JPWO2012039438A1 - 植物ベンジルイソキノリンアルカロイドの生産方法 - Google Patents
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Abstract
Description
該組換え宿主細胞を、炭素源としてグルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、ラクトースおよびマルトースからなる群より選択される1種以上の糖および/またはグリセロールを含む培地において培養する工程、
を含む、(S)-レチクリンを生産する方法を提供する。
該組換え宿主細胞を、炭素源としてグルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、ラクトースおよびマルトースからなる群より選択される1種以上の糖および/またはグリセロールを含む培地において培養する工程、
を含む、(S)-レチクリンを生産する方法をさらに提供する。
該組換え宿主細胞を、炭素源としてグルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、ラクトースおよびマルトースからなる群より選択される1種以上の糖および/またはグリセロールを含む培地において培養する工程、
を含む、(S)-レチクリンを生産する方法を提供する。
該組換え宿主細胞を、炭素源としてグルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、ラクトースおよびマルトースからなる群より選択される1種以上の糖および/またはグリセロールを含む培地において培養する工程、
を含む、イソキノリンアルカロイドを生産する方法を提供する。
(i) tyrR遺伝子を有しないかまたはその機能が欠損しているものであること、
(ii) fbr-DAHPS および/または fbr-CM/PDH を発現するものであること、
(iii) TKT および/または PEPS を過剰発現するものであること。
これらの性質を有することにより、該組換え宿主細胞における L-チロシンの生産性が向上し、(S)-レチクリンないし他のイソキノリンアルカロイドの収量を増大させることができる。
該組換え宿主細胞を、炭素源としてグルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、ラクトースおよびマルトースからなる群より選択される1種以上の糖および/またはグリセロールを含む培地において培養する工程、
を含む、(S)-レチクリンを生産する方法をさらに提供する。
(1) 宿主細胞が有する tyrR遺伝子の機能喪失(loss of function)または tyrR遺伝子の発現抑制(ここにいう機能喪失には、完全な機能喪失と部分的な機能喪失が含まれる);
(2) fbr-DAHPS および/または fbr-CM/PDH をコードする1以上の遺伝子の宿主細胞への導入および宿主細胞における発現;
(3) TKT および/または PEPS をコードする1以上の遺伝子の宿主細胞への導入および宿主細胞における過剰発現。
ここで、tyrR遺伝子の機能は、当該技術分野における公知の手段、例えば相同組換えを利用したノックイン/ノックアウト、トランスポゾン等の転移因子の転移を利用した遺伝子破壊等によって喪失させることができる。また、tyrR遺伝子の発現は、当該技術分野における公知の手段、例えばコサプレッション、アンチセンス法、RNAiなどによって抑制することができる。
(1) tyrR遺伝子を有しないかまたはその機能が欠損している宿主細胞に、TYR等の必要な遺伝子を導入すること、
(2) 宿主細胞が有するtyrR遺伝子の機能を喪失させた後、該宿主細胞にTYR等の必要な遺伝子を導入すること、または
(3) 宿主細胞にTYR等の必要な遺伝子を導入した後、該宿主細胞が有するtyrR遺伝子の機能を喪失させること。
(1) これら全ての遺伝子を宿主細胞に導入すること、または
(2) 「fbr-DAHPS、fbr-CM/PDH、TKT、PEPS、TYRまたはTYRおよびそのアダプタータンパク質、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMT ならびに 4'OMT」からなる群より選択されるタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子を有している宿主細胞に、当該群に含まれる他の全ての遺伝子を導入すること。
(a) 配列番号2、3、4、5、6もしくは36もしくは37、7、8、9もしくは10、11、12、13、14、15、16または17のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b) 配列番号2、3、4、5、6もしくは36もしくは37、7、8、9もしくは10、11、12、13、14、15、16または17のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、fbr-DAHPS、fbr-CM/PDH、TKT、PEPS、TYR、ORF378、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4'OMT、CYP80G2、P450レダクターゼまたは BBE の酵素活性を有するタンパク質。
(b') 配列番号2、3、4、5、6もしくは36もしくは37、7、8、9もしくは10、11、12、13、14、15、16または17のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列に対して、70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、fbr-DAHPS、fbr-CM/PDH、TKT、PEPS、TYR、ORF378、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4'OMT、CYP80G2、P450レダクターゼまたは BBE の酵素活性を有するタンパク質。
(a) 配列番号2、3、4、5、6もしくは36もしくは37、7、8、9もしくは10、11、12、13、14、15、16または17のヌクレオチド配列からなるDNA;
(b)(a)のヌクレオチド配列からなるDNAと相補的なヌクレオチド配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、fbr-DAHPS、fbr-CM/PDH、TKT、PEPS、TYR、ORF378、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4'OMT、CYP80G2、P450レダクターゼまたは BBE の酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(c) 配列番号2、3、4、5、6もしくは36もしくは37、7、8、9もしくは10、11、12、13、14、15、16または17のヌクレオチド配列に対して、70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、fbr-DAHPS、fbr-CM/PDH、TKT、PEPS、TYR、ORF378、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4'OMT、CYP80G2、P450レダクターゼまたは BBE の酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
全ての合成遺伝子は、GenScript Inc. から入手した。(R,S)-ノルラウダノソリンは、Acros Organics から購入した。L-チロシン、L-DOPAおよびドーパミンは、Sigma-Aldrich から購入した。(R,S)-レチクリンは、三井化学株式会社から寄贈されたものを使用した。
tyrAfbr-aroGfbr-tktA-ppsA/pCOLADuet-1 の構築
L-チロシンを過剰生産する宿主細胞を作出するために、以下の4つの遺伝子を含む発現ベクターを構築した:tyrAfbr(fbr-CM/PDH)、aroGfbr(fbr-DAHPS)、tktA(TKT)および ppsA(PEPS)。
tktA および ppsA 遺伝子を、大腸菌 K-12 MG1655 のゲノムDNAから、それぞれ NdeI-tktA-F(配列番号18)と tktA-XhoI-R(配列番号19)のプライマーセットおよび NdeI-ppsA-F(配列番号20)と ppsA-XhoI-R(配列番号21)のプライマーセット(表1)を用いて増幅した。NdeI-XhoI を用いた制限酵素消化の後、tktA および ppsA 遺伝子を個別に、それぞれ pET-41a(Novagen)および pCOLADuet-1(Merck)の NdeI-XhoI 部位へクローニングした。
ノルラウダノソリンの合成経路を再構築するため、以下の4つの酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクターを構築した: Streptomyces castaneoglobisporus のチロシナーゼ(TYR)(TYRの完全な活性のため、TYRおよびそのアダプタータンパク質ORF378を共発現させる)、Pseudomonas putida の L-DOPA特異的デカルボキシラーゼ(DODC)、Micrococcus luteus のモノアミンオキシダーゼ(MAO)およびオウレン(Coptis japonica)のノルコクラウリンシンターゼ(NCS)。
骨格の異なるプラスミドを有する宿主細胞の間で生産を比較するために、pET-21d(Novagen)プラスミドに基づくベクターを作成した。
pGS-21a 中にクローニングされた、Ralstonia solanacearumのTYR(RsTYR)遺伝子(配列番号37)を、GenScript Inc.から購入した。このコンストラクトにおいては、RsTYR遺伝子のコドン使用頻度が最適化されている。上記の NCS-ORF378-TYR-DODC-optMAO/pKK223-3 および NCS-ORF378-TYR-DODC-optMAO/pET-21d の構築と同じ手順に従い(プライマーも同一のものを使用)、Streptomyces castaneoglobisporusのTYR遺伝子およびORF378の代わりに該RsTYR遺伝子(配列番号37)の配列を用いて、NCS-RsTYR-DODC-optMAO/pKK223-3 および NCS-RsTYR-DODC-optMAO/pET-21d を作成した(図11、後者のコンストラクトのみを示す)。
ノルラウダノソリンからレチクリンを合成する経路を再構築するため、前述の特開2009−225669号公報および Minami, H. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 7393-7398 (2008) に記載される方法に従って、オウレン(C. japonica)の 6OMT、4'OMT および CNMT 遺伝子を含む発現ベクター pACYC184(6OMT-4'OMT-CNMT/pACYC184)を構築した(図8)。
まず、L-チロシンを過剰生産する宿主細胞を作出するため、Lutke-Eversloh, T., and Gregory Stephanopoulos, G., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2007) 75:103-110 に記載されている L-チロシンを過剰生産する大腸菌株の遺伝的構成を採用した。具体的には、tyrR遺伝子中にノックアウト突然変異を有し、tyrAfbr、aroGfbr、tktA および ppsA を発現するプラスミドを有する大腸菌株を作出した。
宿主細胞を液体 LB培地中において 37℃で終夜培養し、10 mL の細胞培養物を、1 Lの改変した常套の培地(3 Lのジャーファーメンター(BMS-03PI、ABLE)中において、1リットルあたり以下を含む: 47.6 g の Turbo Broth(商標)(Athena Enzyme System)、1.6 g の NH4Cl、2.49 mg の CuSO4・5H2O、3 g のグルコースまたは 5 g のグリセロール、50 mg のアンピシリン、25 mg のカナマイシン、および 50 mg のクロラムフェニコール)に接種した。
製造元の説明書に従い、グルコースCII−テストワコー(和光純薬工業株式会社)を用いてムタロターゼ−グルコース法によって培地中のグルコースを解析した。製造元の説明書に従い、Glycerol Assay Kit(Cayman Chemical Co.)を用いて培地中のグリセロールを解析した。
Oasis HLB 固相抽出カートリッジ(Waters)および HPLC により、培養上清から(S)-レチクリンを精製した。培養上清をロードする前に、該カートリッジを水で前平衡化した。カートリッジを 5% のメタノールで洗浄し、その後 100% のメタノールを用いて(S)-レチクリンを溶出した。溶出液を、上記の条件において、TSKgel ODS-80Ts カラムを備える HPLC に供試した。(S)-レチクリンに相当するピーク画分を回収し、その後、精製の程度を MS 解析によって確認した。
組換え宿主細胞による(S)-レチクリンの生産
上記の通りに作出した2種の組換え大腸菌株(tyrR::null 変異を有し、発現プラスミド tyrAfbr-aroGfbr-tktA-ppsA/pCOLADuet-1、NCS-ORF378-TYR-DODC-optMAO/pET-21d および 6OMT-4'OMT-CNMT/pACYC184 を有する「組換え生産株A」、および、L-チロシンの生産に関わる代謝経路が改変されておらず、発現プラスミド NCS-ORF378-TYR-DODC-optMAO/pET-21d および 6OMT-4'OMT-CNMT/pACYC184 を有する「組換え生産株B」)を、炭素源としてグルコースを含む培地を用いてジャーファーメンター中において培養し、レチクリンの生産を測定するために培地を様々な時点において回収した。
Claims (15)
- L-チロシンを生産する代謝経路を有するイソキノリンアルカロイド非生産性細胞に、チロシナーゼまたはチロシナーゼおよびそのアダプタータンパク質、L-DOPA特異的デカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン 6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼならびに3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン-4'-O-メチルトランスフェラーゼからなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子が導入されてなる、チロシナーゼまたはチロシナーゼおよびそのアダプタータンパク質、L-DOPA特異的デカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン 6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼならびに3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン-4'-O-メチルトランスフェラーゼを発現する組換え宿主細胞を提供する工程、および
該組換え宿主細胞を、炭素源としてグルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、ラクトースおよびマルトースからなる群より選択される1種以上の糖および/またはグリセロールを含む培地において培養する工程、
を含む、(S)-レチクリンを生産する方法。 - 組換え宿主細胞が、tyrR遺伝子を有しないかまたはその機能が欠損しているものである、請求項1に記載の方法。
- 組換え宿主細胞が、さらにフィードバック阻害耐性の3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸シンターゼおよび/またはフィードバック阻害耐性のコリスミ酸ムターゼ/プレフェナートデヒドロゲナーゼを発現するものである、請求項1または2に記載の方法。
- 組換え宿主細胞が、さらにトランスケトラーゼおよび/またはホスホエノールピルビン酸シンテターゼを過剰発現するものである、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- L-チロシンを生産する代謝経路を有するイソキノリンアルカロイド非生産性細胞に、フィードバック阻害耐性の3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸シンターゼ、フィードバック阻害耐性のコリスミ酸ムターゼ/プレフェナートデヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ、チロシナーゼまたはチロシナーゼおよびそのアダプタータンパク質、L-DOPA特異的デカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン 6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼならびに3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン-4'-O-メチルトランスフェラーゼからなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子が導入されてなる組換え宿主細胞であって、フィードバック阻害耐性の3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸シンターゼ、フィードバック阻害耐性のコリスミ酸ムターゼ/プレフェナートデヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ、チロシナーゼまたはチロシナーゼおよびそのアダプタータンパク質、L-DOPA特異的デカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン 6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼならびに3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン-4'-O-メチルトランスフェラーゼを発現し、かつ、tyrR遺伝子を有しないかまたはその機能が欠損している組換え宿主細胞を提供する工程、および
該組換え宿主細胞を、炭素源としてグルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、ラクトースおよびマルトースからなる群より選択される1種以上の糖および/またはグリセロールを含む培地において培養する工程、
を含む、(S)-レチクリンを生産する方法。 - 得られるレチクリンが、実質的に(R)-レチクリンを含まないものであることを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- イソキノリンアルカロイド非生産性細胞が、大腸菌、酵母、枯草菌および糸状菌からなる群より選択される、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 組換え宿主細胞に、L-DOPA特異的デカルボキシラーゼ以外の芳香族L-アミノ酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が導入されていないことを特徴とする、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- L-チロシンを生産する代謝経路を有するイソキノリンアルカロイド非生産性細胞に、チロシナーゼまたはチロシナーゼおよびそのアダプタータンパク質、L-DOPA特異的デカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン 6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼならびに3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン-4'-O-メチルトランスフェラーゼからなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子が導入されてなる、チロシナーゼまたはチロシナーゼおよびそのアダプタータンパク質、L-DOPA特異的デカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン 6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼならびに3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン-4'-O-メチルトランスフェラーゼを発現する組換え宿主細胞。
- tyrR遺伝子を有しないかまたはその機能が欠損しているものである、請求項9に記載の組換え宿主細胞。
- さらにフィードバック阻害耐性の3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸シンターゼおよび/またはフィードバック阻害耐性のコリスミ酸ムターゼ/プレフェナートデヒドロゲナーゼを発現するものである、請求項9または10に記載の組換え宿主細胞。
- さらにトランスケトラーゼおよび/またはホスホエノールピルビン酸シンテターゼを過剰発現するものである、請求項9〜11のいずれかに記載の組換え宿主細胞。
- L-チロシンを生産する代謝経路を有するイソキノリンアルカロイド非生産性細胞に、フィードバック阻害耐性の3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸シンターゼ、フィードバック阻害耐性のコリスミ酸ムターゼ/プレフェナートデヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ、チロシナーゼまたはチロシナーゼおよびそのアダプタータンパク質、L-DOPA特異的デカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン 6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼならびに3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン-4'-O-メチルトランスフェラーゼからなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子が導入されてなる組換え宿主細胞であって、フィードバック阻害耐性の3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸シンターゼ、フィードバック阻害耐性のコリスミ酸ムターゼ/プレフェナートデヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ、チロシナーゼまたはチロシナーゼおよびそのアダプタータンパク質、L-DOPA特異的デカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン 6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼならびに3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン-4'-O-メチルトランスフェラーゼを発現し、かつ、tyrR遺伝子を有しないかまたはその機能が欠損している、組換え宿主細胞。
- 大腸菌、酵母、枯草菌および糸状菌からなる群より選択される、請求項9〜13のいずれかに記載の組換え宿主細胞。
- L-DOPA特異的デカルボキシラーゼ以外の芳香族L-アミノ酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が導入されていないことを特徴とする、請求項9〜14のいずれかに記載の組換え宿主細胞。
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