JPWO2011142117A1 - 細胞培養基材及びそれを用いた細胞培養方法 - Google Patents
細胞培養基材及びそれを用いた細胞培養方法Info
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Abstract
本発明は、効率よく細胞を培養することができる細胞培養基材を提供する。本発明の細胞培養基材は、基板と、基板上に形成された複数の繊維状突起物と、繊維状突起物表面に形成された撥水膜とを有する。複数の繊維状突起物は互いに絡み合うマトリクス構造である。このような細胞培養基材によれば、撥水性の繊維状突起物に検体を含む培養液を吐出することによって、細胞の非接触下での培養が容易となり、効率よく細胞を培養することができる。
Description
本発明は、血液由来細胞や組織由来細胞、またはｉＰＳ細胞やＥＳ細胞といった各種細胞の培養に用いられる細胞培養基材及びそれを用いた細胞培養方法に関する。
従来、ヒト、動物由来の細胞を単離して培養させる際には、以下のような方法を用いる。まず、生理食塩水中に、栄養分であるグルコースや、細胞の成長を促す成長剤や、雑菌の繁殖を防ぐ抗生物質などを添加して培養液を調製する。そして、この培養液中に細胞を所定の濃度で撒く。そして、細胞を含む培養液を平面的な培養皿等の容器に入れる。その後に、周囲環境を維持できる環境維持装置（一般にインキュベータと呼ばれる）の中に培養皿を設置する。環境維持装置によって、培養皿の周囲環境として温度、二酸化炭素濃度、酸素濃度等を所定の値に保ち、細胞が分裂し増殖するのを２〜３日待つ。
細胞の増殖速度は細胞の種類や状態、環境によって変わるが、例えばＲＢＬ（ラット血液由来細胞）では３日後に細胞濃度が１０倍程度になる。このとき、細胞は周囲の培養液から増殖に必要な栄養分を吸収すると共に老廃物を排出する。そのため、培養皿中の培養液の状態は細胞増殖が進むにつれて大きく変わる。また、たとえばＣＨＯ（ハムスター由来子宮細胞）などにおいては、細胞は培養皿の平面部に付着しながら増殖する。そのため、付着するためのスペースが培養皿の平面部に無くなると、細胞の増殖は停止する。このように、細胞の増殖が進むと培養液中の細胞密度が高くなりそれ以上の増殖が行われなくなる。このため、ある程度細胞の培養が進んだ後は、細胞と培養液とを培養皿から回収し、遠心分離器を用いて細胞と培養液を分離する。そして、古い培養液を除去した上で、新しい培養液に適切な濃度で細胞を撒き、改めて細胞を培養する。この作業は一般的に継代と呼ばれる。
特に、この継代を細胞の状態に応じて適切に行うことは細胞の培養にとっては重要である。しかし、特に、付着性細胞の場合、平面部を有する培養皿中では細胞の下側が平面部に密着している。そのため、細胞周辺の環境、特に細胞の培養皿と接触している面周辺の環境を一定に保つことが困難な場合がある。
このような課題に対して、例えば、培養皿の平面部に微小な突起群を形成することにより、培養皿と細胞との接触度を低減し、密着度を制御することが提案されている（例えば、特許文献１及び特許文献２）。
あるいは、矩形状のプレートに適当な間隔で撥水処理を施した球形状の突起部を設け、複数の突起部で液滴を保持し、その液滴中で細胞を培養することが提案されている（例えば、特許文献３）。
細胞はその周辺の環境の変化に敏感である。そのために、前述したように、培養液の入れ替えや、細胞の周辺環境の維持を怠ると、培養液のｐＨや酸素濃度が変化したり、老廃物が特定の場所に溜まったりしてしまう。それにより、望ましくない環境の変化が起こった周辺の細胞の活性が失われてしまう。このため、細胞の周辺環境の維持は細胞の培養において極めて重要な要素である。しかし、従来の平面的な培養皿では上述したような作業の効率が良くない。そのため、従来の構成による細胞培養基材やそれを用いた細胞培養方法においては、細胞培養の作業効率が良くない。
特許文献１〜３に示す技術は、この問題を解決する一つの方法であるが、作業効率の向上に限界がある。特許文献１、２に開示される技術においては、突起群の形成には、培養皿となる基板に微細な凹凸パターンが形成された金型を押し付けることによって、基板に凹凸パターンを転写して形成する、いわゆるナノインプリント技術を用いている。従って、形成された突起群はその突起の一つ一つが独立している。よって、突起同士が相互に接続するような形状を形成することはできない。さらに、上記転写方法で形成された突起群は、基板の平面にのみしか形成することができないので、この基板の平面に対し垂直方向に伸長する突起群しか構成することができない。
あるいは、特許文献３に開示される技術においても、同様に、基材として、矩形プレート状基材を用いるため、この基板の平面に対し垂直方向に伸長する突起部しか構成することができない。このため、培養皿の基板平面に形成された微細な凹凸パターンにおける突起の形成ではその突起部の空隙率の向上において限界がある。
本発明は、従来よりも効率よく細胞を培養できる細胞培養基材及びそれを用いた細胞培養方法を提供する。
本発明の細胞培養基材は、基板と、基板上に形成された複数の繊維状突起物と、繊維状突起物表面に形成された撥水膜とを有する。複数の繊維状突起物は互いに絡み合うマトリクス構造を形成している。このような細胞培養基材によれば、撥水性の繊維状突起物に検体を含む培養液を吐出することによって、細胞の非接触下での培養が容易となり、効率よく細胞を培養することができる。
図１は本実施の形態における細胞培養基材の模式図である。図２は、図１の細胞培養基材における繊維状突起物の拡大図である。
図１に示すように、本実施の形態における細胞培養基材は、基板１１と、複数の繊維状突起物１２とを有する。基板１１は、例えば、単結晶シリコンからなるシリコン基板である。また、基板１１としてはそれ以外にも例えば、多結晶シリコン、アモルファスシリコンを材料として用いることができる。繊維状突起物１２は基板１１上に直接接合されている。複数の繊維状突起物１２は、互いに絡み合いマトリクス構造を形成している。繊維状突起物１２は二酸化ケイ素を主成分としている。そして、図２に示すように、撥水膜１３は繊維状突起物１２の表面全体を覆うように撥水膜１３が形成されている。撥水膜１３は、例えばフッ化炭素系（ＣＦ系）ポリマーからなり、複数の繊維状突起物１２の表面にそれぞれにコーティングされている。
ここで、「直接接合」とは、基板１１上に繊維状突起物１２が直接形成され、基板１１と繊維状突起物１２とを構成する原子が結合している状態を指す。通常は繊維状突起物１２と基板１１との分子間が共有結合をしている状態である。本実施の形態では、基板１１の表面のケイ素原子と繊維状突起物１２中のケイ素原子とが、酸素原子を介して共有結合している。また基板１１と繊維状突起物１２との接合面には接着剤などが含まれておらず、基板１１と繊維状突起物１２を構成する原子または分子以外の材料を含んでいない。
なお後述するが、基板１１と繊維状突起物１２は必ずしも「直接接合」されていなくても良い。
繊維状突起物１２の長さは全長で１０μｍ以上２００μｍ以下程度である。複数の繊維状突起物１２は、互いに絡み合うように密集し形成されていても、自由な方向へ枝分かれしているものが混在して形成されていてもよい。但し、複数の繊維状突起物１２が互いに絡み合い、枝分かれをして、マトリクス構造を形成することで、複数の繊維状突起物１２から形成される繊維構造体が強固に構成される。なお、繊維状突起物１２の太さは、０．０１μｍ〜１０μｍであることが好ましい。繊維状突起物１２の太さが１０μｍよりも太い場合は、単位面積当たりの空隙率が低減してしまう場合がある。また、繊維状突起物１２同士の間隔は０．００１〜１０μｍであることが好ましい。繊維状突起物１２同士の間隔が１０μｍよりも広い場合は、液滴を保持する効果が低減してしまう場合がある。
図３は、繊維状突起物１２のＳＥＭ画像を示す図である。繊維状突起物１２は、例えば二酸化ケイ素を主成分としたシリコン酸化物を含み、より詳細にはアモルファスの二酸化ケイ素を主成分とする。ケイ素と酸素の分子数比は概ね１：２であるが、アモルファスで存在しているため、微視的には場所によって分子数比にズレがある場合がある。このようなズレは、本発明の構成を限定するものでは無い。また、繊維状突起物１２には微量の不純物が含まれている場合があるがそのような不純物は本発明の構成を限定するものではない。また、繊維状突起物１２の先端は、基板平面に対して垂直な方向からカーブしていることが好ましい。これによって、複数の繊維状突起物１２がより互いに絡み合い、繊維状突起物１２の密度を向上できる。
次に本実施の形態の細胞培養基材の製造方法の一例を説明する。
まず、アモルファス二酸化ケイ素によって構成された繊維状突起物１２を形成する方法について説明する。
単結晶シリコンからなる基板１１において繊維状突起物１２を形成させたい場所にのみ、触媒層となるＰｔ層を成膜する。基板１１の表面にＰｔ層を成膜する手段としては、スパッタリング、蒸着、スピンコーティング等、通常の薄膜形成手段が適用できる。Ｐｔの膜厚は１〜２０ｎｍ程度が望ましい。
その後、Ｐｔ層を成膜した基板１１を、温度１０００〜１２００℃、不活性ガスを含むガス中での酸素分圧０．１〜１０００Ｐａにおいて所定時間、熱処理する。この熱処理工程で、特に昇温過程においては、基板１１表面に形成されたＰｔ薄膜は溶融を起こし、粒子状に凝集する（粒子は図示していない）。この時、凝集したＰｔの粒子径は最初に成膜した際のＰｔ膜の膜厚、熱処理時の昇温速度や温度等により制御できる。さらに、加熱を進め、基板１１を構成する材料の蒸気圧温度まで達すると、基板１１から材料が蒸発する。具体的には、シリコンが蒸発する。すると、この蒸発したシリコンと雰囲気に存在する酸素とが結合して亜酸化ケイ素が形成され気化する。この気化した亜酸化ケイ素は、過飽和を起こし、その一部が液化する。液化した亜酸化ケイ素は、粒子状に凝集したＰｔを核に凝集する。Ｐｔ周辺に凝集した液化亜酸化ケイ素は、さらに雰囲気に存在する酸素と結合して二酸化ケイ素となり固化する。固化した二酸化ケイ素の先端にはさらに液状化亜酸化ケイ素が凝集し、さらに二酸化ケイ素が形成する。このようにして、Ｐｔを核として、そこから二酸化ケイ素からなる繊維状突起物１２が形成される。なお、繊維状突起物１２の径は、Ｐｔの粒子径、雰囲気の酸素濃度や温度等に左右されるので、これらを制御することで必要な径、長さの繊維状突起物１２を基板１１上に形成出来る。
なお熱処理条件は、生産性や、繊維状突起物１２の耐熱性を考慮すると、温度１１００〜１２００℃、不活性ガスを含むガス中での酸素分圧１０〜２００Ｐａがより好ましい。この繊維状突起物１２は、基板１１の表面のシリコンと、熱処理工程で供給される酸素ガスとを原料として形成される。そのため、基板１１の表面と繊維状突起物１２とが直接接合し、強固に結合された状態となる。さらに、反応場の雰囲気の全圧を大気圧より低くすることで、長さ分布の小さい繊維状突起物１２を形成できる。
なお、繊維状突起物１２は、熱処理工程における酸素ガスの拡散方向に沿うように形成される。特に、反応場の雰囲気内の酸素分圧値が高いと複数の繊維状突起物１２が互いに絡み合うようにマトリクス構造に密集し、それぞれ縮れた形状となる。逆に、酸素分圧値が低いと複数の繊維状突起物１２が互いに同方向に配向した形状となる。
なお、繊維状突起物１２は、熱処理工程における条件を制御することで、先端が基板１１に対して垂直な方向からカーブするように形成できる。これによって、複数の繊維状突起物１２が互いに絡み合い、密度を向上できる。ここで、熱処理工程における条件とは、例えば、ガス流量、ガス分圧、ガス全圧、温度、排気速度といった条件をいう。
なお、熱処理工程における反応場の雰囲気は、昇温過程においては出来るだけ酸素を取り除いた状態が好ましく、昇温後の温度維持過程においては少量の酸素を追加した低酸素分圧下状態であることが好ましい。これにより、繊維状突起物１２の生産性が向上する。
高酸素分圧下とは、具体的に、例えば不活性ガスを含むガス中の全圧１０００〜５０００Ｐａ時における酸素分圧が５０〜１０００Ｐａ程度であることを指す。
一方、低酸素分圧下とは具体的に、例えば不活性ガスを含むガス中の全圧１０００〜５０００Ｐａ時における酸素分圧が５０Ｐａより低い程度であることを指す。
なお、熱処理温度が低いほど繊維状突起物１２が形成されるのに適した酸素分圧は小さくなる。従って、温度維持過程時の温度に適した酸素分圧で昇温過程を行うと、昇温過程での酸素が過剰となる。すると昇温過程時に、Ｓｉ表面に酸化膜が形成されてしまう。Ｓｉ表面の酸化膜は、温度維持過程時での繊維状突起物１２の形成を抑制してしまう。
なお、上記工程により繊維状突起物１２は１〜５００μｍの長さで制御することが可能である。
なお、シリコンからなる基板１１の表面の一部に二酸化ケイ素を主成分として含む層を形成することにより、層を形成した部分からの繊維状突起物１２の形成を抑制できる。二酸化ケイ素を主成分として含む層に触媒層を堆積させても、そこから繊維状突起物１２は形成されないためである。このようにすれば、基板１１の必要な箇所にのみ、繊維状突起物１２を形成できる。
また、シリコンからなる基板１１の表面の所望の位置のみに触媒層を形成することで、所望の位置のみに繊維状突起物１２を選択的に形成することもできる。これは前述した亜酸化ケイ素の液化が触媒層粒子によって形成された核周辺に集中して発生するからである。
なお、触媒層にＰｔを用いたが、例えばＦｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ａｕ等であっても同様の効果は得られる。ただし、触媒層に用いる材料としては、繊維状突起物１２の形成時の温度で容易に蒸発してしまわない材料であることが望ましい。触媒層が蒸発してしまうと亜酸化ケイ素の液化を促進する核が無くなり、繊維状突起物１２が形成されにくくなる。
次に、形成された繊維状突起物１２に撥水膜１３をコーティングする方法を説明する。
繊維状突起物１２が形成された基板１１を真空装置内に配置する。次に、真空装置内にフッ化炭素系のガスを導入する。そして、装置内に導入されたガスをプラズマ化させ、繊維状突起物１２の表面に、フッ化炭素系ポリマーからなる撥水膜１３をコーティングする。
フッ化炭素系のガスとしては、例えば、ＣＦ４，Ｃ２Ｆ６、Ｃ３Ｆ６、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ８、Ｃ５Ｆ８、ＣＨＦ３などのフッ化炭素系ガスを用いることが出来る。ほかにも、アルキルシリル基、フルオロシリル基、長鎖アルキル基によって、撥水膜１３を形成できる。
なお、このときガスをプラズマ化させる方法としては、ＩＣＰ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｐｌａｓｍａ、誘導結合型プラズマ）を用いることが望ましい。ＩＣＰではプラズマ化されたガスが自己バイアス効果によって電界加速および偏向されることがない。よって、繊維状突起物１２の表面に均一にポリマー膜が形成される。
また、このようにして形成された撥水膜１３の接触角を調べたところ、一般的なシリコン基板での接触角が１０３．６°であったのに対し、撥水性を有する繊維状突起物１２の接触角は１４６．７°と大きく、表面改質により繊維状突起物１２表面を超撥水性に修飾できていることが分かる。なお、上述の接触角の測定は、液滴を落とし、ＣＣＤカメラを通してコンピューターに取り込まれた画像から、自動的に、気液間の境界を決定し、カーブフィッティングを行った。なお、本実施の形態における撥水膜１３としては、撥水膜１３上に培養液１５を吐出した際に、培養液１５が球形の液滴を形成する程度の撥水性を有することが好ましい。
なお、上記のようにガスをプラズマ化させる方法の他、熱によって撥水性の原料を気化させ、繊維状突起物１２の表面にコーティングする方法もある。たとえば、アルコールや、ヘプタン、テトラデカン、ヘキサデカン、ペンタデカンといったアルカン、などの有機溶剤を熱によって気化させ、繊維状突起物１２の表面に撥水膜１３をコーティングできる。あるいは、有機溶剤に、シランカップリング剤を溶解させて撥水膜１３をコーティングすることもできる。シランカップリング剤としては、例えば、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、ビニルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−イソシアネートプロピルトリエトキシシラン等を用いることができる。
なお、上記構成は一回のプロセスで形成させることができるので生産性に優れる。
なお、本実施の形態では、繊維状突起物１２を形成する方法として、基板１１に触媒層を堆積させる方法を例に挙げたが、その他の方法であってもよい。例えば、繊維状突起物１２の他の形成方法として、基板１１の表面に形成したシード層から形成する方法がある。ここでシード層とは、薄膜シリコンや、シリコン粒子など、シリコンを含む膜のことを指す。従って基板１１がシリコンの場合はシード層を形成する必要はない。一方基板１１がシリコン以外の場合はシード層を用いる。シード層を形成した基板１１を酸素雰囲気で１０００℃〜１１００℃程度で熱処理をすることで繊維状突起物１２が形成される。この方法によっても、基板１１と繊維状突起物１２とが直接形成された細胞培養基材が得られる。
また、繊維状突起物１２の他の形成方法として、例えば、シリコン粒子を用いることにより、無触媒で繊維状突起物１２を形成することができる。具体的には、シリコン粒子を高温、低酸素濃度下において熱処理することにより、無触媒下で繊維状突起物１２を形成できる。これは、シリコン粒子の表面積がその体積に比べて大きいために、より小さな熱容量でかつ無触媒であっても蒸発されやすく、または亜酸化ケイ素となり気化しやすいためである。さらに、シード層として、シリコン粒子を用いている場合は、これらシード層によって基板１１の表面が凸凹しているため、気化した亜酸化ケイ素が凸凹部に凝集しやすく、酸素との結合によって二酸化ケイ素への固化が起こりやすい。このため、上述の製造方法で説明したような触媒層やシード層が無くても二酸化ケイ素の繊維状突起物１２が形成できる。
ここで、シリコン粒子とは、例えばシリコン、一酸化シリコン、あるいはシリコンの合金であるシリサイドの粒子をいう。シリコン粒子の大きさは出来るだけ小さいことが好ましく、例えば、５μｍ以下の大きさが好ましい。これにより、シリコンの蒸発量を増大させることができより効率良く繊維状突起物１２を形成できる。また高温とは、例えば１０００〜１２００℃程度であることが望ましい。なお、一酸化シリコン粒子を用いる場合には、上記温度より低い温度９００℃程度であっても繊維状突起物１２を形成できる。低酸素濃度とは、例えば不活性ガスを含むガス中の全圧１０００〜５０００Ｐａ時における酸素分圧が５０Ｐａ以下程度であることが望ましい。
なお、上記熱処理工程における温度調整は、昇温過程においては出来るだけ酸素を取り除いた状態で行い、昇温後の温度維持過程においては少量の酸素を追加した低酸素分圧下で行うことにより、繊維状突起物１２の生産性が向上する。
また、上記方法によると繊維状突起物１２は、シリコン粒子と熱処理工程で供給される酸素ガスとを原料として形成される。すなわち、シリコンからなる基板１１の材料成分を原料としないので、基板１１として結晶性のシリコンウエハなどを用いなくても本実施の形態の細胞培養基材を形成できる。たとえば、基板１１として石英、ガラス、サファイヤ等を採用し、それら基板１１上に繊維状突起物１２を形成できる。これにより、より低コスト化ができ、さらに基板１１として透明基板を用いることによって、細胞を顕微鏡で観察する場合、透過照明型顕微鏡を用いることが可能であり、細胞をより観察しやすくなる。
また、別の方法として、一旦、シリコンからなる基板に繊維状突起物１２を形成した後、繊維状突起物１２を剥離させ、別の基板１１へ転写することもできる。たとえば、シリコンからなる基板に一度繊維状突起物１２を形成させた後、ガラスなどからなる基板１１などへ繊維状突起物１２を転写することで細胞培養基材を形成できる。
なお、基板１１として、ＩＴＯ（Ｉｎｄｉｕｍ Ｔｉｎ Ｏｘｉｄｅ）などの電極を表面に形成した基板を採用することで、細胞を培養しながら電圧を印加することができる。これにより、培養液を流動させることや、培養液の状態を電気的に計測でき、精度良く培養液の状態を管理できる。
あるいは、基板１１として、ガラスファイバーシートなどのフレキシブルな基板を採用することもできる。たとえば、シリコン粒子をガラスファイバーシートなどに含有させ、上述した加熱工程を行うことで繊維状突起物１２を形成できる。
また、シリコン粒子をバインダ等と混合し、スピンコート、印刷、インクジェット法等により、任意の場所のみにシリコン粒子を配置することで、繊維状突起物１２を任意の場所のみに容易に形成することができる。
なお、上記粒子からの製造方法においては形成された繊維状突起物１２に撥水膜１３をコーティングした後に、基板１１に接合する方法であっても構わない。
次に本実施の形態の細胞培養基材を用いた細胞培養方法及びその効果を説明する。図４は、本実施の形態における細胞培養基材の模式図である。
細胞培養基材における基板１１に形成された複数の繊維状突起物１２上に、細胞などの検体１４を含む培養液１５を吐出する。検体１４は、培養液１５に所定の濃度となるように蒔種されている。培養液１５が吐出された細胞培養基材は所定の細胞培養環境維持装置の中に設置される。細胞培養をする間、細胞培養環境維持装置の内部は所定のガス、例えば酸素や二酸化炭素等のガスを所定の濃度になるように環境維持される。
繊維状突起物１２の表面には超撥水性を有する撥水膜１３が形成されており、なおかつ、繊維状突起物１２は互いに絡み合ってマトリクス構造を構成している。そのため、繊維状突起物１２上に吐出された培養液１５は、繊維状突起物１２の隙間には侵入せず、繊維状突起物１２の上面でほぼ球形状になる。検体１４は、培養液１５中で増殖を始める。たとえば検体１４が付着性細胞の場合は、繊維状突起物１２により構成されたマトリクス構造を足場として検体１４が付着し、検体１４は、ほぼ球形状となった培養液１５中で増殖する。
すなわち、付着性細胞は何らかのものに接触して固定されていなければ増殖することが出来ない。浮いたままだとアポトーシスを起こして多くの場合、死んでしまう。従って、付着性細胞の固定の為には接触するものが必要だが、平面部に固定させる場合では培地交換が困難となる。
しかし、本発明では、繊維状突起物１２によって構成されたマトリクス構造に固定させるため、固定は要する面積を最小にしつつも、培地交換も容易となる。その結果、増殖を可能とすることができる。
また、本発明では、空隙率が高いためガス交換率を向上することができる。さらに、液滴表面上のガス交換できる領域が細かく分散され、これによってガス置換を均一にすることができる。
その際、検体１４が代謝した老廃物により培養液１５のｐＨが変化する。本実施の形態の細胞培養基材によれば、複数の繊維状突起物１２で形成される繊維構造体の内部の空隙部には、繊維状突起物１２に形成された撥水膜１３により、培養液１５が浸入しない。よって、複数の繊維状突起物１２で形成される繊維構造体の内部の空隙部を外気と接触させておけば空隙部内部にガスが潤沢に浸透できる。そのため、たとえば従来、二酸化炭素や酸素などのガスを供給しにくかった、培養液１５の底面にも容易にガスを供給でき、培養液１５全体を新鮮な環境に維持できる。こうして、細胞増殖の過程において適切な環境で管理された細胞群を得られる。
なお、検体１４として用いる細胞が組織を構成する場合（たとえば皮膚細胞）、繊維状突起物１２の上部に組織化された細胞シートが形成される。このような場合でも、培養液１５は繊維状突起物１２上で空隙部に侵入することなく保持されている状態なので、容易に培養液を交換でき、培養液１５内の環境を容易に保持できる。
また、培養液１５の液量は、繊維状突起物１２で形成される繊維構造体の平面部のみかけの面積に依存しているので、みかけの面積が大きければ大きいほど多量の培養液１５で多くの検体１４を培養できる。
なお、繊維状突起物１２の先端は基板１１の平面に対して垂直な方向からカーブしていることが好ましい。これによって複数の繊維状突起物１２は相互により高密度に絡み合い、マトリクス構造を構成できる。よって、繊維状突起物１２で形成される繊維構造体の上部において細胞が足場として接触できる面積を増やすことができ、かつ繊維構造体内部に十分な空隙部を持つことが出来る。これにより、より効率よく細胞を培養できる。
なお、細胞培養基材１００に電気や超音波、振動といった外部刺激を与えることによって、培養液１５を繊維状突起物１２上で流動させることができる。培養液１５を流動させることで、培養液１５中での培養塊の沈降を防ぎ、検体１４を培養液１５内で浮遊した状態で培養できる。
なお、細胞培養中の培養液１５内に繊維状突起物１２の一部分が入っていても良い。
また、本実施の形態の細胞培養基材によれば、細胞培養における分化効率も向上する。ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの分化誘導においては、細胞の極性、すなわちアクシンや微小管などの細胞骨格分子の配置は細胞の分化と密接に関わることが知られている。つまり、分化誘導において、細胞が他の細胞や支持体等に接着すると細胞の極性に大きく影響してしまう。よって、極性なく細胞の分化を誘導することが組織を形成するための細胞培養に重要である。従来例でも示したようなナノインプリント構造による微少凹凸の三次元構造などにおける細胞培養においては、平面での培養よりは改善されるものの、その構造上、培養中に細胞が微小凹凸部等に接触することがある。これにより多くの場合、細胞に極性をもたらしてしまう。その結果、効率よく細胞を培養あるいは分化誘導することが困難となる。しかし、本実施の形態の細胞培養基材では、複数の繊維状突起物１２にそれぞれ撥水膜１３がコーティングされている。そして、繊維状突起物１２の上面に細胞などの検体１４を含む培養液１５を吐出し、細胞（検体１４）を培養する。この時、検体１４は、検体１４下方全体が繊維状突起物１２に接触せずに、培養液１５内で培養される。よって、細胞培養中に検体１４下方全体が繊維状突起物１２に接触しないので、効率的な細胞培養が可能となる。さらに、繊維状突起物１２の直径を極めて小さくしておくことで、細胞などの検体１４が繊維状突起物１２に接触することをより抑制できる。このときの繊維状突起物１２の直径は最小で１０ｎｍ程度まで小さくすることが出来る。
なお、本実施の形態によれば、繊維状突起物１２によりマトリクス構造を容易に形成できる点、さらに繊維状突起物１２が互いに接続させることが容易にできるため繊維構造体としての強度を容易に高められる点、といったカーボン系ファイバーにはない特徴を有する。
また、例えば、複数の繊維状突起物１２が互いに絡み合うことによって構成するマトリクス構造の密度を調整することで、繊維状突起物１２の形状、空隙率をより自由に調整できる。これにより、検体１４として扱う細胞の種類毎に適した表面状態を形成できる。
なお、ＳＡＭ（Ｓｅｌｆ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）や化学修飾などを用いて、複数の繊維状突起物１２に蛋白質を結合させてもよい。蛋白質を結合させることによって、培養液１５内に蛋白質が入り、細胞の増殖を促進させることができる。ここで蛋白質とは、例えばアクチン、アルブミンなどをいう。
なお、図５に示すように、基板１１の表面に開口部を有する窪み１６を形成し、窪み１６の内壁面に繊維状突起物１２を形成しても良い。窪み１６の内底面および側面には、繊維状突起物１２が形成されている。さらに、繊維状突起物１２表面全体が撥水膜１３によってコーティングされている。このような細胞培養基材において、窪み１６に形成された繊維状突起物１２上に吐出された培養液１５は、底面側のみでなく側面側からも保持される。そのため、例えば培養中に基板１１に振動が加わった場合にも培養液１５及びその中に含まれる検体１４が細胞培養基材上を流動することが抑制でき、確実に検体１４を細胞培養基材上に保持できる。よって、より効率的かつ確実に細胞を培養することができる。
また、図６、図７に示すように、基板１１には第一面と第一面の反対面である第二面とを貫通する貫通孔１７が形成されていても良い。基板１１の第一面における貫通孔１７の周辺から貫通孔１７の内壁面にかけて複数の繊維状突起物１２が形成されている。さらに、その繊維状突起物１２の表面全体が撥水膜１３によってコーティングされている。
上記構成により、培養液１５の液滴の側面は繊維状突起物１２で保持されかつ、液滴の一部は貫通孔１７内に入り込む。このようにして液滴は細胞培養基材に保持される。これにより、液滴の底面を完全に非接触な状態で保持できる。そのため、細胞などの検体１４の着床をさらに抑制しながら細胞培養を行える。また培養液１５の底面側が開放されているので，倒立顕微鏡等を用い容易に観察可能となる。さらに基板１１の第二面側から観察しながら、基板１１の第一面側から培養液１５の液滴の操作、例えば薬液の投入などが可能となる。これにより、より作業効率を高め、かつ確実に精度良く細胞の培養ができる。
なお、図６に示すように、貫通孔１７の形状は第一面から第二面に向かって孔径が狭くなるようにテーパ形状を有していると良い。これにより、培養液１５の液滴がちょうど貫通孔１７に挿入され、保持された形状となり、液滴が他方へ転がり移動することを抑制することが出来るだけでなく、基板１１の第二面側への落下もさらに抑制できるため好ましい。
なお、貫通孔１７の第二面側に細胞捕捉孔を有した薄板や、パッチクランプピペットを用いることによって、例えば細胞培養後に細胞同士がネットワークを形成した状態でそれら細胞の電気生理状態をそのまま測定することも可能である。
本発明の細胞培養基材は、血液由来細胞や組織由来細胞、またはｉＰＳ細胞やＥＳ細胞といった細胞の細胞培養に用いられることが期待される。
１１ 基板
１２ 繊維状突起物
１３ 撥水膜
１４ 検体
１５ 培養液
１６ 窪み
１７ 貫通孔
１２ 繊維状突起物
１３ 撥水膜
１４ 検体
１５ 培養液
１６ 窪み
１７ 貫通孔
細胞の増殖速度は細胞の種類や状態、環境によって変わるが、例えばＲＢＬ（ラット好塩基球白血病）では３日後に細胞濃度が１０倍程度になる。このとき、細胞は周囲の培養液から増殖に必要な栄養分を吸収すると共に老廃物を排出する。そのため、培養皿中の培養液の状態は細胞増殖が進むにつれて大きく変わる。また、たとえばＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）などにおいては、細胞は培養皿の平面部に付着しながら増殖する。そのため、付着するためのスペースが培養皿の平面部に無くなると、細胞の増殖は停止する。このように、細胞の増殖が進むと培養液中の細胞密度が高くなりそれ以上の増殖が行われなくなる。このため、ある程度細胞の培養が進んだ後は、細胞と培養液とを培養皿から回収し、遠心分離器を用いて細胞と培養液を分離する。そして、古い培養液を除去した上で、新しい培養液に適切な濃度で細胞を撒き、改めて細胞を培養する。この作業は一般的に継代と呼ばれる。
また、本実施の形態の細胞培養基材によれば、細胞培養における分化効率も向上する。ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの分化誘導においては、細胞の極性、すなわちアクチンや微小管などの細胞骨格分子の配置は細胞の分化と密接に関わることが知られている。つまり、分化誘導において、細胞が他の細胞や支持体等に接着すると細胞の極性に大きく影響してしまう。よって、極性なく細胞の分化を誘導することが組織を形成するための細胞培養に重要である。従来例でも示したようなナノインプリント構造による微少凹凸の三次元構造などにおける細胞培養においては、平面での培養よりは改善されるものの、その構造上、培養中に細胞が微小凹凸部等に接触することがある。これにより多くの場合、細胞に極性をもたらしてしまう。その結果、効率よく細胞を培養あるいは分化誘導することが困難となる。しかし、本実施の形態の細胞培養基材では、複数の繊維状突起物１２にそれぞれ撥水膜１３がコーティングされている。そして、繊維状突起物１２の上面に細胞などの検体１４を含む培養液１５を吐出し、細胞（検体１４）を培養する。この時、検体１４は、検体１４下方全体が繊維状突起物１２に接触せずに、培養液１５内で培養される。よって、細胞培養中に検体１４下方全体が繊維状突起物１２に接触しないので、効率的な細胞培養が可能となる。さらに、繊維状突起物１２の直径を極めて小さくしておくことで、細胞などの検体１４が繊維状突起物１２に接触することをより抑制できる。このときの繊維状突起物１２の直径は最小で１０ｎｍ程度まで小さくすることが出来る。
Claims (11)
- 基板と、
前記基板上に形成された複数の繊維状突起物と
前記繊維状突起物表面に形成された撥水膜とを備え、
複数の前記繊維状突起物は互いに絡み合うマトリクス構造である
細胞培養基材。 - 前記繊維状突起物の先端は、前記基板の平面の垂直方向からカーブしている、請求項１に記載の細胞培養基材。
- 前記繊維状突起物は、シリコン酸化物からなる
請求項１に記載の細胞培養基材。 - 前記繊維状突起物は、アモルファスの二酸化ケイ素からなる
請求項１に記載の細胞培養基材。 - 前記撥水膜はフッ化炭素系ポリマーからなる
請求項１に記載の細胞培養基材。 - 前記繊維状突起物と前記基板とは直接接合されている
請求項１に記載の細胞培養基材。 - 前記基板は窪みを有しており、前記繊維状突起物は、前記窪みの内底面と側面とに形成されている
請求項１に記載の細胞培養基材。 - 前記基板は第一の面と、前記第一の面の反対面である第二の面とを有し、前記基板には前記第一の面と前記第二の面とを連通する貫通孔が設けられ、
前記第一の面における前記貫通孔の周辺部から前記貫通孔の内壁面にかけて前記繊維状突起物が形成される
請求項１に記載の細胞培養基材。 - 細胞を含む培養液を請求項１に記載の細胞培養基材の前記繊維状突起物の上部に配置するステップと、
前記細胞培養基材を細胞培養環境維持装置の中に設置するステップと、前記細胞培養環境維持装置の内部がガスにより所定のガス濃度になるように環境維持するステップとを含む、
細胞培養方法。 - 前記ガスは二酸化炭素と酸素との少なくともいずれかを含み、前記所定のガスは所定の濃度に維持される
請求項９に記載の細胞培養方法。 - 前記ガスを前記繊維状突起物の周囲に存在する空隙部に循環させる請求項９に記載の細胞培養方法。
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