JP2019026591A - AhRアンタゴニストを含む血小板産生促進剤及びそれを用いた血小板の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明に係る血小板産生促進剤は、有効成分として、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤、バニロイド受容体阻害剤、PDGFR阻害剤、TrioN阻害剤、SIRT2阻害剤、H+,K+-ATPase阻害剤、ベンゾジアゼピン逆作動薬、および神経発生促進剤から成る群より選択される1又は複数のAhRアンタゴニストを含む。
・SR1(StemRegenin 1, 4-(2- (2-(benzo [b] thiophen-3-yl)-9-isopropyl-9H-purin-6-ylamino) ethy1)phenol);
・αナフトフラボン
・1,4-ジヒドロキシアントラキノン
・1,5-ジヒドロキシアントラキノン
・1,8-ジヒドロキシアントラキノン
・ガランギン
・レスベラトロール
・CH-223191(2-methyl-2H-pyrazole-3-carboxylic acid(2-methyl-4-o-tolylazo-phenyl)amide);
・GN F351(N-[2-(3H-indol-3-y1)ethyl]-9-isopropy1-2-(5-methy1-3-pyridy1)purin-6-amine)
・PD98059(2-(29-amino-39-methoxypheny1)-oxanaphthalen-4-one)
・TSU-16((Z)-3-[(2,4-dimethylpyrrol-5-y1)methylidenyl]-2-indolinone)
・TMF(6,2',4'-trimethoxyflavone)
・DMF(3',4'-dimethoxyflavone)
本発明に係る血小板の製造方法は、本発明に係る血小板産生促進剤と巨核球細胞及び/又はその前駆細胞とを接触させることを含む。巨核球細胞は、細胞表面マーカーであるCD41a、CD42a、及びCD42b陽性を特徴とし、他に、CD9、CD61、CD62p、CD42c、CD42d、CD49f、CD51、CD110、CD123、CD131、及びCD203cからなる群より選択されるマーカーをさらに発現していることもある。巨核球細胞は、多核化(多倍体化)し成熟すると、血小板を放出する。多核化した巨核球細胞は、通常の細胞の16〜32倍のゲノムを有する。本明細書において、単に「巨核球細胞」という場合、多核化した巨核球細胞と多核化前の巨核球細胞の双方を含む。「多核化前の巨核球細胞」は、「未熟な巨核球細胞」、又は「増殖期の巨核球細胞」とも同義である。
1.受容体型チロシンキナーゼ阻害剤、バニロイド受容体阻害剤、PDGFR阻害剤、TrioN阻害剤、SIRT2阻害剤、H+,K+-ATPase阻害剤、ベンゾジアゼピン逆作動薬、および神経発生促進剤からなる群より選択される1又は複数のAhRアンタゴニストを含む、血小板産生促進剤。
2.受容体型チロシンキナーゼ阻害剤がアキシチニブおよびRG-14620である;
バニロイド受容体阻害剤がSB366791である;
PDGFR阻害剤がAG1296である;
TrioN阻害剤がITX3である;
SIRT2阻害剤がAGK2である;
H+,K+-ATPase阻害剤がSCH-28080である;
ベンゾジアゼピン逆作動薬がβ-CCBおよびFG7142である;および
神経発生促進剤がニューロダジンである;
前記1に記載の血小板産生促進剤。
3.アキシチニブ、RG-14620、SB366791、AG1296、ITX3、AGK2、SCH-28080、β-CCB、FG7142、およびニューロダジンからなる群より選択される1又は複数のAhRアンタゴニストを含む、血小板産生促進剤。
4.ROCK阻害剤を更に含む、又はROCK阻害剤と併用される、前記1〜3のいずれかに記載の血小板産生促進剤。
5.前記1〜4のいずれかに記載の血小板産生促進剤と巨核球細胞及び/又はその前駆細胞とを接触させることを含む、血小板の製造方法。
6.TPOの存在下で前記血小板産生促進剤と前記細胞とを接触させる、前記5に記載の方法。
7.TPOおよびSCFの存在下で前記血小板産生促進剤と前記細胞とを接触させる、前記5または6に記載の方法。
8.ROCK阻害剤と前記細胞とを接触させることを更に含む、前記5〜7のいずれかに記載の方法。
9.前記血小板産生促進剤と接触させた細胞から産生された血小板を得ることを更に含む、前記5〜8のいずれかに記載の方法。
10.前記細胞が巨核球細胞である、前記5〜9のいずれかに記載の方法。
11.巨核球細胞が不死化巨核球細胞である、前記10に記載の方法。
12.不死化巨核球細胞が多能性幹細胞から誘導されたものである、前記11に記載の方法。
13.多能性幹細胞がiPS細胞である、前記12に記載の方法。
14.iPS細胞がヒト由来である、前記13に記載の方法。
15.前記5〜14のいずれかに記載の方法により製造された血小板を含む、血小板製剤または血液製剤。
不死化巨核球株 (MKCL SeV2) は、Nakamura, et al. Cell Stem Cell, 2014に記載の方法に従い、iPS細胞 (SeV2: 新生児ヒト線維芽細胞へ国際公開第2010/134526号の方法に従って、センダイウィルスベクターによりc-MYC、OCT3/4、SOX2およびKLF4を導入することによって作製した細胞)に、ドキシサイクリンの存在下で発現するBcl-xL、c-MycおよびBmilを導入することで調製した。Okita K, et al, Stem Cells. 31(3): 458-466, 2013に記載の方法に従って、不死化巨核球株 (MKCL SeV2) からiPS細胞 (MK iPS #12) を製造した。得られたiPS細胞 (MK iPS #12) は、Nakagawa M, et al, Sci Rep. 8; 4: 3594, 2014 に記載の方法に従って、StemFit (登録商標) AK03 (Ajinomoto)及びラミニン511 (iMatrix 511 (Nippi)) を用いて培養した。
巨核球の成熟マーカーであるTUBB1の遺伝子座にレポーター遺伝子(VENUS)が導入された細胞を、CRISPR/Cas9システムを用いた相同組換えにより作製した。詳細には、iPS細胞 (MK iPS #12) をTrypLE (登録商標)Selectにて剥離し、0.8 x lO6個を、テンプレートベクター(pBlueScript II SK+ (TUBBl-VENUS)、図1参照) (1.7μg)、TUBB1遺伝子座を標的とするgRNAを発現するガイドベクター(1.7μg)、cas9 ベクター (pHL-EFla-SphcCas9-iC-A、京都大学iPS細胞研究所 堀田博士より受領)(1.7μg)と混和し、Human Stem Cell Nucleofector (登録商標) Kit 2 (Lonza) 及びNucleofectorを用いてエレクトロポレーションにより細胞にベクターを導入した。エレクトロポレーション後、StemFit (登録商標) AK03で懸濁し、ラミニン511をコーティングした10 cmディッシュに播種し、37℃ 5%CO2条件下で培養した。3日後、ピューロマイシンを1 ng/mlとなるように培地に添加し培養を継続した。7日後、形成したコロニーをピックアップし、得られた各コロニーからQIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) を用いてDNAを抽出し、プライマーを用いてGenotyping PCRにより相同組換えを確認した。ホモで相同組換えができたiPS細胞株を拡大培養し、MK iPS#l2-23として樹立した。
上記iPS細胞 (MK iPS #12-23 cre2)より、iPS-sacを介して造血前駆細胞 (HPC)の誘導を行った。詳細には、iPS細胞をセルスクレーパーを用いて培養皿から細胞を剥離させ、1/20程度の細胞を、コロニーの塊として、マイトマイシンC (MMC)処理したマウス線維芽細胞株C3H10Tl/2 (理研から入手可能)上へ播種した。なお、MMC処理したC3H10Tl/2は、iPS細胞を播種する前日に8 x 105 cells/dishで10 cmディッシュへ播種して用意した。播種後、20 ng/ml VEGFを添加したEagel's Basal Medium (EBM) 中で5%CO2、37℃環境下で培養を開始した (day0)。2回/1週間の頻度で同じ培地にて培地交換を行った。
上述の方法で得られたレポーター不死化巨核球細胞株(MKCL#12-23 cre2)を、0.75μM SR1 (Selleckchem) 、10 μM Y-27632 (wako)、50 ng/ml TPO (R&D) 及び50 ng/ml SCF (R&D)を含み、ドキシサイクリンを含まない分化培地中で7日間培養し、遺伝子の強制発現を解除して血小板産生を誘導した。細胞を懸濁後、培養上清より細胞を回収し、抗CD41抗体及び抗CD426抗体で染色しFACSにて解析した。同様に、誘導途中の細胞もFACS解析を行なった。その結果、培養7日目に、CD41及びCD42b両陽性の巨核球が誘導され(図2A)、当該巨核球から血小板が産生されていることを確認した(図2B)。
AhRアゴニストがCYP1B1の発現を誘導することから、CYP1B1の発現に基づき各種化合物のAhR阻害作用を調べた。ドキシサイクリンの存在下で不死化巨核球株 (MKCL SeV2) (2.5×105個)を培養後、ドキシサイクリンを含まない分化培地に、50 ng/mL TPO、50 ng/ml SCF、および10μM Y-27632を添加し、6ウェルプレートに播種した (2 ml/well)。この細胞に、試験化合物(表1)と、DMSOまたはAhRアゴニストであるFICZ(最終濃度100 nM)とを添加した。4日後、細胞を回収して溶解し、RNAの単離および定量的PCR解析のため-80℃で保存した。この試料からmiRNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いて全RNAを単離し、ReverTra Ace(登録商標)逆転写酵素 (TOYOBO)により逆転写し、ヒトCYP1B1およびGAPDHに対するプライマーを用いて、EagleTaq Master Mix with ROXおよびUniversal ProbeLibrary (Roche Applied Science)によりリアルタイムPCRを行った。PCR反応には、StepOne(登録商標) Plus リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems) を用いた。相対的遺伝子発現量を、GAPDHを参照遺伝子として2-ΔΔCt法により算出し、平均±SEで示した。その結果、各化合物はCYP1B1の発現を阻害し、AhRアンタゴニスト活性を有することが示された(図3)。
AhRアゴニストがCYP1A1の発現を誘導することから、CYP1A1プロモーターのAhRの結合領域(Dioxin Responsive Elements; DRE)の下流にFirefly Luciferase遺伝子を組み込んだヒト肝がん細胞株 (Huh7)を作製した(図4A参照)。更に、この細胞に、細胞毒性のモニター用にTymidine Kinaseの下流にRenilla Luciferase遺伝子を組み込んだ細胞(Transient→DRE dual-Luc Huh7 cell)を作製した(図4B参照)。この細胞を試験化合物(表2)と24時間プレインキュベートした後、アゴニストであるTCDD(最終濃度10-9 M)を添加して24時間インキュベートし、発現が上昇する2種類のLuciferaseの活性を発光測定によって数値化し、Luciferaseの酵素反応阻害率に対する濃度反応曲線に基づき、化合物のIC50値および95%信頼区間を統計解析ソフトSAS (release 8.1, SAS Institute Japan株式会社)の 4-Paramete Logistic Modelにより算出した。各化合物について、TCDDをアゴニストとして用いた場合のAhRに対する阻害作用を数値化した。その結果、試験した化合物がAhRアンタゴニスト活性を有することが示された(図5)。
上記レポーター不死化巨核球細胞株 (MKCL#12-23 cre2)のもととなったMKCL SeV2を6ウェルディッシュにて、所定の濃度の試験化合物(図6A〜Fおよび図7、図7の試験化合物の濃度を表3に示す)、10μM Y-27632 、50 ng/ml TPO及び50 ng/ml SCFを添加した分化培地中、又は0.75μM SRl、10μM Y-27632 、50 ng/ml TPO及び50 ng/ml SCFを添加した分化培地中(ポジティブコントロール)、又は0.1% DMSO、10μM Y-27632、50 ng/ml TPO及び50 ng/ml SCFを添加した分化培地中(ネガティブコントロール)で培養し、培養7日目に培養液を懸濁して上清を採取し、抗CD41抗体及び抗CD42b抗体で染色し、FACSにて解析した。各化合物を用いた場合の血小板数を、ポジティブコントールでの血小板数 (100%とする)及びネガティブコントロールでの血小板数 (0%とする)で補正して、相対血小板数を算出した。その結果、AhRアンタゴニスト活性を有する化合物が血小板産生促進効果を有することが示された(図6A〜F、図7)。
Claims (4)
- 受容体型チロシンキナーゼ阻害剤、バニロイド受容体阻害剤、PDGFR阻害剤、TrioN阻害剤、SIRT2阻害剤、H+,K+-ATPase阻害剤、ベンゾジアゼピン逆作動薬、および神経発生促進剤からなる群より選択される1又は複数のAhRアンタゴニストを含む、血小板産生促進剤。
- 受容体型チロシンキナーゼ阻害剤がアキシチニブおよびRG-14620である;
バニロイド受容体阻害剤がSB366791である;
PDGFR阻害剤がAG1296である;
TrioN阻害剤がITX3である;
SIRT2阻害剤がAGK2である;
H+,K+-ATPase阻害剤がSCH-28080である;
ベンゾジアゼピン逆作動薬がβ-CCBおよびFG7142である;および
神経発生促進剤がニューロダジンである;
請求項1に記載の血小板産生促進剤。 - ROCK阻害剤を更に含む、又はROCK阻害剤と併用される、請求項1または2に記載の血小板産生促進剤。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の血小板産生促進剤と巨核球細胞及び/又はその前駆細胞とを接触させることを含む、血小板の製造方法。
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