mmol), 및 1-브로모도데칸 대신에 참고예 21에서 얻어지는 화합물 IIIc-2(0.728 g, 1.86 mmol)를 이용하여, 화합물 B-9(0.600 g, 수율 60%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 560(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.86-0.94(m, 6H), 1.24-1.39(m, 40), 1.51-1.62(m, 2H), 1.96-2.10(m, 8H), 2.68(t, J=7.3 Hz, 2H), 2.78(t, J=6.0 Hz, 2H), 2.85(t, J=5.1 Hz, 2H), 3.45(t, J=6.8 Hz, 2H), 3.57(t, J=5.1 Hz, 2H), 5.30-5.44(m, 6H).
실시예 39
(9Z,12Z)-N-(2-((Z)-헥사데카-9-에닐옥시)에틸)옥타데카-9,12-디엔-1-아민(화합물 B-10)
실시예 13과 같은 방법으로, 참고예 7에서 얻어지는 화합물 IId-1(0.610 g, 1.35 mmol), 및 1-브로모도데칸 대신에 참고예 22에서 얻어지는 화합물 IIIc-3(0.589 g, 1.62 mmol)을 이용하여, 화합물 B-10(0.550 g, 수율 76%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 532(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.85-0.93(m, 6H), 1.23-1.38(m, 34H), 1.45-1.54(m, 4H), 1.94-2.11(m, 8H), 2.60(t, J=7.3 Hz, 2H), 2.77(t, J=5.4 Hz, 4H), 3.43(t, J=6.8 Hz, 2H), 3.53(t, J=5.4 Hz, 2H), 5.29-5.44(m, 6H).
실시예 40
3-(피페리딘-1-일)프로필 (2-((Z)-옥타데카-9-에닐옥시)에틸)((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)카바메이트(화합물 A-33)
실시예 10과 같은 방법으로, 화합물 B-1 대신에 실시예 38에서 얻어지는 화합물 B-9(0.130 g, 0.232 mmol), 및 화합물 VI-3 대신에 참고예 5에서 얻어지는 화합물 VI-4(0.120 g, 0.348 mmol)를 이용하여, 화합물 A-33(0.137 g, 수율 81%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 729(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.84-0.92(m, 6H), 1.20-1.36(m, 38H), 1.40-1.62(m, 10H), 1.77-1.87(m, 2H), 1.96-2.09(m, 8H), 2.37(t, J=7.5 Hz, 6H), 2.77(t, J=5.9 Hz, 2H), 3.20-3.31(m, 2H), 3.40(t, J=6.6 Hz, 4H), 3.45-3.56(m, 2H), 4.10(t, J=6.4 Hz, 2H), 5.28-5.44(m, 6H).
실시예 41
2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에틸 (2-((Z)-옥타데카-9-에닐옥시)에틸)((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)카바메이트(화합물 A-34)
실시예 10과 같은 방법으로, 화합물 B-1 대신에 실시예 38에서 얻어지는 화합물 B-9(0.130 g, 0.232 mmol)를 이용하여, 화합물 A-34(0.131 g, 수율 79%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 716(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.85-0.92(m, 6H), 1.20-1.39(38 H, m), 1.47-1.61(m, 8H), 1.66-1.83(m, 2H), 1.93-2.18(10H, m), 2.32(s, 3H), 2.78(t, J=5.9 Hz, 2H), 3.07(t, J=8.4 Hz, 1H), 3.21-3.31(m, 2H), 3.41(t, J=6.6 Hz, 4H), 3.47-3.56(m, 2H), 4.08-4.19(m, 2H), 5.29-5.43(m, 6H).
실시예 42
3-(디메틸아미노)프로필 (2-((Z)-옥타데카-9-에닐옥시)에틸)((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)카바메이트(화합물 A-35)
실시예 10과 같은 방법으로, 화합물 B-1 대신에 실시예 38에서 얻어지는 화합물 B-9(0.130 g, 0.232 mmol), 및 화합물 VI-3 대신에 화합물 VI-1(0.106 g, 0.348 mmol)을 이용하여, 화합물 A-35(0.100 g, 수율 63%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 690(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.85-0.92(m, 6H), 1.20-1.39(m, 38H), 1.45-1.59(m, 4H), 1.74-1.84(m, 2H), 1.96-2.09(m, 8H), 2.23(s, 6H), 2.34(t, J=7.5 Hz, 2H), 2.77(t, J=5.7 Hz, 2H), 3.21-3.30(m, 2H), 3.35-3.44(m, 4H), 3.45-3.55(m, 2H), 4.11(t, J=6.4 Hz, 2H), 5.26-5.44(m, 6H).
실시예 43
3-(디메틸아미노)프로필 (2-((Z)-헥사데카-9-에닐옥시)에틸)((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)카바메이트(화합물 A-36)
실시예 10과 같은 방법으로, 화합물 B-1 대신에 실시예 39에서 얻어지는 화합물 B-10(0.150 g, 0.282 mmol), 및 화합물 VI-3 대신에 화합물 VI-1(0.095 g, 0.310 mmol)을 이용하여, 화합물 A-36(0.148 g, 수율 79%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 662(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.85-0.94(m, 6H), 1.21-1.39(m, 34H), 1.47-1.59(m, 4H), 1.76-1.84(m, 2H), 1.94-2.09(m, 8H), 2.23(s, 6H), 2.34(t, J=7.3 Hz, 2H), 2.77(t, J=6.3 Hz, 2H), 3.20-3.31(m, 2H), 3.31-3.45(m, 4H), 3.45-3.57(m, 2H), 4.11(t, J=6.3 Hz, 2H), 5.27-5.46(m, 6H).
실시예 44
3-(피페리딘-1-일)프로필 (2-((Z)-헥사데카-9-에닐옥시)에틸)((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)카바메이트(화합물 A-37)
실시예 10과 같은 방법으로, 화합물 B-1 대신에 실시예 39에서 얻어지는 화합물 B-10(0.150 g, 0.282 mmol), 및 화합물 VI-3 대신에 참고예 5에서 얻어지는 화합물 VI-4(0.107 g, 0.310 mmol)를 이용하여, 화합물 A-37(0.148 g, 수율 75%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 702(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.82-0.96(m, 6H), 1.23-1.39(m, 34H), 1.39-1.48(m, 2H), 1.49-1.61(m, 8H), 1.79-1.86(m, 2H), 1.95-2.09(m, 8H), 2.33-2.42(m, 6H), 2.78(t, J=6.8 Hz, 2H), 3.21-3.32(m, 2H), 3.34-3.44(m, 4H), 3.46-3.56(m, 2H), 4.10(t, J=6.3 Hz, 2H), 5.29-5.44(m, 6H).
실시예 45
3-(디((Z)-옥타데카-9-에닐)아미노)프로판-1-올(화합물 C-2)
공정 1
참고예 11과 같은 방법으로, 화합물 B-1 대신에 실시예 2에서 얻어지는 화합물 B-2(500 mg, 0.965 mmol)를 이용하여, 3-(디((Z)-옥타데카-9-에닐)아미노)프로피온산에틸(548 mg, 수율 92%)을 얻었다.
공정 2
실시예 21과 같은 방법으로, 화합물 XI-6 대신에 3-(디((Z)-옥타데카-9-에닐)아미노)프로피온산에틸(548 mg, 0.887 mmol)을 이용하여, 화합물 C-2(0.445 g, 수율 87%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 577(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.88(t, J=6.9 Hz, 6H), 1.24-1.42(m, 44H), 1.42-1.50(m, 4H), 1.65-1.70(m, 2H), 2.01(q, J=6.4 Hz, 8H), 2.40(t, J=7.5 Hz, 4H), 2.63(t, J=5.5 Hz, 2H), 3.79(t, J=5.3 Hz, 2H), 5.30-5.39(m, 4H).
실시예 46
3-(디((11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐)아미노)프로판-1-올(화합물 C-3)
공정 1
참고예 11과 같은 방법으로, 화합물 B-1 대신에 실시예 4에서 얻어지는 화합물 B-4(400 mg, 0.702 mmol)를 이용하여, 3-(디((11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐)아미노)프로피온산에틸(548 mg, 수율 90%)을 얻었다.
공정 2
실시예 21과 같은 방법으로, 화합물 XI-6 대신에 3-(디((11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐)아미노)프로피온산에틸(424 mg, 0.633 mmol)을 이용하여, 화합물 C-3(352 mg, 수율 88%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 629(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.9 Hz, 6H), 1.24-1.40(m, 40H), 1.42-1.50(m, 4H), 1.64-1.70(m, 2H), 2.02-2.08(m, 8H), 2.40(t, J=7.5 Hz, 4H), 2.63(t, J=5.3 Hz, 2H), 2.78(t, J=6.4 Hz, 4H), 3.79(t, J=5.0 Hz, 2H), 5.29-5.42(m, 8H).
실시예 47
2-(디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)아미노)에탄올(화합물 C-4)
공정 1
실시예 1에서 얻어지는 화합물 B-1(600 mg, 1.17 mmol)의 1,2-디클로로에탄(2.0 mL) 용액에 탄산칼륨(243 mg, 1.76 mmol) 및 브로모아세트산에틸(195 μL, 1.76 mmol)을 가하여, 85℃에서 밤새 교반했다. 얻어진 혼합물에 물을 가하여 헵탄으로 2회 추출했다. 유기층을 합쳐, 물로 세정하여, 무수황산나트륨으로 건조하고, 여과하여, 감압 농축했다. 잔사를 아미노 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헵탄/아세트산에틸=100/0~95/5)로 정제함으로써 2-(디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)아미노)아세트산에틸(527 mg, 수율 75%)을 얻었다.
공정 2
실시예 21과 같은 방법으로, 화합물 XI-6 대신에 2-(디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)아미노)아세트산에틸(527 mg, 0.878 mmol)을 이용하여, 화합물 C-4(433 mg, 수율 88%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 559(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.9 Hz, 6H), 1.24-1.39(m, 32H), 1.39-1.46(m, 4H), 2.02-2.08(m, 8H), 2.43(t, J=7.5 Hz, 4H), 2.57(t, J=5.3 Hz, 2H), 2.77(t, J=6.2 Hz, 4H), 3.52(t, J=5.5 Hz, 2H), 5.29-5.41(m, 8H).
실시예 48
4-(디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)아미노)부탄-1-올(화합물 C-5)
공정 1
실시예 1에서 얻어지는 화합물 B-1(500 mg, 0.973 mmol)의 1,2-디클로로에탄(2.0 mL) 용액에 탄산칼륨(202 mg, 1.46 mmol) 및 tert-부틸(4-요오드부톡시)디메틸실란(SIGMA-ALDRICH사 제조, 378 μL, 1.46 mmol)을 가하여, 85℃에서 4시간 교반했다. 얻어진 혼합물에 물을 가하여 헵탄으로 2회 추출했다. 유기층을 합쳐, 물로 세정하고, 무수황산나트륨으로 건조하고, 여과하여, 감압 농축했다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헵탄/아세트에틸=95/5~80/20)로 정제함으로써 (4-(tert-부틸디메틸실릴옥시)부틸)디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)아민(233 mg, 수율 34%)을 얻었다.
공정 2
(4-(tert-부틸디메틸실릴옥시)부틸)디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)아민(233 mg, 0.333 mmol)의 테트라히드로푸란(5 mL) 용액에, 불화테트라부틸암모늄(1 mol/L 테트라히드로푸란 용액, 0.666 mL, 0.666 mmol)을 가하여, 실온에서 밤새 교반했다. 얻어진 혼합물에 포화식염수를 가하여 아세트산에틸로 추출했다. 유기층을 무수황산나트륨으로 건조하고, 여과하여, 감압 농축했다. 잔사를 아미노 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헵탄/아세트산에틸=90/10)로 정제하고, 또 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산에틸/메탄올=100/0~90/10)로 정제함으로써 화합물 C-5(160 mg, 수율 82%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 587(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.9 Hz, 6H), 1.23-1.40(m, 32H), 1.43-1.51(m, 4H), 1.62-1.68(m, 4H), 2.05(q, J=7.0 Hz, 8H), 2.41-2.45(m, 6H), 2.77(t, J=6.6 Hz, 4H), 3.53-3.56(m, 2H), 5.29-5.42(m, 8H).
참고예 23: 3-(디메틸아미노)프로필 2,3-비스((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐옥시)프로필(메틸)카바메이트(화합물 XI-9)
공정 1
국제공개 제2009/129395호 팜플렛에 기재된 방법으로 합성한 2,3-비스((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐옥시)프로판-1-올(0.303 g, 0.514 mmol)의 디클로로메탄(4 ml) 용액에, 0℃에서 트리에틸아민(0.108 ml, 0.772 mmol)과 메실산클로리드(0.060 ml, 0.772 mmol)를 가하여, 실온에서 3시간 교반했다. 반응액에 포화중조수를 가하고, 아세트산에틸로 추출하여, 포화식염수로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조 후 여과하여, 감압 농축했다.
얻어진 잔사를 디클로로메탄(4 mL)에 용해하고, 메틸아민(7 mol/L 메탄올 용액, 2.20 mL)을 가하여, 마이크로파 반응 장치를 이용하여 110℃에서 5분간 교반했다. 반응액에 물을 가하여, n-헥산으로 추출하고, 포화식염수로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조 후 여과하여, 감압 농축했다. 얻어진 잔사를 아미노 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(n-헥산/아세트산에틸=95/5~70/30)로 정제하여, N-메틸-2,3-비스((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시)프로판-1-아민(0.278 g, 수율 90%)을 얻었다.
ESI-MS m/z: 603(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=7.1 Hz, 6H), 1.27-1.39(m, 34H), 1.51-1.58(m, 3H), 2.05(q, J=7.1 Hz, 8H), 2.44(s, 3H), 2.64-2.70(m, 2H), 2.77(t, J=6.9 Hz, 4H), 3.41-3.50(m, 5H), 3.54-3.58(m, 1H), 3.61-3.65(m, 1H), 5.30-5.41(m, 8H).
공정 2
N-메틸-2,3-비스((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시)프로판-1-아민(0.220 g, 0.365 mmol)의 아세토니트릴(2 mL) 현탁액에 화합물 VI-1(0.167 g, 0.548 mmol)과 트리에틸아민(0.255 mL, 1.827 mmol)을 가하여, 80℃에서 밤새 교반했다. 반응액을 포화중조수로 희석하여 아세트산에틸로 추출했다. 유기층을 포화식염수로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조 후 여과하여, 감압 농축했다. 잔사를 아미노 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(n-헥산/아세트산에틸=80/20~65/35)로 정제하여 화합물 XI-9(0.178 g, 수율 67%)를 얻었다.
ESI-MS m/z: 732(M+H)+; 1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(t, J=6.9 Hz, 6H), 1.26-1.38(m, 32H), 1.51-1.59(m, 4H), 1.77-1.83(m, 2H), 2.05(q, J=7.0 Hz, 8H), 2.22(s, 6H), 2.34(t, J=7.4 Hz, 2H), 2.77(t, J=6.8 Hz, 4H), 2.97(s, 3H), 3.19-3.25(m, 1H), 3.38-3.65(m, 8H), 4.12(t, J=6.3 Hz, 2H), 5.30-5.41(m, 8H).
실시예 49
실시예 5~9에서 얻어진 화합물(화합물 A-1~5)을 이용하여, 다음과 같이 조성물을 조제했다. 이용한 핵산은, 센스쇄 [5'-rGmUrCrAmUrCrArCrArCmUrGrArAmUrArCrCrArAmU-3'(r 및 m이 첨부된 염기에 결합하는 당은, 각각 리보오스 및 2' 위치의 수산기가 -O-메틸로 치환되어 있는 리보오스이다)]와, 안티센스쇄 [5'-rArUrUrGrGrUrArUrUrCrArGrUrGrUrGrArUrGrArCrArC-3'(염기에 결합하는 당은 모두 리보오스이고, 5' 말단을 인산화하고 있다)]로 이루어지는, 아포리포프로테인 B(Apolipoprotein-B, 이하 apo-b라고 나타냄) 유전자의 발현을 억제하는 항APO-B siRNA이며, 진디자인사로부터 입수했다(이하 apo-b siRNA라고 함).
화합물 A-1~5의 각각 /1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000)나트륨염(PEG-DMPE Na, N-(카르보닐메톡시폴리에틸렌글리콜2000)-1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민=나트륨염, 니치유사 제조)/디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 니치유사 제조)/콜레스테롤(니치유사 제조)=8.947/1.078/5.707/13.698 mmol/L가 되도록, 각 시료를 칭량하고 90 vol% 에탄올에 용해시켜, 지질막의 구성 성분의 용액을 조제했다. 한편, apo-b siRNA/증류수(24 mg/mL)를 Tris-EDTA 완충액(200 mM Tris-HCl, 20 mM EDTA, 인비트로젠(Invitrogen) 제조) 및 20 mM 시트르산 완충액(pH 5.0)으로 희석하여, 1.5 mg/mL의 apo-b siRNA 수용액(2 mM Tris-EDTA 완충액, 20 mM 시트르산 완충액, pH 5.0)을 조제했다.
얻어진 지질 용액을 37℃로 가온한 후, 500 μL를 제제 조제용의 용기로 옮겨, 얻어진 apo-b siRNA 수용액 500 μL를 교반 하에 가했다. 얻어진 지질 핵산 혼합 현탁액 1000 μL에, 20 mM 시트르산 완충액(300 mM NaCl 함유, pH 6.0) 1000 μL를 교반 하에 가하고, 또한 DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 둘베코의 인산 완충 생리식염수, Invitrogen 제조) 3310 μL를 적하하여 조제제(粗製劑)를 얻었다. 얻어진 조제제는 아미콘울트라(Millipore사 제조)를 이용하여 농축 후, DPBS로 희석하고, 0.2 ㎛의 필터(도요로시사 제조)를 이용하여 클린 벤치 내에서 여과했다. 얻어진 조성물의 siRNA 농도를 측정하고, siRNA 농도로 0.3 또는 0.03 mg/mL가 되도록 DPBS를 이용하여 희석함으로써, 제제(화합물 A-1~5의 각각 및 핵산을 함유하는 조성물)를 얻었다.
입자경 측정 장치(Zetasizer Nano ZS, 말반(Malvern)사 제조, 이하 동일)로 제제(조성물)의 평균 입자경을 측정했다. 결과를 제8표에 나타낸다.
Figure pct00027
비교예 1
화합물 1을, 특허문헌 1에 기재된 방법에 준한 방법으로 합성한 DLin-KC2-DMA 및 참고예 1~3에서 얻어진 화합물(화합물 XI-1~3)로 한 것 이외에, 실시예 49와 같은 식으로 하여 제제를 얻었다.
비교예에서 이용한 화합물(DLin-KC2-DMA 및 화합물 XI-1~3)의 구조식을 제9표에 나타낸다.
입자경 측정 장치로 제제(조성물)의 평균 입자경을 측정했다. 결과를 제10표에 나타낸다.
Figure pct00028
Figure pct00029
시험예 1
실시예 49에서 얻어진 각 제제(화합물 A-1, 3~5의 각각 및 핵산을 함유하는 조성물) 및 비교예 1에서 얻어진 각 제제(DLin-KC2-DMA 및 화합물 XI-1~3의 각각 및 핵산을 함유하는 조성물)에 관해서, 각각 이하의 방법에 의해, 인간 간암 유래 세포주 HepG2 세포(HB-8065)에 도입했다.
핵산의 최종 농도가 3-100 nM가 되도록, 옵티멤(Opti-MEM, 기브코(GIBCO)사, 31985)로 희석한 각 제제를, 96 웰의 배양 플레이트에, 20 μL씩 분주한 후, 1.25% 소 태아 혈청(FBS, SAFC바이오사이엔스(SAFC Biosciences)사, 12203C)를 포함하는 Opti-MEM에 현탁시킨 HepG2 세포를, 세포수 6250/80 μL/웰이 되도록 파종하고, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양함으로써, 각 제제를 HepG2 세포 내에 도입했다. 또한 음성 대조의 군으로서 아무것도 처리하지 않는 세포를 파종했다.
각 제제를 도입한 세포를 37℃의 5% CO2 인큐베이터 내에서 24시간 배양하고, 빙냉한 인산 완충화 생리식염수(PBS, GIBCO사, 14190)로 세정하고, Cells-to-Ct Kit(어플라이드바이오사이엔스(ABI)사, AM1728)를 이용하여, 제품에 첨부된 설명서에 기재된 방법에 따라서, 전체 RNA의 회수와, 얻어진 전체 RNA를 주형으로 하는 역전사 반응에 의한 cDNA를 제작했다.
얻어진 cDNA를 주형으로 하고, 유니버샬 프로브 라이브러리(Universal Probe Library, 로슈어플라이드사이엔스(Roche Applied Science)사, 04683633001)를 프로브로 하고, ABI7900HT Fast(ABI사 제조)를 이용하여, 첨부된 사용 설명서에 기재된 방법에 따라서 PCR 반응시킴으로써, apo-b 유전자 및 구성적 발현 유전자인 글리세르알데히드3-인산 탈수소 효소(D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, 이하 gapdh라고 나타냄) 유전자를 PCR 반응시켜 mRNA 증폭량을 각각 측정하고, gapdh의 mRNA 증폭량을 내부 대조로 하여, apo-b의 mRNA의 준정량치를 산출했다. 같은 식으로 측정한 음성 대조에 있어서의 apo-b의 mRNA의 준정량치를 1로 하여, apo-b의 mRNA의 준정량치로부터 apo-b의 mRNA의 발현율을 구했다. 얻어진 apo-b의 mRNA의 발현율의 결과를 도 1에 나타낸다.
도 1로부터 분명한 것과 같이, 실시예 49에서 얻어진 제제(화합물 A-1, 3~5의 각각 및 핵산을 함유하는 조성물) 및 비교예 1에서 얻어진 각 제제 중 DLin-KC2-DMA, 화합물 XI-1 및 화합물 XI-3의 각각, 그리고 핵산을 함유하는 조성물은, 인간 간암 유래 세포주 HepG2 세포 내에 도입 후의 apo-b 유전자의 mRNA의 발현을 억제했다. 한편, 비교예 1에서 얻어진 각 제제 중 화합물 XI-2 및 핵산을 함유하는 조성물은, 인간 간암 유래 세포주 HepG2 세포 내에 도입 후의 apo-b 유전자의 mRNA의 발현을 억제하지 않았다.
시험예 2
실시예 49에서 얻어진 각 제제(화합물 A-1~5의 각각 및 핵산을 함유하는 조성물) 및 비교예 1에서 얻어진 각 제제(DLin-KC2-DMA 및 화합물 XI-1~3의 각각, 그리고 핵산을 함유하는 조성물)에 관해서, 각각 이하의 방법에 의해 인비보 약효 평가 시험을 실시했다. 한편, 각 제제는 시험에 맞춰 DPBS로 희석하여 이용했다.
마우스(Balb/c, 니혼쿠레아로부터 입수)를 순화 사육 후, 각 제제를, siRNA 농도로 3 내지 0.3 mg/kg으로 마우스에게 정맥내 투여했다. 투여부터 48시간 후에 채혈하고, 채취한 혈액을 소형 냉각 원심기(05PR-22: 히타치사 제조)를 이용하여 3000 rpm, 20분간, 4℃에서 원심분리했다. 콜레스테롤 어세이 키트(Cayman Chemical사 제조, Cat#: 10007640)를 이용하여, 제품의 설명서에 기재된 방법에 따라서, 표준액 및 혈청 샘플 중의 형광도를 ARVO(530 nm/595 nm) 혹은 EnVision(531 nm/595 nm)으로 측정했다. 얻어진 형광도로부터 검량선을 작성하여, 혈청 중의 콜레스테롤농도를 산출했다.
산출된 혈청 중의 콜레스테롤 농도의 결과를 도 2 및 도 3에 나타낸다.
도 2 및 도 3으로부터 분명한 것과 같이, 실시예 49에서 얻어진 제제(apo-b 유전자의 발현을 억제하는 항APO-B siRNA와, 화합물 A-1~5의 각각을 함유하는 조성물)에 관해서, 인비보로 약효 평가 시험한, 콜레스테롤 농도의 측정 결과는, 비교예 1에서 얻어진 각 제제 중 화합물 XI-1~3 및 핵산을 함유하는 조성물에서의 측정 결과와 비교하여 낮아, 실시예 22에서 얻어진 제제를 투여함으로써, apo-b 유전자의 발현이 강하게 억제되고 있음을 보이고 있다.
따라서, 본 발명의 조성물은, 핵산을 세포 내 등에 도입할 수 있고, 본 발명의 양이온성 지질은, 인비보로 세포 내에 핵산을 송달하는 것을 용이하게 하는 양이온성 지질임이 분명하게 되었다.
실시예 50
실시예 10에서 얻어진 화합물(화합물 A-6)을 이용하여, 다음과 같이 조성물을 조제했다. 이용한 핵산은, 센스쇄 [5'-rGrGrAfUfCrAfUfCfUfCrArArGfUfCfUfUrAfCdTdT-3'(r, d 및 f가 첨부된 염기에 결합하는 당은, 각각 리보오스, 데옥시리보오스 및 2' 위치의 수산기가 불소로 치환되어 있는 리보오스이고, 5' 말단 측에서 3' 말단 측을 향해 20번째의 염기에 결합하는 데옥시리보오스와 21번째의 염기에 결합하는 데옥시리보오스와의 결합이 포스포로티오에이트 결합이다)]와, 안티센스쇄 [5'-rGfUrArArGrAfCfUfUrGrArGrAfUrGrAfUfCfCdTdT-3'(r, d 및 f가 첨부된 염기에 결합하는 당은, 각각 리보오스, 데옥시리보오스 및 2' 위치의 수산기가 불소로 치환되어 있는 리보오스이고, 5' 말단 측에서 3' 말단 측을 향해 20번째의 염기에 결합하는 데옥시리보오스와 21번째의 염기에 결합하는 데옥시리보오스와의 결합이 포스포로티오에이트 결합이다)]로 이루어지는, 혈액 응고 제7 인자(Coagulation factor VII, 이하 f7이라고 나타냄) 유전자의 발현을 억제하는 항f7 siRNA이며, 진디자인사로부터 입수했다(이하 f7 siRNA라고 함).
화합물 A-6/PEG-DMPE Na(니치유사 제조)/DSPC(니치유사 제조)/콜레스테롤(니치유사 제조)=3.532/0.270/1.156/2.401 mmol/L가 되도록, 각 시료를 칭량하고 100 vol% 에탄올에 용해시켜, 지질막의 구성 성분의 용액을 조제했다. 한편, f7 siRNA/증류수(24 mg/mL)를 Tris-EDTA 완충액(200 mM Tris-HCl, 20 mM EDTA, 인비트로젠(Invitrogen) 제조) 및 20 mM 시트르산 완충액(pH 4.0)으로 희석하여, 0.375 mg/mL의 f7 siRNA 수용액(2 mM Tris-EDTA 완충액, 20 mM 시트르산 완충액, pH 4.0)을 조제했다.
얻어진 지질 용액을 37℃로 가온한 후, 800 μL를 제제 조제용의 용기로 옮겨, 얻어진 f7 siRNA 수용액 800 μL를 교반 하에 가했다. 얻어진 지질 핵산 혼합 현탁액 1600 μL에, 20 mM 시트르산 완충액(300 mM NaCl 함유, pH 6.0) 1600 μL를 교반 하에 가하고, 또한 DPBS(Invitrogen 제조) 7086 μL를 적하하여 조제제를 얻었다. 얻어진 조제제는 아미콘울트라(Millipore사 제조)를 이용하여 농축 후, DPBS로 희석하고, 0.45 ㎛의 필터(도요로시사 제조)를 이용하여 클린 벤치 내에서 여과했다. 얻어진 조성물의 siRNA 농도를 측정하고, siRNA 농도로 0.03 mg/mL가 되도록 DPBS를 이용하여 희석함으로써, 제제(화합물 A-6 및 핵산을 함유하는 조성물)를 얻었다.
입자경 측정 장치로 제제(조성물)의 평균 입자경을 측정했다. 결과를 제11표에 나타낸다.
실시예 51
실시예 1~48에서 얻어진 화합물 중, 화합물 A-1, A-5, A-7~21, A-28~36, B-1, B-8 및 C-1~5의 각각을 이용하여, 실시예 50과 같은 식으로 제제(화합물 A-1, A-5, A-7~21, A-28~36, B-1, B-8 및 C-1~5의 각각 및 핵산을 함유하는 조성물)를 얻었다.
입자경 측정 장치로 제제(조성물)의 평균 입자경을 측정했다. 결과를 제11표에 나타낸다.
Figure pct00030
비교예 2
화합물 A-6을, 참고예 9~13에서 얻어진 화합물(화합물 XI-4~8)로 한 것 이외에는, 실시예 50과 같은 식으로 하여 제제를 얻었다.
비교예 2에서 이용한 화합물(화합물 XI-4~8)의 구조식을 제12표에 나타낸다.
입자경 측정 장치로 제제(조성물)의 평균 입자경을 측정했다. 결과를 제13표에 나타낸다.
Figure pct00031
Figure pct00032
시험예 3
실시예 50 및 51에서 얻어진 각 제제(화합물 A-1, A-5~21, A-28~36, B-1, B-8 및 C-1~5의 각각 및 핵산을 함유하는 조성물) 및 비교예 2에서 얻어진 각 제제(화합물 XI-4~8 및 핵산을 함유하는 조성물)에 관해서, 각각 이하의 방법에 의해 인비보 약효 평가 시험을 실시했다. 한편, 각 제제는 시험에 맞춰 DPBS 또는 생리식염수로 희석하여 이용했다.
마우스(Balb/c, 니혼쿠레아로부터 입수)를 순화 사육 후, 각 제제를, siRNA 농도로 0.3, 0.1 및/또는 0.03 mg/kg으로 마우스에게 정맥내 투여했다. 투여부터 48시간 후에 채혈하고, 채취한 혈액을 미량 고속 냉각 원심기(TOMY MX305: 토미세이코사 제조)를 이용하여 8000 rpm, 8분간, 4℃에서 원심분리했다. BIOPHEN VII 키트(ANIARA사 제조 cat#: A221304)를 이용하여, 제품의 설명서에 기재된 방법에 따라서, 표준액 및 혈장 샘플 중의 흡광도를 ARVO(405 nm)로 측정했다. 얻어진 흡광도로부터 검량선을 작성하여, 혈장 중의 인자 VII 단백질 농도를 산출했다. 한편 예의 수는 각 군 3마리로 했다.
산출된 혈장 중의 인자 VII 단백질 농도의 결과를 도 4~도 9에 나타낸다.
도 4~도 8로부터 분명한 것과 같이, 실시예 50 및 51에서 얻어진 각 제제(인자 VII 유전자의 발현을 억제하는 항인자 VII siRNA와, 화합물 A-6, A-1, A-7~12, B-1, B-8, C-1, A-5, A-13~21, A-28~26 및 C-2~5의 각각을 함유하는 조성물)에 관해서, 인비보로 약효 평가 시험한, 혈장 중 인자 VII 단백질 농도의 측정 결과는, 실시예 50 및 51에서 얻어진 각 제제를 투여함으로써, 인자 VII 유전자의 발현이 강하게 억제되고 있음을 보이고 있다.
따라서, 본 발명의 조성물은, 핵산을 세포 내 등에 도입할 수 있고, 본 발명의 양이온성 지질은, 인비보로 세포 내에 핵산을 송달하는 것을 용이하게 하는 양이온성 지질임이 분명하게 되었다.
실시예 52
실시예 5에서 얻어진 화합물 A-1을 이용하여, 다음과 같이 조성물을 조제했다.
핵산으로는, 실시예 50에서 이용한 것과 동일한 핵산을, 증류수로 24 mg/mL로 조제하여 이용했다.
화합물 A-1/PEG-DMPE Na(니치유사 제조)=57.3/5.52 mmol/L가 되도록, 각 시료를 칭량하여, 염산 및 에탄올을 함유하는 수용액에 현탁시키고, 와류(vortex) 교반 믹서로 교반하고 또 가온을 반복하여 균일한 현탁액을 얻었다. 이 현탁액을 실온 하에서, 0.2 ㎛의 폴리카보네이트 멤브레인 필터에 통과시키고, 또한 0.05 ㎛의 폴리카보네이트 멤브레인 필터에 통과시켜, 화합물 A-1/PEG-DMPE Na의 입자(리포좀)의 분산액을 얻었다. 입자경 측정 장치로 얻어진 리포좀의 평균 입자경을 측정하여, 30 nm에서 100 nm의 범위 내임을 확인했다. 얻어진 리포좀의 분산액과, f7 siRNA 용액을, 리포좀의 분산액: f7 siRNA 용액=3:1의 비율로 혼합하고, 또한 3배량의 증류수를 가하여 혼합함으로써 화합물 A-1/PEG-DMPE Na/f7 siRNA 복합체의 분산액을 조제했다.
한편, A-1/PEG-DMPE Na(니치유사 제조)/DSPC(니치유사 제조)/콜레스테롤(니치유사 제조)=8.947/1.078/5.707/13.698 mmol/L가 되도록, 각 시료를 칭량하고 90 vol% 에탄올에 용해시켜, 지질막 구성 성분의 용액을 조제했다.
얻어진 지질막 구성 성분의 용액을 가온한 후, 얻어진 화합물 A-1/PEG-DMPE Na/f7 siRNA 복합체의 분산액과, 1:1의 비율로 혼합하고, 또한 수배량의 증류수를 혼합하여, 조제제를 얻었다.
얻어진 조제제는 아미콘울트라(Millipore사 제조)를 이용하여 농축 후, 생리식염수로 희석하고, 0.2 ㎛의 필터(도요로시사 제조)를 이용하여 클린 벤치 내에서 여과했다. 얻어진 조성물의 siRNA 농도를 측정하고, siRNA 농도로 0.03, 0.01 또는 0.003 mg/mL가 되도록 생리식염수를 이용하여 희석함으로써, 제제(화합물 A-1 및 핵산을 함유하는 조성물)를 얻었다.
입자경 측정 장치로 제제(조성물)의 평균 입자경을 측정했다. 결과를 제14표에 나타낸다.
실시예 53
실시예 1~48에서 얻어진 화합물 중, 화합물 A-5~7, A-10, A-12~21, A-28~36, B-8 및 C-1~5의 각각을 이용하여, 실시예 52와 같은 식으로 제제(화합물 A-5~7, A-10, A-12~21, A-28~36, B-8 및 C-1~5의 각각 및 핵산을 함유하는 조성물)를 얻었다.
입자경 측정 장치로 제제(조성물)의 평균 입자경을 측정했다. 결과를 제14표에 나타낸다.
Figure pct00033
비교예 3
화합물 A-1을, 참고예 23에서 얻어진 화합물 XI-9로 한 것 이외에는, 실시예 52와 같은 식으로 하여 제제를 얻었다.
비교예 3에서 이용한 화합물(화합물 XI-9)의 구조식을 제12표에 나타낸다.
입자경 측정 장치로 제제(조성물)의 평균 입자경을 측정했다. 결과를 제13표에 나타낸다.
시험예 4
실시예 52 및 53에서 얻어진 각 제제 또는 실시예 52 혹은 53과 같은 식으로 하여 얻어진 제제(화합물 A-1, A-5~7, A-10, A-12~21, A-28~36, B-8 및 C-1~5의 각각 및 핵산을 함유하는 조성물) 및 비교예 3에서 얻어진 제제(화합물 XI-9 및 핵산을 함유하는 조성물)에 관해서, 시험예 3과 같은 방법에 의해 인비보 약효 평가 시험을 실시했다. 산출된 혈장 중의 인자 VII 단백질 농도의 결과를 도 10~도 13에 나타낸다.
실시예 54
실시예 5, 11 및 17에서 얻어진 화합물(화합물 A-1, A-7 및 A-10)을 각각 이용하여, 다음과 같이 조성물을 조제했다. 핵산으로서는, 실시예 50에서 이용한 것과 같은 핵산을 이용했다.
화합물 A-1, A-7 또는 A-10의 각각 /PEG-DMPE Na(니치유사 제조)/DSPC(니치유사 제조)/콜레스테롤(니치유사 제조)=7.030/0.755/2.038/4.892 mmol/L가 되도록, 각 시료를 칭량하고 100 vol% 에탄올에 용해시켜, 지질막의 구성 성분의 용액을 조제했다. 한편, f7 siRNA/증류수(24 mg/mL)를 Tris-EDTA 완충액(200 mM Tris-HCl, 20 mM EDTA, 인비트로젠(Invitrogen) 제조) 및 20 mM 시트르산 완충액(pH 4.0)으로 희석하여, 0.536 mg/mL의 f7 siRNA 수용액(2 mM Tris-EDTA 완충액, 20 mM 시트르산 완충액, pH 4.0)을 조제했다.
얻어진 지질 용액을 37℃로 가온한 후, 560 μL를 제제 조제용의 용기로 옮겨, 얻어진 f7 siRNA 수용액 560 μL를 교반 하에 가했다. 얻어진 지질 핵산 혼합 현탁액 1120 μL에, 20 mM 시트르산 완충액(300 mM NaCl 함유, pH 6.0) 1120 μL를 교반 하에 가하고, 또한 DPBS(Invitrogen 제조) 4960 μL를 적하하여 조제제를 얻었다. 얻어진 조제제는 아미콘울트라(Millipore사 제조)를 이용하여 농축 후, DPBS로 희석하고, 0.45 ㎛의 필터(도요로시사 제조)를 이용하여 클린 벤치 내에서 여과했다. 또한 얻어진 조성물의 siRNA 농도를 측정하고, siRNA 농도로 0.03 또는 0.01 mg/mL가 되도록 DPBS를 이용하여 희석함으로써, 제제(화합물 A-1, A-7 및 A-10의 각각 및 핵산을 함유하는 조성물)를 얻었다.
입자경 측정 장치로 제제(조성물)의 평균 입자경을 측정했다. 결과를 제15표에 나타낸다.
Figure pct00034
시험예 5
실시예 54에서 얻어진 각 제제(화합물 A-1, A-7 혹은 A-10의 각각 및 핵산을 함유하는 조성물)에 관해서, 시험예 3과 같은 방법에 의해 인비보 약효 평가 시험을 실시했다. 산출된 혈장 중의 인자 VII 단백질 농도의 결과를 도 14에 나타낸다.
본 발명의 양이온성 지질 및 핵산을 함유하는 조성물을 포유류 등에 투여함으로써, 상기 핵산을 예컨대 세포 내 등에 용이하게 도입할 수 있다.
서열 번호 1-아포리포프로테인 B siRNA 센스쇄
서열 번호 2-아포리포프로테인 B siRNA 안티센스쇄
서열 번호 3-혈액 응고 제7 인자 siRNA 센스쇄
서열 번호 4-혈액 응고 제7 인자 siRNA 안티센스쇄
SEQUENCE LISTING <110> Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. <120> Cationic Lipid <130> 1000P12278 <150> JP2012152423 <151> 2012-07-06 <150> US61789466 <151> 2013-03-15 <150> JP2013092327 <151> 2013-04-25 <160> 4 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apolipoprotein-B siRNA sense <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> um <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> um <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> um <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> um <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> um <400> 1 gucaucacac ugaauaccaa u 21 <210> 2 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apolipoprotein-B siRNA antisense <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5'-phosphorylated Adenosine <400> 2 auugguauuc agugugauga cac 23 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor VII siRNA sense <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n = uracil <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n = uracil <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n = uracil <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n = uracil <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> n = uracil <220> <221> modified_base <222> (4)..(5) <223> 2'-fluoro <220> <221> modified_base <222> (7)..(10) <223> 2'-fluoro <220> <221> modified_base <222> (14)..(17) <223> 2'-fluoro <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> 5'-phosphorothioated Thymidine <400> 3 ggancancnc aagncnnact t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor VII siRNA antisense <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n = uracil <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> n = uracil <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n = uracil <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n = uracil <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-fluoro <220> <221> modified_base <222> (7)..(9) <223> 2'-fluoro <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-fluoro <220> <221> modified_base <222> (17)..(19) <223> 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> 5'-phosphorothioated Thymidine <400> 4 gnaagacnng agangancct t 21

Claims (22)

  1. 식(A)
    Figure pct00035

    (식에서, R1은 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐이고,
    R2는 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐, 알콕시에틸, 알콕시프로필, 알케닐옥시에틸, 알케닐옥시프로필, 알키닐옥시에틸 또는 알키닐옥시프로필이고,
    R3 및 R4는 동일하거나 또는 상이하며 탄소수 1~3의 알킬이거나, 또는 함께 결합하여 탄소수 2~8의 알킬렌을 형성하거나, 또는 R3은 R5와 함께 결합하여 탄소수 2~8의 알킬렌을 형성하고,
    R5는 수소 원자, 탄소수 1~6의 알킬, 탄소수 3~6의 알케닐, 아미노, 모노알킬아미노, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일 또는 동일하거나 혹은 상이한 1~3개의 아미노, 모노알킬아미노, 히드록시, 알콕시, 카르바모일, 모노알킬카르바모일 혹은 디알킬카르바모일로 치환된 탄소수 1~6의 알킬 혹은 탄소수 3~6의 알케닐이거나, 또는 R3과 함께 결합하여 탄소수 2~8의 알킬렌을 형성하고,
    X1은 탄소수 1~6의 알킬렌이고,
    X2는 단결합이거나, 또는 탄소수 1~6의 알킬렌이고, 단, X1과 X2의 탄소수의 합은 7 이하이고, R5가 수소 원자인 경우, X2는 단결합이고, R5가 R3과 함께 결합하여 탄소수 2~6의 알킬렌을 형성하는 경우, X2는 단결합이거나, 또는 메틸렌 혹은 에틸렌이다),
    식(B)
    Figure pct00036

    (식에서, R6은 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐이고,
    R7은 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐, 알콕시에틸, 알콕시프로필, 알케닐옥시에틸, 알케닐옥시프로필, 알키닐옥시에틸 또는 알키닐옥시프로필이다), 또는
    식(C)
    Figure pct00037

    (식에서, R8은 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐이고,
    R9는 탄소수 8~24의 직쇄상 또는 분기상의 알킬, 알케닐 혹은 알키닐, 알콕시에틸, 알콕시프로필, 알케닐옥시에틸, 알케닐옥시프로필, 알키닐옥시에틸 또는 알키닐옥시프로필이고,
    X3은 탄소수 1~3의 알킬렌이고,
    R10은 수소 원자 또는 탄소수 1~3의 알킬이다)으로 나타내어지는 양이온성 지질.
  2. 제1항에 있어서, R1, R2, R6, R7, R8 및 R9가, 각각 테트라데실, 헥사데실, (Z)-테트라데카-9-에닐, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (E)-옥타데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-11-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (9Z,12Z,15Z)-옥타데카-9,12,15-트리에닐, (Z)-이코사-11-에닐, (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐 또는 (Z)-도코사-13-에닐인 양이온성 지질.
  3. 제1항에 있어서, R1, R2, R6, R7, R8 및 R9가, 각각 헥사데실, (Z)-헥사데카-9-에닐, (Z)-옥타데카-6-에닐, (Z)-옥타데카-9-에닐, (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐, (Z)-이코사-11-에닐 또는 (11Z,14Z)-이코사-11,14-디에닐인 양이온성 지질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 탄소수 1~3의 알킬렌이고, X2가 단결합 또는 메틸렌인 양이온성 지질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, X3이 메틸렌 또는 에틸렌인 양이온성 지질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, R3 및 R4가, 동일하거나 혹은 상이하며 메틸 혹은 에틸, 또는 함께 결합하여 n-펜틸렌 또는 n-헥실렌을 형성하는 양이온성 지질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R3 및 R5가 함께 결합하여 n-프로필렌 또는 n-부틸렌을 형성하고, R4가 메틸 또는 에틸인 양이온성 지질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, R5 및 R10이 각각 수소 원자 또는 메틸인 양이온성 지질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재한 양이온성 지질 및 핵산을 함유하는 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 양이온성 지질과 상기 핵산이 복합체를 형성하고 있거나, 또는 상기 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 상기 핵산이 복합체를 형성하고 있는 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 양이온성 지질과 상기 핵산이 복합체를 형성하고 있거나, 또는 상기 양이온성 지질에 중성 지질 및/혹은 고분자를 조합시킨 것과 상기 핵산이 복합체를 형성하고 있고, 상기 복합체를 봉입하는 지질막을 함유하는 조성물.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 RNA 간섭(RNAi)을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 작용을 갖는 핵산인 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 표적 유전자가, 간장, 폐, 신장 또는 비장에서 발현되는 유전자인 조성물.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재한 조성물을 이용하여 상기 핵산을 세포 내에 도입하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 세포가, 포유류의 간장, 폐, 신장 또는 비장에 있는 세포인 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 세포 내에 도입하는 방법이, 상기 조성물의 정맥내 투여에 의해서 세포 내에 도입하는 방법인 방법.
  17. 제13항에 기재한 조성물을 포유동물에게 투여하는 공정을 포함하는, 간장, 폐, 신장 또는 비장에 관련된 질환의 치료 방법.
  18. 제17항에 있어서, 투여하는 방법이 정맥내 투여인 방법.
  19. 제12항에 기재한 조성물을 포함하는, 질환의 치료에 이용하기 위한 의약.
  20. 제19항에 있어서, 정맥내 투여용인 의약.
  21. 제13항에 기재한 조성물을 포함하는, 간장, 폐, 신장 또는 비장에 관련된 질환의 치료제.
  22. 제21항에 있어서, 정맥내 투여용인 간장, 폐, 신장 또는 비장에 관련된 질환의 치료제.
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