KR101836547B1 - 혈소판의 기능을 유지하기 위한 조성물 - Google Patents

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고쿠리츠다이가쿠호우진 도쿄다이가쿠
가켄 세이야쿠 가부시키가이샤
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Abstract

하기의 일반식(1):
[식 중, X는 페닐렌기; Y는 수소원자, 또는 -(CH2)m R1; m은 0~4 중 몇 개의 정수; R1은, -NR5COR2, -NR5SO2R2, 또는 -NR3R4; R2는 C1~C6 알킬기, 아릴기, 또는 C1~C6 알콕시기 등； R3 및 R4는, C1~C6 알킬기 등; R5는, 수소 원자, C1~C6 알킬기 등; Z는, 수소 원자 또는 C1~C6알킬기를 나타낸다.］로 표시되는 화합물, 또는 그의 염, 또는 이들의 용매화물을 유효성분으로 하는 혈소판의 기능을 유지하기 위한 조성물.

Description

혈소판의 기능을 유지하기 위한 조성물{Composition for maintaining platelet function}
본 발명은 N－히드록시포름아미드(N-hydroxyformamide) 유도체를 이용한 혈소판의 기능을 유지하기 위한 조성물, 혈소판을 조제하기 위한 방법, 혈소판을 함유한 혈액 제제 및 혈액제제에서 혈소판의 기능을 유지하기 위한 방법에 관한 것이다.
백혈병으로 대표되는 혈액 관련 질환의 치료에 대해, 치료에 필요한 양의 혈구 세포를 안정하게 증식시켜 공급하는 것은 지극히 중요한 것이기 때문에, 지금까지 많은 연구자에 의해, 조혈간 세포 또는 조혈 전구 세포를 효율적으로 증식시키려고 하는 시도가 있어 왔다.
혈구 세포 중에서 거핵구는 혈소판 전구세포, 즉 혈소판을 생산하기 위한 세포인 proplatelet(포체 돌기) 구조를 거쳐 혈소판을 생산하는 것으로 알려져 있으며, 치료적인 응용에 대해 중요한 위치에 있다. 혈소판은 혈액 응고(지혈)에 있어서 필수이기 때문에, 백혈병, 골수 이식, 항암치료 등에 있어서 수요가 극히 높다.
혈소판의 생산에 대해서는, 지금까지 도너로부터의 헌혈에 의해 채취하는 방법의 외에, 트롬보포이에틴(Thrombopoietin: TPO)을 투여하는 방법을 이용하거나, 제대혈 또는 골수 세포로부터 거핵구을 분화시키는 방법을 이용하는 등의 시도가 있어 왔다. 최근에는, 조혈 전구 세포를 생체 외에서 증식시키고, 이러한 전구 세포로부터 혈소판을 조제하는 방법 등도 시도되어 왔다. 예를 들면, 본 발명자들은 인간 배아줄기세포(ES 세포)로부터 조혈 전구 세포를 내포하는 네트형 구조물을 조제하고, 이 네트형 구조물로부터 비교적 대량이면서 효율적으로 혈소판의 생산을 실시하는 방법(특허 문헌 1)이나, 인공 유도만능줄기세포(iPS 세포)로부터 in vitro의 배양계에 의해 성숙 거핵세포 및 혈소판을 효율적으로 조제하는 방법(특허 문헌 2) 등을 보고한 바 있다.
이와 같이, 혈소판 자체를 세포 외에서 조제하는 방법의 연구는 진전하고 있지만 조제된 혈소판의 기능은 안정성이 부족한 것으로부터 장기 보존에 견딜만한기능적 혈소판을 대량으로 조제할 수 있는 방법의 개발이 필요하게 되었다.
혈소판과 세포 외 매트릭스와의 결합은, 혈액 응고(지혈, 혈전 형성 등)가 유도되는데 있어서 중요한 과정이다. 이 과정은, 혈소판 수용체 GPIb가,α서브유니트(GPIbα)을 통해서 폰·윌 브랜드 인자(ｖon　Willebrand　factor：VWF)와 결합하는 것에 의해, 개시된다고 생각되고 있다. 그렇지만, 37℃ 부근의 조건하에 대해서는 메탈로프로테아제의 ADAM17(a　disintegrin　and　metallopeptidase　domain　17)이 GPIbα의 세포외 영역을 쉐딩(Shedding, 절단하여 제거)하는 것에 의해 GPIbα와 VWF와의 회합이 저해되어 혈소판의 혈액 응고 기능이 사라져 버리는 것이보고된 바 있다(비특허 문헌 1및 비특허 문헌 2).
이 때문에 in vitro에 대해 조제한 혈소판의 기능을 보관 및 유지하기 위해서는, 적어도 ADAM17의 활성을 억제할 필요가 있는 것이 예상된다. 실제, 본 발명자들에 의해, 메탈로프로테아제 활성을 직접 저해하는 저해제(GM6001 등), 혹은, ADAM17등의 메탈로프로테아제 활성의 활성화를 간접적으로 저해하는 p38MAP 키나제 저해제를, 타이밍 좋게 첨가하는 것에 의해, in vitro에 대해 조제한 혈소판의 기능을 보관 및 유지할 수가 있는 것이 보고된 바 있다(특허 문헌 3).
그렇지만, GM6001등의 저해제는 ADAM17 뿐만 아니라, 다른 메탈로프로테아제 (특히 조혈기능에 필수적인 MMP9나 MMP14)의 활성도 저해시키기 때문에, 이들 저해제를 이용한 in vitro 에서의 혈소판의 조제에 대해서는, 이들 저해제를 혈소판 생산이 최대로 관찰되는 일정 시기에 첨가하는 것이 필요하였다. 일관성 및 재현성이 부족한 세포 배양에 대해 그 타이밍을 가늠한다고 한 번잡한 작업을 필요로 하기 때문에, 이들 저해제를 이용한 혈소판의 조제 방법은, 기능적 혈소판을 대량으로 조제한다고 하는 점, 특히 혈소판 생산계의 플랜트화에 대해서는, 아직도 충분한 것은 아니었다.
게다가 비선택적인 메탈로프로테아제 저해제는, 막형 및 유리형 메타로프로테아제나 ADAM 등, 모든 메탈로프로테아제 활성을 저해시키기 위하여, 생체 내부에서의 사용에 의해, 각종의 부작용(장기마다 작용하는 필수 MMP 혹은 ADAM를 저해하는 일에 의한 폐해)이 발휘되는 위험성이 생긴다고 생각되고 있다. 실제로, 비선택적인 메탈로프로테아제 저해제는, 근골격신드롬으로 불리는 심각한 부작용을 일으키기 때문에, 이러한 많은 저해제의 개발은 중지하기에 이르렀다(비특허 문헌 3). 또한, GM6001와 같은 히드로록삼산(hydroxamic acid) 구조를 가지는 저해제는, 변이원성을 가지는 것이 시사되고 있다(비특허 문헌 4). 따라서, 이러한 저해제를 이용한 방법에 따라 얻어진 혈소판은, 안전성이라고 하는 점에 대해도, 아직도 충분한 것은 아니었다.
한편, 현재로서는, 생체로부터 조제한 혈소판을 보존하는 방법으로는, 20℃내지 24℃에서 교반하여 보존하는 방법 이외에 유효한 방법이 존재하지 않는 것으로부터, 혈소판의 기능을 보관 유지하기 위해서 ADAM17의 메탈로프로테아제 활성을 억제하는 방법을 이용하는 경우도, 이러한 실온(20℃ 내지 24℃) 조건하에서 혈소판의 조제를 실시하는 것이 유효하다라고 생각할 수 있다. 그렇지만, 지금까지, 실온 조건하에서, 제대혈 또는 골수 세포로부터 거핵구로 분화시키는 것이 가능한지 어떤지, 또는, ES세포 등에서 유래하는 조혈 전구 세포로부터 혈소판을 생산하는 것이 가능한지 어떤지에 대해서는 아무런 검증이 이루어지지 않았다.
이상과 같이, 혈소판의 기능을 유지하기 위한 조성물의 유효 성분으로서 실용화가 가능한 화합물은 아직 발견되지 않았지만, 이 때문에, 기능적으로 안정된 혈소판을 in vitro 에서 취득하기 위한 방법, 특히 안전성이 높은 혈소판의 대량생산에도 적절한 방법이 확립되어 있지 않은 것이 현실이다.
특허문헌1: 국제공개 제2008/041370호 특허문헌2: 국제공개 제2009/122747호 특허문헌3: 국제공개 제2009/119105호
비특허 문헌1: Bergmeier 등, Circulation　Research, 2004년, 95권, 677 ~ 683 페이지. 비특허 문헌2: Bergmeier 등, Blood, 2003년, 102권, 4229 ~ 4235 페이지. 비특허 문헌3: Peterson 등, Cardioｖasc. Res. , 2006년, 69권, 677 ~ 687 페이지. 비특허 문헌4: Skipper 등, Cancer　Res. , 1980년, 40권, 4704 ~ 4708 페이지.
본 발명은 상기 종래 기술이 갖는 과제를 감안한 것으로 그 목적은 ADAM17의 메탈로프로테아제 활성을 특이적으로 억제하고, GPIbα의 쉐딩을 억제하는 것에 의해 혈소판의 기능을 유지하는 것이 가능한 화합물을 동정하기 위한 것이다.
추가로 본 발명의 목적은 동정한 화합물을 이용하여 혈소판의 기능을 유지하는 조성물을 제공하기 위한 것이고, 효율적으로 혈소판을 생산하는 것이며, 혈액 제제의 품질 유지의 향상을 도모하는데 있다.
본 발명자는 상기 목적을 달성하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과로, ES세포나 iPS 세포 등에서 유래하는 조혈 전구 세포로부터 거핵구로의 분화 유도나, 해당 거핵구로부터의 혈소판 생산이 25℃의 실온 조건에서 배양을 실시하지 않고, 37℃부근의 배양 조건이 바람직하다는 것을 발견하였다. 그 다음에 본 발명자들은 37℃부근의 배양에서 생기는 ADAM17에 의한 GPIbα의 쉐딩을 특이적으로 억제할 수 있는 화합물의 탐색을 실시하였다. 그 결과, 특정의 구조를 가지는 N－히드록시포름아미드 유도체가, ADAM17에 대해서 특이적인 저해 작용을 갖고, 혈소판을 생산하는 배양계나 사람 말초혈 유래의 혈소판에 첨가했을 경우, GPIbα의 쉐딩이 억제되어 37℃부근의 온도 조건하에서도 혈소판의 기능이 유지된다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 동정한 N－히드록시포름아미드 유도체의 이러한 작용으로부터, 해당 유도체가 효율적인 혈소판의 생산이나 혈소판을 함유한 혈액제제의 품질 유지의 향상 등에 있어 지극히 유용한 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 보다 상세하게는 이하의 발명을 제공하기 위한 것이다.
(1) 하기 일반식(1):
Figure 112013015062440-pct00001
[식 중, X는 페닐렌기;
Y는 수소원자, 또는 -(CH2)m R1;
m은 0~4중 몇 개의 정수;
R1은,
Figure 112013015062440-pct00002
R2는, 치환되어 있어도 좋은 C1~C6 알킬기, 치환되어 있어도 좋은 아릴기, 또는 C1~C6 알콕시기；
R3 및 R4는, 각각 독립적으로 수소 원자, C1~C6 알킬기, 혹은 R3와 R4가 인접하는 질소 원자와 함께 질소함유 복소환을 형성하고 있어도 좋다；
R5는, 수소 원자, C1~C6 알킬기, 또는 C1~C6 알킬술포닐기；
Z는, 수소 원자 또는 C1~C6 알킬기를 나타낸다.］
로 표시되는 화합물, 또는 그의 염, 또는 이들의 용매화물을 유효 성분으로 하는, 혈소판의 기능을 유지하기 위한 조성물.
(2) 상기 일반식(I)에서 표시되는 화합물은,
N－［2－(4－부토－2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(4－디에틸아미노메틸페닐) 에틸］－N－히드록시포름아미드, 또는
N－｛4－［2－(4－부토－2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노)에틸］벤질｝메탄술폰아미드,
인 (1)에 기재한 것의 조성물.
(3) 혈소판의 기능을 유지하기 위한 시약 또는 혈소판을 함유한 혈액제제에의 첨가제인 (1) 또는(2)에 기재한 것의 조성물.
(4) 거핵구로 분화되어지는 세포로부터 거핵구로의 분화를 유도하고, 해당 거핵구로부터 혈소판을 생산하는 배양계에, 하기의 일반식(I)：
Figure 112013015062440-pct00003
[식 중, X는 페닐렌기;
Y는 수소원자, 또는 -(CH2)m R1;
m은 0~4 중 몇 개의 정수;
R1은,
Figure 112013015062440-pct00004
R2는, 치환되어 있어도 좋은 C1~C6 알킬기, 치환되어 있어도 좋은 아릴기, 또는 C1~C6 알콕시기；
R3 및 R4는, 각각 독립적으로 수소 원자, C1~C6 알킬기, 혹은 R3와 R4가 인접하는 질소 원자와 함께 질소함유 복소환을 형성하고 있어도 좋다；
R5는, 수소 원자, C1~C6 알킬기, 또는 C1~C6 알킬술포닐기；
Z는, 수소 원자 또는 C1~C6알킬기를 나타낸다.］
로 표시되는 화합물, 또는 그의 염, 또는 이들의 용매화물을 첨가하는 것을 특징으로 하는 혈소판을 조제하는 방법.
(5) 상기 일반식(1)로 표시되는 화합물이,
N－［2－(4－부토－2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(4－디에틸아미노메틸페닐) 에틸］－N－히드록시포름아미드, 또는
N－｛4－［2－(4－부토－2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노)에틸］벤질｝메탄술폰아미드,
인 (4)에 기재한 것의 방법.
(6) 상기 배양계에서 배양 온도가 35 ~ 38℃인 것을 특징으로 하는 (4) 또는(5)에 기재한 것의 방법.
(7) 거핵구로 분화하여지는 세포로부터 거핵구로의 분화를 유도하여, 해당 거핵구로부터 혈소판을 생산하는 배양계에, 하기의 일반식(I)：
Figure 112013015062440-pct00005
[식 중, X는 페닐렌기;
Y는 수소원자, 또는 -(CH2)m R1;
m은 0~4 중 몇 개의 정수;
R1은,
Figure 112013015062440-pct00006
R2는, 치환되어 있어도 좋은 C1~C6 알킬기, 치환되어 있어도 좋은 아릴기, 또는 C1~C6 알콕시기；
R3 및 R4는, 각각 독립적으로 수소 원자, C1~C6 알킬기, 혹은 R3와 R4가 인접하는 질소 원자와 함께 질소함유 복소환을 형성하고 있어도 좋다；
R5는, 수소 원자, C1~C6 알킬기, 또는 C1~C6 알킬술포닐기；
Z는, 수소 원자 또는 C1~C6알킬기를 나타낸다.］
로 표시되는 화합물, 또는 그의 염, 또는 이들의 용매화물을 첨가한 배양물.
(8) 상기 일반식(1)로 표시되는 화합물이,
N－［2－(4－부토－2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(4－디에틸아미노메틸페닐) 에틸］－N－히드록시포름아미드, 또는
N－｛4－［2－(4－부토－2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노)에틸］벤질｝메탄술폰아미드,
인 (7)에 기재한 것의 배양물.
(9) 하기 일반식(1):
Figure 112013015062440-pct00007
[식 중, X는 페닐렌기;
Y는 수소원자, 또는 -(CH2)m R1;
m은 0~4 중 몇 개의 정수;
R1은,
Figure 112013015062440-pct00008
R2는, 치환되어 있어도 좋은 C1~C6 알킬기, 치환되어 있어도 좋은 아릴기, 또는 C1~C6 알콕시기；
R3 및 R4는, 각각 독립적으로 수소 원자, C1~C6 알킬기, 혹은 R3와 R4가 인접하는 질소 원자와 함께 질소함유 복소환을 형성하고 있어도 좋다；
R5는, 수소 원자, C1~C6 알킬기, 또는 C1~C6 알킬술포닐기；
Z는, 수소 원자 또는 C1~C6알킬기를 나타낸다.］
로 표시되는 화합물, 또는 그의 염, 또는 이들의 용매화물이 첨가된 혈소판을 함유하는 혈액제제.
(10) 상기 일반식(1)로 표시되는 화합물이,
N－［2－(4－부토－2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(4－디에틸아미노메틸페닐) 에틸］－N－히드록시포름아미드, 또는
N－｛4－［2－(4－부토－2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노)에틸］벤질｝메탄술폰아미드,
인 (9)에 기재한 것의 혈액제제.
(11) 하기의 일반식(1):
Figure 112013015062440-pct00009
[식 중, X는 페닐렌기;
Y는 수소원자, 또는 -(CH2)m R1;
m은 0~4 중 몇 개의 정수;
R1은,
Figure 112013015062440-pct00010
R2는, 치환되어 있어도 좋은 C1~C6 알킬기, 치환되어 있어도 좋은 아릴기, 또는 C1~C6 알콕시기；
R3 및 R4는, 각각 독립적으로 수소 원자, C1~C6 알킬기, 혹은 R3와 R4가 인접하는 질소 원자와 함께 질소함유 복소환을 형성하고 있어도 좋다；
R5는, 수소 원자, C1~C6 알킬기, 또는 C1~C6 알킬술포닐기；
Z는, 수소 원자 또는 C1~C6알킬기를 나타낸다.］
로 표시되는 화합물, 또는 그의 염, 또는 이들의 용매화물을 혈소판을 함유하는 혈액제제에 첨가하는 것을 특징으로 하는, 혈액제제에서 혈소판의 기능을 유지하기 위한 방법.
(12) 상기 일반식(1)로 표시되는 화합물이,
N－［2－(4－부토－2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(4－디에틸아미노메틸페닐) 에틸］－N－히드록시포름아미드, 또는
N－｛4－［2－(4－부토－2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노)에틸］벤질｝메탄술폰아미드,
인 (9)에 기재한 것의 방법.
본 발명에서 발견한 N－히드록시포름아미드 유도체에 의하면, ADAM17의 메탈로프로테아제 활성을 특이적으로 억제하고, GPIbα의 쉐딩을 억제하는 것에 의해, 37℃부근의 온도 조건하에서도 혈소판의 기능을 유지하는 것이 가능하다. 따라서, 해당 유도체에 의하면, in vitro에 대해, 기능적으로 안정한 혈소판을 대량으로 생산하는 것이 가능하고, 또, 혈소판을 함유한 혈액제제의 품질 안정화를 도모할 수 있다.

도 1은 실온 조건하에서의 ES 세포 등 유래의 조혈 전구 세포로부터 거핵구/혈소판으로의 유도 방법을 나타내는 개략도이다.
도 2는 실온 조건하에서의 배양에 있어서 ES 세포 유래의 조혈 전구 세포로부터 생산된 거핵구 수를 나타내는 그래프이다. 세로축의 단위는, 세포수/well이다.
도 3은 실온 조건하에서의 배양에 있어서 ES세포 유래의 조혈 전구 세포로부터 생산된 혈소판의 총수를 나타내는 그래프이다. 세로축의 단위는 세포수/well이다.
도 4는 실온 조건하에서의 배양에 있어서 제대혈 유래의 CD34(＋) 세포로부터 생산된 거핵구수를 나타내는 그래프이다. 세로축의 단위는 세포수/well 이다.
도 5는　실온 조건하에서의 배양에 있어서 제대혈 유래의 CD34(＋) 세포로부터 생산된 혈소판의 총수를 나타내는 그래프이다. 세로축의 단위는 세포수/well 이다.
도 6은 ＜프로토콜 1＞은, ES 세포 또는 iPS 세포 유래의 조혈 전구 세포로부터 거핵구/혈소판으로의 유도하는 과정에 있어서 본 발명에 따른 화합물 (S－45282 또는 S－45457) 등을 첨가한 시기를 나타낸다. ＜프로토콜 2＞는, 사람의 말초혈로부터 세정 혈소판을 조제하고 본 발명에 의한 화합물(S－45282 또는 S－45457) 등을 첨가한 것을 나타낸다.
도 7은　GM6001 또는 S－45282를 2일간 배양계에 첨가했을 때(2 days)의 각 화합물의 ES 세포 유래 혈소판에 대한 기능 유지 효과에 대해 검증한 결과를 나타내는 그래프이다. 세로축은 혈소판 총수(CD41(＋))를 100으로 했을 때의 CD42b(GPIbα)(＋) 및 CD42b(GPIbα)(－)의 비율(%)을 나타낸다.
도 8은　GM6001 또는 S－45282를 2일간 배양계에 첨가했을 때 (2 days)에 얻어진 ES세포 유래 혈소판의 총수를 나타내는 그래프이다. 세로축의 단위는 세포수/well이다.
도 9는　GM6001 또는 S－45282를 8일간 배양계에 첨가했을 때(8 days)의 각 화합물의 ES 세포 유래 혈소판에 대한 기능 유지 효과에 대해 검증한 결과를 나타내는 그래프이다. 세로축은 혈소판 총수(CD41(＋))를 100으로 했을 때의 CD42b(GPIbα)(＋) 및 CD42b(GPIbα)(－)의 비율(%)을 나타낸다.
도 10은　GM6001 또는 S－45282를 8일간 배양계에 첨가했을 때(8 days)에 얻어진 ES세포 유래 혈소판의 총수를 나타내는 그래프이다. 세로축의 단위는 세포수/well이다.
도 11은　GM6001, S－45282, 또는 S－45457을 8일간 배양계에 첨가했을 때에 얻어진 ES 세포 유래 혈소판수(CD41(＋) CD42b(＋) 및 CD41(＋) CD42b(－)의 수)를 나타내는 그래프이다. 세로축의 단위는, 세포수/well이다.
도 12는 GM6001, S－45282, 또는 S－45457을 8일간 배양계에 첨가했을 때의 각 화합물의 ES 세포 유래 혈소판에 대한 기능 유지 효과에 대해 검증한 결과를 나타내는 그래프이다. 세로축은 혈소판 총수(CD41(＋))를 100으로 했을 때의 CD42b(GPIbα)(＋)의 비율(%)을 나타낸다.
도 13은　GM6001, 또는 S－45457을 8일간 배양계에 첨가했을 때에 얻어진 ES세포 유래 혈소판의 총수를 나타내는 그래프이다. 세로축의 단위는, 세포수/well이다. 값은 평균치＋표준오차(n=4)이다.
도 14는　S－45457의 농도 의존적인 ES 세포 유래 혈소판에 대한 기능 유지 효과를 나타내는 그래프이다. 세로축은 혈소판 총수를 100으로 했을 때의 CD42b(GPIbα)(＋)의 비율(%)을 나타낸다. 값은 평균치＋표준오차(n = 4)이다. ＃(샵)은 p＜0. 1을 나타낸다.
도 15는　GM6001, 또는 S－45457을 8일간 배양계에 첨가했을 때에 얻어진 iPS 세포 유래 혈소판의 총수를 나타내는 그래프이다. 세로축의 단위는, 세포수/well이다. 값은 평균치＋표준오차(n = 4)이다.
도 16은　S－45457의 농도 의존적인 iPS 세포 유래 혈소판에 대한 기능 유지 효과를 나타내는 그래프이다. 세로축은 혈소판 총수를 100으로 했을 때의 CD42b(GPIbα)(＋)의 비율(%)을 나타낸다. *(아스터리스크(asterisk)), **(ㅇk아t앗m아스터리스크(asterisk) 2개)는, 각각 p＜0.05, p＜0.01을 나타낸다.
도 17은 S－45457의 농도 의존적인 말초혈 유래 혈소판에 대한 기능 유지 효과를 나타내는 그래프이다. 세로축은 혈소판 총수를 1.00으로 했을 때의 CD41(＋) CD42b(GPIbα)(＋)의 비율(%)을 나타낸다. 값은, 평균치＋표준오차(n = 4)이다. **(아스터리스크 2개)는, p＜0. 01을 나타낸다.
도 18은 S－45457또는 p38 저해제의 말초혈 유래 혈소판에 대한 기능 유지 효과를 나타내는 닷 플롯도이다.
도 19는 GM6001, S－45457, 또는 p38 저해제의 말초혈 유래 혈소판에 대한 기능 유지 효과를 나타내는 그래프이다. 세로축은 혈소판 총수를 1.0으로 했을 때의 CD41(＋) CD42b(GPIbα)(＋)의 비율(%)을 나타낸다. 값은 평균치＋표준오차(n = 4)이다.
도 20은　GM6001, S－45457, 또는 p38 저해제를 8일간 배양계에 첨가했을 때에 얻어진 ES 세포 유래 혈소판의 총수를 나타내는 그래프이다. 세로축의 단위는 세포수/well이다.
도 21은　GM6001, S－45457, 또는 p38 저해제를 8일간 배양계에 첨가했을 때의 각 화합물의 ES 세포 유래 혈소판에 대한 기능 유지 효과에 대해 검증한 결과를 나타내는 그래프이다. 세로축은 혈소판 총수를 100으로 했을 때의, CD42b(GPIbα)(＋)의 비율(%)을 나타낸다.
도 22는 GM6001, S－45457, 또는 S－45282의 말초혈 유래 혈소판에 대한 기능 유지 효과에 대해 검증한 결과를 나타내는 그래프이다. 세로축은 혈소판 총수를 100으로 했을 때의 CD42b(GPIbα)(＋)의 비율(%)을 나타낸다.
도 23은　GM6001, S－45457, S－45282, 또는 p38 저해제의 말초혈 유래 PRP에 대한 기능 유지 효과에 대해 검증한 결과를 나타내는 그래프이다. 세로축은 혈소판 총수(CD41(＋))를 100으로 했을 때의, CD41(＋) CD42b(＋) 및 CD41(＋) CD42b(－)의 비율(%)을 나타낸다.
도 24는 GM6001, S－45457, S－45282, 또는 p38 저해제의 말초혈 유래 혈소판에 대한 기능 유지 효과를 나타내는 닷 플롯도이다.
도 25는 S－45457의 농도 의존적인 말초혈 유래 혈소판에 대한 기능 유지 효과를 나타내는 닷 플롯도이다.
도 26은 S－45457을 첨가하여 조제한 혈소판의 접착능을 경시적으로 평가한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 27은　S－45457을 첨가하여 조제한 혈소판의 접착능을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 28은　레이저 조사 시 (0초) 및 그의 20초 후에 S－45457을 첨가하여 조제한 혈소판을 주입한 생쥐에 있어서의 혈전 형성을 나타내는 현미경 사진이다.
도 29는 S－45457을 첨가해 조제한 혈소판의 혈전 형성에의 기여를 나타내는 그래프이다. 세로축은 각 샘플을 수혈한 생쥐의 장 사이의 막의 모세 혈관에서 유발한 폐색성 혈전을 관찰하고, 혈전 형성에 관여한 혈소판의 총수(생쥐＋사람)에서 차지하는 사람 혈소판의 수의 비율(%)이다. 값은 20 혈관의 관찰로 얻어진 비율의 평균치＋표준오차이다.
본 발명의 조성물은
하기의 일반식(1):
Figure 112013015062440-pct00011
[식 중, X는 페닐렌기;
Y는 수소원자, 또는 -(CH2)m R1;
m은 0~4중 몇 개의 정수;
R1은,
Figure 112013015062440-pct00012
R2는, 치환되어 있어도 좋은 C1~C6 알킬기, 치환되어 있어도 좋은 아릴기, 또는 C1~C6 알콕시기；
R3 및 R4는, 각각 독립적으로 수소 원자, C1~C6 알킬기, 혹은 R3와 R4가 인접하는 질소 원자와 함께 질소함유 복소환을 형성하고 있어도 좋다；
R5는, 수소 원자, C1~C6 알킬기, 또는 C1~C6 알킬술포닐기；
Z는, 수소 원자 또는 C1~C6 알킬기를 나타낸다.］
로 표시되는 화합물, 또는 그의 염, 또는 이들의 용매화물을 유효 성분으로 하는, 혈소판의 기능을 유지하기 위한 조성물이다.
상기 일반식(I)로 표시되는 화합물에서 「C1~C6」, 「C6~C14」는, 각각, 탄소수가 1~6, 6~14의 범위 내에 있는 것을 의미한다.
R2, R3, R4, R5 및 Z에서 「치환되어 있어도 좋은 C1~C6알킬기」의 「C1~C6알킬기」로는 직쇄 또는 분지상의 C1~C6 알킬기를 의미하고, 구체적인 예로서는, 메틸기, 에틸기, n－프로필기, 이소프로필기, n－부틸기, 이소부틸기, tert－부틸기, sec－부틸기, n－펜틸기, tert－아밀기, 3－메틸부틸기, 네오펜틸기, n－헥실기등을 들 수 있다.
상기, 「치환되어 있어도 좋은 C1~C6알킬기」에서 치환기는 수산기, 할로겐 원자, 시아노기, 니트로기, C1~C6 알콕시기, 카르복실기, C1~C6 알콕시카르보닐기 등을 들 수 있다. 이것들은, 모든 가능한 위치에서 한 개 이상 치환할 수 있다. 복수개 치환하는 경우에 그러한 치환기는 동일하거나 상이하여도 좋고, 동일한 탄소 원자에 치환하고 있어도 좋고 다른 탄소 원자에 치환하고 있어도 좋다.
「할로겐 원자」란, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자를 의미한다.
「C1~C6 알콕시기」로는 알킬 부분이, 상기 「C1~C6 알킬기」와 같은 의미의 알콕시기를 의미하며, 예를 들어, 메톡시기, 에톡시기, n－프로폭시기, 이소프로폭시기, n－부톡시기, 이소부톡시기, tert－부톡시기, sec－부톡시기, n－펜틸옥시기, tert－아밀옥시기, 3－메틸부톡시기, 네오펜틸옥시기, n－헥실옥시기 등의 직쇄 또는 분지상의 알콕시기를 들 수 있다.
「C1~C6 알콕시카르보닐기」로는 옥시카르보닐 부분을 제외한 알킬 부분이 직쇄 또는 분지상의 C1~C6 알킬기인 것을 의미하며, 예를 들어, 메톡시카르보닐기, 에톡시카르보닐기, n－프로폭시카르보닐기, 이소프로폭시카르보닐기, n－부톡시카르보닐기, 이소부톡시카르보닐기, tert－부톡시카르보닐기, sec－부톡시카르보닐기, n－펜틸옥시카르보닐기, tert－아밀옥시카르보닐기, 3－메틸부톡시카르보닐기, 네오펜틸옥시카르보닐기, n－헥실옥시카르보닐기등을 들 수 있다.
R3 및 R4가 인접하는 질소 원자와 함께 형성하는 「질소함유 복소환」으로는, 예를 들면, 환구성 원자로서 탄소 원자 이외에 적어도 1개의 질소 원자를 함ㅇ유하며, 더욱이 산소 원자, 유황 원자 및 질소 원자로부터 선택되는 헤테로 원자를 1 또는 2개 포함하고 있어도 좋고 5 ~ 7원의 질소함유 복소환을 들 수 있다. 해당 질소함유 복소환의 가장 적합한 예로는, 피페리진환, 피페라진환, 몰포린환, 티오몰포린환, 피로리진환, 이미다조리진환등을 들 수 있다.
R2에 있어서 「치환되어 있어도 좋은 아릴기」의 「아릴기」는 방향족 탄소환을 나타내는 C6~C14의 방향족 탄소환이 바람직하고, 예를 들어, 페닐기, 나프틸기등을 들 수 있다.
상기, 「치환되어 있어도 좋은 아릴기」에서 방향환 상의 치환기는, 수산기, 할로겐 원자, 시아노기, 니트로기, 트리플로오로메틸기, 치환되어 있어도 좋은 C1~C6 알킬기, C1~C6 알콕시기, 카르복실기, C1~C6 알콕시카르보닐기 등을 들 수 있다. 이것들은, 모든 가능한 위치에서 한 개 이상 치환할 수 있다. 복수개 치환하는 경우는, 그러한 치환기는 동일해도 상이하여도 좋고, 동일한 탄소 원자에 치환하고 있어도 좋으며 다른 탄소 원자에 치환하고 있어도 좋다. 여기서, 「할로겐 원자」, 「치환되어 있어도 좋은 C1~C6 알킬기」, 「C1~C6 알콕시기」 및 「C1~C6 알콕시카르보닐기」는 상기와 같은 의미를 나타낸다.
R5에 있어서 「C1~C6 알킬술포닐기」는, 알킬 부분이, 상기 「C1~C6 알킬기」와 같은 의미인 알킬술포닐기를 의미하며, 예를 들어, 메탄술포닐기, 에탄술포닐기 등을 들 수 있다.
일반식(I)에서 표시되는 화합물에서, 비대칭 탄소가 존재하는 경우에는, 그 라세미체, 입체 이성체 및 개개의 광학 활성체 모두 본 발명에 포함되는 것이며, 또 기하 이성체가 존재하는 경우에는 (E)체, (Z)체 및 그 혼합물의 모두 본 발명에 포함되는 것이다.
일반식(I)로 표시되는 화합물의 염으로는 약리학적으로 허용되는 염이면 특별히 제한하지 않으며, 예를 들어, 무기 염기와의 염, 유기 염기와의 염, 유기산과의 염, 무기산과의 염 및 아미노산과의 염 등을 들 수 있다. 무기 염기와의 염의 예로는, 리튬염, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리 금속염 및 알칼리 토류 금속 염 등을 들 수 있다. 유기 염기와의 염의 예로는, 트리에틸아민염, 피리딘염, 에탄올아민염, 시클로헥실아민염, 디시클로헥실아민염, 디벤질에탄올아민 염 등을 들 수 있다. 유기산과의 염의 예로는, 포름산염, 초산염, 주석산염, 말레인산염, 호박산염, 젖산염, 말산염, 아스코르빈산염, 옥살산염, 글리콜산염, 페닐초산염, 메탄술폰산염 등을 들 수 있다. 무기산과의 염의 예로는, 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 술파민산염, 질산염 등을 들 수 있다. 또, 아미노산과의 염의 예로서는, 글리신염, 알라닌염, 아르기닌염, 글루타민산염, 아스파라긴산 염 등을 들 수 있다.
일반식(I)에서 표시되는 화합물은 프로드러그(prodrug)의 형태를 취할 수 있다. 프로드러그의 예로서는, 일반식(I)의 화합물의 카르복실기의 메틸에스테르, 에틸에스테르, 아미노알킬에스테르 유도체, 일반식(I)의 화합물의 수산기 및 아민 관능기의 아세테이트, 포름산염(formate), 및 벤조에이트 유도체 등을 들 수 있지만, 이것들로 한정되지 않는다.
상기 일반식(I)에서 표시되는 화합물은, 여러 가지의 방법으로 제조할 수 있지만, 이하에서 나타내는 제조 방법에 의해, 효율적으로 제조할 수 있다. 또한 이하의 제조 방법에서 사용되는 「보호기」의 구체적인 예로서는, tert－부틸기, 벤질기, o－메틸 벤질기, p－니트로 벤질기, p－메톡시 벤질기, o－클로로 벤질기, 2, 4－디클로로 벤질기, p－브로모 벤질기, 알릴기, tert－부톡시카르보닐기, 벤질옥시카르보닐기, o－메티벤질옥시카르보닐기, p－니트로벤질옥시카르보닐기, p－메톡시벤질옥시카르보닐기, o－크로로벤질옥시카르보닐기, 2, 4－디클로로벤질옥시카르보닐기, p－브로모벤질옥시카르보닐기, 아릴옥시카르보닐기, tert－부틸 디메틸 실릴기, tert－부틸 디페닐 실릴기, 트리에틸실릴기, 트리메틸실릴기, 트리이소프로필실릴기, 메톡시 메틸기, 테트라히드로피라닐기, 카르보닐의 보호기(예를 들면, 에탄 디올, 프로판디올, 메르캅토 에탄올, 메르캅토 프로파놀, 에탄디티올, 프로판디티올 등에 의한 보호기) 등을 들 수 있다.
상기 일반식(1)로 표시되는 화합물은 예를 들면 하기의 공정 1 ~ 공정 2의 반응에 의해 제조할 수 있다.
Figure 112013015062440-pct00013
(식 중, X,Y 및 Z는 상기와 동일하다.)
<공정 1>
공정 1에 대해서는, 히드록실 아민 또는 그 염을 화합물(II)에 부가하여 일반식(III)으로 표시되는 화합물을 제조한다. 이 부가 반응에서는, 히드록실 아민이 염(염산염이나 초산염 등)의 경우, 탄산칼륨, 탄산나트륨, 탄산수소나트륨, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 리튬 등의 무기 염기의 존재하에 행해진다. 반응 용매로서는, 반응을 현저하게 저해하지 않는 용매이면 특별히 한정되지 않지만, 물, 테트라 히드로 퓨란, 시클로 펜틸 메틸 에테르, 아세토니트릴, 1, 4－디옥산, 디에틸 에테르 또는 이들의 혼합 용매 등이 바람직하다.
반응 온도는 특별히 한정하는 것은 아니지만, 통상, 0 ~ 100℃에서 수행하며, 반응 시간은, 2시간 내지 1주간이 바람직하다.
＜공정 2＞
공정 2에 대해서는, 공정 1에서 얻어진 화합물(III)을, 일반식(IV)로 표시되는 중간체와 축합하여 일반식(I)로 표시되는 화합물을 제조한다. 중간체(IV)는, 포름산의 혼합 산무수물(포름산과 초산의 혼합 산무수물 등), 포름산펜타플루오로 페닐 또는 포르만과 카르복시이미드(디시클로헥실카르복시이미드, 디이소프로필카르복시이미드 또는 수용성 카르복시이미드)로부터 얻을 수 있는 활성 중간체이다. 반응을 원활하게 수행하기 위해서, 트리에틸아민, 디이소프로필 에틸아민, 피리딘, 루티딘(lutidine), 콜리딘(collidine), 디메틸 아미노 피리딘 등의 유기 염기를 공존시켜도 좋다. 이러한 경우의 몇개(특히 카르복시이미드로부터 활성 중간체를 얻는 경우)는 1－히드록시벤조트리아졸 및/또는 4－디메틸 아미노 피리딘을 첨가하는 것에 의해 반응이 촉진된다. 반응 용매로는, 반응을 현저하게 저해하지 않는 용매이면 특별히 한정하지 않지만, 클로로포름, 염화 메틸렌, 테트라 히드로 퓨란, 아세토니트릴, 시클로 펜틸 메틸 에테르, 1, 4－디옥산, 디메틸 포름 아미드, 디메틸술폭사이드, 피리딘 등이 바람직하다. 반응 온도는 특별히 한정하는 것은 아니지만, 통상, 0 ~ 100℃으로 수행하고 반응 시간은 1 ~ 24시간이 바람직하다. 또한, 본 공정에 있어서, 원료의 화학적 성질에 의해, 히드록실 아미노기의 수산기에도 CHO기가 부가되는 경우가 있지만, 이것은, 산성, 알칼리성 또는 중성 조건하에서 저급 알코올로 처리함으로써 목적물인 화합물(I)로 변환될 수 있다. 저급 알코올로서는, 메탄올, 에탄올, 프로판올 등이 바람직하다. 보조 용매를 사용해도 좋은데 이 경우 사용하는 보조 용매는 특별히 한정하지는 않는다.
X, Y, 및 Z의 성질에 따라서는, 상기 공정 1 ~ 공정 2의 반응에서 사전에 보호기를 사용하는 것과 사후에 보호기 제거를 수행할 필요가 있다는 것은 두 말할 필요가 없다. 보호되지 않은 경우, 다음 공정 혹은 그 다음 공정의 수율이 저하되거나 중간체의 취급이 곤란한 경우가 있다.
상기 화합물(II)는 이하에서 표시한 바와 같이 공정 3 ~ 공정 5에 의해 제조할 수가 있다.
Figure 112013015062440-pct00014
(식 중, X, Y, 및 Z는 상기와 동일하며, E는, C1 ~ C6 알콕시기, 할로겐 원자, N,O－디메틸히드록시 아미노기 등의 이탈성 관능기；M1는, Li, CeCl2, NaBH3, LiBH3, LiBEt3, KBEt3, LiB［CH(CH3) C2H5]3, KB[CH(CH3) C2H5]3, Al [CH(CH3) C2H5]2 등을 나타낸다. Et는 에틸기를 나타낸다. ).
＜공정 3＞
공정 3에 대해서는, 일반식(V)로 표시되는 화합물을 염기에 의해 음이온으로 한 후, 일반식(VI)으로 표시되는 화합물과 반응시켜 화합물(VII)을 제조한다. 사용하는 염기로서는, 리튬디이소프로필아미드, 리튬(비스트리메틸실릴)아미드, 리튬테트라메틸피페라지드, 나트륨(비스트리메틸실릴)아미드, 칼륨(비스트리메틸실릴)아미드, n－부틸리튬, sec－부틸리튬, tert－부틸리튬등을 들 수 있다. 이러한 염기는, 단독으로 사용하거나, 또는 경우에 따라서 2개 이상을 조합하여 사용한다. 반응 용매로서는, 반응을 현저하게 저해하지 않는 용매이면 특별히 한정하지 않지만, 테트라히드로퓨란, 시클로펜틸메틸에테르, 테트라히드로피란(Tetrahydropyran), 디에틸에테르, tert－부틸메틸에테르 또는 이들의 혼합 용매 등이 바람직하다.
반응 온도는, 통상 -100 ~ 40℃으로 수행하며 반응 시간은, 1 ~ 12시간이 바람직하다. 또한 이 공정에 대해서는, 화합물(VI)의 화학적 성질에 의해 화합물(II)을 얻을 수 있는 경우가 있지만, 본 제조 목적을 참작하면 문제가 되지 않는다.
＜공정 4＞
공정 4에 대해서는, 공정 3에서 얻어진 화합물(VII)을 일반식(VIII)로 표시되는 화합물과 반응시켜서 일반식(IX)로 표시되는 화합물을 제조한다. 반응 용매로는, 화합물(VIII)이 수소화붕소나트륨 또는 수소화붕소리튬의 경우에는, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 테트라히드로퓨란, 시클로펜틸메틸에테르, 디클로로메탄, 클로로포름 또는 이들의 혼합 용매등이 바람직하고, 화합물(VIII)이 상기 2종 이외의 경우는, 테트라히드로퓨란, 시클로펜틸메틸에테르, 테트라히드로피란, 디에틸 에테르, tert－부틸메틸에테르 또는 이들의 혼합 용매등이 바람직하다. 반응 온도는, 통상 -100 ~ 30℃에서 수행하며 반응 시간은, 1 ~ 12시간이 바람직하다.
또한, 공정 4의 반응 중 혹은 반응 후에, 생성된 화합물(IX)의 수산기가 자연 이탈하여 일부 혹은 전부가 화합물(II)로 되는 경우가 있다. 일부의 경우, 이들을 분리하는 일 없이 공정 5를 수행할 수가 있으며, 전부의 경우, 공정 5를 생략 할 수가 있다.
＜공정 5＞
공정 5에 대해서는, 공정 4에서 얻어진 화합물(IX)을 탈수 반응에 의해 화합물(II)을 제조한다. 탈수 반응은, 수산기를 활성화하는 시약과 유기 염기의 조합에 의해 수행되며, 수산기를 활성화하는 시약으로는, 염화메탄술포닐, 염화 p－톨루엔술포닐, 염화벤젠술포닐, 염화메탄술포닐, 염화티오닐, 염화술푸릴(sulfuryl chloride), 오염화인 등을 들 수 있다. 유기 염기로서는, 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, 디아자비시클로운데센(diazabicycloundecene), 디아자비시클로노넨(diazabicyclononene), 피리딘, 디메틸아미노피리딘, 루티딘(Lutidine), 코리딘(Collidine) 등을 들 수 있다. 매우 적합한 조합으로서, 염화메탄술포닐과 트리에틸아민을 들 수 있다. 또, 다른 탈수 시약으로서 트리페닐포스핀-디에틸아조디카르복실레이트(diethyl azodicarboxylate), 트리페닐포스핀-디이소프로필아조디카르복실레이트(Diisopropyl azodicarboxylate), 트리 n-부틸포스핀-디에틸아조카르복실레이트, 트리 n-부틸포스핀-디이소프로필아조카르복실레이트 등을 들 수 있다. 반응 용매로서는, 반응을 현저하게 저해하지 않는 용매이면 특별히 한정하지 않지만, 클로로포름, 염화메틸렌, 테트라히드로퓨란, 시클로펜틸메틸에테르, 아세토니트릴, 1,4－디옥산, 디메틸폼아미드 등이 바람직하다. 반응 온도는 특별히 한정하는 것은 아니지만 통상, 0 ~ 100℃에서 수행하며, 반응 시간은, 1~24시간이 바람직하다.
X, Y, 및 Z의 성질에 따라서는, 상기 공정 3~공정 5의 반응에 대해 사전에 보호기 등을 사용하는 것 및 사후에 보호기 등의 제거를 수행하는 것이 필요하다 것은 말할 필요도 없다.
상기 화합물(V)은, 이하에 나타낸 바와 같이 공정 6에 의해 제조할 수가 있다.
Figure 112013015062440-pct00015
(식 중, Z는 상기와 동일하며, J1는 할로겐 원자, 메탄술포닐옥시기, p－톨루엔술포닐옥시기, 벤젠술포닐옥시기, 트리플루오로메탄술포닐옥시기 또는 수산기를 나타낸다.).
＜공정 6＞
공정 6에 대해서는, 일반식(X)로 표시되는 화합물 또는 그의 염과 일반식(XI)로 표시되는 화합물을 무기 염기의 존재하에서 축합시켜, 화합물(V)을 제조한다. 적합한 무기 염기로는, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화리튬, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 탄산세슘, 수산화칼슘 등을 들 수 있다. 다만, J1이 수산기일 경우에는 일반식(X)로 표시되는 화합물 또는 그의 염의 수산기를 시약에 의해 활성화하고, 일반식(XI)로 표시되는 화합물을 축합시켜서 화합물(V)을 제조한다. 수산기의 활성화에 적합한 시약으로는 아조디카르본산디에틸(DEAD)－트리페닐포스핀, 아조디카르본산디이소프로필-트리페닐포스핀, 시아노메틸렌트리부틸포스포란, 시아노메틸렌트리메틸포스포란, 부틸리튬-클로로디페닐포스핀 등을 들 수 있다. 또한, 부틸리튬-클로로디페닐포스핀으로 활성화하는 경우에는 2,6－디메틸-1,4－벤조퀴논, 테트라 플루오로-1,4－벤조퀴논 등의 퀴논류를 첨가한다.
반응 용매로는, 반응을 현저하게 저해하지 않는 용매라면 특별히 한정하지 않지만, 물, 메탄올, 에탄올, tert－부탄올, 테트라히드로퓨란, 시클로펜틸메틸에테르, 아세토니트릴, 디에틸에테르, 디메틸에테르, 디클로로메탄, 1,4－디옥산, 2－메톡시에탄올, N,N－디메틸포름아미드 또는 이들의 혼합 용매 등이 바람직하다. 반응 온도는 특별히 한정하지 않지만, 통상,－80 ~ 120℃에서 수행하며, 반응 시간은, 1 ~ 24시간이 바람직하다.
또한, 상기 화합물(II)은, 이하에 나타내는 바와 같이 공정 7 ~ 공정 11에 의해도 제조될 수가 있다.
Figure 112013015062440-pct00016
(식 중, X, Y, Z, E, M1 및 J1은 상기와 동일하며, P1는 수산기의 보호기를 나타낸다.).
＜공정 7＞
공정 7에 대해서는, 공정 3과 같이 일반식(XII)로 표시되는 화합물을 염기에 의해 음이온으로 한 후, 화합물(VI)과 반응시켜 화합물(XIII)을 제조한다.
＜공정 8＞
공정 8에 대해서는, 공정 4와 같이 일반식(XIII)로 표시되는 화합물을 일반식(VIII)로 표시되는 화합물과 반응시켜 화합물(XIV)을 제조한다.
X 및 Y의 성질에 따라서는, 상기 공정 7 ~ 공정 8의 반응에 대해 사전에 보호기 등을 사용하는 것과 사후에 보호기 등의 제거를 실시하는 것이 필요하다는 것은 말할 필요도 없다.
＜공정 9＞
공정 9에 대해서는, 공정 5와 같이 화합물(XIV)을 탈수 반응시켜서 화합물(XV)을 제조한다.
또한, 공정 9에 대해 보호기 P1가 자연 이탈하여 일부 혹은 전부가 화합물(XVI)이 되는 경우가 있다. 일부의 경우, 그것들을 분리하는 일 없이 공정 10을 수행할 수가 있으며, 전부의 경우, 공정 10을 생략할 수가 있다.
＜공정 10＞
공정 10에 대해서는, 일반식(XV)로 표시되는 화합물에 사용되고 있는 보호기P1의 종류에 맞추어, 공지의 방법에 의해 탈보호를 실시하여 일반식(XVI)로 표시되는 화합물을 제조한다.
＜공정 11＞
공정 11에 대해서는, 공정 6과 같이 화합물(XVI)과 일반식(X)로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 축합시켜, 화합물(II)을 제조한다.
전술한 방법으로 제조되는 본 발명의 N－히드록시포름아미드 유도체는 유리 화합물, 그의 염, 그의 수화물 또는 에탄올화물 등의 각종 용매화물 또는 여러 형태의 결정 물질로 단리정제된다. 일반식(I)의 화합물의 약리학적으로 허용되는 염은 통상적인 염 제조반응에 의해 제조할 수가 있다. 단리정제는 추출 분별, 결정화, 각종 분획 크로마토그래피 등의 화학적인 조작을 적용하여 수행할 수 있다. 또한, 광학 이성체는 적당한 원료 화합물을 선택하는 것에 의해 또는 라세미 화합물의 광학 분할에 의해 입체화학적으로 순수한 이성체로서 얻을 수 있다.
본 발명의 조성물은, 상기 화합물, 혹은 그의 염, 또는 이들의 용매화물(이하, 「상기 일반식(I)로 표시되는 화합물 등」이라 칭한다)을 유효 성분으로 하는, 혈소판의 기능을 유지하기 위한 조성물이다. 본 발명에서 「혈소판의 기능을 유지한다」란, 주로, 혈소판의 지혈이나 혈전 형성이라고 하는 혈액 응고에 관한 기능을 유지하는 것을 의미한다. 해당 기능은, 본 발명의 조성물에 의해, ADAM17에 의한 GPIbα의 쉐딩(Shedding, 절단하여 제거함)을 억제시킴으로써 달성할 수가 있다.
「혈소판의 기능 유지」는, 예를 들면, 국제 공개 제2009/119105호나 후술하는 시험예 15에 기재한 바와 같이 플로우 챔버 시스템을 이용하여 혈소판의 VWF에 대한 접착능을 평가하는 방법, 혈소판 감소 마우스를 이용하여 혈소판의 생체내 수명을 평가하는 방법, 트롬빈(thrombin) 존재하에 피브리노겐 코트 카바 글라스(fibrinogen coat cover glass) 상의 혈소판의 형상을 관찰하는 방법, 혹은, 후술하는 시험예 16에 기재한 바와 같이, 레이저 조사와 헤마토포르피린(hematoporphyrin) 등을 이용하여 혈전 형성 모델 동물을 제작하고, 이 모델 동물 내에 있는 혈소판의 동태를 단일 레벨로 관찰하는 생체 분자 이미징 수법 등을 이용하여 평가할 수 있다.
ADAM17(a　disintegrin　and　metallopeptidase　domain　17)은, 구조상 디스인티그린도메인을 가지며, 메탈로프로테아제 활성을 가지는 단백질이다. GPIbα이외에도 막결합형의 TNF－α(Tumor　necrosis　factor－alpha, 종양괴사 인자-α)를 쉐딩하고, 유리형의 TNF－α를 생산하는 것으로부터 TACE(TNF－alpha　conｖerting　enzyme, TNF－α변환 효소)라고 불리우는 단백질이다. 전형적으로는, 사람 으로부터 유래되는 ADAM17로서 ACCESSION　No. NP＿003174. 3(No. NM＿003183. 4)로 특정되는 단백질(유전자)을 들 수 있다.
또, GPIbα(glycoprotein　Ib　alpha, 당단백질 Ibα)는, 혈소판의 막 단백질이며, 폰·윌레브랜드 인자(ｖon　Willebrand　factor, VWF)의 수용체로서 기능을 하고 있다. 또, GPIbα는 사람 체내에서 혈소판에만 발현하고 있기 때문에, CD42b 항원이라고도 불리우며 혈소판의 표면 마커로도 이용되고 있다. 전형적으로는, 사람으로부터 유래되는 GPIbα로서 ACCESSION　No. NP＿000164. 5(No. NM＿000173. 5)로 특정되는 단백질(유전자)을 들 수 있다.
ADAM17 및 GPIbα의 전형적인 예로서 GenBank에 등록되어 있는 각각의 Reference　Sequence를 예시했으나, 단백질의 아미노산 배열은, 자연계에서 (즉, 비인공적으로) 변이하여 얻어진다. 따라서, 본 발명의 조성물의 작용 기서에 관련해서는 ADAM17 및 GPIbα에 이와 같은 천연의 변이체도 포함되는 것으로 이해할 수 있다.
본 발명에서 「ADAM17에 의한 GPIbα의 쉐딩의 억제」에는, ADAM17에 의한 쉐딩의 완전한 억제(저해) 및 부분적인 억제 모두가 포함된다. 또, 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 조성물의 존재하에서 혈소판의 총 수에 대한 CD42b(GPIbα)(＋) 혈소판 수의 비율을 산출하고, 본 발명의 조성물의 비존재하에 서의 비율과 비교하여 큰 값인 경우에는 본 발명의 조성물이 ADAM17에 의한 GPIbα의 쉐딩을 억제하는 것으로 평가할 수 있다. 본 발명의 조성물에 의한 GPIbα의 쉐딩의 억제 정도로는, 본 발명의 조성물의 존재하에서 CD42b(＋) 혈소판 수의 비율이 80%이상인 것이 바람직하고, 보다 큰 것이 더욱 바람직하다(예를 들면, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상).
또한 본 발명의 조성물에 의한 GPIbα의 쉐딩을 억제하는 능력을, 후술하는 시험예 3에서 나타내는 방법을 이용하여 평가를 한 경우, 50%억제 농도(IC50)는 0. 01nmol/L~100 nmol/L인 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물의 유효 성분인 상기 일반식(I)에서 표현되는 화합물로는, 예를 들면, N－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(4－디에틸아미노메틸 페닐)에틸］－N－히드록시포름아미드,
N－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(4－디메틸아미노메틸페닐) 에틸］－N－히드록시포름아미드,
N－｛4－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노) 에틸］벤질｝－2－메톡시아세트아미드,
N－｛4－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노) 에틸］벤질｝메탄술폰아미드,
N－｛4－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노) 에틸］벤질｝벤즈아미드,
N－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(4－몰포린-4－일메틸페닐) 에틸］－N－히드록시포름아미드,
N－히드록시-N－［1－(4－몰포린-4－일메틸페닐)－2－(4－펜토-2－이닐옥시벤젠술포닐) 에틸］포름아미드,
N－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(4－디메틸아미노페닐)에틸］－N－히드록시포름아미드,
N－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(3－디메틸아미노페닐)에틸］－N－히드록시포름아미드,
N－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(2－디메틸아미노페닐)에틸］－N－히드록시포름아미드,
N－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(4－피페리진-1－일메틸페닐) 에틸］－N－히드록시포름아미드,
N－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(3－피페리진-1－일메틸페닐) 에틸］히드록시포름아미드,
N－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(3－몰포린-4－일메틸페닐) 에틸］－N－히드록시포름아미드,
N－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－｛4－［(에틸메틸아미노)메틸］페닐］에틸｝－N－히드록시포름아미드,
N－(2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－｛3－［(에틸메틸아미노)메틸］페닐｝에틸)－N－히드록시포름아미드,
N－｛4－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노) 에틸］벤질｝－N－메틸메탄술폰아미드,
N－｛4－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노) 에틸］벤질｝－4－메틸벤젠술폰아미드,
N－｛4－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노) 에틸］벤질｝－4, N－디메틸벤젠술폰아미드,
N－｛4－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노) 에틸］벤질｝－N－메틸술포닐메탄술폰아미드,
N－｛2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－［4－(2－디메틸아미노에틸) 페닐］에틸｝－N－히드록시포름아미드,
N－｛2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－［4－(2－몰포린-4－일에틸) 페닐］에틸｝－N－히드록시포름아미드,
N－(2－｛4－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노) 에틸］페닐｝에틸) 메탄술폰아미드,
N－｛2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－［4－(3－디메틸아미노프로필) 페닐］에틸｝－N－히드록시포름아미드,
N－｛2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－［4－(3－디에틸아미노프로필) 페닐］에틸｝－N－히드록시포름아미드,
N－｛2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－［4－(3－몰포린-4－일프로필) 페닐］에틸｝－N－히드록시포름아미드,
N－｛2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－［4－(4－몰포린-4－일부틸)－페닐］－에틸｝－N－히드록시포름아미드,
N－｛4－［1－(포르밀히드록시아미노)－2－(4－펜토-2－이닐옥시벤젠술포닐) 에틸］벤질｝메탄술폰아미드, 또는,
N－｛4－［1－(포르밀히드록시아미노)－2－(4－옥토-2－이닐옥시벤젠술포닐) 에틸］벤질｝메탄술폰아미드를 들 수 있다. 후술하는 시험예 4에 나타낸 바와 같이, ADAM17에 대해서 높은 특이성을 갖는다는 관점에서, N－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(4－디에틸아미노메틸페닐) 에틸］－N－히드록시포름아미드, 또는 N－｛4－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노) 에틸］벤질｝메탄술폰아미드가 바람직하다.
또한, N－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(4－디에틸아미노메틸 페닐) 에틸］－N－히드록시포름아미드는, 후술하는 실시예에서 「I－1」또는 「S－45282」이며, N－｛4－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노) 에틸］벤질｝메탄술폰아미드는, 후술하는 실시예에서 「I－4」또는 「S－45457」이다.
본 발명의 조성물의 형태로는, 예를 들면, 연구개발 목적(예를 들면, in vitro 또는 in vivo의 연구개발)으로 이용되는 시약이나 의약품 첨가제를 들 수 있다.
본 발명의 조성물은, ADAM17에 의한 GPIbα의 쉐딩을 억제하는 것에 의해 혈소판의 기능을 유지하는 작용을 가지기 때문에, 혈소판의 기능을 유지하기 위한 시약(예를 들면, 거핵구로 분화할 수 있는 세포로부터 거핵구로 분화 유도시켜, 해당 거핵구로부터 혈소판을 생산하는 배양계에 사용하는 시약이나 생산된 혈소판에 첨가하여 그 기능을 유지하기 위한 시약)이나 헌혈용의 혈소판을 포함한 혈액제제에 첨가되는 의약품 첨가물로서 적합하게 이용할 수가 있다. 본 발명에 있어서의 조성물을 상기 첨가물이나 시약으로 이용하는 경우에는, 유효 성분인 상기 일반식(I)포 표시되는 화합물 등 외에, 예를 들면, 안정화제나 용제 등을 함유하여도 좋다.
본 발명의 조성물의 제품(예를 들면, 시약이나 의약품 첨가물) 또는 그 설명서는, 혈소판의 기능을 유지하기 위해서 이용되는 취지의 표시를 첨부한 것일 수 있다. 여기서 「제품 또는 설명서에 표시를 첨부하였다」라는 것은 제품의 본체, 용기, 포장 등에 표시를 첨부한 것, 혹은 제품의 정보를 개시하는 설명서, 첨부 문서, 선전물, 그 외의 인쇄물 등에 표시를 첨부한 것을 의미한다. 혈소판의 기능을 유지하기 위해서 이용되는 취지의 표시에 대해서는, 본 발명의 조성물의 유효 성분인 상기 일반식(I)에서 표시되는 화합물 등이 혈소판의 기능을 유지하는 효과를 발휘하기에 이를 때까지의 기서에 대한 정보를 포함할 수가 있다. 기서로서는, 예를 들면, ADAM17에 의한 GPIbα의 쉐딩을 억제하는 것에 의해 혈소판의 기능을 유지하는 것에 관한 정보를 들 수 있다. 또한, 혈소판의 기능을 유지하기 위해서 이용되는 취지의 표시에 대해서는, 혈소판의 제조 또는 보존하는데 이용되는 것에 관한 정보를 포함할 수가 있다.
상기 일반식(I)로 표시되는 화합물 등은, 상기 본 발명의 조성물을 제조하기 위한 유효 성분이 된다. 따라서, 본 발명은, 상기 본 발명의 조성물을 제조하기 위해서 이용된다, 상기 일반식(I)에서 표시되는 화합물 등 , 및 상기 일반식(I)로 표시되는 화합물 등을 이용하는 것을 특징으로 한다, 상기 본 발명의 조성물의 제조 방법도 제공한다.
또한, 본 발명은, 거핵구로 분화할 수 있는 세포로부터 거핵구로 분화 유도시켜서, 해당 거핵구로부터 혈소판을 생산하는 배양계에 상기 일반식(I)로 표시되는 화합물 등을 첨가한 배양물을 제공하는 것이다. 더욱이 본 발명은 거핵구로 분화할 수 있는 세포로부터 거핵구로 분화 유도시켜서, 해당 거핵구로부터 혈소판을 생산하는 배양계에 상기 일반식(I)로 표시되는 화합물등을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 혈소판을 조제하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 있어서 「거핵구」은, 혈소판 전구 세포, 거핵 세포라고 칭하며, 그 세포질을 분리하는 것에 의해 혈소판을 생산하는 세포이다.
본 발명에 있어서, 「거핵구로 분화할 수 있는 세포」는, 거핵구로 분화 유도할 수가 있는 세포이면 특히 제한될 것은 없고, 예를 들면, 수정란, 배아 줄기 세포(ES세포), 인공 유도 만능 줄기 세포(iPS 세포), 배아 생식 세포(EG세포)라고 하는 만능 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 거핵아구, 지방세포를 들 수 있다. 조혈 줄기 세포나 조혈 전구 세포는, 골수나 제대혈 등으로부터 채취되는 것이어도 좋다. 더욱이 이들 중에서는 배(胚)를 파괴하는 일이 없기 때문에 윤리적인 문제가 없고, 본 발명에 의해 조제된 혈소판을 수혈하는 환자와 사람 백혈구형 항원(HLA)의 형태를 적합시키기에 용이하다는 관점에서, iPS 세포가 바람직하다. 또한, iPS 세포의 배양을 개시하고 나서 25~35일까지, iPS 세포 유래의 거핵구는 계속 증가하는 것이 가능하고, 이러한 거핵구로부터 생산되는 혈소판수도, 3 인자(Oct3/4, Sox2, Klf4)를 이용하여 수립한 iPS 세포와 비교하여, 2~10배가 된다고 하는 관점으로부터, 4 인자(Oct3/4, Sox2, Klf4, c－Myc)를 이용하여 수립한 iPS 세포가 더욱 바람직하다. 또한 이러한 거핵구 및 혈소판 생산수의 증가는 c－Myc 유전자의 재활성화에 의해 일어난다고 하는 것을 본 발명자 등에 의해 확인되고 있다.
더욱이 본 발명의 방법에 사용하는 상기 세포가 유래하는 동물종으로는 특히 제한하는 것은 아니지만, 예를 들면, 사람, 생쥐, 쥐, 개, 고양이, 소, 말, 양 등을 들 수 있지만, 바람직하게는, 생쥐, 쥐, 사람이며, 보다 바람직하게는 생쥐 또는 사람이며, 특히 바람직하게는, 사람이다.
본 발명에서 「거핵구로 분화할 수 있는 세포로부터 거핵구로 분화 유도시켜,해당 거핵구로부터 혈소판을 생산하는 배양계」로는, 예를 들면, 혈소판에 이르는 도중의 단계에서 배양체(胚樣體)(분화 유도된 중배엽(中胚葉)계 미분화 세포를 포함하는 세포 집단)을 형성하는 배양계(Eto등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002년, 99권, 12819－12824 페이지등 ), 조혈 전구 세포를 내포하는 네트형 구조물(sac 구조체)을 형성하는 배양계(특허 문헌 1~3등 참조), 제대형 유래의 조혈 전구 세포로부터 혈소판을 생산하는 배양계(Robert 등, 「Glycoprotein　Ibalpha　receptor　instability　is　associated　with　loss　of　quality　of　platelets　produced　in　culture.」, Stem　Cells　Deｖelopment, 2010년 5월 26일 온라인판 등 참조) 등을 들 수가 있다(그 외, Fujimoto 등, Blood, 2003년, 102권, 4044－4051 페이지：Hiroyama 등, Exp. Hematol. , 2006년, 34권, 760－769 페이지：Gaur등, J　Thromb　Haemost., 2005년, 4권, 436－442 페이지 등 참조). 이들 중에서는 네트 형 구조물 내에 조혈 전구 세포가 농축되어 존재하고 있으며, 생체외에 있어서 효율적으로 거핵구나 혈소판 등을 생산하는 것이 가능하기 때문에 네트형 구조물을 형성하는 배양계가 바람직하다.
본 발명과 관련된 배양계의 배양 조건으로는 거핵구의 배양 및 혈소판의 생산에 적합한 조건이면 특히 제한하지 않지만 배양 온도로는 35~38℃인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 37℃이다. 상기 배양 온도가 상기 하한선 미만이면 거핵구나 혈소판의 생산수가 감소하게 되는 경향이 있고, 상기 상한선을 초과할 경우에는 세포의 배양이나 유지가 곤란해지는 경향이 있다.
더욱이, 본 발명과 관련한 「거핵구로 분화할 수 있는 세포」를 배양할 때(특히, 거핵구를 분화 유도하는 과정에서), 지지 세포(feeder cells)와 공배양하는 것이 바람직하다. 여기서 사용하는 「지지 세포」로서는, 「거핵구로 분화할 수 있는 세포」의 분화 유도에 기여하는 것이면 특히 제한은 없지만, 예를 들면, 생쥐 배아 섬유아세포, 바람직하게는, 10 T1/2 세포주, OP9 세포 등을 이용할 수가 있다. 죽지 않은 주화(株化) 세포 이외의 세포로는, 사람 골수에서 유래한 중간엽 줄기세포(사람 골수로부터 직접 조제하고 배양하여 얻은 세포)를 들 수가 있어 해당 중간엽 줄기세포를 지지 세포로서 이용하는 경우에도, 사람 ES 세포 또는 iPS 세포로부터 거핵구 성숙 및 혈소판 생산이 가능하다. 마트리겔(Martrigel) 등의 세포외 기질상에서 배양한 경우에도, 효율은 떨어지지만, 혈소판을 유도하는 것이 가능하다. 「지지 세포」를 이용할 때에는 방사선을 조사하는 등으로 세포의 증식을 억제하는 것이 바람직하다.
상기 일반식(I)로 표시되는 화합물 등의 상기 배양계에 대한 첨가량(농도)은, 0. 01 ~ 100μM인 것이 바람직하다. 상기 첨가량이 상기 하한선 미만이면 혈소판에 있어서의 GPIbα의 절단 억제가 곤란하게 되는 경향에 있고, 상기 상한선을 초과하면 세포의 증식을 억제하는 경향이 있다. 또한, 상기 일반식(I)로 표시되는 화합물 등을 상기 배양계에 첨가하는 시기로는, 혈액 세포 분화의 불균일성의 상황하에도 불구하고 배양 과정에서 균일성의 확보, 균질인 제품의 확보를 위해서, 조혈 전구 세포로부터 혈소판의 생산에 이르는 전기간으로 하는 것이 바람직하고, 거핵구로부터 혈소판의 생산에 이르는 전기간으로 한정되지 않는다고 하는 점으로써, GM6001와는 크게 다르다.
이하에, 본 발명의 배양계에 매우 적합하게 이용되는 네트형 구조물을 형성하는 방법을 일례로 본 발명의 혈소판을 조제하기 위한 방법을 보다 구체적으로 설명한다.
먼저, 네트형 구조물(sac 구조체)을 형성하는 방법에 대해 설명하기로 한다. 네트형 구조물을 조제하기 위한 적합한 배양 조건은 이용하는 ES 세포 또는 iPS 세포에 따라 다르지만, 예를 들면, 배지로는 최종 농도 15%의 FBS를 첨가한 이스코브 개질 둘베코 배지(Isocove's modified Dulbecco's medium: IMDM)를 이용하고 그 외 무혈청의 경우에 대해도 적당 증식 인자 및 서플리멘트 등을 첨가한 것을 사용할 수가 있다. 더욱이 네트형 구조물을 효율적으로 형성시키기 위해서 혈관내피성장인자(VEGF)를 0 ~ 300 ng/ml 정도, 더욱 바람직하게는 20 ng/ml 정도 첨가하는 것이 좋다. 배양의 환경으로는, 이용하는 ES 세포 또는 iPS 세포의 종류에 따라서 다르지만, 바람직하게는 5%CO2, 35 ~ 38℃, 더욱 바람직하지는 37℃의 조건이다. 네트형 구조물이 형성될 때까지의 배양 기간은, ES 세포 또는 iPS 세포의 종류에 따라서 다르지만, 지지 세포 위에 파종하고 나서, 15 일째(14 ~ 16일 후) 정도에 그 존재를 확인할 수가 있다.
형성된 네트형 구조물은, 로포성 구조로 되어 있으며, 내부는 조혈 전구 세포, 특히 CD34 양성의 세포가 농축된 상태로 존재하고 있다. 네트형 구조물의 내부에 존재하는 조혈 전구 세포는, 물리적인 수단, 예를 들면, 멸균이 끝난 체형 기구(예를 들면, 셀 스트레이너(cell strainer) 등)에 통과시키는 것에 의해 분리할 수가 있다.
다음에, 네트형 구조물에서 분리한 조혈 전구 세포로부터 혈소판을 조제하는 방법에 대해 설명한다. 분리하여 얻어진 조혈 전구 세포를 지지 세포 위에 파종하고, 거핵구 및 혈소판을 생산하기에 적합한 조건으로 배양을 수행한다. 여기서 「거핵구 및 혈소판을 생산하기에 적합한 조건」이란, 예를 들면, 트롬보포이에틴(TPO), 10 ~ 200 ng/mL, 바람직하게는 100 ng/mL 정도)의 존재하에서, 또는 줄기 세포 인자(Stem Cell Factor(SCF), 10 ~ 200 ng/mL, 바람직하게는 50 ng/mL 정도), 헤파린(Heparin, 10 ~ 100 U/mL, 바람직하게는 25 U/ml 정도) 및 TPO(10 ~ 200 ng/mL, 바람직하게는 100 ng/mL 정도)의 존재하에, 7 ~ 15일간 정도 배양하는 것을 들 수 있다. 배양 환경으로서는 바람직하게 5% CO2, 35 ~ 38℃, 더욱 바람직하게는 37℃의 조건이다.
또한, 이러한 배양계에 있어서, 상기 일반식(I)로 표시되는 화합물 등을 이 배양계에 첨가하는 시기로는, 조혈 전구 세포를 지지 세포 위에 다시 파종할 때 첨가하는 것이 바람직하고, 배양 개시 후 22 일째(20일 ~ 23 일째, 네트형 구조물의 파종 후부터 6일 ~ 10일째) 무렵에 상기 일반식(I)에서 표현되는 화합물등을 첨가하는 것이 보다 바람직하다.
더욱이 본 발명의 방법에 있어서, 거핵구로부터 방출된 혈소판이 풍부하게 존재하는 배양액의 분획물(예를 들면, 네트형 구조물을 형성시키는 방법에서는 사람 iPS 세포 또는 ES 세포의 배양 후 22 ~ 28 일째 정도의 분획물)을 회수하고, 백혈구 제거 필터(예를 들면, 데루모사, 아사히카세이메디칼사 등에서 구입 가능)등을 사용하여 혈소판 이외의 성분(거핵구, 그 외의 혈액 세포)의 제거를 실시하는 것에 의해 혈소판을 조제할 수가 있다.
상술한 바와 같이, 상기 일반식(I)로 표시되는 화합물 등은, ADAM17에 의한 GPIbα의 쉐딩을 억제하여 혈소판의 기능을 유지하는 작용을 갖는다. 따라서, 본 발명은 상기 일반식(I)로 표시되는 화합물 등이 첨가된 혈소판을 포함한 혈액제제 및 상기 일반식(I)로 표시되는 화합물 등을 혈소판을 포함한 혈액제제에 첨가하는 것을 특징으로 하는 혈액제제에 있어서의 혈소판의 기능을 유지하기 위한 방법도 제공하는 것이다.
또한, 상기 일반식(I)로 표시되는 화합물 등은 혈소판을 포함한 혈액제제를 제조하기 위한 유효 성분이 된다. 따라서, 본 발명은 상기 본 발명의 혈액제제를 제조하기 위해서 이용되는 의약품 첨가물로서 상기 일반식(I)로 표시되는 화합물 등도 제공하는 것이다.
본 발명에 있어서의 혈액제제에 포함되는 혈소판으로서는 특히 제한하는 것은 아니지만, 상술한 본 발명의 혈소판을 조제하기 위한 방법에 따라 얻어진 혈소판이어도 좋고, 또 채혈에 의해 얻어진 말초혈 등으로부터 유래의 혈소판이어도 좋다. 혈액제제를 조제할 때에는 혈소판이 보존에 대해 불안정한 것 등을 고려해서 혈소판의 안정화에 이바지하는 다른 성분을 함유하게 할 수도 있다. 혈소판을 안정화시키는 조건은, 해당 기술 분야의 전문가에 있어 주지의 방법을 선택하는 것이 가능하다. 예를 들면, 혈소판의 기능을 보관 유지하기 위해서 필요한 용액 중(예를 들면, ACD－A액(구연산나트륨/구연산/포도당으로부터 조제되는 액 등, 경우에 따라서는, 신선 동결 혈장 등을 적당히 첨가한다)에, 적당한 농도(예를 들면, 1×108 ~ 1×1010 혈소판/mL 정도, 바람직하게는 1×109 혈소판/mL 정도)로 현탁하여 제제화할 수가 있다. 또한, 혈소판을 포함한 제제를 수납하는 용기는 유리와 같이 혈소판을 활성화하는 재질의 것을 피하는 것이 바람직하다. 상기 일반식(I)로 표시되는 화합물 등의 첨가량(농도)은, 0.01 ~ 100μmol/L인 것이 바람직하다. 상기 첨가량이 상기 하한선 미만이면 혈소판은 접착 기능을 보관 유지할 수 없다고 하는 경향에 있고, 상기 상한선을 초과하면 최대 효과가 된다.
실시예
이하, 실시예 및 시험예에 근거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예로 한정되는 것은 아니다. 또한 후술하는 시험예에 서 이용한 거핵구나 혈소판의 생산, 및 이러한 해석은 아래에 표시하는 방법을 이용하였다.
＜사람 ES 세포, 사람 iPS 세포 및 지지 세포의 조제＞
사람 ES 세포(hES　cells)는, 쿄토대학재의과학연구소가 수립하고, 동연구소로부터 공여된 KhES 세포주(KhES－3)를 이용하였다.
또, 사람 iPS 세포(hiPS　cells)는, 도쿄대학에서 사람 유래의 피부 세포에 Oct4, Klf4, Sox2 및 c－Myc를 도입하여 수립한 iPS 세포주(TkDA3－4)를 이용하였다. 그리고, TkDA3－4 세포를 0.1 mM 비필수아미노산(Invitrogen사제), 2mM　L－글루타민(Inｖitrogen사제), 20%　녹아웃 혈청 대체 첨가물(KSR, Inｖitrogen사제), 0.1mM　2－메르캅토에탄올, 및 5 ng/ml　염기성 섬유아세포 증식인자(bFGF, Upstate사제)를 첨가한 둘베코 개질 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)와 햄(Ham) F－12 배지(SIGMA사제)와의 혼합 배지(혼합 비율 1：1) 중, 방사선이 조사된 생쥐 섬유아세포 위에서 배양하고, 3일 마다 계대하여, 미분화 상태를 유지한 것을 사용하였다.
또한 리켄 바이오자원센터로부터 구입한 생쥐 태아 유래의 섬유아세포　C3H10T1/2 세포주(이하, 「10T1/2 세포」라고 칭함)를 10%　소 태아 혈청(FBS) 및 2 mM　L－글루타민을 첨가한 이글 기초 배지(BME, Inｖitrogen사제) 중에서 배양하였다. 그리고, 세포수 8×106개/10 cm 디쉬(Dish)가 되도록 조정한 10T1/2 세포에 50 Gy의 방사선 조사를 실시한 것을 지지 세포로 이용하였다.
＜거핵구 및 혈소판의 생산 및 이들의 해석＞
상기 지지 세포 위에 사람 ES 세포 또는 사람 iPS 세포를 세포수 5×104~1×105개/10 cm 디쉬가 되도록 파종하고, 15%　FBS(제품명：CELLect(TM)　GOLD, ICN　Biomedicals사제), 2 mM　L－글루타민(Inｖitrogen사제), ITS 서플리먼트(10μg/ml　인슐린, 5.5mg/ml　사람 트랜스페린, 5ng/ml　아셀렌산나트륨)(Sigma사제), 50μg/ml　아스코르빈산(Sigma사제), 0.45mM　α－모노티오글리세롤(MTG, Sigma 사제), 20 ng/ml　혈관내피성장인자(VEGF, R＆D　systems사제)를 첨가한 이스코브 개질 둘베코 배지(IMDM, Inｖitrogen/GIBCO사제) 중에서 배양하였다. 또한, 이 배양은 CO2 인큐베이터(제품명：HERA　CELL　150 i, Thermo SCIENTIFIC사제)를 이용하고, 37℃, 5%CO2, 21%O2(대기 산소) 하에서 실시하였다. 그리고, 3일 마다 배지 교환을 실시하고, 내부에 조혈 전구 세포를 포함한 sac 구조체(네트형 구조물)가 다수 확인되는 15 일째까지, 관계된 조건으로 배양하였다.
다음에, sac 구조체를 디쉬로부터 박리하여 파쇄하고, 3%　FBS를 포함한 인산 완충액(PBS)에 현탁한 후, 40μm 셀 스트레이너(BD사제)를 통과시켰다. 통과한 용액을 440×g, 10분간 원심분리하여 조혈 전구 세포를 회수하고, 세포수를 카운트 하였다. 새롭게, 6 웰(well) 플레이트에 준비한 50 Gy 방사선 조사가 끝난 10T1/2 세포(6×105개/6 웰 플레이트 1매) 상에 조혈 전구 세포를 2 ~ 3×104개/웰로 뿌리고, 15%　FBS(제품명：CELLect(TM)　GOLD, ICN　Biomedicals사제), 2 mM　L－글루타민(Inｖitrogen사제), ITS 서플리먼트(10μg/ml　인슐린, 5. 5mg/ml　트랜스페린, 5 ng/ml　아셀렌산나트륨)(Sigma사제), 50μg/ml　아스코르빈산(Sigma사제), 0.45mM　MTG(Sigma사제), 100 ng/ml　사람 트롬보포이에틴(사람 TPO, Peprotec사제), 50 ng/ml　사람 줄기세포 인자(SCF, Peprotec사제) 및 25 U/ml　헤파린을 첨가한 IMDM(Inｖitrogen/GIBCO사제) 중에서 게다가 8일간 배양ㅎ하여 거핵구/혈소판을 유도하였다.
그리고, 유도된 거핵구/혈소판을 항응고제액(Acid　Citrate　Dextrose, ACD)으로 회수한 후 브레이크 없이 900 rpm으로 10분간 원심분리하였다. 원심 분리하여 얻어진 상청액을 추가로 브레이크 없이 1500 rpm으로 10분간 원심분리한 후 상청액을 제거하였다. 그리고, 이와 같이 하여 얻어진 침전물에서 거핵구나 혈소판의 개수를 항체로 염색하고, 플로우사이토메트리(Flow cytometry)에서 해석하였다.
추가로, 플로우사이토메트리는 Becton　Dickinson 사제의 FACS　Aria를 이용하고, 거핵구나 혈소판을 염색하기 위해서 이용한 항체로는 Phycoerythrin(PE) 수식항 사람 CD42a(GPIX) 항체, PE 수식항 사람 CD42b(GPIbα) 항체, allophycocyanin(APC) 표지항 CD41a(인테그린αIIbbeta3 복합체, HIP8　clone) 항체(BD　Bioscience 사제)를 이용하였다. 또한 거핵구나 혈소판의 절대수를 정확하게 측정하기 위하여 세포를 이들 항체로 염색하고, TruCount 비즈(BD　Bioscience 사제)도 이용하여, 플로우사이토메트리에서 해석을 실시하였다.
( 시험예 1) 실온 조건하에 있어서의 ES 세포 유래의 조혈 전구 세포로부터 거핵구/혈소판의 유도
실온 조건하에서의 배양(25℃에서의 배양)으로, 거핵구/혈소판의 유도가 가능한지를 조사하기 위하여 상술한 바와 같이 얻어진 ES 세포 유래의 조혈 전구 세포를 도 1에 나타낸 조건으로 거핵구/혈소판의 유도를 시도하였다. 즉, 조혈 전구 세포를 거핵구/혈소판으로 유도하는 상술한 8일간의 배양 과정에 대해,
대조군：37℃에서 8일간 배양,
2일간의 실온 배양：37℃에서 6일간 배양한 후, 25℃에서 2일간 배양,
실온 배양：25℃에서 8일간 배양,
으로 하는 조건하에서 각각 배양을 실시하고, 상술한 바와 같이 회수하여 플로우사이토메트리에서 거핵구 및 혈소판의 수를 측정하였다. 얻어진 결과를 도 2와 도 3에 나타내었다.
도 2 및 도 3에 나타낸 결과로부터 분명한 바와 같이, 25℃에서 8일간 배양한 것에 관해서는, 대부분 거핵구도 혈소판도 얻을 수 없었다. 또, 플로우사이토메트리 해석의 2일 전부터 25℃에서 배양한 것은, 거핵구 및 혈소판을 얻을 수 있었지만, 대조군의 반정도의 양 밖에 없었다.
( 시험예 2) 실온 조건하에서의 제대형 유래 CD34 (＋) 세포로부터 거핵구/혈소판의 유도
실온 조건하에서의 배양(24 ~ 25℃에서 배양)으로 제대혈 유래 CD34(＋) 세포로부터 혈소판의 유도가 가능한지를 조사하였다.
먼저, 제대혈(CB)로부터 비즈 컬럼을 이용하여 106개의 CD45lowCD34＋세포의 선별 및 단리를 실시하였다. 얻어진 제대혈 유래 CD34(＋) 세포 4×104개를 상기 지지 세포 상에 뿌리고, medium　A(15%　FBS(제품명：CELLect(TM)　GOLD, ICN　Biomedicals 사제), 2 mM　L－글루타민(Inｖitrogen 사제), ITS 서플리먼트(10μg/ml　인슐린, 5.5mg/ml　트랜스페린, 5 ng/ml　아셀렌산나트륨)(Sigma 사제), 50μg/ml　아스코르빈산(Sigma 사제), 0.45mM　MTG(Sigma 사제), 및 사이토킨칵테일(Cytokine Cocktail)(2 ng/ml　TPO(Peprotec 사제), 7.5ng/ml　SCF(Peprotec 사제), 11 ng/ml　FLT－3)을 첨가한 IMDM(Inｖitrogen/GIBCO 사제)) 중에서 4일간 배양하였다. 배양 4 일째에 medium　A와 같은 양의 medium　B를 제대형 유래 CD34(＋) 세포에 추가하였다. 또한 medium　B는 medium　A와 달리, 사이토킨칵테일로서 30 ng/ml　TPO, 1 ng/ml　SCF, 7.5ng/ml　IL－6 및 13. 5ng/ml　IL－9가 첨가되고 있다. 또한, medium　A와 medium　B와는 첨가하고 있는 사이토킨칵테일이 다른 것 이외는 같은 조성이다.
그리고, 이와 같이 하여 배양한 7 일째의 제대혈 유래 CD34(＋) 세포를 medium　B로 4×105개/mL가 되도록 조정하고, 추가로 7일간 37℃으로 배양(대조군) 또는 추가로 7일간 24 ~ 25℃로 배양(실온 배양)하고 배양 14 일째에 플로우사이토메트리에서 거핵구 및 혈소판의 수를 측정하였다. 얻어진 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
도 4 및 도 5에 나타낸 결과로부터 분명한 바와 같이, 약 25℃에서 7일간 배양한 것에 관해서는, 먼저 나타낸 ES 세포 유래의 조혈 전구 세포와 같이 대부분 거핵구도 혈소판도 얻을 수 없었다. 따라서, 시험예 1 및 시험예 2에서 나타낸 결과로부터 ES 세포나 제대혈 유래 CD34(＋) 세포 등의 거핵구로 분화하여 얻어지는 세포로부터 거핵구로 분화 유도시켜,해당 거핵구로부터 혈소판을 생산하는 배양계에 있어서 배양 온도가 37℃ 부근인 것이 바람직하고, 25℃ 부근의 실온 조건하의 배양에서는 거핵구 및 혈소판을 생산하지 못하는 것이 밝혀졌다.
그렇지만, 이러한 혈소판을 생산하는 배양계에서 배양 온도를 37℃부근으로 해 버리면, 혈소판 표면상에서, 혈액 응고에 대해 중요한 인자인 GPIbα가 ADAM17에 의해 쉐딩하여 버리기 때문에 지혈 기능을 발휘하는 혈소판을 얻는 것이 어렵다고 하는 문제가 있다. 또, ADAM17를 포함한 메탈로프로테아제를 대상으로 한 저해제(예를 들면, GM6001)를 배양계에 첨가해 GPIbα의 쉐딩을 억제할 수도 있지만, 이러한 경우에 조혈기능에 필수인 ADAM17 이외의 메탈로프로테아제(MMP－9, MMP－14)도 저해되기 때문에, 혈소판 생산이 최대로 관찰되는 일정 시기에만 첨가할 필요성이 있으며, 혈소판을 생산하는 배양계의 플랜트화 등을 실시하기에 바람직하지 않다. 더욱이 GM6001와 같은 비특이적 메탈로프로테아제 저해제는 생체에 투여하면 안전성의 면에서 염려가 있기 때문에 이러한 저해제가 혼입되어 있는 혈소판을 혈액제제로서 이용하는 일도 바람직하지 않다.
그래서, 아래의 실시예에서 나타내는 바와 같이 ADAM17를 특이적으로 저해하는 화합물을 설계, 합성하였다. 또한 이하에서 표시하는 1 H－NMR 스펙트럼은 중클로로포름(CDCl3) 또는 중디메틸술폭사이드(DMSO－d6)를 용매로 하고 테트라메치르실란(TMS)을 내부 표준으로서 ECA400형 분광계-(400 MHz, 일본전자주식회사제)로 측정한 것이다. 화학 쉬프트의 측정 결과는,δ값을 ppm로 표시하고, 결합 정수의 J값을 Hz로 표시하였다. 약호의 s는 singlet, d는 doublet, t는 triplet, q는 quartet, dd는 doublet　doublet, m는 multiplet, br는 broad를 의미한다. 저분해가능 질량스펙트럼(고속 원자 충격법：FAB－MS) 측정에는, 일본전자 JMS－HX－110 A형을, 질량스펙트럼(엘렉트로 스프레이 이온화법：ESI-MS) 측정에는, 서모피셔사이언티픽(주)의 Exactiｖe를 각각 사용하였다.
N－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(4－디에틸아미노메틸페닐) 에틸］－N－히드록시포름아미드(I－1)
Figure 112013015062440-pct00017
(1－1)：1－부토-2－이닐옥시-4-메탄술포닐벤젠(V－1)
1－브로모-2－부틴 2. 12 g(15. 9 mmol)의 디메틸술폭시드 용액(30 mL)에 4－메틸술포닐페놀 2. 88 g(15. 9 mmol)를 첨가하여 용해시킨 후, 탄산칼륨 2. 64 g(19. 1 mmol)를 첨가하였다. 6시간 교반을 한 후, 포화 식염수를 첨가하고 초산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 1－부토-2－이닐옥시-4－메탄술포닐벤젠(V－1) 3. 39 g(15. 11 mmol)를 조정제물로서 얻었다(수율 95%). 물성값을 이하에 나타내었다.
MS
(FAB) m/z : 225 (M+H)+.
1H-NMR(CDCl3):δ 7.88(2H, m), 7.10(2H, m), 4.73(2H, m), 3.04(3H, s), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz)..
(1－2)：｛4－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)아세틸］벤질｝카르바민산 tert－부틸에스테르(VII－1)
상기(1－1)로 얻어진 화합물(V－1) 1. 36 g(6. 08 mmol)의 테트라히드로 퓨란(70 mL) 용액에 아르곤 분위기하-78℃에서 리튬디이소프로필아미드의 2.0 M헥산-헵탄-에틸벤젠 용액 3. 65 mL(7. 29 mmol)를 첨가하고, 30분간 교반한 후, 리튬헥산메틸디실라지드의 1.0M－테트라히드로퓨란 용액 12.16 mL(12.16 mmol)와 4－(tert－부톡시카르보닐아미노메틸) 안식향산메틸(VI－1) 1.61 g(6.08 mmol)의 테트라히드로퓨란 용액 5 mL를 첨가하였다. －78℃에서 5분간 교반한 후, 서서히 실온까지 승온하고, 1시간 교반하였다. 포화 식염수를 첨가한 후, 초산에틸로 추출하고, 유기층을 포화 식염수로 세정하였다. 무수 황산마그네슘으로 건조한 후, 용매를 감압하에서 증류하여 제거하였다. 실리카 겔 컬럼크로마토그래피(헥산：초산에틸 = 2：1→1：1)으로 정제하고, 4－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)아세틸］벤질｝카르바민산 tert－부틸에스테르(VII－1) 2.02 g(4. 41 mmol)를 무색의 시럽 형태의 물질로 얻었다(수율 72%). 물성값을 이하에 나타내었다.
MS
(FAB) m/z : 480 (M+Na)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 7.93(2H, br d, J = 8.2 Hz), 7.81(2H, m), 7.40(2H, br d, J = 8.2 Hz), 7.07 (2H, m), 4.72(2H, m), 4.70(2H, s), 4.39(2H, m), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz), 1.57(9H, s)..
(1－3)：｛4－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－히드록시에틸］벤질｝카르바민산 tert－부틸에스테르(IX－1)
상기(1－2)에서 얻어진 화합물(VII－1) 2.02 g(4. 41 mmol)의 메탄올(50 mL) 용액에, 0℃에서 수소화붕소나트륨 167 mg(4. 41 mmol)를 첨가하였다. 2시간 30분간 교반한 후, 포화 식염수와 포화 염화암모늄 수용액을 첨가하였다. 메탄올을 감압하에 증류 제거한 후, 초산에틸로 추출하고, 유기층을 포화식염수로 세정한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 용매를 감압하에 증류 제거하여 {4－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－히드록시에틸］벤질｝카르바민산 tert－부틸에스테르(IX－1) 2.04 g(4.41 mmol)를 무정형상 고체의 조정제물로 얻었다(수율 99%). 물성값을 이하에 나타내었다.
MS
(FAB) m/z : 482 (M+Na)+..
(1－4)：｛4－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)비닐］벤질｝카르바민산 tert－부틸에스테르(II－1 a)
상기 (1－3)에서 얻어진 화합물(IX－1) 2.04 g(4.41 mmol)와 트리에틸아민 3.1 mL(22.1 mmol)의 디클로로메탄(45 mL) 용액에 0℃에서 염화 메탄술포닐 0.7 mL(8.8 mmol)를 추가하였다. 3시간 30분간 교반한 후, 포화 식염수를 첨가하여 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 포화식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 용매를 감압하에 증류 제거한 후, 잔사를 실리카 겔 컬럼크로마토그래피(클로로포름：초산에틸 = 3：1)로 정제하여｛4－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)비닐］벤질｝카르바민산 tert－부틸에스테르(II－1a) 1.77 g(4.00 mmol)를 무색 무정형상의 고체로 얻었다(수율 91 %). 물성값을 이하에 나타내었다.
1H-NMR (CDCl3) : δ 7.87(2H, d, J = 8.7 Hz), 7.61(1H, d, J = 15 Hz), 7.43(2H, J = 8.2 Hz), 7.30(2H, d, J = 8.2 Hz), 7.10(2H, d, J = 8.7 Hz), 6.82 (1H, d, J = 15 Hz), 4.88(1H, m), 4.71(2H, m), 4.33(2H, m), 1.86(3H, m), 1.45(9H, s)..
(1－5)：4－［(E)－2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)비닐］벤질아민 염산염(II－1b)
상기 (1－4)에서 얻어진 화합물(II－1a) 295 mg(0.67 mmol)의 메탄올(5 mL) 용액에 0℃에서 4 M－염산/디옥산 2 mL를 첨가하고 10분간 교반한 후, 실온까지 승온하여 2시간 교반하였다. 용매를 감압하에 증류 제거한 후, 메탄올 20 mL를 첨가하고 다시 용매를 감압하에서 증류 제거하여 4－［(E)－2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)비닐］벤질아민 염산염(II－1 b)을 무색 고체로서 얻었다. 물성값을 이하에 나타내었다.
1H-NMR (DMSO-d6) : δ 7.85(2H, d, J = 8.7 Hz), 7.78(2H, d, J = 8.2 Hz), 7.52(2H, d, J = 8.2 Hz), 7.20(2H, d, J = 8.7 Hz), 4.87(2H, m), 4.05(2H, m), 1.83(3H, m)..
(1－6)：｛4－［(E)－2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)비닐］벤질｝디에틸아민(II－1 c)
상기 (1－5)에서 얻어진 화합물(II－1b)의 메탄올(6 mL) 용액에 0℃에서 아세토알데히드 1 mL, 트리아세톡시히드로 붕산나트륨 212 mg(1.00 mmol) 및 초산 3방울을 각각 첨가한 후, 실온에서 1시간 30분간 교반하였다. 포화 식염수와 포화 중조수를 첨가한 후, 용매를 감압하에서 증류 제거하였다. 클로로포름으로 추출ㅎ하고 유기층을 포화식염수로 세정한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 용매를 감압하에서 증류 제거한 후, 잔사를 실리카 겔 컬럼크로마토그래피(클로로포름：메탄올 = 20：1→10：1)에서 정제하고,｛4－［(E)－2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)비닐］벤질｝디에틸아민(II－1 c) 111.7 mg(0.28 mmol)를 담황색 무정형상의 고체로 얻었다(2 단계 수율 42%). 물성값을 이하에 나타내었다.
MS
(FAB) m/z : 398 (M+H)+..
(1－7)：N－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(4－디에틸아미노 메틸페닐)에틸］히드록실아민(III－1)
상기 (1－6)에서 얻어진 화합물(II－1 c) 108 mg(0.27 mmol)의 테트라히드로퓨란(8 mL) 용액에 50 % 히드록실아민 용액(3 mL)을 첨가하고 실온에서 25시간 교반하였다. 반응 용액을 감압하에서 증류 제거한 후, 물을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조하여 감압 농축하였다. N－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(4－디에틸아미노메틸페닐)에틸］히드록실 아민(III－1) 92.9 mg(0.22 mmol)를 담황색 무정형상 고체로 얻었다(수율 81%). 물성값을 이하에 나타내었다.
1H-NMR (CDCl3) : δ 7.84(2H, m), 7.27(2H, m), 7.20(2H, m), 7.07(2H, m), 4.72(2H, m), 3.75(1H, m), 3.51(2H, s), 3.33(1H, m), 2.49(4H, m), 1.87(3H, s), 1.03(6H, m)..
(1－8)：N－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(4－디에틸아미노 메틸페닐)에틸］－N－히드록시포름아미드(I－1)
포름산 1 mL를 0℃로 냉각하고, 무수초산 0. 3 mL를 적하한 후, 30분간 교반하는 것에 의해 포름산-초산의 혼합 산무수물 용액을 조제하였다. 상기 (1－7)에서 얻어진 화합물(III－1) 92 mg(0.21 mmol)의 테트라히드로퓨란(3 mL) 용액에 0℃에서 먼저 조제한 포름산-초산의 혼합 산무수물 용액 0.6 mL를 첨가하여 실온에서 4시간 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축한 후, 톨루엔으로 공비하였다. 얻어진 오일상의 물질을 클로로포름 2 mL 및 메탄올 10 mL에 용해하고, 12시간 교반 하였다. 이 용액을 감압 농축하여 얻어진 오일상의 물질을 클로로포름으로 용해하고, 포화 중조수를 첨가하여 중화하였다. 클로로포름으로 추출한 후, 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산 마그네슘으로 건조하였다. 중압 실리카 겔 컬럼크로마토그래피(클로로포름：메탄놀 = 95：5→75：25)에 의해 정제하여 N－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(4－디에틸아미노메틸페닐)에틸］－N－히드록시 포름아미드(I－1) 53. 9 mg(0. 11 mmol)를 담황색 무정형상의 고체로 얻었다(수율 52%). 물성값을 이하에 나타내었다.
MS
(FAB) m/z : 459(M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.32(0.6H, s), 8.10(0.4H, s), 7.80-7.86(2H, m), 7.21-7.30(4H, m), 7.06-7.14(2H, m), 5.65(0.6H, m), 5.36(0.4H, m), 4.74(2H, br s), 4.20(0.4H, m), 4.05(0.6H, br t, J = 13 Hz), 3.48-3.57(3H, m), 2.46(4H, m), 1.87(3H, br s), 0.99(6H, m)..
N－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(4－디메틸아미노메틸페닐) 에틸］－N－히드록시포름아미드(I－2)
Figure 112013015062440-pct00018
실시예 1과 동일하게 조작하는 것에 의해 상기 화합물(I－2)을 얻었다.
MS
(FAB) m/z : 431 (M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.28(0.6H, s), 8.14(0.4H, s), 7.79-7. 91(2H, m), 7.04-7. 32(6H, m), 5.69(0.6H, m), 5.35(0.4H, m), 4.74(2H, br s), 4.18(0.4H, m), 4.07(0.6H, m), 3.47(1H, m), 3.33(2H, m), 2.11(6H, s), 1.87(3H, s)..
N－｛4－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노) 에틸］벤질｝－2－메톡시아세트아미드(I－3)
Figure 112013015062440-pct00019
(3－1)：N－｛4－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)비닐］벤질｝－2－메톡시아세트아미드(II－3)
상기 실시예 1 (1－5)에서 얻어진 화합물(II－1 b) 283 mg(0.75 mmol)의 피리딘 용액(5 mL)에, 실온에서 메톡시아세틸클로라이드 0.2 mL(1.85 mmol)를 적하시켰다. 2일 후, 포화 식염수를 첨가하고 초산에틸로 추출하고, 포화 식염수로 세정하였다. 무수 황산마그네슘으로 건조하고 용매를 감압하에 증류 제거한 후, 실리카 겔 컬럼크로마토그래피(클로로포름：메타놀 = 20：1→10：1)으로 정제하여 화합물(II－3) 296 mg(0.71 mmol)를 담황색 고체로 얻었다(수율 94%). 물성값을 이하에 나타내었다.
MS
(FAB) m/z : 414 (M+H)+..
(3－2)：N－｛4－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노)에틸］벤질｝－2－메톡시아세트아미드(I－3)
상기(3－1)에서 얻어진 화합물(II－3)을 이용하여 상기 실시예 1과 동일한 방법(1－7 및 1－8)으로 N－｛4－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노)에틸］벤질｝－2－메톡시아세트아미드(I－3)를 얻었다. 물성값을 이하에 나타내었다.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.32(0.6H, s), 8.09(0.4H, s), 7.77-7.88(2H, m), 7.20-7.31(4H, m), 7.06-7.16(2H, m), 5.65(0.6H, m), 5.37(0.4H, m), 4.75(2H, br s), 4.39-4. 47(2H, m), 4.16(0.4H, m), 4.03(0.6H, br t), 3.93(0.8H, br s), 3.90(1.2H, br s), 3.46(1H, m), 3.40(3H, br s),
1.87(3H, br s)..
N－｛4－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노)에틸］벤질｝메탄술폰아미드(I－4)
Figure 112013015062440-pct00020
실시예 3과 동일하게 조작하는 것에 의해 상기의 화합물(I－4)을 얻었다.
MS
(FAB) m/z : 481 (M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.42(0.6H, s), 7.87(0.4H, s), 7.78-7.88(2H, m), 7.30-7.35(4H, m), 7.06-7.17(2H, m), 5.65(0.6H, m), 5.39(0.4H, m), 4.75(2H, m), 4.28(2H, m), 4.15(0.4H, m), 4.00(0.6H, br t, J = 12 Hz), 3.45(1H, m), 2.91(1.2H, s), 2.89(1.8H, s), 1.87(3H, m)..
N－｛4－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노)에틸］벤질｝벤즈아미드(I－5)
Figure 112013015062440-pct00021
실시예 3과 동일하게 조작하여 상기의 화합물(I－5)을 얻었다.
MS (FAB) m/z : 507 (M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.31(0.6H, s), 8.08(0.4H, s), 7.73-7.87(4H, m), 7.51(1H, m), 7.42(2H m), 7.27-7.33(3H, m), 7.07-7.14(2H, m), 5.65(0.6H, m), 5.37(0.4H, m), 4.73(2H, m), 4.54-4.62(2H, m), 4.15(0.4H, m), 4.00(0.6H, m), 3.45(1H, m), 1.86(3H, br s)..
N－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(4－몰포린-4－일메틸페닐) 에틸］－N－히드록시포름아미드(I－6)
Figure 112013015062440-pct00022
(6－1)：tert－부틸-(4－메탄술포닐페녹시) 디메틸실란(XII－6)
4－메틸술포닐페놀 10 g(58.07 mmol)의 N,N－디메틸포름아미드 용액(150 mL)에 이미다졸 9.9 g(145.18 mmol)를 첨가하여 용해시킨 후, tert－부틸메틸클로로실란 10.5 g(69.7 mmol)를 첨가하여 교반하였다. 반응 종료 후, 포화 식염수를 추가하여 초산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 3회 세정하고, 무수 황산 마그네슘으로 건조하였다. 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산：초산에틸=5：1→3：1)로 정제하여, tert－부틸-(4－메탄술포닐페녹시) 디메틸실란(XII－6) 15.97 g(55.75 mmol)를 얻었다(수율 96%). 물성값을 이하에 나타내었다.
1H-NMR (CDCl3) : δ 7.83(1H, m), 7.81(1H, m), 6.97(1H, m), 6.95(1H, m), 3.04(1H, s), 1.56(9H, s), 0.25(6H, s)..
(6－2)：　2－［4－(tert－부틸디메틸실라니록시)벤젠술포닐］－1－(4－몰포린-4－일메틸페닐)에탄올(XIII－6)
상기(6－1)로 얻어진 tert－부틸-(4－메탄술포닐페녹시)디메틸실란(XII－6) 2.0 g(6.98 mmol)의 테트라히드로퓨란 용액에 아르곤 분위기하-78℃에서 리튬 디이소프로필 아미드의 2. 0 M 헥산-헵탄-에틸벤젠 용액 4.19 mL(8.37 mmol)를 첨가하여 리튬헥사메틸디실라이드의 1.0M－테트라 히드로퓨란 용액 6.98 mL(6. 98 mmol)와 4－몰포린-4－일메틸 안식향산메틸(IX－6) 1.6 g(6.98 mmol)의 테트라 히드로 퓨란 용액 5 mL를 첨가하였다. 그 다음에 교반하면서 서서히 실온까지 승온하였다. 반응 종료 후 포화 식염수를 첨가하고, 초산에틸로 추출하고, 유기층을 포화 식염수로 세정하였다. 무수 황산 마그네슘으로 건조한 후, 용매를 감압하에서 증류 제거하였다. 2－［4－(tert－부틸디메틸실라니록시)벤젠술포닐］－1－(4－몰포린-4－일메틸페닐) 에탄올(XIII－6) 3. 74 g를 조정제물로 하여 얻었다.
(6－3)：2－［4－(tert－부틸디메틸실라니록시)벤젠술포닐］－1－(4－몰포린-4－일메틸페닐) 에탄올(XIV－6)
상기(6－2)에서 얻어진 화합물(XIII－6) 3.74 g(6.98 mmol)의 메탄올(50 mL) 용액에, 0℃에서 수소화 붕소나트륨　264 mg(6.98 mmol)를 첨가하였다. 1시간교반한 후, 포화 식염수를 첨가하였다. 메탄올 감압하에서 증류 제거한 후, 초산에틸로 추출하고, 유기층을 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산 마그네슘으로 건조하였다. 용매를 감압하에 증류 제거하고 잔사를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(초산에틸→초산에틸：메타놀=10：1)로 정제하여 2－［4－(tert－부틸메틸실라니록시)벤젠술포닐］－1－(4－몰포린-4－일메틸페닐)에탄올(XIV－6)을 2.19 g(4. 48 mmol) 얻었다. 물성치를 이하에 나타내었다.
1H-NMR (CDCl3) : δ 7.83(2H, m), 7.25-7.30(4H, m), 6.98(2H, m), 5.22(1H, d, J = 7.7 Hz), 3.68(4H, m), 3.46(3H, m), 3.30(1H, dd, J= 1.5, 14 Hz), 2.40(4H, m), 0.99(9H, s), 0.25(6H, s)..
(6－4)：　4－［(E)－2－(4－몰포린-4－일메틸페닐)에텐술포닐］페놀(XVI－6)
상기(6－3)에서 얻어진 2－［4－(tert－부틸디메틸실라니록시)벤젠술포닐］－1－(4－몰포린-4－일메틸페닐)에탄올(XIV－6) 2. 19 g(4.48 mmol)의 디클로로 메탄 용액(45 mL)에 트리에틸아민 3.10 mL를 첨가하고 0℃에서 교반하였다. 염화 메탄술포닐 0.61 mL(8.91 mmol)를 첨가한 후, 실온에서 8시간 교반하였다. 추가로 트리에틸아민 3.10 mL, 염화 메탄술포닐 0.61 mL를 각각 첨가하고 4시간 교반하였다. 포화 식염수를 첨가하고 클로로포름으로 추출하고, 유기층을 포화 식염수로 세정하였다. 무수 황산 마그네슘으로 건조하였다. 용매를 감압하에 증류 제거하고, 잔사를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산：초산에틸 = 1：2→초산에틸→초산에틸：메타놀=10：1)로 정제하고, 4－［(E)－2－(4－몰포린-4－일메틸페닐)에텐술포닐］페놀(XVI－6)을 0.757 g(2.11 mmol) 얻었다(수율 47%). 물성값을 이하에 나타내었다.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.01(1H, d, J = 8.7 Hz), 7.81(1H, d, J = 8.7 Hz), 7.61(1H, d, J = 15 Hz), 7.35-7.47(5H, m), 6.92(1H, d, J = 6.9 Hz), 6.81(1H, d, J = 15 Hz), 3.71(4H, m), 3.51(2H, m), 2.44(4H, m)..
(6－5)：　4－｛4－［(E)－2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)비닐］벤질］몰포린(II－6)
상기 (6－4)에서 얻어진 4－［(E)－2－(4－몰포린-4－일메틸페닐)에텐술포닐］페놀(XVI－6) 187 mg(0.520 mmol)의 N, N－디메틸포름아미드 용액에 탄산칼륨 108 mg(0.780 mmol) 및 1－브로모-2－부틴 0.094 mL(1.04 mmol)를 첨가하고 4시간교반하였다. 포화 식염수를 첨가하고 초산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산 마그네슘으로 건조하였다. 용매를 감압하에 증류 제거하고, 잔사를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(초산에틸：클로로포름=1：1→1：2→초산에틸)에서 정제하여 4－｛4－［(E)－2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)비닐］벤질］몰포린(II－6)을 0. 0238 g(0.0578 mmol) 얻었다(수율 11%). 물성값을 이하에 나타내었다.
1H-NMR (CDCl3) : δ 7.87(2H, d, J = 8.7 Hz), 7.63(1H, d, J = 15.5 Hz), 7.35-7.44(4H, m), 7.07(2H, d, J = 8.7 Hz), 6.83(1H, d, J = 15.5 Hz), 4.71(2H, m), 3.69(4H, m), 3.50(2H, s), 2.43(4H, m), 1.86(3H, s)..
(6－6)：　N－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(4－몰포린-4－일메틸페닐)에틸］－N－히드록시포름아미드(I－6)
상기(6－5)에서 얻어진 화합물(II－6)을 이용하여 상기와 동일한 방법(1－7 및 1－8)에 의해, N－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(4－몰포린-4－일메틸페닐)에틸］－N－히드록시포름아미드(I－6)를 얻었다. 물성값을 이하에 나타내었다.
MS
(FAB) m/z : 473 (M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.45(0.6H, s), 8.11(0.4H, s), 7.80-7.88(2H, m), 7.23-7.32(4H, m), 7.07-7.16(2H, m), 5.63(0.6H, m), 5.38(0.4H, m), 4.75(2H, m), 4.19(0.4H, m), 4.03(0.6H, m), 3.64-3.71(4H, m), 3.40-3.51(2H, m), 2.39(4H, m), 1.87(3H, m)..
N－히드록시-N－［1－(4－몰포린-4－일메틸페닐)－2－(4－펜토-2－이닐옥시벤젠술포닐)에틸］포름아미드(I－7)
Figure 112013015062440-pct00023
실시예 6과 동일하게 조작하여, 상기의 화합물(I－7)을 얻었다.
MS
(FAB) m/z : 487 (M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.44(0.6H, s), 8.11(0.4H, s), 7.78-7.88(2H, m), 7.26-7.32(4H, m), 7.06-7.16(2H, m), 5.63(0.6H, dd, J = 3.6, 12.3 Hz), 5.38(0.4H, dd, J = 3.0, 10.1 Hz), 4.75(2H, m), 4.18(0.4H, dd, J = 10.1, 15.7 Hz), 4.03(0.6H, dd, J = 12.3, 14.6 Hz), 3.72(2H, q, J = 6.9 Hz), 3.64-3.70(4H, m), 3.41-3.48(3H, m), 2.36-2.43(4H, m), 1.24(3H, t, J = 6.9 Hz)..
반응식 1~4에 따라, 실시예 1~7과 동일한 방법으로 이하의 화합물(I－8~I－28)을 얻었다.
N－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(4－디메틸아미노페닐)에틸］－N－히드록시포름아미드(I－8)
Figure 112013015062440-pct00024
MS
(ESI) m/z : 417(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.40(0.5H, s), 8.04(0.5H, s), 7.73-7.89(2H, m), 7.02-7.22(4H, m), 6.62(2H, d, J = 8.7 Hz), 5.49-5.58(0.5H, m), 5.22-5.31(0.5H, m), 4.73(2H, d, J = 9.2 Hz), 3.98-4. 23(1H, m), 3.37-3.55(1H, m), 2.93(3H, s), 2.91(3H, s), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz)..
N－［2－(4－부토--2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(3－디메틸아미노페닐)에틸］－N－히드록시포름아미드(I－9)
Figure 112013015062440-pct00025
MS
(ESI) m/z : 417(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.45(0.5H, s), 8.07(0.5H, s), 7.77-7.89(2H, m), 7.04-7.21(4H, m), 6.57-6.68(2H, m), 5.54-5.62(0.5H, m), 5.27-5.34(0.5H, m), 4.69-4.77(2H, m), 4.00-4.25(1H, m), 3.41-3.54(1H, m), 2.90-2.95(6H, m), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz)..
N－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(2－디메틸아미노페닐)에틸］－N－히드록시포름아미드(I－10)
Figure 112013015062440-pct00026
MS
(ESI) m/z : 417(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.31(0.6H, s), 8.08(0.4H, s), 7.88(0.6H, d, J = 9.2 Hz), 7.83(0.4H, d, J = 8.7 Hz), 7.07-7.42(6H, m), 6.57-6. 68(2H, m), 6.04(0.4H, dd, J = 2.7, 10 Hz), 5.88(0.6H, dd, J = 2.7, 11 Hz), 4.71-4. 78(2H, m), 3.99-4. 08(1H, m), 3.39-3. 51(1H, m), 2.61(2.4H, s), 2.54(3.6H, s), 1.86(3H, t, J = 2.3 Hz)..
N－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(4－피페리진-1－일메틸페닐)에틸］－N－히드록시포름아미드(I－11)
Figure 112013015062440-pct00027
MS
(ESI) m/z : 471(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.28(0.6H, s), 8.10(0.4H, s), 7.77-7.89(2H, m), 7.04-7.30(6H, m), 5.61-5.69(0.6H, m), 5.31-5.39(0.4H, m), 4.69-4.78(2H, m), 3.99-4.26(1H, m), 3.35-3.53(3H, m), 2.37(4H, br s), 1.87(3H, br s), 1.35-1. 59(6H, m)..
N－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(3－피페리진-1－일메틸페닐)에틸］히드록시포름아미드(I－12)
Figure 112013015062440-pct00028
MS
(ESI) m/z : 471(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.38(0.5H, s), 8.10(0.5H, s), 7.77-7.89(2H, m), 7.04-7.30(6H, m), 5.70(0.5H, dd, J = 3.7, 11 Hz), 5.30-5.38(0.5H, m), 4.69-4.77(2H, m), 4.01-4. 27(1H, m), 3.23-3.60(3H, m), 2.30(4H, br s), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz), 1.31-1. 55(6H, m)..
N－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(3－몰포린-4－일메틸페닐) 에틸］－N－히드록시포름아미드(I－13)
Figure 112013015062440-pct00029
MS
(ESI) m/z : 473(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.46(0.5H, s), 8.10(0.5H, s), 7.78-7.90(2H, m), 7.06-7.31(6H, m), 5.65(0.5H, dd, J = 3.7, 12 Hz), 5.35-5. 42(0.5H, m), 4.70-4.78(2H, m), 3.98-4.26(1H, m), 3.68(4H, dd, J = 4.6, 4.6 Hz), 3.39-3. 54(3H, m), 2.36-2.44(4H, m), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz)..
N－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－｛4－［(에틸메틸아미노)메틸］페닐］에틸｝－N－히드록시포름아미드(I－14)
Figure 112013015062440-pct00030
MS
(ESI) m/z : 445(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.35(0.5H, s), 8.11(0.5H, s), 7.78-7.89(2H, m), 7.06-7.28(6H, m), 5.65(0.5H, dd, J = 3.7, 12 Hz), 5.32-5.40(0.5H, m), 4.71-4.77(2H, m), 3.99-4.24(1H, m), 3.38-3.53(3H, m), 2.38(3H, q, J = 7.3 Hz), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz), 1.05(3H, t, J = 7.3 Hz)..
N－(2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－｛3－［(에틸메틸아미노)메틸］페닐｝에틸)－N－히드록시포름아미드(I－15)
Figure 112013015062440-pct00031
MS
(ESI) m/z : 445(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.37(0.5H, s), 8.11(0.5H, s), 7.78-7.90(2H, m), 7.06-7.34(6H, m), 5.70(0.5H, dd, J = 3.7, 12 Hz), 5.32-5.40(0.5H, m), 4.70-4.78(2H, m), 4.00-4.22(1H, m), 3.29-3.59(3H, m), 2.38(3H, q, J = 6.9 Hz), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz), 1.03(3H, t, J = 6.9 Hz)..
N－｛4－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노) 에틸］벤질｝－N－메틸메탄술폰아미드(I－16)
Figure 112013015062440-pct00032
MS
(ESI) m/z : 495(M＋H)+.
1H-NMR (DMSO-d6) : δ 8.22(0.5H, br s), 8.11(0.5H, br s), 7.75-7.86(2H, m), 7.09-7.42(4H, m), 7.13(2H, d, J = 9.2 Hz), 5.70(0.5H, br s), 5.40(0.5H, br s), 4.83-4.89(2H, m), 4.18(2H, s), 3.86-4.16(2H, m), 2.94(3H, s), 2.63(3H, s), 1.84(3H, t, J = 2.3 Hz)..
N－｛4－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노) 에틸］벤질｝－4－메틸벤젠술폰아미드(I－17)
Figure 112013015062440-pct00033
MS
(ESI) m/z : 557(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.37(0.6H, br s), 8.03(0.4H, br s), 7.69-7.88(4H, m), 7.04-7.33(8H, m), 5.61(0.6H, dd, J = 3.6, 12 Hz), 5.31-5.39(0.4H, m), 4.70-4.83(2H, m), 3.92-4.17(3H, m), 3.36-3.51(1H, m), 2.43(3H, s), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz)..
N－｛4－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노)에틸］벤질｝－4, N－디메틸벤젠술폰아미드(I－18)
Figure 112013015062440-pct00034
MS
(ESI) m/z : 571(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.47(0.6H, br s), 8.11(0.4H, br s), 7.78-7.89(2H, m), 7.70(2H, d, J = 8.2 Hz), 7.35(2H, d, J = 8.2 Hz), 7.23-7.32(4H, m), 7.06-7.17(2H, m), 5.64(0.6H, dd, J = 3.6, 12 Hz), 5.36-5.43(0.4H, m), 4.71-4.78(2H, m), 3.96-4.22(3H, m), 3.38-3.52(1H, m), 2.58(1.2H, s), 2.54(1.8H, s), 2.45(3H, s), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz)..
N－｛4－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노)에틸］벤질｝－N－메틸술포닐메탄술폰아미드(I－19)
Figure 112013015062440-pct00035
MS
(ESI) m/z : 559(M＋H)+.
1H-NMR (DMSO-d6) : δ 8.12(0.5H, br s), 8.21(0.5H, br s), 7.80(2H, br s), 7.35-7.44(1H, m), 7.32(2H, d, J = 9.2 Hz), 7.31(1H, s), 7.14(2H, d, J = 9.2 Hz), 5.41(0.5H, br s), 5.71(0.5H, br s), 4.87(2H, q, J = 2.3 Hz), 4.83(2H, s), 4.00-4.16(1H, m), 3.84-3.98(1H, m), 3.25(6H, s), 1.84(3H, t, J = 2.3 Hz)..
N－｛2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－［4－(2－디메틸아미노에틸) 페닐］에틸｝－N－히드록시포름아미드(I－20)
Figure 112013015062440-pct00036
MS
(ESI) m/z : 445(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.30(0.5H, s), 8.14(0.5H, s), 7.76-7.89(2H, m), 7.00-7.24(6H, m), 5.71(0.5H, dd, J = 3.7, 11 Hz), 5.29-5.36(0.5H, m), 4.69-4.76(2H, m), 4.02-4.21(1H, m), 3.42-3.59(1H, m), 2.43-2.54(2H, m), 2.10-2. 28(2H, m), 2.19(6H, s), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz)..
N－｛2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－［4－(2－몰포린-4－일에틸)페닐］에틸｝－N－히드록시포름아미드(I－21)
Figure 112013015062440-pct00037
MS
(ESI) m/z : 487(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.44(0.5H, s), 8.10(0.5H, s), 7.77-7.89(2H, m), 7.05-7.27(6H, m), 5.62(0.5H, dd, J = 3.7, 12 Hz), 5.32-5.39(0.5H, m), 4.69-4.78(2H, m), 3.96-4.23(1H, m), 3.71(4H, dd, J = 4.1, 4.6 Hz), 3.39-3. 53(1H, m), 2.69-2.77(2H, m), 2.43-2.56(6H, m), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz)..
N－(2－｛4－［2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노) 에틸］페닐｝에틸) 메탄술폰아미드(I－22)
Figure 112013015062440-pct00038
MS
(ESI) m/z : 495(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.39(0.5H, s), 8.07(0.5H, s), 7.78-7.89(2H, m), 7.05-7.30(6H, m), 5.65(0.5H, dd, J = 3.7, 12 Hz), 5.33-5.41(0.5H, m), 4.70-4.78(2H, m), 3.95-4.21(1H, m), 3.31-3.52(3H, m), 2.80-2.91(5H, m), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz)..
N－｛2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－［4－(3－디메틸아미노프로필) 페닐］에틸｝－N－히드록시포름아미드(I－23)
Figure 112013015062440-pct00039
MS
(ESI) m/z : 459(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.06-8.13(1H, m), 7.74-7.88(2H, m), 7.02-7.24(6H, m), 5.64-5.75(0.5H, m), 5.22-5.32(0.5H, m), 4.68-4.76(2H, m), 4.02-4.22(1H, m), 3.40-3.58(1H, m), 2.51(2H, dd, J = 7.3, 7.8 Hz), 2.17(2H, dd, J = 7.3, 7.8 Hz), 2.08(3H, s), 2.06(3H, s), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz), 1.52-1.66 (2H, m)..
N－｛2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－［4－(3－디에틸아미노프로필) 페닐］에틸｝－N－히드록시포름아미드(I－24)
Figure 112013015062440-pct00040
MS
(ESI) m/z : 487(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.29(0.5H, s), 8.07(0.5H, m), 7.75-7.89(2H, m), 7.04-7.24(6H, m), 5.64(0.5H, dd, J = 3.7, 11 Hz), 5.28-5.37(0.5H, m), 4.69-4.77(2H, m), 4.00-4.23(1H, m), 3.41-3.55(1H, m), 2.33-2.60(6H, m), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz), 1.61-1.72(2H, m), 0.91-1.01(6H, m)..
N－｛2－(4－부토-이닐옥시벤젠술포닐)－1－［4－(3－몰포린-4－일프로필) 페닐］에틸｝－N－히드록시포름아미드(I－25)
Figure 112013015062440-pct00041
MS
(ESI) m/z : 501(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.37(0.5H, s), 8.08(0.5H, s), 7.76-7.89(2H, m), 7.04-7.24(6H, m), 5.64(0.5H, dd, J = 3.7, 12 Hz), 5.29-5.38(0.5H, m), 4.68-4.77(2H, m), 3.98-4.23(1H, m), 3.67(4H, br s), 3.40-3.53(1H, m), 2.52-2. 63(2H, m), 2.24-2.46(6H, m), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz), 1.65-1.76(2H, m)..
N－｛2－(4－부토-2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－［4－(4－몰포린-4－일부틸)－페닐］－에틸｝－N－히드록시포름아미드(I－26)
Figure 112013015062440-pct00042
MS
(ESI) m/z : 515(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.41(0.5H, s), 8.10(0.5H, s), 7.77-7.89(2H, m), 7.05-7.24(6H, m), 5.57-5.66(0.5H, m), 5.31-5.38(0.5H, m), 4.69-4.77(2H, m), 3.97-4.23(1H, m), 3.67(4H, dd, J = 4.1, 4.6 Hz), 3.40-3.53(1H, m), 2.52-2. 63(2H, m), 2.24-2.46(6H, m), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz), 1.39-1.63(4H, m)..
N－｛4－［1－(포르밀히드록시아미노)－2－(4－펜토-2－이닐옥시벤젠술포닐) 에틸］벤질｝메탄술폰아미드(I－27)
Figure 112013015062440-pct00043
MS
(ESI) m/z : 495(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.29(0.6H, s), 8.00(0.4H, s), 7.75-7.88(2H, m), 7.23-7.35(4H, m), 7.05-7.16(2H, m), 5.66(0.6H, dd, J = 3.7, 12 Hz), 5.31-5. 41(0.4H, m), 4.71-4.80(2H, m), 4.26(2H, br s), 3.95-4.18(1H, m), 3.39-3. 50(1H, m), 2.89(3H, br s), 2.24(2H, tq, J = 1.8, 7.3 Hz), 1.14(3H, t, J = 7.3 Hz)..
N－｛4－［1－(포르밀히드록시아미노)－2－(4－옥토-2-이닐옥시벤젠술포닐) 에틸］벤질｝메탄술폰아미드(I－28)
Figure 112013038244313-pct00044
MS
(ESI) m/z : 537(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.35(0.6H, s), 8.03(0.4H, s), 7.76-7.88(2H, m), 7.27-7.36(4H, m), 7.06-7.17(2H, m), 5.66(0.6H, dd, J = 3.7, 12 Hz), 5.34-5. 42(0.4H, m), 4.72-4.82(2H, m), 4.23-4.33(2H, m), 3.94-4.18(1H, m), 3.38-3. 51(1H, m), 2.90(1.2H, s), 2.89(1.8H, s), 2.22(2H, tt, J = 2.3, 7.3 Hz), 1.45-1.55(2H, m), 1.23-1.38(4H, m), 0.87(3H, t, J = 7.3 Hz)..
(시험예 3)　ADAM17 저해 실험
실시예 1~7에서 얻어진 N－히드록시포름아미드 유도체의 ADAM17에 대한 저해 작용의 유무를 조사하였다.
즉, 먼저, ADAM17의 염기 배열은 모스(Moss) 등에 의해 보고되고 있는(Moss 등, Nature, 1997년, 385권, 733－736 페이지 참조) 것으로, 사람 단구 세포주 THP－1 세포로부터 정법에 따라 ADAM－17의 cDNA를 취득하고, 이것을 발현 벡터에 삽입하고, 그 다음에 이 벡터를 포유동물 세포 혹은 곤충 세포에 형질 전환시켜서, ADAM17를 발현시켜 취득하였다.
다음에, 얻어진 ADAM17을 효소로 이용하고 또 기질로는 막결합형 TNF의 ADAM17 절단 배열을 포함한 형광 합성 기질　Nma(N－메틸안트라닐산)－Leu－Ala－Gln－Ala－Val－Arg－Ser－Ser－Lys－Dnp(디니트로페닐)－D－Arg－NH2를 이용하여, 피시험물질 존재하에 또는 비존재하에서 ADAM17의 활성을 이하와 같이 측정하였다.
즉, 에세이버퍼 A(Assay buffer A)(200 mmol/L 염화나트륨, 5 mmol/L 염화 칼슘, 10μmol/L 황산아연, 2 mg/mL 소혈청알부민을 포함하는 50 mmol/L 트리스 염산완충액(pH 7. 5))에서 조제한 14 units의 효소액(25℃의 조건하에서 1 pmol의 기질을 1분간 분해하는 효소량을 1 unit라고 정의함) 90μL, 및 에세이버퍼 B(200 mmol/L 염화나트륨, 5 mmol/L 염화칼슘, 10μmol/L 황산아연, 0. 05% PLURONIC　F－68을 포함하는 50 mmol/L 트리스염산완충액(pH 7. 5))에서 20μmol/L로 조제한 형광 합성 기질 90μL를 혼합하고, 37℃에서 1.5시간 반응시켰다. 이 후, 형광 강도계(Fluoroskan　Ascent)에서, 여기 파장 355 nm, 측정 파장 460 nm의 조건으로 측정하고, 효소 활성을 구하였다. 그리고, 피시험 화합물의 존재하 및 비존재하의 효소 활성에 의해 저해율을 구하기 위해 50% 억제농도(IC50)를 산출하였다. 얻어진 결과를 표 1에 나타내었다.
Figure 112013038244313-pct00045
표 1에 나타낸 결과로부터 분명한 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물(N－히드록시포름아미드 유도체)인 I－1~I－7은 모두 저농도에서 ADAM17의 효소 활성을 저해하는 것으로 확인되었다.
(시험예 4) 각종 평가 시험
다음에 실시예 1~7에서 얻어진 N－히드록시포름아미드 유도체 중에서 ADAM17에 대한 저해 효과가 높았던 화합물　I－1(이하, 「S－45282」라고 칭함) 및 I－4(이하, 「S－45457」라고 칭함)에 있어서 아래와 같은 방법으로 그 저해제로서의 특이성과 세포에서의 TACE 저해 활성을 조사하였다. 비교를 위해서 비선택적인 메탈로프로테아제 저해제인 GM6001(EMD/Calbiochem사, 제품 번호 364205)도 평가하였다.
＜효소 저해 시험＞
이 시험에서 이용한 효소는 아래와 같다.
Matrix　metalloproteinase　1(MMP－1)(Calbiochem 사제, 제품 번호：444208)
Matrix　metalloproteinase　2(MMP－2)(Calbiochem 사제, 제품 번호：444213)
Matrix　metalloproteinase　3(MMP－3)(Calbiochem 사제, 제품 번호：444217)
Matrix　metalloproteinase　8(MMP－8)(Calbiochem 사제, 제품 번호：444229)
Matrix　metalloproteinase　9(MMP－9)(Calbiochem 사제, 제품 번호：444231)
Matrix　metalloproteinase　13(MMP－13)(Chemicon 사제, 제품 번호：CC068)
Matrix　metalloproteinase　14(MMP－14)(Calbiochem 사제, 제품 번호：475935)
Matrix　metalloproteinase　17(MMP－17)(Calbiochem 사제, 제품 번호：475940)
A　disintegrin　and　metalloproteinase　10(ADAM10)(후나코시(Funakoshi) 사제, 상품 코드：936－AD－020)
A　disintegrin　and　metalloproteinase　17(ADAM17, TACE)(시험예 3과 같이 카켄 제약(科硏製藥)에서 유전자 조작법을 이용하여 제작한 것을 사용하였다. 또한 시험예 3과 같이 25℃의 조건하에서 1 pmol의 기질을 1분간 분해하는 효소량을 1 unit라고 정의하였다. ).
또한, 이 시험에서 이용한 기질은 아래와 같다.
444221 기질(DNP－Pro－Cha－Gly－Cys(Me)－His－Ala－Lys(Nma)－NH2, 커스텀(Custom) 합성)：여기 파장 355 nm, 형광 파장 460 nm
TACE 기질(시험예 3에서 이용한 것과 동일)：　여기 파장 355 nm, 형광 파장 460 nm
3168 기질(MOCAc－Arg－Pro－Lys－Pro－Val－Glu－Nｖa－Trp－Arg－Lys(Dnp)－NH2, 펩티드 연구소 사제)：　여기 파장 320 nm, 형광 파장 405 nm
3163 기질(MOCAc－Pro－Leu－Gly－Leu－A2pr(Dnp)－Ala－Arg－NH2, 펩티드 연구소 사제)：　여기 파장 320 nm, 형광 파장 405 nm.
그리고, 상기 효소 및 기질을 이용하여 효소 반응을 실시하였다. 즉, 효소에 대해서는 제조원의 정보에 따라 미리 APMA(최종농도 1 mmol/L, p－aminophenylmercuric　acetate, Sigma－Aldrich 사제, A9563)로 활성화시킨 후, 형광 전용 96 well 플레이트에 에세이버퍼 A(200 mmol/L　염화나트륨, 5 mmol/L　염화칼슘, 10μmol/L　황산아연, 2 mg/mL　소혈청 알부민을 포함하는 50 mmol/L트리스 염산완충액(pH 7.5))으로 조제한 효소액 90μL에, 에세이버퍼 B(200 mmol/L　염화나트륨, 5 mmol/L　염화칼슘, 10μmol/L　황산아연, 0. 05% PLURONIC F－68을 포함하는 50 mmol/L　트리스 염산완충액(pH7. 5))에서 20μmol/L로 조제한 기질 90μL를 혼합하고, 25℃ 혹은 37℃에서 수시간 반응시켰다. 그리고, 반응 전후의 형광 강도를 형광 강도계로 측정하고, 효소 활성을 구하고 시험 물질의 존재하 및 비존재하의 효소 활성으로부터 저해율을 구해서 50% 억제 농도(IC50)를 산출하였다. 각 효소의 반응 조건은 표 2에 나타내었다.
Figure 112013038244313-pct00046
＜세포에 있어서의 TACE 저해 시험＞
THP－1 세포(사람 급성 단구형 백혈병 유래의 세포, ATCC 카탈로그 번호：TIB202)를 10ｖ／ｖ％　FBS 함유 RPMI1640에 현탁하고, 96 웰 배양 플레이트에 200μL/well(1×105개)씩 분주하고, PMA(최종농도 50 nmol/L)를 첨가하고, 37℃, 5%CO2 존재하에서 40 ~ 48시간 배양하며, THP－1 세포를 매크로파지형태의 세포로 분화시켰다. 분화 후에, 배양지를 버리고 세포를 THP－1 세정 버퍼(RPMI1640, 20 mM　HEPES－NaOH(pH 7.4))로 세정하였다. 세포의 세정 후, THP－1 에세이버퍼(RPMI1640, 20 mmol/L　HEPES－NaOH(pH 7.4), 0. 01w/　PF－68, 10ｖ／ｖ％　FBS)를 100μL/well 씩 첨가하였다. 그리고, 시험 물질(I－1 또는 I－4)을 함유하는 THP－1 에세이버퍼를 다시 50μL/well씩 첨가하고, 테이핑(tapping)에 의해 혼합하고, CO2 인큐베이터내에서 30 ~ 45분간 프리인큐베이트(Preincubate)한 후, LPS 가 들어 있는 THP－1 에세이버퍼를 50μL/well 추가하였(LPS의 최종 농도는 1μg/mL가 된다). 추가로, 플레이트를 테이핑하는 것으로 혼합하고, CO2 인큐베이터내에서 6시간 인큐베이트를 하였다. 인큐베이트 종료후, 배양 상청 중에 사람 TNF－α농도를 시판 키트(Human　TNF－α　CytoSet(BIOSOURCE 사제) 또는 Human　TNF－α　Ready－Set－Go! (eBioscience 사제))로 측정하였다.
이러한 시험 방법으로 얻어진 결과를 표 3에 나타내었다.
Figure 112013038244313-pct00047
표 3에 나타낸 결과로부터 분명한 바와 같이, 본 발명에 의한 화합물인 I－1 및 I－4는 모두 ADAM17 이외의 메탈로프로테아제와 비교해서, ADAM17에 대해서 높은 특이성을 가지고 있는 것이 확인되었다. 매크로파지 형태의 세포에 발현한 TACE에 대한 저해 활성도 확인되었다. 또한, 양화합물은 ADAM10에 대해서도 ADAM17에 비해 약간 약하게 억제되었다. ADAM10는 ADAM17와 동일한 기질을 절단하는 효소이며(Caescu 등, Biochemical　J. , 2009년, 424권, 79~88 페이지 참조), 그 저해는 혈소판 기능의 보존에 유용하다라고 하는 것이 시사되고 있다(Bender 등, 「Differentially　regulated　GPVI　ectodomain　shedding　by　multiple　platelet－expressed　proteinases.」, Blood, 2010년 7월 19일 전자판 참조). 그런데, 본 발명에 의한 화합물인 I－1 및 I－4는 ADAM17 특이적 저해제이며, 동일한 기본 골격을 가지는 다른 본 발명에 의한 화합물(예를 들면, I－2, I－3, I－5, I－6)도 ADAM17 특이적 저해제인 것이 시사되었다. 한편, 히드록삼산 구조를 가지는 GM6001는 종래 알려져 있는 바와 같이 비특이적으로 메탈로프로테아제를 강하게 저해하였으나, ADAM17에 대한 저해 활성은 약한 것이었다.
(시험예 5)　GM6001 및 S－45282의 ES세포 유래 혈소판에 대한 기능 유지 효과에 대한 검증
상술한 바와 같이, 얻어진 ES세포 유래의 조혈 전구 세포를 도 6에 나타낸 조건 하(프로토콜 1)에서 혈소판의 유도를 실시하였다. 즉, 조혈 전구 세포를 거핵구/혈소판에 유도하는 상술한 8일간의 배양 과정에 있어서,
2 days：플로우사이토메트리 해석하기 2일전(도 6에서 나타낸 「d22」)에 GM6001, S－45282 또는 DMSO를 첨가해 배양, 또는
8 days：ES 세포 유래의 조혈 전구 세포를 다시 파종하고 나서 8일간(도 6에서 나타낸 「d15」이후), GM6001(50μM), S－45282(5μM 또는 50μM), 또는 DMSO를 첨가해 배양
이와 같은 조건하에서 각각 배양을 실시하고, 상술한 바와 같이 회수하고, 플로우사이토메트리에서, CD41(＋) CD42b(＋)의 수, CD41(＋) CD42b(－)의 수 및 혈소판의 총수를 측정하였다. 얻어진 결과를 도 7 ~ 도 10에 나타내었다. 또한, CD41(인테그린αIIb)는 혈소판의 표면 마커이기 때문에, CD41(＋)는 혈소판인 것을 나타내고 있다. 또, CD42b(GPIbα)(＋)는, GPIbα가 표면에 존재하고 있는 혈소판인 것을 나타내고, CD42b(GPIbα)(－)는, ADAM17에 의해 GPIbα가 쉐딩되어 버린 혈소판인 것을 나타낸다. 또한 도면 중에서, 「GM」는 50μM　GM6001(용매：DMSO)를 첨가한 결과를 나타내며, 「45282」는 각 농도의 S－45282(용매：DMSO)를 첨가한 결과를 나타낸다.
도 7 및 도 9에 나타낸 결과로부터 분명한 바와 같이, GM6001 및 S－45282는 각각 ADAM17에 의한 GPIbα의 쉐딩을 저해하고 있는 것이 확인되었다. 더욱이 S－45282는 5μM에서도 50μM　GM6001에 상당하는 저해 효과를 가지고 있는 것이 명확해 졌다.
또한, 도 8 및 도 10에 나타낸 결과로부터 분명한 바와 같이, 50μM의 GM6001와 5μM의 S－45282의 2일간 첨가에서는, 거의 동수의 혈소판을 얻을 수 있지만, 8일간 첨가했을 경우에 대해서는, GM6001는 5μM의 S－45282와 비교해서 혈소판 수가 적고, 50μM의 GM6001는 세포 독성을 가지고 있는 것이 밝혀졌다.
(시험예 6)　S－45457 및 S－45282의 ES 세포 유래 혈소판에 대한 기능 유지 효과에 대한 검증
상술한 바에 따라 얻어진 ES 세포 유래의 조혈 전구 세포를 도 6에 나타낸 조건 하(프로토콜 1)에서 혈소판의 유도를 실시하였다. 즉, ES 세포 유래의 조혈 전구 세포를 다시 파종하고 나서 8일간(도 6에서 나타낸「d15」이후), GM6001(50μM), S－45457(5μM 또는 50μM), S－45282(5μM), 또는 DMSO를 첨가하여 배양을 실시하고, 상술한 바에 따라 회수하고, 플로우사이토메트리에서, CD41(＋) CD42b(＋)의 수, CD41(＋) CD42b(－)의 수, 및 혈소판의 총수를 측정하였다. 얻어진 결과는 도 11 및 도 12에 나타내었다. 또한 도면 중에서 「45457」은 각 농도의 S－45457(용매：DMSO)을 첨가한 결과를 나타낸 것이다.
도 11 및 도 12에 나타낸 결과로부터 분명한 것과 같이, S－45457도, GM6001 및 S－45282와 같이 ADAM17에 의한 GPIbα의 쉐딩을 저해하고 있는 것이 확인되었다.
(시험예 7)　S－45457의 혈소판에 대한 기능 유지 효과에 있어서의 농도 의존성에 대한 검증
상술한 바에 따라 얻어진 ES 세포 또는 iPS 세포 유래의 조혈 전구 세포를 도 6에 나타낸 조건하에서 혈소판의 유도를 실시하였다. 즉, ES 세포 또는 iPS 세포 유래의 조혈 전구 세포를 다시 파종하고 나서 8일간(도 6에서 나타낸 「d15」이후), GM6001(50μM), S－45457(1.5~50μM), 또는 DMSO를 첨가하여 배양을 실시하고, 상술한 바와 같이 회수하고, 플로우사이토메트리에서 CD41(＋) CD42b(＋)의 수, CD41(＋) CD42b(－)의 수, 및 혈소판의 총수를 측정하였다. 4회 실시하여 얻어진 결과를 도 13 ~ 16에 나타내었다. 추기로 혈소판 총수에서 차지하는 CD42b(＋)의 비율에 있어서의 통계 처리는 각 변화한 값을 분산 분석으로 실시하고, Dunnet법으로 DMSO군과 시험 물질군의 군간 차이를 다중 비교하였다.
도 14 및 16에 나타낸 결과로부터 분명한 것과 같이, ES 세포를 이용한 배양계(도 14)와 동일하게 iPS 세포를 이용한 배양계(도 16)에 대해서도, 본 발명에 의한 화합물인 S－45457을 첨가하는 것에 의해 그 첨가한 농도에 따라 ADAM17에 의한 GPIbα의 쉐딩을 저해하고 있는 것이 확인되었다. 게다가 도 13 및 15에 나타낸 결과로부터 분명한 것과 같이, 본 발명에 의한 화합물인 S－45457은 ES 세포 및 iPS 세포 및 이것들로부터 분화 유도되는 세포에 대한 독성은 낮은 것으로 확인되었다.
(시험예 8)　S－45457의 사람 말초혈 유래의 혈소판에 대한 기능 유지 효과에 있어서의 농도 의존성에 대한 검증
상술한 바와 같은 배양계를 이용하여 얻어진 혈소판 뿐만이 아니라, 채혈에 의해 얻어진 말초혈 유래의 혈소판에 대해도 본 발명에 의한 화합물은 기능 유지 효과를 발휘하는지를 검증하였다. 즉, 도 6에 나타낸 ＜프로토콜 2＞와 같이, 먼저, 채혈하여 얻어진 사람 말초혈에 그의 1/10양으로 ACD를 첨가하고 브레이크 없이 900 rpm으로 10분간 원심 하였다. 원심해서 얻어진 상청을 추가로 브레이크 없이 1500 rpm으로 10분간 원심한 후, 상청을 제거하였다. 얻어진 침전물을 Tyrode－HEPES 버퍼(칼슘 포함하지 않음)에 현탁시키고, 현탁액 중의 혈소판 수를 세어 5×107~1×108개/Tyrode－HEPES 버퍼(칼슘 포함하지 않음) 200μL가 되도록 혈소판을 포함한 현탁액(세정 혈소판, Washed　Platelet)를 조제하였다. 다음에, 이와 같이 조제하여 얻어진 세정 혈소판에 100μM　CCCP(Carbonyl　cyanide　m－chlorophenyl　hydrazone)와 함께 50μM　GM6001, 1. 5~50μM　S－45457 또는 DMSO를 첨가하여 37℃으로 24시간 인큐베이션하고, 플로우사이토메트리에서, CD41(＋) CD42b(＋)의 수, CD41(＋) CD42b(－)의 수를 측정하였다. 또한, CCCP의 첨가에 의해 혈소판 표면상의 GPIbα의 쉐딩은 항진되는 것이 알려져 있다(Bergmeier등, Blood, 2003년, 102권, 4229~4235 페이지 참조). 얻어진 결과를 도 17에 나타내었다. 통계 처리는 시험예 7과 같다.
도 17에 나타낸 결과로부터 분명한 것과 같이, 본 발명에 의한 화합물은 GM6001와 같이 사람 말초혈 유래의 혈소판에 대한 기능 유지 효과, 특히 37℃에 있어서의 기능 유지 효과를 가지고 있는 것이 확인되었다.
(시험예 9)　S－45457및 p38 저해제의 사람 말초혈 유래의 혈소판에 대한 기능 유지 효과의 검증
p38를 저해하는 것에 의해 GPIbα의 쉐딩은 저해되는 것이 알려져 있다(Matthias　C. 등, TRANSFUSION　MEDICINE, BLOOD, 2010년 3월 4일, 115권, 9호, 1835~1842 페이지 참조). 여기서, 사람 말초혈 유래의 혈소판에 대한 기능 유지 효과에 대해 p38 저해제와 본 발명에 의한 화합물을 비교하였다. 즉, 시험예 8에서와 같이 조제하여 얻어진 세정 혈소판에 100μM　CCCP와 함께 40μM　p38 저해제 2종(p38MAP 키나제 저해제, Calbiochem 사제, 제품 번호 SB202190 및 SB203580), 50μM　S－45457, 또는 DMSO를 첨가하고 37℃으로 24시간 인큐베이션 하고, 플로우사이토메트리에서, CD41(＋) 및 CD42b(＋)의 닷 플롯 해석을 실시하였다. 얻어진 결과를 도 18에 나타내었다. 또한. 도 18 중에서 X축은 CD41을 나타내, Y축은 CD42b를 나타낸다. 또한, 도면 중에서 「202190」 「203580」은 40μM각 p38 저해제(용매：DMSO)를 첨가한 결과를 나타낸 것이다.
더욱이 시험예 8과 동일하게 조제하여 얻어진 세정 혈소판에 100μM　CCCP와 함께 40μM　상기 p38 저해제 2종, 50μM　GM6001, 0.5~50μM　S－45457 또는 DMSO를 첨가하고, 37℃으로 24시간 인큐베이션하고, 플로우사이토메트리에서 해석하여 혈소판에 있어서의 CD41(＋) CD42b(＋)의 비율을 산출하였다. 얻어진 결과를 도 19에 나타내었다.
도 18 및 도 19에 나타낸 결과로부터 분명한 것과 같이, p38 저해제의 첨가에 있어서의 GPIbα(CD42b)(＋) 세포의 수는 DMSO 첨가의 그것과 비교해서 많은 것으로부터 p38 저해제도 사람 말초혈 유래의 혈소판에 대한 기능 유지 효과를 가지고 있는 것이 확인되었다. 그렇지만, 본 발명에 의한 화합물의 첨가에 의한 효과는 p38 저해제의 첨가에 의한 효과보다 우수한 것이었다.
(시험예 10)　S－45457 및 p38 저해제의 ES 세포 유래의 혈소판에 대한 기능 유지 효과에 대한 검증
상술한 바에 따라 얻어진 ES 세포 유래의 조혈 전구 세포를 도 6에 나타낸 조건하(프로토콜 1)에서 혈소판의 유도를 실시하였다. 즉, ES 세포 유래의 조혈 전구 세포를 다시 파종하고 나서 8일간(도 6에서 나타낸 「d15」이후), 50μM　GM6001, 0.15~50μM S－45457, 40μM　상기 p38 저해제 2종, 50μM　GM6001, 또는 DMSO를 첨가하여 배양을 실시하고, 상술한 대로 회수하고, 플로우사이토메트리에서, 혈소판의 총수, 혈소판에 있어서의 CD41(＋) CD42b(＋)의 비율을 측정, 산출하였다. 얻어진 결과를 도 20 및 도 21에 나타내었다.
도 20에 나타낸 결과로부터 분명한 것바와 같이, p38 저해제의 첨가에 의해 얻어진 혈소판의 수는 현저하게 적은 것이 되며, 현저한 세포 독성이 확인되었다. 또, 도 21에 나타낸 결과로부터 분명한 것과 같이, 본 발명에 의한 화합물의 첨가에 의한 ES 세포 유래의 혈소판에 대한 기능 유지 효과는 인정되지만, p38 저해제의 첨가에 의한 효과는 전혀 인정되지 않았다.
(시험예 11)　S－45457 및 S－45282의 사람 말초혈 유래의 혈소판에 대한 기능 유지 효과에 대한 검증
S－45457및 S－45282의 사람 말초혈 유래의 혈소판에 대한 기능 유지 효과를 조사하기 위하여 시험예 8과 동일하게 하여 세정 혈소판에 100μM　CCCP와 함께, 50μM　GM6001, 5μM 혹은 50μM　S－45457, 50μM　S－45282, 또는 DMSO를 첨가하고, 37℃에서 24시간 인큐베이션하고, 프롱우사이트메트리에서, 혈소판의 총수 및 CD42b(＋)의 수를 측정하고, 혈소판에 있어서의 CD42b(＋)의 비율을 산출하였다. 얻어진 결과를 도 22에 나타내었다.
도 22에 나타낸 결과로부터 분명한 것과 같이, 본 발명에 의한 화합물은 GM6001와 같이 사람 말초혈 유래의 혈소판에 대한 기능 유지 효과, 특히 37℃에 있어서의 기능 유지 효과를 가지고 있는 것이 확인되었다.
(시험예 12) 사람 말초혈 PRP에 대한 기능 유지 효과에 대한 검증
사람 말초혈 PRP(platelet－rich　plasma, 다혈소판 혈장)을 이용하여 각 화합물이 가지는 혈소판에 대한 기능 유지 효과의 지속성에 대해 조사하였다. 즉, 먼저, 채혈해 얻어진 말초혈에 그의 1/10양으로 ACD를 첨가하고 실온하에서 브레이크 없이 900 rpm으로 10분간 원심하였다. 다음에, 이와 같이 하여 얻어진 상청(PRP)에, 50μM　GM6001, 50μM　S－45457, 5μM　S－45282, 40μM　상기 p38 저해제 2종, 또는 DMSO를 첨가하고, 37℃으로 24시간 또는 72시간 인큐베이션하고, 플로우사이토메트리에서 CD41(＋) CD42b(＋)의 수, CD41(＋) CD42b(－)의 수를 측정하여 혈소판에 있어서의 CD41(＋) CD42b(－) 또는 CD41(＋) CD42b(＋)의 비율을 산출하였다. 얻어진 결과를 도 23에 나타내었다. 또한 도 23 중에서 「fresh」는 사람 말초혈 PRP를 인큐베이션 하지 않고 플로우사이토메트리에서 해석한 결과를 나타낸 것이다.
도 23에 나타낸 결과로부터, 본 발명에 의한 화합물인 S－45457은 72시간 인큐베이션해도 ADAM17에 의한 GPIbα(CD42b)의 쉐딩을 억제하는 것이 계속되는 것으로 밝혀졌다. 또, 본 발명에 의한 화합물인 S－45282도 5μM라고 하는 첨가 농도를 고려하면 사람 말초혈 PRP에 대한 기능 유지 효과를 높게 가지고 있는 것이 밝혀졌다. 한편, p38 저해제의 효과는 약하거나 혹은 거의 관찰할 수 없는 레벨 밖에 인정되지 않았다.
(시험예 13) 사람 말초혈 유래의 혈소판에 대한 기능 유지 효과의 검증
시험예 8과 같이 하여 얻어진 세정 혈소판에 100μM　CCCP와 함께, 50μM GM6001, 50μM　S－45457, 5μM　S－45282, 40μM　상기 p38 저해제 2종, 또는 DMSO를 첨가하고, 37℃에서 24시간 인큐베이션하고, 플로우사이토메트리에서, CD41(＋) 및 CD42b(＋)의 닷 플롯 해석을 실시하였다. 얻어진 결과를 도 24에 나타내었다. 또한 도 24 중에서, X축은 CD41를 나타내고, Y축은 CD42b를 나타낸다. 또 도 24 중에서, 「fresh」는 세정 혈소판을 인큐베이션하지 않고 플로우사이토메트리에서 해석한 결과를 나타낸 것이다.
도 24에 나타낸 결과로부터 분명한 것과 같이, 본 발명에 의한 화합물인 S－45457은 ADAM17에 의한 GPIbα(CD42b)의 쉐딩을 억제하고 있는 것이 확인되었다. 또, S－45457에는 뒤떨어지지만, 본 발명에 의한 화합물인 S－45282도 높은 사람 말초혈 유래의 혈소판에 대한 기능 유지 효과를 가지고 있는 것이 확인되었다. 더욱이 p38 저해제의 효과는 약한 것이 확인되었다.
(시험예 14)　S－45457의 사람 말초혈 유래의 혈소판에 대한 기능 유지 효과에 있어서의 농도 의존성에 대한 검증
시험예 8과 동일하게 하여 세정 혈소판에 100μM　CCCP와 함께, 50μM　GM6001, 0. 5~50μM　S－45457, 또는 DMSO를 첨가하여 37℃에서 24시간 인큐베이션하고, 플로우사이토메트리에서, CD41(＋) 및 CD42b(＋)의 닷 플롯 해석을 실시하고, S－45457의 사람 말초혈 유래의 혈소판에 대한 기능 유지 효과를 조사하였다. 얻어진 결과를 도 25에 나타내었다. 또한 도 25 중에서 X축은 CD41를 나타내고, Y축은 CD42b를 나타낸다.
도 25에 나타낸 결과로부터 분명한 것과 같이, 본 발명에 의한 화합물은 그 농도 의존적으로 ADAM17에 의한 GPIbα(CD42b)의 쉐딩을 억제하고 있는 것이 확인되었다.
(시험예 15) 플로우 챔버를 이용한, S－45457에 의한 혈소판 접착능의 유지 효과의 검증
통상, 혈관벽이 손상하면 혈관내피 세포 하의 콜라겐 조직의 노출이 생겨 혈장중의 본·빌레브란트 인자(VWF)가 콜라겐 조직에 결합하게 된다. 그리고, VWF와 GPIbα(CD42b)와의 상호작용 및 VWF와α2bβ3 인테그린과의 상호작용을 통해서 혈소판이 혈관에 접착하는 것으로 해석된다. 또한, 혈관에 접착한 혈소판을 기점으로서 VWF와 GPIbα와의 상호작용 및 VWF와α2bβ3 인터그린과의 상호작용을 통해서 혈소판끼리도 접착을 하여서 혈전이 발달해 나가는 것으로 해석된다(Ruggeri　ZM. , Nature　Medicine, 2002년 11월, 8권, 11호, 1227~1234 페이지 참조).
여기서, 시험예 1~14에 나타낸, 본 발명에 의한 화합물(S－45457 등)에 의한 GPIbα쉐딩에 대한 억제 효과는, VWF와 GPIbα(CD42b)와의 상호작용을 유지하고, 혈소판의 접착능의 유지에 유지에 기여하고 있는지를, 혈전 형성 경과를 정량적으로 평가할 수 있는 플로우 챔버를 이용하여 평가하였다.
즉, 먼저, 채혈하여 얻어진 사람 말초혈에 ACD를 첨가하고 브레이크 없이 900 rpm으로 10분간 원심하여 상청을 회수하였다. 얻어진 상청에 1μM　프로스타글란딘E1(PGE1)를 첨가하고, 브레이크 없이 1500 rpm으로 10분간 원심한 후, 상청을 제거하였다. 얻어진 침전물을 Tyrode　HEPES　Ca(－) 완충액 중에 현탁하여 100μM　CCCP를 첨가하고, 동시에 DMSO 혹은 15μM　S－45457을 첨가한 후, 37℃에서 24시간 인큐베이션 하였다. 또한 이 때 CCCP와 DMSO를 첨가하여 인큐베이션 한 것을 음성(陰性) 대조군으로서 아무것도 첨가하지 않고 인큐베이션 처리를 실시하지 않았던 것을 양성(陽性) 대조군으로서 준비하였다.
그리고, 인큐베이션 후(양성 대조군는 인큐베이션 하지 않고), 현탁액에 1/2000로 희석한 TMRE(테트라메틸로다민에틸에스테르, 과염소산)를 첨가하고, 실온하에서 15분간 인큐베이트하여 혈소판을 형광 표식하였다. 그 후, Tyrode　HEPES　Ca(－) 완충액을 첨가하고 브레이크 없이 1500 rpm로 8분간 원심하여, 세정을 실시하였다.
다음에, 형광 표식한 각 혈소판 샘플을 아르가트로반(argatroban : 항트론빈약)에서 항응고 처리를 실시하여 채취한 사람 말초혈의 전혈 샘플에, 전혈 혈소판의 10%의 수가 되도록 추가하여 혼합하였다. 그리고, 이와 같이 조제한 혈액 샘플을 일정한 벽전단 속도(1500 S－1)로, 시린지펌프(Syringe pump; Harｖard　Apparatus 사제)에 의해 VWF으로 표면을 코팅 한 챔버 내에 주입하고, 이 표면 위에 VWF를 매개로 접착하고, 혈전을 형성하는 형광 표식한 혈소판을 도립 스테이지에피 형광 비디오 현미경 시스템(DM　IRB, Leica 사제)를 이용하여 가시화하고, 그 현미경 상을 감광성 칼라 CCD 카메라(L－600, Leica 사제)를 이용하여 디지털화하고, 추가로 이미지-J소프트웨어(NIH 이미지)를 이용하여 혈소판에 의한 표면적 커버율을 산출하였다. 또한 이러한 시험은 2회씩 실시하고, 양성 대조군(fresh한 혈소판)에 있어서의 표면적 커버율의 최대치를 각각 100%로 하여 각 샘플의 생 데이터를 환산하고, 2회의 시험으로부터 얻어진 값의 평균치를 산출하였다. 얻어진 결과는 도 26 및 도 27에 나타내었다. 또한, 도 26 및 27 중에서 세로축은 상기 평균치를 나타내고, 「S－45457」은 15μM　S－45457을 첨가하여 조제한 혈소판에 있어서의 결과를 나타내며, 「DMSO」는 음성 대조군에 있어서의 결과를 나타내고, 「fresh」는 양성 대조군(fresh인 혈소판)에 있어서의 결과를 나타낸 것이다. 또, 도 26 중에서 횡축은 챔버 내에 주입하고 나서의 계측 시간(단위：분)을 나타낸ㄱ것이다.
도 26 및 도 27에 나타낸 결과로부터 분명한 것과 같이 본 발명에 의한 화합물(S－45457)은 음성 대조군인 DMSO를 첨가하여 CCCP와 함께 인큐베이션 한 결과와 비교해서 혈소판에 의한 표면적 커버율은 큰 것이었다. 그런데, 본 발명에 의한 화합물은 ADAM17에 의한 GPIbα의 쉐딩을 억제하고, 나아가서는 GPIbα와 VWF와의 회합도 가능하고, 혈소판의 접착능을 유지할 수가 있는 것이 밝혀졌다.
(시험예 16) 생체 분자 이메징 수법을 이용한 S－45457에 의한 혈소판 접착능의 유지 효과의 검증
본 발명자등에 의해 개발된 혈전 형성 모델 및 생체 분자 이메징(Imaging) 수법을 이용하여 본 발명에 의한 화합물(S－45457등 )에 따른 혈소판 접착능의 유지 효과 특히 혈소판의 혈관에의 접착능을 in vivo에 대해 평가하였다.
또한, 본 시험예에서 이용한 혈전 형성 모델은, 레이저 조사와 헤마트포르피린(Hematoporphyrin) 등을 이용하여 활성 산소(ROS)를 혈관 내에 국소적으로 발생시켜, 혈관내 가죽 세포에 장해를 일으키는 것으로, 혈소판을 혈관에 접착시켜, 혈전 형성을 유발시키는 것이다. 또, 본 시험예에서 이용한 생체 분자 이메징 수법은 고속 레이저 공초점 현미경 및 멀티빔 식의 공초점 유니트를 이용하여 혈류의 방향과 평행에 매우 좁은 단면에 초점을 맞추어 고속 화상을 취득하는 것이 가능하기 때문에, 혈관내를 변형하면서 흐르는 혈소판 등에 각각 포커스를 맞추어 관찰하는 것에 의해 단일 혈소판 레벨에서의 생체 이메징을 가능하게 하는 것이다(Takizawa 등, The　Journal　of　Clinical　Inｖestigation, 2010년 1월, 120권, 1호, 179~190 페이지 참조). 이하, 본 시험예에서 이용한 혈전 형성 모델 및 생체 분자 이메징 수법에 대해 설명한다.
먼저, 혈전 형성 모델 생쥐에 주입하기 위한 혈소판을 조제하였다. 즉, 채혈하여 얻어진 사람 말초혈에 10ｖ/ｖ％이 되도록 ACD를 첨가하고 브레이크 없이 900 rpm으로 10분간 원심하여 상청을 회수하였다. 얻어진 상청에 1μM　PGE1를 첨가하고 브레이크 없이 1500 rpm으로 10분간 원심한 후, 상청을 제거하였다. 얻어진 침전물을 Tyrode　HEPES　Ca(－) 완충액에 현탁하고, 100μM　CCCP와 DMSO 또는 15μM　S－45457을 첨가한 후, 37℃에서 24시간 인큐베이션 하였다. 추가로 이 때 CCCP와 DMSO를 첨가하고 인큐베이션 한 것을 음성 대조군로서 아무것도 첨가하지 않고 인큐베이션 처리를 실시하지 않았던 것을 양성 대조군로서 준비하였다. 인큐베이션 후(양성 대조군는 인큐베이션 하지 않고), 이러한 침전물에 있어서의 혈소판의 수를 계측하고, 2 ml　Tyrode　HEPES　Ca(－) 완충액(1μM　PGE1 함유) 중에 현탁시켰다. 그리고, 이러한 현탁액에 5μM　TMRE를 첨가하고, 실온하에서 15분간 인큐베이트를 하여 혈소판을 형광 표식하였다. 그 후, Tyrode　HEPES　Ca(－) 완충액을 첨가하여 브레이크 없이 1500 rpm으로 8분간 원심하여 세정을 실시하였다.
다음에, 혈전 형성 모델 생쥐를 조제하였다. 즉, 미리 2 Gy의 방사선 처치에 의해 혈소판 감소 처치를 실시해 둔 NOG 생쥐(중증 복합 면역 부전 생쥐)를 마취하여 복부벽을 소절개하여, 장간막에 있어서의 미소 순환 및 혈전 형성을 시각적으로 해석할 수 있도록 하였다. 더욱이 NOG 생쥐 유래의 혈구의 동태를 가시화하기 위해서, FITC－덱스트란(20 mg/kg 체중)을 이 NOG 마우스의 꼬리 정맥에 주입하였다. 그리고, 앞에서와 같이 형광 표식을 한 혈소판을 이 NOG 생쥐에, 이 생쥐의 순환 혈소판수의 15%의 수가 되도록 주입하였다. 더욱이 혈전 형성을 유발시키기 위해서, 헤마트포르피린(1.8mg/kg체중)을 이 NOG 생쥐에 투여하였다. 추가로 이와 같이 생쥐를 처리하는 것에 의해 혈구 동태 및 혈전 형성은 레이저 조사 및 ROS 생산 중에 가시화되게 된다.
그리고, 레이저 조사 시 이러한 가시화 화상(씨퀀셜(sequential) 화상)은, 회전 디스크 공초점 현미경(요코가와 전기주식회사제, CSU－X1) 및 EM(Electron　Multiplying)－CCD 카메라(iXon, Andor 사제)를 이용하여, 20초간, 30프레임/초로, 먼저 실시한 소절개 부위(~3 mm)를 통해 관찰 및 촬영하는 것에 의해 얻었다.또한, 이러한 관찰은, S－45457을 첨가하여 조제한 혈소판을 주입한 생쥐, 음성 대조군, 양성 대조군에 대해, 폐쇄성 혈전을 형성한 20개의 독립한 혈관을 대상으로 실시하였다. 얻어진 결과는 도 28 및 도 29에 나타내었다. 또한 도 28 및 도 29 중에서 「S－45457」은 15μM　S－45457을 첨가하여 조제한 혈소판을 주입한 생쥐에 의한 혈전 형성을 나타내고, 「DMSO」는 음성 대조군에 있어서의 혈전 형성의 결과를 나타내며, 「fresh」는 양성 대조군에 있어서의 혈전 형성의 결과를 나타낸 것이다. 또, 대표적인 예로 도 28 중에서 흰 화살표는 혈류의 방향을 나타내고, 흰 삼각형이 가리키고 있는 장소는 사람 유래의 혈소판이 혈관에 부착하고 있는 장소를 나타내며, 스케일 바는 10μm를 나타낸 것이다. 또한, 도 29 중에서 세로축은 혈전 형성에 관여한 혈소판 총수에 차지하는 사람 혈소판수의 비율(%)이며, 값은, 20개의 평균＋표준오차이다.
도 28및 도 29에 나타낸 결과로부터 분명한 것과 같이, 본 발명에 의한 화합물(S－45457)을 첨가하여 조제한 혈소판을 주입한 생쥐에 대해서는, 음성 대조군와 비교해서 사람 유래의 혈소판이 혈전 형성에 기여하는 비율이 컸다. 그런데, 본 발명에 따른 화합물은, ADAM17에 의한 GPIbα의 쉐딩을 억제하는 것에 의해 혈소판의 혈관에의 접착능을 유지할 수가 있다는 것이 밝혀졌다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 의하면 ADAM17의 메탈로프로테아제 활성을 특이적으로 억제하여, GPIbα의 쉐딩을 억제하는 것에 의해 혈소판의 기능을 유지하는 것이 가능해진다. 따라서, 본 발명은 기능적으로 안정되어, 안전성이 높은 혈소판을 번잡한 작용을 요구하지 않고 효율 좋게 대량으로 생산하기 위한 시약이나 혈액제제에 있어서의 혈소판의 기능을 유지하고 그 품질의 안정화를 도모하는 의약품 첨가제 등으로서 유용하다.

Claims (12)

  1. N－［2－(4－부토－2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(4－디에틸아미노메틸페닐) 에틸］－N－히드록시포름아미드와 N－｛4－［2－(4－부토－2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노)에틸］벤질｝메탄술폰아미드 중 어느 하나로 부터 선택되는 화합물을 유효 성분으로 포함하는 혈액 응고와 관련된 혈소판의 기능을 유지하기 위한 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 혈액 응고와 관련된 혈소판의 기능을 유지하기 위한 시약 및 혈소판을 함유한 혈액제제에의 첨가제 중에서 어느 하나의 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 거핵구로 분화될 수 있는 세포로부터 거핵구로의 분화를 유도하고, 해당 거핵구로부터 혈소판을 생산하기 위한 배양계에, N－［2－(4－부토－2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(4－디에틸아미노메틸페닐)에틸］－N－히드록시포름아미드와 N－｛4－［2－(4－부토－2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노)에틸］벤질｝메탄술폰아미드 중 어느 하나로 부터 선택되는 화합물 첨가하여서 되는 것을 특징으로 하는 혈소판을 조제하는 방법.
  5. 삭제
  6. 제4항에 있어서, 상기 배양계에서 배양 온도가 35 ~ 38℃인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 거핵구로 분화될 수 있는 세포로부터 거핵구로의 분화를 유도하고, 해당 거핵구로부터 혈소판을 생산하는 배양계에 N－［2－(4－부토－2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(4－디에틸아미노메틸페닐)에틸］－N－히드록시포름아미드와 N－｛4－［2－(4－부토－2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노)에틸］벤질｝메탄술폰아미드 중 어느 하나로 부터 선택되는 화합물을 첨가한 배양물.
  8. 삭제
  9. N－［2－(4－부토－2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(4－디에틸아미노메틸페닐)에틸］－N－히드록시포름아미드와 N－｛4－［2－(4－부토－2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노)에틸］벤질｝메탄술폰아미드 중 어느 하나로 부터 선택되는 화합물이 첨가된 혈소판을 함유하는 혈액제제.
  10. 삭제
  11. N－［2－(4－부토－2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(4－디에틸아미노메틸페닐)에틸］－N－히드록시포름아미드와 N－｛4－［2－(4－부토－2－이닐옥시벤젠술포닐)－1－(포르밀히드록시아미노)에틸］벤질｝메탄술폰아미드 중 어느 하나로 부터 선택되는 화합물을 혈소판을 함유하는 혈액제제에 첨가하는 것을 특징으로 하는, 혈액제제에서 혈액 응고와 관련된 혈소판의 기능을 유지하기 위한 방법.
  12. 삭제
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