ES2915379T3 - Sistema y método para la clasificación de espermatozoides - Google Patents

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Abstract

Un sistema (10) para clasificar espermatozoides que comprende: un alojamiento (12) que incluye un componente inferior y un componente superior acoplados entre sí; un sistema microfluídico soportado por el alojamiento (12); una entrada (14) que se extiende a través del componente inferior y que proporciona acceso al sistema microfluídico para suministrar espermatozoides al sistema microfluídico; una cámara de recolección (16) configurada para hacer pasar los espermatozoides mótiles para recoger y restringir los espermatozoides no mótiles, incluyendo la cámara de recolección (16) una primera cámara (24) que se extiende a través del componente inferior y una segunda cámara (26) que se extiende a través del componente superior y situada por encima de la primera cámara (24); al menos un canal que se extiende desde la entrada (14) hasta la cámara de recolección (16) para permitir que los espermatozoides suministrados al sistema microfluídico a través de la entrada (14) progresen a lo largo de una trayectoria de flujo (20) hacia la cámara de recolección (16); un filtro (18) que incluye una pluralidad de microporos y dispuesto en la cámara de recolección (16) para provocar que los espermatozoides que viajan a lo largo de la trayectoria de flujo (20) se muevan contra el filtro (18) y la gravedad para alcanzar la segunda cámara (26); y una cámara de concentración (25) que se extiende hacia el componente superior y conectada a la segunda cámara (26), estando la cámara de concentración (25) configurada para concentrar los espermatozoides mótiles procedentes de la segunda cámara (26) y para facilitar la recogida de la cámara de concentración (25).

Description

DESCRIPCIÓN
Sistema y método para la clasificación de espermatozoides
Referencia cruzada con solicitudes relacionadas
Esta aplicación se basa en, reivindica prioridad de la solicitud provisional de los Estados Unidos con n.° de serie 61/906.740, presentada el 20 de noviembre de 2013, y titulada, "SYSTEM AND METHOD FOR SPERM SORTING."
Declaración con respecto a investigación patrocinada por el gobierno federal
N/A
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere, en general, a sistemas y métodos para la clasificación de espermatozoides.
De acuerdo con estimaciones, existen más de 70 millones de parejas infértiles en todo el mundo. Aproximadamente 1 de cada 4 parejas infértiles busca tratamiento clínico, donde, de acuerdo con fuentes, el factor masculino puede representar aproximadamente el 50 por ciento de los casos de infertilidad. La tecnología de reproducción asistida (TRA), tales como la fecundación in vitro (FIV), la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) y la inseminación intrauterina (IUI), se utilizan, por lo general, en clínicas de reproducción para tratar parejas infértiles. Con una tasa creciente de infertilidad masculina debido a condiciones ambientales y fisiológicas, existe una necesidad cada vez mayor del uso de TRA en las clínicas de reproducción. El aislamiento de los espermatozoides más mótiles y morfológicamente normales es un proceso integral a los procedimientos de FIV/ICSI comúnmente utilizados. La selección de espermatozoides sanos a partir de semen sin procesar (espermatozoides de reserva) es crucial, ya que requiere seleccionar espermatozoides que no solo sean muy mótiles, sino que también tengan una morfología normal, núcleos maduros y una menor producción de especies reactivas de oxígeno (ERO). Aunque los procedimientos actuales de FIV/ICSI dan como resultado un embarazo exitoso aproximadamente el 50 por ciento de las veces, el resultado se puede ver muy comprometido si los espermatozoides que se seleccionan son anómalos.
En la actualidad, las técnicas de TRA más conocidas utilizan la swim-up basada en la centrifugación de los espermatozoides, los métodos de separación de gradiente de densidad y los métodos basados en microfluidos con/sin el uso de quimiotaxis para clasificar los espermatozoides. Estas técnicas presentan inconvenientes y limitaciones potenciales en su uso para procedimientos tan delicados como la FIV/ICSI. Cabe señalar que las técnicas de clasificación de espermatozoides basadas en centrifugación, tal como la swim-up, comprometen la calidad de los espermatozoides durante las etapas de centrifugación repetitivas. La calidad de una muestra de espermatozoides se degrada durante la técnica swim-up debido a la generación de ERO. La exposición a ERO puede dañar, en gran medida, el ADN de los espermatozoides aparentemente mótiles y sanos. Así mismo, las técnicas de clasificación de espermatozoides basadas en centrifugación requieren mucha mano de obra y el resultado puede variar de un técnico a otro.
Las tecnologías de clasificación de espermatozoides basadas en microfluidos presentan una ventaja porque pueden gestionar con precisión un pequeño volumen de muestras de espermatozoides. Por otro lado, los dispositivos de clasificación de espermatozoides basados en microfluidos presentan un rendimiento muy bajo y únicamente pueden procesar pequeños volúmenes de semen, tal como 2 pl - 50 pl, lo cual limita su aplicación a clínicas de reproducción, donde una muestra de espermatozoides normal puede tener un volumen de >1,5 ml.
En un procedimiento clínico de ICSI, un embriólogo tendrá, en promedio, 20 ovocitos que se pueden gestionar en cuatro placas petri y necesitará 20 espermatozoides. El embriólogo elegiría estos 20 espermatozoides en una muestra oligospérmica entre unos cientos de espermatozoides. Tal situación requeriría una supervisión en tiempo real de los espermatozoides individuales y la recolección de la salida cuando 20 espermatozoides alcancen la salida, lo cual no es alcanzable utilizando las tecnologías clínicas o basadas en microfluidos actuales. En un segundo procedimiento, donde un embriólogo gestiona muestras sanas, la fecundación in vitro se realiza utilizando 0,5 millones de espermatozoides sanos suspendidos en una suspensión de 5-20 pl que se introducirá en un ovocito. Sin embargo, los sistemas de clasificación actuales, tales como los que se han descrito anteriormente, no proporcionan el rendimiento necesario para cumplir con estos criterios.
Tradicionalmente, se han utilizado microscopios ópticos para obtener imágenes de los espermatozoides para un análisis de espermatozoides asistido por computadora (CASA) y la identificación manual de la motilidad de los espermatozoides para las TRA. Este enfoque clásico tiene limitaciones en el seguimiento de una gran cantidad de espermatozoides simultáneamente debido a su pequeño campo de visión (FOV). De manera adicional, después de la clasificación, se realizan análisis de seguimiento y motilidad de los espermatozoides. En la actualidad, no existe ningún sistema que pueda clasificar y analizar los espermatozoides simultáneamente.
Por lo tanto, sería deseable proporcionar un sistema y un método para procesar, incluso clasificar, espermatozoides sin dañar los espermatozoides o someter los espermatozoides a condiciones potencialmente dañinas. Así mismo, sería deseable proporcionar un sistema y un método que pueda analizar los espermatozoides, pero que sea eficiente y capaz de escalar.
En el documento EP 0639223 A1, se divulgan dispositivos para detectar la presencia de un analito preseleccionado en una muestra de fluido. Los dispositivos comprenden un sustrato microfabricado para definir un puerto de entrada de muestras y un sistema de flujo de mesoescala que incluye un canal de flujo de muestra que se extiende desde el puerto de entrada. El sistema de flujo de mesoescala incluye, además, una región de detección de analito en comunicación fluida con el canal de flujo que comprende una fracción de enlace para enlazar específicamente el analito.
En el documento WO 01/60968 A1, se divulga un dispositivo para separar espermatozoides mótiles de una muestra. El dispositivo comprende un recipiente que tiene un puerto de entrada, un puerto de salida y un medio al que los espermatozoides mótiles de la muestra pueden migrar al recipiente a través de la entrada. El dispositivo comprende, además, un accionador que se puede hacer funcionar para abrir el puerto de salida de muestras, permitiendo, de este modo, que el medio de separación de muestras fluya hacia el exterior del recipiente a través del puerto de salida de muestras.
Un sistema fluídico de mesoescala para analizar la motilidad celular en una muestra, en particular, la motilidad de las células en una muestra de espermatozoides, y un método de estimación de la cantidad y la calidad de las células mótiles en una muestra, y para extraer células mótiles de células no mótiles, en particular, utilizando el sistema fluídico de mesoescala, se divulgan en el documento WO 2014/177157 A1. El sistema fluídico de mesoescala comprende un sustrato que tiene una cámara de muestras con un filtro permeable a las células que define un compartimento de aplicación de muestras y un compartimento de medio de acondicionamiento, así como una cámara de análisis. La cámara de muestras incluye un puerto de entrada en el compartimento de aplicación de muestras y la cámara de análisis incluye un puerto de admisión y un puerto de expulsión. El compartimiento de medio de acondicionamiento está en comunicación fluida con el puerto de admisión de la cámara de análisis.
Sumario de la invención
La presente invención está definida en las reivindicaciones independientes adjuntas. En las reivindicaciones dependientes se definen las realizaciones preferentes. Esta supera los inconvenientes mencionados anteriormente al proporcionar un sistema y un método que integra micro y macrofluídica para clasificar espermatozoides de una manera que permite una selección eficiente de los espermatozoides que son favorablemente aptos para la fecundación. En particular, la presente invención reconoce que los espermatozoides adecuados para la fecundación son los más deseables y se pueden seleccionar o clasificar utilizando un sistema presente y un entorno similar al presentado en el proceso de fecundación. En este sentido, se proporciona un sistema donde los macrodepósitos están conectados mediante microporos para aproximarse al aparato genital femenino. Se proporciona un sistema y un método mediante el cual los espermatozoides más mótiles, morfológicamente normales, maduros y funcionales pasan selectivamente a través de los microporos en contra de la gravedad, dejando atrás aquellos espermatozoides muertos o menos funcionales. La presente invención es una tecnología libre de químicos, sin centrifugación y sin flujo, donde los espermatozoides funcionales se aíslan de una muestra de semen sin procesar con una alta tasa de recuperación.
De conformidad con un aspecto de la invención, se proporciona un sistema para clasificar los espermatozoides que incluye un alojamiento y un sistema microfluídico soportado por el alojamiento. El sistema también incluye una entrada que proporciona acceso al sistema microfluídico para suministrar espermatozoides al sistema microfluídico y una salida que proporciona acceso al sistema microfluídico para recoger espermatozoides clasificados del sistema microfluídico. El sistema microfluídico proporciona una trayectoria de flujo para los espermatozoides desde la entrada hasta la salida e incluye al menos un canal que se extiende desde la entrada hasta la salida para permitir que los espermatozoides suministrados al sistema microfluídico a través de la entrada progresen a lo largo de la trayectoria de flujo hacia la salida. El sistema microfluídico también incluye un filtro que incluye una pluralidad de microporos y dispuesto en la trayectoria de flujo entre la entrada y la salida para provocar que los espermatozoides que viajan a lo largo de la trayectoria de flujo se muevan contra el filtro y la gravedad para alcanzar la salida.
De conformidad con otro aspecto de la invención, se divulga un método para clasificar espermatozoides que incluye suministrar una muestra de espermatozoides a una entrada conectada a un sistema microfluídico y permitir que los espermatozoides en la muestra de espermatozoides atraviesen una trayectoria de flujo a través del sistema microfluídico hacia una salida que proporciona acceso al sistema microfluídico para recoger espermatozoides clasificados del sistema microfluídico. El método también incluye filtrar los espermatozoides antes de que alcancen la salida utilizando un filtro que tiene una pluralidad de microporos y la gravedad para restringir el movimiento de los espermatozoides a través del filtro. El método incluye, además, recoger los espermatozoides que pasan a la salida después de pasar a través del filtro y vencer la gravedad.
Lo anterior y otros aspectos y ventajas de la invención aparecerán a partir de la siguiente descripción. En la descripción, se hace referencia a los dibujos adjuntos que forman parte de esta y en los que se muestra, a modo de ilustración, una realización preferente de la invención. Tal realización no representa necesariamente el alcance completo de la invención, sin embargo, y, por lo tanto, se hace referencia a las reivindicaciones y al presente documento para interpretar el alcance de la invención.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1A es una vista en planta de un sistema de clasificación de espermatozoides no cubierto por la presente invención.
La figura 1B es una vista en sección transversal del sistema de la figura 1A.
La figura 1C es una vista esquemática de un sistema multicanal con una cámara de recolección para concentrar los espermatozoides clasificados, de conformidad con la presente invención.
La figura 1D es una vista esquemática del sistema multipocillo con múltiples canales que conectan la entrada y la cámara de concentración, de conformidad con la presente invención.
La figura 2A es una vista en despiece en sección transversal de un sistema de clasificación de espermatozoides y de formación de imágenes de conformidad con la presente invención.
La figura 2B es una vista detallada en perspectiva de un sistema microfluídico de las figuras 1A o 2A.
La figura 2C es una vista esquemática de un sistema microfluídico multicanal de conformidad con la presente invención.
La figura 2D es una vista en sección transversal del sistema global para la clasificación de espermatozoides y el sistema de formación de imágenes de conformidad con la presente invención.
La figura 3 es una vista en perspectiva de un sistema prototipo para clasificar espermatozoides no cubierto por la presente invención.
La figura 4 es una serie de imágenes de espermatozoides adquiridas utilizando la presente invención.
La figura 5A es un gráfico que ilustra la motilidad de los espermatozoides humanos aislados utilizando filtros de diferentes diámetros de poro y recuperados en diferentes momentos.
La figura 5B es un gráfico que ilustra la tasa de recuperación de los espermatozoides clasificados utilizando diferentes chips.
Las figuras 6A, 6B y 6C son gráficos que ilustran la velocidad curvilínea (VCL), la velocidad en línea recta (VLR) y la velocidad de trayectoria promedio (VTP) de los espermatozoides de reserva y clasificados utilizando chips MMSS de 3, 5 y 8 |jm, respectivamente.
La figura 7 es un gráfico que muestra la morfología normal (%) para los espermatozoides de reserva y clasificados. La figura 8 es un gráfico que muestra el porcentaje de espermatozoides maduros calculado para espermatozoides de reserva y clasificados.
La figura 9A es un gráfico que muestra los espermatozoides clasificados utilizando dispositivos de filtro de 3, 5 y 8 jm que mostraron una generación de ERO significativamente menor en comparación con los métodos swim-up y de lavado.
Las figuras 9B a 9G son gráficos de generación de especies reactivas de oxígeno (ERO) para (B) Muestra de semen, (C) Espermatozoides lavados, (D) Espermatozoides clasificados utilizando el método swim-up (la región de ERO está resaltada por un círculo), (E) Espermatozoides clasificados utilizando un chip MMSS de 3 jm , (F) Espermatozoides clasificados utilizando un chip MMSS de 5 jm y (G) Espermatozoides clasificados utilizando un chip MMSS de 8 jm . La figura 10A es un gráfico que muestra los espermatozoides clasificados utilizando chips MMSS de 5 y 8 jm que mostraron una fragmentación de ADN significativamente menor en comparación con la muestra de semen de swimup y sin clasificar.
Las figuras 10B a 10F son diagramas de dispersión de fragmentación de ADN para (B) Muestra de semen, (C) Espermatozoides clasificados utilizando el método swim-up, (D) Espermatozoides clasificados utilizando un chip MMSS de 3 jm , (E) Espermatozoides clasificados utilizando un chip MMSS de 5 jm y (F) Espermatozoides clasificados utilizando un chip MMSS de 8 jm .
La figura 11 es un diagrama de flujo que muestra un ejemplo de algunas etapas de conformidad con la presente divulgación.
Descripción detallada de la invención
La presente invención reconoce que el moco vaginal se vuelve acuoso y forma diminutos microcanales que ayudan a guiar a los espermatozoides hasta el óvulo. La presente invención reconoce el agotamiento como mecanismo para clasificar los espermatozoides y se ha demostrado experimental y teóricamente que aprovecha el agotamiento para clasificar los espermatozoides sanos utilizando una simulación multiescala de granulosidad gruesa. Específicamente, la presente invención proporciona un sistema de clasificación de espermatozoides macro y microfluídico (MMSS) para clasificar, de manera eficiente, de manera fiable y de manera exitosa los espermatozoides. Como se describirá, los espermatozoides sanos y mótiles se recolectan por completo en las salidas después de su clasificación. Este sistema mejora la eficiencia del proceso de selección de espermatozoides con una perturbación mínima, controlándose, de este modo, contra la fragmentación de ADN, la acumulación de desechos y la generación de ERO.
De manera adicional, la presente invención puede, simultáneamente, clasificar, supervisar y evaluar los espermatozoides. Específicamente, el presente sistema permite una evaluación de cada espermatozoide individualmente, por ejemplo, en función de la respuesta de velocidad, utilizando una tecnología de formación de imágenes sin lentes de campo de visión (FOV) amplio. El sistema proporciona una tecnología basada en microchip de FOV amplio y sin lentes que utiliza la formación de imágenes por sombreado. Adicionalmente, la presente invención se puede utilizar para recopilar información morfométrica, la cual es un indicador fiable de la fertilidad masculina.
Haciendo referencia a la figura 1A, se ilustra un sistema de clasificación de espermatozoides 10. El sistema 10 puede ser un sistema microfluídico basado en polidimetilsiloxano (PDMS), basado en polimetilmetacrilato (PMMA) u otro. El sistema 10 incluye un alojamiento 12 que tiene una entrada 14 y una cámara de recolección 16 que tiene un filtro 18 dispuesto en esta. El filtro 18 puede ser un filtro de policarbonato u otro filtro que tenga propiedades de materiales adecuadas, tal como el tamaño de los poros o pasos, como se describirá. Haciendo referencia a la figura 1B, la entrada 14 y la cámara de recolección 16 están conectadas a través de un paso o trayectoria de flujo 20 que se extiende a lo largo de un chip microfluídico 22. Como se describirá, el chip microfluídico 22 puede incluir un microchip que puede ser desechable y que gestiona muestras de semen sin procesar (ya sea fresco o congelado, procesado o en bruto), por ejemplo, de 10|jl-3ml, y clasifica los espermatozoides rápidamente, tal como en menos de 30 minutos, sin necesidad de instrumentación compleja ni de operadores capacitados.
La trayectoria de flujo 20 se extiende desde la entrada 14 hasta la cámara de recolección 16. En la cámara de recolección 16, una primera cámara o inferior 24 está ubicada próxima al chip microfluídico 22 y una segunda cámara o superior 26 está ubicada distalmente con respecto al chip microfluídico 22, por encima de la primera cámara o inferior 24. Como se describirá, la primera cámara 24 está diseñada para recolectar el semen de una muestra, ya sea fresco o congelado, procesado o en bruto, presentado a la entrada 14, y la segunda cámara 26 está diseñada para filtrar los espermatozoides mótiles.
Haciendo referencia a la figura 1C, el sistema descrito anteriormente con respecto a la figura 1B incluye, de acuerdo con la invención, una cámara de recolección o "concentración" adicional 25 que está conectada a la cámara superior mediante una conexión de fluido 27. Es decir, en este sentido, los espermatozoides se pueden concentrar en la cámara de recolección 25 para facilitar su recogida.
En otra configuración, como se ilustra en la figura 1D, la cámara de recolección 25 puede estar conectada a través de una pluralidad de canales 28, teniendo cada uno una entrada 29 opuesta a la cámara de concentración 25. En este sentido, los espermatozoides procedentes de múltiples trayectorias de flujo 20 de la figura 1C o procedentes de múltiples cámaras de recolección 16 se pueden suministrar a una cámara de concentración común 25. Tales variaciones del diseño descrito anteriormente se pueden utilizar para facilitar el uso de múltiples filtros y múltiples canales para gestionar volúmenes aún mayores o para aplicaciones de mayor rendimiento.
Haciendo referencia a la figura 2A, se ilustra una vista en despiece de una configuración opcional del sistema 10 que incluye un sistema de formación de imágenes integrado. El sistema de formación de imágenes puede formar una plataforma de formación de imágenes sin lentes de FOV amplio. En esta vista, componentes del sistema de formación de imágenes integrado, tales como una luz 30, un sensor de formación de imágenes 31 y una capa de protección de vidrio 32 combinados con el sistema 10 descrito anteriormente. Durante el funcionamiento, la luz 30 ilumina los espermatozoides 34 introducidos en el chip microfluídico 22 a través de la entrada 14. Los espermatozoides 34 iluminados pueden ser reflejados por el sensor de formación de imágenes 31, que puede ser un dispositivo de carga acoplada (CCD), un semiconductor de óxido de metal complementario (CMOS) u otro dispositivo de formación de imágenes. Es más, específicamente, haciendo referencia a la figura 2B, durante el funcionamiento, los espermatozoides y el semen 34 se pueden introducir en la salida 14 utilizando, por ejemplo, una pipeta 36. Los espermatozoides atraviesan un medio 38 a lo largo del chip microfluídico 22, que puede incluir el vidrio 32 mencionadas anteriormente, así como una capa de PMMA u otro material 40, estando una capa de adhesivo de doble cara (DSA) 42 dispuesta entre estos para fijar el vidrio 32 y la capa de PMMA 40. En última instancia, los espermatozoides 34 atraviesan el chip microfluídico 22 hasta la salida 16, donde se puede encontrar un aceite mineral 44. Específicamente, una fina capa de aceite mineral estéril testado con embriones se puede ubicar en la parte superior del medio 38 en la entrada 14 y la salida 16 para evitar la evaporación del medio.
Como se ilustra, se pueden utilizar o seleccionar diferentes longitudes de canal para una clasificación eficaz de los espermatozoides. Así mismo, haciendo referencia a la figura 2C, se puede utilizar un diseño multicanal donde la entrada 14 y la cámara de recolección 16 están conectadas mediante múltiples canales 46. Como se ilustra, también se puede incluir un tampón de recolección de PBS 48, por ejemplo, para utilizar en los lavados. Así mismo, el sustrato de chip que aloja los canales puede ser desechable.
Haciendo referencia a las figuras 2A y 2B, de estar incluida, la formación de imágenes sin lentes se puede utilizar para registrar la imagen de sombra de cada espermatozoide 34 individual sobre un plano de matriz de sensores optoelectrónicos 31. Este sistema 10 tiene como objetivo la detección/conteo de células o la supervisión en tiempo real de la ubicación dinámica de cientos de miles de células individuales en el chip en un FOV ultra amplio, por ejemplo, un FOV que es de unos pocos centímetros por unos pocos centímetros. Esta tecnología proporciona estas características con una complejidad reducida y facilidad de miniaturización.
Un ejemplo particular del sistema 10 que incluye las capacidades de formación de imágenes se ilustra en la figura 2D. Un microscopio estándar no puede supervisar un chip microfluídico de clasificación completo y analizar los espermatozoides en tiempo real. Este desafío se puede abordar mediante la integración de formación de imágenes sin lentes con microcanales que proporcionan supervisión y conteo de espermatozoides en el chip en paralelo. El diseño permite la miniaturización de esta tecnología para que sea adecuada para un laboratorio de embriología/clínico y entornos de punto de atención.
El sistema 10, en el ejemplo de la figura 2D, incluye la fuente de luz 30 que se dirige a través de una abertura 50 en el alojamiento 12, tal como una abertura de 50 |jm, para enfocar la luz monocromática 52 hacia el chip microfluídico 22, a través del cual los espermatozoides 34 atraviesan, como se ha descrito anteriormente. El sistema 10 puede estar acoplado con un sistema informático 54 conectado a través de una conexión de datos 56, que puede ser alámbrica o inalámbrica, y una batería recargable u otra fuente de alimentación 58 acoplada a través de una conexión de alimentación 60 para proporcionar alimentación operativa para las capacidades de formación de imágenes.
En una configuración, se podría utilizar una combinación de polimetilmetacrilato (PMMA) de 1,5 mm de espesor y una película adhesiva de doble cara (DSA) de 50 jm de espesor para crear microcanales. La película DSA se puede cortar para crear microcanales de diferentes longitudes que oscilen desde 5 mm hasta 40 mm utilizando un cortador láser. Los puertos de entrada y de salida se extienden a través del PMMA con un diámetro de 0,65 mm y 2 mm, respectivamente. Entonces, la película DSA se ubica directamente sobre el PMMA uniendo los dos. Se ubica un portaobjetos sobre el otro lado de la película DSA, de tal manera que la altura del canal está determinada por el espesor de capa adhesiva. El tamaño de salida más grande está especialmente diseñado para extraer espermatozoides clasificados hacia el exterior del canal al que se puede acceder fácilmente con una pipeta. La distancia entre la entrada y la salida determinó la longitud de canal. La longitud del canal se define como la distancia entre la entrada y la salida.
Para aumentar el porcentaje de células mótiles en la salida y para un procesamiento de alto volumen, en estos microchips, se puede integrar un filtro de policarbonato. Este dispositivo basado en filtro se puede diseñar utilizando un corte de PMMA de 3 mm de espesor en un área de 50 mm por 30 mm y otro corte en un área de 30 mm por 30 mm. Los cilindros de 20 mm de diámetro se pueden cortar en ambos componentes de PMMA y alinearse verticalmente entre sí utilizando DSA de 150 jm . También se corta una entrada de inyección de semen de 0,6 mm en el componente de dispositivo más grande a una distancia de 10 mm. El sistema se puede montar utilizando un filtro de nucleoporo Whatman ubicado entre los dos componentes de PMMA.
Haciendo referencia a las figuras 1A a 2D, el sistema 10 se puede utilizar en el procesamiento de semen a gran escala. Para ello, los espermatozoides 34 se introducen a través de la entrada 14 para ubicarse en el chip microfluídico 22. Durante este movimiento, se pueden obtener imágenes de los espermatozoides 34 utilizando la luz 30 y el sensor de formación de imágenes 31. Los espermatozoides 34 se mueven hacia la salida 16. Esta salida/cámara de recolección presenta dos cámaras 24, 26. La primera cámara 24 incluye un filtro que presenta microporos y la segunda cámara 26 incluye otro filtro que incluye microporos. En este sentido, el sistema 10 presenta macrodepósitos 14, 16 conectados mediante microporos para aproximarse al aparato genital femenino. En este, los espermatozoides 34 se mueven colectivamente, influidos entre sí, tal como sucedería naturalmente, a lo largo del medio 38 hacia la salida 16. Los espermatozoides más mótiles, morfológicamente normales, maduros y funcionales pasan selectivamente a través de los microporos en contra de la gravedad, dejando atrás los espermatozoides muertos o menos funcionales en la primera cámara 24. Es decir, la cabeza de los espermatozoides es de forma esférica y tiene un tamaño de aproximadamente 3 jm x 4,5 jm . Las colas de los espermatozoides son de aproximadamente 45 y 50 jm de largo. Si se ubica un filtro que tiene microporos de diámetro mayor que la cabeza de los espermatozoides en la primera y la segunda cámaras 24, 26, únicamente los espermatozoides que son mótiles se pueden abrir paso a través de los microporos, mientras que los espermatozoides muertos, moribundos o dañados no pueden pasar a través de los microporos debido a sus largas colas. Por el contrario, estos espermatozoides muertos, moribundos y/o dañados sucumben a la gravedad y permanecen en la primera cámara 24.
Por tanto, se proporciona un sistema basado en microchip que está diseñado de tal manera que no requiere ninguna etapa de centrifugación para recuperar los espermatozoides sanos, mótiles y morfológicamente normales con una generación de ERO mínima. El diseño del dispositivo hace que el procedimiento de clasificación de espermatozoides sea menos laborioso y económico. El sistema incorpora y utiliza el agotamiento en canales con limitaciones de espacio como mecanismo para clasificar los espermatozoides. El sistema puede aislar los espermatozoides mótiles y morfológicamente normales sin ninguna etapa de centrifugación. Por tanto, se utiliza un modelo actual de granularidad gruesa de la motilidad de los espermatozoides para modelar dispositivos microfluídicos basados en filtro en tres dimensiones, incorporando los efectos del aumento cooperativo de las interacciones hidrodinámicas entre los espermatozoides, con las paredes de canal y con las superficies y orificios de filtro. Este modelo permite el diseño de parámetros del dispositivo, tales como el tamaño de los microporos y los tiempos de incubación.
El diseño y el funcionamiento del sistema descrito anteriormente se pueden apreciar adicionalmente a partir de la siguiente exposición de un ejemplo de un sistema, la configuración para tal sistema y los resultados de las pruebas de tal sistema. Este es únicamente un ejemplo y no es de naturaleza limitante a la variedad de configuraciones, diseños y funcionamientos que se pueden emplear y caen dentro del alcance de la presente invención.
Ejemplo
Montaje de chip MMSS
El poli (metil metacrilato) (PMMA, 3 mm de espesor; McMaster Carr, Atlanta, Georgia) y el adhesivo de doble cara (d Sa , 120 |jm de espesor, San Pablo, Minnesota) se cortaron con un cortador láser (Versa Laser™, Scottsdale, Arizona). El diseño para el chip se generó en Coral Draw4 y se implementó en el software USLE Engrave para cortar. Los componentes principales del chip MMSS incluían un corte de PMMA de 3 mm en un área de 50 mm x 30 mm (cámara inferior) y otro corte en un área de 30 mm x 30 mm (cámara superior). También se cortó un punto de inyección de 0,6 mm en la lámina de PMMA inferior a una distancia de 5 mm de las cámaras. Se cortaron cilindros de 20 mm de diámetro en ambos componentes de PMMA. La cámara de PMMA inferior se afianzó, en primer lugar, al portaobjetos utilizando DSA. La cámara de PMMA superior se alineó y se afianzó con la cámara inferior utilizando DSA. Los filtros de membrana de policarbonato con surcos grabados de Nuclepore™ (Whatman Ltd, 25 mm de diámetro, 3 jm , 5 jm , 8 jm ) se intercalaron entre dos cámaras de PMMA durante el montaje del chip. Por tanto, se consideró que al menos 1 jm y menos de 10 jm pueden ser un intervalo de tamaños de poro ventajosos. En la figura 3, se muestra una vista en perspectiva del chip montado.
Clasificación de espermatozoides utilizando chip MMSS
Se inyectó una muestra de semen descongelado sin procesar (espermatozoides de reserva) en la entrada del chip MMSS hasta que se llenó la primera cámara/inferior. La primera cámara/inferior fue diseñada para contener hasta 560 j l de la muestra de semen. En otro grupo de experimentos, la muestra de semen de reserva se diluyó 4 veces con albúmina sérica bovina (BSA) al 1 por ciento en fluido tubárico humano (HTF) antes de la inyección en el chip MMSS. Después de la inyección, la primera cámara/superior se completó con 560 j l de BSA al 1 por ciento en HTF. A continuación, los chips se almacenaron a 37 °C en una incubadora durante intervalos de 15, 30, 45 y 60 min antes de que el fluido procedente de la cámara superior se recolectara en tubos de eppendorf para su análisis.
Análisis de concentración y motilidad
Se utilizó un Hemocitómetro Makler estándar para analizar la concentración y la motilidad de las muestras de espermatozoides utilizando un microscopio óptico. Brevemente, se pipeteó 1 j l de muestra de espermatozoides en el Hemocitómetro Makler y se cubrió con la tapa protectora que se proporciona con el Hemocitómetro. Los espermatozoides fueron contados por personal familiarizado con el método utilizando un contador por clics al menos tres veces. Los espermatozoides que avanzaban se consideraron mótiles.
Análisis de viabilidad
Se analizó la viabilidad de las muestras de espermatozoides utilizando el kit de viabilidad de espermatozoides LlVE/DEAD® (L-7011, Molecular Probes®). Se utilizó colorante SYBR 14 para teñir los espermatozoides vivos, mientras que se utilizó yoduro de propidio (PI) para teñir los espermatozoides muertos. Las muestras se tiñeron de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, se añadió el primer colorante SYBR 14 a la muestra de espermatozoides hasta la concentración final de 100 nM. La muestra se incubó durante 5 min a 37 °C. Para teñir los espermatozoides muertos, se añadió colorante de PI a la muestra hasta la concentración final de 10 jM y se dejó incubar durante 5 min adicionales. Las muestras de espermatozoides se frotaron sobre un cubreobjetos de vidrio y se formaron imágenes utilizando el microscopio fluorescente Zeiss Axio Observer.Z1. Se utilizaron filtros de emisión verde y rojo para SYBR 14 y PI, respectivamente.
Medición de velocidad
Las muestras de espermatozoides se analizaron utilizando el método descrito por el manual de laboratorio de la OMS para el análisis de espermatozoides. Brevemente, los espermatozoides se recuperaron de los chips MMSS (3 jm , 5 jm , 8 jm ) después de 30 min. Los portaobjetos se prepararon poniendo 6 j l de muestra de espermatozoides sobre un portaobjetos y se cubrieron con un cubreobjetos de 18x18 mm para dar a la muestra una profundidad de 20,7 jm . Para evitar que las muestras se secasen, los portaobjetos se hicieron periódicamente, no simultáneamente. Cada diapositiva se analizó bajo 20x (Carl Zeiss) utilizando microscopía de luz con imágenes en vivo de la muestra proyectada sobre un monitor de ordenador. Utilizando un software de captura de vídeo (Snagit, TechSmith), el movimiento de las muestras de espermatozoides se capturó en ubicaciones aleatorias durante 5 segundos. Los videos se convirtieron en secuencias de imágenes utilizando el software VideotoJpeg a 100 fps. La secuencia de imágenes se ingresó en ImageJ (National Institute of Health, http://rsbweb.nih.gov/ij/) para su análisis utilizando el complemento CASA para supervisar los parámetros de velocidad de los espermatozoides, es decir, la velocidad en línea recta (VLR), la velocidad curvilínea (VCL) y la velocidad de trayectoria promedio (VTP).
Evaluación de morfología de espermatozoides
La suspensión de espermatozoides recuperada de los chips MMSS de 5 jm y 8 jm se recolectaron después de 30 min. Los espermatozoides recuperados del chip MMSS de 3 jm no se analizaron en términos de morfología de los espermatozoides, ya que la concentración de espermatozoides es demasiado baja para un análisis morfológico. Luego, se tomó una suspensión de espermatozoides de 10 j l y se ubicó sobre un portaobjetos de microscopio limpio y estéril y se prepararon frotis con plumas. Los frotis se secaron al aire y se prepararon para su fijación. Se siguió un protocolo de tinción de Spermac similar al proporcionado por FertiPro para teñir los espermatozoides para las evaluaciones de morfología. Brevemente, los frotis secos se sumergieron en una solución fijadora Spermac durante al menos 5 min y, luego, se enjuagaron con agua DI. La tinción A se pipeteó en un borde de los portaobjetos y se dejó fluir sobre el frotis. A continuación, los portaobjetos se ubicaron sobre una superficie plana y se dejaron en remojo con tinte durante 1 min. A continuación, los portaobjetos se enjuagaron dos veces con agua DI. A continuación, la tinción B se aplicó de manera similar a la tinción A y se permitió que penetrara en los espermatozoides durante 1 min. Esto fue seguido por un único enjuague con agua DI. Por último, la tinción C se pipeteó sobre el frotis y se dejó reposar durante 1 min antes de enjuagar con agua DI. En este punto, se formaron imágenes de al menos 100 espermatozoides utilizando inmersión en aceite y un objetivo 100X (N (n°. de repeticiones) = 3). Los espermatozoides se consideraron morfológicamente normales si se encontraban dentro de los criterios de morfología de la OMS (Cabeza: cabeza esférica; acrosoma que cubre 40-70 % del área de cabeza; longitud de cabeza 3,7-4,7 pm; anchura de cabeza 2,5­ 3,2 pm; proporción longitud-anchura 1,3-1,8; no más de 2 pequeñas vacuolas; la región posterior al acrosoma no debería contener ninguna vacuola. Pieza intermedia: sin citoplasma residual en la pieza intermedia; la longitud de la pieza intermedia debería ser aproximadamente la misma que la longitud de cabeza; sin cuello roto. Pieza principal: sin ángulos agudos ni dobleces indicativos de rotura de cola; más delgada que la pieza intermedia, la longitud de la pieza principal debería ser aproximadamente 10 veces la longitud de cabeza).
Evaluación de madurez de espermatozoides
La suspensión de espermatozoides recuperada de los chips MMSS de 5 y 8 pm se recolectaron después de 30 min. Los espermatozoides recuperados del chip MMSS de 3 pm no se analizaron en términos de madurez nuclear, ya que la concentración de espermatozoides es demasiado baja para este análisis. Los frotis secos se fijaron con la solución fijadora Spermac durante 5 min y, posteriormente, se enjuagaron con agua DI. Se preparó una solución de azul de anilina al 5 % en ácido acético al 4 % y se vertió sobre los frotis. Los frotis se empaparon durante 5 min en solución de tinción y luego se enjuagaron con agua DI. Se evaluaron al menos 100 espermatozoides utilizando inmersión en aceite con un objetivo 100X (N (n.° de repeticiones) = 3). Las cabezas de los espermatozoides que se tiñeron de azul oscuro se declararon inmaduras, mientras que las que permanecieron sin teñir se consideraron maduras.
Detección de ERO
Lavado de espermatozoides: Se extrajo 1 ml de semen de un tanque de crioconservación y se descongeló durante 15 min en un baño tibio a 37 °C. La muestra de semen lavado se preparó agregando 9 ml de medio HTF+BSA al 1 % a 1 ml de semen, centrifugando a 500 Xg durante 5 min y eliminando el sobrenadante, dejando el sedimento de espermatozoides en el fondo del tubo. Este procedimiento se repitió tres veces. Se añadió medio HTF al sedimento de espermatozoides y las muestras se tiñeron con estudios de ERO.
Método swim-up: Se extrajo 1 ml de semen de un tanque de crioconservación y se descongeló durante 15 min en un baño tibio a 37 °C. El semen se diluyó con 9 ml de HTF+BSA al 1 %. A continuación, la suspensión de espermatozoides diluida se centrifugó a 500 Xg durante 5 min. A continuación, el sobrenadante se retiró y desechó. El sedimento restante se lavó de nuevo centrifugando la muestra a 500 Xg durante 5 min. Se eliminó el sobrenadante y se desechó de nuevo. Por último, se añadieron 500 pl de medio a lo largo de la pared lateral del tubo de centrífuga mientras se evitaba la rotura del sedimento. Entonces, la muestra se ubicó en la incubadora y se permitió que los espermatozoides mótiles nadasen hacia arriba hacia el exterior del sedimento durante 30 min. Los espermatozoides mótiles se recolectaron dejando los sedimentos atrás. Los chips MMSS se incubaron durante un período de 30 min y la suspensión de espermatozoides se recuperó para los estudios de ERO.
Tinción para detección de ERO: La generación de ERO se examinó utilizando citometría de flujo junto con dos colorantes fluorescentes, dihidroetidio (DHE) y verde SYTOX. El DHE reacciona con el anión superóxido que produce dos fluorocromos que se enlazan al ADN de los espermatozoides y produce una fluorescencia roja. Mientras que el SYTOX verde es indicativo de viabilidad celular, este produce una fluorescencia verde cuando la célula está muerta. Para este experimento, se prepararon cuatro muestras de control en las que todas consistían en 200 pl de suspensión de espermatozoides recuperados mezclada con 20 pl de peróxido de hidrógeno. Esto fue seguido por una incubación a 37 °C durante 30 min. Los colorantes se añadieron a las muestras; sin colorante para un control negativo, se añadió DHE a 5 pM a la segunda muestra, Se añadió verde SYTOX a 50 nM a la tercera muestra, y la cuarta muestra contenía tanto DHE como SYTOX a 5 pm y 50 nM, respectivamente. Los colorantes se incubaron durante 15 min y luego se transfirieron al citómetro de flujo para la medición 15 min antes a la prueba de las muestras. Un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson, San José, California) se utilizó durante los experimentos. Una excitación con láser de argón a 488 nm se acopló con mediciones de emisión utilizando filtros de paso de banda 530/30 (verde) y de paso de banda 585/42 (rojo) para FL1 y FL2, respectivamente. Los eventos no espermáticos se excluyeron y se examinaron al menos 10.000 células. Para muestras de prueba, se recogieron 500 pl de muestra de semen descongelado, suspensión swim-up, microchips de tamaño de poro de filtro de 3, 5 y 8 pm. Se añadieron, a cada muestra, DHE y SYTOX a 5 pm y 50 nM, respectivamente, y se dejaron incubar durante 15 min. Las muestras se llevaron al citómetro de flujo para su medición.
Fragmentación de ADN
Un kit de ensayo TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein de Roche Applied Science) se utilizó para cuantificar la fragmentación de ADN en semen en bruto, swim-up, y población de espermatozoides recuperados procedentes de dispositivos de microchip con filtros de tamaño de poro de 3, 5 y 8 |jm. Todas estas muestras se obtuvieron como se mencionó anteriormente en la sección Detección de ERO. Inicialmente, todas las suspensiones de espermatozoides se lavaron dos veces centrifugando a 500 Xg durante 5 min con PBS y BSA al 1 %. Una vez lavadas, las concentraciones de células de espermatozoides se ajustaron a 2 X 106 células/ml. A continuación, las suspensiones de espermatozoides se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS (200 j l por cada 100 j l de suspensión celular) durante 30 min a temperatura ambiente. Las células de espermatozoides se lavaron dos veces a 500 Xg durante 6 min con PBS y BSA al 1 % y se permeabilizaron con TritonX al 0,1 % en citrato de sodio al 0,1 % durante 2 min en/sobre hielo. Los espermatozoides se lavaron dos veces seguido de 1 hora de incubación a 37 °C con 5 j l de solución de enzima (TdT) y 45 j l de solución de marcado (dUTP-fluoresceína). De manera similar, se preparó una muestra de control negativo y positivo. Sin embargo, antes de la tinción, el control positivo se incubó con DNasa durante 40 min a 37 °C. Durante la tinción, el control negativo únicamente se incubó con solución de marcado (sin solución de enzima). Después de la tinción, las muestras se lavaron dos veces con PBS y BSA al 1 % y se volvieron a suspender en PBS (Muratori et al, 2000). La emisión de fluorescencia de las células fragmentadas de ADN se evaluó con un citómetro de flujo y se detectó mediante el detector FL-1 (521 nm). Se adquirió un total de 5000 eventos. La población de espermatozoides se excluyó de los datos para eliminar cualquier señal de los desechos. Los experimentos se repiten 6 veces (N=6).
Resultados y exposición
Para desarrollar un dispositivo de clasificación de espermatozoides vertical, libre de químicos y libre de centrifugación, de alto rendimiento, los chips MMSS se fabricaron y montaron como se ha descrito anteriormente. Brevemente, es un chip de dos cámaras separadas por filtros de policarbonato de diversos diámetros, tales como, por ejemplo, 3, 5, 8 jm . La muestra de espermatozoides se inyectó en la cámara inferior y los espermatozoides mótiles/sanos clasificados se recolectaron de la cámara de recuperación superior. La presencia de los filtros con, por ejemplo, poros de tamaño uniforme entre dos cámaras se diseñó de tal manera que los espermatozoides más mótiles y sanos se pudieran trasladar a través de los poros del filtro. Las imágenes del microscopio electrónico de barrido (SEM) de los filtros de policarbonato utilizados para la clasificación de espermatozoides mostraron diámetros de poro uniformes, como se muestra en la figura 4. Las imágenes del SEM de filtros de membrana de policarbonato con surcos grabados de nuclepore de diferentes diámetros de microporos, i) 3 jm ii) 5 jm e iii) 8 jm . La barra de escala es de 10 jm . Estas imágenes muestran el tamaño comparativo de diversos poros de filtro y espermatozoides.
La cabeza de los espermatozoides es de forma esférica y tiene un tamaño de aproximadamente 3 jm x 4,5 jm . La cola de los espermatozoides es de aproximadamente 45-50 jm de largo. Si se ubica un filtro de diámetro mayor que la cabeza de los espermatozoides entre este chip de dos cámaras, únicamente los espermatozoides que son mótiles pueden abrirse camino a través de los microporos, mientras que los espermatozoides muertos/moribundos no pueden pasar a través de los microporos debido a sus largas colas.
Motilidad y tasa de recuperación de espermatozoides
Para investigar la motilidad de los espermatozoides clasificados, se analizaron los espermatozoides recolectados de la cámara de recuperación superior de los tres chips MMSS (chips de filtro de 3, 5 y 8 jm de diámetro). Los resultados mostraron que los espermatozoides clasificados con chips MMSs mostraban una motilidad significativamente mayor en comparación con la muestra de espermatozoides de reserva, tal como se ilustra en la figura 5A. Específicamente, los chips de filtro de 3, 5 y 8 jm mostraron una motilidad de los espermatozoides mayor o igual a 95 por ciento ± 10, mayor o igual que 90,4 por ciento ± 1,8, mayor o igual que 85,9 por ciento ± 1,5, respectivamente, que fue significativamente mayor que la motilidad de los espermatozoides de reserva (39,8 por ciento ± 1,9). Se investigó más a fondo el efecto del tiempo de incubación sobre la motilidad de los espermatozoides. Los espermatozoides se recolectaron después de 15, 30, 45 y 60 min. Se descubrió que la motilidad de los espermatozoides recuperados aumentó cuando la muestra de espermatozoides se recolectó después de un período de tiempo más largo; la motilidad en el caso del momento de 60 min fue la más alta, mientras que fue la más baja para momentos de 15 min, tal como se ilustra en la figura 5A. Este aumento de la motilidad se nota en los tres chips. Cuando se pipeteó HTF+BSA al 1 por ciento en la cámara superior del chip MMSS al inicio de cada experimento, se produjo una ligera turbulencia en la muestra de espermatozoides debido a la mezcla de los dos líquidos; muestra de espermatozoides de reserva y medio HTF+BSA al 1 %. Esta turbulencia en la muestra de espermatozoides es la posible razón de la menor motilidad de los espermatozoides al inicio del experimento (después de 15 min) en comparación con los últimos momentos (después de 30, 45 y 60 min). De manera adicional, se calculó la tasa de recuperación de espermatozoides en diversos momentos, es decir, porcentaje (%) de espermatozoides sanos recuperados de la muestra de reserva. La tasa de recuperación es un parámetro importante para cualquier dispositivo de clasificación de espermatozoides, especialmente para la situación donde las muestras de espermatozoides tienen un bajo recuento de espermatozoides (especímenes oligospérmicos y azoospérmicos). En el chip MMSS, la tasa de recuperación de espermatozoides se analizó durante un período de tiempo; los momentos de 15, 30, 45 y 60 min se ilustran en la figura 5B. La tasa de recuperación de espermatozoides fue máxima para las muestras recolectadas después de 30 min (3,08 por ciento ± 0,42, 23,75 por ciento ± 3,96 y 28,58 por ciento ± 2,81 para chips MMSS de 3, 5 y 8 jm , respectivamente). A este momento de 30 minutos se le denomina momento de saturación, ya que la tasa de recuperación de espermatozoides se redujo si la muestra se incubó durante más de 30 minutos, tal como se ilustra en la figura 5B. Se cree que algunos de los espermatozoides podrían viajar de regreso a través del filtro hacia la cámara inferior después de 30 minutos.
Viabilidad de espermatozoides
Los espermatozoides mótiles se consideran viables. Para corroborar nuestro hallazgo de que los espermatozoides clasificados son viables, se realizó la tinción vivos/muertos para los espermatozoides clasificados durante un momento de 30 min. La viabilidad de los espermatozoides clasificados fue significativamente mayor que la de la muestra de espermatozoides de reserva; 41,0 por ciento ± 0,45 (espermatozoides de reserva), 91,32 por ciento ± 3,43 (chip MMSS de 3 |jm), 89,83 por ciento ± 5,82 (chip MMSS de 5 |jm), 91,59 por ciento ± 4,44 (chip MMSS de 3 jm).
Efecto de la dilución de la muestra sobre la motilidad y la recuperación de los espermatozoides
Para investigar el efecto de la dilución de la muestra de espermatozoides sobre la motilidad y la tasa de recuperación, se diluyó la muestra de espermatozoides de reserva con HTF+BSA al 1 por ciento en una proporción de 1:4 antes de procesarla utilizando chips MMSS. La motilidad de los espermatozoides clasificados fue significativamente mayor que la de la muestra de espermatozoides de reserva en todos los 4 momentos (15, 30, 45 y 60 min); 45,8 por ciento ± 1,5 (espermatozoides de reserva), > 95,0 por ciento ± 5,0 (chip MMSS de 3 jm ), > 93,7 por ciento ± 4,7 (chip MMSS de 5 jm ), > 90,7 por ciento ± 2,5 (chip MMSS de 8 jm ), mientras que no fue diferente que si se utilizase una muestra de espermatozoides sin diluir, como se muestra en la figura 5A. Sin embargo, la tasa de recuperación de espermatozoides aumenta si se utiliza una muestra de espermatozoides diluida en lugar de espermatozoides de reserva sin diluir, como se muestra en la figura 5B. Se descubrió que la tasa de recuperación máxima era de 52,68 por ciento ± 4,97 para el chip de 8 jm después de un momento de 30 minutos. En la muestra diluida, los espermatozoides han aumentado la trayectoria libre media antes de chocar con otro espermatozoide. Este fenómeno podría haber ayudado a los espermatozoides a alcanzar y cruzar el microporo de filtro más rápidamente. En segundo lugar, el filtro tiene un número fijo de poros (<14 por ciento de porosidad). Puesto que una menor cantidad de espermatozoides intentaba cruzar los poros de filtro en la muestra diluida, era más probable que cada espermatozoide encontrara un poro vacío y se trasladara a través de este.
Análisis de la velocidad de los espermatozoides
Se analizaron diversos parámetros de velocidad de los espermatozoides, es decir, la velocidad curvilínea (VCL), la velocidad en línea recta (VLR) y la velocidad de trayectoria promedio (VTP). En la figura complementaria 3, se muestra una imagen representativa de la pista de espermatozoides que muestra estas definiciones de velocidad. El vídeo de espermatozoides original a partir del cual se genera la pista de la figura 3 se proporciona como Película complementaria 1. Los espermatozoides clasificados utilizando chips MMSS mostraron velocidades de espermatozoides significativamente mayores que la muestra de espermatozoides de reserva, como se ilustra en la figura 6. Específicamente, la VCL promedio de los espermatozoides aumentó de 52,7 ± 6,0 jm /s (espermatozoides de reserva) a 59,9 ± 3,5 jm /s, 75,3 ± 3,1 jm /s y 75,6 ± 4,5 jm /s para chips MMSS de 3, 5 y 8 jm , respectivamente, como se ilustra en la figura 6A. La VLR promedio de los espermatozoides aumentó de 44,4 ± 5,6 jm /s (espermatozoides de reserva) a 52,1 ± 3,5 jm /s, 63,4 ± 3,5 jm /s y 64,1 ± 3,9 jm /s para chips de 3, 5 y 8 jm , respectivamente, como se ilustra en la figura 6B. La VTP promedio de los espermatozoides aumentó de 48,4 ± 5,8 jm /s (espermatozoides de reserva) a 54,1 ± 3,4 jm/s, 68,0 ± 2,9 jm /s y 67,5 ± 4,1 jm /s para chips de 3, 5 y 8 jm , respectivamente, como se ilustra en la figura 6C. Velocidades de espermatozoides mayores indican que los espermatozoides clasificados son más sanos que la muestra de reserva. Cuando se compraron las velocidades entre los espermatozoides clasificados utilizando tres chips MMSS diferentes, se notó que los espermatozoides clasificados utilizando chips MMSS de 5 y 8 jm brindaron velocidades VCL, VLR y VTP mayores que un chip de filtro de 3 jm . Esto probablemente se deba al hecho de que la mayoría de los espermatozoides mótiles inmaduros que tienen tamaños de cabeza inferiores a 3 jm podrían pasar a través de los microporos de 3 jm . La única excepción a esto fueron las áreas de filtro donde se unieron dos o más poros de 3 jm para formar un poro más grande.
Análisis morfológico de los espermatozoides
Para el análisis morfológico, los espermatozoides se tiñeron con Spermac Stain. Los espermatozoides se consideraron morfológicamente normales en función de los estrictos criterios definidos por la OMS. Cualquier muestra de espermatozoides que tenga >4 por ciento de espermatozoides morfológicamente normales se considera normal. Se descubrió que los espermatozoides clasificados con chips MMSS de 5 jm no mejoraron la calidad de los espermatozoides en términos de morfología global, aunque los espermatozoides clasificados eran mótiles. Los espermatozoides clasificados con chips MMSS de 8 jm mostraron una morfología significativamente mejorada con respecto los espermatozoides de reserva y clasificados con chips MMSS de 5 jm ; 30,0 por ciento ± 7,6 (chip MMSS de 8 jm ), 17,0 por ciento ± 3,2 (chip MMSS de 5 jm ) y 17,6 por ciento ± 0,5 (espermatozoides de reserva).
Análisis de madurez nuclear de los espermatozoides
Los espermatozoides se tiñeron con azul de anilina y se analizaron para determinar su madurez nuclear. La tinción con azul de anilina puede discriminar los núcleos ricos en lisina de los espermatozoides inmaduros y los núcleos ricos en arginina/cisteína de los espermatozoides maduros. Los núcleos de los espermatozoides inmaduros se tiñeron con azul de anilina y mostraron un contraste de color entre los núcleos y el acrosoma. En la figura 7, se muestran imágenes representativas de espermatozoides teñidos con azul de anilina y sus criterios de evaluación. Los espermatozoides clasificados con un chip de filtro de 5 pm no mostraron ninguna mejora con respecto a los espermatozoides de reserva en términos de madurez de los núcleos. Mientras que, los espermatozoides clasificados con un chip de filtro de 8 pm mostraron una mayor madurez nuclear que la muestra de espermatozoides de reserva, como se muestra en la figura 8; 0,8 por ciento ± 5,1 (chip MMSS de 8 pm), 25 por ciento ± 4,6 (chip MMSS de 5 pm) y 26,9 por ciento ± 5,8 (espermatozoides de reserva).
Análisis de generación de ERO
Los espermatozoides clasificados se analizaron en términos de generación de ERO. Se ha comparado la generación de ERO en los espermatozoides después del método de lavado, el método swim-up convencional y los chips MMSS. Se descubrió que los espermatozoides clasificados mediante chips MMSS produjeron significativamente menos ERO que el método de lavado y swim-up (figura 9). El método de lavado y swim-up de espermatozoides produjo ERO en 10,1 % ± 0,3% y 10,6% ± 1,1 % de los espermatozoides, respectivamente, mientras que los espermatozoides clasificados utilizando chips MMSS mostraron una producción de ERO de únicamente 0,8 %±0,4 % (chip MMSS de 3 pm), 0,7 % ± 0,1 % (chip MMSS de 5 pm) y 1,0 % ± 0,1 % (chip MMSS de 8 pm) de los espermatozoides. La muestra de semen sin clasificar mostró generación de ERO en 1,8% ± 0,6% de los espermatozoides, lo cual indicaba claramente que el aumento de la generación de ERO en los métodos de lavado y swim-up provenía de las etapas de centrifugación.
Análisis de fragmentación de ADN
El análisis de la fragmentación de ADN de los espermatozoides puede diferenciar hombres fértiles e infértiles y las muestras de espermatozoides que muestran un mayor nivel de fragmentación de ADN dan como resultado tasas de fecundación más bajas en FIV/ICSI, alteración de la progresión embrionaria y menores tasas de embarazo. Los espermatozoides clasificados con chips MMSS se analizaron para determinar la fragmentación de ADN. La fragmentación de ADN (%) fue de 1,1 % ± 0,3 % (MMSS de 8 pm), 2,1 % ± 0,7 % (chip MMSS de 5 pm), 3,4 % ± 0,8 % (chip MMSS de 3 pm), 3,7 % ± 1,2 % (método swim-upj y 31,2 % ± 1,2 % (semen sin clasificar). Los espermatozoides clasificados utilizando chips de 5 pm y 8 pm mostraron una fragmentación de ADN significativamente menor (%) que la muestra de semen sin clasificar y los espermatozoides clasificados utilizando el método swim-up (figura 10).
Exposición
La técnica ideal de clasificación de espermatozoides debería (i) ser rápida y rentable, (ii) ser menos intensiva en términos de mano de obra, (iii) procesar mayores volúmenes de espermatozoides, (iv) tener una mayor eficiencia de recuperación para aislar los espermatozoides mótiles de los espermatozoides muertos/no mótiles, (v) aislar los espermatozoides con mayor velocidad, (vi) aislar los espermatozoides morfológicamente normales y maduros, (vii) reducir la generación de ERO y el daño morfológico al eliminar las etapas de centrifugación, (viii) reducir el porcentaje de fragmentación de ADN de los espermatozoides. Estos parámetros son generalmente características deseables para cualquier dispositivo de clasificación de espermatozoides y el sistema de la presente invención ofrece una plataforma que proporciona estas características.
En el ejemplo particular que se proporciona en el presente documento, el coste total del material para fabricar un chip es menos de un euro (0,56 céntimos por filtro, <0,56 céntimos para PMMA y DSA) (un dólar (50 centavos por filtro, <50 centavos para PMMA y DSA). El chip MMSS aisló rápidamente (aproximadamente 30 minutos) los espermatozoides mótiles de los no mótiles con una tasa de recuperación mayor (28,58 por ciento ± 2,81 por ciento de recuperación de los espermatozoides de reserva) que la técnica swim-up (<20 por ciento). La recuperación se incrementó adicionalmente hasta 52,68 por ciento ± 4,97 (filtro de 8 pm) utilizando una muestra diluida. Si bien la dilución de espermatozoides brindó una mayor recuperación de espermatozoides sanos, esta redujo el volumen de espermatozoides de reserva real que se podría procesar a la vez. Deseablemente, los espermatozoides de reserva se pueden diluir antes del procesamiento para (i) eyaculados de bajo volumen y (ii) eyaculados con un recuento de espermatozoides muy bajo. El diseño del chip MMSs es altamente escalable y puede procesar grandes volúmenes de semen utilizando filtros más grandes (por ejemplo, >1,5 ml). Se necesita procesar una gran muestra de semen para recuperar suficientes espermatozoides para los procedimientos de FIV. Así mismo, el procesamiento de alto volumen es muy importante para las muestras que tienen un recuento bajo de espermatozoides o una motilidad baja de espermatozoides.
Los espermatozoides que tienen parámetros de velocidad mayores pueden aumentar las tasas de fecundación ICSI. Los espermatozoides clasificados mediante el chip MMSS mostraron parámetros de velocidad significativamente mejorados (VCL, VLR y VTP) en comparación con los espermatozoides de reserva que demostraron claramente que los espermatozoides clasificados eran de mayor calidad. La morfología de los espermatozoides es otro indicador importante para una fecundación exitosa. Los espermatozoides morfológicamente normales aumentan la tasa de fecundación durante los procedimientos de FIV. La clasificación de los espermatozoides con un chip MMSS de 8 pm mejoró la morfología de los espermatozoides 1,7 veces, lo cual supone una mejora significativa, como se ilustra en la figura 7. También es interesante señalar la asociación de la motilidad y la morfología de los espermatozoides. Se descubrió que los espermatozoides morfológicamente normales también mostraron mejores velocidades, lo cual demostró que estos dos parámetros funcionales (velocidad y morfología de los espermatozoides) están asociados.
La madurez nuclear de los espermatozoides ha mostrado una asociación con la infertilidad masculina. La condensación de cromatina según lo descrito por la madurez nuclear es otro factor predictivo del resultado de la FIV. Los espermatozoides clasificados con chips MMSS de 8 pm mostraron una madurez de los espermatozoides significativamente mejorada en comparación con la muestra de reserva, como se ilustra en la figura 8. También se investigó la generación de ERO por parte de espermatozoides humanos. La generación de ERO es una herramienta de investigación importante para evaluar la calidad de los espermatozoides y su estado de apoptosis. Existen muchas vías y razones que conducen a la generación de ERO en los espermatozoides, tales como una diferenciación deficiente durante la espermiogénesis, una compacidad deficiente de la cromatina, una exposición a metales pesados, calor o radiaciones electromagnéticas, un cultivo in vitro prolongado y la presencia de espermatozoides en las células generadoras de ERO de las proximidades. Las técnicas convencionales que utilizan etapas de centrifugación para clasificar los espermatozoides sanos son otra razón para la generación de ERO, ya que estas técnicas centrifugan los espermatozoides con células generadoras de ERO, tales como los leucocitos. Se descubrió que los espermatozoides clasificados con los tres chips MMSS mostraron una generación de ERO significativamente baja en comparación con los espermatozoides de reserva.
La fragmentación de ADN es otro indicador muy importante de la infertilidad masculina. De acuerdo con algunos informes, la integridad del ADN de los espermatozoides se puede considerar un marcador independiente de la fecundación. Los espermatozoides clasificados con chips MMSS mostraron una mejora significativa en la fragmentación de ADN en comparación con la muestra de semen sin clasificar, como se muestra en la figura 10. En la actualidad, el método swim-up de espermatozoides se considera estándar para clasificar los espermatozoides con una fragmentación de ADN más baja. Es interesante señalar aquí que los espermatozoides clasificados con chips MMSS de 5 y 8 pm mostraron una fragmentación de ADN cada vez menor que el método swim-up. Se cree, en base a estos ensayos funcionales, que los espermatozoides clasificados con un chip MMSS de 8 pm son de mejor calidad en comparación con los métodos convencionales. La clasificación de espermatozoides morfológicamente normales, maduros, mótiles y funcionales mejoraría potencialmente los resultados de FIV/ICSI.
Haciendo referencia ahora a la figura 11, se proporcionan algunas etapas 100 de ejemplo en un proceso para clasificar espermatozoides. Las etapas 100, que se inicien en el bloque de proceso 102, incluyen recibir una muestra de espermatozoides en una entrada de un sistema microfluídico, tal como el que se ha descrito anteriormente. A partir de entonces, en el bloque de proceso 104, se permite que los espermatozoides de la muestra atraviesen una trayectoria de flujo a través del sistema microfluídico hacia una salida que proporciona acceso al sistema microfluídico para recoger los espermatozoides clasificados del sistema microfluídico. En el bloque de proceso 106, los espermatozoides se someten a un filtro antes de alcanzar la salida. Como se ha descrito, el filtro tiene una pluralidad de microporos y está orientado para restringir el movimiento de los espermatozoides a través del filtro utilizando la gravedad. Por tanto, en el bloque de proceso 108, los espermatozoides clasificados se proporcionan en la salida. Los espermatozoides clasificados incluyen los espermatozoides que pasan a la salida después de pasar a través del filtro y vencer la gravedad.
Por tanto, la presente divulgación proporciona un sistema y métodos para (i) el desarrollo de un sistema libre de químicos y libre de flujo para clasificar espermatozoides sanos, analizar la motilidad, la velocidad y la morfología, (ii) el aislamiento de los espermatozoides sanos clasificados, y (iii) el desarrollo de una mejor comprensión del agotamiento y el movimiento colectivo de los espermatozoides. Esta plataforma es una innovación más allá de los procedimientos clínicos existentes, tales como las técnicas swim-up y de microgota. También es novedosa más allá de los dispositivos de clasificación de espermatozoides basados en microfluidos informados, ya que utiliza un nuevo conocimiento innovador sobre el agotamiento en canales con limitaciones de espacio para clasificar y analizar los espermatozoides. Dado que la medicina reproductiva clínica ha sido un campo desafiante que requiere mucha mano de obra, un microchip tan fácil de utilizar puede conducir a una mejor selección de espermatozoides sanos y una menor dependencia de las habilidades del operador, facilitando etapas operativas repetibles y fiables.
La presente invención se ha descrito en términos de una o más realizaciones preferentes y se debería apreciar que la invención está definida por el alcance de las reivindicaciones.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un sistema (10) para clasificar espermatozoides que comprende:
un alojamiento (12) que incluye un componente inferior y un componente superior acoplados entre sí;
un sistema microfluídico soportado por el alojamiento (12);
una entrada (14) que se extiende a través del componente inferior y que proporciona acceso al sistema microfluídico para suministrar espermatozoides al sistema microfluídico;
una cámara de recolección (16) configurada para hacer pasar los espermatozoides mótiles para recoger y restringir los espermatozoides no mótiles, incluyendo la cámara de recolección (16) una primera cámara (24) que se extiende a través del componente inferior y una segunda cámara (26) que se extiende a través del componente superior y situada por encima de la primera cámara (24);
al menos un canal que se extiende desde la entrada (14) hasta la cámara de recolección (16) para permitir que los espermatozoides suministrados al sistema microfluídico a través de la entrada (14) progresen a lo largo de una trayectoria de flujo (20) hacia la cámara de recolección (16);
un filtro (18) que incluye una pluralidad de microporos y dispuesto en la cámara de recolección (16) para provocar que los espermatozoides que viajan a lo largo de la trayectoria de flujo (20) se muevan contra el filtro (18) y la gravedad para alcanzar la segunda cámara (26); y
una cámara de concentración (25) que se extiende hacia el componente superior y conectada a la segunda cámara (26), estando la cámara de concentración (25) configurada para concentrar los espermatozoides mótiles procedentes de la segunda cámara (26) y para facilitar la recogida de la cámara de concentración (25).
2. El sistema (10) de la reivindicación 1, en donde la pluralidad de microporos tiene un tamaño para permitir que una cabeza de los espermatozoides pase a su través.
3. El sistema (10) de la reivindicación 1, en donde la pluralidad de microporos incluye microporos que tienen un tamaño de al menos 1 pm o un tamaño de menos de 10 pm.
4. El sistema (10) de la reivindicación 1, en donde el filtro (18) incluye un filtro de policarbonato.
5. El sistema (10) de la reivindicación 1, en donde el filtro (18) es un primer filtro (18) dispuesto dentro de la primera cámara (24) y que comprende, además, un segundo filtro (18) dispuesto dentro de la segunda cámara (26).
6. El sistema (10) de la reivindicación 5, en donde la primera cámara (24) está configurada para recolectar semen en bruto asociado con los espermatozoides y la segunda cámara (26) está configurada para hacer pasar los espermatozoides mótiles y restringir los espermatozoides no mótiles.
7. El sistema (10) de la reivindicación 1, que comprende, además, un sistema de formación de imágenes configurado para formar imágenes de los espermatozoides dentro de la trayectoria de flujo (20) y que incluye al menos una luz (30) configurada para iluminar los espermatozoides dentro de la trayectoria de flujo (20) y un sensor de formación de imágenes (31) dispuesto próximo a la trayectoria de flujo (20) para formar imágenes de los espermatozoides.
8. El sistema (10) de la reivindicación 7, en donde el sistema de imágenes está configurado para registrar una imagen de sombra de los espermatozoides a lo largo de la trayectoria de flujo (20).
9. El sistema (10) de la reivindicación 1, en donde el componente inferior y el componente superior comprenden polimetilmetacrilato (PMMA).
10. Un método para clasificar espermatozoides que comprende:
suministrar una muestra de espermatozoides a una entrada (14) conectada a un sistema microfluídico que está soportado por un alojamiento (12), extendiéndose la entrada (14) a través de un componente inferior del alojamiento (12);
permitir que los espermatozoides en la muestra de espermatozoides atraviesen una trayectoria de flujo (20) a través del sistema microfluídico desde la entrada (14) hasta una cámara de recolección (16) que proporciona acceso al sistema microfluídico para recoger los espermatozoides clasificados del sistema microfluídico, incluyendo la cámara de recolección (16) una primera cámara (24) que se extiende a través del componente inferior del alojamiento (12) y una segunda cámara (26) que se extiende a través de un componente superior del alojamiento (12) y situada por encima de la primera cámara (24);
filtrar los espermatozoides utilizando un filtro (18) situado en la cámara de recolección (16), teniendo el filtro (18) microporos;
restringir adicionalmente el movimiento de los espermatozoides a través del filtro (18) por gravedad; permitir que los espermatozoides, después de pasar a través del filtro (18) y vencer la gravedad, se concentren en una cámara de concentración (25) que se extiende hacia el compartimento superior y conectada a la segunda cámara (26); y
recoger los espermatozoides de la cámara de concentración (25).
11. El método de la reivindicación 10, que comprende, además, restringir que los espermatozoides no mótiles alcancen la segunda cámara (26) utilizando el filtro (18) y la gravedad.
12. El método de la reivindicación 10, que comprende, además, restringir que los espermatozoides no mótiles alcancen la segunda cámara (26) utilizando el filtro (18) en la primera cámara (24), otro filtro en la segunda cámara (26) y la gravedad.
13. El método de la reivindicación 10, que comprende, además, formar imágenes de los espermatozoides dentro del sistema microfluídico.
14. El método de la reivindicación 13, en donde formar imágenes de los espermatozoides incluye registrar una imagen de sombra de los espermatozoides a medida que los espermatozoides atraviesan la trayectoria de flujo utilizando al menos una luz (30) configurada para iluminar los espermatozoides dentro de la trayectoria de flujo y un sensor de formación de imágenes (31) dispuesto próximo a la trayectoria de flujo (20).
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