JPWO2012091056A1 - 血液中の標的細胞の検査方法、標的細胞検索装置、及びバイオチップ - Google Patents

Abstract

非侵襲で安全に胎児の出生前診断を迅速かつ正確に行うために,採血した母体血液中に極僅かしか存在しない胎児由来標的細胞を適宜濃縮し,又は乳幼児乃至成人の血液中に存在する異常な標的細胞を適宜濃縮し,平面プレート上やバイオチップの流路内で短時間で高精度に検索し,その位置を特定してからその標的細胞を確実に回収し,その細胞核内の染色体やＤＮＡやＲＮＡを正確に解析する簡易かつ効率的な血液中の標的細胞の検査方法を提供する。血液中の標的細胞の検査方法は,標的辞書作成工程、及び非標的辞書作成工程を予め行っておいてから検査対象となる血液に対して検体取得工程,検体標識工程,光学標識発現工程,焦点制御工程,カラー画像取得工程,２値化処理工程,収縮膨張工程,１次候補検索工程,２次候補検索工程,３次候補検索工程,標的細胞特定工程,標的細胞回収工程,及び標的細胞検査工程の各工程を行って血液中の標的細胞を検査する。

Description

本発明は、出生前診断を行うために、採血した血液を用いて胎児由来細胞のような特定の標的細胞を検査する方法、標的細胞検索装置、及びバイオチップに関するものである。

胎児の出生前診断として知られている羊水検査は、母体への侵襲が大きいばかりでなく、子宮や胎児を傷つけ流産や死産を招いてしまう恐れがある。

母体の血液１ｍｌ中に、胎児由来細胞、例えば有核赤血球が１個程度移行していることが知られている。そこで、非侵襲性の出生前診断としての臨床的有用性を検討するため、米国等で１９９５年から約５年間かけて、母体血液を用いた胎児の出生前診断に関する大規模な臨床研究（NIFTY study）が行われた。この臨床研究は、抗原抗体法を用いて標的細胞を特異的に蛍光標識してから液流に乗せて流しながらレーザー光源等で蛍光強度や標的細胞の大きさ等を高速に測定するフローサイトメトリーである蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ法：Fluorescence-activated cell sorting）や、細胞表面抗原と抗原抗体反応する抗体を介して磁性マイクロビーズをその標的細胞へ特異的に結合させ、磁力によって目的の細胞を回収する核磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ法：Magnetic-activated cell sorting）などの手法により、２７４４症例も実施された。

これらのＦＡＣＳ法やＭＡＣＳ法などを利用した胎児細胞分離法を行った後、得られた細胞について、そのＤＮＡを標識した蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ法：Fluorescence in situ hybridization）でＸＹ細胞と診断できた細胞が高々４１％でしかなく、しかも偽陽性率が１１％にも達するという報告がなされている。

このように、これらのＦＡＣＳ法、ＭＡＣＳ法などの手法では、母体血液中から胎児由来細胞をロスなく確実に回収することは極めて困難である。

これらの問題を解決するために、特許文献１に、ＸＹステージを設けた光学顕微鏡及びＣＣＤカメラを用いて、試料台に置かれた標的細胞のあるスライドガラスを、標的細胞の形態的な特長すなわち核領域と細胞膜領域と細胞質領域とに分けて色、形状、位置関係及び面積比などから画像処理を施すことによって、標的細胞を効果的に探索する方法が開示されている。しかし、検体がスライドガラス上に撒かれており、母体血液の１ｍｌに１個程度、即ち血液中の雑多な約１０^８個の細胞中に１個程度しか存在しない胎児由来有核赤血球のような標的細胞を母体血液全血から検索して見つけ出すには、くまなく全血検査して探索しなければならず、見つけ出すまでの時間が相当必要となる。仮に探索できても胎児由来有核赤血球のような極僅かの標的細胞を分離・回収するのは容易でない。

特許文献２に、対物レンズ及び撮像装置を備えた顕微鏡と、ＸＹ移動機構を有し標的対象物含有試料の載ったスライドガラスを顕微鏡で観察可能な位置に移動できる試料台と、試料から探索された標的対象物を回収するノズルと、撮像装置で取得した標的対象物及びノズルの画像データを解析する解析部及びそれらのデータ及びその位置を記憶する記憶部を有する画像処理ユニットと、焦点合わせ及びＸＹ面内における試料板−ノズルの相対位置を制御する制御ユニットとを含む標的対象物の自動探索回収装置が開示されている。この装置では、焦点合わせの際に、顕微鏡のＺ位置を移動させながら画像を取得する処理を繰り返し、得られた複数の画像のコントラスト強度を計算して、コントラスト強度が最も高い画像を合焦画像としている。しかし、複数の画像におけるコントラスト強度の計算は演算量が多いため時間が掛かってしまい、その結果、標的対象物の検索に時間がかかってしまう。

特開２００４−２４８６１９号公報 特開２００５−２０７９８６号公報

本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、非侵襲で安全に胎児の出生前診断を迅速かつ正確に行うために、採血した母体血液中に極僅かしか存在しない胎児由来標的細胞を適宜濃縮し、又は乳幼児乃至成人の血液中に存在する異常な標的細胞を適宜濃縮し、平面プレート上やバイオチップの流路内で、短時間で高精度に、検索し、その位置を特定してから、その標的細胞を確実に回収し、その細胞核内の染色体やＤＮＡやＲＮＡを正確に解析する簡易かつ効率的な血液中の標的細胞の検査方法を提供することを第一の目的とする。さらに、その方法に用いるのに適しており、多数の血液検体を迅速に検索できる簡素で高性能な標的細胞検索装置を提供することを第二の目的とする。さらに、標的細胞の光学検索に適しており、標的細胞検索装置と組み合わせて用いることで、標的細胞を迅速かつ効率的に回収できるバイオチップを提供することを第三の目的とする。

前記の目的を達成するためになされた、請求の範囲の請求項１に記載された血液中の標的細胞の検査方法は、
辞書作成用サンプルとして採血した基準となる細胞が含まれる血液中の細胞を光学標識し、その光学標識に対応した光を照射してカラー撮像し、撮像したカラー画像データから前記基準となる細胞を複数個分選別し、選別した各細胞領域を標的辞書用画像データとして所定画像サイズで各々切り出し、切り出した各標的辞書用画像データを前記基準となる細胞に対応する所定色に基づいて２値化処理し、得られた複数個分の標的用２値化画像データを主成分分析してその固有ベクトルから得られた正規直交基底を予め標的辞書とする標的辞書作成工程、
前記カラー画像データの中から前記基準となる細胞以外の細胞を複数個分選別し、選別した各細胞領域を非標的辞書用画像データとして前記所定画像サイズで各々切り出し、切り出した各非標的辞書用画像データを前記所定色に基づいて２値化処理し、得られた複数個分の非標的用２値化画像データを主成分分析してその固有ベクトルから得られた正規直交基底を予め非標的辞書とする非標的辞書作成工程、
検査用に血液を採血し、又はその血液を濃縮して、検査すべき標的細胞が含まれている血液検体を取得する検体取得工程、
前記血液検体を、平面プレート上で膜化して固定した後、又はバイオチップの流路へ注入した前若しくは後に、前記標的細胞を前記光学標識と同様に光学標識する検体標識工程、
前記平面プレート、又は前記バイオチップの前記検体に前記光学標識に対応した光学標識発現光を照射する光学標識発現工程、
前記平面プレート、又は前記バイオチップで全反射可能な照射角度で焦点合わせ用の光を照射し、前記平面プレート、又は前記バイオチップにおける前記焦点合わせ用の光の反射位置に基づいて、前記血液検体に撮像カメラの焦点合わせをする焦点制御工程、
前記撮像カメラで前記血液検体を拡大して撮像してカラー画像データを得るカラー画像取得工程、
前記カラー撮像取得工程で撮像したカラー画像データを、前記所定色に基づいて２値化処理する２値化処理工程、
前記２値化処理した画像データを収縮膨張処理する収縮膨張処理工程、
前記収縮膨張処理した画像データの各連結画素領域にラベルを付与する１次候補検索工程、
前記ラベルのうちから前記所定画像サイズ内で近接する異なるラベルの連結画素領域同士に同一のラベルを再付与し直す２次候補検索工程、
前記２次候補検索工程後の各ラベルが示す前記連結画像領域を含む前記所定画像サイズの検査用画像データを順次切り出し、その検査用画像データと、前記標的辞書及び前記非標的辞書の各々とのベクトル距離を算出し、その両ベクトル距離を順次評価処理して、前記非標的辞書よりも前記標的辞書に所定評価値内で類似する検査用画像データを選定する３次候補検索工程、
前記選定された検査用画像データの前記連結画素領域を前記標的細胞であると判定してその位置を特定する標的細胞特定工程、
前記標的細胞を前記位置の情報に基づいて回収する標的細胞回収工程、
前記標的細胞の染色体、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを解析する標的細胞検査工程
を有することを特徴とする。

請求項２に記載の血液中の標的細胞の検査方法は、請求項１に記載のものであり、前記標的細胞が、胎児由来有核赤血球であることを特徴とする。

請求項３に記載の血液中の標的細胞の検査方法は、請求項１〜２の何れかに記載のものであり、前記検体取得工程中、比重遠心法により前記濃縮が行われ、そこから比重によって分離して前記取得することを特徴とする。

請求項４に記載の血液中の標的細胞の検査方法は、請求項１〜３の何れかに記載のものであり、前記検体標識工程中、前記血液検体を平面プレート上で膜化して固定し、そこから、前記標的細胞回収工程中、前記標的細胞を前記選別しつつ、吸い出し、掻き出し、又は掬い出して、前記回収することを特徴とする。

請求項５に記載の血液中の標的細胞の検査方法は、請求項１〜４の何れかに記載のものであり、前記検体標識工程中、前記バイオチップの流路に、前記血液検体を注入しつつ、前記標的細胞回収工程中、前記流路内で前記位置を特定することを特徴とする。

請求項６に記載の血液中の標的細胞の検査方法は、請求項５に記載のものであり、前記標的細胞回収工程中、前記流路から、前記選別した前記標的細胞を、前記回収する流路経路へ誘導することを特徴とする。

請求項７に記載の血液中の標的細胞の検査方法は、請求項１〜６の何れかに記載のものであり、前記標的細胞検査工程中、前記染色体、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを、その検出すべき染色体のセントロメア又は検出すべき遺伝子配列に結合する１本鎖の相補配列と蛍光色素とが結合した診断用蛍光プローブでハイブリダイゼーション反応させて検出して、前記解析することを特徴とする。

請求項８に記載の血液中の標的細胞の検査方法は、請求項７に記載されたもので、前記診断用プローブの標識材は、蛍光、又は磁気を用いていることを特徴とする。

請求項９に記載の血液中の標的細胞の検査方法は、請求項１〜８の何れかに記載されたもので、前記標的細胞検査工程中、前記標的細胞及び／又はそれに由来する組織の懸濁液からなる試料を、流路、区画、溝、キャピラリー、ファイバー及び／又ビーズからなるバイオチップ反応場に注入し、前記試料を前記細胞の染色体、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡに反応する標識試薬と前記反応場で反応させてから、前記標識試薬の標識を、検出することを特徴とする。

請求項１０に記載の標的細胞検索装置は、
辞書作成用サンプルとして採血した基準となる細胞が含まれる血液中の細胞を光学標識し、その光学標識に対応した光を照射してカラー撮像し、撮像したカラー画像データから前記基準となる細胞を複数個分選別し、選別した各細胞領域を標的辞書用画像データとして所定画像サイズで各々切り出し、切り出した各標的辞書用画像データを前記基準となる細胞に対応する所定色に基づいて２値化処理し、得られた複数個分の標的用２値化画像データを主成分分析してその固有ベクトルから得られた正規直交基底が標的辞書として予め記憶されている標的辞書記憶部と、
前記カラー画像データの中から前記基準となる細胞以外の細胞を複数個分選別し、選別した各細胞領域を非標的辞書用画像データとして前記所定画像サイズで各々切り出し、切り出した各非標的辞書用画像データを前記所定色に基づいて２値化処理し、得られた複数個分の非標的用２値化画像データを主成分分析してその固有ベクトルから得られた正規直交基底が非標的辞書として予め記憶されている非標的辞書記憶部と、
検査用に血液が採血され又はその血液が濃縮され、検査すべき標的細胞が光学標識されている血液検体が、載せられた平面プレート、又は前記血液検体が注入されている流路を有するバイオチップを、保持可能であると共に、ＸＹＺ軸方向に移動制御可能なＸＹＺステージと、
前記ＸＹＺステージで保持された前記平面プレート、又は前記バイオチップの前記血液検体を拡大してそのカラー画像を撮像可能な撮像カメラと、
前記光学標識に対応した光学標識発現光を前記平面プレート、又は前記バイオチップに照射する撮像用光源と、
前記平面プレート、又は前記バイオチップで全反射可能な照射角度で焦点制御用の光を照射する焦点制御用光源と、
前記平面プレート、又は前記バイオチップにおける前記焦点制御用の光の反射位置を検出する反射光検出器と、
前記反射光検出器の検出する前記反射位置に基づいて、前記ＸＹＺステージをＺ軸方向に移動させて前記血液検体に前記撮像カメラの焦点合わせをする焦点制御手段と、
前記ＸＹＺステージをＸＹ軸方向に移動させて前記撮像カメラの撮像位置を制御する撮像位置制御手段と、
前記撮像カメラに撮像させて前記血液検体のカラー画像データを取得するカラー画像取得手段と、
前記カラー画像データを前記所定色に基づいて２値化処理する２値化処理手段と、
前記２値化処理した画像データを収縮膨張処理する収縮膨張処理手段と、
前記収縮膨張処理した画像データの各連結画素領域に対応するラベルを付与する１次候補検索手段と、
前記ラベル記憶部に記憶されたラベルのうちから前記所定画像サイズ内で近接する異なるラベルの連結画素領域同士に同一のラベルを再付与し直す２次候補検索手段と、
前記２次候補検索工程後の各ラベルが示す前記連結画像領域を含む前記所定画像サイズの検査用画像データを順次切り出し、その検査用画像データと、前記標的辞書及び前記非標的辞書の各々とのベクトル距離を算出し、その両ベクトル距離を順次評価処理して、前記非標的辞書よりも前記標的辞書に所定評価値内で類似する検査用画像データを選定するする３次候補検索手段と、
前記選定された検査用画像データの前記連結画素領域が前記標的細胞であると判定してその位置を特定する標的細胞特定手段とを、
備えることを特徴とする。

請求項１１に記載の標的細胞検索装置は、請求項１０に記載されたもので、前記３次候補検索手段が、前記検査用画像データを切り出す位置を１画素ずつずらして前記所定画像サイズで複数回切り出して、そのずらして切り出した各々の前記検査用画像データごとに前記評価処理を行うことを特徴とする。

請求項１２に記載の標的細胞検索装置は、請求項１０〜１１の何れかに記載のもので、前記標的細胞特定手段が、前記３次候補検索手段で選定された前記検査用画像データの前記連結画像領域の大きさ、及び／又は真円度が所定規定値内である前記連結画像領域を前記標的細胞であると判定してその標的細胞の位置を特定することを特徴とする。

請求項１３に記載の標的細胞検索装置は、請求項１０〜１２の何れかに記載されたもので、前記焦点制御用光源が前記撮像用光源として兼用されていることを特徴とする。

請求項１４に記載の標的細胞検索装置は、請求項１０〜１３の何れかに記載されたもので、前記標的細胞特定手段で前記標的細胞であると特定された前記検査用画像データと、前記標的辞書の作成に用いられた複数の前記標的用２値化画像データとを合わせて主成分分析して、その固有ベクトルから得られた正規直交基底を前記標的辞書として前記標的辞書記憶部に更新して記憶させる標的辞書学習手段をさらに備えることを特徴とする。

請求項１５に記載の標的細胞検索装置は、請求項１０〜１４の何れかに記載されたもので、３次候補検索手段で前記選定されなかった前記検査用画像データ、又は前記標的細胞特定手段で前記標的細胞であると判定されなかった前記検査用画像データと、前記非標的辞書の作成に用いられた複数の前記非標的用２値化画像データとを合わせて主成分分析して、その固有ベクトルから得られた正規直交基底を非標的辞書として前記非標的辞書記憶部に更新して記憶させる非標的辞書学習手段をさらに備えることを特徴とする。

請求項１６に記載の標的細胞検索装置は、請求項１０〜１５の何れかに記載されたもので、さらにディスプレイを備え、前記標的細胞特定手段が位置を特定した前記標的細胞の前記類似度、前記検査用画像データの画像、前記検査用画像データと同範囲で切り出した前記カラー画像データの画像、及びカラー画像データ全体の画像の中から選ばれる少なくとも１つを前記ディスプレイに表示可能であることを特徴とする。

請求項１７に記載の標的細胞検索装置は、請求項１０〜１６の何れかに記載されたもので、前記標的細胞特定後の前記平面プレート、及び特定前の前記平面プレートを各々複数枚収容することが可能なストッカと、このストッカと前記ＸＹＺステージとの間で前記平面プレートを搬送する搬送機構とをさらに有することを特徴とする。

請求項１８に記載のバイオチップは、検査用に採血した血液とそれを濃縮した血液との何れかの血液検体が注入される流路を有するバイオチップであって、
前記流路は、前記血液検体中の検査すべき光学標識された標的細胞が通過可能であると共に前記標的細胞よりも大きな細胞が通過不可である隙間を有する標的細胞通過フィルターと、この標的細胞通過フィルターよりも下流に配されて前記標的細胞を前記バイオチップの外界から光学観察可能な光学観測用窓部と、この光学観測用窓部よりも下流で前記流路から分岐する前記標的細胞の回収用分岐路と、この回収用分岐路の分岐部分に配されて前記標的細胞を前記回収用分岐路に誘導するための弁とを備えることを特徴とする。

請求項１９に記載のバイオチップは、請求項１８に記載されたもので、前記標的細胞通過フィルターが前記流路に複数配されていることを特徴とする。

請求項２０に記載のバイオチップは、請求項１８〜１９の何れかに記載されたもので、前記弁が、熱的に制御可能な熱制御弁、電気的に制御可能な電気制御弁、又は磁気的に制御可能な磁気制御弁であることを特徴とする。

請求項２１に記載のバイオチップは、請求項１８〜２０の何れかに記載されたもので、前記光学観測窓部における前記流路が、前記標的細胞が重なり合うことなくその流路に沿って１列で通過可能な流路幅で形成されていることを特徴とする。

請求項２２に記載のバイオチップは、請求項１８〜２１の何れかに記載されたもので、前記光学観測窓部よりも上流の前記流路に、前記標的細胞を光学標識する光学標識用薬液を外界から注入するための薬液注入路が合流していることを特徴とする。

本発明の血液中の標的細胞の検査方法によれば、非侵襲であって母体・胎児に対して安全であり、検査を行う所為で流産や死産を誘発することがなく、胎児の出生前診断を迅速かつ正確に行うことができる。この検査方法は、採血した母体血液中に極僅かしか存在しない胎児由来標的細胞を遠心分離等で適宜濃縮し一検体当たりの容量を少なくして効率化を図ったものである。またこの検査方法によれば、出生後の乳幼児のような子供から成人までの老若を問わずその血液中に存在する異常な標的細胞の有無などの診断を迅速かつ正確に行うことができる。

この検査方法は、その母体血液から適宜濃縮した胎児由来標的細胞や乳幼児乃至成人の血液から適宜濃縮した異常な標的細胞を、平面プレート上やバイオチップの流路内で、短時間で高精度に、瞬時に検索して、その位置を光学的に測定して特定してから、その僅かな標的細胞を確実に捕捉して回収できるので、信頼性が高いものである。

しかも、その細胞核内の染色体やＤＮＡやＲＮＡ等の遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等により増幅したり、増幅せずに核細胞へのＦＩＳＨ法の操作を行ったりして、特異的な蛍光プローブで光学的に又は磁気プローブで磁気的に検出し、染色体診断・ＤＮＡ診断をして、正確に解析して高信頼性の遺伝子診断をすることができるので、簡易かつ効率的に、胎児の出生前の高度な医療診断、乳幼児乃至成人の血液成分検査による精密で高度な医療診断に資する。

さらに、本発明の血液中の標的細胞の検査方法、及び標的細胞検索装置によれば、標的細胞の基準となる細胞の画像を主成分分析して標的辞書を作成し、それ以外の細胞の画像を主成分分析して非標的辞書を作成しておいて、検査用に採血した血液の画像と、これら辞書及び検査用画像とのベクトル距離を計算し、辞書との類似度を評価するという僅かな計算量で標的細胞を検索できるので、高速で高効率な検索が可能である。しかも、カラー画像自体を画像処理して検索するのではなく、標的細胞に対応する所定色でカラー画像を２値化し、この２値化画像を画像処理して検索を行うので、カラー画像での画像処理よりも演算量が少なくなり一層高速な検索が可能である。また、焦点制御用の光を平面プレート等に全反射させ、その反射位置に基づき焦点合わせを行うことで、画像のコントラスト強度を演算する場合より、演算量が遥かに少なく高速に焦点合わせを行えるので、高速な検索が可能になる。また、撮像用の光を焦点制御用の光に兼用させる場合、簡便な構成とすることができる。

また、本発明の標的細胞検索装置は、血液検体を迅速に処理して高速で高効率に標的細胞を検索できるので、標的細胞を分離して確実に捕捉して回収し、またそれの細胞核内の染色体やＤＮＡやＲＮＡ等の遺伝子を、正確に解析して高信頼性の遺伝子診断を行う非侵襲の診断システム用に適した簡素で高性能な標的細胞検索装置である。

また、本発明のバイオチップは、血液やそれの濃縮成分・分離成分のような血液検体中から標的細胞を検索するのに適しており、検索した標的細胞を直ちに分離回収し得るものである。

本発明を適用する血液中の標的細胞の検査方法を示すフローチャートである。 標的辞書作成工程における主成分分析を詳細に説明するフローチャートである。 本発明を適用する標的細胞検索装置のブロック図である。 図３中の撮像部の概要を示す側面図（ａ）、及びその変形例を示す側面図（ｂ）である。 図４の撮像部の焦点合わせの動作の概要を説明する概要図である。 図１中の３次候補検索工程を詳細に説明するフローチャートである。 本発明を適用する他の標的細胞検索装置における撮像部の概要を示す側面図である。 本発明を適用するバイオチップの模式的な平面図（ａ）、標的細胞通過フィルター７２の拡大平面図（ｂ）、光学観察窓部７３の拡大平面図（ｃ）、光学観察窓部７３における流路７６の拡大側面断面図（ｄ）である。 本発明を適用するバイオチップの張り合わせ法を模式的に示す側面図である。 染色後の標的細胞画像（ａ）、赤血球画像（ｂ）、白血球画像（ｃ）である。 ＦＩＳＨ後の正常細胞画像例（ａ）、２１番染色体トリソミー細胞蛍光観察画像（ｂ）である。 本発明を適用する染色体検査及び遺伝子検査用バイオチップの模式的な平面図である。 本発明を適用する染色体検査及び遺伝子検査用バイオチップでの染色後細胞観察画像（ａ）とＦＩＳＨ後蛍光観察画像（ｂ）である。 本発明を適用する染色体検査及び遺伝子検査用バイオチップでの遺伝子検査用ＤＮＡマイクロアレイ蛍光観察画像を示しており、夫々正常細胞ＤＮＡマイクロアレイ結果（ａ）と２１トリソミー細胞ＤＮＡマイクロアレイ結果（ｂ）とを示している。 標的辞書用画像データとして切り出したカラー画像例（ａ）、非標的辞書用画像データとして切り出したカラー画像例（ｂ）である。 濃縮した血液検体を撮像したカラー画像（ａ）、２値化処理後の２値化画像（ｂ）、収縮膨張処理後の２値化画像（ｃ）である。

１は標的細胞検索装置、２は撮像部、３は処理部、４はディスプレイ、５はストッカ、６は搬送機構、８は平面プレート、９は標的辞書作成手段、１０は非標的辞書作成手段、１１はＸＹＺステージ、１２はレーザー光源、１３は焦点用カメラ、１４は撮像用光源、１５は撮像カメラ、１６は拡大レンズ、２１は画像取得手段、２２は焦点制御手段、２３は撮像位置制御手段、２４は搬送制御手段、３１は標的辞書記憶部、３２は非標的辞書記憶部、４１は検索用記憶部、４２は２値化処理手段、４３は収縮膨張処理手段、４４は１次候補検索手段、４５は２次候補検索手段、４６は３次候補検索手段、４７は標的細胞特定手段、５１は標的辞書学習手段、５２は非標的辞書学習手段、５５は観察画像、５６は規定位置、６１は検体用容器、６２は制御弁、６３は加圧ポンプ、６４は三方開閉制御弁、６５は回収用容器、６６は廃棄用容器、６７は一方の出力管、６８は他方の出力管、７０・７５はバイオチップ、７１・７６は流路、７２は標的細胞通過フィルター、７３は光学観察窓部、７７は廃棄路、７８は回収用分岐路、７９は開閉制御弁、８０は薬液注入路、８２は隙間、８５は制御用電極、８６はベース板材、８７はカバー板材、９１は標的細胞、９２は非標的細胞、１０１は液流路、１０２は開閉制御弁、１０３はＦＩＳＨチャンバー、１０４は細胞固定化フィルター、１０５はＰＣＲチャンバー、１０６はＤＮＡマイクロアレイチャンバー、Ｌ１・Ｌ２は幅、Ｌｅは焦点制御用のレーザー光、Ｌｅ´は反射光、Ｌ_Ｔは光学標識発現光、θは角度、Ｓ１は標的辞書作成工程、Ｓ２は非標的辞書作成工程、Ｓ１１は検体取得工程、Ｓ１２は検体標識工程、Ｓ１３は光学標識発現工程、Ｓ１４は焦点制御工程、Ｓ１５はカラー画像取得工程、Ｓ１６は２値化処理工程、Ｓ１７は収縮膨張工程、Ｓ１８は１次候補検索工程、Ｓ１９は２次候補検索工程、Ｓ２０は３次候補検索工程、Ｓ２１は標的細胞特定工程、Ｓ２２はステップ、Ｓ２３は標的細胞回収工程、Ｓ２４は標的細胞検査工程、Ｓ２２・Ｓ３１〜Ｓ３５・Ｓ４１〜Ｓ５０はフローチャートにおけるステップである。

以下、本発明の実施形態を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの形態に限定されるものではない。

本発明を適用する血液中の標的細胞の検査方法は、図１の標的辞書作成工程Ｓ１、及び非標的辞書作成工程Ｓ２を予め行っておく。その後、検査対象となる採血した血液に対して、同図の検体取得工程Ｓ１１、検体標識工程Ｓ１２を行って濃縮血液検体中の標的細胞を光学標識し、光学標識発現工程Ｓ１３、焦点制御工程Ｓ１４、カラー画像取得工程Ｓ１５、２値化処理工程Ｓ１６、収縮膨張工程Ｓ１７、１次候補検索工程Ｓ１８、２次候補検索工程Ｓ１９、３次候補検索工程Ｓ２０、標的細胞特定工程Ｓ２１を行って標的細胞の位置を特定し、標的細胞回収工程Ｓ２３、標的細胞検査工程Ｓ２４を行って血液中の標的細胞を検査する。なお、平面プレートに濃縮血液検体を固定した場合、１度に撮像できる領域が平面プレートよりも狭いので、平面プレートの撮像領域を移動させて光学標識発現工程Ｓ１３〜標的細胞特定工程Ｓ２１までの処理を繰り返し行い、平面プレート全体についての標的細胞の探索を行う（ステップＳ２２）。平面プレートの濃縮血液検体を１度で撮像できる場合には、ステップＳ２２の繰り返しは不要である。

以下では、検査すべき血液中の標的細胞が胎児由来有核赤血球（ＮＲＢＣ）である場合について詳細に説明するが、標的細胞はこれに限られず、未分化なＮＲＢＣのみならず非有核赤血球に限定されず、様々な血中細胞としてもよく、具体的には白血球、血小板などを検査対象としてもよい。例えば、ＮＲＢＣ以外の赤血球として、形態異常の赤血球、例えばマラリアに感染した患者の赤血球、鎌状赤血球（鎌状赤血球症）をはじめ、大赤血球（ビタミンB12欠乏症など）、小赤血球・低色素性（鉄欠乏症など）、球状赤血球（遺伝子性球状赤血球症など）、楕円赤血球（遺伝子性楕円赤血球症など）、口腔赤血球（溶血性貧血など）、涙滴状赤血球（骨髄線維症など）、標的赤血球（サラセミア）、有赫赤血球（先天性無β-リポプロテイン血症など）、三日月状赤血球（播種性血管内凝固など）のような、非有核赤血球を検査対象としてもよい。

標的辞書作成工程Ｓ１では、辞書作成用サンプルとして採血した基準となるＮＲＢＣが含まれる母体血液中の細胞を光学標識し、その光学標識に対応した光を照射してカラー撮像してカラー画像データを得る。このようなカラー画像データは、後述する検体取得工程Ｓ１１〜カラー画像取得工程Ｓ１５までと同様に行うことで得ることができる。撮像したカラー画像データ中からオペレータが画像を見ながらＮＲＢＣを複数個分選別し、選別した各細胞領域を所定画像サイズで標的辞書用画像データとして各々切り出す。この所定画像サイズは、ＮＲＢＣがちょうど１つ切り出せる（含まれる）程度の画像の大きさであり、撮像倍率により適宜調整する。一例として、所定画像サイズは５２画素×５２画素の大きさである。切り出した各々の標的辞書用画像データを基準となるＮＲＢＣに対応する所定色に基づいて２値化処理する。このような２値化処理は、後述する２値化処理工程Ｓ１６と同様に行う。得られた複数個分の標的用２値化画像データを主成分分析してその固有ベクトルから得られた正規直交基底を予め標的辞書とする。

図２に、主成分分析のフローチャートを示す。先ず、ステップＳ３１で、複数（ｎ個）のＮＲＢＣの各標的用２値化画像データＤ（ｐ、ｑ）を各々ベクトル化する。ここで、ｐは画素のＸ座標、ｑは画素のＹ座標を表し、例えば、標的用２値化画像データＤ（ｐ、ｑ）が５２画素×５２画素の場合、ｐ、ｑは各々１〜５２の値を取る。ｐ、ｑの最大値をＰ，Ｑとすると、標的用２値化画像データＤ（ｐ、ｑ）はＰ行Ｑ列の行列であるので、これをＰ×Ｑ次元の１列の行列である標的辞書用ベクトルＤｖ（ｍ）で表すことができる。ここでｍは、１〜Ｐ×Ｑの整数値であり、５２画素×５２画素の場合、１〜２７０４になる。

例えば、Ｄｖ（１）＝Ｄ（１，１）、Ｄｖ（２）＝Ｄ（１，２）、Ｄｖ（３）＝Ｄ（１，３）・・・Ｄｖ（ｍ）＝Ｄ（Ｐ，Ｑ）のようにベクトル化する。このような標的辞書用ベクトルがｎ個あるので、各ベクトルをＤｖ１、Ｄｖ２・・・Ｄｖｎで表す。

次に、ステップＳ３２で、辞書用ベクトルＤｖ１、Ｄｖ２・・・Ｄｖｎの平均ベクトルを下記（１）式で算出する。

次にステップＳ３３で、平均ベクトルとの共分散行列Ｃｐを下記（２）式で算出する。

次に、ステップＳ３４で、共分散行列Ｃｐを固有値分解する。続いて、ステップＳ３５で、固有値の値の大きい上位から複数個（例えば４０個）の固有値に対する固有ベクトルを求める。固有値の個数は、９０％以上を表現できる個数とすることが好ましい。これらの固有ベクトルを並べた行列は、正規直交基底であり、これが標的辞書Ｂになる。

後述する標的細胞検索装置１（図３参照）では、標的辞書作成手段９が上記のようにして標的辞書Ｂを作成して、標的辞書記憶部３１に記憶させる。

非標的辞書作成工程Ｓ２では、標的辞書作成工程Ｓ１で使用したカラー画像データ、又は同様にして得られたカラー画像データの中から基準となるＮＲＢＣ以外の細胞を、オペレータが画像を見ながら複数個分選別し、選別したその各細胞領域を所定画像サイズで非標的辞書用画像データとして切り出す。切り出した各非標的辞書用画像データを所定色に基づいて２値化処理し、得られた複数個分の非標的用２値化画像データを主成分分析してその固有ベクトルから得られた正規直交基底を予め非標的辞書Ｃとする。

非標的辞書を作成する際に、ＮＲＢＣ以外の細胞として、好中球などの白血球の他、ＮＲＢＣではない赤芽球等の細胞を選択することが好ましい。

非標的辞書作成工程Ｓ２中の画像の切り出し方法、２値化処理や主成分分析の方法などは、対象とする細胞が異なるだけで、標的辞書作成工程Ｓ１と同様に行うことができるので、詳細な説明を省略する。後述する標的細胞検索装置１（図３参照）では、非標的辞書作成手段１０が上記のようにして非標的辞書Ｃを作成して、非標的辞書記憶部３２に記憶させる。また、標的辞書Ｂ及び非標的辞書Ｃは、標的細胞検索装置１で作成してもよいし、例えば、標的細胞検索装置１の製造メーカーが予め作成しておいて、それを装置とは別にデータで販売してもよい。

図１に戻って、検体取得工程Ｓ１１から説明する。

検体取得工程Ｓ１１では、検査用に採血した母体血液を遠心分離等により所望の成分に濃縮して、検査すべき胎児由来の標的細胞が含まれている濃縮血液検体を取得する。例えば、赤血球や白血球よりも比重が大小の２種で互いに難混和性懸濁液である比重調整液、具体的にはポリビニルピロリドン被覆シリカゲル微細粉末懸濁液であるパーコール液（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）と共に母体血液を遠沈管に入れて、遠心分離する。より具体的には、ヘパリン採血した母体血液を、比重の異なる２層のパーコール液を入れた遠沈管に注入し、それを遠心分離器で高速回転させて比重の違いから遠心分離させ、比重に応じて複数層に分かれた母体血液中からＮＲＢＣの含まれる赤血球及び白血球含有層をピペットで採取して濃縮血液検体を取得する。複数の遠沈管を用いて同時に遠心分離することで、異なる母体血液から濃縮血液検体を並列的に高速に採取してもよい。このような比重調整液を用いた比重遠心分離法の他に、ナイロンウール法、糖鎖レクチンを用いたレクチン法、多孔質フィルターによる白血球及びＮＲＢＣ捕捉法、遠心による血漿除去法、脱水法、限外濾過法、血液吸着法など公知の種々の方法によって濃縮血液検体を採取してもよい。

検体標識工程Ｓ１２では、濃縮血液検体を、平面プレート８（図３参照）上で膜化して固定した後、標的細胞全体を光学標識する。平面プレート８は、例えばスライドグラスなどの光学顕微鏡観察に適した試料台である。光学標識としては、一例として、ギムザ染色やヘマトキシリン染色やライト染色のような蛍光・染色標識；抗CD7１抗体、抗CD36抗体、抗glycophorin A抗体のような抗体を用いたもので、緑色蛍光色素であるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識モノクローナル抗体、オレンジ色蛍光色素であるフィコエリスリン（ＰＥ）標識モノクローナル抗体、テキサスレッド標識モノクローナル抗体、アロフィコシアニン標識モノクローナル抗体のような標識蛍光色素を用いた蛍光標識が挙げられる。ＮＲＢＣを蛍光標識する場合、検体取得工程Ｓ１１で得られた濃縮血液検体を平面プレート８上に滴下して、均一に広げて乾燥させ、ギムザ染色液などの蛍光染色液につけて乾燥させる。

このように細胞の全体を染色することによって光学標識した平面プレート８に対して、光学標識発現工程Ｓ１３〜標的細胞特定工程Ｓ２１を繰り返し行って、画像処理により標的細胞の位置を特定するが、先ずこれら工程Ｓ１３〜Ｓ２１を行うに適している本発明の標的細胞検索装置１の構成について説明を行ってから、工程Ｓ１３〜Ｓ２１について説明する。

図３に示すように、標的細胞検索装置１は、一例として、撮像部２、処理部３、ディスプレイ４、ストッカ５、及び搬送機構６を備えている。

撮像部２は、処理部３に制御されて動作して、濃縮血液検体を拡大したカラー画像を撮像するものであり、ＸＹＺステージ１１、撮像カメラ１５、撮像用光源１４、レーザー光源１２、及び焦点用カメラ１３を備えている。この撮像部２の側面図を図４（ａ）に示す。

同図に示すように、ＸＹＺステージ１１は、平面プレート８を位置決めして保持可能であると共に、ＸＹＺ軸方向に移動制御可能なものである。ＸＹＺステージ１１は、平端な台であり、その上部（図の上側）に平面プレート８が載置され、位置決め機構（図示せず）で平面プレート８を位置決め固定する。また、ＸＹＺステージ１１は、ＸＹＺ移動機構（図示せず）を有し、処理部３の撮像位置制御手段２３（図３参照）に接続され、Ｘ軸方向（図の左右方向）及びＹ軸方向（図の表面裏面方向）の動きを制御され、処理部３の焦点制御手段２２（図３参照）に接続され、Ｚ軸方向（図の上下方向）の動きを制御される。このようなＸＹＺステージ１１は、公知のものを採用することができる。

撮像カメラ１５は、一例として、カラーＣＣＤカメラであり、その撮像方向に光学顕微鏡などの拡大レンズ１６を有している。この撮像カメラ１５は、ＸＹＺステージ１１に保持された平面プレート８に対向する位置に配置されていて、平面プレート８上の濃縮血液検体中に含まれる標的細胞を識別可能な倍率で拡大して、そのカラー画像を撮像する。

撮像用光源１４は、撮像用の光を平面プレート８に照射するものであり、濃縮血液検体の光学標識に対応して、光学標識を発現させる波長の光学標識発現光Ｌ_Ｔを照射する。例えば、光学標識が蛍光標識である場合、光学標識発現光Ｌ_Ｔは蛍光物質を励起可能な波長の光である。この場合、撮像用光源１４として蛍光物質に対応した紫外や近紫外などの特定波長を発振する発光ダイオードが用いられる。また、光学標識が視認可能な染色標識である場合、光学標識発現光Ｌ_Ｔは可視光である。この場合、撮像用光源１４として白色発光ダイオードやハロゲンランプなどが用いられる。

撮像用光源１４は、図４（ａ）に示すように平面プレート８に対して撮像カメラ１５と同じ側に配置する構成（落射照明の構成）としてもよいし、図４（ｂ）に示すように平面プレート８に対して撮像カメラ１５と反対側に配置する構成（透過照明の構成）としてもよい。図４（ａ）の落射照明の場合、撮像カメラ１５は濃縮血液検体の反射光を撮像し、図４（ｂ）の透過照明の場合、撮像カメラ１５は濃縮血液検体の透過光を撮像する。透過照明の場合には、ＸＹＺステージ１１には、光学標識発現光Ｌ_Ｔの照射を妨げないように平面プレート８の縁部分を保持させる。標的細胞検索装置１は、撮像用光源１４として、落射照明及び透過照明の両照明を有していて、いずれかを選択可能であることが好ましい。いずれの照明で撮像するかは、光学標識の発色具合、鮮明度などに基づき適宜選択する。

レーザー光源１２は、焦点制御用の光を照射する焦点制御用光源である。このレーザー光源１２は、ＸＹＺステージ１１上の平面プレート８に対して角度θでレーザー光Ｌｅを照射する位置に配置されている。この角度θは、レーザー光Ｌｅが平面プレート８で全反射する角度である。

焦点用カメラ１３は、本発明における反射光検出器に相当し、例えばモノクロＣＣＤカメラである。この焦点用カメラ１３は、同図に示すように、平面プレート８で反射したレーザー光Ｌｅの反射光Ｌｅ´を検出可能となるように、平面プレート８に対して撮像方向を角度θで傾斜させてレーザー光源１２に対向する位置に配置されている。

図３に戻って説明すると、標的細胞検索装置１の処理部３は、標的細胞検索装置１の動作を統括的に制御するものであり、図示しないが、各種演算や処理を行う中央処理装置（ＣＰＵ）、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ハードディスク、入出力インタフェースなどを有する１台又は複数台のコンピュータ、及びその動作用プログラムで構成されている。以下の各手段は、このコンピュータ及び動作用プログラムによって協働して実現されている。

処理部３は、標的辞書作成手段９、非標的辞書作成手段１０、画像取得手段２１、焦点制御手段２２、撮像位置制御手段２３、搬送制御手段２４、標的辞書記憶部３１、非標的辞書記憶部３２、検索用記憶部４１、２値化処理手段４２、収縮膨張処理手段４３、１次候補検索手段４４、２次候補検索手段４５、３次候補検索手段４６、標的細胞特定手段４７、標的辞書学習手段５１、及び非標的辞書学習手段５２を有している。各記憶部３１，３２，４１は、一例としてハードディスクである。

ストッカ５は、標的細胞の検索前、及び検索後の平面プレート８を、複数枚（例えば８０枚）収容して、各平面プレート８の出し入れが制御可能なものである。搬送機構６は、ストッカ５と撮像部２との間で、平面プレート８を搬送する。

検査方法に戻って説明を続けると、検体標識工程Ｓ１２で検体標識した複数の平面プレート８を、オペレータがストッカ５に収容する。標的細胞検索装置１を作動させると、その搬送制御手段２４がストッカ５及び搬送機構６を制御して、ストッカ５から１枚の平面プレート８をＸＹＺステージ１１にセットする。また、撮像位置制御手段２３が、平面プレート８の所定の撮像位置が撮像カメラ１５の撮像領域に入るように、ＸＹＺステージ１１を制御する。

光学標識発現工程Ｓ１３では、画像取得手段２１が撮像用光源１４に光学標識発現光Ｌ_Ｔを照射させる。これにより、濃縮血液検体の蛍光標識が励起されて、その細胞核が蛍光発色する。

焦点制御工程Ｓ１４では、焦点制御手段２２がレーザー光源１２にレーザー光Ｌｅ（図４参照）を照射させる。焦点制御手段２２が、焦点用カメラ１３から撮像画像を取得し、平面プレート８で反射したレーザー光Ｌｅの反射光Ｌｅ´の反射位置に基づいて、ＸＹＺステージ１１をＺ軸方向に移動させて、平面プレート８と拡大レンズ１６との距離を制御することで、濃縮血液検体に撮像カメラ１５（拡大レンズ１６）の焦点合わせを行う。

図５に、焦点用カメラ１３の観察画像５５を示す。焦点用カメラ１３は、平面プレート８上の反射光Ｌｅ´の反射位置を観察している。拡大レンズ１６と平面プレート８（図４参照）との距離が、拡大レンズ１６の焦点がちょうど平面プレート８に合う距離で、図５（ｂ）に示すように、反射光Ｌｅ´が観察画像５５の画面中央の規定位置５６に一致して観察されるように、焦点用カメラ１３の撮像領域を予め調整しておく。このようにしておくと、平面プレート８が拡大レンズに１４に近いときには、図５（ａ）に示すように、反射光Ｌｅ´の反射位置がずれるので、規定位置５６から一例として観察画像５５中の左側にずれて観察される。逆に遠いときには、図５（ｃ）に示すように、反射光Ｌｅ´の反射位置が規定位置５６から右側にずれて観察される。焦点制御手段２２は、反射光Ｌｅ´が規定位置５６にちょうど重なって観察されるようにＸＹＺステージ１１をＺ軸方向に移動させることで、焦点合わせが行われる。

このように焦点合わせを行うと、反射光Ｌｅ´が規定位置５６に合うようにＸＹＺステージ１１を移動させるだけなので、例えば、ＸＹＺステージ１１をＺ軸方向に徐々に移動させながら撮像カメラ１５の撮像した画像のコントラストを演算し、コントラストが最も高くなる位置を見つけ出すように制御する場合よりも、遥かに演算量が少ないので、高速に焦点合わせを行うことができる。

カラー画像取得工程Ｓ１５では、カラー画像取得手段２１が撮像カメラ１５に撮像させて、カラー画像データＸ（ｉ，ｊ）を取得し、平面プレート８におけるＸ，Ｙ情報（位置情報）と共に、検索用記憶部４１に記憶させる。撮像カメラ１５が一度に撮像できる平面プレート８の領域は通常狭い領域であるので、撮像したカラー画像データＸ（ｉ，ｊ）は平面プレート８の一部の画像データになる。ここで、ｉは画像データにおけるＸ軸方向の位置、ｊはＹ軸方向の位置を示し、例えばカラー画像データＸ（ｉ，ｊ）が２０００画素×１０００画素のサイズであれば、ｉは１〜２０００の整数値、ｊは１〜１０００の整数値である。平面プレート８はＸＹＺステージ１１に位置決めされているので、得られたカラー画像データＸ（ｉ，ｊ）中の位置ｉ，ｊを特定し、撮像したカラー画像データＸ（ｉ，ｊ）の平面プレート８における位置を参照することで、平面プレート８における位置の特定が可能である。

２値化処理工程Ｓ１６では、２値化処理手段４２が、検索用記憶部４１に記憶されたカラー画像データＸ（ｉ，ｊ）を読み出して、基準となる細胞に対応する所定色に基づいて２値化処理して、検索用記憶部４１に記憶させる。この所定色とは、この場合、標的とするＮＲＢＣの蛍光標識された細胞核の色であり、予め、サンプルから得られた基準となる複数のＮＲＢＣの色を平均化して求めている。ここでは、演算に用いるために、この所定色の赤色（Ｒ）成分、緑色（Ｇ）成分、青色（Ｂ）成分は、各々の色の階調の最大値（例えば、８ビット階調の場合２５５）で除算することで、最大値を１とするように、正規化されている。正規化された所定色のＲ成分をＸｒ、Ｇ成分をＸｇ、Ｂ成分をＸｂとする。このＸｒ，Ｘｇ，Ｘｂは検索用記憶部４１に予め記憶させておく。

２値化処理は、２値化処理手段４２がカラー画像データＸ（ｉ，ｊ）の各画素のＲＧＢ成分を、各々色の階調の最大値で正規化してから、画素ごとに下記（３）式を算出する。ここで正規化後の画素のＲ成分をｒ、Ｇ成分をｇ、Ｂ成分をｂとする。

Ｃ＞０．９９となった画素、つまり所定色に近似する色の画素を例えば１とし、それ以外の画素を例えば０として全ての画素について２値化する。２値化処理手段４２は、２値化した２値化画像データＩＲ（ｉ、ｊ）を、カラー画像データＸ（ｉ，ｊ）とは別に検索用記憶部４１に記憶させる。

このようにＮＲＢＣ細胞核の色情報に基づいて２値化処理すると、カラー画像よりもデータ量が少なくなるため、以下の各工程で高速に検索することができる。

収縮膨張工程Ｓ１７では、収縮膨張処理手段４３が、検索用記憶部４１から２値化画像データＩＲ（ｉ、ｊ）を読み込んで、注目画素の周囲を取り囲む８画素の中に０が有ればその注目画素を０とする収縮処理を全画素について処理後、注目画素の周囲を取り囲む８画素の中に１が有れば注目画素を１とする膨張処理を全画素について行い、その処理結果で２値化画素データＩＲ（ｉ，ｊ）を置き換えて、検索用記憶部４１に記憶させる。収縮膨張処理により、ノイズが除去される。収縮膨張処理は、必要に応じて複数回行ってもよい。

１次候補検索工程Ｓ１８では、１次候補検索手段４４が、２値化画像データＩＲ（ｉ，ｊ）の中で、１である画素が隣接し合って塊となっている連結画素領域に対して、各連結画素領域を識別できるようにラベルを付与するラベリング処理を行い、付与したラベルをその連結画素領域に対応付けて、検索用記憶部４１に記憶させる。なお、ラベリング処理は公知の方法で行うことができる。

２次候補検索工程Ｓ１９では、２次候補検索手段４５が、検索用記憶部４１に記憶されたラベルを読み込んで、所定画像サイズ内で近接する異なるラベルの連結画素領域同士に同一のラベルを再付与し直して検索用記憶部４１に記憶させる。つまり、次の３次候補検索工程Ｓ２０で検査用画像データを切り出す際に、所定画像サイズ内に入って同時に切り出せる異なるラベルの連結画素領域に対して、同一のラベルを再付与する。この所定画像サイズは、標的辞書Ｂや非標的辞書Ｃを作成する際の標的辞書用画像データや非標的辞書用画像データと同じ画像サイズである。例えば、切り出す所定画像サイズが５２画素×５２画素である場合、異なる連結画素領域がこの５２画素×５２画素内に入っているときには、同一のラベルを再付与する。

このように近接する連結画素領域に同一のラベルを付与することで、次の３次候補検索工程Ｓ２０で処理する計算量が少なくなるので、高速に検索することができる。

また、２次候補検索手段４５は、同一のラベルの連結画素領域のＸ座標、Ｙ座標を平均化して、その連結画素領域の重心座標Ｌｘ，Ｌｙを求め、そのラベルに対応付けて、検索用記憶部４１に記憶させる。

３次候補検索工程Ｓ２０では、３次候補検索手段４６が、２次候補検索工程後の各ラベルが示す連結画像領域を含む所定画像サイズの検査用画像データを順次切り出し、その検査用画像データと、標的辞書Ｂ及び非標的辞書Ｃの各々とのベクトル距離を算出し、その両ベクトル距離を順次評価処理して、非標的辞書よりも標的辞書に所定評価値内で類似する検査用画像データを選定する。この３次候補検索工程Ｓ２０を図６のフローチャートに沿って詳細に説明する。

先ずステップＳ４１で、３次候補検索手段４６が、検索用記憶部４１から１つのラベルの重心座標Ｌｘ，Ｌｙを読み込んで、所定画像サイズの検査用画像データの切り出し位置を決定する。標的細胞が歪んでいる場合には、重心が偏るため、重心座標Ｌｘ，Ｌｙを中心として検査用画像データを切り出したときに、標的細胞が偏って切り出されてしまい、検査用画像データからはみ出してしまう場合がある。そのため、重心座標Ｌｘ，Ｌｙを中心座標として検査用画像データを切り出して評価するだけでなく、切り出す中心座標を重心座標Ｌｘ，Ｌｙから１画素ずつずらして検査用画像データを切り出して評価処理を行うことが好ましい。画素をずらす最大の範囲は、所定画像サイズの縦や横の１／８〜１／２０の範囲程度とすることが好ましい。ここでは、一例として、重心座標Ｌｘ，Ｌｙから±４画素までずらして評価するものとする。この場合、１つのラベルについて、計８１回切り出して評価処理を行うことになる。このように１画素ずつずらして探索を行うと、標的細胞を高精度に検索することができる。なお、標的細胞の形状に歪みが無い場合や、検査用画像データから標的細胞がはみ出さないように切り出せる場合には、１画素ずつずらす処理は行わなくてもよい。

このように１画素ずつずらして検査用画像データを切り出すために、ステップＳ４１では、３次候補検索手段４６が、重心座標Ｌｘ，Ｌｙから±４画素の範囲内の切り出す中心座標を順番に１つ指定する。

次にステップＳ４２で、３次候補検索手段４６が、ステップＳ４１で指定された座標を中心とする所定画像サイズ（５２画素×５２画素）の検査用画像データＫ（ｐ、ｑ）を、２値化画像データＩＲ（ｉ，ｊ）から切り出して検索用記憶部４１から読み込む。ここで、ｐはＸ軸方向の画素を表し、ｑはＹ軸方向の画素を表す。所定画像サイズが５２画素×５２画素の場合、ｐ、ｑは、１〜５２の整数値である。

３次候補検索手段４６は、この検査用画像データＫ（ｐ、ｑ）をベクトル化する。すなわち、Ｐ×Ｑ次元の検査用ベクトルＡ、つまり１列の行列Ａ（ｍ）で表現する。このベクトル化は、標的辞書作成工程Ｓ１で行ったベクトル化と同様に行う。

例えば、検査用ベクトルＡ（ｍ）は、Ａ（１）がＫ（１,１）、Ａ（２）がＫ（１,２）、・・・Ａ（ｍ）がＫ（Ｐ，Ｑ）のように、検査用画像データＫ（ｐ、ｑ）が５２画素×５２画素の場合、その２７０４個の画素値を順に並べた１列の行列である。

ステップＳ４３で、３次候補検索手段４６は、検査用ベクトルＡ（ｍ）の各要素（各画素）の加算平均値ｈを下記（４）式で算出する。

ステップＳ４４で、３次候補検索手段４６は、検査用ベクトルＡ（ｍ）のノルム計算を行う。検査用ベクトルＡ（ｍ）のノルムＶｒの計算は、以下の（５）式で算出する。

ステップＳ４５で、３次候補検索手段４６は、算出した加算平均値ｈ及びノルムＶｒで検査用ベクトルＡ（ｍ）を正規化する。具体的には、検査用正規化ベクトルＡｖ（ｍ）は、次の（６）式で算出される。

ステップＳ４６で、３次候補検索手段４６は、検査用正規化ベクトルＡｖと標的辞書Ｂとの距離Ｇｂを算出すると共に、検査用正規化ベクトルＡｖと非標的辞書Ｃとの距離Ｇｃを算出する。

検査用正規化ベクトルＡｖと標的辞書Ｂとの距離Ｇｂは両ベクトル同士の内積Ａ・Ｂを算出する。また、検査用正規化ベクトルＡｖと非標的辞書Ｃとの距離Ｇｃは両ベクトル同士の内積Ａ・Ｃを算出する。

ステップＳ４７で、３次候補検索手段４６は、式（７）で示す評価関数Ｓで類似度を算出して、検索用記憶部４１に記憶させる。

この評価関数Ｓは、検査用正規化ベクトルＡｖ（検査用ベクトルＡ）が非標的辞書Ｃよりも標的辞書Ｂに近い場合に負の値になり、標的辞書Ｂに近いほど値が−１に近づく。

ステップＳ４８で、３次候補検索手段４６は、ステップＳ４６で算出した値Ｓが負の場合、つまり所定評価値（値０）よりも小さい範囲内の場合に、その検査用ベクトルＡが、非標的辞書Ｃよりも標的辞書Ｂに類似するものとして選定し、選定したことが分かるようにフラグ等を検索用記憶部４１に記憶させる。

ステップＳ４９で、３次候補検索手段４６は、重心座標Ｌｘ，Ｌｙの±４画素の範囲について全て評価が終了していないときには、ステップＳ４１に戻り、１画素ずらした検査用画像データを切り出してＳ４２〜Ｓ４８を行う。３次候補検索手段４６は、中心位置を１画素ずつずらして評価した中で、最も評価関数Ｓの値が−１に近い中心位置を重心座標Ｌｘ，Ｌｙとして更新し、そのときの類似度を、ラベルに対応させて検索用記憶部４１に上書きして記憶させる。

ステップＳ５０で、３次候補検索手段４６は、全てのラベルについて類似度を算出したか判別し、まだ全ての算出が終了していないときには、別のラベルについてステップＳ４１〜Ｓ４９を繰り返す。全てのラベルについて終了すると、３次候補検索工程Ｓ２０を終了する。

標的細胞特定工程Ｓ２１では、標的細胞特定手段４７が、３次候補検索工程Ｓ２０で選定された検査用画像データの連結画素領域が標的細胞であるものと判定し、その位置を特定して出力する。なお、３次候補検索工程Ｓ２０で標的細胞と判定される連結画素領域が複数あった場合、類似度が高い（Ｓが−１に近い）ものから所定数（例えば３つ）の連結画素領域を標的細胞と判定してそれら位置を特定して出力するようにしてもよい。

さらに、必要に応じて、標的細胞特定手段４７が、３次候補検索工程Ｓ２０で選定された検査用画像データの連結画像領域の大きさ、及び／又は真円度が各々所定規定値内である連結画像領域を標的細胞の細胞核であると判定する処理を行ってもよい。

具体的には、標的細胞特定手段４７は、連結画素領域の大きさとして、そのＸ軸方向の幅、及びＹ軸方向の幅を判定し、両幅が大きさ判別用の所定規定値内（例えば、細胞の画素数が５２画素×５２画素の場合、２０〜４０画素の範囲内）であるものを標的細胞と判定する。この大きさ判別用の所定規定値は、検査用画像データにおいてＮＲＢＣの細胞核が取りうる大きさの範囲を、画素数に置き換えたものである。

また、標的細胞特定手段４７は、連結画素領域の真円度を以下の（８）式で算出し、この真円度が、真円度判別用の所定規定値内（例えば、０．５〜１．５の範囲内）であるものを標的細胞であると判定する。
ここで、Ｒ＝Ｌ÷π÷２
Ｌは連結画素領域の周囲長である。

標的細胞特定手段４７は、大きさ、及び／又は真円度が所定規定値内のものを、標的細胞の細胞核であると特定し、特定したものであることが分かるようにフラグ等を検索用記憶部４１に記憶させる。なお、大きさ及び真円度の両方から標的細胞の判定を行うことが好ましい。

標的細胞特定手段４７は、３次候補検索工程Ｓ２０で選定された全てのラベルについて判定し、その後、ＮＲＢＣであると特定したその位置Ｌｘ，Ｌｙや平面プレート８上の位置を細胞回収装置（図示せず）に出力する。

以上で、平面プレート８の一部の領域の標的細胞の検索が終了する。続いて撮像位置制御手段１１が、ＸＹＺステージ１１を撮像領域ずつ、又は多少撮像領域が重なり合うように、Ｘ軸方向やＹ軸方向に移動させて、上記の光学標識発現工程Ｓ１３から標的細胞特定工程Ｓ２１までの工程を繰り返すことで、１枚の平面プレート８の検索が終了する。

なお、カラー画像取得工程Ｓ１５で、ＸＹＺステージ１１をＸＹ方向に撮像領域ずつ移動させて繰り返し撮像を行い、１枚の平面プレート８の全体のカラー画像データを取得しておいてから２値化処理工程１６〜標的細胞特定工程Ｓ２１までを行ってもよい。

検索が終了した平面プレート８を、搬送機構６がストッカ５に収容し、検索前の他の平面プレート８をストッカ５からＸＹＺステージ１１にセットして、同様に検索を開始する。このようにして標的細胞検索装置１は、ストッカ５に収容された全ての平面プレート８の検索を自動的に行う。

標的細胞検索装置１は、標的細胞を特定した位置、その類似度、検査用画像データの画像、検査用画像データと同範囲で切り出したカラー画像データの画像、及びカラー画像データ全体の画像の中から選ばれる少なくとも１つを、ディスプレイ４に表示可能であることが好ましい。検査用画像データの画像やカラー画像データの画像をディスプレイ４に表示させる場合、特定したＮＲＢＣの位置に、赤丸や矢印等の指示画像を表示させることが好ましい。

また、標的細胞検索装置１は、標的細胞特定手段Ｓ２１がＮＲＢＣの細胞核であると判定した検査用画像データＫ（ｐ、ｑ）と、標的辞書の作成に用いられた複数の標的用２値化画像データＤ（ｐ、ｑ）とを合わせて主成分分析して、その固有ベクトルから得られた正規直交基底を標的辞書Ｂとして標的辞書記憶部３１に更新して記憶させる標的辞書学習手段５１（図３参照）をさらに備えてもよい。このように標的辞書Ｂを学習して更新することで、標的辞書Ｂがより正確になるため、ＮＲＢＣの検索精度を向上させることができる。

また、標的細胞検索装置１は、３次候補検索手段４６が選定しなかった検査用画像データＫ（ｐ、ｑ）、又は標的細胞特定手段がＮＲＢＣであると判定しなかった検査用画像データＫ（ｐ、ｑ）と、非標的辞書Ｃの作成に用いられた複数の非辞書用画像データとを合わせて主成分分析して、その固有ベクトルから得られた正規直交基底を非標的辞書Ｃとして非標的辞書記憶部３２に更新して記憶させる非標的辞書学習手段１０をさらに備えてもよい。このように非標的辞書Ｃを学習して更新することで、非標的辞書Ｃがより正確になるため、ＮＲＢＣの検索精度を向上させることができる。

以上で、標的細胞検索装置１を用いたＮＲＢＣの細胞検索が終了する。

標的細胞回収工程Ｓ２２では、標的細胞検索装置１から出力された標的細胞の位置に基づいて、記標的細胞を回収する。例えば、倒立顕微鏡のＸＹステージに平面プレート８をセットして、標的細胞が特定された位置Ｌｘ，Ｌｙを観察するように、ＸＹステージを移動させる。オペレータは、倒立顕微鏡を確認しつつ、標的細胞よりも幾分大きな内腔を有する細胞回収用ガラスキャピラリーの先端が標的細胞の位置Ｌｘ，Ｌｙにくるようにモーターで大まかに位置移動し圧電素子で微小な位置移動するマイクロマニピュレーターを操作して、標的細胞を回収する。標的細胞の回収は、公知の種々の方法で行うことができる。例えば、細胞回収用ガラスキャピラリーで所望の標的細胞に、生理食塩水、リンゲル液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、又はプロテインキナーゼＫのような酵素含有溶液を垂らして、暫く放置してスライドガラスに固定された標的細胞を取り出し易くしてから、同一なガラスキャピラリー又は別な細胞回収用ガラスキャピラリーで、陰圧にして標的細胞を選択的に吸い出して、標的細胞を得る。スパーテルで標的細胞を掻き出したり、掬い出したりしてもよい。

標的細胞検査工程Ｓ２４では、回収した標的細胞の細胞核内の染色体、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを解析する。そのためには高感度の分析法が必要であり、例えば、得られた細胞について、細胞核の中にある染色体やそのＲＮＡを標識する蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ法：Fluorescence in situ hybridization）、ＤＮＡ等を増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法：polymerase chain reaction）、ゲノムを通じてのコピーを開始させるためにＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼと組み合せてランダム１５−量体を用いてゲノムＤＮＡを増幅するプライマー伸長プレ増幅（ＰＥＰ法：primer extension preamplification)、全染色体を対象にしてゲノムDNAの過剰、欠失、増幅などのコピー数異常を検出する比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ法：comparative genomic hybridization）、in situ ＰＣＲ法、変性オリゴヌクレオチド起点ポリメラーゼを利用してＤＮＡ等を増幅する（ＤＯＰ−ＰＣＲ法：Degenerated Oligonucleotide Primer PCR）などの分析法が挙げられる。このような検査工程は、プレートのウェル、マイクロチューブ等で行われてもよいが、貴重な試料を無駄なく確実に検査処理するため、検出用バイオチップを用いてもよい。検出用バイオチップは、例えば流路、区画、溝、キャピラリー、ファイバー及び／又ビーズからなる反応場を有しており、必要に応じて標識試薬を注入できる経路、余分な試薬や副生成物や不要な薬液を排出できる経路を有し、反応場内で、これらの分析法を、微量で行うことができるものである。

例えば、得られた細胞について、CD71とglycophorin Aに対するモノクロナール抗体を使ったりするＦＩＳＨ法で調べることにより、染色体の異常、ＸＹ染色体数の異常、２１・１８又は１３トリソミーの異常を検査することができ、ＰＣＲ法で性別判定、個人識別、Rh(D)型を検査することができ、ＰＥＰ法により複数の遺伝子異常の診断ができる。

標的細胞検査工程Ｓ２４中、染色体、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを、染色体に特異的な遺伝子と蛍光色素とが結合した診断用蛍光プローブ、例えばセントロメアに特異的に結合する蛍光標識されたプローブを用いてハイブリダイゼーション反応させて検出して、解析してもよい。例えば、Ａｂｂｏｔｔ社製のＣＥＰシリーズ（ＣＥＰは登録商標）であるＣＥＰ ＤＮＡ ＦＩＳＨプローブ、ＣＥＰ Chromosome Enumeration DNA FISH Probes、ＣＥＰプローブキットが挙げられる。診断用プローブの標識材は、蛍光、又は磁気を用いていてもよい。

以上で、血液中の標的細胞の検査方法が終了する。

なお、図７に示すように、光学標識した濃縮血液検体をバイオチップ７０の流路７１に注入して、標的細胞検索装置１でＮＲＢＣを検索するようにしてもよい。同図では、すでに説明した構成と同様の構成については同じ符号を付して詳細な説明を省略する。

同図では、標的細胞検索装置１のＸＹＺステージ１１にバイオチップ７０が保持されている。このバイオチップ７０は、１本の流路７１を有しているものである。バイオチップ７０の流路７１の入力側には、濃縮血液検体を入れた検体用容器６１が管路を介して繋がり、さらにこの検体用容器６１には開閉制御可能な制御弁６２を介して加圧ポンプ６３が繋がっている。また、流路７１の出力側には、三方開閉制御弁６４が繋がり、三方開閉制御弁６４の一方の出力管６７（回収する流路経路）には回収用容器６５が繋がり、他方の出力管６８には、廃棄用容器６６が繋がっている。三方開閉制御弁６４は、１入力ポート、２出力ポートを有して、各出力ポートを開閉制御可能な開閉制御弁である。この場合、三方開閉制御弁６４は、出力管６７側と出力管６８側とを各々開閉制御する。なお、出力管６７、出力管６８の各々に別個の開閉制御弁を配してもよい。バイオチップ７０は、その外界から流路７１を流れるＮＲＢＣの光学観察が可能なように、透明な材質、例えば耐圧性の樹脂、具体的にはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）のようなポリエステル樹脂、アクリル樹脂、環状ポリオレフィン、シリコーン樹脂などのプラスチック樹脂で形成されている。

流路は、ＮＲＢＣが約１０μｍの大きさであるので、管路幅が１０μｍ〜２０μｍ、好ましくは１０μｍ〜１５μｍで形成されている。

制御弁６２及び三方開閉制御弁６４の出力管６８側を開放し、出力管６７側を閉じて、濃縮血液検体が流路７１に流れ込んでから各弁を閉じ、既に説明した光学標識発現工程Ｓ１３〜標的細胞特定工程Ｓ２１を行う。ＮＲＢＣを特定した場合、制御弁６２及び三方開閉制御弁６４を制御して、そのＮＲＢＣが回収用容器６５に流れるように誘導し、ＮＲＢＣ以外は廃棄用容器６６に流れるように制御する。この処理を繰り返すことで、ＮＲＢＣを回収する（標的細胞回収工程Ｓ２２）。

又は、制御弁６２及び三方開閉制御弁６４の出力管６８側を開放し、出力管６７側を閉じて、濃縮血液検体を流路７１にゆっくりと流しながら、光学標識発現工程Ｓ１３〜標的細胞特定工程Ｓ２１を繰り返し行い、ＮＲＢＣを特定した場合、そのＮＲＢＣが回収用容器６５に流れるように三方開閉制御弁６４を制御して誘導し、ＮＲＢＣ以外は廃棄用容器６６に流れるように三方開閉制御弁６４を制御する（標的細胞回収工程Ｓ２２）。流路７１は平面プレート８よりも狭いので、画像処理する画像データのサイズが小さくなるため、画像処理を高速に行えて、ＮＲＢＣを高速に特定することができる。このため、三方開閉制御弁６４を通りすぎる前にＮＲＢＣを特定でき、そのＮＲＢＣを回収することができる。

このようなバイオチップ７０を用いることで、平面プレート８に濃縮血液検体を固定したり、平面プレート８からＮＲＢＣを剥離、回収したりする手間が不要になるため、作業効率が向上し、ＮＲＢＣを迅速に回収することができる。したがって、検査効率を向上させることができる。

また、図７のバイオチップ７０を、図８に示すバイオチップ７５に換えて標的細胞の検索、回収を行うようにしてもよい。この場合、図７の三方開閉制御弁６４は不要であり、バイオチップ７５に回収用容器６５及び廃棄用容器６６を接続する。

図８に示すバイオチップ７５は、一例として、シリコーン樹脂（例えばポリジメチルシロキサン：ＰＤＭＳ）やＰＥＴやアクリル樹脂や環状ポリオレフィンのようなプラスチック樹脂やガラス、で形成されており、検査用に採血した血液を濃縮し濃縮血液検体が注入される流路７６を有している。この流路７６には、標的細胞通過フィルター７２、光学観察窓部７３、回収用分岐路７８、及び開閉制御弁７９が設けられている。なお、同図では、これら流路７６や標的細胞通過フィルター７２等の位置関係を模式的に表している。

標的細胞通過フィルター７２は、同図（ｂ）に拡大して示すように、濃縮血液検体中の検査すべき標的細胞９１が通過可能であると共に標的細胞９１よりも大きな細胞（非標的細胞）９２が通過不可である隙間８２を有している。例えば標的細胞９１は、ＮＲＢＣのような赤血球であり、非標的細胞９２は、赤血球より大きな白血球である。非標的細胞９２は、隙間８２のすぐ上流側で流路７６から分岐する廃棄路７７を通ってバイオチップ７５の外部に排出される。なお、非標的細胞９２が少ない場合、バイオチップ７５内に非標的細胞９２の貯留槽を形成して、標的細胞通過フィルター７２で除去される非標的細胞９２を外部に廃棄せず貯留槽内に収容する構造としてもよい。

このような標的細胞通過フィルター７２を、流路７６に沿って複数配してもよい。複数の標的細胞通過フィルター７２を配することで、標的細胞９１と非標的細胞９２との分離精度が向上するため、標的細胞９１の検索が一層高速になる。

この標的細胞通過フィルター７２の下流に、光学観察窓部７３が配されている。その拡大平面図を同図（ｃ）に、その拡大側面断面図を同図（ｄ）に示す。光学観察窓部７３は、バイオチップ７５の外界から流路７６を流れる標的細胞９１の光学観察が可能なように、透明な材質で形成されている。標的細胞検索装置１の撮像カメラ１５がこの光学観察窓部７３を撮像するように、ＸＹＺステージ１１を位置制御する。

光学観察窓部７３の流路７６は、ＮＲＢＣが重なり合うことなく流路７６に沿って１列で通過可能な流路幅で形成されていることが好ましい。具体的には、ＮＲＢＣは、略円盤形状であるので、その平たい面を光学観察窓部７３から観察できるように、円盤が１列で面の向きも整列して通過可能な断面が長方形状の穴で流路７６を形成することが好ましい。例えば、光学観察窓部７３に平行な流路７６の幅を、中央で窪んだ円盤状のＮＲＢＣ外形の円盤（直径約１０μｍ）が通る程度の幅Ｌ１（例えば１０μｍ〜１５μｍ）で形成し、光学観察窓部７３に対して垂直な流路７６の幅を、円盤（厚み約３μｍ）が通る程度の幅Ｌ２（例えば３μｍ〜４μｍ）で形成する。このように流路７６を形成すると、ＮＲＢＣが重なり合うことなく、さらにその平たい面を確実に観察できるので、脱核した通常の赤血球とＮＲＢＣとを精度よく区別でき、ＮＲＢＣの検索効率を一層向上することができる。同図では、標的細胞通過フィルター７２を過ぎたところから、このような狭い流路幅で流路７６が形成されている例を図示している。

この光学観測用窓部７３よりも下流では、流路７６からＮＲＢＣを回収するための回収用分岐路７８（回収する流路経路）が分岐している。この回収用分岐路７８の分岐部分には、分岐制御が可能な開閉制御弁７９が配されている。この開閉制御弁７９は、既に説明した開閉制御弁６４と同様の機能のものであり、回収用分岐路７８、流路７６を各々開閉制御可能なものである。開閉制御弁７９は、制御用電極８５に制御信号を入力することで、開閉制御が可能になっている。

この開閉制御弁７９は、熱的に制御可能な熱制御弁、電気的に制御可能な電気制御弁、磁気的に制御可能な磁気制御弁、又は空圧で制御可能な空圧式制御弁であることが好ましい。開閉制御弁７９が熱制御弁の場合、例えば、熱膨張率が異なる２枚の金属板を重ね合わせたバイメタル、形状記憶合金、又はポリ-Ｎ-イソプロピルアミドなどの熱応答性ポリマーで弁が形成されていて、熱を加えることで弁が作動する。例えば熱制御弁にレーザー光を照射することで発熱させ、この熱で熱制御弁を作動させる。開閉制御弁７９が電気制御弁の場合、例えば、電磁コイルに通電することで作動する電磁制御弁や圧電素子で弁が形成されている。電気制御弁に電気的に繋がる金属製の端子をバイオチップ７５の表面に形成しておき、この端子に制御電気信号を加えて電気制御弁を作動させる。開閉制御弁７９が磁気制御弁の場合、例えば、磁歪素子で弁が形成されている。磁気制御弁に磁石を近づけるなどして磁界を印加することで、磁気制御弁を作動させる。開閉制御弁７９が空圧式制御弁の場合、バイオチップ内にＰＤＭＳなどの弾性素材で作られたエアバルブが形成されておりエアの加圧・減圧により空圧式制御弁を作動させる。熱制御弁や磁気制御弁の場合、バイオチップ７５に非接触で弁を作動させることができるので、接触不良を考慮する必要が無く、高い信頼性で作動させることができるため好ましい。

回収用分岐路７８には、図７の回収容器６５を繋げ、流路７６の出力には同図の廃棄用容器６６を繋げる。

開閉制御弁７９を作動させるための制御機構（例えば熱制御弁の場合レーザー光源及びその制御手段）は、図示しないが標的細胞検索装置１が有している。バイオチップ７５内に開閉制御弁７９を有し、この制御を標的細胞検索装置１が行うことで、特定したＮＲＢＣを確実に回収することができる。また、外部に三方開閉制御弁６４を配する必要が無く、複数の検体を検査する場合、三方開閉制御弁６４を検体ごとに交換する手間がかからず、迅速に多数の検体からＮＲＢＣを回収することができる。

なお、図８中に示すように、光学観測窓部７３よりも上流の流路７６に、ＮＲＢＣを光学標識する光学標識用薬液を外界から注入するための薬液注入路８０を合流させてもよい。この場合、流路７６に光学標識していない濃縮血液検体を注入し、薬液注入路８０から光学標識薬液を注入することで、流路７６内でＮＲＢＣを光学標識することができる（検体標識工程Ｓ１２）。染色後の細胞画像例を図１０に示す。図１０（ａ）は標的細胞であるＮＲＢＣの典型的な画像である。なお、図１０（ｂ）は非標的細胞の一例である通常の赤血球（ＲＢＣ）の典型的な画像であり、図１０（ｃ）は別な非標的細胞の一例である白血球（ＷＢＣ）の典型的な画像である。

また、開閉制御弁７９に換えて、回収用分岐路７８、流路７６の分岐箇所に三方開閉制御弁を配してもよいし、回収用分岐路７８及び流路７６のいずれの流路に流れるかを制御可能な方向切換弁を配してもよい。

また、開閉制御弁７９に換えて、開閉操作可能な手動式の弁を配してもよい。この場合、ＮＲＢＣが特定されたときに、例えば、撮像カメラ１５でＮＲＢＣを追跡して撮像して、その画像を見ながらオペレータが手動で弁を操作してＮＲＢＣを回収容器６５に回収する（標的細胞回収工程Ｓ２２）。

バイオチップ７５は、一例として、図９に側面図で示すように、２枚の板材であるベース板材８６とカバー板材８７とを貼り合わせて形成する。ベース板材８６は、流路７６、標的細胞通過フィルター７２、廃棄路７７、及び回収用分岐路７８となる溝や、開閉制御弁７９を嵌め込む溝を有し、一体成型で形成されている。このベース板材８６は透明な樹脂やガラスでできており、硬質樹脂を用いる場合には金型やＳｉ型を用いたナノインプリンティングや転写成型、切削加工、金型を用いたインジェクション成型などにより製作することができる。ＰＤＭＳやエラストマーなどの軟質樹脂を用いる場合には金型やＳｉ型を用いたナノインプリンティングや転写成型、金型を用いたインジェクション成型などにより製作することができる。ガラスを用いる場合には、ドライエッチング、ウエットエッチングなどにより製作することができる。電気配線が必要な場合にはＣｒ、Ａｕなどの配線を真空蒸着やスパッタにより製作する。このベース板材８６に開閉制御弁７９を組み込んでから、透明な樹脂平板であるカバー板材８７を接着や熱接合、物理吸着により接合しバイオチップ７５が完成する。光学観測窓部７３には、その位置を示すような例えば枠状の指示表示を、印刷、彫り込み等で付してもよい。また、必要に応じてカバー板材８６に流路を製作したり、３層以上の重ね合わせでバイオチップを製作したりすることも可能である。

バイオチップ７５で回収された標的細胞（図１のＳ２３）に対して、前記の標的細胞検査工程Ｓ２４のような処理が施される。

なお、標的細胞検索装置１において、焦点制御用のレーザー光源１２が、撮像用光源１４として兼用されていてもよい。具体的には、図４（ａ）や図７の撮像用光源１４を配さずに、レーザー光源１２から、焦点合わせ用の光Ｌｅとして光学標識発現光Ｌ_Ｔを照射させる。このようにすると、簡便な構成になる。レーザー光Ｌｅの照射範囲（照射エリア）は狭いので、この構成は、撮像範囲が狭い図７の流路７１や図８の流路７６を撮像するときに特に好ましく採用することができる。

本発明を適用する血液中の細胞の検査方法を行い、母体血中の胎児由来有核赤血球（ＮＲＢＣ）によって出生前診断に利用した例を、以下に示す。

（実施例１）
胎児由来細胞の検査方法は、〔１〕母体血液の密度勾配遠心法によるＮＲＢＣの濃縮により濃縮血液検体を取得する検体取得工程、〔２〕濃縮血液検体を平面プレート上で塗抹して膜化し血液塗抹標本を作製し、ギムザ染色して光学標識する検体標識工程、〔３〕光学標識された検体を発現させそのカラー画像を撮像する光学標識発現工程、焦点制御工程、カラー画像取得工程、〔４〕カラー画像を２値化してノイズ除去する２値化処理工程、収縮膨張工程、〔５〕ＮＲＢＣの位置を検索し特定する１次候補検索工程、２次候補検索工程、３次候補検索工程、標的細胞特定工程、〔６〕その位置情報に基づいてプレート上のＮＲＢＣを捕捉して回収する標的細胞回収工程、〔７〕回収した標的細胞の細胞核内の遺伝子情報を、ＦＩＳＨ法のような染色体検査法である生物学的手法によって解析する標的細胞検査工程とにより、行われる。

以下に、各工程〔１〕〜〔７〕の基本的な操作手順を詳細に説明する。

〔１〕検体取得工程
ポリビニルピロリドン被覆シリカゲル微細粉末の原液（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製：パーコール）を生理食塩水（０．１５ＭのＮａＣｌ水溶液：０．９％ＮａＣｌ水溶液）で希釈し、比重１．０８５ｇ／ｍｌと１．０７５ｇ／ｍｌとのパーコール希釈液を調製した。

比重１．０８５ｇ／ｍｌのパーコール希釈液の５ｍｌを１５ｍｌ遠沈管に注入した後、その遠沈管に、比重１．０７５ｇ／ｍｌパーコール希釈液の５ｍｌを、ゆっくりと注入し、積層させた。妊婦からヘパリン採血した母体血液を、生理食塩水で２倍に希釈した。希釈した母体血液５ｍｌを、先の１５ｍｌ遠沈管にゆっくりと注入し積層させた。なお、さらに多めの母体血液を用いる場合は遠沈管数を増やしてもよく５０ｍｌ遠沈管を用いてもよい。

この遠沈管を、３０分間遠心した。下から順に、赤血球層、比重１．０８５ｇ／ｍｌのパーコール希釈液層、ＮＲＢＣ及び白血球含有層、比重１．０７５ｇ／ｍｌパーコール希釈液、リンパ球層、血漿層に、分離した。血漿層を、ディスポーザブルピペットで除去した。次いで、リンパ球層、比重１．０７５ｇ／ｍｌパーコール希釈液層も同様に、除去した。

ＮＲＢＣ及び白血球が存在する目的層が、表層に現れるので、それを注意深くピペットで採取した。

採取した目的層の回収液を２５ｍｌ遠沈管に入れ、そこへ生理食塩水又はｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、１０分間遠心し、上澄みを除去する操作を、３回繰り返すことによって、洗浄を行った。

そこへ、ＰＢＳを加えて１０μｌに希釈してＮＲＢＣ含有細胞懸濁液を得た。

〔２〕検体標識工程
メチレンブルー、エオシン、アズールIIを含むギムザ液原液を、ＰＢＳで希釈して１％ギムザ液希釈溶液にした。

前記の検体取得工程で得たＮＲＢＣ含有細胞懸濁液２μｌをスライドガラス上に滴下した後、カバーガラスを用いてその懸濁液をスライドガラス上で均一に塗抹し膜にした。必要に応じその塗抹膜に冷風を当てて、塗抹膜を乾燥させた。その乾燥した塗抹膜ごとスライドガラスを、パッド中でメタノールに１０分間漬け、塗抹膜を固定化した。必要に応じ冷風を当てながら塗抹膜を乾燥させた。

次いで、その乾燥した塗抹膜ごとスライドガラスを、別なパッド中で２％ギムザ液希釈溶液に、１０分間漬け、染色した。その染色した塗抹膜ごとスライドガラスを、別なパッド中で、超純水で２回洗浄した。必要に応じ冷風を当てながら塗抹膜を乾燥させて、検体標識した血液塗抹サンプルを作製した。

実施形態で説明した標的細胞検索装置を試作した。標的辞書や非標的辞書を予め作成した。標的辞書の作成に使用した標的辞書用画像データの１つを拡大して図１５（ａ）に示す。また、非標的辞書の作成に使用した非標的辞書用画像データの１つを拡大して図１５（ｂ）に示す。これらの画像は５２画素×５２画素の大きさである。
〔３〕光学標識発現工程、焦点制御工程、カラー画像取得工程
試作した標的細胞検索装置のストッカに、前記の検体標識工程で作成したスライドガラスをセットした。標的細胞検索装置１を作動させると、標的細胞検索装置１は、このスライドガラスをＸＹＺステージに搬送し、血液塗抹サンプルに撮像用光源を照射すると共に、焦点合わせしてカラー画像を自動で撮像した。撮像したカラー画像の一例を図１６（ａ）に示す。このカラー画像は、２４４８画素×２０５０画素の大きさである。

〔４〕２値化処理工程、収縮膨張工程
続いて、標的細胞検索装置は、カラー画像データを２値化処理し、収縮膨張処理した。図１６（ａ）のカラー画像を２値化処理した２値化画像を図１６（ｂ）に示し、それを収縮膨張処理した２値化画像を図１６（ｃ）に示す。各画像中に、後述する標的細胞特定工程で特定されたＮＲＢＣの位置を、矢印で示す。

〔５〕１次候補検索工程、２次候補検索工程、３次候補検索工程、標的細胞特定工程
次いで、標的細胞検索装置は、１次検索工程〜標的細胞特定工程を行い、図１６（ｃ）の画像中から自動的に標的細胞を１個特定した。標的細胞特定工程では、３次候補検索工程で選定された検査用画像データの連結画像領域の大きさが２０〜４０画素の範囲内、及びは真円度が０．５〜１．５の範囲内である連結画像領域を標的細胞の細胞核であると判定した。特定したＮＲＢＣの画像を、オペレータが目視で、ＮＲＢＣであることを確認した。

図１６に示したＮＲＢＣは、３次候補検索工程において、
標的辞書Ｂとの距離Ｇｂ＝４４．００４８４７
非標的辞書Ｃとの距離Ｇｃ＝２９．５１２５０６
評価関数Ｓ＝−０．１９７１２８１６６
であり、標的細胞特定工程において、
Ｘ軸方向の幅（最大値）＝２５画素
Ｙ軸方向の幅（最大値）＝２４画素
面積＝４６３
周囲長Ｌ＝８２
半径Ｒ＝周囲長÷π÷２＝１３．０５０７０５
真円度＝０．８６５２９３
であった。

〔６〕標的細胞回収工程
標的細胞検索装置で見つけたＮＲＢＣが存在する血液塗末サンプルをマイクロマニピュレーター付き倒立顕微鏡のステージ上にセットした。標的細胞特定工程で特定された位置にステージを動かしＮＲＢＣの存在する位置に、顕微鏡に装着されたメジャーを見ながら手動で合わせた。

次いで、マイクロマニピュレーターを用いつつ、細胞回収用ガラスキャピラリーに１００μｇ/ｍｌのプロテイナーゼＫ溶液（和光純薬工業株式会社製 １６４−１４００４をＴＥ緩衝液に溶解したもの）を吸引し、回収用キャピラリーからプロテイナーゼＫ溶液を、標的のＮＲＢＣに向け吐出してから室温で５分間放置した。暫くして標的のＮＲＢＣ近傍がプロテイナーゼＫ溶液により剥離しやすくなったら、標的のＮＲＢＣを細胞剥離用ガラスキャピラリーでつついて剥がし、細胞回収用ガラスキャピラリーでＮＲＢＣを吸引し、捕捉して回収した。回収したＮＲＢＣを、６００μｌマイクロチューブに入れ、ＰＢＳで２回洗浄し、最終的に２μｌ程度の容量に調整し、回収したＮＲＢＣ懸濁液を得た。なお、マイクロマニピュレーターで回収したＮＲＢＣはマイクロチューブに回収するのではなく、直接染色体検査用スライドガラス上に移してカルノア固定することも可能である。

〔７〕標的細胞検査工程（染色体検査：ＦＩＳＨ法）
先ず、カルノア液として、エタノール：酢酸＝３：１の液を、調製した。エージング溶液として、２×ＳＳＣ（標準クエン酸添加生理食塩水）／０．１％ＮＰ−４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ−４０）溶液を、調製した。エタノール洗浄液として、７０％エタノール水溶液、８５％エタノール水溶液、１００％エタノールを、調製した。変性溶液として、７０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ溶液を、調製した。ホルムアミド洗浄液として、５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ溶液を、調製した。

次に、ハイブリダイゼーションバッファー（Ａｂｂｏｔｔ製、ＦＩＳＨプローブに添付されているもの）７μｌと、蛍光物質で標識したオリゴヌクレオチドプローブであるＦＩＳＨプローブ（Ａｂｂｏｔｔ製 ３２−１９０００２、３２−１９０００１、３２−１９２０１８、３２−１３００１８、３２−１３１０１８、３２−１３２０２３、３２−１３１０２４など）１μｌと、超純水２μｌとをマイクロチューブに調合した。調合比率は、使用するＦＩＳＨプローブの数により異なる。上記の例は、１種類のＦＩＳＨプローブを使用する場合の例これを、攪拌後数秒間、遠心した後、７３℃のブロックヒーターで５分間加熱してプローブを変性させた。このプローブ液は、使用直前まで４５℃に保温しておいた。

回収したＮＲＢＣ懸濁液に、カルノア液５μｌを加え、１５００ｒｐｍで５分間遠心した後、上澄みを除去し、さらにカルノア液２μｌを加えた。以上の遠心、上澄み除去、カルノア液２μｌ添加という操作を３回繰り返す。

このＮＲＢＣを含むカルノア液を、細胞固定化コートスライドガラスであるフロンティア（松波硝子工業株式会社製 ＦＲＣ−０５）の中央に滴下し、それを、加湿したタッパーに入れて６７℃で１０分間放置した後、冷風で乾燥し、ＮＲＢＣ固定化スライドを得た。

染色パッド中で、エージング溶液（２×ＳＳＣ／０．１％ＮＰ−４０）を３７℃に加熱し、そこへ、ＮＲＢＣ固定化スライドを３０分間浸漬した。次いで、ＮＲＢＣ固定化スライドを、別な染色パッド中、エタノール洗浄液である７０％エタノール水溶液、８５％エタノール水溶液、１００％エタノールの順で、１分間ずつ浸漬して洗浄・脱水を行った後、冷風で乾燥した。

サンプル細胞の状態により、必要に応じて、硫酸リチウムドデシル（Lithium Dodecyl Sulfate：ＬＩＳ)溶液処理とペプシン溶液処理を行うとＦＩＳＨ成功率が向上する。

ＮＲＢＣ固定化スライドを染色パッド中で室温のＬＩＳ溶液（１０〜１００ｍＭのＬＩＳ／０．１ＭのＴｒｉｓ(トリス ヒドロキシメチル アミノメタン)、ｐＨ７．４）に３０分間浸漬した。次いで、ＮＲＢＣ固定化スライドを、別な染色パッド中、２×ＳＳＣ溶液に室温で１分間浸漬する洗浄を３回行う。次に染色パッド中で３７℃に加熱したペプシン溶液（１０〜１００μｇ／ｍｌのペプシン／０．０１ＭのＨＣｌ、ｐＨ２）に１０分間浸漬した。次いで別の染色パッド中の室温の酵素反応停止溶液（５０ｍＭのＭｇＣｌ_２／ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．４）に５分間、別の染色パッド中の室温ホルマリン再固定液（１％ホルムアルデヒド／５０ｍＭのＭｇＣｌ_２／ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．４）に１０分間浸漬した。さらに室温のＰＢＳに５分間浸漬し、エタノール洗浄液である７０％エタノール水溶液、８５％エタノール水溶液、１００％エタノールの順で、１分間ずつ浸漬して洗浄・脱水を行った後、冷風で乾燥した。

染色パッド中で、変性溶液（７０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ溶液）を７３℃に加熱し、そこへ、ＮＲＢＣ固定化スライドを５分間浸漬した。次いで、ＮＲＢＣ固定化スライドを、別な染色パッド中、エタノール洗浄液である７０％エタノール水溶液、８５％エタノール水溶液、１００％エタノールの順で、１分間ずつ浸漬して洗浄・脱水を行った後、冷風で乾燥した。

ＮＲＢＣ固定化スライドを、ヒーターで４５℃に加熱した後、４５℃で保存しておいたプローブ液１０μｌを、ＮＲＢＣ固定化スライドに滴下し、カバーガラスを被せ、気泡を追い出した後、ペーパーボンド（コクヨ株式会社製）でシールする。もしくは、ＮＲＢＣ固定化スライド上の細胞固定化位置にハイブリダイゼーション用マスクシール（エスシーワールド株式会社製）を貼り、ヒーターで４５℃に加熱した後、４５℃で保存しておいたプローブ液２μｌを、ＮＲＢＣ固定化スライド上でハイブリダイゼーション用マスクシールで土手の如く形作られたウェルに滴下し、気泡が入らないように封印用シールを貼った。

このプローブ液を滴下したＮＲＢＣ固定化スライドを、３７℃に調整したインキュベーター中の加湿したタッパーに入れ、４〜１８時間ハイブリダイゼーションを行った。

カバーガラスあるいはハイブリダイゼーション用マスクシールを外し、ハイブリダイゼーションの終了したＮＲＢＣ固定化スライドを、室温にて２×ＳＳＣ溶液で洗浄した。

このＮＲＢＣ固定化スライドを、染色パッド中で室温の２×ＳＳＣ／０．３％ＮＰ−４０溶液に５分間浸けて洗浄し、別の染色パッド中で７３℃の２×ＳＳＣ／０．３％ＮＰ−４０溶液に２分間浸けて洗浄し、次いで別な染色パッド中で室温にて２×ＳＳＣに１分間浸けて洗浄した。

このＮＲＢＣ固定化スライドに、２．３％ＤＡＢＣＯ(1,4-diazabicyclo[2,2,2]octan、和光純薬工業株式会社製；049-25712)を含む１５０μg/mlのＤＡＰＩ（4’,6-diamidino-2-phenylindole、株式会社同仁化学研究所製；340-07971）溶液もしくは蛍光退色防止剤入りＤＡＰＩ溶液（ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ製；SlowFade(登録商標) Gold Antifade Reagent with DAPI S36938 など）１０μｌを滴下し、カバーガラスを被せ、カバーガラスのずれやＤＡＰＩ溶液の乾燥を防ぐため、無蛍光かつ無色のマニキュアでカバーガラスをシールした。

蛍光顕微鏡で適切なフィルターを用いて、このＮＲＢＣ固定化スライドを、観察し、画像撮像を行った。このＮＲＢＣ固定化スライド上のＮＲＢＣの核は、蛍光標識したＦＩＳＨプローブとのハイブリダイゼーションにより、染色体数に応じた数の蛍光のスポットが観察される状態となっていた。図１１に正常細胞と２１染色体トリソミー細胞の画像例を示す。図１１（ａ）は正常細胞のＦＩＳＨ後の蛍光画像の顕微鏡写真であり、図１１（ｂ）は２１染色体トリソミー細胞のＦＩＳＨ後の蛍光画像の顕微鏡写真であり、夫々ＸはＸ染色体、ＹはＹ染色体である。

撮像した画像を用いて蛍光スポット数による染色体数に関するデータ解析を行ったところ、染色体数異常による先天性異常の判定が可能であった。

（実施例２）
必要に応じて染色体検査（ＦＩＳＨ）後の核を回収してＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子検査を行うことも可能である。ＤＮＡマイクロアレイを用いることにより、１つの細胞で多数の疾病に関する検査を行うことができる。その基本的な操作手順を詳細に説明する。

実施例１の〔１〕〜〔７〕のようにした染色体検査（ＦＩＳＨ）後のＮＲＢＣ固定化スライドを用いた。

〔７’〕標的細胞検査工程（遺伝子検査：ＤＮＡマイクロアレイ法）
ＦＩＳＨ後のＮＲＢＣ固定化スライドから、倒立顕微鏡に付いているマイクロマニピュレーターを用いて、ＮＲＢＣ若しくはＮＲＢＣの核を、マイクロチューブに回収した。

ＮＲＢＣを回収したマイクロチューブに、ランダムプライマー（オペロンバイオテクノロジー株式会社製 ＳＰ１８０−１）とＰＣＲ酵素（タカラバイオ株式会社製 ＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＲＲ００１Ａ）、バッファー（ＰＣＲ酵素に添付されているもの）、ｄＮＴＰＰｍｉｘ等（ＰＣＲ酵素に添付されているもの）を加えＰＣＲ増幅反応を行った。

ＰＣＲ反応後の溶液からＰＣＲ産物精製キット（株式会社キアゲン製 28104）を用いて増幅した遺伝子の精製を行ない、UULISYS Nucleic Acid Labeling Kits、Alexa Flour 546（Molecular Probe製 U-21652）を用いてＰＣＲ反応で増幅した遺伝子の蛍光ラベル化を行ない、Microcon YM-30（Millipore製 42409）で精製を行い、蛍光ラベル化したＰＣＲ産物を得た。その他の蛍光ラベル化したＰＣＲ産物を得る方法として、ＰＣＲ反応時にCy3-dUTP（GE Healthcare製 PA55021）を反応溶液中に添加してＰＣＲ反応時に直接ラベル化を行い、ＰＣＲ産物精製キットで精製を行うという方法もある。

この蛍光ラベル化したＰＣＲ産物と２×ハイブリダイゼーションバッファー（12 × SSC、0.4％ SDS、10 × Denhardt’s溶液、0.2 mg/ml denatured salmon sperm DNA）とを等量混合し、９４℃で１分間熱変性を行った後、氷上で急冷した。

それを、先天性異常に関連するＤＮＡの部分配列を配置し固定化したＤＮＡチップとも呼ばれるＤＮＡマイクロアレイ（タカラバイオ株式会社製 ＤＮＡチップ用スライドガラス Takara-Hubble Slide Glass TX720や、住友ベークライト株式会社製 オリゴＤＮＡ用固定化基板 BS-11607を用いてエスシーワールド株式会社にてプローブＤＮＡの固定化を行ったもの）上に１０μｌ滴下し、カバーガラスを被せた。もしくは、ＤＮＡマイクロアレイ上にハイブリダイゼーション用マスクシール（エスシーワールド株式会社製）を貼り、ウェル内にハイブリダイゼーション溶液を２μl滴下し、シールをした。

ハイブリダイゼーション温度（４５〜６０℃）に設定したインキュベーター内の加湿したタッパーに、このＤＮＡマイクロアレイを入れ、４〜１８時間ハイブリダイゼーションを行った。

そのＤＮＡマイクロアレイからカバーガラスやシールを外し、室温の2 × SSC溶液と65℃の2 × SSC/0.2％ SDS溶液と室温の0.05 × SSC溶液の３種の洗浄液に、順番に５分間ずつ浸けて洗浄を行った。

ＤＮＡチップスキャナーもしくは蛍光顕微鏡にて、蛍光観察し、撮像を行った。ハイブリダイゼーション液中に、ＤＮＡマイクロアレイ上にスポットしたＤＮＡに対応するＤＮＡが存在した場合には、その箇所でＤＮＡのハイブリダイゼーション反応が起こるため、ハイブリダイゼーション液中ＤＮＡにラベルした蛍光が観察される。

撮像した画像を用いてデータ解析を行ったところ、先天性異常に関係する遺伝子の配列の異常があった場合には、関連するプローブをスポットした箇所で蛍光が観察された。

なお、遺伝子検査の手法によってはＰＣＲ増幅時にCy3-dUTP（GE Healthcare社製 PA55021）などの蛍光標識した核酸を用いてＰＣＲ反応時に直接ラベル化を行い、ＰＣＲ産物精製キットで精製を行うことにより、ＰＣＲ後の蛍光ラベル化操作が必要ない場合がある。

（実施例３）
（３−１）バイオチップ上でのＦＩＳＨによる染色体検査

パーコール法により得られた濃縮血液検体に０．１５Ｍ ＫＣｌ低膨張液を加え、室温で、１０分間置き核の無い赤血球の破壊を行った（全ての無核赤血球が破壊されず残るものもあった）。次に１５００ｒｐｍで５分間遠心を行い上澄みを除去した。さらに、ＰＢＳを添加し遠心、上澄み除去という操作を３回繰り返し無核赤血球量を削減した濃縮血液検体とした。

この無核赤血球量を削減した濃縮血液検体を用いたこと以外は、実施例１の〔２〕〜〔６〕と同様にして、標的細胞を回収し、ＮＲＢＣ懸濁液を得た。それにＰＢＳを加え、白血球除去フィルターを通す、若しくはＣＤ４５標識磁気ビーズを用いて白血球を除去した濃縮血液検体を図１２に示すバイオチップ反応検出装置上のバイオチップへ注入した。同図では、液流路１０１を実線で示し、各液流路１０１の途中に配置した開閉制御弁１０２の制御用パターン配線を破線で示している。同図に示すように、バイオチップ反応検出装置は、細胞固定化フィルター１０４を内蔵するＦＩＳＨ用チャンバー１０３、ＰＣＲチャンバー１０５、及びＤＮＡマイクロアレイチャンバー（遺伝子検査用チャンバー）１０６を有している。

バイオチップ反応検出装置に調合した各反応液をセットした（各溶液の組成・調合等の詳細は前述したＦＩＳＨ、ＤＮＡマイクロアレイと同様である）。

白血球除去フィルターを通過させた濃縮血液検体液５〜１０μｌ、もしくは血液塗抹サンプルスライドから回収したＮＲＢＣ懸濁液５μｌをバイオチップ内ＦＩＳＨ用チャンバー１０３に送液し、細胞固定化フィルター１０４上に細胞を固定化させた。

エージング溶液５μｌ（２×ＳＳＣ／０．１％ＮＰ−４０）をバイオチップ内ＦＩＳＨ用チャンバー１０３に送液し装置で３７℃にバイオチップを加熱し、３０分間置いた。次いで、室温で７０％エタノール水溶液１０μｌ、８５％エタノール水溶液１０μｌ、１００％エタノール１０μｌの順でゆっくり送液して洗浄を行い、ＦＩＳＨ用チャンバー１０３にエアを送り風乾させた。

変性溶液（７０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ溶液）５μｌ（２×ＳＳＣ／０．１％ＮＰ−４０）をバイオチップ内ＦＩＳＨ用チャンバー１０３に送液し、装置で７３℃にバイオチップを加熱し、５分間置く。次いで、装置でバイオチップを４℃に冷却をしてから、４℃に冷却した７０％エタノール水溶液１０μｌで洗浄した。次に装置を室温に戻し８５％エタノール水溶液１０μｌ、１００％エタノール１０μｌの順でゆっくり送液して洗浄を行い、ＦＩＳＨ用チャンバー１０３にエアを送り風乾させた。

調整済みのハイブリダイゼーション用プローブ液２μｌを流路チップのＦＩＳＨ用チャンバー１０３に入れ、装置で７３℃にバイオチップを加熱し、５分間加熱変性を行なった後、３７℃で４〜１６時間置き、ハイブリダイゼーション反応をさせた（必要に応じ振動を与えてハイブリダイゼーション反応を促進させた）。

室温で２×ＳＳＣ／０．３％ＮＰ−４０ １０μｌをＦＩＳＨ用チャンバー１０３に流し、５分間置いた。

２×ＳＳＣ／０．３％ＮＰ−４０ １０μｌをＦＩＳＨ用チャンバー１０３に流し、装置で７３℃にバイオチップを加熱して２分間置いた。

室温で２×ＳＳＣ ２０μｌをＦＩＳＨ用チャンバー１０３に流し洗浄した。

２．３％ ＤＡＢＣＯを含む対比色染色液１５０μｇ／ｍｌ ＤＡＰＩ ２μｌをＦＩＳＨ用チャンバー１０３に入れた。

装置に搭載された適切なフィルターを用いて、このチャンバー内固定化細胞を、観察し、画像撮像を行った。

撮像した画像の細胞形状から、ＮＲＢＣの判別を行い、ＮＲＢＣのＦＩＳＨの結果より、染色体数異常による先天性異常についての判定を行った。正常細胞観察結果例を図１３に示す。図１３（ａ）は標的細胞であるＮＲＢＣの顕微鏡写真である。図１３（ｂ）はＦＩＳＨ後における標的細胞であるＮＲＢＣの顕微鏡写真であり、２１は２１染色体であり、ＸはＸ染色体、ＹはＹ染色体である。図１３から明らかな通り、評価した標的ＮＲＢＣには染色体数異常は見られず正常であることが分かった。

（３−２）バイオチップ上でのＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子検査
染色体検査後のバイオチップのＦＩＳＨチャンバー１０３内ＮＲＢＣから直接、もしくは別途回収したＮＲＢＣからバイオチップ内で遺伝子検査を行った。染色体検査後のバイオチップ内ＦＩＳＨチャンバー１０３内ＮＲＢＣを用いる場合には、ＦＩＳＨチャンバー１０３内に低張液（７５ｍＭ ＫＣｌ）５μｌ、室温で５分間置く。次に、細胞破砕液（１００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ／０．０１ Ｍ ＥＤＴＡ／０．５％ ＳＤＳ／ＴＥ緩衝液）５μｌを注入し、装置で３７℃に加熱して１０分間置き細胞を破砕した。

バイオチップのＦＩＳＨチャンバー１０３から細胞破砕液をＰＣＲ反応用チャンバー１０５へ移動させ、ＰＣＲミックス液（プライマー／ＰＣＲ酵素／ＰＣＲバッファー／Ｃｙ３−ｄＵＴＰ／ｄＮＴＰｍｉｘ）５μｌを加え、装置でバイオチップの温度をコントロール（９４℃１分→３７℃２分→７２℃１分というサイクルを繰り返す）してＰＣＲ反応を行った。

ＰＣＲ反応後の反応液を検査対象のプローブＤＮＡを固定化したＤＮＡマイクロアレイを内蔵した遺伝子検査用チャンバー１０６へ送液し、２×ハイブリダイゼーションバッファー２μｌを加え、装置で９４℃にバイオチップを加熱し、２分間加熱変性を行なった後、３７℃まで急冷させ、３７℃で４〜１６時間置き、ハイブリダイゼーション反応をさせた（必要に応じ振動を与えてハイブリダイゼーション反応を促進させた）。

ハイブリダイゼーション反応終了後、遺伝子検査用チャンバー１０６を、室温の２×ＳＳＣ １０μｌで洗浄し、次に２×ＳＳＣ／０．２％ ＳＤＳ溶液１０μｌを注入して装置で６５℃に加熱して５分間置いた。次に、室温の０．０５×ＳＳＣ ２０μｌで洗浄を行った。

装置に搭載された適切なフィルターを用いて、遺伝子検査用チャンバー１０６のＤＮＡマイクロアレイを蛍光観察し、画像撮像を行った。

ＤＮＡマイクロアレイの配置を、表１に示す。表１中、ポジティブコントロールとして各濃度のヒトの遺伝子配列とマッチングしない３０塩基の合成オリゴＤＮＡ（特注品）を用い、検査用プローブとして株式会社ＧＳＰ研究所製のＸ，Ｙ，１３，１８，２１の各染色体のセントロメア近傍ＦＩＳＨプローブを基にＤＮＡマイクロアレイ用プローブとしたもの（濃度10μＭ：特注品）である。１３トリソミーは所謂パトー症候群、１８トリソミーは所謂エドワード症候群、２１トリソミーは所謂ダウン症候群の各障害の原因となる染色体異常を検査するものである。

撮像した画像の蛍光箇所と蛍光値から、遺伝子異常による先天性異常についての判定を行った。正常細胞観察結果と２１トリソミー観察結果を示す表１と２及び図１４にから明らかな通り、染色体数が異常な場合は検出される蛍光値に違いが現れ、トリソミーの場合には正常の場合と比較して蛍光値が約1.5倍に明るく観察されることが分かった。

このように、２１トリソミー細胞では、２１番染色体プローブの蛍光値が通常細胞より約１．５倍高く染色体数異常の判定が可能であった。このように染色体数の異常の判定では、蛍光数値の大小の比較を定量的行い、遺伝子異常の判定ではプローブとのハイブリダイゼーション結果から、検知すべき所期の染色体とのハイブリダイゼーションが行われたかどうか定性的に行い、診断に用いられることが示された。

本発明の血液中の標的細胞の検査方法は、出生前診断を行うために、採血した母体血液を用いて、胎児由来細胞のような特定の標的細胞を検査して、非侵襲で安全に胎児の出生前診断するのに有用である。また乳幼児乃至成人の血液中に存在する異常な標的細胞を検査して診断や治療を行うのに有用である。本発明の標的細胞検索装置やそれに装着されるバイオチップは、この血液中の標的細胞の検査方法を正確かつ迅速に行うのに使用される。

また、第三の目的のためのバイオチップは、検査用に採血した血液とそれを濃縮した血液との何れかの血液検体が注入される流路を有するバイオチップであって、
前記流路は、前記血液検体中の検査すべき光学標識された標的細胞が通過可能であると共に前記標的細胞よりも大きな細胞が通過不可である隙間を有する標的細胞通過フィルターと、この標的細胞通過フィルターよりも下流に配されて前記標的細胞を前記バイオチップの外界から光学観察可能な光学観測用窓部と、この光学観測用窓部よりも下流で前記流路から分岐する前記標的細胞の回収用分岐路と、この回収用分岐路の分岐部分に配されて前記標的細胞を前記回収用分岐路に誘導するための弁とを備えることを特徴とする。

バイオチップは、前記標的細胞通過フィルターが前記流路に複数配されていることを特徴とする。

【００２９】
バイオチップは、前記弁が、熱的に制御可能な熱制御弁、電気的に制御可能な電気制御弁、又は磁気的に制御可能な磁気制御弁であることを特徴とする。
【補正の内容】

バイオチップは、前記光学観測窓部における前記流路が、前記標的細胞が重なり合うことなくその流路に沿って１列で通過可能な流路幅で形成されていることを特徴とする。

バイオチップは、前記光学観測窓部よりも上流の前記流路に、前記標的細胞を光学標識する光学標識用薬液を外界から注入するための薬液注入路が合流していることを特徴とする。

Claims (22)

1. 辞書作成用サンプルとして採血した基準となる細胞が含まれる血液中の細胞を光学標識し、その光学標識に対応した光を照射してカラー撮像し、撮像したカラー画像データから前記基準となる細胞を複数個分選別し、選別した各細胞領域を標的辞書用画像データとして所定画像サイズで各々切り出し、切り出した各標的辞書用画像データを前記基準となる細胞に対応する所定色に基づいて２値化処理し、得られた複数個分の標的用２値化画像データを主成分分析してその固有ベクトルから得られた正規直交基底を予め標的辞書とする標的辞書作成工程、
   前記カラー画像データの中から前記基準となる細胞以外の細胞を複数個分選別し、選別した各細胞領域を非標的辞書用画像データとして前記所定画像サイズで各々切り出し、切り出した各非標的辞書用画像データを前記所定色に基づいて２値化処理し、得られた複数個分の非標的用２値化画像データを主成分分析してその固有ベクトルから得られた正規直交基底を予め非標的辞書とする非標的辞書作成工程、
   検査用に血液を採血し、又はその血液を濃縮して、検査すべき標的細胞が含まれている血液検体を取得する検体取得工程、
   前記血液検体を、平面プレート上で膜化して固定した後、又はバイオチップの流路へ注入した前若しくは後に、前記標的細胞を前記光学標識と同様に光学標識する検体標識工程、
   前記平面プレート、又は前記バイオチップの前記検体に前記光学標識に対応した光学標識発現光を照射する光学標識発現工程、
   前記平面プレート、又は前記バイオチップで全反射可能な照射角度で焦点合わせ用の光を照射し、前記平面プレート、又は前記バイオチップにおける前記焦点合わせ用の光の反射位置に基づいて、前記血液検体に撮像カメラの焦点合わせをする焦点制御工程、
   前記撮像カメラで前記血液検体を拡大して撮像してカラー画像データを得るカラー画像取得工程、
   前記カラー撮像取得工程で撮像したカラー画像データを、前記所定色に基づいて２値化処理する２値化処理工程、
   前記２値化処理した画像データを収縮膨張処理する収縮膨張処理工程、
   前記収縮膨張処理した画像データの各連結画素領域にラベルを付与する１次候補検索工程、
   前記ラベルのうちから前記所定画像サイズ内で近接する異なるラベルの連結画素領域同士に同一のラベルを再付与し直す２次候補検索工程、
   前記２次候補検索工程後の各ラベルが示す前記連結画像領域を含む前記所定画像サイズの検査用画像データを順次切り出し、その検査用画像データと、前記標的辞書及び前記非標的辞書の各々とのベクトル距離を算出し、その両ベクトル距離を順次評価処理して、前記非標的辞書よりも前記標的辞書に所定評価値内で類似する検査用画像データを選定する３次候補検索工程、
   前記選定された検査用画像データの前記連結画素領域を前記標的細胞であると判定してその位置を特定する標的細胞特定工程、
   前記標的細胞を前記位置の情報に基づいて回収する標的細胞回収工程、
   前記標的細胞の染色体、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを解析する標的細胞検査工程
   を有することを特徴とする血液中の標的細胞の検査方法。
2. 前記標的細胞が、胎児由来有核赤血球であることを特徴とする請求項１に記載の血液中の標的細胞の検査方法。
3. 前記検体取得工程中、比重遠心法により前記濃縮が行われ、そこから比重によって分離して前記取得することを特徴とする請求項１〜２の何れかに記載の血液中の標的細胞の検査方法。
4. 前記検体標識工程中、前記血液検体を平面プレート上で膜化して固定し、そこから、前記標的細胞回収工程中、前記標的細胞を前記選別しつつ、吸い出し、掻き出し、又は掬い出して、前記回収することを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載の血液中の標的細胞の検査方法。
5. 前記検体標識工程中、前記バイオチップの流路に、前記血液検体を注入しつつ、前記標的細胞回収工程中、前記流路内で前記位置を特定することを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載の血液中の標的細胞の検査方法。
6. 前記標的細胞回収工程中、前記流路から、前記選別した前記標的細胞を、前記回収する流路経路へ誘導することを特徴とする請求項５に記載の血液中の標的細胞の検査方法。
7. 前記標的細胞検査工程中、前記染色体、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを、その検出すべき染色体のセントロメア又は検出すべき遺伝子配列に結合する１本鎖の相補配列と蛍光色素とが結合した診断用蛍光プローブでハイブリダイゼーション反応させて検出して、前記解析することを特徴とする請求項１〜６の何れかに記載の血液中の標的細胞の検査方法。
8. 前記診断用プローブの標識材は、蛍光、又は磁気を用いていることを特徴とする請求項７に記載の血液中の標的細胞の検査方法。
9. 前記標的細胞検査工程中、前記標的細胞及び／又はそれに由来する組織の懸濁液からなる試料を、流路、区画、溝、キャピラリー、ファイバー及び／又ビーズからなるバイオチップ反応場に注入し、前記試料を前記細胞の染色体、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡに反応する標識試薬と前記反応場で反応させてから、前記標識試薬の標識を、検出することを特徴とする請求項１〜８の何れかに記載の血液中の標的細胞の検査方法。
10. 辞書作成用サンプルとして採血した基準となる細胞が含まれる血液中の細胞を光学標識し、その光学標識に対応した光を照射してカラー撮像し、撮像したカラー画像データから前記基準となる細胞を複数個分選別し、選別した各細胞領域を標的辞書用画像データとして所定画像サイズで各々切り出し、切り出した各標的辞書用画像データを前記基準となる細胞に対応する所定色に基づいて２値化処理し、得られた複数個分の標的用２値化画像データを主成分分析してその固有ベクトルから得られた正規直交基底が標的辞書として予め記憶されている標的辞書記憶部と、
    前記カラー画像データの中から前記基準となる細胞以外の細胞を複数個分選別し、選別した各細胞領域を非標的辞書用画像データとして前記所定画像サイズで各々切り出し、切り出した各非標的辞書用画像データを前記所定色に基づいて２値化処理し、得られた複数個分の非標的用２値化画像データを主成分分析してその固有ベクトルから得られた正規直交基底が非標的辞書として予め記憶されている非標的辞書記憶部と、
    検査用に血液が採血され又はその血液が濃縮され、検査すべき標的細胞が光学標識されている血液検体が、載せられた平面プレート、又は前記血液検体が注入されている流路を有するバイオチップを、保持可能であると共に、ＸＹＺ軸方向に移動制御可能なＸＹＺステージと、
    前記ＸＹＺステージで保持された前記平面プレート、又は前記バイオチップの前記血液検体を拡大してそのカラー画像を撮像可能な撮像カメラと、
    前記光学標識に対応した光学標識発現光を前記平面プレート、又は前記バイオチップに照射する撮像用光源と、
    前記平面プレート、又は前記バイオチップで全反射可能な照射角度で焦点制御用の光を照射する焦点制御用光源と、
    前記平面プレート、又は前記バイオチップにおける前記焦点制御用の光の反射位置を検出する反射光検出器と、
    前記反射光検出器の検出する前記反射位置に基づいて、前記ＸＹＺステージをＺ軸方向に移動させて前記血液検体に前記撮像カメラの焦点合わせをする焦点制御手段と、
    前記ＸＹＺステージをＸＹ軸方向に移動させて前記撮像カメラの撮像位置を制御する撮像位置制御手段と、
    前記撮像カメラに撮像させて前記血液検体のカラー画像データを取得するカラー画像取得手段と、
    前記カラー画像データを前記所定色に基づいて２値化処理する２値化処理手段と、
    前記２値化処理した画像データを収縮膨張処理する収縮膨張処理手段と、
    前記収縮膨張処理した画像データの各連結画素領域に対応するラベルを付与する１次候補検索手段と、
    前記ラベル記憶部に記憶されたラベルのうちから前記所定画像サイズ内で近接する異なるラベルの連結画素領域同士に同一のラベルを再付与し直す２次候補検索手段と、
    前記２次候補検索工程後の各ラベルが示す前記連結画像領域を含む前記所定画像サイズの検査用画像データを順次切り出し、その検査用画像データと、前記標的辞書及び前記非標的辞書の各々とのベクトル距離を算出し、その両ベクトル距離を順次評価処理して、前記非標的辞書よりも前記標的辞書に所定評価値内で類似する検査用画像データを選定するする３次候補検索手段と、
    前記選定された検査用画像データの前記連結画素領域が前記標的細胞であると判定してその位置を特定する標的細胞特定手段とを、
    備えることを特徴とする標的細胞検索装置。
11. 前記３次候補検索手段が、前記検査用画像データを切り出す位置を１画素ずつずらして前記所定画像サイズで複数回切り出して、そのずらして切り出した各々の前記検査用画像データごとに前記評価処理を行うことを特徴とする請求項１０に記載の標的細胞検索装置。
12. 前記標的細胞特定手段が、前記３次候補検索手段で選定された前記検査用画像データの前記連結画像領域の大きさ、及び／又は真円度が所定規定値内である前記連結画像領域を前記標的細胞であると判定してその標的細胞の位置を特定することを特徴とする請求項１０〜１１の何れかに記載の標的細胞検索装置。
13. 前記焦点制御用光源が前記撮像用光源として兼用されていることを特徴とする請求項１０〜１２の何れかに記載の標的細胞検索装置。
14. 前記標的細胞特定手段で前記標的細胞であると特定された前記検査用画像データと、前記標的辞書の作成に用いられた複数の前記標的用２値化画像データとを合わせて主成分分析して、その固有ベクトルから得られた正規直交基底を前記標的辞書として前記標的辞書記憶部に更新して記憶させる標的辞書学習手段をさらに備えることを特徴とする請求項１０〜１３の何れかに記載の標的細胞検索装置。
15. ３次候補検索手段で前記選定されなかった前記検査用画像データ、又は前記標的細胞特定手段で前記標的細胞であると判定されなかった前記検査用画像データと、前記非標的辞書の作成に用いられた複数の前記非標的用２値化画像データとを合わせて主成分分析して、その固有ベクトルから得られた正規直交基底を非標的辞書として前記非標的辞書記憶部に更新して記憶させる非標的辞書学習手段をさらに備えることを特徴とする請求項１０〜１４の何れかに記載の標的細胞検索装置。
16. さらにディスプレイを備え、前記標的細胞特定手段が位置を特定した前記標的細胞の前記類似度、前記検査用画像データの画像、前記検査用画像データと同範囲で切り出した前記カラー画像データの画像、及びカラー画像データ全体の画像の中から選ばれる少なくとも１つを前記ディスプレイに表示可能であることを特徴とする請求項１０〜１５の何れかに記載の標的細胞検索装置。
17. 前記標的細胞特定後の前記平面プレート、及び特定前の前記平面プレートを各々複数枚収容することが可能なストッカと、
    このストッカと前記ＸＹＺステージとの間で前記平面プレートを搬送する搬送機構とをさらに有することを特徴とする請求項１０〜１６の何れかに記載の標的細胞検索装置。
18. 検査用に採血した血液とそれを濃縮した血液との何れかの血液検体が注入される流路を有するバイオチップであって、
    前記流路は、前記血液検体中の検査すべき光学標識された標的細胞が通過可能であると共に前記標的細胞よりも大きな細胞が通過不可である隙間を有する標的細胞通過フィルターと、この標的細胞通過フィルターよりも下流に配されて前記標的細胞を前記バイオチップの外界から光学観察可能な光学観測用窓部と、この光学観測用窓部よりも下流で前記流路から分岐する前記標的細胞の回収用分岐路と、この回収用分岐路の分岐部分に配されて前記標的細胞を前記回収用分岐路に誘導するための弁とを備えることを特徴とするバイオチップ。
19. 前記標的細胞通過フィルターが前記流路に複数配されていることを特徴とする請求項１８に記載のバイオチップ。
20. 前記弁が、熱的に制御可能な熱制御弁、電気的に制御可能な電気制御弁、又は磁気的に制御可能な磁気制御弁であることを特徴とする請求項１８〜１９の何れかに記載のバイオチップ。
21. 前記光学観測窓部における前記流路が、前記標的細胞が重なり合うことなくその流路に沿って１列で通過可能な流路幅で形成されていることを特徴とする請求項１８〜２０の何れかに記載のバイオチップ。
22. 前記光学観測窓部よりも上流の前記流路に、前記標的細胞を光学標識する光学標識用薬液を外界から注入するための薬液注入路が合流していることを特徴とする請求項１８〜２１の何れかに記載のバイオチップ。