JP6531455B2

JP6531455B2 - ベタキサンチンの製造方法

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Publication number: JP6531455B2
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Authority: JP
Inventors: 恭士山本; 康平宮奥
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Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
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Filing date: 2015-03-25
Publication date: 2019-06-19
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Description

本発明は、ベタレイン色素の一群であるベタキサンチンの製造方法に関する。

ベタレイン色素とは、天然では、ナデシコ目の植物およびある種の高等菌類にのみ含まれ、その化学構造中に窒素を含有することを特徴とする水溶性の色素である。ベタレイン色素は、構造上の特徴からベタキサンチンとベタシアニン類に分類されている。ベタキサンチンは黄色に発色し、ベタシアニン類は赤紫に発色するため従来から天然着色料として利用されている。

近年、ベタレイン色素が強力な抗酸化作用を有することが見出され、抗酸化剤としての活用も検討されている。さらに、ベタレイン色素が太陽エネルギーを効率よく吸収する性質を有することも見出され、色素増感型太陽電池の増感色素等への利用も期待されている。このベタレイン色素の製造方法としては、植物から抽出し、精製する方法が一般的であるが、ベタレイン色素を含む植物は、マツバギク、ビート、サボテンなどのナデシコ目（ツルナ科、ヒユ科、スベリヒユ科、ツルムラサキ科、サボテン科、アカザ科、オシロイバナ科など）に限られている。そのため、高価であり、また、安定して供給することも難しい。

近年、新たなベタレイン色素の製造方法として、各種キノコが含まれる担子菌類等の菌類由来のチロシナーゼ遺伝子およびオシロイバナ由来のＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）４，５−ジオキシゲナーゼ遺伝子を、植物プロモーターの制御
下で導入した形質転換植物細胞を用いたベタキサンチンの製造方法が報告されている（特許文献１）。

また、チロシナーゼをコードする遺伝子としては、植物や微生物由来のものが数多く知られており（非特許文献１）、ＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子
としては、オシロイバナやテンサイ由来のものが知られている（非特許文献２、３）。

特開２０１２−５５２０８号公報

Michael Fairhead et al, New Biotechnology, Volume 29, Issue 2, 15 January 2012, p.183-191 Sasaki N. et al, Plant Cell Physiol. 50(5):1012-1026 (2009) Fernando Gandia-Herrero et al, Planta(2012) 236:91-100

現在、一般的に用いられている植物からベタレイン色素を抽出する製造方法では、上述のとおり、ごく限られた植物から抽出する必要があること、それらの植物においても含有量が極めて少ないこと等により、安定して持続的に供給することが難しく、かつ製造コストが高いものとなっている。また、特許文献１に記載の植物細胞を用いた方法では、植物細胞の細胞増殖速度が極めて遅いため、生産効率が低く、工業化は難しいものと考えられる。

また、チロシナーゼをコードする遺伝子（非特許文献１）や、ＤＯＰＡ４，５−ジオ
キシゲナーゼをコードする遺伝子（非特許文献２、３）をそれぞれ単独で大腸菌や酵母などの微生物へ導入し、それぞれの酵素活性を個別に確認した例が知られている。しかし、これら２種類の遺伝子を同時に微生物へ導入した例は知られておらず、これら２種類の遺伝子を導入した微生物を用いてグルコースなどの基質からベタレイン色素の一群であるベタキサンチンが一貫生産されることを確認した例もこれまで知られていない。

本発明は、安定して供給することができ、かつ、工業化可能なベタキサンチンの製造方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ベタキサンチンの生合成に必須である、チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性、およびＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有する微生物の作製に成功し、当該微生物を用い、効率よくベタキサンチンを製造できることを見出し、本発明を完成させた。

即ち、本発明の要旨は、以下の（１）〜（８）に存する。
（１）チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性、およびＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有する微生物またはその処理物の存在下、水性媒体中で原料をベタキサンチンへと変換する工程（変換工程）を有することを特徴とする、ベタキサンチンを製造する方法。
（２）前記変換工程の前に、チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性、およびＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有する微生物を水性媒体中で培養する工程
（培養工程）を有することを特徴とする（１）に記載のベタキサンチンを製造する方法。（３）前記変換工程の後に、前記水性媒体からベタキサンチンを回収する工程を有することを特徴とする（１）または（２）に記載のベタキサンチンを製造する方法。
（４）前記チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素がチロシナーゼであることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれかに記載のベタキサンチンを製造する方法。
（５）前記変換工程において、前記微生物として休止菌体を用いることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載のベタキサンチンを製造する方法。
（６）前記原料がチロシン、および／または糖質原料であることを特徴とする、（１）〜（５）のいずれかに記載のベタキサンチンを製造する方法。
（７）前記原料に加えて、チロシン以外のアミノ酸またはアミンを添加することを特徴とする（１）〜（６）のいずれかに記載のベタキサンチンを製造する方法。
（８）前記変換工程において、前記水性媒体が、アスコルビン酸、銅および鉄からなる群から選ばれる少なくとも一種を含むことを特徴とする、（１）〜（７）のいずれかに記載のベタキサンチン類を製造する方法。

本発明によれば、グルコースやアミノ酸などの安価な原料から効率良くベタレイン色素の一群であるベタキサンチンを製造することができ、さらに、安定して供給することも可能となる。
また、本発明により得られたベタキサンチンは、色素増感型太陽電池の色素増感剤、抗酸化剤等の広範な各種用途に好適に用いることができる。

実施例１においてＥ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）／ＢＭＴＹＲ／ＭｊＤＯＤを用いた場合に得られたＬＣ／ＭＳ分析結果を示す。実施例１においてＥ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）／ＢＴＴＹＲ／ＭｊＤＯＤを用いた場合に得られたＬＣ／ＭＳ分析結果を示す。実施例１においてＥ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤを用いた場合に得られたＬＣ／ＭＳ分析結果を示す。実施例２（Ｌ−バリン）において得られたＬＣ／ＭＳ分析結果を示す。実施例２（Ｌ−バリン）において反応開始後２４時間までの生成量の変化を示す。実施例９（（Ｓ）−α−プロパルギルアラニン）において得られたＬＣ／ＭＳ分析結果を示す。実施例９（（Ｓ）−α−プロパルギルアラニン）において反応開始後２４時間までの生成量の変化を示す。実施例１９においてＥ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）ΔｔｙｒＲ：：Ｋａｎ／ＴｙｒＡ^ｆｂｒ＋ＡｒｏＧ^ｆｂｒ／ＢＭＴＹＲ＋ＭｊＤＯＤを用いた場合に得られたＬＣ／ＭＳ分析結果を示す。実施例１９においてＥ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）ΔｔｙｒＲ：：Ｋａｎ／ＴｙｒＡ^ｆｂｒ＋ＡｒｏＧ^ｆｂｒ／ＲＳＴＹＲ＋ＭｊＤＯＤを用いた場合に得られたＬＣ／ＭＳ分析結果を示す。実施例２０においてＹＰＨ５００／ＢＭＴＹＲ／ＭｊＤＯＤを用いた場合に得られたＬＣ／ＭＳ分析結果を示す。実施例２０においてＹＰＨ５００／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤを用いた場合に得られたＬＣ／ＭＳ分析結果を示す。本発明の微生物が有する代謝経路の一例を示す。

本発明は、ベタレイン色素の一群であるベタキサンチンを製造する方法に関するものであり、チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性、およびＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有する微生物またはその処理物の存在下、水性媒体中で原料をベタキサンチンへと変換する工程（変換工程）を有することを特徴とする。
ここで、ＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼとは、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン：オキシゲン４，５−オキシドレダクターゼのことである。
ここでベタキサンチンは、ベタラミン酸に、アミノ酸またはアミンがイミン結合した化合物群の総称であり、その構造は、以下の式（１）または式（２）として表される。

式（１）、（２）においてＲ_１、Ｒ_２およびＲ_３は、水素原子、炭素数１〜４０の直鎖または分岐鎖または環状の飽和もしくは不飽和炭化水素基からなる群から選択される１種である。ただし該炭化水素基の水素原子の一部または全部は、ハロゲン原子、アシル基、アミド基、アミノ基、アルコキシ基、アルデヒド基、イミダゾール基、インドール基、オキソ基、カルボキシル基、グアニジノ基、シアノ基、スルホ基、チオール基、ニトロ基、ヒドロキシル基およびフェニル基からなる群から選択される少なくとも一種で置換されていてもよく、該炭化水素基は、イミニウムの窒素を含有する形で環を形成していてもよい。さらに該イミダゾール基、該インドール基および該フェニル基の芳香環の一部または全部は、上記と同様の置換基群から選択される少なくとも一種にて置換されていてもよい。また、該炭化水素基の炭素原子の一部は、硫黄原子、酸素原子、窒素原子、リン原子から選択される少なくとも一種で置換されていてもよい。

例えば、Ｒ_１が水素原子、Ｒ_２が炭素数３の直鎖炭化水素基であり、イミニウムの窒素を含有する形で環を形成する化合物は、プロリン−ベタキサンチンである。また、Ｒ_１が水素原子、Ｒ_２が炭素数３の直鎖炭化水素基であり、該炭化水素基の末端の水素原子の一つがグアニジノ基で置換された化合物は、アルギニン−ベタキサンチンである。Ｒ_１が水素原子、Ｒ_２が炭素数１の炭化水素基であり、該炭化水素基の水素原子の一つがイミダゾール基で置換された化合物は、ヒスチジン−ベタキサンチンである。Ｒ_１が水素原子、Ｒ_２が炭素数４の直鎖炭化水素基であり、該炭化水素基の末端から２番目の炭素原子が硫黄原子に置換された化合物は、メチオニン−ベタキサンチンである。Ｒ_１が水素原子、Ｒ_２が炭素数１の炭化水素基であり、該炭化水素基の水素原子の一つがインドール基で置換された化合物は、トリプトファン−ベタキサンチンである。Ｒ_１が水素原子、Ｒ_２が炭素数１の炭化水素基であり、該炭化水素基の水素原子の一つがフェニル基で置換され、さらに該フェニル基のパラ位の水素原子がヒドロキシル基で置換された化合物は、チロシン−ベタキサンチンである。

［本発明で用いる微生物またはその処理物］
本発明で用いる微生物（以下、「本発明の微生物」と称することがある。）は、チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性、およびＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有する。

本発明の微生物は、チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性、およびＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有するものあれば特に制限はなく、本来的にこれらの酵素活性を有する微生物であってもよいし、育種によりこれらの酵素活性を付与したものであってもよい。育種によりこれらの酵素活性を付与する手段としては、変異処理や遺伝子組換え処理などが挙げられ、有機化合物の生合成経路における酵素遺伝子の発現強化や副生物生合成経路における酵素遺伝子の発現低減など、公知の方法を採用することができる。

本発明の製造方法は、例えば、図１２に示す代謝経路を有する微生物を用いることでベタキサンチンを製造することができる。図１２においてＳｐと表記されている化学反応は酵素が不要な自発反応である。よって、少なくともチロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性、およびＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有する微生物を用いれば、図１２に示す経路でベタキサンチンを製造することができる。ここで、Ｓｐと表記されている反応は酵素反応ではないことから、必ずしも微生物の代謝において行われる必要はない。例えば、微生物により生産させたベタラミン酸を菌体外へと取り出し、適切な溶媒中で試薬のアミノ酸やアミンと混合させることでベタキサンチンを製造することが可能である。

本発明における微生物は、生きている微生物に限らず、生体としては死んでいるが酵素活性を有するものも含む。
また、本発明における微生物の処理物としては、アセトン、トルエン等で処理した菌体、凍結乾燥菌体、菌体破砕物、菌体を破砕した無細胞抽出物、精製酵素（部分的に精製した酵素を含む。）等が挙げられる。また、これらの微生物の処理物を、常法により担体に固定化した固定化物も処理物に含まれる。
以下、本発明で用いる微生物について説明する。

（チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性）
チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性とは、チロシンが有するフェノール環の３位に水酸基を付加することができる酵素活性である。この酵素活性を有するか否かは、発現されたタンパク質が、チロシンの３位を水酸化する活性を通常のアッセイ方法で測定することにより判定が可能である。例えば、チロシンに、測定の対象とする酵素を作用させ、チロシンから変換されたＬ−ＤＯＰＡ量を直接的に測定することで、その酵素活性を確認することができる。

チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素としては、例えば、チロシナーゼ、シトクロムＰ４５０、カテコールオキシダーゼ、チロシン３‐モノオキシゲナーゼ、芳香環水酸化ジオキシゲナーゼ等が挙げられる。

チロシナーゼとしては、エアロモナス・メディア菌（Aeromonas media）、マッシュル
ーム（Agaricus bisporus）、アゾスピリラム菌（Azospirillum sp.）、バチルス・メガ
テリウム菌（Bacillus megaterium）、バチルス・スリンジェンシス菌（Bacillus thuringiensis）、テンサイ（Beta vulgaris）、キャベツ（Brassica oleracea）、チャノキ（Camellia sinensis）、アラビカコーヒーノキ（Coffea arabica）、アサイー（Euterpe oleracea）、ヒト（Homo sapiens）、レタス（Lactuca sativa）、マリノモラス・メディテラニア菌（Marinomonas mediterranea）、ハツカネズミ（Mus musculus）、ニューロスポラ・クラッサ菌（Neurospora crassa）、タバコ（Nicotiana tabacum）、ナメコ（Pholiota nameko）、シュードモナス・プチダＦ６菌（Pseudomonas putida F6）、ラルストニア・ソラナセアラム菌（Ralstonia solanacearum）、リゾビウム・エトリ菌（Rhizobium etli）、トマト（Solanum lycopersicum）、ナス（Solanum melongena）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、ストレプトマイセス・アンチバイオティカス（Streptomyces antibioticus）、ストレプトマイセス・カスタネオグロビスポラス菌（Streptomyces castaneoglobisporus）、ストレプトマイセス・グロセッセンス菌（Streptomyces glauescens）、ストレプトマイセス・リンコルネンシス菌（Streptomyces lincolnensis）、ストレプト
マイセス・リビダンス菌（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス属ＲＥＮ−
２１菌（Streptomyces sp.REN-21）、サーモミクロビウム・ロゼウム菌（Thermomicrobium roseum）、バニラ（Vanilla planifolia）、ベルコミクロビウム・スピノサム菌（Verrucomicrobium spinosum）、ソラマメ（Vicia faba）、ヨーロッパブドウ（Vitis vinifera）等に由来する酵素が挙げられる。中でも、バチルス・メガテリウム菌、バチルス・ス
リンジェンシス菌、ラルストニア・ソラナセアラム菌に由来するものが好ましい。

シトクロムＰ４５０としては、アースロバクター属菌（Arthrobacter spp.）、アスコ
キタ属菌（Ascochyta spp.）、アスペルギルス・フラバス菌（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・ニドランス菌（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー菌（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼ菌（Aspergillus oryze）、バチルス・メガテリウム菌（Bacillus megaterium）、カルダリオミセス・フマゴ菌（Caldariomyces fumago）、カンジダ・アルビカンス菌（Candida albicans）、カンジダ・マルトーサ菌（Candida maltosa）、カンジダ・トロピカリス菌（Candida tropicalis）、フザリウム属菌（Fusarium spp.）、フザリウム・オキシスポラム菌（Fusarium oxysporum）、フザリウム
・スポロトリキオイデス菌（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・バーティシリ
オイデス菌（Fusarium verticillioides）、マイクロコッカス属菌（Micrococcus spp.）、モルティエレラ・イサベリナ菌（Mortierella isabellina）、マイコバクテリウム・チューバキュロシス菌（Mycobacterium tuberculosis）、ネクトリア・ハエマトコッカ菌（Nectria haematoccoca）、ネウロスポラ・クラッサ菌（Neurospora crassa）、ノカルデ
ィア属菌（Nocardia spp.）、ファネロケーテ・クリソスポリウム菌（Phanerochaete chrisosporium）、シュードモナス・プチダ菌（Pseudomonas putida）、ストレプトマイセス属菌（Streptomyces spp.）、リゾビウム属菌（Rhizobium spp.）、サッカロミセス・セ
レビシエ菌（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・ポンベ菌（Saccharomyces pombe）、ストレプトミセス・エバーミチリス菌（Streptomyces avermitilis）、スト
レプトミセス・セリカラー菌（Streptomyces coelicolor）、スルホロブス・ソルファタ
リカス菌（Sulfolobus solfataricus）、ヤロウィア・リポリティカ菌（Yarrowia lipolutica）等に由来する酵素が挙げられる。中でも、アースロバクター属菌（Arthrobacter spp.）、アスコキタ属菌（Ascochyta spp.）、フザリウム属菌（Fusarium spp.）、マイクロコッカス属菌（Micrococcus spp.）、モルティエレラ・イサベリナ（Mortierella isabellina）、ノカルディア属菌（Nocardia spp.）、ストレプトマイセス属菌（Streptomyces spp.）、リゾビウム属菌（Rhizobium spp.）、ストレプトミセス・エバーミチリス（Streptomyces avermitilis）菌に由来するものが好ましい。

カテコールオキシダーゼとしては、マッシュルーム（Agaricus bisporus）、アスペル
ギルス・オリゼ菌（Aspergillus oryze）、アスペルギルス・ニガー菌（Aspergillus niger）、ポーポー（Asimina triloba）、テンサイ（Beta vulgaris）、ウシ（Bos taurus）、チャノキ（Camellia sinensis）、ヘンリーグリ（Castanea henryi）、アラビカコーヒーノキ（Caffea arabica）、メロン（Cucumis melo）、ビワ（Eriobotrya japonica）、
ヒト（Homo sapiens）、サツマイモ（Ipomoea batatas）、フジマメ（Lablab purpureus
）、マグワ（Morus alba）、バナナ（Musa acuminata）、ニューロスポラ・クラッサ菌（Neurospora crassa）、タバコ（Nicotiana tabacum）、バジリコ（Ocimum basilicum）、ヒラタケ（Pleurotus ostreatus）、マツバボタン（Portulaca grandiflora）、アンズ（Prunus armeniaca）、ラルストニア・ソラナセアラム菌（Ralstonia solanacearum）、トマト（Solanum lycopersicum）、ナス（Solanum melongena）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、ストレプトミセス・グラウセッセンス菌（Streptomyces glaucescens）、ストレプトマイセス・グリセウス菌（Streptomyces griseus）、ヨーロッパブドウ（Vitis vinifera）等に由来する酵素が挙げられる。中でもアスペルギルス・オリゼ菌（Aspergillus oryze）、チャノキ（Camellia sinensis）、ラルストニア・ソラナセアラム菌（Ralstonia solanacearum）、ストレプトマイセス・グリセウス菌（Streptomyces griseus）、ヨーロッパブドウ（Vitis vinifera）等に由来するものが好ましい。

チロシン３‐モノオキシゲナーゼとしては、ウシ（Bos taurus）、モルモット（Cavia porcellus）、アズマニシキ（Chlamys farreri nipponensis）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、ゴリラ（Gorilla gorilla）、ヒト（Homo sapiens）、
アカゲザル（Macaca mulatta）、ハツカネズミ（Mus musculus）、ウサギ（Oryctolagus cuniculus）、チンパンジー（Pan troqlodytes）、マツバボタン（Portulaca grandiflora）、ヨーロッパトノサマガエル（Rana esculenta）、ドブネズミ（Rattus norvegicus）、コクヌストモドキ（Tribolium castaneum）等に由来する酵素が挙げられる。中でもキ
イロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、ヒト（Homo sapiens）、ドブネズ
ミ（Rattus norvegicus）に由来するものが好ましい。

芳香環水酸化ジオキシゲナーゼとしては、アルスロバクター属菌（Arthrobacter sp.）、アシネトバクター・カルコアセチカス菌（Acinetobacter calcoaceticus）、バークホ
ルデリア・セパシア菌（Barkholderia cepacia）、バークホルデリア・テラ菌（Burkholderia terrae）、コマモナス・テストステローニ菌（Comamonas testosteroni）、クロモ
ハロバクター属菌（Chromohalobacter sp.）、メソリゾビウム・ロティ菌（Mesorhizobium loti）、シュードモナス・アエルギノサ菌（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・フルオレッセンス菌（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・プチダ菌（Pseudomonas putida）、シュードモナス・レシノボランス菌（Pseudomonas resinovorans）
、ロドコッカス・オパカス菌（Rhodococcus opacus）、トリコスポロン・クタネウム菌（Trichosporon cutaneum）等に由来する酵素が挙げられる。中でも、シュードモナス・プ
チダ菌（Pseudomonas putida）、アシネトバクター・カルコアセチカス菌（Acinetobacter calcoaceticus）、メソリゾビウム・ロティ菌（Mesorhizobium loti）、バークホルデ
リア・セパシア菌（Barkholderia cepacia）に由来するものが好ましい。

上述した中でも、チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素としては、チロシナーゼが好ましい。
チロシナーゼの具体例としては、上述した通りであるが、中でも、以下の（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）の塩基配列でコードされる酵素であることが特に好ましい。配列番号１３はバチルス・メガテリウム菌に、配列番号１４はラルストニア・ソラナセアラム菌に、配列番号１５はバチルス・スリンジェンシス菌に由来する塩基配列である。

（Ａ) 配列番号１３、１４、または１５で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（Ｂ）配列番号１３、１４、または１５で表される塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失、および／または付加された塩基配列を含み、かつチロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（Ｃ）配列番号１３、１４、または１５で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェ
ントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつチロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ

ここで「１または（もしくは）数個の塩基」とは、例えば、１個〜３００個、好ましくは１個〜１５０個、より好ましくは１個〜６０個、さらに好ましくは１個〜３０個、特に好ましくは１個〜１５個、の塩基である。以下、本明細書において同様である。

また、１もしくは数個の塩基が欠失、追加、挿入、および／または置換された塩基配列の作製は、突然変異剤を用いる方法や部位特異的変異法等の通常の変異操作によって得ることができる。これらは、例えばＤｉｖｅｒｓｉｆｙＰＣＲＲａｎｄｏｍＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）やＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＬｉｇｈｔｎｉｎｇＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等の市販キットで容易に行うことができる。

また、上述のチロシナーゼをアミノ酸配列で規定すると、以下の（Ｄ）、（Ｅ）、または（Ｆ）のアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましく、以下の（Ｄ）、（Ｅ）、または（Ｆ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。
配列番号１６はバチルス・メガテリウム菌に、配列番号１７はラルストニア・ソラナセアラム菌に、配列番号１８はバチルス・スリンジェンシス菌に由来するアミノ酸配列である。

（Ｄ) 配列番号１６、１７または１８で表されるアミノ酸配列
（Ｅ）配列番号１６、１７、または１８で表されるアミノ酸配列において１または数
個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつチロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列
（Ｆ）配列番号１６、１７、または１８で表されるアミノ酸配列の６０％以上の同一
性を有するアミノ酸配列を有し、かつチロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列

ここで「１または数個のアミノ酸」とは、例えば、１個〜１００個、好ましくは１個〜５０個、より好ましくは１個〜２０個、さらに好ましくは１個〜１０個、特に好ましくは１個〜５個、のアミノ酸である。以下、本明細書において同様である。

また、前記（Ｆ）に記載の通り、チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性を保持する限り、配列番号１６、１７、または１８に示されるアミノ酸配列全長と少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するタンパク質であってもよい。

上記に例示したように、自然界に存在する生物のゲノム情報に基づく塩基配列、またはそのホモログを用いることもできるが、各々の遺伝子は、必要に応じて宿主微生物のコドン使用頻度にあわせて塩基配列を最適化することができる。コドン最適化は、例えば、J.
Microbiol. Biotechnol. (2012), 22(3), 316-325に記載の方法や、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社のＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ^TMサービスを利用する方法がある。コドン最適化を行なうと、ベタキサンチンの生産性が向上するので好ましい。

即ち、大腸菌を宿主微生物とする場合は、配列番号１３、１４または１５の塩基配列に対してコドン最適化を実施して得られた以下の（Ｇ）、（Ｈ）、または（Ｉ）の塩基配列でコードされる酵素であることがより好ましい。
（Ｇ) 配列番号１、２、または３で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（Ｈ）配列番号１、２、または３で表される塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失、および／または付加された塩基配列を含み、かつチロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（Ｉ）配列番号１、２、または３で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつチロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ

また、酵母を宿主微生物とする場合は、配列番号１３、１４の塩基配列に対してコドン最適化を実施して得られた以下の（Ｊ）、（Ｋ）、または（Ｌ）の塩基配列でコードされる酵素であることがより好ましい。
（Ｊ）配列番号２１、配列番号２２で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（Ｋ）配列番号２１、配列番号２２で表される塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失、および／または付加された塩基配列を含み、かつチロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（Ｌ）配列番号２１、配列番号２２で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつチロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。

また、上述のチロシナーゼをアミノ酸配列で規定すると、前述の（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）と同様のアミノ酸配列を含むことが好ましく、（Ｄ）、（Ｅ）、または（Ｆ）のアミノ酸配列からなることがより好ましい。前記（Ｆ）のアミノ酸配列の配列同一性の好ましい範囲についても、同様に考えることができる。
なお、配列番号１３、１４、１５に対して大腸菌発現用にコドン最適化を行なったものが、それぞれ、配列番号１、２、３であり、配列番号１３、１４に対して酵母発現用にコドン最適化を行ったものが、それぞれ、配列番号２１、２２であるが、これらは、翻訳後のアミノ酸配列としては最適化前後で同一である。つまり、配列番号１、１３、２１の塩基配列により規定されるアミノ酸配列は配列番号１６であり、配列番号２、１４、２２の塩基配列により規定されるアミノ酸配列は配列番号１７であり、配列番号３、１５の塩基配列により規定されるアミノ酸配列は配列番号１８となる。

（ＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性）
ＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性とは、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）のエクストラジオール開裂を触媒する活性を有し、該Ｌ−ＤＯＰＡを４，５−ｓｅｃｏ−ＤＯＰＡに変換する反応、さらに、それに続く自発的反応を経て、該Ｌ−ＤＯＰＡをベタラミン酸へと変換する酵素のことである。この酵素活性を有するか否かは、測定の対象とするタンパク質が、Ｌ−ＤＯＰＡのフェノール環の４位、５位の炭素間でのエクストラジオール開裂を引き起こし、その結果としてベタラミン酸を生成することができるかどうかを通常のアッセイ方法で測定することにより判定が可能である。例えば、Ｌ−ＤＯＰＡに、測定の対象とする酵素を作用させ、Ｌ−ＤＯＰＡから変換されたベタラミン酸の生成量を直接的に測定することで、その酵素活性を確認することができる。

ＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼとしては、ベニテングダケ（Amanita muscaria）、スギモリケイトウ（Amaranthus cruentus）、ハゲイトウ（Amaranthus tricolor）、テンサイ（Beta vulgaris）、ケイトウ（Celosia argentea）、キヌア（Chenopodium quinoa
）、リビングストンデージー（Dorotheanthus bellidiformis）、オシロイバナ（Mirabilis jalapa）、ウチワサボテン（Opuntia ficus）、センニンサボテン（Opuntia stricta
）、マツバボタン（Portulaca grandiflora）、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolacca americana）、レッドビート（Red beet）、ホウレンソウ（Spinacia oleracea）等に由来するものが好ましい。

上述した中でも、ＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼとしては、以下の（Ｍ）、（Ｎ）、または（Ｏ）の塩基配列でコードされる酵素であることが好ましい。配列番号１９はオシロイバナに由来する塩基配列である。
（Ｍ）配列番号１９で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（Ｎ）配列番号１９で表される塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失、および／または付加された塩基配列を含み、かつＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（Ｏ）配列番号１９で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ

ここで「１または数個の塩基」とは、例えば、１個〜３００個、好ましくは１個〜１５０個、より好ましくは１個〜６０個、さらに好ましくは１個〜３０個、特に好ましくは１個〜１５個、の塩基である。以下、本明細書において同様である。

また、１もしくは数個の塩基が欠失、追加、挿入、および／または置換された塩基配列の作製は、突然変異剤を用いる方法や部位特異的変異法等の通常の変異操作によって得ることができる。これらは、例えばＤｉｖｅｒｓｉｆｙＰＣＲＲａｎｄｏｍＭｕｔａ
ｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）やＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＬｉｇｈｔｎｉｎｇＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等の市販キットで容易に行うことができる。

また、上述のＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼをアミノ酸配列で規定すると、以下の（Ｐ）、（Ｑ）、または（Ｒ）のアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましく、以下の（Ｐ）、（Ｑ）、または（Ｒ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。配列番号２０はオシロイバナに由来するアミノ酸配列である。
（Ｐ）配列番号２０で表されるアミノ酸配列
（Ｑ）配列番号２０で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列
（Ｒ）配列番号２０で表されるアミノ酸配列の６０％以上の同一性を有するアミノ酸
配列を有し、かつＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列

ここで「１または数個のアミノ酸」とは、例えば、１個〜１００個、好ましくは１個〜５０個、より好ましくは１個〜２０個、さらに好ましくは１個〜１０個、特に好ましくは１個〜５個のアミノ酸である。以下、本明細書において同様である。

また、前記（Ｒ）に記載の通り、ＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を保持する限り、配列番号２０に示されるアミノ酸配列全長と少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するタンパク質であってもよい。

上記に例示したように、自然界に存在する生物のゲノム情報に基づく塩基配列、またはそのホモログを用いることもできるが、各々の遺伝子は、必要に応じて宿主微生物のコドン使用頻度にあわせて塩基配列を最適化することができる。

即ち、大腸菌を宿主微生物とする場合は配列番号１９の塩基配列に対してコドン最適化を実施して得られた以下の（Ｓ）、（Ｔ）、または（Ｕ）の塩基配列でコードされる酵素であることがより好ましい。
（Ｓ) 配列番号１０で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（Ｔ）配列番号１０で表される塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失、および／または付加された塩基配列を含み、かつＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（Ｕ）配列番号１０で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ

また、酵母を宿主微生物とする場合は配列番号１９の塩基配列に対してコドン最適化を実施して得られた以下の（Ｖ）、（Ｗ）、または（Ｘ）の塩基配列でコードされる酵素であることがより好ましい。
（Ｖ）配列番号２７で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（Ｗ）配列番号２７で表される塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失、および／または付加された塩基配列を含み、かつＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（Ｘ）配列番号２７で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ

また、上述のＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼをアミノ酸配列で規定すると、前述の（Ｐ）、（Ｑ）、（Ｒ）と同様のアミノ酸配列を有することが好ましく、（Ｐ）、（Ｑ）、または（Ｒ）のアミノ酸配列からなることがより好ましい。前記（Ｒ）のアミノ酸配列の配列同一性の好ましい範囲についても、同様に考えることができる。
なお、配列番号１９に対して大腸菌発現用にコドン最適化を行なったものが配列番号１０、酵母発現用にコドン最適化を行ったものが配列番号２７であるが、両者は、翻訳後のアミノ酸配列としては最適化前後で同一であり、いずれの塩基配列でも規定されるアミノ酸配列は配列番号２０となる。

（本発明で用いる微生物の作製方法）
以下、本発明で用いる微生物（本発明の微生物）の作製方法について説明する。宿主微生物とする微生物の種類は特に限定されないが、大腸菌、コリネ型細菌、シュードモナス属細菌、バチルス属細菌、リゾビウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、サクシノバチルス属細菌、アナエロビオスピリラム属細菌、アクチノバチルス属細菌、糸状菌、酵母等が例示され、これらの中でも、大腸菌、酵母、コリネ型細菌が好ましく、大腸菌、酵母がより好ましく、大腸菌が特に好ましい。

本発明の微生物は、チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素をコードするＤＮＡ（例えば、前記の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｉ）、（Ｊ）、（Ｋ）、（Ｌ）等）、およびＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡ（例えば、前記の（Ｍ）、（Ｎ）、（Ｏ）、（Ｓ）、（Ｔ）、（Ｕ）、（Ｖ）、（Ｗ）、（Ｘ）等）を上記微生物に、プラスミドベクターや相同組換えなどを利用した形質転換法等により導入することで得ることができる。
上述のＤＮＡを宿主となる微生物に導入する際、プラスミドベクター上に該ＤＮＡを導入しても、染色体（ゲノム）上に該ＤＮＡを導入してもよい。宿主微生物が染色体上に該酵素をコードする遺伝子を有する場合は、該遺伝子のプロモーターを強力なプロモーターに置換することによっても本発明で用いる微生物を得ることもできる。宿主微生物の染色体上に該酵素遺伝子がない場合は、該酵素遺伝子を染色体上へ相同組換え法により導入したり、プラスミドベクターにより該酵素遺伝子を導入したりすることもできる。

微生物に該ＤＮＡを導入する際には、適当なプロモーターを該遺伝子の５'-側上流に組み込むことが好ましく、加えてターミネーターを３'-側下流にそれぞれ組み込むことがより好ましい。このプロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用する微生物において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されず、該酵素遺伝子自身のプロモーター及びターミネーターであってもよいし、他のプロモーター及びターミネーターに置換してもよい。これら各微生物において利用可能なベクター、プロモーター及びターミネーターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳細に記述されている。

なお、ＤＮＡの切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., ”Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。

以下、微生物の種類ごとに、該酵素および／または該酵素反応系の活性が付与された微生物を得る方法について説明する。

（大腸菌）
宿主微生物として大腸菌を用いる場合、大腸菌の親株としては、例えば、Ｋ１２株またはＢ株、加えてこれらの誘導体を用いることが好ましい。本発明で用いることのできる親株としては、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＪＭ１０９、ＪＭ１１０、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＴＨ２、ＴＯＰ１０、及びこれらの改良株が挙げられ、これらの菌株は市販されている。加えて、例えば一遺伝子破壊株であるＫＥＩＯコレクションで使用されているＢＷ２５１１３株なども利用可能であり、これらはナショナルバイオリソースプロジェクトより分与が可能である。

大腸菌の組換え方法としては、目的とする遺伝子または配列を含むＤＮＡ断片をプラスミドベクターに導入することにより、大腸菌内で前記酵素遺伝子の発現増強が可能な組換えプラスミドベクターを得て、このプラスミドベクターを菌体内へ導入する方法等が挙げられる。

大腸菌に目的とする遺伝子または配列を導入することができるプラスミドベクターとしては、大腸菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されない。プラスミドベクターとしては、例えば、Ｐ１５Ａ、ＣｏｌＥ１（ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ）、ＲＳＦ１０３０、ｐＳＣ１０１、ＣｌｏＤＦ１３などの複製開始点をもつものを好適に用いることができる。

また、プロモーターとしては、大腸菌において機能するものであればいかなるプロモーターであってもよく、導入される遺伝子自身のプロモーターであってもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ＰＬプロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター及びλＰＬプロモーター等を用いることができる。

本発明で用いることができるプラスミドベクターは、例えば、ｐＥＴシリーズ（ノバジェン）、ＤｕｅｔＶｅｃｔｏｒシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＤＵＡＬシリーズ（ストラタジェン）、ｐＭＡＬシリーズ（ＮＥＢ）、ｐＧＥＸシリーズ（ＧＥヘルスケア）、ｐＫＫ２２３（ＧＥヘルスケア）ｐＴｒｃシリーズ（ライフテクノロジーズ）、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（タカラバイオ）等が挙がられる。

また、上記の組換え方法に代えて、あるいは、上記の組換え方法に加えて、公知の相同組換え法によって、前述した外来および内在の遺伝子の一部または全部を導入したり、置換したり、増幅したり、加えて、染色体上へ導入された当該遺伝子のプロモーターへの変異導入、より強力なプロモーターへの置換などによっても高発現株を得ることができる。

（コリネ型細菌）
宿主微生物として、コリネ型細菌（coryneform bacterium）を用いる場合、コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム属に属する細菌、ブレビバクテリウム属に属する細菌又はアースロバクター属に属する細菌等が挙げられ、これらのうち、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属するものが好ましく、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）に属する
細菌がより好ましい。

本発明において用いることのできる親株としては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３ＡＢ−４１（ＦＥＲＭＢＰ−
１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテ
リウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、ココリネバクテリウム・グルタミカムＡＴ
ＣＣ３１８３１、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９等が挙げられる。

なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあることから（Lielbl, W. et al. International Journal of Systematic Bacteriology, 1991, vol. 41, p255-260）、本発明においては、ブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ−２３３株、及びその変異株ＭＪ−２３３ＡＢ−４１株はそれぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株及びＭＪ−２３３ＡＢ−４１株と同一の株であるものとする。また、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３は、１９７５年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭＰ−３０６８として寄託され、１９８１年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭＢＰ−１４９７の受託番号で寄託されている。

本発明の方法において親株として用いられる上記の微生物としては、野生株だけでなく、ＵＶ照射やＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。

目的とする遺伝子または配列は、以下に示す方法によりコリネ型細菌に導入することができる。
コリネ型細菌に前記遺伝子をプラスミドベクターにより導入する際、利用できるプラスミドベクターの具体例は、例えば、特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２−７２８７６号公報及び米国特許５，１８５，２６２号明細書公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１；Plasmid vol.36(1)p62-66(1996)
に記載のｐＣ２又はその改変プラスミド等を挙げることができる。

また、上記の組換え方法に代えて、あるいは、上記の組換え方法に加えて、公知の相同組換え法によって、前述した外来遺伝子の一部または全部を導入したり、置換したり、増幅したり、加えて、染色体上へ導入された当該遺伝子のプロモーターへの変異導入、より強力なプロモーターへの置換などによっても高発現株を得ることができる。

（酵母）
宿主微生物として、酵母を用いる場合、親株として用いる酵母の種類は特に限定されないが、サッカロミセス属、デバリオマイセス属、シゾサッカロマイセス属、キャンディダ属、ヤロウィア属、ロドトルラ属、リポマイセス属、クルイベロマイセス属、ロドスポリジウム属、トリコデルマ属または、トルロプシス属、ピキア属等に属する酵母を親株として用いることが好ましい。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）、デバリオマイセス・ニ
ルソニ（Debaryomyces nilssonii）、デバリオマイセス・ハンセニ（Debaryomyces hansenii）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、キャンディダ・グラブラータ（Candida glabrata）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）、キャンディダ・ボイディニィ（Cand
ida boidinii）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ロドトルラ・グ
ルティニス（Rhodotorula glutinis）、リポマイセス・リポフェラス（Lipomyces lipoferus）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、ロドスポリジウム
・トルロイディス（Rhodosporidium toruloides）、トリコデルマ・リセイ（Trichoderma
reesei）、トルロプシス・コリキュロサ（Torulopsis colliculosa）、ピキア・ファリ
ノサ（Pichia farinosa）等が挙げられる。これらの中で、代謝工学的手法が用いやすい
ことからサッカロミセス属が最も好ましい。

さらに、サッカロミセス属は、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｔｒｐ１、ｕｒａ３などの栄養要求性の遺伝型であることが望ましく、例えば、サッカロミセス・セレビジエＹＰＨ４９９株（ＭＡＴａｕｒａ３ｌｙｓ２ａｄｅ２ｔｒｐ１ｈｉｓ３ｌｅｕ２）（ＡＴＣＣ２０４６７９：ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ又はＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社より入手できる）、サッカロミセス・セレビジエＦＹ１６７９−０６ｃ株（ＭＡＴα ｕｒａ３ｌｅｕ２ｔｒｐ１ｈｉｓ３）（Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ社から入手できる）、サッカロミセス・セレビジエＢＹ４７４１株（ＭＡＴａ，ｈｉｓ３Δ１，ｌｅｕ２Δ０，ｍｅｔ１５Δ０，ｕｒａ３Δ０）（Ｙｅａｓｔ１４：１１５−１３２（１９９８）、ＡＴＣＣ２０１３８８）なども用いることができる。

目的とする遺伝子または配列は、以下に示す方法により酵母に導入することができる。酵母において外来遺伝子を導入する方法としては、公知の手法を用いることができ、形質転換体において形質転換の目的とした酵素が発現していればよく、遺伝子の導入の方法は限定されない。用いるプラスミドベクターとしては、例えば、後述する３つのプラスミドベクターが挙げられる。（ｉ）酵母に常在する２μｍプラスミドの複製配列を利用した多コピーのＹＥｐ型ベクターを用いることができる。本発明において酵母に遺伝子を導入するために使用できるプラスミドの具体例としては、２μｍプラスミド由来のｐＡＵＲ１１２ベクター（タカラバイオ社製）やｐＥＳＣベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、ｐＹＥＳベクター（ライフテクノロジーズ）などが挙げられる。これらのベクターは市販されている。（ｉｉ）自立複製配列（ＡＲＳ）とセントロメア配列（ＣＥＮ）を利用した低コピー安定型のＹＣｐ型ベクターを用いることができる。本発明において用いることのできるプラスミドベクターとしては、例えば、ｐＡＵＲ１２３（タカラバイオ）等が挙げられる。（ｉｉｉ）染色体組込みを目的とした酵母内では自律複製をしないＹＩｐ型のプラスミドを用いることができる。これは、酵母の高い相同組換え能を利用するものであり、染色体ゲノムと相同な配列を両端に置き、選択可能なマーカー遺伝子、プロモーター及びターミネーターに挟まれた形で希望の遺伝子をＹＩｐ型のプラスミドに組み込み、これを酵母内に導入することで、外来遺伝子は染色体内に組み込まれ、安定的に外来遺伝子を発現することが期待できる。これは一般的な大腸菌や酵母用のプラスミドを用いて構築することが可能であるほか、ＰＣＲや合成ＤＮＡを用いて作製することが可能である。

本発明において用いることのできるプロモーターとしては、宿主酵母で機能しうるものであれば特に制限されないが、例えば、ＰＧＫ遺伝子のプロモーター（３−ホスホグリセラートキナーゼ 1983、Science、219、620-625）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒドホ
スフェートデヒドロゲナーゼ 1979、J.Biol.Chem.、254、9839-9845）をコードするＴＤＨ遺伝子のプロモーター、ＴＥＦ１遺伝子（伸長因子１ 1985、J.Biol.Chem.、260、3090-3096）のプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼをコードするＡＤＨ遺伝子のプロモーター、グルコースの存在下に抑制される調節可能なＣＹＣ１遺伝子のプロモーター（1981、Proc.Natl.Acad.Sci.、USA、78、2199-2203）、チアミンにより調節され得るＰＨ
Ｏ５遺伝子のプロモーター（1982、EMBO J.、1、675-680）、グルコース非存在下でガラ
クトースにより誘導されるＧＡＬ１またはＧＡＬ１０遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。

また、上記の組換え方法に代えて、あるいは、上記の組換え方法に加えて、公知の相同組換え法によって、外来および内在遺伝子の一部または全部を導入したり、置換したり、増幅したり、加えて、染色体上へ導入された当該遺伝子のプロモーターへの変異導入、より強力なプロモーターへの置換などによっても高発現株を得ることができる。

なお、酵母の形質転換は、例えば、エレクトロポレーション法（Fromm ME,et al. Nature 1986, 319(6056):791-793）、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法（Ito,H.et al, (1983) J. Bacteriol. 153(1), 163-168）等によって行うことができ、二種以上のプラス
ミドを導入することもできる。また、酵母における遺伝子の発現増強は、公知の相同組換え法によって宿主のゲノム上で該遺伝子を多コピー化させることによって行うこともできる。例えば、ゲノム組込型プラスミドのうち多コピーがゲノムに組み込まれるベクターを用いる方法（Bio/Technol. 1991, 9, 1382-1385）が挙げられる。ゲノム上の各遺伝子を
含む発現単位の挿入箇所は、クロチルアルコールもしくはその異性体の合成関連遺伝子や生育関連遺伝子の発現が阻害されない箇所であれば何れのものでもよい。

［本発明の製造方法］
本発明の製造方法は、チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性、およびＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有する微生物（本発明の微生物）またはその処理物の存在下、水性媒体中で原料をベタキサンチンへと変換する工程（変換工程）を有することを特徴とする。

前記変換工程の前に、本発明の微生物を水性媒体中で培養する工程（培養工程）を有することが好ましく、また、前記変換工程の後に、前記水性媒体からベタキサンチンを回収する工程を有することが好ましい。
以下、本発明の製造方法について、工程ごとに説明する。

（原料）
原料としては、チロシン、および／または糖質原料を用いることができる。ここでチロシンとしては、純度９０％以上の市販品を好適に用いることができる。
糖質原料としては、グルコース、ガラクトース、フルクトース、キシロース、スクロース、マルトース、ラクトース、ラフィノース、サッカロース、デンプン、セルロースなどの炭水化物やグリセリン、マンニトール、リビトール、キシリトールなどのポリアルコール類等の発酵性糖質類等を用いることができ、中でもグルコースが好ましい。

本発明の製造方法に用いる微生物が糖質原料からチロシンを合成する代謝フラックスが充分に強くない場合は、原料として糖質原料およびチロシンを用いることが好ましく、特にグルコースおよびチロシンを用いることが好ましい。
一方で、本発明の製造方法に用いる微生物が糖質原料からチロシンを合成する代謝フラックスが強い場合は、原料として糖質原料のみを用いることができる。目的とするベタキサンチンの生産プロセスの低コスト化のためには、より安価原料である糖質原料のみを用いることが好ましい。

また、製造したいベタキサンチンの構造に応じて、上述した原料に加えて、チロシン以外のアミノ酸やアミンを添加することもできる。
上述した式（１）のベタキサンチンを製造したい場合には、所望のＲ_１およびＲ_２を有するアミノ酸を添加することが好ましく、式（２）のベタキサンチンを製造したい場合には所望のＲ_３を有するアミンを添加することが好ましい。

チロシン以外のアミノ酸としては、天然型アミノ酸であっても、非天然型アミノ酸であってもよい。
天然型アミノ酸としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンが挙げられ、これらをチロシン以外のアミノ酸として添加すると、ベタキサンチンとして、それぞれ、アラニン‐ベタキサンチン、アルギニン‐ベタキサンチン、アスパラギン‐ベタキサンチン、アスパラギン酸‐ベタキサンチン、システイン‐ベタキサンチン、グルタミン‐ベタキサンチン、グルタミン酸‐ベタキサンチン、グリシン‐ベタキサンチン、ヒスチジン‐ベタキサンチン、イソロイシン‐ベタキサンチン、ロイシン‐ベタキサンチン、リシン‐ベタキサンチン、メチオニン‐ベタキサンチン、フェニルアラニン‐ベタキサンチン、プロリン‐ベタキサンチン、セリン‐ベタキサンチン、トレオニン‐ベタキサンチン、トリプトファン‐ベタキサンチン、チロシン‐ベタキサンチン、バリン‐ベタキサンチンが製造される。

非天然型アミノ酸としては、例えば、ｍ−チロシン、メトキシフェニルアラニン、メチルシステイン、アリルアラニン、プロパルギルアラニン、アリルグリシン、プロパルギルグリシン、エチルアラニン、メチルアスパラギン酸、メチルシステイン、メチルロイシン、メチルフェニルアラニン、メチルトリプトファン、メチルチロシン、メチルバリン、α−メチル−２−ブロモフェニルアラニン、α−メチル−３−ブロモフェニルアラニン、α−メチル−４−ブロモフェニルアラニン、α−メチル−２−ヨードフェニルアラニン、α−メチル−３−ヨードフェニルアラニン、α−メチル−４−ヨードフェニルアラニン、α−メチル−２−ニトロフェニルアラニン、α−メチル−３−ニトロフェニルアラニン、α−メチル−４−ニトロフェニルアラニン、α−メチル−β−（４−ビスフェニル）アラニン等が挙げられる。これらをチロシン以外のアミノ酸として添加すると、ベタキサンチンとして、それぞれ、ｍ−チロシン−ベタキサンチン、メトキシフェニルアラニン−ベタキサンチン、メチルシステイン−ベタキサンチン、アリルアラニン−ベタキサンチン、プロパルギルアラニン−ベタキサンチン、アリルグリシン−ベタキサンチン、プロパルギルグリシン−ベタキサンチン、エチルアラニン−ベタキサンチン、メチルアスパラギン酸−ベタキサンチン、メチルシステイン−ベタキサンチン、メチルロイシン−ベタキサンチン、メチルフェニルアラニン−ベタキサンチン、メチルトリプトファン−ベタキサンチン、メチルチロシン−ベタキサンチン、メチルバリン−ベタキサンチン、α−メチル−２−ブロモフェニルアラニン−ベタキサンチン、α−メチル−３−ブロモフェニルアラニン−ベタキサンチン、α−メチル−４−ブロモフェニルアラニン−ベタキサンチン、α−メチル−２−ヨードフェニルアラニン−ベタキサンチン、α−メチル−３−ヨードフェニルアラニン−ベタキサンチン、α−メチル−４−ヨードフェニルアラニン−ベタキサンチン、α−メチル−２−ニトロフェニルアラニン−ベタキサンチン、α−メチル−３−ニトロフェニルアラニン−ベタキサンチン、α−メチル−４−ニトロフェニルアラニン−ベタキサンチン、α−メチル−β−（４−ビスフェニル）アラニン−ベタキサンチンが製造される。

アミンとしては、天然型アミンであっても、非天然型アミンであってもよい。
天然型アミンとしては、例えばメチルアミン、エタノールアミン、ピペリジン、ヒスタミン、ドーパミン、フェネチルアミン、チラミン、３−メトキシチラミン、γ−アミノ酪酸、ノルアドレナリン、セロトニン、ムッシモール、スペルミジン、スペルミン等が挙げられる。これらをアミンとして添加すると、ベタキサンチンとして、それぞれ、メチルアミン−ベタキサンチン、エタノールアミン−ベタキサンチン、ピペリジン−ベタキサンチン、ヒスタミン−ベタキサンチン、ドーパミン−ベタキサンチン、フェネチルアミン−ベタキサンチン、チラミン−ベタキサンチン、３−メトキシチラミン−ベタキサンチン、γ−アミノ酪酸−ベタキサンチン、ノルアドレナリン−ベタキサンチン、セロトニン−ベタキサンチン、ムッシモール−ベタキサンチン、スペルミジン−ベタキサンチン、スペルミン−ベタキサンチンが製造される。

非天然型アミンとしては、例えばエチルアミン、ピペラジン、モルホリン、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンエキサミン、ヘキサメチレンジアミン、１，３−ブタジエン−１−アミン、１，３，５−ヘキサトリエン−１−アミン、アニリン、４−ビフェニルアミン、アマンタジン等が挙げられる。これらをアミンとして添加すると、ベタキサンチンとして、それぞれ、エチルアミン−ベタキサンチン、ピペラジン−ベタキサンチン、モルホリン−ベタキサンチン、エチレンジアミン−ベタキサンチン、ジエチレントリアミン−ベタキサンチン、トリエチレンテトラミン−ベタキサンチン、テトラエチレンペンタミン−ベタキサンチン、ペンタエチレンエキサミン−ベタキサンチン、ヘキサメチレンジアミン−ベタキサンチン、１，３−ブタジエン−１−アミン−ベタキサンチン、１，３，５−ヘキサトリエン−１−アミン−ベタキサンチン、アニリン−ベタキサンチン、４−ビフェニルアミン−ベタキサンチン、アマンタジン−ベタキサンチンが製造される。

（培養工程）
本発明の培養工程は、上述のようにして得られた本発明の微生物を水性媒体中で培養する工程である。本工程は、本発明の微生物を培養して増殖させたり、本発明の微生物の状態を調えたりするために行なうものであるので、通常、本工程では、上述した原料のうち、本発明の微生物の生育に必要な原料のみを、具体的には、糖質原料（好ましくはグルコース）のみを用いる。
ただし、ベタキサンチン生産に必要な酵素を何らかの誘導性プロモーター下に配置している場合は、上記プロモーターの種類により適切に選択される誘導剤を培養工程途中に添加する必要がある。
なお、本発明の微生物が充分な量、存在する場合等は、本工程は省略して、次の変換工程を行なうことができる。

本発明で用いる水性媒体（培地）に特に制限はなく、使用する微生物の種類に応じて適宜設定することができるが、例えば、以下のような条件で行なうことができる。
水性媒体としては、炭素源、窒素源、無機塩及び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができるが、後述の炭素源等を含む培地や、水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類等が挙げられる。

炭素源は、上記微生物が資化しうる炭素源であれば特に限定されないが、例えば、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられる。
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。

無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が用いられる。
また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加してもよい。

また、培養条件は、用いる微生物の生育が可能であれば特に制限はなく、通常、培養温度１０℃〜４５℃で１２時間〜９６時間実施することができるが、後述の変換工程において、酵素活性が高くなり、かつ、副生成物であるメラニンの生成が低減されるような条件で培養することが好ましい。本発明の微生物が、大腸菌である場合、水性媒体の温度を、
好ましくは１６℃以上、より好ましくは２０℃以上、また、好ましくは２９℃以下、より好ましくは２５℃以下とするとベタキサンチンの生産効率が向上する傾向にあり、好ましい。

（変換工程）
本発明の変換工程は、本発明の微生物またはその処理物の存在下、水性媒体中で原料をベタキサンチンへと変換する工程である。本工程は、原料をベタキサンチンへと変換することを目的とするものであり、原料としては、上述の糖質原料、および／またはチロシンと、さらに、必要に応じてチロシン以外のアミノ酸が用いられる。

また、上述の培養工程で培養された本発明の微生物の菌体を、休止菌体として、当該休止菌体を、本工程において、本発明の微生物として用いることも好ましい。本発明の微生物の菌体を休止菌体とする方法としては、培養工程で得られた培養液から遠心操作等による菌体を回収する方法や、水、または、微生物の生育に必要な炭素源、および窒素源を含有しないバッファー等により洗浄することにより、菌体を回収する方法等が挙げられる。

なお、本発明の微生物が糖質原料からベタキサンチンを合成する代謝経路をすべて有するものである場合は、上述の培養工程と特に区別することなく連続して本工程を実施してもよい。

用いる水性媒体（培地）に特に制限はなく、用いる微生物の種類に応じて適宜設定することができ、前記培養工程に記載したものと同様のものを用いることができる。本工程においては、水性媒体が、アスコルビン酸、銅および鉄からなる群から選ばれる少なくとも一種を含むものであることが好ましく、アスコルビン酸、銅および鉄を含むことがより好ましい。

また、反応は、用いる微生物の生育が可能な条件、またはベタレイン色素生産のために導入した酵素が完全に酵素活性を失わない条件であれば特に制限はなく、通常、反応温度１０℃〜４５℃で１２時間〜９６時間実施するが、酵素活性が高くなり、かつ、副生成物であるメラニンの生成が低減されるような条件で反応させることが好ましい。本発明の微生物が、大腸菌である場合、水性媒体の温度を、好ましくは１６℃以上、より好ましくは２０℃以上、また、好ましくは２９℃以下、より好ましくは２５℃以下とするとベタキサンチンの生産効率が向上する傾向にあり、好ましい。

（回収工程）
上述の変換工程の後に、必要に応じて、水性媒体からベタキサンチンを回収する工程を有することが好ましい。
周知の方法、例えば、有機溶媒を用いる抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィーなどにより、水性媒体または菌体内から回収することができ、必要に応じてさらに精製することができる。

［ベタキサンチン］
本発明の製造方法では、公知のベタキサンチンはもちろん、原料として、任意の非天然型アミノ酸を用いれば、非天然型のアミノ酸が付加されたベタキサンチンを製造することができる。このような非天然型のアミノ酸が付加されたベタキサンチンとしては、例えば、以下の式（３）で表されるものが挙げられる。

式（３）において、Ｒは、炭素数１〜４０の直鎖または分岐鎖または環状の飽和もしくは不飽和炭化水素基からなる群から選択される１種である。ただし該炭化水素基の水素原子の一部または全部は、ハロゲン原子、アシル基、アミド基、アミノ基、アルコキシ基、アルデヒド基、イミダゾール基、インドール基、オキソ基、カルボキシル基、グアニジノ基、シアノ基、スルホ基、チオール基、ニトロ基、ヒドロキシル基およびフェニル基からなる群から選択される少なくとも一種で置換されていてもよく、該炭化水素基は、イミニウムの窒素を含有する形で環を形成していてもよい。さらに、該イミダゾール基、該インドール基および該フェニル基の芳香環の一部または全部は、上記と同様の置換基群から選択される少なくとも一種にて置換されていてもよい。さらに該炭化水素基の炭素原子の一部は、硫黄原子、酸素原子、窒素原子、リン原子から選択される少なくとも一種で置換されていてもよい。

式（３）において、Ｒが、直鎖または分岐鎖のアルキル基である場合、その炭素数が１〜１０であることが好ましく、１〜５であることがより好ましい。この場合、Ｒが、エチル基、プロピル基、およびイソブチル基からなる群から選ばれる少なくとも一種であることが特に好ましい。

式（３）において、Ｒが、直鎖または分岐鎖のアルケニル基である場合、その炭素数が１〜１０であることが好ましく、１〜５であることがより好ましい。この場合、Ｒが、アリル基、１−ブテニル基、および２−ブテニル基からなる群から選ばれる少なくとも一種であることが特に好ましい。

式（３）において、Ｒが、直鎖または分岐鎖のアルキニル基である場合、その炭素数が１〜１０であることが好ましく、１〜５であることがより好ましい。この場合、Ｒが、エチニル基、１−ブチニル基、および２−ブチニル基からなる群から選ばれる少なくとも一種であることが特に好ましい。

式（３）において、Ｒが、直鎖または分岐鎖のアリール基である場合、その炭素数が１〜２０であることが好ましく、１〜１０であることがより好ましい。この場合、Ｒが、ベンジル基、トリル基、およびフェネシル基からなる群から選ばれる少なくとも一種であることが特に好ましい。

前記式（３）で表される化合物は、強力な抗酸化活性を有するという性質を生かし、抗酸化剤等に好適に用いることができる。
また、前記式（３）で表される化合物の中でも、例えば、下記式（４）で表される化合物が好ましい。

同様に、原料として非天然型アミンを用いることで、非天然型のアミンが付加されたベタキサンチンを製造することができる。このような非天然型のアミンが付加されたベタキサンチンとしては、アミン骨格中に複数の共役構造を有するものが好ましく、例えば、以下の式（５）や式（６）で表されるものが挙げられる。

式（５）においてｎは１〜２０であることが好ましく、１〜１０であることがより好ましい。

式（６）においてｎは１〜５であることが好ましく、１〜３であることがより好ましい。

前記式（５）、（６）で表される化合物は、強力な抗酸化活性を有するという性質を生かし、抗酸化剤等に好適に用いることができる。

次に、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定されるものではない。

［作製例１］チロシナーゼ活性、およびＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有
する大腸菌の作製
（１）大腸菌用チロシナーゼ発現プラスミドの構築
Bacillus megaterium DSM 319, Ralstonia solanacearum GMI1000, Bacillus thuringiensis BMB171由来の３種類のチロシナーゼ(以下、この３種類のチロシナーゼを、それぞ
れ、ＢＭＴＹＲ，ＲＳＴＹＲ，ＢＴＴＹＲと称する。）の遺伝子配列情報をＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）から得て、遺伝子合成により大腸菌のコドン頻度に最適化した。得られた最適化された遺伝子断片の全遺伝子配列を、それぞれ、配列番号１〜３に示す。配列番号１〜３の遺伝子断片を、ｐＵＣ５７ベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）のＥｃｏＲＶサイトに挿入したプラスミドを作製した。得られたプラスミドを鋳型として、５’末端に制限酵素ＮｄｅＩサイトを、３’末端に制限酵素ＫｐｎＩサイトを付加した、以下のプライマーを用いたＰＣＲにより各遺伝子断片を得た。
ＢＭＴＹＲ遺伝子増幅用プライマー：配列番号４、５
ＲＳＴＹＲ遺伝子増幅用プライマー：配列番号６、７
ＢＴＴＹＲ遺伝子増幅用プライマー：配列番号８、９
ＰＣＲ反応液組成：鋳型ＤＮＡ２μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ^（Ｒ）ＨＳＤＮＡ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）０．５μｌ、５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＢｕｆｆｅｒ１０μｌ、２．５ｍＭｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ４μｌ、２μＭ各々プライマー５μｌ、滅菌水２４μｌ（これらを混合して全量５０μｌとした。）
反応温度条件：ＴａＫａＲａＰＣＲＴｈｅｒｍａｌＣｙｌｃｅｒＤｉｃｅＴｏｕｃｈ（型式ＴＰ３５０）を用い、９８℃で１０秒、５５℃で５秒、７２℃で１分（ＢＭＴＹＲおよびＢＴＴＹＲ）、１分３０秒（ＲＳＴＹＲ）からなるサイクルを３０回繰り返した。ただし、１サイクル目の９８℃での保温は１分１０秒とした。

ＰＣＲの増幅産物の確認は、１％アガロース（アガロース−ＲＥ：ナカライテスク株式会社）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、ＢＭＴＹＲは約０．９ｋｂ、ＲＳＴＹＲは約１．５ｋｂ、ＢＴＴＹＲは０．８ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的断片の回収はＷｉｚａｒｄ^（Ｒ）ＳＶＧｅｌａｎｄ
ＰＣＲＣｌｅａｎ−ＵＰＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて行った。得られたチロシナーゼのＰＣＲ断片を、それぞれ、ＺｅｒｏＢｌｕｎｔ^（Ｒ）ＴＯＰＯ^（Ｒ）ＰＣＲＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（ｉｎｖｉｔｏｒｇｅ製）を用いてｐＣＲ^ＴＭ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ^（Ｒ）ベクター（ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ製）に連結した後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。このようにして得られた組み換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅ^ＴＭＨＰＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡを、それぞれ、ＢＭＴＹＲ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩ、ＲＳＴＹＲ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩ、ＢＴＴＹＲ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩと命名した。

次に、上記ＢＭＴＹＲ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩ、ＲＳＴＹＲ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩ、ＢＴＴＹＲ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩを、それぞれ、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩにて制限酵素処理した後、１％アガロース（アガロース−ＲＥ：ナカライテスク株式会社）ゲル電気泳動により分離した。分離されたＢＭＴＹＲ由来の約０．９ｋｂ遺伝子断片、ＲＳＴＹＲ由来の約１．５ｋｂ遺伝子断片、ＢＴＴＹＲ由来の約０．８ｋｂ遺伝子断片を、Ｗｉ
ｚａｒｄ^（Ｒ）ＳＶＧｅｌａｎｄＰＣＲＣｌｅａｎ−ＵＰＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて回収した。
大腸菌用発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ製）についても、同様の方法で制限酵素処理、および分離を行ない、約５．４ｋｂの遺伝子断片を回収した。

次いで、上記で得られた、それぞれのチロシナーゼ遺伝子断片と、大腸菌発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ−１とをＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。
このようにして得られた組み換え大腸菌を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅ^ＴＭＨＰＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡを、それぞれ、ＢＭＴＹＲ／ｐＥＴＤｕｅｔ−１、ＲＳＴＹＲ／ｐＥＴＤｕｅｔ−１、ＢＴＴＹＲ／ｐＥＴＤｕｅｔ−１と命名した。

（２）大腸菌用ＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ（ＤＯＤ）発現プラスミドの構築
オシロイバナ（Ｍｉｒａｂｉｌｉｓｊａｌａｐａ）由来のＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ（以下、「ＭｊＤＯＤ」と称する。）遺伝子配列情報１種類をＮＣＢＩから得て、遺伝子合成により大腸菌のコドン頻度に最適化した。最適化したＭｊＤＯＤの全遺伝子配列を配列番号１０に示す。配列番号１０に記載の配列を、ｐＵＣ５７ベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）のＥｃｏＲＶサイトに挿入した。得られたプラスミドを鋳型として、５’末端に制限酵素ＮｄｅＩサイトを、３’末端に制限酵素ＫｐｎＩサイトを付加したプライマー（配列番号１１、および１２）を用いたＰＣＲにより遺伝子断片を得た。
ＰＣＲ反応液組成：鋳型ＤＮＡ２μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ^（Ｒ）ＨＳＤＮＡ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）０．５μｌ、５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＢｕｆｆｅｒ１０μｌ、２．５ｍＭｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ４μｌ、２μＭ各々プライマー５μｌ、滅菌水２４μｌ（これらを混合して全量５０μｌとした。）
反応温度条件：ＴａＫａＲａＰＣＲＴｈｅｒｍａｌＣｙｌｃｅｒＤｉｃｅＴｏｕｃｈ（型式ＴＰ３５０）を用い、９８℃で１０秒、５５℃で５秒、７２℃で１分からなるサイクルを３０回繰り返した。ただし、１サイクル目の９８℃での保温は１分１０秒とした。

増幅産物の確認、およびゲルからの目的断片の回収は、前記「（１）大腸菌用チロシナーゼ発現プラスミドの構築」に記載の方法と同様にして行い、約０．８ｋｂのＭｊＤＯＤ由来遺伝子断片を検出し、回収した。
得られたＭｊＤＯＤのＰＣＲ断片をＺｅｒｏＢｌｕｎｔ^（Ｒ）ＴＯＰＯ^（Ｒ）ＰＣＲＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いてｐＣＲ^ＴＭ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ^（Ｒ）ベクター（ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ製）に連結した後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。
このようにして得られた組み換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅ^ＴＭＨＰＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。ここで得られたプラスミドＤＮＡをＭｊＤＯＤ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩと命名した。

次に、上記ＭｊＤＯＤ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩを、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩにて制限
酵素処理した後、１％アガロースゲル電気泳動により分離し、約０．８ｋｂ遺伝子断片をＷｉｚａｒｄ^（Ｒ）ＳＶＧｅｌａｎｄＰＣＲＣｌｅａｎ−ＵＰＳｙｓｔｅｍ
（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて回収した。
ｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターと共存可能な大腸菌発現ベクターであるｐＲＳＦＤｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ製）についてもＮｄｅＩおよびＫｐｎＩにて制限酵素処理した後、同様の方法で分離し、約３．８ｋｂの遺伝子断片を回収した。
ＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いて、上記のＭｊＤＯＤ遺伝子断片と大腸菌発現ベクターｐＲＳＦＤｕｅｔ−１とを連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。

このようにして得られた組み換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅ^ＴＭＨＰＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡをＭｊＤＯＤ／ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１と命名した。

（３）チロシナーゼおよびＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ共発現大腸菌株の作製
上記（１）および（２）で作製した、ＢＭＴＹＲ／ｐＥＴＤｕｅｔ−１およびＭｊＤＯＤ／ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１、ＲＳＴＹＲ／ｐＥＴＤｕｅｔ−１およびＭｊＤＯＤ／ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１、ＢＴＴＹＲ／ｐＥＴＤｕｅｔ−１およびＭｊＤＯＤ／ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１の混合プラスミドで、それぞれ、大腸菌（ＢＬ２１Ｓｔａｒ^ＴＭ（ＤＥ３）株）を形質転換した。得られた組換え大腸菌を１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、それぞれ、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）／ＢＭＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）／ＢＴＴＹＲ／ＭｊＤＯＤと命名し、ベタキサンチン生産株として以下のベタキサンチン生産試験に用いた。

［実施例１］
まず、上記で作製した微生物を、以下の方法で培養した。
（前培養工程）
上記で作製した３種類の共発現株Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）／ＢＭＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）／ＢＴＴＹＲ／ＭｊＤＯＤを、それぞれ前培養培地［５×Ｍ９ＭｉｎｉｍａｌＳａｌｔｓ
４００μｌ、１ＭＣａＣｌ_２０．２μｌ、１ＭＭｇＳＯ_４４μｌ、１００ｇ／ＬＣａｓａｍｉｎｏａｃｉｄ２００μｌ、１ＭＧｌｕｃｏｓｅ４４μｌ、１％
Ｔｈｉａｍｉｎｅ４μｌ、５０ｍＭＦｅＳＯ_４２μｌ、４０ｍｇ／ｍｌＣｕＳＯ_４２μｌ、５０ｍｇ／ｍｌＫａｎａｍｙｃｉｎ２μｌ、および１００ｍｇ／ｍｌ
Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ２μｌを、全量２ｍｌとなるように滅菌水に溶解したもの］２ｍｌに植菌し、培養温度３２℃、１８０ｒｐｍで１８時間培養した。

（本培養工程）
上記で得られた前培養液５００μｌを、本培養培地［５×Ｍ９ＭｉｎｉｍａｌＳａｌｔｓ１０ｍｌ、１ＭＣａＣｌ_２５μｌ、１ＭＭｇＳＯ_４１００μｌ、４０ｇ／ＬＮＨ_４Ｃｌ３．７５ｍｌ、１００ｇ／ＬＣａｓａｍｉｎｏａｃｉｄ５ｍｌ、１％Ｔｈｉａｍｉｎｅ１００μｌ、５０ｍＭＦｅＳＯ_４５０μｌ、４０ｍｇ／ｍｌＣｕＳＯ_４５０μｌ、５０ｍｇ／ｍｌＫａｎａｍｙｃｉｎ５０μｌ、１００ｍｇ／ｍｌＣａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ５０μｌ、ＯｖｅｒｎｉｇｈｔＥｘｐｒｅｓｓ^ＴＭＡｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ１ＯｎＥｘＳｏｌｕｔｉｏｎ
１１ｍｌ、ＯｎＥｘＳｏｌｕｔｉｏｎ２２．５ｍｌ、およびＯｎＥｘＳｏｌｕｔｉｏｎ３５０μｌを、全量５０ｍｌになるように滅菌水に溶解したもの］５０ｍｌに植菌し、培養温度２０℃、２００ｒｐｍで２４時間培養することで、タンパク質の発現を誘導した。

（変換工程）
上記で得られた本培養液に、Ｌ−チロシン（終濃度１ｍＭ）および１Ｍアスコルビン酸５００μｌを添加することでベタキサンチンの生産反応を開始し、反応温度２０℃、２００ｒｐｍで２４時間培養してベタキサンチンを生産させた。得られた培養液１ｍｌから遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１分間）して得られた上清を０．４５μｍコスモスピンフィルター（日本ミリポア株式会社製）に通し、ろ液を分析サンプルとした。

（解析）
解析は、ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ６４６０ＴｒｉｐｌｅＱｕａｄＬＣ／ＭＳを用いて行なった。カラムはＳｕｎＦｉｒｅ^ＴＭＣ１８３．５μｍ
２．１×１５０ｍｍＣｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用した。溶出は１％ギ酸（ＳｏｌｖｅｎｔＡ）と８０％アセトニトリル（ＳｏｌｖｅｎｔＢ）を用い、ＳｏｌｖｅｎｔＢの混合比を０％（０分）→０％（２分）→２０％（２０分）→１００％（２４分）→１００％（２６分）と経時的に増加させることにより行った（流速０．３ｍｌ／ｍｉｎ、温度４０℃）。ベタキサンチンはｍ／ｚおよび４７０ｎｍのＵＶ吸収をモニタリングすることで検出した。

（解析結果）
得られたＬＣ／ＭＳ分析結果（全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ））を共発現株ごとに図１（Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）／ＢＭＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ）、図２（Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）／ＢＴＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ）、図３（Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ）に示す。また、生成したベタキサンチンの分子イオンピークのシグナルＡｒｅａ値の経時変化を共発現株ごとに表１（Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）／ＢＭＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ）、表２（Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）／ＢＴＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ）、表３（Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ）に示す。

分析の結果、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）／ＢＭＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）／ＢＴＴＹＲ／ＭｊＤＯＤのいずれの共発現株においても数種類のベタキサンチン類および生合成前駆体であるベタラミン酸の生産が検出された。いずれの共発現株においてもバリン−ベタキサンチンの生産量が最も高く、続いてイソロイシン−ベタキサンチン、ロイシン−ベタキサンチン、フェニルアラニン−ベタキサンチンの順で生産量が高いことが示された。
また、上記３種の共発現株の中では、Ｌ−ＤＯＰＡからドーパキノンへの酸化活性が低いことが公知であるRalstonia solanacearum GMI1000由来チロシナーゼ発現株であるＥ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤにおいて最もベタキサンチン類の生産量が高く、本色素由来の黄色い呈色が強く確認された。
以上より、微生物にチロシナーゼおよびＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼを導入することでベタキサンチンが効率よく生産可能であることが示された。

［実施例２〜８］
休止菌体を用いて、天然型アミノ酸が付加したベタキサンチンの生産を行なった実施例を以下に示す。
（前培養工程）
作製例１で作製したＥ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤを、前培養培地（組成は、実施例１と同様とした。）２ｍｌに植菌し、培養温度３２℃、１８０ｒｐｍで１８時間培養した。

（本培養工程）
得られた前培養液５００μｌを、本培養培地（組成は、実施例１と同様とした。）５０ｍｌに植菌し、培養温度２０℃、２００ｒｐｍで２４時間培養することでタンパク質の発現を誘導した。

（変換工程）
上記の方法で得られた本培養液１０ｍｌを遠心分離（６０００ｒｐｍ、５分間）して得た菌体を一度５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍｌにて洗浄後、再度、遠心分離して菌体を回収した。回収された菌体を反応バッファー［０．１ｍＭＩＰＴＧ、５０μＭＦｅＳＯ_４、４μｇ／ｍｌＣｕＳＯ_４、１０ｍＭアスコルビン酸、５０μｇ／ｍｌＫａｎａｍｙｃｉｎ、１００μｇ／ｍｌＣａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎを含むリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）］２ｍｌにて懸濁した。
得られた懸濁液に、ベタラミン酸の基質となるＬ−チロシンに加え、Ｌ−バリン（実施例２）、Ｌ−フェニルアラニン（実施例３）、Ｌ−トリプトファン（実施例４）、Ｌ−ロイシン（実施例５）、Ｌ−イソロイシン（実施例６）、Ｌ−ヒスチジン（実施例７）、Ｌ−メチオニン（実施例８）を添加した。なお、これらの天然アミノ酸の前記懸濁液中の終濃度は１ｍＭとした。その後、反応温度２０℃、２００ｒｐｍの条件で２４時間反応させた。得られた反応液１ｍｌから遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１分間）して得られた上清を０．４５μｍコスモスピンフィルター（日本ミリポア株式会社製）に通し、ろ液を分析サンプルとした。解析は、実施例１と同様の方法で行なった。

（解析結果）
図４に、実施例２（Ｌ−バリン）で得られた反応溶液のＬＣ／ＭＳ分析結果を示す。図４では、ベタラミン酸の合成基質であるチロシンに加えてバリンを添加した時にベタキサンチン由来の４７０ｎｍのＵＶ吸収を有するバリン−ベタキサンチンの分子イオンピーク（［Ｍ＋Ｈ］^＋＝３１１）が検出された。

また、反応開始後24時間までの生成量の経時変化のグラフ(図５)からは、バリン-ベタ
キサンチン生産量が経時的に増加していることがわかる。実施例２では、添加したバリン以外のアミノ酸由来ベタキサンチンの生成量は極めて少量であった。そのため、休止菌体を利用すると、目的とするアミノ酸が付加されたベタキサンチンの単一生産が可能と考えられる。
また、実施例３〜８で得られた反応溶液についても、実施例２と同様の方法で解析を行ない、その結果を下表に示す。

表４から、Ｌ−バリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−メチオニンを添加すると、添加したアミノ酸が付加したベタキサンチンが生産可能なことがわかる。
実施例２〜８で添加したアミノ酸は、疎水性が比較的高いものである。疎水性アミノ酸は、ベタラミン酸とイミン結合により縮合しやすく、ベタキサンチンが生成しやすい傾向にあることが示唆された。
なお、表４に掲載していないが、Ｌ−リシン、Ｌ−プロリンについても、ベタキサンチンの生成が確認されており、本発明によれば、これらのベタキサンチンの生産も可能であ
る。これらの実施例２〜８より、休止菌体反応時にＬ−チロシンに加えて単一のアミノ酸を添加することで、添加したアミノ酸が付加したベタキサンチンをほぼ単一に生産可能であることがわかる。

［実施例９〜１８］
休止菌体を用いて、非天然型アミノ酸が付加したベタキサンチンの生産を行なった実施例を以下に示す。
（前培養工程、本培養工程、ベタキサンチン生産工程）
実施例２〜８の（変換工程）において、得られた懸濁液に、天然型のアミノ酸に代えて、それぞれ、（Ｓ）−α−プロパルギルアラニン（実施例９）、（Ｓ）−α−メチルバリン（実施例１０）、（Ｓ）−α−アリルアラニン（実施例１１）、（Ｓ）−α−メチルトリプトファン（実施例１２）、（Ｓ）−α−メチル−３−ヨードフェニルアラニン（実施例１３）、（Ｓ）−α−メチル−２−ブロモフェニルアラニン（実施例１４）、（Ｓ）−α−エチルアラニン（実施例１５）、（Ｓ）−α−メチルロイシン（実施例１６）、（Ｓ）−α−メチル−２−ニトロフェニルアラニン（実施例１７）、（Ｓ）−α−メチルフェニルアラニン（実施例１８）を添加したこと以外は、実施例２と同様の条件で、前培養工程、本培養工程、および変換工程を行なった。ここで用いた非天然型アミノ酸は、長瀬産業株式会社製のものであり、純度≧９８％、≧９８％ｅｅのものを用いた。

（解析結果）
図６に、実施例９（（Ｓ）−α−プロパルギルアラニン）で得られた反応溶液のＬＣ／ＭＳ分析結果を示す。図６では、ベタラミン酸の合成基質であるチロシンに加えて非天然型アミノ酸を添加した時に、ベタキサンチン由来の４７０ｎｍのＵＶ吸収を有するプロパルギルアラニン−ベタキサンチン由来の分子イオンピーク（［Ｍ＋Ｈ］^＋＝３２１）が検出された。これにより、目的としていた非天然型ベタキサンチン色素の生産が確認された。また、反応２４時間までの生成量の経時変化のグラフ（図７）からは、プロパルギルアラニン−ベタキサンチン生産量が経時的に増加していることが確認された。
また、実施例１０〜１８についても、同様の方法で解析を行ない、その結果を下表に示す。

実施例１０においては、（Ｓ）−α−メチルバリン−ベタキサンチン、実施例１１においては、（Ｓ）−α−アリルアラニン−ベタキサンチン、実施例１２においては、（Ｓ）−α−メチルトリプトファン−ベタキサンチン、実施例１３においては、（Ｓ）−α−メチル−３−ヨードフェニルアラニン−ベタキサンチン、実施例１４においては、（Ｓ）−α−メチル−２−ブロモフェニルアラニン−ベタキサンチン、実施例１５においては、（Ｓ）−α−エチルアラニン−ベタキサンチン、実施例１６においては、（Ｓ）−α−メチ
ルロイシン−ベタキサンチン、実施例１７においては、（Ｓ）−α−メチル−２−ニトロフェニルアラニン−ベタキサンチン、実施例１８においては、（Ｓ）−α−メチルフェニルアラニン−ベタキサンチンが生産されたことがわかる。実施例９〜１８により、休止菌体反応時にＬ−チロシンに加えて単一の非天然型アミノ酸を添加することで、新規物質である非天然型ベタキサンチンを生産可能であることがわかる。

［作製例２］チロシナーゼ活性、およびＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有
するチロシン生産大腸菌の作製
（１）チロシン生産大腸菌の作製チロシン生産大腸菌は、芳香族アミノ酸生合成に関与する遺伝子の転写制御因子であるｔｙｒＲの遺伝子破壊およびチロシンによるフィードバック阻害に耐性を有するコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ＴｙｒＡ^ｆｂｒ）、フェニルアラニンによるフィードバック阻害に耐性を有するＤＡＨＰ合成酵素（ＡｒｏＧ^ｆｂｒ）の増強により育種した。

Zhangらの文献「Improved RecT or RecET cloning and subcloning method(2001)」の
プロトコールに従い大腸菌（ＢＬ２１Ｓｔａｒ^ＴＭ（ＤＥ３）株）のｔｙｒＲ遺伝子欠損株を取得した。以下この株をＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１Ｓｔａｒ^ＴＭ（ＤＥ３） ΔｔｙｒＲ：：Ｋａｎと称する。
フィードバック耐性コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ＴｙｒＡ^ｆｂｒ）は、大腸菌由来の野生型酵素ＴｙｒＡの遺伝子配列情報をＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）から得て、アミノ酸配列５３番目のメチオニンをイソロイシン、３５４番目のアラニンをバリンに変換した形で遺伝子合成により取得した（配列番号３０）。配列番号３０に記載の遺伝子断片をｐＵＣ５７ベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）のＥｃｏＲＶサイトに挿入したプラスミドを作製した。得られたプラスミドを鋳型として、５’末端に制限酵素ＮｄｅＩサイトを、３’末端に制限酵素ＫｐｎＩサイトを付加した、以下のプライマーを用いたＰＣＲにより遺伝子断片を得た。

ＴｙｒＡ^ｆｂｒ遺伝子増幅用プライマー：配列番号３１、３２
フィードバック耐性ＤＡＨＰ合成酵素（ＡｒｏＧ^ｆｂｒ）は、大腸菌由来の野生型酵素ＡｒｏＧの遺伝子配列情報をＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）から得て、アミノ酸配列１４６番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変換した形で遺伝子合成により取得した（配列番号３３）。ｐＵＣ５７ベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）のＥｃｏＲＶサイトに挿入したプラスミドを作製した。得られたプラスミドを鋳型として、５’末端に制限酵素ＥｃｏＲＩサイトを、３’末端に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを付加した、以下のプライマーを用いたＰＣＲにより遺伝子断片を得た。

ＡｒｏＧ^ｆｂｒ遺伝子増幅用プライマー：配列番号３４、３５
ＰＣＲ反応液組成：鋳型ＤＮＡ２μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ^（Ｒ）ＨＳＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）０．５μｌ、５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＢｕｆｆｅｒ１０μｌ、２．５ｍＭｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ４μｌ、２μＭ各々プライマー５μｌ、滅菌水２４μｌ（これらを混合して全量５０μｌとした。）
反応温度条件：ＴａＫａＲａＰＣＲＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＤｉｃｅＴｏｕｃｈ（型式ＴＰ３５０）を用い、９８℃で１０秒、５５℃で５秒、７２℃で１分からなるサイクルを３０回繰り返した。ただし、１サイクル目の９８℃での保温は１分１０秒とした。

ＰＣＲの増幅産物の確認は、１％アガロース（アガロース−ＲＥ：ナカライテスク株式会社）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い
、ＴｙｒＡ^ｆｂ、ＡｒｏＧ^ｆｂｒ共に約１．０ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的断片の回収はＷｉｚａｒｄ^（Ｒ）ＳＶＧｅｌａｎｄＰＣＲＣｌｅａｎ−ＵＰＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて行った。
得られたＴｙｒＡ^ｆｂｒおよびＡｒｏＧ^ｆｂｒのＰＣＲ断片を、それぞれ、Ｚｅｒｏ
Ｂｌｕｎｔ^（Ｒ）ＴＯＰＯ^（Ｒ）ＰＣＲＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ製）を用いてｐＣＲ^ＴＭ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ^（Ｒ）ベクター（ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ製）に連結した後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。このようにして得られた組み換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅ^ＴＭＨＰＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡを、それぞれ、ＴｙｒＡ^ｆｂｒ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩ、ＡｒｏＧ^ｆｂｒ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩと命名した。

次に、上記ＴｙｒＡ^ｆｂｒ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩを、それぞれ、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩにて制限酵素処理した後、１％アガロース（アガロース−ＲＥ：ナカライテスク株式会社）ゲル電気泳動により分離した。分離されたＴｙｒＡ^ｆｂｒ由来の約１．０ｋｂ遺伝子断片をＷｉｚａｒｄ^（Ｒ）ＳＶＧｅｌａｎｄＰＣＲＣｌｅａｎ−ＵＰＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて回収した。
大腸菌発現ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ製）についても、同様の方法で制限酵素処理、および分離を行ない、約３．８ｋｂの遺伝子断片を回収した。

次いで、上記で得られた、ＴｙｒＡ^ｆｂｒ遺伝子断片と、大腸菌発現ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ−１とをＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。
このようにして得られた組み換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、５０μｇ／ｍｌ
ストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅ^ＴＭＨＰＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡを、ＴｙｒＡ^ｆｂｒ／ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１と命名した。

さらに上記ＡｒｏＧ^ｆｂｒ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩを、それぞれ、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにて制限酵素処理した後、１％アガロース（アガロース−ＲＥ：ナカライテスク株式会社）ゲル電気泳動により分離した。分離されたＡｒｏＧ^ｆｂｒ由来の約１．０ｋｂ遺伝子断片をＷｉｚａｒｄ^（Ｒ）ＳＶＧｅｌａｎｄＰＣＲＣｌｅａｎ−ＵＰＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて回収した。
ＴｙｒＡ^ｆｂｒ／ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１についても、同様の方法で制限酵素処理、および分離を行ない、約４．８ｋｂの遺伝子断片を回収した。

得られた、ＡｒｏＧ^ｆｂｒ遺伝子断片と、ＴｙｒＡ^ｆｂｒ／ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１とをＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。
このようにして得られた組み換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、５０μｇ／ｍｌ
ストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅ^ＴＭＨＰＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡを、ＴｙｒＡ^ｆｂｒ＋ＡｒｏＧ^ｆｂｒ／ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１と命名した。

得られたＴｙｒＡ^ｆｂｒ＋ＡｒｏＧ^ｆｂｒ／ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１を用いて、先に構築したｔｙｒＲ遺伝子欠損株Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１Ｓｔａｒ^ＴＭ（ＤＥ３） ΔｔｙｒＲ：：Ｋａｎを形質転換した。得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンをＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１）ΔｔｙｒＲ：：Ｋａｎ／ＴｙｒＡ^ｆｂｒ＋ＡｒｏＧ^ｆｂｒと命名し、チロシン生産大腸菌とした。

（２）大腸菌用チロシナーゼ、ＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ（ＤＯＤ）共発現プラスミドの構築
上記したｐＵＣ５７に挿入された大腸菌用コドン最適化済みＭｊＤＯＤ遺伝子断片を鋳型として、５’末端に制限酵素ＥｃｏＲＩサイトを、３’末端に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加した、以下のプライマーを用いたＰＣＲにより遺伝子断片を得た。
ＭｊＤＯＤ遺伝子増幅用プライマー：配列番号３６、３７
ＰＣＲ反応液組成、反応温度条件は先の記載と同様である。得られた遺伝子断片をｐＣＲ^ＴＭ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ^（Ｒ）ベクター（ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ製）に連結した後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。このようにして得られた組み換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅ^ＴＭＨＰＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡをＭｊＤＯＤ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩ−２と命名した。

次に、上記ＭｊＤＯＤ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩ−２および先に作製例１の（１）で構築したＢＭＴＹＲ／ｐＥＴＤｕｅｔ−１、ＲＳＴＹＲ／ｐＥＴＤｕｅｔ−１をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにて制限酵素処理した後、１％アガロース（アガロース−ＲＥ：ナカライテスク株式会社）ゲル電気泳動により分離した。ＭｊＤＯＤ由来約０．８ｋｂ遺伝子断片とＢＭＴＹＲ／ｐＥＴＤｕｅｔ−１由来約６．３ｋｂ遺伝子断片、ＲＳＴＹＲ／ｐＥＴＤｕｅｔ−１約６．９ｋｂ遺伝子断片をＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（TOYOBO製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。このようにして得られた組み換え大腸菌を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅ^ＴＭＨＰＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡを、それぞれ、ＢＭＴＹＲ＋ＭｊＤＯＤ／ｐＥＴＤｕｅｔ−１、ＲＳＴＹＲ＋ＭｊＤＯＤ／ｐＥＴＤｕｅｔ−１と命名した。

（３）チロシナーゼおよびＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ共発現チロシン生産大腸菌株の作製
上記（２）で得られたＢＭＴＹＲ＋ＭｊＤＯＤ／ｐＥＴＤｕｅｔ−１、ＲＳＴＹＲ＋ＭｊＤＯＤ／ｐＥＴＤｕｅｔ−１を用いて上記（１）で得られたチロシン生産大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）ΔｔｙｒＲ：：Ｋａｎ／ＴｙｒＡ^ｆｂｒ＋ＡｒｏＧ^ｆｂｒを形質転換した。得られた組換え大腸菌を１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌ
カナマイシン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、それぞれ、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）ΔｔｙｒＲ：：Ｋａｎ／ＴｙｒＡ^ｆｂｒ＋ＡｒｏＧ^ｆｂｒ／ＢＭＴＹＲ＋ＭｊＤＯＤ、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）ΔｔｙｒＲ：：Ｋａｎ／ＴｙｒＡ^ｆｂｒ＋ＡｒｏＧ^ｆｂｒ／ＲＳＴＹＲ＋ＭｊＤＯＤと命名し、ベタキサンチン生産株として以下の糖質を原料としたベタキサン
チン生産試験に用いた。

［実施例１９］
まず、上記で作製した微生物を、以下の方法で培養した。
（前培養工程）
作製例２で作製した２種類のベタキサンチン生産株Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）ΔｔｙｒＲ：：Ｋａｎ／ＴｙｒＡ^ｆｂｒ＋ＡｒｏＧ^ｆｂｒ／ＢＭＴＹＲ＋ＭｊＤＯＤ、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）ΔｔｙｒＲ：：Ｋａｎ／ＴｙｒＡ^ｆｂｒ＋ＡｒｏＧ^ｆｂｒ／ＲＳＴＹＲ＋ＭｊＤＯＤを、それぞれ前培養培地［５×Ｍ９ＭｉｎｉｍａｌＳａｌｔｓ４００μｌ、１ＭＣａＣｌ_２０．２μｌ、１ＭＭｇＳＯ_４４μｌ、１００ｇ／ＬＣａｓａｍｉｎｏａｃｉｄ２００μｌ、１ＭＧｌｕｃｏｓｅ４４μｌ、１％Ｔｈｉａｍｉｎｅ４μｌ、５０ｍＭＦｅＳＯ_４２μｌ、４０ｍｇ／ｍｌＣｕＳＯ_４２μｌ、５０ｍｇ／ｍｌＫａｎａｍｙｃｉｎ２μｌ、１００ｍｇ／ｍｌＣａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ２μｌ、５０ｍｇ／ｍｌＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ２μｌを、全量２ｍｌとなるように滅菌水に溶解したもの］２ｍｌに植菌し、培養温度３２℃、１８０ｒｐｍで２０時間培養した。

（本培養、変換工程）
上記で得られた前培養液を、本培養培地［５×Ｍ９ＭｉｎｉｍａｌＳａｌｔｓ４ｍｌ、１ＭＣａＣｌ_２２μｌ、１ＭＭｇＳＯ_４４０μｌ、４０ｇ／ＬＮＨ_４Ｃｌ１．５ｍｌ、１００ｇ／ＬＣａｓａｍｉｎｏａｃｉｄ２ｍｌ、１％Ｔｈｉａｍｉｎｅ４０μｌ、５０ｍＭＦｅＳＯ_４２０μｌ、４０ｍｇ／ｍｌＣｕＳＯ_４２０μｌ、５０ｍｇ／ｍｌＫａｎａｍｙｃｉｎ２０μｌ、１００ｍｇ／ｍｌＣａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ２０μｌ、５０ｍｇ／ｍｌＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ２０μｌ、ＯｖｅｒｎｉｇｈｔＥｘｐｒｅｓｓ^ＴＭＡｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ１ＯｎＥｘＳｏｌｕｔｉｏｎ１４００μｌ、ＯｎＥｘＳｏｌｕｔｉｏｎ２１ｍｌ、およびＯｎＥｘＳｏｌｕｔｉｏｎ３２０μｌを、全量２０ｍｌになるように滅菌水に溶解したもの］２０ｍｌにＯＤ６００＝０．３となるように植菌し、培養温度２０℃、１８０ｒｐｍ、２７時間培養し、タンパク発現誘導を行った。その後、１Ｍアスコルビン酸のみ２００μｌ添加し、さらに２１時間培養することで糖質を原料としたベタキサンチン生産を行った。得られた培養液１ｍｌから遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１分間）して得られた上清を０．４５μｍコスモスピンフィルター（日本ミリポア株式会社製）に通し、ろ液を分析サンプルとした。
解析は、実施例１と同様の方法で行なった。

（解析結果）
得られたＬＣ／ＭＳ分析結果（全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）およびＵＶ４７０ｎｍ）を図８（Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）ΔｔｙｒＲ：：Ｋａｎ／ＴｙｒＡ^ｆｂｒ＋ＡｒｏＧ^ｆｂｒ／ＢＭＴＹＲ＋ＭｊＤＯＤ）、図９（Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）ΔｔｙｒＲ：：Ｋａｎ／ＴｙｒＡ^ｆｂｒ＋ＡｒｏＧ^ｆｂｒ／ＲＳＴＹＲ＋ＭｊＤＯＤ）に示す。また、培養４８時間目の生成したベタキサンチンの分子イオンピークのシグナルＡｒｅａ値の値を表６（Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）ΔｔｙｒＲ：：Ｋａｎ／ＴｙｒＡ^ｆｂｒ＋ＡｒｏＧ^ｆｂｒ／ＢＭＴＹＲ＋ＭｊＤＯＤ）、表７（Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）ΔｔｙｒＲ：：Ｋａｎ／ＴｙｒＡ^ｆｂｒ＋ＡｒｏＧ^ｆｂｒ／ＲＳＴＹＲ＋ＭｊＤＯＤ）に示す。

分析の結果、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）ΔｔｙｒＲ：：Ｋａｎ／ＴｙｒＡ^ｆｂｒ＋ＡｒｏＧ^ｆｂｒ／ＢＭＴＹＲ＋ＭｊＤＯＤ、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）ΔｔｙｒＲ：：Ｋａｎ／ＴｙｒＡ^ｆｂｒ＋ＡｒｏＧ^ｆｂｒ／ＲＳＴＹＲ＋ＭｊＤＯＤ両株ともに、培地中の糖質を原料として自ら生産したチロシンを利用することで、数種のベタキサンチン類およびベタキサンチンの前駆体であるベタラミン酸を生産することが確認された。両株共、バリン
‐ベタキサンチンの生成量が最も多く、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）ΔｔｙｒＲ：：Ｋａｎ／ＴｙｒＡ^ｆｂｒ＋ＡｒｏＧ^ｆｂｒ／ＢＭＴＹＲ＋ＭｊＤＯＤにおいては、次いでロイシン‐ベタキサンチン、イソロイシン‐ベタキサンチン、プロリン‐ベタキサンチン、リシン‐ベタキサンチン、フェニルアラニン‐ベタキサンチンの順で多く、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）ΔｔｙｒＲ：：Ｋａｎ／ＴｙｒＡ^ｆｂｒ＋ＡｒｏＧ^ｆｂｒ／ＲＳＴＹＲ＋ＭｊＤＯＤにおいては、Ｌ−ＤＯＰＡ−ベタキサンチン、ロイシン‐ベタキサンチン、イソロイシン‐ベタキサンチン、プロリン‐ベタキサンチン、フェニルアラニン‐ベタキサンチン、リシン‐ベタキサンチンの順で多く生産していた。この蓄積傾向は実施例１とほぼ同様の傾向を示していた。

また実施例１同様、Ralstonia solanacearum GMI1000由来チロシナーゼを用いたＥ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）ΔｔｙｒＲ：：Ｋａｎ／ＴｙｒＡ^ｆｂｒ＋ＡｒｏＧ^ｆｂｒ／ＲＳＴＹＲ＋ＭｊＤＯＤにおいてベタキサンチン類の生産量が高く、本色素由来の黄色い呈色が強く確認された。
以上より、チロシン生産大腸菌にチロシナーゼおよびＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼを導入することでチロシンを添加することなく、糖質を原料としてベタキサンチンが効率よく生産可能であることが示された。

［作製例３］チロシナーゼ活性、およびＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有
する酵母の作製
（１）酵母用チロシナーゼ発現プラスミドの構築
Bacillus megaterium DSM 319, Ralstonia solanacearum GMI1000由来の２種類のチロ
シナーゼ（以下、この２種類のチロシナーゼを、それぞれ、ＢＭＴＹＲ，ＲＳＴＹＲと称する）の遺伝子配列情報をＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）から得て、遺伝子合成により酵母のコドン頻度に最適化した。得られた最適化された遺伝子断片の全遺伝子配列（ｙＢＭＴＹＲおよびｙＲＳＴＹＲ）を、それぞれ、配列番号２１、２２に示す。配列番号２１、２２の遺伝子断片を、ｐＵＣ５７ベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）のＥｃｏＲＶサイトに挿入したプラスミドを作製した。得られたプラスミドを鋳型として、５’末端に制限酵素ＢａｍＨＩサイトを、３’末端に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加した、以下のプライマーを用いたＰＣＲにより各遺伝子断片を得た。

ｙＢＭＴＹＲ遺伝子増幅用プライマー：配列番号２３、２４
ｙＲＳＴＹＲ遺伝子増幅用プライマー：配列番号２５、２６
ＰＣＲ反応液組成：鋳型ＤＮＡ２μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ^（Ｒ）ＨＳＤＮＡ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）０．５μｌ、５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＢｕｆｆｅｒ１０μｌ、２．５ｍＭｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ４μｌ、２μＭ各々プライマー５μｌ、滅菌水２４μｌ（これらを混合して全量５０μｌとした。）反応温度条件：ＴａＫａＲａＰＣＲＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＤｉｃｅＴｏｕｃｈ（型式ＴＰ３５０）を用い、９８℃で１０秒、５５℃で５秒、７２℃で１分（ＢＭＴＹＲ）、１分３０秒（ＲＳＴＹＲ）からなるサイクルを３０回繰り返した。ただし、１サイクル目の９８℃での保温は１分１０秒とした。

ＰＣＲの増幅産物の確認は、１％アガロース（アガロース−ＲＥ：ナカライテスク株式会社）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、ｙＢＭＴＹＲは約０．９ｋｂ、ｙＲＳＴＹＲは約１．５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的断片の回収はＷｉｚａｒｄ^（Ｒ）ＳＶＧｅｌａｎｄＰＣＲＣｌｅａｎ−ＵＰＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて行った。
得られたチロシナーゼのＰＣＲ断片を、それぞれ、ＺｅｒｏＢｌｕｎｔ^（Ｒ）ＴＯＰＯ^（Ｒ）ＰＣＲＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ製）を用いてｐＣ
Ｒ^ＴＭ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ^（Ｒ）ベクター（ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ製）に連結した後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。このようにして得られた組み換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅ^ＴＭＨＰ
ＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡを、それぞれ、ｙＢＭＴＹＲ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩ、ｙＲＳＴＹＲ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩと命名した。

次に、上記ｙＢＭＴＹＲ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩ、ｙＲＳＴＹＲ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩを、それぞれ、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにて制限酵素処理した後、１％アガロース（アガロース−ＲＥ：ナカライテスク株式会社）ゲル電気泳動により分離した。分離されたｙＢＭＴＹＲ由来の約０．９ｋｂ遺伝子断片、ｙＲＳＴＹＲ由来の約１．５ｋｂ遺伝子断片をＷｉｚａｒｄ^（Ｒ）ＳＶＧｅｌａｎｄＰＣＲＣｌｅａｎ−ＵＰ
Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて回収した。
酵母用発現ベクターｐＥＳＣ−ＬＥＵ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）についても、同様の方法で制限酵素処理、および分離を行ない、約７．８ｋｂの遺伝子断片を回収した。

次いで、上記で得られた、それぞれのチロシナーゼ遺伝子断片と、酵母発現ベクターｐＥＳＣ−ＬＥＵとをＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。
このようにして得られた組み換え大腸菌を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅ^ＴＭＨＰＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡを、それぞれ、ｙＢＭＴＹＲ／ｐＥＳＣ−ＬＥＵ、ｙＲＳＴＹＲ／ｐＥＳＣ−ＬＥＵと命名した。

（２）酵母用ＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ（ＤＯＤ）発現プラスミドの構築
オシロイバナ（Mirabilis jalapa）由来のＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ（以下、「ＭｊＤＯＤ」と称する。）遺伝子配列情報１種類をＮＣＢＩから得て、遺伝子合成により酵母のコドン頻度に最適化した。最適化したＭｊＤＯＤの全遺伝子配列（ｙＭｊＤＯＤ）を配列番号２７に示す。配列番号２７に記載の配列を、ｐＵＣ５７ベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）のＥｃｏＲＶサイトに挿入した。得られたプラスミドを鋳型として、５’末端に制限酵素ＢａｍＨＩサイトを、３’末端に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加したプライマー（配列番号２８、および２９）を用いたＰＣＲにより遺伝子断片を得た。

反応液組成：鋳型ＤＮＡ２μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ^（Ｒ）ＨＳＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）０．５μｌ、５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＢｕｆｆｅｒ１０μｌ、２．５ｍＭｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ４μｌ、２μＭ各々プライマー５μｌ、滅菌水２４μｌ（これらを混合して全量５０μｌとした。）
反応温度条件：ＴａＫａＲａＰＣＲＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＤｉｃｅＴｏｕｃｈ（型式ＴＰ３５０）を用い、９８℃で１０秒、５５℃で５秒、７２℃で１分からなるサイクルを３０回繰り返した。ただし、１サイクル目の９８℃での保温は１分１０秒とした。

増幅産物の確認、およびゲルからの目的断片の回収は、前記「（１）酵母用チロシナーゼ発現プラスミドの構築」に記載の方法と同様にして行い、約０．８ｋｂのｙＭｊＤＯＤ由来遺伝子断片を検出し、回収した。
得られたｙＭｊＤＯＤのＰＣＲ断片をＺｅｒｏＢｌｕｎｔ^（Ｒ）ＴＯＰＯ^（Ｒ）ＰＣＲＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いてｐＣＲ^ＴＭ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ^（Ｒ）ベクター（ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ製）に連結した後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。

このようにして得られた組み換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅ^ＴＭＨＰＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。ここで得られたプラスミドＤＮＡをｙＭｊＤＯＤ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩと命名した。

次に、上記ｙＭｊＤＯＤ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩを、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにて制限酵素処理した後、１％アガロースゲル電気泳動により分離し、約０．８ｋｂ遺伝子断片をＷｉｚａｒｄ^（Ｒ）ＳＶＧｅｌａｎｄＰＣＲＣｌｅａｎ−ＵＰＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて回収した。
ｐＥＳＣ−ＬＥＵベクターと共存可能な酵母発現ベクターであるｐＥＳＣ−ＵＲＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）についてもＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにて制限酵素処理した後、同様の方法で分離し、約６．６ｋｂの遺伝子断片を回収した。

ＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈＶｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いて、上記のｙＭｊＤＯＤ遺伝子断片と酵母発現ベクターｐＥＳＣ−ＵＲＡとを連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。
このようにして得られた組み換え大腸菌を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅ^ＴＭＨＰＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡをｙＭｊＤＯＤ／ｐＥＳＣ−ＵＲＡと命名した。

（３）チロシナーゼおよびＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ共発現酵母株の作製
上記（１）および（２）で作製した、ｙＢＭＴＹＲ／ｐＥＳＣ−ＬＥＵおよびｙＭｊＤＯＤ／ｐＥＳＣ−ＵＲＡ、ｙＲＳＴＹＲ／ｐＥＳＣ−ＬＥＵおよびｙＭｊＤＯＤ／ｐＥＳＣ−ＵＲＡの混合プラスミドで、それぞれ、サッカロミセス・セレビジエＹＰＨ５００株（ＭＡＴα ｕｒａ３ｌｙｓ２ａｄｅ２ｔｒｐ１ｈｉｓ３ｌｅｕ２）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を酢酸リチウム法（Ito,H.et al, (1983) J. Bacteriol. 153(1), 163-168）、もしくはエレクトロポレーション法（Fromm ME,et al.,(1986) Nature 319(6056):791-793）で形質転換した。得られた組換え酵母をＹｅａｓｔＳｙｎｔｈｅｔｉｃＤｒｏｐ−ｏｕｔＭｅｄｉｕｍＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓｗｉｔｈｏｕｔｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，ｌｅｕｃｉｎｅ，ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎａｎｄｕｒａｃｉｌ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）および２０ｍｇ／Ｌトリプトファン、２０ｍｇ／Ｌのヒスチジンを含有するＳＤ寒天培地（０．６７％ＹｅａｓｔＮｉｔｒｏｇｅｎＢａｓｅｗ／ｏＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社）、２％グルコース、２％寒天）に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、それぞれ、ＹＰＨ５００／ＢＭＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ、ＹＰＨ５００／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤと命名し、ベタキサンチン生産酵母株として以下のベタキサンチン生産試験に用いた。

［実施例２０］
休止菌体を用いて、ベタキサンチン生産を行った実施例を以下に示す。
（前培養工程）
作製例３で作製したＹＰＨ５００／ＢＭＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ、ＹＰＨ５００／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤをＹｅａｓｔＳｙｎｔｈｅｔｉｃＤｒｏｐ−ｏｕｔＭｅｄｉｕｍＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓｗｉｔｈｏｕｔｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，ｌｅｕｃｉｎｅ，ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎａｎｄｕｒａｃｉｌ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）および２０ｍｇ／Ｌトリプトファン、２０ｍｇ／Ｌのヒスチジンを含有するＳＤ培地２ｍｌに植菌し、培養温度３０℃、１８０ｒｐｍで１８時間培養した。

（本培養工程）
得られた前培養液をＯＤ６００＝０．２となるようにＹｅａｓｔＳｙｎｔｈｅｔｉｃ
Ｄｒｏｐ−ｏｕｔＭｅｄｉｕｍＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓｗｉｔｈｏｕｔｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，ｌｅｕｃｉｎｅ，ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎａｎｄｕｒａｃｉｌ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）および２０ｍｇ／Ｌトリプトファン、２０ｍｇ／Ｌのヒスチジンを含有するＳＲ培地（０．６７％ＹｅａｓｔＮｉｔｒｏｇｅｎＢａｓｅｗ／ｏ
ＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社）、２％ラフィノース）２０ｍｌに添加し、培養温度３０℃、１８０ｒｐｍで培養した。ＯＤ６００＝０．７となった時点でガラクトース（終濃度２％）及びＣｕＳＯ_４（終濃度４０μｇ／ｍｌ）、ＦｅＳＯ_４（終濃度５０μＭ）を添加し、タンパク発現誘導を行った。引き続き、培養を継続し、培養後９時間においてガラクトース（終濃度１％）及びラフィノース（終濃度１％）を、培養後２４時間目においてリシン（終濃度３０ｍｇ／Ｌ）及びトリプトファン（終濃度２０ｍｇ／Ｌ）、ヒスチジン（終濃度２０ｍｇ／Ｌ）、アデニン（終濃度２０ｍｇ／Ｌ）を添加し、５０時間目まで培養を実施した。

（変換工程）
上記の方法で得られた培養液全量を遠心分離（６０００ｒｐｍ、５分間）して得た菌体を一度５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍｌにて洗浄後、再度、遠心分離して菌体を回収した。回収された菌体を反応バッファー［５０μＭＦｅＳＯ_４、４μｇ／ｍｌＣｕＳＯ_４、１０ｍＭアスコルビン酸を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）］４ｍｌにて懸濁した。得られた懸濁液に基質となるＬ−チロシンを添加することで反応を開始し、３０ ℃、１８０ｒｐｍにて２４時間反応させた。得られた反応液から遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１分間）した上清を０．４５μｍコスモスピンフィルター（日本ミリポア株式会社製）に通し、ろ液を分析サンプルとした。
解析は、実施例１と同様の方法で行なった。

（解析結果）
得られたＬＣ／ＭＳ分析結果（抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）およびＵＶ４７０ｎｍ）を図１０（ＹＰＨ５００／ＢＭＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ）、図１１（ＹＰＨ５００／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ）に示す。また、生成したベタキサンチンの分子イオンピークのシグナルＡｒｅａ値の経時変化を表８（ＹＰＨ５００／ＢＭＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ）、表９（ＹＰＨ５００／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ）に示す。

分析の結果、ＹＰＨ５００／ＢＭＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ、ＹＰＨ５００／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ両株ともに、数種のベタキサンチン類およびベタキサンチンの前駆体であるベタラミン酸を生産することが確認された。両株共、グリシン‐ベタキサンチンの生成量が最も多く、ＹＰＨ５００／ＢＭＴＹＲ／ＭｊＤＯＤにおいては、次いでプロリン‐ベタキサンチン、ＤＯＰＡ−ベタキサンチン、イソロイシン−ベタキサンチン、バリン−ベタキサンチン、ロイシン−ベタキサンチンの順で多く生産しており、ＹＰＨ５００／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤにおいては、ＤＯＰＡ−ベタキサンチン、プロリン‐ベタキサンチン、イソロイシン−ベタキサンチン、バリン−ベタキサンチンの順で多く生産していた。以上より、酵母にチロシナーゼおよびＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼを導入することでベタキサンチンが生産可能であることが示された。

Claims

ベタキサンチンの製造方法であって、
該ベタキサンチンが、チロシン以外のアミノ酸またはアミンが付加されたものであり、
チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性、およびＤＯＰＡ４，５−ジオキ
シゲナーゼ活性を有する大腸菌または酵母の存在下、水性媒体中で原料をベタキサンチン
へと変換する工程（変換工程）を有し、
該原料に加えて、該チロシン以外のアミノ酸またはアミンを添加することを特徴とする
、ベタキサンチンを製造する方法。
前記変換工程の前に、チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性、およびＤ
ＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有する微生物を水性媒体中で培養する工程（培
養工程）を有することを特徴とする、請求項１に記載のベタキサンチンを製造する方法。
前記変換工程の後に、前記水性媒体からベタキサンチンを回収する工程（回収工程）を
有することを特徴とする、請求項１または請求項２に記載のベタキサンチンを製造する方
法。
前記チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素がチロシナーゼであることを特徴
とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のベタキサンチンを製造する方法。
前記変換工程において、前記微生物として休止菌体を用いることを特徴とする、請求項
１〜４のいずれか一項に記載のベタキサンチンを製造する方法。
前記原料がチロシン、および／または糖質原料であることを特徴とする、請求項１〜５
のいずれか一項に記載のベタキサンチンを製造する方法。
前記変換工程において、前記水性媒体が、アスコルビン酸、銅および鉄からなる群から
選ばれる少なくとも一種を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の
ベタキサンチンを製造する方法。
前記ベタキサンチンが、チロシン以外のアミノ酸が付加されたベタキサンチンであり、
前記原料に加えて、該チロシン以外のアミノ酸を添加することを特徴とする、請求項１
〜７のいずれか一項に記載のベタキサンチンを製造する方法。
前記ベタキサンチンが、アミンが付加されたベタキサンチンであり、
前記原料に加えて、該アミンを添加することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一
項に記載のベタキサンチンを製造する方法。
前記ベタキサンチンが、非天然型のアミノ酸が付加されたベタキサンチンであり、
前記原料に加えて、該非天然型アミノ酸を添加することを特徴とする、請求項１〜７の
いずれか一項に記載のベタキサンチンを製造する方法。