JPWO2012036257A1 - 血小板の機能を維持するための組成物 - Google Patents

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Abstract

下記一般式(I):【化1】[式中、Xは、フェニレン基;Yは、水素原子、または−(CH2)mR1;mは0〜4のいずれかの整数;R1は、−NR5COR2、−NR5SO2R2、または−NR3R4;R2は、C1〜C6アルキル基、アリール基、またはC1〜C6アルコキシ基等;R3およびR4は、C1〜C6アルキル基等;R5は、水素原子、C1〜C6アルキル基等;Zは、水素原子またはC1〜C6アルキル基を示す。]で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を有効成分とする、血小板の機能を維持するための組成物。

Description

本発明は、N−ヒドロキシホルムアミド誘導体を利用した、血小板の機能を維持するための組成物、血小板を調製するための方法、血小板を含む血液製剤、並びに血液製剤における血小板の機能を維持するための方法に関する。
白血病に代表される血液関連疾患の治療に対し、治療に必要な量の血球細胞を安定に増殖させて供給することは極めて重要なことであるため、これまでに多くの研究者によって、造血幹細胞又は造血前駆細胞を効率的に増殖させようとする試みがなされてきた。
血球細胞の中で巨核球は、血小板前駆細胞、すなわち血小板を産生せしめる細胞でありproplatelet(胞体突起)構造を経て血小板を産生することが知られており、治療的な応用において重要な位置づけにある。血小板は血液凝固(止血)において必須であるため、白血病、骨髄移植、抗癌治療などにおける需要が極めて高い。
血小板の生産においては、これまでドナーからの献血により採取する方法の他、トロンボポイエチン(TPO)を投与する方法の利用や、臍帯血又は骨髄細胞から巨核球を分化させる方法の利用などが試みられてきた。最近では、造血前駆細胞を生体外において増殖させ、これらの前駆細胞から血小板を調製する方法なども試みられるようになった。例えば、本発明者らは、ヒト胚性幹細胞(ES細胞)から造血前駆細胞を内包するネット様構造物を調製し、このネット様構造物から比較的大量かつ効率的に血小板の産生を行う方法(特許文献1)や、人工多能性幹細胞(iPS細胞)からインビトロの培養系により、成熟巨核細胞および血小板を効率的に調製する方法(特許文献2)等を報告している。
このように、血小板自体を細胞外において調製する方法の研究は進展しているものの、調製された血小板の機能は安定性に乏しいことから、長期保存に耐えうる機能的血小板を大量に調製しうる方法の開発が必要とされている。
血小板と細胞外マトリックスとの結合は、血液凝固(止血、血栓形成など)が誘導される上で重要な過程である。この過程は、血小板受容体GPIbが、αサブユニット(GPIbα)を介してフォン・ウィルブランド因子(von Willebrand factor:VWF)と結合することよって、開始されると考えられている。しかしながら、37℃付近の条件下においては、メタロプロテアーゼのADAM17(a disintegrin and metallopeptidase domain 17)がGPIbαの細胞外領域をシェディング(Shedding、切断して除去)してしまうことにより、GPIbαとVWFとの会合が阻害され、血小板の血液凝固機能が失われてしまうことが報告されている(非特許文献1及び非特許文献2)。
このためインビトロにおいて調製した血小板の機能を保持するためには、少なくともADAM17の活性を抑制する必要があることが予想される。実際、本発明者らによって、メタロプロテアーゼ活性を直接阻害する阻害剤(GM6001等)、あるいは、ADAM17等のメタロプロテアーゼ活性の活性化を間接的に阻害するp38MAPキナーゼ阻害剤を、タイミング良く添加することにより、インビトロにおいて調製した血小板の機能を保持することができることが報告されている(特許文献3)。
しかしながら、GM6001等の阻害剤はADAM17のみならず、他のメタロプロテアーゼ(特に造血機能に必須なMMP9やMMP14)の活性も阻害してしまうため、これら阻害剤を利用したインビトロでの血小板の調製においては、これら阻害剤を血小板産生が最も観察される一定時期に添加することが必要であった。一貫性及び再現性が乏しい細胞培養においてそのタイミングを見計らうといった煩雑な作業を要するため、これら阻害剤を利用した血小板の調製方法は、機能的血小板を大量に調製するという点、特に血小板産生系のプラント化においては、未だ十分なものではなかった。
さらに、非選択的なメタロプロテアーゼ阻害剤は,膜型及び遊離型メタロプロテアーゼやADAM等、すべてのメタロプロテアーゼ活性を阻害してしまう為に、生体内部での使用によって、各種の副作用(臓器毎に作用する必須MMPあるいはADAMを阻害する事による弊害)が発揮される危険性が生じると考えられている。実際に、非選択的なメタロプロテアーゼ阻害剤は、筋骨格シンドロームと呼ばれる重篤な副作用を引き起こすため、これら多くの阻害剤の開発は中止に至っている(非特許文献3)。また、GM6001のようなヒドロキサム酸構造を有する阻害剤は、変異原性を有することが示唆されている(非特許文献4)。従って、かかる阻害剤を用いた方法によって得られた血小板は、安全性という点においても、未だ十分なものではなかった。
一方、現在のところ、生体から調製した血小板を保存する方法としては、20℃から24℃において攪拌しながら保存する方法以外に有効な方法が存在しないことから、血小板の機能を保持するためにADAM17のメタロプロテアーゼ活性を抑制する方法を利用する場合も、かかる室温(20℃から24℃)条件下において血小板の調製を行うことが有効であるとも考えられる。しかしながら、これまでのところ、室温条件下において、臍帯血又は骨髄細胞から巨核球に分化させることが可能であるかどうか、また、ES細胞等に由来する造血前駆細胞から血小板を産生させることが可能であるかどうかについては何ら検証がなされていない。
以上のように、血小板の機能を維持するための組成物の有効成分として実用化可能な化合物は未だ見出されておらず、このため、機能的に安定した血小板をインビトロにおいて取得するための方法、特に安全性の高い血小板の大量生産に適した方法が確立されていないのが現状である。
国際公開2008/041370号 国際公開2009/122747号 国際公開2009/119105号
Bergmeierら、Circulation Research、2004年、95巻、660〜670ページ Bergmeierら、Blood、2003年、102巻、4229〜4235ページ Petersonら、Cardiovasc.Res.、2006年、69巻、677〜687ページ Skipperら、Cancer Res.、1980年、40巻、4704〜4708ページ
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、ADAM17のメタロプロテアーゼ活性を特異的に抑制し、GPIbαのシェディングを抑制することによって、血小板の機能を維持することを可能とする化合物を同定することにある。さらなる本発明の目的は、同定した化合物を利用して血小板の機能を維持する組成物を提供すること、効率的に血小板を産生すること、および血液製剤の品質維持の向上を図ることにある。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ES細胞やiPS細胞等に由来する造血前駆細胞から巨核球への分化誘導や、該巨核球からの血小板産生は、25℃の室温条件での培養では行うことができず、37℃付近の培養条件が好ましいことを見出した。そこで、本発明者らは、次に、37℃付近の培養において生じるADAM17によるGPIbαのシェディングを特異的に抑制しうる化合物の探索を行った。その結果、特定の構造を有するN−ヒドロキシホルムアミド誘導体が、ADAM17に対して特異的な阻害作用を有し、血小板を産生させる培養系やヒト末梢血由来の血小板に添加した場合、GPIbαのシェディングが抑制され、37℃付近の温度条件下においても血小板の機能が維持されることを見出した。本発明者らは、同定したN−ヒドロキシホルムアミド誘導体のこのような作用から、当該誘導体が効率的な血小板の産生や血小板を含む血液製剤の品質維持の向上などにおいて極めて有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
(1)下記一般式(I):
[式中、Xは、フェニレン基;
Yは、水素原子、または−(CH
mは0〜4のいずれかの整数;
は、
は、置換されていてもよいC1〜C6アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはC1〜C6アルコキシ基;
およびRは、それぞれ独立して水素原子、C1〜C6アルキル基、あるいはRとRが隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい;
は、水素原子、C1〜C6アルキル基、またはC1〜C6アルキルスルホニル基;
Zは、水素原子またはC1〜C6アルキル基を示す。]
で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を有効成分とする、血小板の機能を維持するための組成物。
(2)前記一般式(I)で表わされる化合物が、
N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(4−ジエチルアミノメチルフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド、または
N−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]ベンジル}メタンスルホンアミド、
である、(1)に記載の組成物。
(3)血小板の機能を維持するための試薬または血小板を含む血液製剤への添加剤である、(1)または(2)に記載の組成物。
(4)巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系に、下記一般式(I):
[式中、Xは、フェニレン基;
Yは、水素原子、または−(CH
mは0〜4のいずれかの整数;
は、
は、置換されていてもよいC1〜C6アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはC1〜C6アルコキシ基;
およびRは、それぞれ独立して水素原子、C1〜C6アルキル基、あるいはRとRが隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい;
は、水素原子、C1〜C6アルキル基、またはC1〜C6アルキルスルホニル基;
Zは、水素原子またはC1〜C6アルキル基を示す。]
で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を添加することを特徴とする、血小板を調製するための方法。
(5)前記一般式(I)で表わされる化合物が、
N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(4−ジエチルアミノメチルフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド、または
N−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]ベンジル}メタンスルホンアミド、
である、(4)に記載の方法。
(6)前記培養系における培養温度が35〜38℃であることを特徴とする、(4)または(5)に記載の方法。
(7)巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系に、下記一般式(I):
[式中、Xは、フェニレン基;
Yは、水素原子、または−(CH
mは0〜4のいずれかの整数;
は、
は、置換されていてもよいC1〜C6アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはC1〜C6アルコキシ基;
およびRは、それぞれ独立して水素原子、C1〜C6アルキル基、あるいはRとRが隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい;
は、水素原子、C1〜C6アルキル基、またはC1〜C6アルキルスルホニル基;
Zは、水素原子またはC1〜C6アルキル基を示す。]
で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を添加した培養物。
(8)前記一般式(I)で表わされる化合物が、
N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(4−ジエチルアミノメチルフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド、または
N−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]ベンジル}メタンスルホンアミド、
である、(7)に記載の培養物。
(9)下記一般式(I):
[式中、Xは、フェニレン基;
Yは、水素原子、または−(CH
mは0〜4のいずれかの整数;
は、
は、置換されていてもよいC1〜C6アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはC1〜C6アルコキシ基;
およびRは、それぞれ独立して水素原子、C1〜C6アルキル基、あるいはRとRが隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい;
は、水素原子、C1〜C6アルキル基、またはC1〜C6アルキルスルホニル基;
Zは、水素原子またはC1〜C6アルキル基を示す。]
で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物が添加された、血小板を含む血液製剤。
(10)前記一般式(I)で表わされる化合物が、
N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(4−ジエチルアミノメチルフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド、または
N−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]ベンジル}メタンスルホンアミド、
である、(9)に記載の血液製剤。
(11)下記一般式(I):
[式中、Xは、フェニレン基;
Yは、水素原子、または−(CH
mは0〜4のいずれかの整数;
は、
は、置換されていてもよいC1〜C6アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはC1〜C6アルコキシ基;
およびRは、それぞれ独立して水素原子、C1〜C6アルキル基、あるいはRとRが隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい;
は、水素原子、C1〜C6アルキル基、またはC1〜C6アルキルスルホニル基;
Zは、水素原子またはC1〜C6アルキル基を示す。]
で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を、血小板を含む血液製剤に添加することを特徴とする、血液製剤における血小板の機能を維持するための方法。
(12)前記一般式(I)で表わされる化合物が、
N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(4−ジエチルアミノメチルフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド、または
N−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]ベンジル}メタンスルホンアミド、
である、(11)に記載の方法。
本発明において見出されたN−ヒドロキシホルムアミド誘導体によれば、ADAM17のメタロプロテアーゼ活性を特異的に抑制し、GPIbαのシェディングを抑制することによって、37℃付近の温度条件下においても血小板の機能を維持することが可能である。従って、当該誘導体によれば、インビトロにおいて、機能的に安定した血小板を大量に生産することが可能であり、また、血小板を含む血液製剤の品質の安定化を図ることができる。
室温条件下における、ES細胞等由来の造血前駆細胞から巨核球/血小板への誘導方法を示す概略図である。 室温条件下での培養において、ES細胞由来の造血前駆細胞から産生された巨核球数を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数/wellである。 室温条件下での培養において、ES細胞由来の造血前駆細胞から産生された血小板の総数を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数/wellである。 室温条件下での培養において、臍帯血由来のCD34(+)細胞から産生された巨核球数を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数/wellである。 室温条件下での培養において、臍帯血由来のCD34(+)細胞から産生された血小板の総数を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数/wellである。 <プロトコール1>は、ES細胞又はiPS細胞由来の造血前駆細胞から巨核球/血小板への誘導する過程において、本発明にかかる化合物(S−45282又はS−45457)等を添加した時期を示す。<プロトコール2>は、ヒトの末梢血から洗浄血小板を調製し、本発明にかかる化合物(S−45282又はS−45457)等を添加したことを示す。 GM6001又はS−45282を2日間培養系に添加した際(2days)の、各化合物のES細胞由来血小板に対する機能維持効果について検証した結果を示すグラフである。縦軸は血小板総数(CD41(+))を100とした時の、CD42b(GPIbα)(+)およびCD42b(GPIbα)(−)の割合(%)を表す。 GM6001又はS−45282を2日間培養系に添加した際(2days)に得られたES細胞由来血小板の総数を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数/wellである。 GM6001又はS−45282を8日間培養系に添加した際(8days)の、各化合物のES細胞由来血小板に対する機能維持効果について検証した結果を示すグラフである。縦軸は血小板総数(CD41(+))を100とした時の、CD42b(GPIbα)(+)およびCD42b(GPIbα)(−)の割合(%)を表す。 GM6001又はS−45282を8日間培養系に添加した際(8days)に得られたES細胞由来血小板の総数を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数/wellである。 GM6001、S−45282、又はS−45457を8日間培養系に添加した際に得られたES細胞由来血小板数(CD41(+)CD42b(+)及びCD41(+)CD42b(−)の数)を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数/wellである。 GM6001、S−45282、又はS−45457を8日間培養系に添加した際の、各化合物のES細胞由来血小板に対する機能維持効果について検証した結果を示すグラフである。縦軸は血小板総数(CD41(+))を100とした時の、CD42b(GPIbα)(+)の割合(%)を表す。 GM6001、又はS−45457を8日間培養系に添加した際に得られたES細胞由来血小板の総数を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数/wellである。値は、平均値+標準誤差(n=4)である。 S−45457の濃度依存的なES細胞由来血小板に対する機能維持効果を示すグラフである。縦軸は血小板総数を100とした時の、CD42b(GPIbα)(+)の割合(%)を表す。値は、平均値+標準誤差(n=4)である。#(シャープ)は、p<0.1を示す。 GM6001、又はS−45457を8日間培養系に添加した際に得られたiPS細胞由来血小板の総数を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数/wellである。値は、平均値+標準誤差(n=4)である。 S−45457の濃度依存的なiPS細胞由来血小板に対する機能維持効果を示すグラフである。縦軸は血小板総数を100とした時の、CD42b(GPIbα)(+)の割合(%)を表す。*(アスタリスク)、**(アスタリスク2つ)は、それぞれp<0.05、p<0.01を示す。 S−45457の濃度依存的な末梢血由来血小板に対する機能維持効果を示すグラフである。縦軸は血小板総数を1.00とした時の、CD41(+)CD42b(GPIbα)(+)の割合(比率)を表す。値は、平均値+標準誤差(n=4)である。**(アスタリスク2つ)は、p<0.01を示す。 S−45457又はp38阻害剤の末梢血由来血小板に対する機能維持効果を示すドットプロット図である。 GM6001、S−45457、又はp38阻害剤の末梢血由来血小板に対する機能維持効果を示すグラフである。縦軸は血小板総数を1.0とした時の、CD41(+)CD42b(GPIbα)(+)の割合(比率)を表す。値は、平均値+標準誤差(n=4)である。 GM6001、S−45457、又はp38阻害剤を8日間培養系に添加した際に得られたES細胞由来血小板の総数を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数/wellである。 GM6001、S−45457、又はp38阻害剤を8日間培養系に添加した際の、各化合物のES細胞由来血小板に対する機能維持効果について検証した結果を示すグラフである。縦軸は血小板総数を100とした時の、CD42b(GPIbα)(+)の割合(%)を表す。 GM6001、S−45457、又はS−45282の末梢血由来血小板に対する機能維持効果について検証した結果を示すグラフである。縦軸は血小板総数を100とした時の、CD42b(GPIbα)(+)の割合(%)を表す。 GM6001、S−45457、S−45282、又はp38阻害剤の末梢血由来PRPに対する機能維持効果について検証した結果を示すグラフである。縦軸は血小板総数(CD41(+))を100とした時の、CD41(+)CD42b(+)及びCD41(+)CD42b(−)の割合(%)を表す。 GM6001、S−45457、S−45282、又はp38阻害剤の末梢血由来血小板に対する機能維持効果を示すドットプロット図である。 S−45457の濃度依存的な末梢血由来血小板に対する機能維持効果を示すドットプロット図である。 S−45457を添加し調製した血小板の接着能を経時的に評価した結果を示すグラフである。 S−45457を添加し調製した血小板の接着能を評価した結果を示すグラフである。 レーザー照射時(0秒)及びその20秒後の、S−45457を添加し調製した血小板を注入したマウスにおける血栓形成を示す顕微鏡写真である。 S−45457を添加し調製した血小板の血栓形成への寄与を表すグラフである。縦軸は、各サンプルを輸血したマウスの腸間膜毛細血管に誘発した閉塞性血栓を観察し、血栓形成に関与した血小板の総数(マウス+ヒト)に占めるヒト血小板の数の割合(%)である。値は20血管の観察で得られた割合の平均値+標準誤差である。
本発明の組成物は、
下記一般式(I):
[式中、Xは、フェニレン基;
Yは、水素原子、または−(CH
mは0〜4のいずれかの整数;
は、
は、置換されていてもよいC1〜C6アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはC1〜C6アルコキシ基;
およびRは、それぞれ独立して水素原子、C1〜C6アルキル基、あるいはRとRが隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい;
は、水素原子、C1〜C6アルキル基、またはC1〜C6アルキルスルホニル基;
Zは、水素原子またはC1〜C6アルキル基を示す。]
で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を有効成分とする、血小板の機能を維持するための組成物である。
前記一般式(I)で表される化合物における「C1〜C6」、「C6〜C14」は、それぞれ、炭素数が1〜6、6〜14の範囲内にあることを意味する。
,R,R,RおよびZにおける「置換されていてもよいC1〜C6アルキル基」の「C1〜C6アルキル基」とは、直鎖または分岐状のC1〜C6アルキル基を意味し、具体例としては、メチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基、n−ブチル基、イソブチル基、tert−ブチル基、sec−ブチル基、n−ペンチル基、tert−アミル基、3−メチルブチル基、ネオペンチル基、n−ヘキシル基等が挙げられる。
前記、「置換されていてもよいC1〜C6アルキル基」における置換基とは、水酸基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、C1〜C6アルコキシ基、カルボキシル基、C1〜C6アルコキシカルボニル基等が挙げられる。これらは、全ての可能な位置で一個以上置換しうる。複数個置換する場合は、それらの置換基は同一であっても異なっていてもよいし、同一の炭素原子に置換していてもよいし異なる炭素原子に置換していてもよい。
「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を意味する。
「C1〜C6アルコキシ基」とは、アルキル部分が、前記「C1〜C6アルキル基」と同義であるアルコキシ基を意味し、たとえば、メトキシ基、エトキシ基、n−プロポキシ基、イソプロポキシ基、n−ブトキシ基、イソブトキシ基、tert−ブトキシ基、sec−ブトキシ基、n−ペンチルオキシ基、tert−アミルオキシ基、3−メチルブトキシ基、ネオペンチルオキシ基、n−ヘキシルオキシ基などの直鎖または分岐状のアルコキシ基が挙げられる。
「C1〜C6アルコキシカルボニル基」とは、オキシカルボニル部分を除いたアルキル部分が直鎖または分岐状のC1〜C6アルキル基であるものを意味し、たとえば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、n−プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、n−ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、tert−ブトキシカルボニル基、sec−ブトキシカルボニル基、n−ペンチルオキシカルボニル基、tert−アミルオキシカルボニル基、3−メチルブトキシカルボニル基、ネオペンチルオキシカルボニル基、n−ヘキシルオキシカルボニル基等が挙げられる。
およびRが隣接する窒素原子と一緒になって形成する「含窒素複素環」としては、例えば、環構成原子として炭素原子以外に少なくとも1個の窒素原子を含み、さらに酸素原子、硫黄原子および窒素原子から選ばれるヘテロ原子を1または2個含んでいてもよい5〜7員の含窒素複素環が挙げられる。該含窒素複素環の好適な例としては、ピペリジン環、ピペラジン環、モルホリン環、チオモルホリン環、ピロリジン環、イミダゾリジン環等が挙げられる。
における「置換されていてもよいアリール基」の「アリール基」とは、芳香族炭素環を表わし、C6〜C14の芳香族炭素環が好ましく、たとえば、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。
前記、「置換されていてもよいアリール基」における芳香環上の置換基とは、水酸基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、置換されていてもよいC1〜C6アルキル基、C1〜C6アルコキシ基、カルボキシル基、C1〜C6アルコキシカルボニル基等が挙げられる。これらは、全ての可能な位置で一個以上置換しうる。複数個置換する場合は、それらの置換基は同一であっても異なっていてもよいし、同一の炭素原子に置換していてもよいし異なる炭素原子に置換していてもよい。ここで、「ハロゲン原子」、「置換されていてもよいC1〜C6アルキル基」、「C1〜C6アルコキシ基」および「C1〜C6アルコキシカルボニル基」は前記と同じ意味を示す。
における「C1〜C6アルキルスルホニル基」とは、アルキル部分が、前記「C1〜C6アルキル基」と同義であるアルキルスルホニル基を意味し、たとえば、メタンスルホニル基、エタンスルホニル基などがあげられる。
一般式(I)で表される化合物において、不斉炭素が存在する場合には、そのラセミ体、ジアステレオ異性体および個々の光学活性体のいずれも本発明に包含されるものであり、また幾何異性体が存在する場合には(E)体、(Z)体およびその混合物のいずれも本発明に包含されるものである。
一般式(I)で表される化合物の塩としては、薬理学的に許容される塩であればとくに制限されず、たとえば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、有機酸との塩、無機酸との塩およびアミノ酸との塩等が挙げられる。無機塩基との塩の例としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩等が挙げられる。有機塩基との塩の例としては、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、エタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、ジベンジルエタノールアミン塩等が挙げられる。有機酸との塩の例としては、ギ酸塩、酢酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、シュウ酸塩、グリコール酸塩、フェニル酢酸塩、メタンスルホン酸塩等が挙げられる。無機酸との塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、スルファミン酸塩、硝酸塩等が挙げられる。また、アミノ酸との塩の例としては、グリシン塩、アラニン塩、アルギニン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩等が挙げられる。
一般式(I)で表される化合物はプロドラッグの形態をとり得る。プロドラッグの例としては、一般式(I)の化合物のカルボキシル基のメチルエステル、エチルエステル、アミノアルキルエステル誘導体、一般式(I)の化合物の水酸基およびアミン官能基のアセテート、ホルメート、およびベンゾエート誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。
前記一般式(I)で表わされる化合物は、種々の方法で製造できるが、以下に示す製造方法により、効率よく製造することができる。なお、以下の製造方法において使用される「保護基」の具体例としては、tert−ブチル基、ベンジル基、o−メチルベンジル基、p−ニトロベンジル基、p−メトキシベンジル基、o−クロロベンジル基、2,4−ジクロロベンジル基、p−ブロモベンジル基、アリル基、tert−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、o−メチルベンジルオキシカルボニル基、p−ニトロベンジルオキシカルボニル基、p−メトキシベンジルオキシカルボニル基、o−クロロベンジルオキシカルボニル基、2,4−ジクロロベンジルオキシカルボニル基、p−ブロモベンジルオキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、tert−ブチルジメチルシリル基、tert−ブチルジフェニルシリル基、トリエチルシリル基、トリメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、メトキシメチル基、テトラヒドロピラニル基、カルボニルの保護基(たとえば、エタンジオール、プロパンジオール、メルカプトエタノール、メルカプトプロパノール、エタンジチオール、プロパンジチオールなどによる保護基)等が挙げられる。
前記一般式(I)で表される化合物は、例えば下記の工程1〜工程2における反応により製造することができる。
(式中、X、YおよびZは前記と同じ意味を示す。)。
<工程1>
工程1においては、ヒドロキシルアミンまたはその塩を化合物(II)に付加し、一般式(III)で表される化合物を製造する。この付加反応では、ヒドロキシルアミンが塩(塩酸塩や酢酸塩など)の場合、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムなどの無機塩基の存在下に行なわれる。反応溶媒としては、反応を著しく阻害しない溶媒であればとくに限定されないが、水、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、アセトニトリル、1,4−ジオキサン、ジエチルエーテルまたはそれらの混合溶媒などが好ましい。
反応温度はとくに限定されず、通常、0〜100℃で行なわれ、反応時間は、2時間から1週間が好ましい。
<工程2>
工程2においては、工程1で得られた化合物(III)を、一般式(IV)で表される中間体と縮合し、一般式(I)で表される化合物を製造する。中間体(IV)は、ギ酸の混合酸無水物(ギ酸と酢酸の混合酸無水物など)、ギ酸ペンタフルオロフェニルまたはギ酸とカルボジイミド(ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミドまたは水溶性カルボジイミド)から得られる活性中間体である。反応を円滑に行なうためにトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、ルチジン、コリジン、ジメチルアミノピリジンなどの有機塩基を共存させてもよい。これらの場合の幾つか(とくにカルボジイミドから活性中間体を得る場合)は1−ヒドロキシベンゾトリアゾールおよび/または4−ジメチルアミノピリジンを加えることにより反応が促進される。反応溶媒としては、反応を著しく阻害しない溶媒であればとくに限定されないが、クロロホルム、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、シクロペンチルメチルエーテル、1,4−ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジンなどが好ましい。反応温度はとくに限定されず、通常、0〜100℃で行なわれ、反応時間は、1〜24時間が好ましい。なお、本工程において、原料の化学的性質により、ヒドロキシルアミノ基の水酸基にもCHO基が付加する場合があるが、これは、酸性、塩基性または中性条件下において低級アルコールで処理することにより目的物である化合物(I)に変換できる。低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノールなどが好ましい。補助溶媒を使用してもよく、その場合使用する補助溶媒はとくに限定されない。
X、Y、およびZの性質によっては、前記工程1〜工程2の反応において事前に保護基を使用することおよび事後に保護基の除去を行なうことが必要であることは言うまでもない。保護されていない場合、次工程あるいは次次工程の収率が低下したり、中間体の取り扱いが困難な場合がある。
前記化合物(II)は、以下に示すように、工程3〜工程5により製造することができる。
(式中、X、Y、およびZは前記と同じ;Eは、C1〜C6アルコキシ基、ハロゲン原子、N,O−ジメチルヒドロキシアミノ基などの脱離性官能基;Mは、Li、CeCl、NaBH、LiBH、LiBEt、KBEt、LiB[CH(CH)C]、KB[CH(CH)C]、Al [CH(CH)C]などを表す。Etはエチル基を表す。)。
<工程3>
工程3においては、一般式(V)で表される化合物を塩基によりアニオンにしたのち、一般式(VI)で表される化合物と反応させて化合物(VII)を製造する。使用する塩基としては、リチウムジイソプロピルアミド、リチウム(ビストリメチルシリル)アミド、リチウムテトラメチルピペラジド、ナトリウム(ビストリメチルシリル)アミド、カリウム(ビストリメチルシリル)アミド、n−ブチルリチウム、sec−ブチルリチウム、tert−ブチルリチウム等が挙げられる。これらの塩基は、単独で用いるか、または場合によって2つ以上を組み合わせて使用する。反応溶媒としては、反応を著しく阻害しない溶媒であればとくに限定されないが、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロピラン、ジエチルエーテル、tert−ブチルメチルエーテルまたはそれらの混合溶媒などが好ましい。
反応温度は、通常−100〜40℃で行なわれ、反応時間は、1〜12時間が好ましい。なお、この工程においては、化合物(VI)の化学的性質により化合物(II)が得られる場合があるが、本製造目的を斟酌すると問題にならない。
<工程4>
工程4においては、工程3で得られた化合物(VII)を一般式(VIII)で表される化合物と反応させ、一般式(IX)で表される化合物を製造する。反応溶媒としては、化合物(VIII)が水素化ホウ素ナトリウムまたは水素化ホウ素リチウムの場合には、メタノール、エタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、ジクロロメタン、クロロホルムまたはそれらの混合溶媒などが好ましく、化合物(VIII)が前記2種以外の場合は、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロピラン、ジエチルエーテル、tert−ブチルメチルエーテルまたはそれらの混合溶媒などが好ましい。反応温度は、通常−100〜30℃で行なわれ、反応時間は、1〜12時間が好ましい。
なお、工程4の反応中あるいは反応後に、生成した化合物(IX)の水酸基が自然脱離し、一部あるいは全部が化合物(II)になる場合がある。一部の場合、それらを分離することなく工程5を行なうことができ、全部の場合、工程5を省略することができる。
<工程5>
工程5においては、工程4で得られた化合物(IX)を脱水反応により化合物(II)を製造する。脱水反応は、水酸基を活性化する試薬と有機塩基の組み合わせにより行なわれ、水酸基を活性化する試薬としては、塩化メタンスルホニル、塩化p−トルエンスルホニル、塩化ベンゼンスルホニル、塩化メタンスルホニル、塩化チオニル、塩化スルフリル、五塩化リン等が挙げられる。有機塩基としては、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ジアザビシクロウンデセン、ジアザビシクロノネン、ピリジン、ジメチルアミノピリジン、ルチジン、コリジン等が挙げられる。好適な組み合わせとして、塩化メタンスルホニルとトリエチルアミンがあげられる。また、別の脱水試薬として、トリフェニルホスフィン−ジエチルアゾジカルボキシラート、トリフェニルホスフィン−ジイソプロピルアゾカルボキシラート、トリn−ブチルホスフィン−ジエチルアゾジカルボキシラート、トリn−ブチルホスフィン−ジイソプロピルアゾカルボキシラート等が挙げられる。反応溶媒としては、反応を著しく阻害しない溶媒であればとくに限定されないが、クロロホルム、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、アセトニトリル、1,4−ジオキサン、ジメチルホルムアミドなどが好ましい。反応温度はとくに限定されず、通常、0〜100℃で行なわれ、反応時間は、1〜24時間が好ましい。
X,Y、およびZの性質によっては、前記工程3〜工程5の反応において事前に保護基などを使用することおよび事後に保護基などの除去を行なうことが必要であることは言うまでもない。
前記化合物(V)は、以下に示すように、工程6により製造することができる。
(式中、Zは前記と同じ;Jはハロゲン原子、メタンスルホニルオキシ基、p−トルエンスルホニルオキシ基、ベンゼンスルホニルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基または水酸基を表す。)。
<工程6>
工程6においては、一般式(X)で表される化合物またはその塩と一般式(XI)で表される化合物を無機塩基の存在下縮合させ、化合物(V)を製造する。好適な無機塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。ただし、Jが水酸基の場合は、一般式(X)で表される化合物またはその塩の水酸基を試薬により活性化し、一般式(XI)で表される化合物を縮合させ、化合物(V)を製造する。水酸基の活性化に適した試薬としては、アゾジカルボン酸ジエチル(DEAD)−トリフェニルホスフィン、アゾジカルボン酸ジイソプロピル−トリフェニルホスフィン、シアノメチレントリブチルホスホラン、シアノメチレントリメチルホスホラン、ブチルリチウム−クロロジフェニルホスフィン等が挙げられる。また、ブチルリチウム−クロロジフェニルホスフィンで活性化する場合は、2,6−ジメチル−1,4−ベンゾキノン、テトラフルオロ−1,4−ベンゾキノンなどのキノン類を添加する。
反応溶媒としては、反応を著しく阻害しない溶媒であればとくに限定されないが、水、メタノール、エタノール、tert−ブタノール、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、ジクロロメタン、1,4−ジオキサン、2−メトキシエタノール、N,N−ジメチルホルムアミドまたはそれらの混合溶媒などが好ましい。反応温度はとくに限定されず、通常、−80〜120℃で行なわれ、反応時間は、1〜24時間が好ましい。
また、前記化合物(II)は、以下に示すように、工程7〜工程11によっても製造することができる。
(式中、X、Y、Z、E、M1およびJ1は前記と同じ、Pは水酸基の保護基を表す。)。
<工程7>
工程7においては、工程3と同様にして、一般式(XII)で表される化合物を塩基によりアニオンとした後、化合物(VI)と反応させて化合物(XIII)を製造する。
<工程8>
工程8においては、工程4と同様にして、一般式(XIII)で表される化合物を一般式(VIII)で表される化合物と反応させ、化合物(XIV)を製造する。
XおよびYの性質によっては、前記工程7〜工程8の反応において事前に保護基などを使用することおよび事後に保護基などの除去を行うことが必要であることは言うまでもない。
<工程9>
工程9においては、工程5と同様にして、化合物(XIV)を脱水反応により化合物(XV)を製造する。
なお、工程9において保護基Pが自然脱離し、一部あるいは全部が化合物(XVI)になる場合がある。一部の場合、それらを分離することなく工程10を行なうことができ、全部の場合、工程10を省略する事ができる。
<工程10>
工程10においては、一般式(XV)で表される化合物に使用されている保護基Pの種類にあわせて、公知の方法によりその脱保護を行い、一般式(XVI)で表される化合物を製造する。
<工程11>
工程11においては、工程6と同様にして、化合物(XVI)と一般式(X)で表される化合物またはその塩を縮合させ、化合物(II)を製造する。
前述した方法で製造される本発明のN−ヒドロキシホルムアミド誘導体は遊離化合物、その塩、その水和物もしくはエタノール和物などの各種溶媒和物または結晶多形の物質として単離精製される。一般式(I)の化合物の薬理学的に許容される塩は常法の造塩反応により製造することができる。単離精製は抽出分別、結晶化、各種分画クロマトグラフィーなどの化学操作を適用して行なわれる。また、光学異性体は適当な原料化合物を選択することにより、またはラセミ化合物の光学分割により立体化学的に純粋な異性体として得ることができる。
本発明の組成物は、前記化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物(以下、「前記一般式(I)で表わされる化合物等」とも称する)を有効成分とする、血小板の機能を維持するための組成物である。本発明において「血小板の機能を維持する」とは、主として、血小板の止血や血栓形成といった血液凝固に関する機能を維持することを意味する。当該機能は、本発明の組成物により、ADAM17によるGPIbαのシェディング(Shedding、切断して除去)を抑制することによって達成することができる。
「血小板の機能の維持」は、例えば、国際公開2009/119105号や後述の試験例15に記載されているような、フローチャンバーシステムを用いて血小板のVWFに対する接着能を評価する方法、血小板減少マウスを用いて血小板の生体内寿命を評価する方法、トロンビン存在下フィブリノーゲンコートカバーグラス上の血小板の形状を観察する方法、あるいは、後述の試験例16に記載したような、レーザー照射とヘマトポルフィリン等とを用いて血栓形成モデル動物を作製し、このモデル動物内における血小板の動態を単一レベルで観察する生体分子イメージング手法等を用いて、評価することができる。
ADAM17(a disintegrin and metallopeptidase domain 17)は、構造上ディスインテグリンドメインを有し、メタロプロテアーゼ活性を有するタンパク質である。GPIbα以外にも膜結合型のTNF−α(Tumor necrosis factor−alpha、腫瘍壊死因子−α)をシェディングし、遊離型のTNF−αを産生することから、TACE(TNF−alpha converting enzyme、TNF−α変換酵素)とも称されるタンパク質である。典型的には、ヒト由来のADAM17として、ACCESSION No.NP_003174.3(No.NM_003183.4)で特定される蛋白質(遺伝子)が挙げられる。
また、GPIbα(glycoprotein Ib alpha、糖タンパク質Ibα)は、血小板の膜タンパク質であり、フォン・ウィルブランド因子(von Willebrand factor、VWF)の受容体として機能している。また、GPIbαはヒト体内において血小板のみに発現しているため、CD42b抗原とも称され、血小板の表面マーカーとしても用いられている。典型的には、ヒト由来のGPIbαとして、ACCESSION No.NP_000164.5(No.NM_000173.5)で特定される蛋白質(遺伝子)が挙げられる。
ADAM17及びGPIbαの典型例としてGenBankに登録されている各々のReference Sequenceを例示したが、蛋白質のアミノ酸配列は、自然界において(すなわち、非人工的に)変異し得る。従って、本発明の組成物の作用機序に関わる、ADAM17及びGPIbαには、このような天然の変異体も含まれることを理解されたい。
本発明における「ADAM17によるGPIbαのシェディングの抑制」には、ADAM17によるシェディングの完全な抑制(阻害)および部分的な抑制の双方が含まれる。また、後述の実施例において示すように、本発明の組成物の存在下における血小板総数に対するCD42b(GPIbα)(+)血小板数の割合を算出し、本発明の組成物の非存在下におけるその割合と比較して、大きい値である場合には、本発明の組成物がADAM17によるGPIbαのシェディングを抑制すると評価することができる。本発明の組成物によるGPIbαのシェディングの抑制の程度としては、本発明の組成物の存在下におけるCD42b(+)血小板数の割合が80%以上であることが好ましく、より大きいほどより好ましい(例えば、85%以上、90%以上、95%以上)。
なお、本発明の組成物によるGPIbαのシェディングを抑制する能力を、後述の試験例3において示す方法を用いて評価した場合には、50%抑制濃度(IC50)が0.01nmol/L〜100nmol/Lであることが好ましい。
本発明の組成物の有効成分たる前記一般式(I)で表わされる化合物としては、例えば、N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(4−ジエチルアミノメチルフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド、
N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(4−ジメチルアミノメチルフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド、
N−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]ベンジル}−2−メトキシアセトアミド、
N−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]ベンジル}メタンスルホンアミド、
N−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシ−アミノ)エチル]ベンジル}ベンズアミド、
N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(4−モルホリン−4−イルメチルフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド、
N−ヒドロキシ−N−[1−(4−モルホリン−4−イルメチルフェニル)−2−(4−ペント−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)エチル]ホルムアミド、
N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(4−ジメチルアミノフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド、
N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(3−ジメチルアミノフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド、
N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(2−ジメチルアミノフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド、
N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(4−ピペリジン−1−イルメチルフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド、
N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(3−ピペリジン−1−イルメチルフェニル)エチル]ヒドロキシホルムアミド、
N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(3−モルホリン−4−イルメチルフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド、
N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−{4−[(エチルメチルアミノ)メチル]フェニル]エチル}−N−ヒドロキシホルムアミド、
N−(2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−{3−[(エチルメチルアミノ)メチル]フェニル}エチル)−N−ヒドロキシホルムアミド、
N−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]ベンジル}−N−メチルメタンスルホンアミド、
N−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]ベンジル}−4−メチルベンゼンスルホンアミド、
N−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]ベンジル}−4、N−ジメチルベンゼンスルホンアミド、
N−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]ベンジル}−N−メチルスルホニルメタンスルホンアミド、
N−{2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−[4−(2−ジメチルアミノエチル)フェニル]エチル}−N−ヒドロキシホルムアミド、
N−{2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−[4−(2−モルホリン−4−イルエチル)フェニル]エチル}−N−ヒドロキシホルムアミド、
N−(2−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]フェニル}エチル)メタンスルホンアミド、
N−{2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−[4−(3−ジメチルアミノプロピル)フェニル]エチル}−N−ヒドロキシホルムアミド、
N−{2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−[4−(3−ジエチルアミノプロピル)フェニル]エチル}−N−ヒドロキシホルムアミド、
N−{2−(4−ブト−2−イニルオキシ−ベンゼンスルホニル)−1−[4−(3−モルホリン−4−イルプロピル)フェニル]エチル}−N−ヒドロキシホルムアミド、
N−{2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−[4−(4−モルホリン−4−イルブチル)−フェニル]−エチル}−N−ヒドロキシホルムアミド、
N−{4−[1−(ホルミルヒドロキシアミノ)−2−(4−ペント−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)エチル]ベンジル}メタンスルホンアミド、または、
N−{4−[1−(ホルミルヒドロキシアミノ)−2−(4−オクト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)エチル]ベンジル}メタンスルホンアミドが挙げられる。後述の試験例4に示すように、ADAM17に対して高い特異性を有するという観点から、N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(4−ジエチルアミノメチルフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド、またはN−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]ベンジル}メタンスルホンアミドが好ましい。
なお、N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(4−ジエチルアミノメチルフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミドは、後述の実施例における「I−1」又は「S−45282」であり、N−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]ベンジル}メタンスルホンアミドは、後述の実施例における「I−4」又は「S−45457」である。
本発明の組成物の形態としては、例えば、研究開発目的(例えば、インビトロやインビボの研究開発)に用いられる試薬や医薬品添加剤が挙げられる。
本発明の組成物は、ADAM17によるGPIbαのシェディングを抑制することにより血小板の機能を維持する作用を有するため、血小板の機能を維持するための試薬(例えば、巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系に使用する試薬や生産した血小板に添加してその機能を維持するための試薬)や献血等用の血小板を含む血液製剤に添加される医薬品添加物として好適に用いることができる。本発明における組成物を上記添加物や試薬として用いる場合には、有効成分たる前記一般式(I)で表わされる化合物等の他に、例えば、安定化剤や溶剤等が含有されていてもよい。
本発明の組成物の製品(例えば、試薬や医薬品添加物)またはその説明書は、血小板の機能を維持するために用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品または説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する。血小板の機能を維持するために用いられる旨の表示においては、本発明の組成物の有効成分である前記一般式(I)で表わされる化合物等が血小板の機能を維持する効果を発揮するに至るまでの機序についての情報を含むことができる。機序としては、例えば、ADAM17によるGPIbαのシェディングを抑制することにより、血小板の機能を維持することに関する情報が挙げられる。また、血小板の機能を維持するために用いられる旨の表示においては、血小板の製造又は保存のため等に用いられること、に関する情報を含むことができる。
前記一般式(I)で表わされる化合物等は、上記本発明の組成物を製造するための有効成分となる。従って、本発明は、上記本発明の組成物を製造するために用いられる、前記一般式(I)で表わされる化合物等、および前記一般式(I)で表わされる化合物等を用いることを特徴とする、上記本発明の組成物の製造方法をも提供するものである。
また、本発明は、巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系に、前記一般式(I)で表わされる化合物等を添加した培養物を提供するものである。さらに、本発明は、巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系に、前記一般式(I)で表わされる化合物等を添加することを特徴とする、血小板を調製するための方法を提供するものである。
本発明における「巨核球」は、血小板前駆細胞、巨核細胞とも称され、その細胞質を分離することにより、血小板を産生する細胞である。
本発明において「巨核球に分化し得る細胞」は、巨核球に分化誘導することができる細胞であれば特に制限されることはなく、例えば、受精卵、胚性幹細胞(ES細胞)、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、胚性生殖細胞(EG細胞)といった万能幹細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞、巨核芽球、脂肪細胞が挙げられる。造血幹細胞や造血前駆細胞は、骨髄や臍帯血等から採取されるものであってもよい。さらに、これらの中では、胚を壊すことがないため倫理的な問題がなく、本発明によって調製された血小板を輸血する患者とヒト白血球型抗原(HLA)の型を適合させ易いという観点から、iPS細胞が好ましい。また、iPS細胞の培養を開始してから25〜35日まで、iPS細胞由来の巨核球は増加し続けることが可能であり、かかる巨核球から産生される血小板数も、3因子(Oct3/4、Sox2、Klf4)を用いて樹立したiPS細胞と比較して、2〜10倍になるという観点から、4因子(Oct3/4、Sox2、Klf4、c−Myc)を用いて樹立したiPS細胞がより好ましい。なお、かかる巨核球及び血小板産生数の増加は、c−Myc遺伝子の再活性化によって引き起こされるということは本発明者等によって確認されている。
さらに、本発明の方法に用いる上記細胞が由来する動物種としては特に制限はなく、例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジなどが挙げられるが、好ましくは、マウス、ラット、ヒトであり、より好ましくはマウス又はヒトであり、特に好ましくは、ヒトである。
本発明において「巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系」としては、例えば、血小板に至る途中の段階で胚様体(分化誘導した中胚葉系未分化細胞を含む細胞集団)を形成させる培養系(Etoら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、2002年、99巻、12819−12824ページ等)、造血前駆細胞を内包するネット様構造物(sac構造体)を形成させる培養系(特許文献1〜3等参照)、臍帯血由来の造血前駆細胞から血小板を産生させる培養系(Robertら、「Glycoprotein Ibalpha receptor instability is associated with loss of quality of platelets produced in culture.」、Stem Cells Development、2010年5月26日オンライン版等参照)等を挙げることができる(その他、Fujimotoら、Blood、2003年、102巻、4044−4051ページ:Hiroyamaら、Exp.Hematol.、2006年、34巻、760−769ページ:Gaurら、J Thromb Haemost.、2005年、4巻、436−442ページ等参照)。これらの中では、ネット様構造物内に造血前駆細胞が濃縮されて存在しており、生体外において効率的に巨核球や血小板等を産生させることができるため、ネット様構造物を形成させる培養系が好ましい。
本発明にかかる培養系の培養条件としては、巨核球の培養および血小板の産生に適した条件であれば特に制限はないが、培養温度としては、35〜38℃であることが好ましく、より好ましくは37℃である。前記培養温度が前記下限未満であると、巨核球や血小板の産生数が少なくなる傾向にあり、前記上限を超えると細胞の培養や維持が困難となる傾向にある。
さらに、本発明にかかる「巨核球に分化し得る細胞」を培養する際(特に、巨核球を分化誘導する過程において)、フィーダー細胞と共培養することが好ましい。ここで使用する「フィーダー細胞」としては、「巨核球に分化し得る細胞」の分化誘導に寄与するものであれば特に制限はないが、例えば、マウス胚線維芽細胞、好ましくは、10T1/2細胞株、OP9細胞などを用いることができる。不死化した株化細胞以外の細胞としては、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞(ヒト骨髄から直接調製し培養して得た細胞)を挙げることができ、当該間葉系幹細胞をフィーダー細胞として用いた場合でも、ヒトES細胞又はiPS細胞からの巨核球成熟および血小板産生が可能である。マトリゲルなどの細胞外基質上で培養した場合でも、効率は下がるが、血小板を誘導することが可能である。「フィーダー細胞」を用いる際には、放射線を照射するなどして、細胞の増殖を抑止することが好ましい。
前記一般式(I)で表わされる化合物等の前記培養系への添加量(濃度)は、0.01〜100μMであることが好ましい。前記添加量が前記下限未満であると血小板におけるGPIbαの切断の抑制が困難になる傾向にあり、前記上限を超えると細胞の増殖を抑制する傾向にある。また、前記一般式(I)で表わされる化合物等を前記培養系に添加する時期としては、血液細胞分化の不均一性の状況下にも関わらず培養過程における均一性の確保、均質な製品の確保を行う観点から、造血前駆細胞から血小板の産生に至る全期間であることが好ましく、巨核球から血小板の産生に至る期間に限定されないという点で、GM6001とは大きく異なる。
以下に、本発明の培養系に好適に用いられるネット様構造物を形成させる方法を一例として、本発明の血小板を調製するための方法をより具体的に説明する。
先ず、ネット様構造物(sac構造体)を形成させる方法について説明する。ネット様構造物を調製するために適した培養条件は、用いるES細胞又はiPS細胞によって異なるが、例えば、培地としては、最終濃度15%のFBSを添加したイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)を用い、その他無血清の場合においても適宜増殖因子およびサプリメント等を加えたものを使用することができる。さらに、ネット様構造物を効率的に形成させるために、血管内皮増殖因子(VEGF)を0〜100ng/ml、0〜300ng/ml程度、より好ましくは、20ng/ml、200ng/ml程度加えるのがよい。培養の環境としては、用いるES細胞又はiPS細胞の種類によって異なるが、好ましくは、5%CO、35〜38℃、より好ましくは37℃の条件である。ネット様構造物が形成されるまでの培養期間は、ES細胞又はiPS細胞の種類によって異なるが、フィーダー細胞上に播いてから、15日目(14〜16日後)くらいにその存在を確認することができる。
形成されたネット様構造物は、濾胞状構造になっており、内部には、造血前駆細胞、特にCD34陽性の細胞が濃縮された状態で存在している。ネット様構造物の内部に存在する造血前駆細胞は、物理的な手段、例えば、滅菌済みの篩状器具(例えば、セルストレイナーなど)に通すことにより、分離することができる。
次に、ネット様構造物から分離した造血前駆細胞から血小板を調製する方法について説明する。分離して得られた造血前駆細胞をフィーダー細胞上に播き、巨核球及び血小板を産生させるのに適した条件で培養を行う。ここで「巨核球及び血小板を産生させるのに適した条件」とは、例えば、トロンボポイエチン(TPO、10〜200ng/mL、好ましくは100ng/mL程度)の存在下で、又は幹細胞因子(SCF、10〜200ng/mL、好ましくは50ng/mL程度)、ヘパリン(Heparin、10〜100U/mL、好ましくは25U/ml程度)及びTPO(10〜200ng/mL、好ましくは100ng/mL程度)の存在下で、7〜15日間程度培養することが挙げられる。培養環境としては、好ましくは、5%CO、35〜38℃、より好ましくは37℃の条件である。
また、かかる培養系において、前記一般式(I)で表わされる化合物等をこの培養系に添加する時期としては、造血前駆細胞をフィーダー細胞上にまき直す際に添加することが好ましく、培養開始後22日目(20日〜23日目、ネット様構造物のまき直しから6日〜10目目)頃に前記一般式(I)で表わされる化合物等を添加することがより好ましい。
さらに、本発明の方法においては、巨核球から放出された血小板が豊富に存在する培養液の画分(例えば、ネット様構造物を形成させる方法においては、ヒトiPS細胞又はES細胞の培養後22〜28日目程度の画分)を回収し、白血球除去フィルター(例えば、テルモ社、旭化成メディカル社などから購入可能)などを使用して血小板以外の成分(巨核球、その他の血液細胞)の除去を行うことにより、血小板を調製することができる。
前述の通り、前記一般式(I)で表わされる化合物等は、ADAM17によるGPIbαのシェディングを抑制し、血小板の機能を維持する作用を有する。従って、本発明は、前記一般式(I)で表わされる化合物等が添加された血小板を含む血液製剤、並びに、前記一般式(I)で表わされる化合物等を、血小板を含む血液製剤に添加することを特徴とする、血液製剤における血小板の機能を維持するための方法をも提供するものである。
また、前記一般式(I)で表わされる化合物等は、血小板を含む血液製剤を製造するための有効成分となる。従って、本発明は、上記本発明の血液製剤を製造するために用いられる医薬品添加物として、前記一般式(I)で表わされる化合物等をも提供するものである。
本発明における血液製剤に含まれる血小板としては特に制限されることはなく、前述の本発明の血小板を調製するための方法によって得られた血小板であってもよく、また採血によって得られた末梢血等由来の血小板であってもよい。血液製剤を調製するにあたっては、血小板が保存に対して不安定であることなどを考慮して、血小板の安定化に資する他の成分を含有せしめることもできる。血小板を安定化させる条件は、当該技術分野の専門家において周知の方法を選択することが可能である。例えば、血小板の機能を保持するために必要な溶液中(例えば、ACD−A液(クエン酸ナトリウム/クエン酸/ブドウ糖から調製される液)など、場合によっては、新鮮凍結血漿などを適宜添加する)に、適当な濃度(例えば、1×10〜1×1010血小板/mL程度、好ましくは、1×10血小板/mL程度)で懸濁し製剤化することができる。なお、血小板を含む製剤を収納する容器は、ガラスのように血小板を活性化する材質のものを避けることが好ましい。前記一般式(I)で表わされる化合物等の添加量(濃度)は、0.01〜100μmol/Lであることが好ましい。前記添加量が前記下限未満であると血小板は接着機能を保持できないとする傾向にあり、前記上限を超えると最大効果となる。
以下、実施例及び試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、後述する試験例において用いた巨核球や血小板の産生、並びにこれらの解析は下記に示す方法を用いて行った。
<ヒトES細胞、ヒトiPS細胞、及びフィーダー細胞の調製>
ヒトES細胞(hES cells)は、京都大学再医科学研究所が樹立し、同研究所から供与されたKhES細胞株(KhES−3)を用いた。
また、ヒトiPS細胞(hiPS cells)は、東京大学でヒト由来の皮膚細胞にOct4、Klf4、Sox2、及びc−Mycを導入して樹立したiPS細胞株(TkDA3−4)を、0.1mM 非必須アミノ酸(Invitrogen社製)を用いた。そして、TkDA3−4細胞を、2mM L−グルタミン(Invitrogen社製)、20% ノックアウト血清代替添加物(KSR、Invitrogen社製)、0.1mM 2−メルカプトエタノール、及び5ng/ml 塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF、Upstate社製)を添加したダルベッコ変法イーグル培地とハムF−12培地(SIGMA社製)との混合培地(混合比率1:1)中、放射線照射したマウス線維芽細胞上で培養し、3日毎に継代して、未分化状態を維持したものを使用した。
さらに、理研バイオリソースセンターから購入したマウス胎児由来の線維芽細胞 C3H10T1/2細胞株(以下、「10T1/2細胞」とも称する)を10% ウシ胎児血清(FBS)及び2mM L−グルタミンを添加したイーグル基礎培地(BME、Invitrogen社製)中で培養した。そして、細胞数8×10個/10cmディッシュになるように調整した10T1/2細胞に50Gyの放射線照射を行ったものをフィーダー細胞として用いた。
<巨核球及び血小板の産生、並びにこれらの解析>
前記フィーダー細胞上に、ヒトES細胞又はヒトiPS細胞を細胞数5×10〜1×10個/10cmディッシュになるように播き、15% FBS(製品名:CELLect(TM) GOLD、ICN Biomedicals社製)、2mM L−グルタミン(Invitrogen社製)、ITSサプリメント(10μg/ml インスリン、5.5mg/ml ヒトトランスフェリン、5ng/ml 亜セレン酸ナトリウム)(Sigma社製)、50μg/ml アスコルビン酸(Sigma)、0.45mM α−モノチオグリセロール(MTG、Sigma社製)、20ng/ml 血管内皮増殖因子(VEGF、R&D systems社製)を添加したイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM、Invitrogen/GIBCO社製)中で培養した。また、この培養はCOインキュベーター(製品名:HERA CELL 150i、Thermo SCIENTIFIC社製)を用いて、37℃、5%CO、21%O(大気酸素)下で実施した。そして、3日毎に培地交換を行い、内部に造血前駆細胞を含んだsac構造体(ネット様構造物)が多数確認される15日目まで、かかる条件で培養した。
次に、sac構造体をディッシュから剥がして破砕し、3% FBSを含むリン酸緩衝液(PBS)に懸濁した後、40μmセルストレイナー(BD社製)を通過させた。通過した溶液を440×g、10分間遠心分離して造血前駆細胞を回収し、細胞数をカウントした。新たに、6ウェル(well)プレートに用意した50Gy放射線照射済みの10T1/2細胞(6×10個/6ウェルプレート1枚)上に造血前駆細胞を2〜3×10個/ウェルで播き、15% FBS(製品名:CELLect(TM) GOLD、ICN Biomedicals社製)、2mM L−グルタミン(Invitrogen社製)、ITSサプリメント(10μg/ml インスリン、5.5mg/ml トランスフェリン、5ng/ml 亜セレン酸ナトリウム)(Sigma社製)、50μg/ml アスコルビン酸(Sigma社製)、0.45mM MTG(Sigma社製)、100ng/ml ヒトトロンボポイエチン(ヒトTPO、Peprotec社製)、50ng/ml ヒト幹細胞因子(SCF、Peprotec社製)及び25U/ml ヘパリンを添加したIMDM(Invitrogen/GIBCO社製)中でさらに8日間培養し、巨核球/血小板を誘導した。
そして、誘導した巨核球/血小板を抗凝固剤液(Acid Citrate Dextrose、ACD)にて回収した後、ブレーキ無し、900rpmで10分間遠心した。遠心して得られた上清を更にブレーキ無し、1500rpmで10分間遠心した後、上清を除去した。そして、このようにして得られた沈殿物における巨核球や血小板の数は、抗体で染色し、フローサイトメトリーにて解析した。
なお、フローサイトメトリーはBecton Dickinson社製のFACS Ariaを用い、巨核球や血小板を染色するために用いた抗体として、Phycoerythrin(PE)修飾抗ヒトCD42a(GPIX)抗体、PE修飾抗ヒトCD42b(GPIbα)抗体、allophycocyanin(APC)標識抗CD41a(インテグリンαIIbbeta3複合体、HIP8 clone)抗体(BD Bioscience社製)を用いた。また、巨核球や血小板の絶対数を正確に測定するために、細胞をこれらの抗体によって染色し、TruCountビーズ(BD Bioscience社製)も用いて、フローサイトメトリーにて解析を行った。
(試験例1) 室温条件下におけるES細胞由来の造血前駆細胞から巨核球/血小板への誘導
室温条件下での培養(25℃での培養)によって、巨核球/血小板の誘導が可能であるかどうかを調べるため、前述の通りにして得られたES細胞由来の造血前駆細胞を、図1に示した条件にて巨核球/血小板の誘導を試みた。すなわち、造血前駆細胞を巨核球/血小板に誘導する前述の8日間の培養過程において、
コントロール:37℃で8日間培養
2日間の室温培養:37℃で6日間培養した後、25℃で2日間培養、
室温培養:25℃で8日間培養、
という条件下で各々培養を行い、前述の通り回収して、フローサイトメトリーにて巨核球及び血小板の数を測定した。得られた結果は図2及び図3に示す。
図2及び図3に示した結果から明らかなように、25℃で8日間培養したものに関しては、殆ど巨核球も血小板も得ることはできなかった。また、フローサイトメトリー解析の2日前から25℃において培養したものは、巨核球及び血小板を得ることはできたものの、コントロールの半分程度の量しかなかった。
(試験例2) 室温条件下における臍帯血由来CD34(+)細胞から巨核球/血小板への誘導
室温条件下での培養(24〜25℃での培養)で、臍帯血由来CD34(+)細胞から血小板の誘導が可能であるかどうかを調べた。
先ず、臍帯血(CB)からビーズカラムを用いて10個のCD45lowCD34細胞の選別及び単離を行った。得られた臍帯血由来CD34(+)細胞4×10個を、前記フィーダー細胞上に播き、medium A(15% FBS(製品名:CELLect(TM) GOLD、ICN Biomedicals社製)、2mM L−グルタミン(Invitrogen社製)、ITSサプリメント(10μg/ml インスリン、5.5mg/ml トランスフェリン、5ng/ml 亜セレン酸ナトリウム)(Sigma社製)、50μg/ml アスコルビン酸(Sigma社製)、0.45mM MTG(Sigma社製)、及びサイトカインカクテル(2ng/ml TPO(Peprotec社製)、7.5ng/ml SCF(Peprotec社製)、11ng/ml FLT−3)を添加したIMDM(Invitrogen/GIBCO社製))中で4日間培養した。培養4日目にmedium Aと同じ量のmedium Bを臍帯血由来CD34(+)細胞に追加した。なお、medium Bはmedium Aと異なり、サイトカインカクテルとして、30ng/ml TPO、1ng/ml SCF、7.5ng/ml IL−6及び13.5ng/ml IL−9が添加されている。また、medium Aとmedium Bとは添加しているサイトカインカクテルが異なる以外は同じ組成である。
そして、このようにして培養した7日目の臍帯血由来CD34(+)細胞をmedium Bで4×10個/mLになるように調整して、更に7日間37℃で培養(コントロール)又は更に7日間24〜25℃で培養(室温培養)し、培養14日目にフローサイトメトリーにて巨核球及び血小板の数を測定した。得られた結果を図4及び図5に示す。
図4及び図5に示した結果から明らかなように、約25℃で7日間培養したものに関しては、先に示したES細胞由来の造血前駆細胞と同じく、殆ど巨核球も血小板も得ることはできなかった。従って、試験例1及び試験例2において示した結果から、ES細胞や臍帯血由来CD34(+)細胞等の巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系において、培養温度が37℃付近であることが好ましく、25℃付近の室温条件下の培養では巨核球及び血小板を産生させることができないことが明らかになった。
しかしながら、かかる血小板を産生させる培養系において培養温度を37℃付近にしてしまうと、血小板表面上にあり、血液凝固において重要な因子であるGPIbαがADAM17によりシェディングされてしまうため、止血機能を発揮しない血小板が得られにくいという問題がある。また、ADAM17を含むメタロプロテアーゼを対象とした阻害剤(例えば、GM6001)を培養系に添加してGPIbαのシェディングを抑制することもできるが、かかる場合においては造血機能に必須であるADAM17以外のメタロプロテアーゼ(MMP−9、MMP−14)をも阻害してしまうため、血小板産生が最も観察される一定時期のみに添加する必要性があり、血小板を産生させる培養系のプラント化等を実施する際には好ましくない。さらに、GM6001のような非特異的メタロプロテアーゼ阻害剤は、生体に投与すると安全性の面で懸念があるために、かかる阻害剤が混入している血小板を血液製剤として用いることも好ましくない。
そこで、下記実施例において示す、ADAM17を特異的に阻害する化合物を設計、合成した。なお、以下に示すH−NMRスペクトルは、重クロロホルム(CDCl)または重ジメチルスルホキシド(DMSO−d)を溶媒とし、テトラメチルシラン(TMS)を内部標準として、ECA400型スペクトルメーター(400MHz、日本電子株式会社製)で測定したものである。化学シフトの測定結果は、δ値をppmで示し、結合定数のJ値をHzで示した。略号のsはsinglet、dはdoublet、tはtriplet、qはquartet、ddはdoublet doublet、mはmultiplet、brはbroadを意味する。低分解能質量スペクトル(高速原子衝撃法:FAB−MS)測定には、日本電子JMS−HX−110A型を、質量スペクトル(エレクトロスプレーイオン化法:ESI-MS)測定には、サーモフィッシャーサイエンティフィック(株)のExactiveをそれぞれ使用した。
(実施例1)
N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(4−ジエチルアミノメチルフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド(I−1)
(1−1):1−ブト−2−イニルオキシ−4−メタンスルホニルベンゼン(V−1)
1−ブロモ−2−ブチン2.12g(15.9mmol)のジメチルスルホキシド溶液(30mL)に4−メチルスルホニルフェノール2.88g(15.9mmol)を加えて溶解させた後、炭酸カリウム2.64g(19.1mmol)を加えた。6時間撹拌した後、飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。1−ブト−2−イニルオキシ−4−メタンスルホニルベンゼン(V−1)3.39g(15.11mmol)を粗精製物として得た(収率95%)。物性値を以下に示す。
MS
(FAB) m/z : 225 (M+H)+.
1H-NMR(CDCl3):δ 7.88(2H, m), 7.10(2H, m),
4.73(2H, m), 3.04(3H, s), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz).。
(1−2):{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)アセチル]ベンジル}カルバミン酸tert−ブチルエステル(VII−1)
前記(1−1)で得た化合物(V−1)1.36g(6.08mmol)のテトラヒドロフラン(70mL)溶液に、アルゴン雰囲気下−78℃でリチウムジイソプロピルアミドの2.0Mヘキサン−ヘプタン−エチルベンゼン溶液3.65mL(7.29mmol)を加え、30分間撹拌した後、リチウムヘキサメチルジシラジドの1.0M−テトラヒドロフラン溶液12.16mL(12.16mmol)と、4−(tert−ブトキシカルボニルアミノメチル)安息香酸メチル(VI−1)1.61g(6.08mmol)のテトラヒドロフラン溶液5mLを加えた。−78℃にて5分間撹拌した後、徐々に室温まで昇温し、1時間撹拌した。飽和食塩水を加えた後、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧下留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=2:1→1:1)にて精製し、{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)アセチル]ベンジル}カルバミン酸tert−ブチルエステル(VII−1)2.02g(4.41mmol)を無色飴状物質として得た(収率72%)。物性値を以下に示す。
MS
(FAB) m/z : 480 (M+Na)+.
1H-NMR (CDCl3)
: δ 7.93(2H, br d, J
= 8.2 Hz), 7.81(2H, m), 7.40(2H, br d, J = 8.2 Hz), 7.07 (2H, m), 4.72(2H, m),
4.70(2H, s), 4.39(2H, m), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz), 1.57(9H, s).。
(1−3):{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−ヒドロキシエチル]ベンジル}カルバミン酸tert−ブチルエステル(IX−1)
前記(1−2)で得た化合物(VII−1)2.02g(4.41mmol)のメタノール(50mL)溶液に、0℃で水素化ホウ素ナトリウム167mg(4.41mmol)を加えた。2時間30分間撹拌した後、飽和食塩水と飽和塩化アンモニウム水溶液を加えた。メタノールを減圧下留去した後、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−ヒドロキシエチル]ベンジル}カルバミン酸tert−ブチルエステル(IX−1)2.04g(4.41mmol)を無定形状固体の粗精製物として得た(収率99%)。物性値を以下に示す。
MS
(FAB) m/z : 482 (M+Na)+.。
(1−4):{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)ビニル]ベンジル}カルバミン酸tert−ブチルエステル(II−1a)
前記(1−3)で得た化合物(IX−1)2.04g(4.41mmol)とトリエチルアミン3.1mL(22.1mmol)のジクロロメタン(45mL)溶液に0℃で塩化メタンスルホニル0.7mL(8.8mmol)を加えた。3時間30分間撹拌した後、飽和食塩水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:酢酸エチル=3:1)で精製し、{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)ビニル]ベンジル}カルバミン酸tert−ブチルエステル(II−1a)1.77g(4.00mmol)を無色無定形状固体として得た(収率91%)。物性値を以下に示す。
1H-NMR (CDCl3) : δ 7.87(2H, d, J
= 8.7 Hz), 7.61(1H, d, J = 15 Hz), 7.43(2H, J = 8.2 Hz), 7.30(2H, d, J = 8.2
Hz), 7.10(2H, d, J = 8.7 Hz), 6.82 (1H, d, J = 15 Hz), 4.88(1H, m), 4.71(2H,
m), 4.33(2H, m), 1.86(3H, m), 1.45(9H, s).。
(1−5):4−[(E)−2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)ビニル]ベンジルアミン塩酸塩(II−1b)
前記(1−4)で得た化合物(II−1a)295mg(0.67mmol)のメタノール(5mL)溶液に、0℃で4M−塩酸/ジオキサン2mLを加えて10分間撹拌した後、室温まで昇温し、2時間撹拌した。溶媒を減圧下留去した後、メタノール20mLを加えて再び、溶媒を減圧下留去し、4−[(E)−2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)ビニル]ベンジルアミン塩酸塩(II−1b)を無色固体として得た。物性値を以下に示す。
1H-NMR (DMSO-d6) : δ 7.85(2H, d, J
= 8.7 Hz), 7.78(2H, d, J = 8.2 Hz), 7.52(2H,d, J = 8.2 Hz), 7.20(2H, d, J = 8.7
Hz), 4.87(2H, m), 4.05(2H, m), 1.83(3H, m).。
(1−6):{4−[(E)−2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)ビニル]ベンジル}ジエチルアミン(II−1c)
前記(1−5)で得た化合物(II−1b)のメタノール(6mL)溶液に、0℃でアセトアルデヒド1mL、トリアセトキシヒドロほう酸ナトリウム212mg(1.00mmol)および酢酸3滴をそれぞれ加えた後、室温にて1時間30分間撹拌した。飽和食塩水と飽和重曹水を加えた後、溶媒を減圧下留去した。クロロホルムで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=20:1→10:1)にて精製し、{4−[(E)−2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)ビニル]ベンジル}ジエチルアミン(II−1c)111.7mg(0.28mmol)を淡黄色無定形状固体として得た(2段階収率42%)。物性値を以下に示す。
MS
(FAB) m/z : 398 (M+H)+.。
(1−7):N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(4−ジエチルアミノメチルフェニル)エチル]ヒドロキシルアミン(III−1)
前記(1−6)で得た化合物(II−1c)108mg(0.27mmol)のテトラヒドロフラン(8mL)溶液に、50%ヒドロキシルアミン溶液(3mL)を加え、室温にて25時間攪拌した。反応溶液を減圧下留去した後、水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシ−ベンゼンスルホニル)−1−(4−ジエチルアミノメチルフェニル)エチル]ヒドロキシルアミン(III−1)92.9mg(0.22mmol)を淡黄色無定形状固体として得た(収率81%)。物性値を以下に示す。
1H-NMR (CDCl3) : δ 7.84(2H, m),
7.27(2H, m), 7.20(2H, m), 7.07(2H, m), 4.72(2H, m), 3.75(1H, m), 3.51(2H, s),
3.33(1H, m), 2.49(4H, m), 1.87(3H, s), 1.03(6H, m).。
(1−8):N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(4−ジエチルアミノメチルフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド(I−1)
ギ酸1mLを0℃に冷却し、無水酢酸0.3mLを滴下した後、30分間撹拌することでギ酸―酢酸の混合酸無水物溶液を調製した。前記(1−7)で得た化合物(III−1)92mg(0.21mmol)のテトラヒドロフラン(3mL)溶液に、0℃で、先に調製したギ酸―酢酸の混合酸無水物溶液0.6mLを加え、室温で4時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、トルエンで共沸した。得られた油状物をクロロホルム2mLおよびメタノール10mLに溶解し、12時間撹拌した。この溶液を減圧濃縮し、得られた油状物をクロロホルムに溶解し、飽和重曹水を加えて中和した。クロロホルムで抽出した後、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=95:5→75:25)により精製し、N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(4−ジエチルアミノメチルフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド(I−1)53.9mg(0.11mmol)を淡黄色無定形状固体として得た(収率52%)。物性値を以下に示す。
MS
(FAB) m/z : 459(M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.32(0.6H, s),
8.10(0.4H, s), 7.80-7.86(2H, m), 7.21-7.30(4H, m), 7.06-7.14(2H, m), 5.65(0.6H,
m), 5.36(0.4H, m), 4.74(2H, br s), 4.20(0.4H, m), 4.05(0.6H, br t, J = 13 Hz),
3.48-3.57(3H, m), 2.46(4H, m), 1.87(3H, br s), 0.99(6H, m).。
(実施例2)
N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(4−ジメチルアミノメチルフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド(I−2)
実施例1と同様の操作により、上記の化合物(I−2)を得た。
MS
(FAB) m/z : 431 (M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.28(0.6H, s),
8.14(0.4H, s), 7.79-7.91(2H, m), 7.04-7.32(6H, m), 5.69(0.6H, m), 5.35(0.4H,
m), 4.74(2H, br s), 4.18(0.4H, m), 4.07(0.6H, m), 3.47(1H, m), 3.33(2H, m),
2.11(6H, s), 1.87(3H, s).。
(実施例3)
N−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]ベンジル}−2−メトキシアセトアミド(I−3)
(3−1):N−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)ビニル]ベンジル}−2−メトキシアセトアミド(II−3)
前記実施例1(1−5)で得た化合物(II−1b)283mg(0.75mmol)のピリジン溶液(5mL)に、室温でメトキシアセチルクロリド0.2mL(1.85mmol)を滴下した。2日後、飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した後、シリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=20:1→10:1)にて精製し、化合物(II−3)296mg(0.71mmol)を淡黄色固体として得た(収率94%)。物性値を以下に示す。
MS
(FAB) m/z : 414 (M+H)+.。
(3−2):N−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]ベンジル}−2−メトキシ−アセトアミド(I−3)
前記(3−1)で得た化合物(II−3)を用い、前記実施例1と同様な方法(1−7および1−8)により、N−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]ベンジル}−2−メトキシアセトアミド(I−3)を得た。物性値を以下に示す。
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.32(0.6H, s),
8.09(0.4H, s), 7.77-7.88(2H, m), 7.20-7.31(4H, m), 7.06-7.16(2H, m), 5.65(0.6H,
m), 5.37(0.4H, m), 4.75(2H, br s), 4.39-4.47(2H, m), 4.16(0.4H, m), 4.03(0.6H,
br t), 3.93(0.8H, br s), 3.90(1.2H, br s), 3.46(1H, m), 3.40(3H, br s),
1.87(3H, br s).。
(実施例4)
N−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]ベンジル}メタンスルホンアミド(I−4)
実施例3と同様の操作により、上記の化合物(I−4)を得た。
MS
(FAB) m/z : 481 (M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.42(0.6H, s),
7.87(0.4H, s), 7.78-7.88(2H, m), 7.30-7.35(4H, m), 7.06-7.17(2H, m), 5.65(0.6H,
m), 5.39(0.4H, m), 4.75(2H, m), 4.28(2H, m), 4.15(0.4H, m), 4.00(0.6H, br t, J
= 12 Hz), 3.45(1H, m), 2.91(1.2H, s), 2.89(1.8H, s), 1.87(3H, m).。
(実施例5)
N−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]ベンジル}ベンズアミド(I−5)
実施例3と同様の操作により、上記の化合物(I−5)を得た。
MS
(FAB) m/z : 507 (M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.31(0.6H, s),
8.08(0.4H, s), 7.73-7.87(4H, m), 7.51(1H, m), 7.42(2H m), 7.27-7.33(3H, m),
7.07-7.14(2H, m), 5.65(0.6H, m), 5.37(0.4H, m), 4.73(2H, m), 4.54-4.62(2H, m),
4.15(0.4H, m), 4.00(0.6H, m), 3.45(1H, m), 1.86(3H, br s).。
(実施例6)
N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(4−モルホリン−4−イルメチルフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド(I−6)
(6−1):tert−ブチル−(4−メタンスルホニルフェノキシ)ジメチルシラン(XII−6)
4−メチルスルホニルフェノール10g(58.07mmol)のN,N−ジメチルホルムアミド溶液(150mL)にイミダゾール9.9g(145.18mmol)を加えて溶解させた後、tert−ブチルジメチルクロロシラン10.5g(69.7mmol)を加えて撹拌した。反応終了後、飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で3回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=5:1→3:1)にて精製し、tert−ブチル−(4−メタンスルホニルフェノキシ)ジメチルシラン(XII−6)15.97g(55.75mmol)を得た(収率96%)。物性値を以下に示す。
1H-NMR (CDCl3) : δ 7.83(1H, m),
7.81(1H, m), 6.97(1H, m), 6.95(1H, m), 3.04(1H, s), 1.56(9H, s), 0.25(6H, s).。
(6−2): 2−[4−(tert−ブチルジメチルシラニロキシ)ベンゼンスルホニル]−1−(4−モルホリン−4−イルメチルフェニル)エタノン(XIII−6)
前記(6−1)で得たtert−ブチル−(4−メタンスルホニルフェノキシ)ジメチルシラン(XII−6)2.0g(6.98mmol)のテトラヒドロフラン溶液に、アルゴン雰囲気下−78℃でリチウムジイソプロピルアミドの2.0Mヘキサン−ヘプタン−エチルベンゼン溶液4.19mL(8.37mmol)を加え、リチウムヘキサメチルジシラジドの1.0M−テトラヒドロフラン溶液6.98mL(6.98mmol)と、4−モルホリン−4−イルメチル安息香酸メチル(IX−6)1.6g(6.98mmol)のテトラヒドロフラン溶液5mLを加えた。その後、撹拌しながら徐々に室温まで昇温した。反応終了後、飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧下留去した。2−[4−(tert−ブチルジメチルシラニロキシ)ベンゼンスルホニル]−1−(4−モルホリン−4−イルメチルフェニル)エタノン(XIII−6)3.74gを粗精製物として得た。
(6−3):2−[4−(tert−ブチルジメチルシラニロキシ)ベンゼンスルホニル]−1−(4−モルホリン−4−イルメチルフェニル)エタノール(XIV−6)
前記(6−2)で得た化合物(XIII−6)3.74g(6.98mmol)のメタノール(50mL)溶液に、0℃で水素化ホウ素ナトリウム 264mg(6.98mmol)を加えた。1時間撹拌した後、飽和食塩水を加えた。メタノールを減圧下留去した後、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル→酢酸エチル:メタノール=10:1)で精製し、2−[4−(tert−ブチルジメチルシラニロキシ)ベンゼンスルホニル]−1−(4−モルホリン−4−イルメチルフェニル)エタノール(XIV−6)を2.19g(4.48mmol)得た。物性値を以下に示す。
1H-NMR (CDCl3) : δ 7.83(2H, m),
7.25-7.30(4H, m), 6.98(2H, m), 5.22(1H, d, J = 7.7 Hz), 3.68(4H, m), 3.46(3H,
m), 3.30(1H, dd, J= 1.5, 14 Hz), 2.40(4H, m), 0.99(9H, s), 0.25(6H, s).。
(6−4): 4−[(E)−2−(4−モルホリン−4−イルメチルフェニル)エテンスルホニル]フェノール(XVI−6)
前記(6−3)で得た2−[4−(tert−ブチルジメチルシラニロキシ)ベンゼンスルホニル]−1−(4−モルホリン−4−イルメチルフェニル)エタノール(XIV−6)2.19g(4.48mmol)のジクロロメタン溶液(45mL)にトリエチルアミン3.10mLを加え、0℃にて撹拌した。塩化メタンスルホニル0.61mL(8.91mmol)を加えた後、室温にて8時間撹拌した。さらにトリエチルアミン3.10mL、塩化メタンスルホニル0.61mLをそれぞれ加え、4時間撹拌した。飽和食塩水を加えてクロロホルムで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=1:2→酢酸エチル→酢酸エチル:メタノール=10:1)で精製し、4−[(E)−2−(4−モルホリン−4−イルメチルフェニル)エテンスルホニル]フェノール(XVI−6)を0.757g(2.11mmol)得た(収率47%)。物性値を以下に示す。
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.01(1H, d, J
= 8.7 Hz), 7.81(1H, d, J = 8.7 Hz), 7.61(1H, d, J = 15 Hz), 7.35-7.47(5H, m),
6.92(1H, d, J = 6.9 Hz), 6.81(1H, d, J = 15 Hz), 3.71(4H, m), 3.51(2H, m),
2.44(4H, m).。
(6−5): 4−{4−[(E)−2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)ビニル]ベンジル]モルホリン(II−6)
前記(6−4)で得た4−[(E)−2−(4−モルホリン−4−イルメチルフェニル)エテンスルホニル]フェノール(XVI−6)187mg(0.520mmol)のN,N−ジメチルホルムアミド溶液に炭酸カリウム108mg(0.780mmol)および1−ブロモ−2−ブチン0.094mL(1.04mmol)を加え、4時間撹拌した。飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル:クロロホルム=1:1→1:2→酢酸エチル)で精製し、4−{4−[(E)−2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)ビニル]ベンジル]モルホリン(II−6)を0.0238g(0.0578mmol)得た(収率11%)。物性値を以下に示す。
1H-NMR (CDCl3) : δ 7.87(2H, d, J
= 8.7 Hz), 7.63(1H, d, J = 15.5 Hz), 7.35-7.44(4H, m), 7.07(2H, d, J = 8.7 Hz),
6.83(1H, d, J = 15.5 Hz), 4.71(2H, m), 3.69(4H, m), 3.50(2H, s), 2.43(4H, m),
1.86(3H, s).。
(6−6): N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(4−モルホリン−4−イルメチルフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド(I−6)
前記(6−5)で得た化合物(II−6)を用い、前記と同様な方法(1−7および1−8)により、N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(4−モルホリン−4−イルメチル−フェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド(I−6)を得た。物性値を以下に示す。
MS
(FAB) m/z : 473 (M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.45(0.6H, s),
8.11(0.4H, s), 7.80-7.88(2H, m), 7.23-7.32(4H, m), 7.07-7.16(2H, m), 5.63(0.6H,
m), 5.38(0.4H, m), 4.75(2H, m), 4.19(0.4H, m), 4.03(0.6H, m), 3.64-3.71(4H, m),
3.40-3.51(2H, m), 2.39(4H, m), 1.87(3H, m).。
(実施例7)
N−ヒドロキシ−N−[1−(4−モルホリン−4−イルメチルフェニル)−2−(4−ペント−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)エチル]ホルムアミド(I−7)
実施例6と同様の操作により、上記の化合物(I−7)を得た。
MS
(FAB) m/z : 487 (M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.44(0.6H, s),
8.11(0.4H, s), 7.78-7.88(2H, m), 7.26-7.32(4H, m), 7.06-7.16(2H, m), 5.63(0.6H,
dd, J = 3.6, 12.3 Hz), 5.38(0.4H, dd, J = 3.0, 10.1 Hz), 4.75(2H, m),
4.18(0.4H, dd, J = 10.1, 15.7 Hz), 4.03(0.6H, dd, J = 12.3, 14.6 Hz), 3.72(2H,
q, J = 6.9 Hz), 3.64-3.70(4H, m), 3.41-3.48(3H, m), 2.36-2.43(4H, m), 1.24(3H,
t, J = 6.9 Hz).。
スキーム1〜4に従い、実施例1〜7と同様の方法にて、以下の化合物(I−8〜I−28)を得た。
(実施例8)
N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(4−ジメチルアミノフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド(I−8)
MS
(ESI) m/z : 417(M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.40(0.5H, s),
8.04(0.5H, s), 7.73-7.89(2H, m), 7.02-7.22(4H, m), 6.62(2H, d, J = 8.7 Hz),
5.49-5.58(0.5H, m), 5.22-5.31(0.5H, m), 4.73(2H, d, J = 9.2 Hz), 3.98-4.23(1H,
m), 3.37-3.55(1H, m), 2.93(3H, s), 2.91(3H, s), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz).。
(実施例9)
N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(3−ジメチルアミノフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド(I−9)
MS
(ESI) m/z : 417(M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.45(0.5H, s),
8.07(0.5H, s), 7.77-7.89(2H, m), 7.04-7.21(4H, m), 6.57-6.68(2H, m),
5.54-5.62(0.5H, m), 5.27-5.34(0.5H, m), 4.69-4.77(2H, m), 4.00-4.25(1H, m),
3.41-3.54(1H, m), 2.90-2.95(6H, m), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz).。
(実施例10)
N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(2−ジメチルアミノフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド(I−10)
MS
(ESI) m/z : 417(M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.31(0.6H, s),
8.08(0.4H, s), 7.88(0.6H, d, J = 9.2 Hz), 7.83(0.4H, d, J = 8.7 Hz), 7.07-7.42(6H,
m), 6.57-6.68(2H, m), 6.04(0.4H, dd, J = 2.7, 10 Hz), 5.88(0.6H, dd, J = 2.7,
11 Hz), 4.71-4.78(2H, m), 3.99-4.08(1H, m), 3.39-3.51(1H, m), 2.61(2.4H, s),
2.54(3.6H, s), 1.86(3H, t, J = 2.3 Hz).。
(実施例11)
N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(4−ピペリジン−1−イルメチルフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド(I−11)
MS
(ESI) m/z : 471(M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.28(0.6H, s),
8.10(0.4H, s), 7.77-7.89(2H, m), 7.04-7.30(6H, m), 5.61-5.69(0.6H, m),
5.31-5.39(0.4H, m), 4.69-4.78(2H, m), 3.99-4.26(1H, m), 3.35-3.53(3H, m),
2.37(4H, br s), 1.87(3H, br s), 1.35-1.59(6H, m).。
(実施例12)
N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(3−ピペリジン−1−イルメチルフェニル)エチル]ヒドロキシホルムアミド(I−12)
MS
(ESI) m/z : 471(M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.38(0.5H, s),
8.10(0.5H, s), 7.77-7.89(2H, m), 7.04-7.30(6H, m), 5.70(0.5H, dd, J = 3.7, 11
Hz), 5.30-5.38(0.5H, m), 4.69-4.77(2H, m), 4.01-4.27(1H, m), 3.23-3.60(3H, m),
2.30(4H, br s), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz), 1.31-1.55(6H, m).。
(実施例13)
N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(3−モルホリン−4−イルメチルフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド(I−13)
MS
(ESI) m/z : 473(M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.46(0.5H, s),
8.10(0.5H, s), 7.78-7.90(2H, m), 7.06-7.31(6H, m), 5.65(0.5H, dd, J = 3.7, 12
Hz), 5.35-5.42(0.5H, m), 4.70-4.78(2H, m), 3.98-4.26(1H, m), 3.68(4H, dd, J =
4.6, 4.6 Hz), 3.39-3.54(3H, m), 2.36-2.44(4H, m), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz).。
(実施例14)
N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−{4−[(エチルメチルアミノ)メチル]フェニル]エチル}−N−ヒドロキシホルムアミド(I−14)
MS
(ESI) m/z : 445(M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.35(0.5H, s),
8.11(0.5H, s), 7.78-7.89(2H, m), 7.06-7.28(6H, m), 5.65(0.5H, dd, J = 3.7, 12
Hz), 5.32-5.40(0.5H, m), 4.71-4.77(2H, m), 3.99-4.24(1H, m), 3.38-3.53(3H, m),
2.38(3H, q, J = 7.3 Hz), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz), 1.05(3H, t, J = 7.3 Hz).。
(実施例15)
N−(2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−{3−[(エチルメチルアミノ)メチル]フェニル}エチル)−N−ヒドロキシホルムアミド(I−15)
MS
(ESI) m/z : 445(M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.37(0.5H, s),
8.11(0.5H, s), 7.78-7.90(2H, m), 7.06-7.34(6H, m), 5.70(0.5H, dd, J = 3.7, 12
Hz), 5.32-5.40(0.5H, m), 4.70-4.78(2H, m), 4.00-4.22(1H, m), 3.29-3.59(3H, m),
2.38(3H, q, J = 6.9 Hz), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz), 1.03(3H, t, J = 6.9 Hz).。
(実施例16)
N−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]ベンジル}−N−メチルメタンスルホンアミド(I−16)
MS
(ESI) m/z : 495(M+H)+.
1H-NMR (DMSO-d6) : δ 8.22(0.5H, br
s), 8.11(0.5H, br s), 7.75-7.86(2H, m), 7.09-7.42(4H, m), 7.13(2H, d, J = 9.2
Hz), 5.70(0.5H, br s), 5.40(0.5H, br s), 4.83-4.89(2H, m), 4.18(2H, s),
3.86-4.16(2H, m), 2.94(3H, s), 2.63(3H, s), 1.84(3H, t, J = 2.3 Hz).。
(実施例17)
N−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]ベンジル}−4−メチルベンゼンスルホンアミド(I−17)
MS
(ESI) m/z : 557(M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.37(0.6H, br
s), 8.03(0.4H, br s), 7.69-7.88(4H, m), 7.04-7.33(8H, m), 5.61(0.6H, dd, J =
3.6, 12 Hz), 5.31-5.39(0.4H, m), 4.70-4.83(2H, m), 3.92-4.17(3H, m),
3.36-3.51(1H, m), 2.43(3H, s), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz).。
(実施例18)
N−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]ベンジル}−4、N−ジメチルベンゼンスルホンアミド(I−18)
MS
(ESI) m/z : 571(M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.47(0.6H, br
s), 8.11(0.4H, br s), 7.78-7.89(2H, m), 7.70(2H, d, J = 8.2 Hz), 7.35(2H, d, J
= 8.2 Hz), 7.23-7.32(4H, m), 7.06-7.17(2H, m), 5.64(0.6H, dd, J = 3.6, 12 Hz),
5.36-5.43(0.4H, m), 4.71-4.78(2H, m), 3.96-4.22(3H, m), 3.38-3.52(1H, m),
2.58(1.2H, s), 2.54(1.8H, s), 2.45(3H, s), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz).。
(実施例19)
N−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]ベンジル}−N−メチルスルホニルメタンスルホンアミド(I−19)
MS
(ESI) m/z : 559(M+H)+.
1H-NMR (DMSO-d6) : δ 8.12(0.5H, br
s), 8.21(0.5H, br s), 7.80(2H, br s), 7.35-7.44(1H, m), 7.32(2H, d, J = 9.2
Hz), 7.31(1H, s), 7.14(2H, d, J = 9.2 Hz), 5.41(0.5H, br s), 5.71(0.5H, br s),
4.87(2H, q, J = 2.3 Hz), 4.83(2H, s), 4.00-4.16(1H, m), 3.84-3.98(1H, m),
3.25(6H, s), 1.84(3H, t, J = 2.3 Hz).。
(実施例20)
N−{2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−[4−(2−ジメチルアミノエチル)フェニル]エチル}−N−ヒドロキシホルムアミド(I−20)
MS
(ESI) m/z : 445(M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.30(0.5H, s),
8.14(0.5H, s), 7.76-7.89(2H, m), 7.00-7.24(6H, m), 5.71(0.5H, dd, J = 3.7, 11
Hz), 5.29-5.36(0.5H, m), 4.69-4.76(2H, m), 4.02-4.21(1H, m), 3.42-3.59(1H, m),
2.43-2.54(2H, m), 2.10-2.28(2H, m), 2.19(6H, s), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz).。
(実施例21)
N−{2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−[4−(2−モルホリン−4−イルエチル)フェニル]エチル}−N−ヒドロキシホルムアミド(I−21)
MS
(ESI) m/z : 487(M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.44(0.5H, s),
8.10(0.5H, s), 7.77-7.89(2H, m), 7.05-7.27(6H, m), 5.62(0.5H, dd, J = 3.7, 12
Hz), 5.32-5.39(0.5H, m), 4.69-4.78(2H, m), 3.96-4.23(1H, m), 3.71(4H, dd, J =
4.1, 4.6 Hz), 3.39-3.53(1H, m), 2.69-2.77(2H, m), 2.43-2.56(6H, m), 1.87(3H, t,
J = 2.3 Hz).。
(実施例22)
N−(2−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]フェニル}エチル)メタンスルホンアミド(I−22)
MS
(ESI) m/z : 495(M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.39(0.5H, s),
8.07(0.5H, s), 7.78-7.89(2H, m), 7.05-7.30(6H, m), 5.65(0.5H, dd, J = 3.7, 12
Hz), 5.33-5.41(0.5H, m), 4.70-4.78(2H, m), 3.95-4.21(1H, m), 3.31-3.52(3H, m),
2.80-2.91(5H, m), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz).。
(実施例23)
N−{2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−[4−(3−ジメチルアミノプロピル)フェニル]エチル}−N−ヒドロキシホルムアミド(I−23)
MS
(ESI) m/z : 459(M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.06-8.13(1H,
m), 7.74-7.88(2H, m), 7.02-7.24(6H, m), 5.64-5.75(0.5H, m), 5.22-5.32(0.5H, m),
4.68-4.76(2H, m), 4.02-4.22(1H, m), 3.40-3.58(1H, m), 2.51(2H, dd, J = 7.3, 7.8
Hz), 2.17(2H, dd, J = 7.3, 7.8 Hz), 2.08(3H, s), 2.06(3H, s), 1.87(3H, t, J =
2.3 Hz), 1.52-1.66 (2H, m).。
(実施例24)
N−{2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−[4−(3−ジエチルアミノプロピル)フェニル]エチル}−N−ヒドロキシホルムアミド(I−24)
MS
(ESI) m/z : 487(M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.29(0.5H, s),
8.07(0.5H, m), 7.75-7.89(2H, m), 7.04-7.24(6H, m), 5.64(0.5H, dd, J = 3.7, 11
Hz), 5.28-5.37(0.5H, m), 4.69-4.77(2H, m), 4.00-4.23(1H, m), 3.41-3.55(1H, m),
2.33-2.60(6H, m), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz), 1.61-1.72(2H, m), 0.91-1.01(6H, m).。
(実施例25)
N−{2−(4−ブト−2−イニルオキシ−ベンゼンスルホニル)−1−[4−(3−モルホリン−4−イルプロピル)フェニル]エチル}−N−ヒドロキシホルムアミド(I−25)
MS
(ESI) m/z : 501(M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.37(0.5H, s),
8.08(0.5H, s), 7.76-7.89(2H, m), 7.04-7.24(6H, m), 5.64(0.5H, dd, J = 3.7, 12
Hz), 5.29-5.38(0.5H, m), 4.68-4.77(2H, m), 3.98-4.23(1H, m), 3.67(4H, br s),
3.40-3.53(1H, m), 2.52-2.63(2H, m), 2.24-2.46(6H, m), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz),
1.65-1.76(2H, m).。
(実施例26)
N−{2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−[4−(4−モルホリン−4−イルブチル)−フェニル]−エチル}−N−ヒドロキシホルムアミド(I−26)
MS
(ESI) m/z : 515(M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.41(0.5H, s),
8.10(0.5H, s), 7.77-7.89(2H, m), 7.05-7.24(6H, m), 5.57-5.66(0.5H, m),
5.31-5.38(0.5H, m), 4.69-4.77(2H, m), 3.97-4.23(1H, m), 3.67(4H, dd, J = 4.1,
4.6 Hz), 3.40-3.53(1H, m), 2.52-2.63(2H, m), 2.24-2.46(6H, m), 1.87(3H, t, J =
2.3 Hz), 1.39-1.63(4H, m).。
(実施例27)
N−{4−[1−(ホルミルヒドロキシアミノ)−2−(4−ペント−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)エチル]ベンジル}メタンスルホンアミド(I−27)
MS
(ESI) m/z : 495(M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.29(0.6H, s),
8.00(0.4H, s), 7.75-7.88(2H, m), 7.23-7.35(4H, m), 7.05-7.16(2H, m), 5.66(0.6H,
dd, J = 3.7, 12 Hz), 5.31-5.41(0.4H, m), 4.71-4.80(2H, m), 4.26(2H, br s),
3.95-4.18(1H, m), 3.39-3.50(1H, m), 2.89(3H, br s), 2.24(2H, tq, J = 1.8, 7.3
Hz), 1.14(3H, t, J = 7.3 Hz).。
(実施例28)
N−{4−[1−(ホルミルヒドロキシアミノ)−2−(4−オクト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)エチル]ベンジル}メタンスルホンアミド(I−28)
MS
(ESI) m/z : 537(M+H)+.
1H-NMR (CDCl3)
: δ 8.35(0.6H, s),
8.03(0.4H, s), 7.76-7.88(2H, m), 7.27-7.36(4H, m), 7.06-7.17(2H, m), 5.66(0.6H,
dd, J = 3.7, 12 Hz), 5.34-5.42(0.4H, m), 4.72-4.82(2H, m), 4.23-4.33(2H, m),
3.94-4.18(1H, m), 3.38-3.51(1H, m), 2.90(1.2H, s), 2.89(1.8H, s), 2.22(2H, tt,
J = 2.3, 7.3 Hz), 1.45-1.55(2H, m), 1.23-1.38(4H, m), 0.87(3H, t, J = 7.3 Hz).。
(試験例3) ADAM17阻害実験
実施例1〜7において得られたN−ヒドロキシホルムアミド誘導体のADAM17に対する阻害作用の有無を調べた。
すなわち、先ず、ADAM17の塩基配列はモス(Moss)らにより報告されている(Mossら、Nature、1997年、385巻、733−736ページ 参照)ので、ヒト単球細胞株THP−1細胞から定法にしたがってADAM−17のcDNAを取得し、これを発現ベクターに組み込み、次いでこのベクターを哺乳動物細胞あるいは昆虫細胞に形質転換し、ADAM17を発現させ取得した。
次に、得られたADAM17を酵素として用い、また基質としては、膜結合型TNFのADAM17切断配列を含んだ蛍光合成基質 Nma(N−メチルアントラニル酸)−Leu−Ala−Gln−Ala−Val−Arg−Ser−Ser−Lys−Dnp(ジニトロフェニル)−D−Arg−NHを用いて、被験物質存在下または非存在下におけるADAM17の活性を以下のようにして測定した。
すなわち、アッセイバッファーA(200mmol/L塩化ナトリウム、5mmol/L塩化カルシウム、10μmol/L硫酸亜鉛、2mg/mL牛血清アルブミンを含む、50mmol/Lトリス−塩酸緩衝液(pH7.5))にて調製した14unitsの酵素液(25℃の条件下で1pmolの基質を1分間で分解する酵素量を1unitと定義した)90μL、およびアッセイバッファーB(200mmol/L塩化ナトリウム、5mmol/L塩化カルシウム、10μmol/L硫酸亜鉛、0.05%PLURONIC F−68を含む、50mmol/Lトリス−塩酸緩衝液(pH7.5))にて20μmol/Lに調製した蛍光合成基質90μLを混合し、37℃で1.5時間反応させた。この後、蛍光強度計(Fluoroskan Ascent)にて、励起波長355nm、測定波長460nmの条件で測定し、酵素活性を求めた。そして、被験化合物の存在下および非存在下の酵素活性より阻害率を求め、50%抑制濃度(IC50)を算出した。得られた結果を表1に示す。
表1に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物(N−ヒドロキシホルムアミド誘導体)であるI−1〜I−7はいずれも低濃度にてADAM17の酵素活性を阻害することが確認された。
(試験例4) 各種評価試験
次に実施例1〜7において得られたN−ヒドロキシホルムアミド誘導体の中から、ADAM17に対する阻害効果の高かった化合物 I−1(以下、「S−45282」とも称する)及びI−4(以下、「S−45457」とも称する)について、下記の方法にて、その阻害剤としての特異性と細胞におけるTACE阻害活性を調べた。比較のために非選択的なメタロプロテアーゼ阻害剤であるGM6001(EMD/Calbiochem社、製品番号364205)も評価した。
<酵素阻害試験>
この試験において用いた酵素は下記の通りである
Matrix metalloproteinase 1(MMP−1)(Calbiochem社製、製品番号:444208)
Matrix metalloproteinase 2(MMP−2)(Calbiochem社製、製品番号:444213)
Matrix metalloproteinase 3(MMP−3)(Calbiochem社製、製品番号:444217)
Matrix metalloproteinase 8(MMP−8)(Calbiochem社製、製品番号:444229)
Matrix metalloproteinase 9(MMP−9)(Calbiochem社製、製品番号:444231)
Matrix metalloproteinase 13(MMP−13)(Chemicon社製、製品番号:CC068)
Matrix metalloproteinase 14(MMP−14)(Calbiochem社製、製品番号:475935)
Matrix metalloproteinase 17(MMP−17)(Calbiochem社製、製品番号:475940)
A disintegrin and metalloproteinase 10(ADAM10)(フナコシ社製、商品コード:936−AD−020)
A disintegrin and metalloproteinase 17(ADAM17、TACE)(試験例3の通り、科研製薬にて遺伝子組み換え法を用いて作製したものを使用した。なお、試験例3の通り、25℃の条件下で1pmolの基質を1分間で分解する酵素量を1unitと定義した。)。
また、この試験で用いた基質は下記の通りである
444221基質(DNP−Pro−Cha−Gly−Cys(Me)−His−Ala−Lys(Nma)−NH、カスタム合成):励起波長355nm、蛍光波長460nm
TACE基質(試験例3で用いたものと同じ): 励起波長355nm、蛍光波長460nm
3168基質(MOCAc−Arg−Pro−Lys−Pro−Val−Glu−Nva−Trp−Arg−Lys(Dnp)−NH、ペプチド研究所社製): 励起波長320nm、蛍光波長405nm
3163基質(MOCAc−Pro−Leu−Gly−Leu−Apr(Dnp)−Ala−Arg−NH、ペプチド研究所社製): 励起波長320nm、蛍光波長405nm。
そして、前記酵素及び基質を用いて酵素反応を行った。すなわち、酵素によっては製造元の情報に従い予めAPMA(終濃度1mmol/L、p−aminophenylmercuric acetate、Sigma−Aldrich社製、A9563)で活性化させた後、蛍光専用96wellプレートにアッセイバッファーA(200mmol/L 塩化ナトリウム、5mmol/L 塩化カルシウム、10μmol/L 硫酸亜鉛、2mg/mL 牛血清アルブミンを含む、50mmol/L トリス−塩酸緩衝液(pH7.5))にて調製した酵素液90μLに、アッセイバッファーB(200mmol/L 塩化ナトリウム、5mmol/L 塩化カルシウム、10μmol/L 硫酸亜鉛、0.05%PLURONIC F−68を含む、50mmol/L トリス−塩酸緩衝液(pH7.5))にて20μmol/Lに調製した基質90μLを混合し、25℃もしくは37℃で数時間反応させた。そして、反応前後の蛍光強度を蛍光強度計にて測定し、酵素活性を求め、試験物質の存在下および非存在下の酵素活性より阻害率を求め、50%抑制濃度(IC50)を算出した。各酵素の反応条件は表2に示す。
<細胞におけるTACE阻害試験>
THP−1細胞(ヒト急性単球型白血病由来の細胞、ATCCカタログ番号:TIB202)を10v/v% FBS含有RPMI1640に懸濁し、96ウェル培養プレートに、200μL/well(1×10個)ずつ分注し、PMA(終濃度50nmol/L)添加し、37℃、5%CO存在下にて40〜48時間培養し、THP−1細胞をマクロファージ様細胞へと分化させた。分化後に、培地を捨て、細胞をTHP−1洗浄バッファー(RPMI1640、20mM HEPES−NaOH(pH7.4))で洗浄した。細胞の洗浄後、THP−1アッセイバッファー(RPMI1640、20mmol/L HEPES−NaOH(pH7.4)、0.01w/v% PF−68、10v/v% FBS)を100μL/wellずつ添加した。そして、試験物質(I−1又はI−4)含有THP−1アッセイバッファーをさらに50μL/wellずつ添加し、タッピングによって混合し、COインキュベーター内にて30〜45分間プレインキュベートした後、LPS入りTHP−11アッセイバッファーを50μL/well加えた(LPSの最終濃度は1μg/mLとなる)。更に、プレートをタッピングすることで混合し、COインキュベーター内にて6時間インキュベートした。インキュベート終了後、培養上清中のヒトTNF−α濃度を市販キット(Human TNF−α CytoSet(BIOSOURCE社製)、または、Human TNF−α Ready−Set−Go!(eBioscience社製))で測定した。
これらの試験方法で得られた結果を表3に示す。
表3に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物であるI−1及びI−4は共にADAM17以外のメタロプロテアーゼと比較して、ADAM17に対して高い特異性を有していることが確認された。マクロファージ様細胞に発現したTACEに対する阻害活性も確認された。また、両化合物は、ADAM10もADAM17に比べると若干弱いものの抑制した。ADAM10は、ADAM17と同一の基質をも切断する酵素であり(Caescuら、Biochemical J.、2009年、424巻、79〜88ページ 参照)、その阻害は血小板機能の保存に有用であることが示唆されている(Benderら、「Differentially regulated GPVI ectodomain shedding by multiple platelet−expressed proteinases.」、Blood、2010年7月19日電子版 参照)。然るに、本発明にかかる化合物であるI−1及びI−4はADAM17特異的阻害剤であり、同様の基本骨格を有する他の本発明にかかる化合物(例えば、I−2、I−3、I−5、I−6)もADAM17特異的阻害剤であることが示唆された。一方、ヒドロキサム酸構造を有するGM6001は、従来知られているように非特異的にメタロプロテアーゼを強く阻害したが、ADAM17に対する阻害活性は弱いものであった。
(試験例5) GM6001及びS−45282のES細胞由来血小板に対する機能維持効果についての検証
前述の通りにして得られたES細胞由来の造血前駆細胞を、図6に示した条件下(プロトコール1)で血小板の誘導を行った。すなわち、造血前駆細胞を巨核球/血小板に誘導する前述の8日間の培養過程において、
2days:フローサイトメトリー解析にかける2日前(図6において示す「d22」)にGM6001、S−45282、又はDMSOを添加して培養、又は
8days:ES細胞由来の造血前駆細胞を播き直してから8日間(図6において示す「d15」以降)、GM6001(50μM)、S−45282(5μM又は50μM)、又はDMSOを添加して培養
という条件下で各々培養を行い、前述の通り回収して、フローサイトメトリーにて、CD41(+)CD42b(+)の数、CD41(+)CD42b(−)の数、及び血小板の総数を測定した。得られた結果を図7〜図10に示す。なお、CD41(インテグリンαIIb)は血小板の表面マーカーであるため、CD41(+)は血小板であることを示している。また、CD42b(GPIbα)(+)は、GPIbαが表面に存在している血小板であることを示し、CD42b(GPIbα)(−)は、ADAM17によってGPIbαがシェディングされてしまった血小板であることを示す。また図中「GM」は50μM GM6001(溶媒:DMSO)を添加した結果を示し、「45282」は各濃度のS−45282(溶媒:DMSO)を添加した結果を示す。
図7及び図9に示した結果から明らかなように、GM6001及びS−45282は各々ADAM17によるGPIbαのシェディングを阻害していることが確認された。さらに、S−45282は5μMでも50μM GM6001に相当する阻害効果を有していることも明らかになった。
また、図8及び図10に示した結果から明らかなように、50μMのGM6001と5μMのS−45282の2日間添加では、ほぼ同数の血小板が得られるが、8日間添加した場合においては、GM6001は5μMのS−45282と比べて血小板数が少なく、50μMのGM6001は細胞毒性を有していることが明らかになった。
(試験例6) S−45457及びS−45282のES細胞由来血小板に対する機能維持効果についての検証
前述の通りにして得られたES細胞由来の造血前駆細胞を、図6に示した条件下(プロトコール1)で血小板の誘導を行った。すなわち、ES細胞由来の造血前駆細胞を播き直してから8日間(図6において示す「d15」以降)、GM6001(50μM)、S−45457(5μM又は50μM)、S−45282(5μM)、又はDMSOを添加して培養を行い、前述の通り回収して、フローサイトメトリーにて、CD41(+)CD42b(+)の数、CD41(+)CD42b(−)の数、及び血小板の総数を測定した。得られた結果は図11及び図12に示す。なお、図中「45457」は各濃度のS−45457(溶媒:DMSO)を添加した結果を示す。
図11及び図12に示した結果から明らかなように、S−45457も、GM6001及びS−45282同様にADAM17によるGPIbαのシェディングを阻害していることが確認された。
(試験例7) S−45457の血小板に対する機能維持効果における濃度依存性についての検証
前述の通りにして得られたES細胞又はiPS細胞由来の造血前駆細胞を、図6に示した条件下で血小板の誘導を行った。すなわち、ES細胞又はiPS細胞由来の造血前駆細胞を播き直してから8日間(図6において示す「d15」以降)、GM6001(50μM)、S−45457(1.5〜50μM)、又はDMSOを添加して培養を行い、前述の通り回収して、フローサイトメトリーにて、CD41(+)CD42b(+)の数、CD41(+)CD42b(−)の数、及び血小板の総数を測定した。4回実施して得られた結果を図13〜16に示す。なお、血小板総数に占めるCD42b(+)の比率における統計処理は、角変換した値を分散分析で実施し、Dunnet法でDMSO群と試験物質群の群間差を多重比較した。
図14及び16に示した結果から明らかなように、ES細胞を用いた培養系(図14)と同様にiPS細胞を用いた培養系(図16)においても、本発明にかかる化合物であるS−45457を添加することによって、その添加した濃度依存的にADAM17によるGPIbαのシェディングを阻害していることが確認された。さらに、図13及び15に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物であるS−45457はES細胞及びiPS細胞、並びにこれらから分化誘導される細胞に対する毒性は低いことも確認された。
(試験例8) S−45457のヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果における濃度依存性についての検証
前述のような培養系を用いて得られた血小板だけでなく、採血によって得られた末梢血由来の血小板においても、本発明にかかる化合物は機能維持効果を発揮するのかを検証した。すなわち、図6に示した<プロトコール2>の通り、先ず、採血して得られたヒト末梢血にその1/10量のACDを加え、ブレーキ無し、900rpmで10分間遠心した。遠心して得られた上清を更にブレーキ無し、1500rpmで10分間遠心した後、上清を除去した。得られた沈殿物をTyrode−HEPESバッファー(カルシウム含まず)に懸濁し、懸濁液中の血小板数を数え、5×10〜1×10個/Tyrode−HEPESバッファー(カルシウム含まず)200μLになるように血小板を含む懸濁液(洗浄血小板、Washed Platelet)を調製した。次に、このように調製して得られた洗浄血小板に100μM CCCP(Carbonyl cyanide m−chlorophenyl hydrazone)と共に、50μM GM6001、1.5〜50μM S−45457、又はDMSOを添加し、37℃で24時間インキュベーションし、フローサイトメトリーにて、CD41(+)CD42b(+)の数、CD41(+)CD42b(−)の数を測定した。なお、CCCPの添加により、血小板表面上のGPIbαのシェディングは亢進されることが知られている(Bergmeierら、Blood、2003年、102巻、4229〜4235ページ 参照)。得られた結果を図17に示す。統計処理は、試験例7と同様である。
図17に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物は、GM6001と同様に、ヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果、特に37℃における機能維持効果を有していることが確認された。
(試験例9) S−45457及びp38阻害剤のヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果の検証
p38を阻害することにより、GPIbαのシェディングは阻害されることが知られている(Matthias C.ら、TRANSFUSION MEDICINE、BLOOD、2010年3月4日、115巻、9号、1835〜1842ページ 参照)。そこで、ヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果において、p38阻害剤と本発明にかかる化合物とを比較した。すなわち、試験例8と同様にして調製して得られた洗浄血小板に100μM CCCPと共に、40μM p38阻害剤2種(p38MAPキナーゼ阻害剤、Calbiochem社製、製品番号SB202190及びSB203580)、50μM S−45457、又はDMSOを添加し、37℃で24時間インキュベーションし、フローサイトメトリーにて、CD41(+)及びCD42b(+)のドットプロット解析を行った。得られた結果を図18に示す。なお。図18中、X軸はCD41を示し、Y軸はCD42bを示す。また、図中「202190」「203580」は40μM 各p38阻害剤(溶媒:DMSO)を添加した結果を示す。
さらに、試験例8と同様にして調製して得られた洗浄血小板に100μM CCCPと共に、40μM 前記p38阻害剤2種、50μM GM6001、0.5〜50μM S−45457、又はDMSOを添加し、37℃で24時間インキュベーションし、フローサイトメトリーにて解析し、血小板におけるCD41(+)CD42b(+)の割合を算出した。得られた結果を図19に示す。
図18及び図19に示した結果から明らかなように、p38阻害剤の添加におけるGPIbα(CD42b)(+)細胞の数は、DMSO添加のそれと比較して多いことから、p38阻害剤もヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果を有していることが確認された。しかしながら、本発明にかかる化合物の添加による効果は、p38阻害剤の添加による効果よりも優れたものであった。
(試験例10) S−45457及びp38阻害剤のES細胞由来の血小板に対する機能維持効果についての検証
前述の通りにして得られたES細胞由来の造血前駆細胞を、図6に示した条件下(プロトコール1)で血小板の誘導を行った。すなわち、ES細胞由来の造血前駆細胞を播き直してから8日間(図6において示す「d15」以降)、50μM GM6001、0.15〜50μM S−45457、40μM 前記p38阻害剤2種、50μM GM6001、又はDMSOを添加して培養を行い、前述の通り回収して、フローサイトメトリーにて、血小板の総数、血小板におけるCD41(+)CD42b(+)の割合を測定、算出した。得られた結果を図20及び図21に示す。
図20に示した結果から明らかなように、p38阻害剤の添加によって得られた血小板の数は著しく少ないものであり、顕著な細胞毒性が確認された。また、図21に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物の添加によるES細胞由来の血小板に対する機能維持効果は認められるが、p38阻害剤の添加による効果は、全く認められなかった。
(試験例11) S−45457及びS−45282のヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果についての検証
S−45457及びS−45282のヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果を調べるため、試験例8と同様にして、洗浄血小板に100μM CCCPと共に、50μM GM6001、5μM若しくは50μM S−45457、50μM S−45282、又はDMSOを添加し、37℃で24時間インキュベーションし、フローサイトメトリーにて、血小板の総数及びCD42b(+)の数を測定し、血小板におけるCD42b(+)の割合を算出した。得られた結果を図22に示す。
図22に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物は、GM6001と同様に、ヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果、特に37℃における機能維持効果を有していることが確認された。
(試験例12) ヒト末梢血PRPに対する機能維持効果についての検証
ヒト末梢血PRP(platelet−rich plasma、多血小板血漿)を用いて、各化合物が有する血小板に対する機能維持効果の持続性について調べた。すなわち、先ず、採血して得られたヒト末梢血にその1/10量のACDを加え、室温下、ブレーキ無し、900rpmで10分間遠心した。次に、このようにして得られた上清(PRP)に、50μM GM6001、50μM S−45457、5μM S−45282、40μM 前記p38阻害剤2種、又はDMSOを添加し、37℃で24時間又は72時間インキュベーションし、フローサイトメトリーにて、CD41(+)CD42b(+)の数、CD41(+)CD42b(−)の数を測定し、血小板におけるCD41(+)CD42b(−)又はCD41(+)CD42b(+)の割合を算出した。得られた結果を図23に示す。また図23中、「fresh」はヒト末梢血PRPをインキュベーションせずにフローサイトメトリーにて解析した結果を示す。
図23に示した結果から、本発明にかかる化合物であるS−45457は72時間インキュベーションしてもADAM17によるGPIbα(CD42b)のシェディングを抑制し続けられることが明らかになった。また、本発明にかかる化合物であるS−45282も5μMという添加濃度を考慮すると高いヒト末梢血PRPに対する機能維持効果を有していることが明らかになった。一方、p38阻害剤の効果は弱いか、あるいはほぼ観察できないレベルしか認められなかった。
(試験例13) ヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果の検証
試験例8と同様にして得た洗浄血小板に100μM CCCPと共に、50μM GM6001、50μM S−45457、5μM S−45282、40μM 前記p38阻害剤2種、又はDMSOを添加し、37℃で24時間インキュベーションし、フローサイトメトリーにて、CD41(+)及びCD42b(+)のドットプロット解析を行った。得られた結果を図24に示す。なお図24中、X軸はCD41を示し、Y軸はCD42bを示す。また図24中、「fresh」は洗浄血小板をインキュベーションせずにフローサイトメトリーにて解析した結果を示す。
図24に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物であるS−45457はADAM17によるGPIbα(CD42b)のシェディングを抑制していることが確認された。また、S−45457には劣るものの、本発明にかかる化合物であるS−45282も高いヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果を有していることが確認された。さらに、p38阻害剤の効果は弱いことが確認された。
(試験例14) S−45457のヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果における濃度依存性についての検証
試験例8と同様にして、洗浄血小板に100μM CCCPと共に、50μM GM6001、0.5〜50μM S−45457、又はDMSOを添加し、37℃で24時間インキュベーションし、フローサイトメトリーにて、CD41(+)及びCD42b(+)のドットプロット解析を行い、S−45457のヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果を調べた。得られた結果を図25に示す。なお図25中、X軸はCD41を示し、Y軸はCD42bを示す。
図25に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物は、その濃度依存的にADAM17によるGPIbα(CD42b)のシェディングを抑制していることが確認された。
(試験例15) フローチャンバーを用いた、S−45457による血小板接着能の維持効果の検証
通常、血管壁が損傷すると、血管内皮細胞下のコラーゲン組織の露出が生じ、血漿中のフォン・ウィルブランド因子(VWF)がコラーゲン組織に結合するようになる。そして、VWFとGPIbα(CD42b)との相互作用、及び、VWFとα2bβ3インテグリンとの相互作用を介して、血小板は血管に接着するようになると解されている。また、血管に接着した血小板を起点として、VWFとGPIbαとの相互作用、並びに、VWFとα2bβ3インテグリンとの相互作用を介して、血小板どうしも接着していき、血栓は発達していくと解されている(Ruggeri ZM.、Nature Medicine、2002年11月、8巻、11号、1227〜1234ページ 参照)。
そこで、試験例1〜14において示された、本発明にかかる化合物(S−45457等)によるGPIbαシェディングに対する抑制効果は、VWFとGPIbα(CD42b)との相互作用を維持し、血小板の接着能の維持に寄与しているのかを、血栓形成の経過を定量的に評価することのできるフローチャンバーを用いて、評価した。
すなわち、先ず、採血して得られたヒト末梢血にACDを加え、ブレーキ無し、900rpmで10分間遠心して上清を回収した。得られた上清に1μM プロスタグランジンE1(PGE1)を加え、ブレーキ無し、1500rpmで10分間遠心した後、上清を除去した。得られた沈殿物をTyrode HEPES Ca(−)緩衝液中に懸濁し、100μM CCCPを添加し、同時にDMSO若しくは15μM S−45457とを添加した後、37℃で24時間インキュベーションした。なお、この際CCCPとDMSOとを添加してインキュベーションしたものを陰性対照として、何も添加せずインキュベーション処理を行わなかったものを陽性対照として用意した。
そして、インキュベーション後(陽性対照はインキュベーションせずに)、懸濁液に1/2000に希釈したTMRE(テトラメチルローダミンエチルエステル、過塩素酸)を添加し、室温下で15分間インキュベートして血小板を蛍光標識した。その後、Tyrode HEPES Ca(−)緩衝液を加え、ブレーキ無し、1500rpmで8分間遠心し、洗浄を行った。
次に、蛍光標識した各血小板サンプルを、アルガトロバン(抗トロンビン薬)にて抗凝固処理を行って採取したヒト末梢血の全血サンプルに、全血血小板の10%の数になるように加え、混合した。そして、このように調製した血液サンプルを一定の壁剪断速度(1500S−1)で、シリンジポンプ(Harvard Apparatus社製)により、VWFで表面をコ―ティングしたチャンバー内に注入し、この表面上にVWFを介して接着し、血栓を形成する蛍光標識した血小板を倒立ステージエピ蛍光ビデオ顕微鏡システム(DM IRB、Leica社製)を用いて可視化し、その顕微鏡像を感光性カラーCCDカメラ(L−600、Leica社製)を用いてデジタル化し、更にイメージ−Jソフトウェア(NIHイメージ)を用いて、血小板による表面積カバー率を算出した。なお、かかる試験は2回ずつ行い、陽性対照(freshな血小板)における表面積カバー率の最大値を各々100%にして、各サンプルの生データを換算して、2回の試験から得られた値の平均値を算出した。得られた結果は図26及び図27に示す。なお、図26及び27中、縦軸は前記平均値を示し、「S−45457」は15μM S−45457を添加して調製した血小板における結果を示し、「DMSO」は陰性対照における結果を示し、「fresh」は陽性対照(freshな血小板)における結果を示す。また、図26中の横軸はチャンバー内に注入してからの計測時間(単位:分)を示す。
図26及び図27に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物(S−45457)は、陰性対照であるDMSOを添加してCCCPと共にインキュベーションした結果と比較して、血小板による表面積カバー率は大きいものであった。然るに、本発明にかかる化合物はADAM17によるGPIbαのシェディングを抑制し、ひいてはGPIbαとVWFとの会合をも可能とし、血小板の接着能を維持することができることが明らかになった。
(試験例16) 生体分子イメージング手法を用いた、S−45457による血小板接着能の維持効果の検証
本発明者等によって開発された血栓形成モデル並びに生体分子イメージング手法を用いて、本発明にかかる化合物(S−45457等)による血小板接着能の維持効果、特に血小板の血管への接着能をインビボにおいて評価した。
なお、本試験例において用いた血栓形成モデルは、レーザー照射とヘマトポルフィリン等とを用いて、活性酸素(ROS)を血管内に局所的に発生させ、血管内皮細胞に障害を引き起こすことにより、血小板を血管に接着させ、血栓形成を誘発させるものである。また、本試験例において用いた生体分子イメージング手法は、高速レーザー共焦点顕微鏡及びマルチビーム式の共焦点ユニットを用いて、血流の方向と平行にごく狭い断面に焦点を合わせて高速画像を取得することが可能であるため、血管内を変形しながら流れる血小板等に各々フォーカスを合わせて観察することにより、単一血小板レベルでの生体イメージングを可能とするものである(Takizawaら、The Journal of Clinical Investigation、2010年1月、120巻、1号、179〜190ページ 参照)。以下、本試験例で用いた血栓形成モデル並びに生体分子イメージング手法について説明する。
先ず、血栓形成モデルマウスに注入するための血小板を調製した。すなわち、採血して得られたヒト末梢血に10v/v%になるようACDを加え、ブレーキ無し、900rpmで10分間遠心して上清を回収した。得られた上清に1μM PGE1を加え、ブレーキ無し、1500rpmで10分間遠心した後、上清を除去した。得られた沈殿物をTyrode HEPES Ca(−)緩衝液に懸濁し、100μM CCCPと、DMSO又は15μM S−45457とを添加した後、37℃で24時間インキュベーションした。なお、この際CCCPとDMSOを添加してインキュベーションしたものを陰性対照として、何も添加せずインキュベーション処理を行わなかったものを陽性対照として用意した。インキュベーション後(陽性対照はインキュベーションせずに)、かかる沈殿物における血小板の数を計測し、2ml Tyrode HEPES Ca(−)緩衝液(1μM PGE1含有)中に懸濁した。そして、かかる懸濁液に5μM TMREを添加し、室温下で15分間インキュベートして血小板を蛍光標識した。その後、Tyrode HEPES Ca(−)緩衝液を加え、ブレーキ無し、1500rpmで8分間遠心し、洗浄を行った。
次に、血栓形成モデルマウスを調製した。すなわち、予め2Gyの放射線処置によって血小板減少処置を施しておいたNOGマウス(重度複合免疫不全マウス)を麻酔して腹壁に小切開を施し、腸間膜における微小循環及び血栓形成を視覚的に解析できるようにした。さらに、NOGマウス由来の血球の動態を可視化するために、FITC−デキストラン(20mg/kg体重)をこのNOGマウスの尾静脈に注入した。そして、前記の通りにして蛍光標識した血小板をこのNOGマウスに、このマウスの循環血小板数の15%の数になるように注入した。さらに、血栓形成を誘発させるために、ヘマトポルフィリン(1.8mg/kg体重)をこのNOGマウスに投与した。なお、このようにマウスを処理することにより、血球動態及び血栓形成は、レーザー照射及びROS産生の間可視化されることになる。
そして、レーザー照射の際のかかる可視化画像(シークエンシャル画像)は、回転ディスク共焦点顕微鏡(横河電機株式会社製、CSU−X1)及びEM(Electron Multiplying)−CCDカメラ(iXon、Andor社製)を用いて、20秒間、30フレーム/秒で、先に施した小切開部位(〜3mm)を通して観察及び撮影することにより得た。なお、かかる観察は、S−45457を添加して調製した血小板を注入したマウス、陰性対照、陽性対照について、閉塞性血栓を形成した20本の独立した血管を対象として行った。得られた結果は図28及び図29に示す。なお、図28及び図29中、「S−45457」は15μM S−45457を添加して調製した血小板を注入したマウスにおける血栓形成を示し、「DMSO」は陰性対照における血栓形成の結果を示し、「fresh」は陽性対照における血栓形成の結果を示す。また、代表例である図28中の白い矢印は血流の方向を示し、白い三角が指している箇所はヒト由来の血小板が血管に付着している箇所を示し、スケールバーは10μmを示す。さらに、図29中の縦軸は、血栓形成に関与した血小板総数に占めるヒト血小板数の割合(%)であり、値は、20本の平均+標準誤差である。
図28及び図29に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物(S−45457)を添加して調製した血小板を注入したマウスにおいては、陰性対照と比較して、ヒト由来の血小板が血栓形成に寄与する割合が大きかった。然るに、本発明にかかる化合物は、ADAM17によるGPIbαのシェディングを抑制することにより、血小板の血管への接着能を維持することができることが明らかになった。
以上説明したように、本発明によれば、ADAM17のメタロプロテアーゼ活性を特異的に抑制し、GPIbαのシェディングを抑制することによって、血小板の機能を維持することが可能となる。したがって、本発明は、機能的に安定し、安全性の高い血小板を、煩雑な作用を要さず、効率良く大量に生産するための試薬や、血液製剤における血小板の機能を維持し、その品質の安定化を図るための医薬品添加剤などとして有用である。

Claims (12)

  1. 下記一般式(I):
    [式中、Xは、フェニレン基;
    Yは、水素原子、または−(CH
    mは0〜4のいずれかの整数;
    は、
    は、置換されていてもよいC1〜C6アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはC1〜C6アルコキシ基;
    およびRは、それぞれ独立して水素原子、C1〜C6アルキル基、あるいはRとRが隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい;
    は、水素原子、C1〜C6アルキル基、またはC1〜C6アルキルスルホニル基;
    Zは、水素原子またはC1〜C6アルキル基を示す。]
    で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を有効成分とする、血小板の機能を維持するための組成物。
  2. 前記一般式(I)で表わされる化合物が、
    N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(4−ジエチルアミノメチルフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド、または
    N−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]ベンジル}メタンスルホンアミド、
    である、請求項1に記載の組成物。
  3. 血小板の機能を維持するための試薬または血小板を含む血液製剤への添加剤である、請求項1または2に記載の組成物。
  4. 巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系に、下記一般式(I):
    [式中、Xは、フェニレン基;
    Yは、水素原子、または−(CH
    mは0〜4のいずれかの整数;
    は、
    は、置換されていてもよいC1〜C6アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはC1〜C6アルコキシ基;
    およびRは、それぞれ独立して水素原子、C1〜C6アルキル基、あるいはRとRが隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい;
    は、水素原子、C1〜C6アルキル基、またはC1〜C6アルキルスルホニル基;
    Zは、水素原子またはC1〜C6アルキル基を示す。]
    で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を添加することを特徴とする、血小板を調製するための方法。
  5. 前記一般式(I)で表わされる化合物が、
    N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(4−ジエチルアミノメチルフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド、または
    N−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]ベンジル}メタンスルホンアミド、
    である、請求項4に記載の方法。
  6. 前記培養系における培養温度が35〜38℃であることを特徴とする、請求項4または5に記載の方法。
  7. 巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系に、下記一般式(I):
    [式中、Xは、フェニレン基;
    Yは、水素原子、または−(CH
    mは0〜4のいずれかの整数;
    は、
    は、置換されていてもよいC1〜C6アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはC1〜C6アルコキシ基;
    およびRは、それぞれ独立して水素原子、C1〜C6アルキル基、あるいはRとRが隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい;
    は、水素原子、C1〜C6アルキル基、またはC1〜C6アルキルスルホニル基;
    Zは、水素原子またはC1〜C6アルキル基を示す。]
    で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を添加した培養物。
  8. 前記一般式(I)で表わされる化合物が、
    N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(4−ジエチルアミノメチルフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド、または
    N−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]ベンジル}メタンスルホンアミド、
    である、請求項7に記載の培養物。
  9. 下記一般式(I):
    [式中、Xは、フェニレン基;
    Yは、水素原子、または−(CH
    mは0〜4のいずれかの整数;
    は、
    は、置換されていてもよいC1〜C6アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはC1〜C6アルコキシ基;
    およびRは、それぞれ独立して水素原子、C1〜C6アルキル基、あるいはRとRが隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい;
    は、水素原子、C1〜C6アルキル基、またはC1〜C6アルキルスルホニル基;
    Zは、水素原子またはC1〜C6アルキル基を示す。]
    で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物が添加された、血小板を含む血液製剤。
  10. 前記一般式(I)で表わされる化合物が、
    N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(4−ジエチルアミノメチルフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド、または
    N−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]ベンジル}メタンスルホンアミド、
    である、請求項9に記載の血液製剤。
  11. 下記一般式(I):
    [式中、Xは、フェニレン基;
    Yは、水素原子、または−(CH
    mは0〜4のいずれかの整数;
    は、
    は、置換されていてもよいC1〜C6アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはC1〜C6アルコキシ基;
    およびRは、それぞれ独立して水素原子、C1〜C6アルキル基、あるいはRとRが隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい;
    は、水素原子、C1〜C6アルキル基、またはC1〜C6アルキルスルホニル基;
    Zは、水素原子またはC1〜C6アルキル基を示す。]
    で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を、血小板を含む血液製剤に添加することを特徴とする、血液製剤における血小板の機能を維持するための方法。
  12. 前記一般式(I)で表わされる化合物が、
    N−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(4−ジエチルアミノメチルフェニル)エチル]−N−ヒドロキシホルムアミド、または
    N−{4−[2−(4−ブト−2−イニルオキシベンゼンスルホニル)−1−(ホルミルヒドロキシアミノ)エチル]ベンジル}メタンスルホンアミド、
    である、請求項11に記載の方法。
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