JPWO2007142316A1 - 新規なナノシリカ粒子の製造方法と用途 - Google Patents
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Abstract
Description
研究開発されており、これ等の一部は白熱ランプの改良、バイオアッセイ等において既に実用化されている。尚、その合成には、常套手段あるいは出発材料としてTEOS(テトラエチルオルソシラン;tetraethylorthsilane;以下「TEOS」と略記する)が常用され、従来のシリカ粒子はTEOS粒子であった。しかし、かかるTEOS粒子の表層は化学反応性(外来のタンパク質や核酸への結合能)が低いため、上記TEOSとは別のシリカ化合物によるアクセプター基の導入による活性化が試みられていた(特許文献1)。例えば、シリカ化合物(括弧内は、導入される「アクセプター基」)として、テトラエトキシシラン(OH基)、メルカプトプロピルエトキシシラン(SH基)、アミノプロピルエトキシシラン(NH2基)等が知られている。換言すれば、従来の活性シリカ粒子は、TEOSからなる内殻とアクセプター基からなる外殻あるいは表層の2重構造になっており、その製造に要する時間や労力等のコストは高価であった。上述のように、従来、シリカ粒子の作製は通常、テトラエトキシシラン(TEOS)を用いて行われており、その他のシリカ化合物、例えばMPSなどで粒子を作製するという報告は数少ない。この理由としてシリカネットワークを形成するための結合サイト(Si−O)がTEOSでは4本あるのが、必然的にその結合部位3本以下となるようなその他のシリカ化合物を選択して粒子を作製することは容易ではないからであると考えられる。また実際に通常のTEOSを用いた粒子の作製条件にてMPSなどで粒子の作製を試みても良好に粒子が作製できない。また、実際にMPSなどを用いている場合においても、そのMPS粒子の製造では、MPSを塩酸単独(又は塩酸と塩化セチルメチルアンモニウムとの混合液)で前処理(室温で2〜5日間)の後、これにアンモニア水溶液を添加混合し、更に、室温で2日間、反応させ、MPS粒子を得る技術(特許文献2)が知られているが、この技術は、製造コストに関し従来技術に比べ、進歩性を欠き、かつ、製造工程が煩雑なため、実用的でないうえに、その粒子の製造にかなりの日数を要することが問題である。また、作製された粒子のサイズ(粒径)の調整が困難であった。
この発明は、「従来では通常、リガンド剤として使用のMPSにアンモニア水溶液を添加
混合の後、加温すれば、迅速にMPS粒子が生成される」という実に驚くべき現象の発見
に基づき、更に、長年にわたる絶え間ない創意工夫と勤勉により完成された。
(A1)メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPS)、メルカプトプロピルトリエトキシシラン(MPES)、メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン(MPDMS)、トリメトキシ[2−(7−オキサビシクロ[4.1.0]−ヘプト−3−イル)エチル]シラン(EpoPS)、チオシシアナトプロピルトリエトキシシラン(TCPS)およびアクリルオキシプロピルトリメトキシシラン(AcPS)からなる群より選択される1種または数種のシリカ化合物を含む、シリカ粒子。
(A2)機能性物質を表層または内部に含む、項目A1に記載のシリカ粒子であって、
該機能性物質が、蛍光性物質、蛋白質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖鎖およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、シリカ粒子。
(A3)該機能性物質が、蛍光性物質である場合、
該蛍光性物質は、ローダミンレッド、フルオロセイン、ヘキサン酸−6−(テトラメチルローダミン-5-カルボキサミド)、ヘキサン酸−5−(テトラメチルローダミン-5-カルボキサミド)、Alexa Fluor 647、DY 635、DY 485、DY 495、DY 505およびトリスジクロロツテニウム(II)ヘキサハイドレートからなる群より選択され、
該蛍光性物質は、単独、またはN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、イソチオシアネート(ITC)およびマレイミドから選択される化合物と結合している形態で内部に含まれるかまたは表層に存在する、
項目A2に記載のシリカ粒子。
(A4)項目A1〜3のいずれか1項に記載されたシリカ粒子を含む、シリカ粒子群。
(A5)フローサイトメトリー、サイズマーカー、ビーズアッセイおよびプローブに使用される、項目A1〜3のいずれかに記載のシリカ粒子、または項目A4に記載のシリカ粒子群を含む、標準マーカー。
(A6)項目A1〜3のいずれかに記載のシリカ粒子、または項目A4に記載のシリカ粒子群を含む、核酸または蛋白質の合成または細胞培養の用途で使用される、支持体。
(A7)シリカ粒子またはシリカ粒子群の作製方法であって、
(a)シリカ化合物とアンモニア水溶液との混合物を作製する工程;および
(b)所定の温度条件下で該シリカ化合物と該アンモニア水溶液を反応させる工程;
を包含する、方法であり、
ここで、該シリカ化合物は、メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPS)、メルカプトプロピルトリエトキシシラン(MPES)、メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン(MPDMS)、トリメトキシ[2−(7−オキサビシクロ[4.1.0]−ヘプト−3−イル)エチル]シラン(EpoPS)、チオシシアナトプロピルトリエトキシシラン(TCPS)およびアクリルオキシプロピルトリメトキシシラン(AcPS)からなる群より選択される1種または数種のシリカ化合物であり、
工程(a)および(b)における、アンモニア水溶液および温度条件は、
(i)高温(80〜100℃の温度範囲);または
(ii)高アンモニア濃度(最終濃度25%以上)
のいずれかまたは両方の条件を満たすように実施される、方法。
(A8)前記工程(b)がイソプロパノール存在下で実施される、項目A7に記載の方法。
(A9)前記温度条件が室温であるか、またはアンモニア水溶液の濃度が、最終濃度2%以上
5%以下である低アンモニア濃度である、項目A7に記載の方法。
(A10)シリカ粒子群であって、
(1)ナノサイズからミクロンサイズ範囲である5nm〜5μmに調節された平均粒径を有することと
(2)粒径分布幅が平均粒径の±25%以内にある狭域分布性であること
との特徴を有する、シリカ粒子群。
(A11)項目A1〜3のいずれかに記載されるシリカ粒子を含む、項目A10に記載のシリカ粒子群。
(A12)項目A1〜3のいずれかに記載されるシリカ粒子であって、
(1)無孔性であること;
(2)マクロポアを含まないこと;
(3)実質的に球状であること;
(4)20nm以上のポアを含まないこと;
(5)細孔容積が、0.1(m3/g)以下である;および
(6)粒径が5nm〜5μmの範囲であること
からなる群より選択される1つ以上の特徴を有する、シリカ粒子。
(B1)表層が無孔性であるシリカ粒子。
(B2)マクロポアを含まないシリカ粒子。
(B3)実質的に球状であるシリカ粒子。
(B4)20nm以上のポアを含まない、項目B1〜3のいずれかに記載のシリカ粒子。
(B5)項目B1〜4いずれかに記載されるシリカ粒子であって、
(1)無孔性であること;
(2)マクロポアを含まないこと;
(3)実質的に球状であること;
(4)20nm以上のポアを含まないこと;
(5)細孔容積が、0.1(m3/g)以下である;および
(6)粒径が5nm〜5μmの範囲であること
からなる群より選択される1つ以上の特徴を有する、シリカ粒子。
(B6)粒径が5nm〜5μmの範囲である、項目B1〜5のいずれかに記載のシリカ粒子。
(B7)メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPS)、メルカプトプロピルトリエトキシシラン(MPES)、メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン(MPDMS)、トリメトキシ[2−(7−オキサビシクロ[4.1.0]−ヘプト−3−イル)エチル]シラン(EpoPS)、チオシシアナトプロピルトリエトキシシラン(TCPS)およびアクリルオキシプロピルトリメトキシシラン(AcPS)からなる群より選択されるシリカ化合物から生成される、項目B1〜6のいずれか1項に記載のシリカ粒子。
(B8)機能性物質を有する、項目B1〜7のいずれかに記載のシリカ粒子。
(B9)前記機能性物質を前記シリカ粒子の表層上に有する、項目B8に記載のシリカ粒子。
(B10)前記機能性物質を前記シリカ粒子の内部に有する、項目B8に記載のシリカ粒子。
(B11)前記機能性物質が、蛍光性物質、蛋白質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖鎖およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目B8〜10のいずれかに記載のシリカ粒子。
(B12)前記機能性物質が、蛍光性物質である、項目B11に記載のシリカ粒子。
(B13)前記蛍光性物質が、ローダミンレッドまたはフルオロセインである、項目B12に記載のシリカ粒子。
(B14)ナノサイズからミクロンサイズ範囲で調節された平均粒径を有するシリカ粒子群であって、粒径分布幅が狭域分布性である、シリカ粒子群。
(B15)前記平均粒径が5nm〜5μmのいずれかで調節されている、項目B14に記載のシリカ粒子群。
(B16)前記狭域分布性が、粒径分布幅が平均粒径の±25%以内であることにより特徴付けられる、項目B14また15に記載のシリカ粒子群。
(B17)メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPS)、メルカプトプロピルトリエトキシシラン(MPES)、メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン(MPDMS)、トリメトキシ[2−(7−オキサビシクロ[4.1.0]−ヘプト−3−イル)エチル]シラン(EpoPS)、チオシシアナトプロピルトリエトキシシラン(TCPS)およびアクリルオキシプロピルトリメトキシシラン(AcPS)からなる群より選択されるシリカ化合物から生成される、項目B14〜16のいずれか1項に記載のシリカ粒子群。
(B18)機能性物質を有する、項目B14〜17のいずれかに記載のシリカ粒子群。
(B19)前記機能性物質を前記粒子群におけるそれぞれの粒子の表層上に有する、項目B18に記載のシリカ粒子群。
(B20)前記機能性物質を前記粒子群におけるそれぞれの粒子の内部に有する、項目B18に記載のシリカ粒子群。
(B21)前記機能性物質が、蛍光性物質、蛋白質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖鎖およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目B18〜20のいずれかに記載のシリカ粒子群。
(B22)前記機能性物質が、蛍光性物質である、項目B21に記載のシリカ粒子群。
(B23)前記蛍光性物質が、ローダミンレッドまたはフルオロセインである、項目B22に記載のシリカ粒子群。
(B24)項目B1〜13に記載されるシリカ粒子または項目B14〜23に記載のシリカ粒子群を含む、標準マーカー。
(B25)フローサイトメトリーで使用されるための項目B24に記載の標準マーカー。
(B26)サイズマーカー用途ならびにビーズアッセイ用途で使用される、項目B24に記載の標準マーカー。
(B27)シリカ化合物とアンモニア水溶液とを混合して混合物を作製する工程;および
80〜100℃の温度範囲にある温度で2〜12時間にわたり該混合物を反応させる工程
を包含する、
シリカ粒子またはシリカ粒子群の製造方法。
(B28)前記シリカ化合物とアンモニア水溶液とを混合して混合物を作製する工程が、イソプロパノールの存在下で実施される、項目B26に記載に製造方法。
(B29)前記シリカ粒子の粒径または前記シリカ粒子群の平均粒径が、5nm〜5μmのいずれかで調節されている、項目B26または27に記載の製造方法。
(B30)前記シリカ化合物の濃度により粒径または平均粒径が制御される、項目B28に記載される製造方法。
(B31)前記シリカ化合物が、メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPS)、メルカプトプロピルトリエトキシシラン(MPES)、メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン(MPDMS)、トリメトキシ[2−(7−オキサビシクロ[4.1.0]−ヘプト−3−イル)エチル]シラン(EpoPS)、チオシシアナトプロピルトリエトキシシラン(TCPS)およびアクリルオキシプロピルトリメトキシシラン(AcPS)からなる群より選択される、項目B26〜29のいずれか1項で記載される製造方法。
(B32)前記温度が90〜100℃である、項目B26〜30のいずれかで記載される製造方法。
(B33)機能性物質を表層または内部に有するシリカ粒子を生成するために機能性物質をシリカ粒子に提供する工程
をさらに包含する、項目B25〜30のいずれか1項に記載される製造方法。
(B34)前記機能性物質が、蛍光性物質、蛋白質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖鎖およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目B31に記載の製造方法。
(B35)前記機能性物質が、蛍光性物質である、項目B32に記載の製造方法。
(B36)前記機能性物質が、ローダミンレッドまたはフルオロセインである、項目B33に記載の製造方法。
(B37)項目B1〜11のいずれかに記載のシリカ粒子または項目B12〜22のいずれかに記載のシリカ粒子群を含む、支持体。
(B38)核酸もしくは蛋白質の合成あるいは細胞浮遊培養のために使用される、項目B36に記載の支持体。
更に、本発明に係るシリカ粒子とその表層・表面、並びに製造方法には、効果に関し、従来にない次の特長ないしは特徴を有する。
(a)シリカ粒子の表層あるいは表面の特長は次の通りである:
(1)表層あるいは表面のアクセプター基により、タンパク質や核酸等の吸着能が高い;
(2)抗原、抗体、酵素等の変性(活性や機能の失活)を生じることなく、これ等の機能を保持した状態で効率良く、これ等を表面に結合させることができる;
(3)表層上で抗原抗体反応が可能である;
(4)シリカ粒子の表面上で高感度に物質を検出することができる;及び
(5)共役試薬によるタンパク質、核酸、色素等の化学物質の表層への結合が可能である。
(b)シリカ粒子それ自体の特長は次の通りである:
(1)粒子の作製や表層修飾に起因する凝集が少ない;及び
(2)シリカ粒子の粒径は、ナノサイズからミクロンサイズまでの調整・調節が可能である。
(c)製造方法の特徴は次の通りである:
(1)シリカ粒子の製造に要する日数が、従来の方法(数日間)に比べ、極めて短時間(1〜12時間)である;
(2)収率は30%を超える;ここで、収率は、反応開始前のシリカ化合物の重量を基準として最終的に得られた粒子群の乾燥重量を測定して決定した。例えば、MPSの重量が30mg、作製した粒子の乾燥重量が10mgであれば、その収率は10mg/30mg=0.33、すなわち、33.3%とした。
すなわち、模式的にあらわすと以下のようになる。
(A) 従来法
1) APS(a)+NHS−色素(b)=APS−色素(c)
2) APS−色素(c)+TEOS(d)=色素含有粒子
(B) 新法
1) マイレイミド−色素+MPS(=(MPS−色素)+MPS)=色素含有粒子
定性試験、定量試験、診断等での有力かつ強力な手段を提供する。
「ナノ材料」、「ナノスケール物質」または「ナノ物質」とは、ナノメートルスケールでの超微細な物質をいい、一般的には、外部刺激(熱・光・電圧など)に対する反応などにおいてバルク性を示す物質とは異なる特徴的な性質を示す。このナノスケール物質の形態は、一般的には、0次元構造(球状)、1次元構造(針状、線状)、2次元構造(膜状、板状)、3次元構造(バルク状)が挙げられる。この0次元構造として、例えば、クラスター、超微粒子、量子ドット、デンドリマーなどが挙げられる。1次元構造としては、ナノチューブ、ナノワイヤ、量子細線が挙げられる。2次元構造としては、ナノシート、ナノベルト、ナノ薄膜、ヘテロ接合、量子井戸が挙げられる。3次元構造として、ナノセラミックス、ナノメタル、ナノ構造フィルターなどが挙げられる。ナノ材料の微粒子の形態として「ナノ粒子」がある。
「サイズ収率」={(最大粒径)−(最小粒径)}/{2×(平均粒径)}×100(%)
ここで、「平均粒径」={(最大粒径)+(最小粒径)}/2である。
これら値は、例えば、透過型電子顕微鏡によって測定され、またはその測定値に基づいて計算される。
につき説明する。
(a)MPSとアンモニアとを用いるMPS粒子の作製:
MPSと28重量%アンモニア水溶液とを混合した後、温度80〜100℃、好ましくは95±5℃にて、1〜12時間、好ましくは7±5時間、攪拌・保温し、反応させ、MPS粒子を生成させる。生成MPS粒子は、高速遠心によるペレットのかたちで採取し、これを70%エタノール水溶液と蒸留水とで交互に計4〜8回、遠心により洗浄する。採取したペレット(MPS粒子)は高速ホモジナイザーや超音波処理等により分散させた後、使用に供する。MPS粒子の粒径はナノサイズからミクロンサイズまで、生成に用いるMPS濃度の変量により、調整・調節できる。例えば、28重量%アンモニア水溶液(一定量)に対するMPSの添加量を、所望の粒径が得られるよう調節し、適宜、変量できる。28重量%アンモニア水溶液675μl(一定量)に対するMPS濃度、平均粒径、及びサイズ収率(%)の3者の相互関係は、後述の実施例3の表1に例示されている。
(b)MPS、イソプロパノール、及びアンモニアによるMPS粒子の生成:
MPS、イソプロパノール、及び28重量%アンモニア水溶液を混合した後、温度80〜100℃、好ましくは95±5℃にて、1〜12時間、好ましくは7±5時間、攪拌・保温し、反応させることにより、MPS粒子を生成させることができる。生成PMS粒子の採取、洗浄、分散は、上述(a)の通りである。MPS粒子の粒径は、生成に用いるMPS濃度の変量と、I/N容量比[イソプロパノール溶液の容量(I):28重量%アンモニア水溶液の容量(N)]の変更により、調整・調節できる。28重量%アンモニア水溶液(一定量)に対するMPS濃度及びI/N比は、所望の粒径が得られるよう調整し、適宜、変更できる。28重量%アンモニア水溶液337.5μl(一定量)に対するMPS濃度、I/N比、及び平均粒径の3者の相互関係は、後述の実施例5の表2に例示されている。
チオール基と反応する物質、例えば、マレイミド化合物と、標識分子、例えば、ローダミンとの結合物と、MPSのチオール基とを反応させることによりMPS−標識分子共役体を事前に調製する。次いで、該共役体、MPS及びアンモニア水溶液を混合の後、又は該共役体、MPS、アンモニア水溶液及びイソプロパノールを混合の後、上記(a)と同様にして、攪拌・保温することにより、標識分子含有MPS粒子を生成させる。尚、標識分子は一種以上を含有させることができる。また、MPSに限らず、他種のシリカ化合物を用い、他種のシリカ化合物−標識分子共役体を調製することも可能である。粒径は上述の通りMPS濃度により調節できる。生成MPS粒子は、採取、洗浄、及び分散の後、使用に供する。具体例は後述する実施例7に記載されている。
(d)定性試験、定量試験及び診断用の標識体:ここでいう標識体とは、MPS粒子あるいは本明細書中で記載されるその他のシリカ粒子内、表層、表面等に標識物質を包埋、包接、含有、吸着、あるいは結合させた状態のシリカ粒子を意味する。標識物質としては、定性試験、定量試験、診断、バイオアッセイ等での検出や反応のマーカーとして使用される物質、例えば、蛍光物質、発光物質、生理活性物質、機能物質、免疫学的反応物質、遺伝子等々、公知の物質を用いることができる。更に具体的には、FITC、酵素、ホルモン、TNF、抗原、抗体、サイトカイン、リガンド、レセプター、毒素、TLR、DNA、RNA等々を挙げることができる。尚、単一物質で標識されたMPS粒子はモノ標識体、また、複数物質で標識されたMPS粒子はポリ標識体あるいはバーコード体として用いることができる。
(e)定性試験、定量試験及び診断用の用具:ここでいう用具とは、その基板の表面が、固定化されたMPS粒子からなるスライドガラス、マイクロチップ、トレイ等を意味し、使用に際しては、固定化MPS粒子を介して上記(d)に例示の種々の標識物質で標識することができる。
(f)タンパク質、核酸、酵素の合成・修飾の支持体:この発明でいう支持体とは、ペプチド鎖、DNAやRNAの断片、酵素の活性中心、エピトープ等をMPS粒子表面に吸着あるいは結合させた状態で、これ等の修飾、伸長、合成、PCR等を行なうこと(MPS粒子を支持体として用いること)ができる。
(g)精製用の混合物質の吸着及び/又は溶出の媒体:この発明でいう媒体とは、例えば、MPS粒子表面のチオール基を介して不純物を結合あるいは吸着させ除去する精製用手段を意味する。また、例えば、MPS粒子表面に抗原を結合させれば、抗体精製用の媒体として用いることができる。
(h)ドラツグデリバリーシステム(DDS)の徐放体・担体例えば、MPS粒子内に薬物を含有させれば薬物徐放体として機能し、更に該徐放体MPS粒子の表面に臓器特異抗体を結合させれば、臓器特異的な(ミサイル療法用)薬物徐放体として用いることができる。
(i)非感染粒子 トレーサー シンチレーター
例えば、MPS粒子表面に感染因子の抗原を結合させれば、核酸を有しない非感染因子と
して研究に供することができる。また、MPS粒子内部に蛍光色素やRI化合物等を含有
させれば、トレーサーやシンチレーターとして使用できる。更に、これに前述のDDSの
除放体・担体機能を付加させることにより、デリバリーの評価・確認と治療を同時に行う
ことのできる治療剤、或いは診断治療両用剤として用いることができる。
(j)フローサイトメトリーの蛍光標準マーカー
例えば、MPS粒子内部への蛍光物質の取り込み、粒子表面への発光物質の結合等により
、フローサイトメトリーのビーズアッセイ用粒子又は蛍光標準マーカーとして供すること
ができる。
(k)細胞の浮遊培養の支持体
例えば、MPS粒子は、浮遊細胞培養において細胞がアンカレッジするための支持体として使用することができる。
(TEOS粒子の作製)
水125μlに、エタノール500μl、TEOS 7.5μl、及び27重量%アンモニア水溶液50μlを添加混合して、室温で24時間、攪拌・反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(10,000×g、5分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレット(生成シリカ粒子)を超音波破砕機にて攪拌の後、分散性TEOS粒子を得た。
水125μlに、エタノール500μl、MPS7.5μl及び28重量%アンモニア水溶液50μlをそれぞれ添加混合し、室温で48時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(10,000×g、5分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレット(シリカ粒子)を超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、ナノシリカ粒子の形成が確認された。
MPS7.5μlに、28重量%アンモニア水溶液675μlを添加混合し、90℃で9時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(10,000xg、5分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレット(シリカ粒子)を超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし、電子顕微鏡で観察した。その結果、シリカ粒子の平均粒径は360nm、そのサイズ制御率は約19%であり、良好なサイズ制御下でのシリカ粒子の作製が確認された。
28重量%アンモニア水溶液675μl(一定量)に対し、用いるMPS量を変量させることにより、シリカ粒子の粒径の調整・調節を行った。尚、上記のMPS量の変量以外は、実施例2の記載と全く同様にして、シリカ粒子(MPS粒子)を生成させた。その結果を表1に示す。MPS濃度の増加に伴い、粒径が増大した。即ち、MPS濃度と粒径との間には、正の相関があった。
MPS15μlに、イソプロパノール溶液337.5μl及び28重量%アンモニア水溶液337.5μlを添加混合し、95℃で3.5時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(10,000xg、5分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレット(シリカ粒子)を超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし、電子顕微鏡で観察した。その結果、シリカ粒子の平均粒径は750nm、そのサイズ制御率は約16%であり、良好なサイズ制御下でのシリカ粒子の作製が確認された。
アンモニア水溶液(一定量)に対し、用いたMPS量の変量と、I/N容量比[イソプロパノール溶液の容量(I):28重量%アンモニア水溶液の容量(N)]変更以外は、実施例4の記載と全く同様にしてシリカ粒子を作製した。その結果を表2に示す。アンモニア水溶液(一定量)に対し、用いたMPS量(濃度)と粒径との間には、正の相関があった。尚、I/N比と粒径との間には、明確な相関が見られなかった。
(ローダミン含有シリカ粒子の調製)
次の通り、(a)ローダミン(標識分子)含有シリカ化合物を事前に調製し、得られた該シリカ化合物を用いて(b)ローダミン(標識分子)含有シリカ球を調製した。
((a)ローダミン(標識分子)含有シリカ化合物の調製)
マレイミド化合物として、Rhodamine RedTM C2 maleimide(約5mg)を50μlのDMSO溶液に溶解した後、チオール基を有する(3−メルカプトプロピル)−トリメトキシシラン((3−Mercaptopropyl)−trimethoxysilan)を、上記Rhodamine RedTM C2 maleimideと等モルになるように添加混合し、2時間、チューブミキサーを用いて遮光下にて攪拌し反応させることにより、ローダミン(標識分子)含有シリカ化合物を調製し、次((b)のシリカ球の調製に供した。)
(b)ローダミン標識分子含有シリカ球の調製
上記(a)で得たローダミン(標識分子)含有シリカ化合物を含む反応溶液に7μlに、MPS 7.5μl、及び27重量%のアンモニア水溶液を約675μlを添加混合の後、100℃で約11時間、反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(10,000×g、5分間)かけ、そのペレットを採取した。該ペレットは、70%エタノールと蒸留水とを交互に使用し洗浄した。洗浄は遠心にて、合計6回、繰り返し行った。採取したペレット(シリカ粒子)を超音波破砕機にて攪拌・分散の後、サンプリングして蛍光顕微鏡で観察し、粒子がローダミンの蛍光を発していることを確認した。
(実施例6−2)
3.4Mの3−メルカプトプロピルトリエトキシシラン(3−Mercaptopropyltriethoxysilane)10μl、10mM Rhodamine RedTM C2 maleimide 5μl、イソプロパノール溶液 245μl、および28重量%アンモニア水溶液 245μlと混合して、100℃で3時間反応させた。得られた溶液(反応終了液)を、合計6回、繰り返し行った。採取したペレット(シリカ粒子)を超音波破砕機にて攪拌・分散の後、サンプリングして蛍光顕微鏡で観察し、粒子がローダミンの蛍光を発していることを確認した。
(1)MPS粒子の作製
MPS10μlに、イソプロパノール溶液405μl、及び28重量%アンモニア水溶液290μlを添加混合し、95℃で2時間、反応させた。次いで、反応終了液を、高速遠心機(10,000×g、5分間)にかけ、そのペレットを採取した。該ペレットは、70%エタノールと蒸留水とを交互に使用し洗浄した。洗浄は遠心にて、合計6回、繰り返し行った。採取したペレット(シリカ粒子)を超音波破砕機にて攪拌・分散の後、サンプリングして蛍光顕微鏡で観察したところ、平均粒径690nm、サイズ制御率約15%であり、良好なサイズ制御下での粒子の作製が確認された。
(2)ローダミン(標識分子)の表層標識による機能化
マレイミド化合物として、Rhodamine RedTM C2 maleimide(5mg)を、73.5μlのDMSO溶液に溶解の後、上記(1)で作成のMPS粒子溶液3μl加え、約2時間、チューブミキサーを用いて遮光下にて攪拌し反応させた。次いで、反応終了液を、高速遠心機(10,000×g、5分間)にかけ、そのペレットを採取した。該ペレットは、70%エタノールと蒸留水とを交互に使用し洗浄した。洗浄は遠心にて、合計6回、繰り返し行った。採取したペレット(シリカ粒子)を超音波破砕機にて攪拌・分散の後、サンプリングして蛍光顕微鏡で観察し、粒子がローダミンの蛍光を発していることを確認した。即ち、ローダミン(標識分子)表層標識による表層機能化MPS粒子の作製に成功した。
<方法>
(a)ガラス基板上にMPSシリカ粒子、及びTEOSシリカ粒子をそれぞれ0.2μl、スポットし乾燥させた;
(b)7.5μg/ml Cy3標識抗ヤギ抗体IgG(Jackson社製)を2μl滴下し、モイストチャンバー内で室温にて5分間、反応させた後、洗浄を行った;
(c)蛍光イメージアナライザー(TAKARA FM BIO II)にて各スポットの蛍光強度を測定した。
<結果>粒子スポットなし(−)、MPSナノシリカ粒子、及びTEOSナノシリカ粒子の蛍光強度はそれぞれ、8,871、32,473、及び12,751であり、MPSナノシリカ粒子は蛋白を吸着、保持し、有意に蛋白を固定できることが証明された。
<方法>(a)ガラス基板上にMPSシリカ粒子0.2μlをスポットし乾燥させた;(b)シリカ粒子のスポットに種々の濃度(10ng/ml〜30μg/ml)のヤギ抗GST抗体(Amersham社製)を2μl滴下し、モイストチャンバー内で室温にて5分間反応させた後、洗浄した;(c)1%BSAを含むPBS溶液を用い、モイストチャンバー内で室温にて10分間、ブロッキング反応を行った後、洗浄した;(d)7.5μg/ml Cy3標識抗ヤギ抗体IgG(Jakson社製)を用い、モイストチャンバー内で室温にて1時間、反応を行った後、洗浄した;(e)蛍光イメージアナライザー(TAKARA FM BIO II)にて各スポットの蛍光強度を測定した。
<結果>ヤギ抗GST抗体、30ng/ml〜30μg/mlにおいて蛍光強度の濃度依存性が確認できた。ナノシリカ粒子仲介法により、ヤギ抗体の抗原性を保持した状態でガラス板上に固定し、広範囲の濃度域において、ヤギ抗体を検出することができた。
<方法>
(a)ガラス基板上にMPSシリカ粒子0.2μlをスポットし乾燥させた;(b)シリカ粒子のスポットに精製酵素GSTを1μl滴下しモイストチャンバー内で室温にて5分間、反応を行った後、洗浄した;(c)1% BSAを含むPBS溶液でモイストチャンバー内で室温にて10分間、ブロッキング反応を行った後、洗浄した;(d)種々の濃度(10ng/ml〜30μg/ml)のヤギ抗GST抗体(Amersham社製)を2μl滴下し、モイストチャンバー内で室温にて1時間反応を行った後、洗浄した;(e)Cy3標識抗ヤギ抗体IgG(7.5μg/ml)でモイストチャンバー内で室温にて1時間反応を行った後、洗浄した;(f)蛍光イメージアナライザー(TAKARA FM BIO II)にて各スポットの蛍光強度を測定した。
<結果>ヤギ抗GST抗体、300ng/ml〜30μg/mlにおいて蛍光強度の濃度依存性が確認できた。ナノシリカ粒子仲介法によりGSTの抗原性を保持した状態でガラス板上に固定し、種々の濃度下における抗GST抗体の結合を検出することができた。
<方法>(a)ガラス基板上にMPSシリカ粒子0.2μlをスポットし乾燥させた;(b)シリカ粒子のスポットに種々の濃度(10ng/ml〜30μg/ml)のヤギ抗GST抗体(Amersham社製)を2μl滴下し、モイストチャンバー内で室温にて5分間反応を行った後、洗浄した;(c)2% Skim milkを含むPBS溶液でモイストチャンバー内で室温にて10分間、ブロッキング反応を行った後、洗浄した;(d)ローダミン標識精製酵素GSTでモイストチャンバー内で室温にて1時間反応を行った後、洗浄した;及び(e)蛍光イメージアナライザー(TAKARA FM BIO II)にて各スポットの蛍光強度を測定した。
<結果>ヤギ抗GST抗体、3〜30μg/mlにおいてローダミン標識GSTによる蛍光強度の濃度依存性が確認できた。ナノシリカ粒子仲介法によりGST抗体の抗原への結合活性を保持した状態でガラス板上に固定し、抗原を検出することができた。
5mM フルオレスセイン(標識分子)含有シリカ化合物(Fluorescein−APS)を含む反応溶液2.7μlに、MPS1μl、及び27重量%のアンモニア水溶液を約675μl添加混合の後、100℃で約10時間、反応させた。次いで、反応終了液を、高速遠心機(10,000xg、5分間)にかけ、そのペレットを採取した。該ペレットは、70%エタノールと蒸留水とを交互に使用し洗浄した。洗浄は遠心にて、合計6回、繰り返し行った。採取したペレット(シリカ粒子)を超音波破砕機にて攪拌・分散の後、粒子(平均粒径96nm)を得た。このシリカ球をフローサイトメトリーFACS CaliburHGにて測定・評価した。その結果、MPS粒子による蛍光は明確な集団及びピーク(紫色(左下図)と薄緑色(右下図): 図の位置はいずれも図2(b)の左を上に正した場合)として確認された。サイズマーカーとしてPolysc ence社Fluoresbriteを使用。図(右下)中M1のピークはサイズR1=6.0 μmに対応。本実施例において平均粒径約100nmという極めて小さい蛍光ナノシリカ粒子の蛍光検出に成功した。また蛍光強度に関してはピークがFluoresbriteのM4とM3の間、すなわち1.0μmと2.0μmの粒子の蛍光ピークの間に位置し、本粒子は約10倍のサイズのFluoresbriteと同等の蛍光強度を発していることを示している。この結果はポアの無い粒子にて高密度に色素が組み込まれた結果得られるものであると考えられる。
(A)3−メルカプト−プロピルトリエトキシシラン(3−mercapto−propyltriethoxysilane;MPES)10μ1、および28重量%アンモニア水溶液990μ1を混合して、100℃で3時間反応させた。得られ溶液(反応終了液)を、高速遠心機(10,000×g;5分間)にて遠沈させ、得られたペレットに対して70%エタノールと蒸留水を使用した洗浄を数回繰り返した。遠沈させた粒子を超音波破砕機にて攪拌して、このシリカ球を電子顕微鏡で観察したところ、平均粒径515nm、サイズ制御率約16%粒子が作製されたことを確認した。
(A)(3−メルカプトプロピル)メチルジメトキシシラン(3−Mercaptopropyl)methyldimethoxysilane;MPDMS)10μ1に28重量%アンモニア水溶液を加えて1m1として混合して、25℃で3日間反応させた。得られた溶液(反応終了液)を高速遠心機(10,000×g;5分間)にて遠沈させ、得られたペレットに対して70%エタノールと蒸留水を使用した洗浄を数回繰り返した。遠沈させた粒子を超音波破砕機にて攪拌して、このシリカ球を電子顕微鏡で観察したところ、平均粒径750nm、サイズ制御率約16%の粒子が作製できたことを確認した。
トリメトキシ[2−(7−オキサビシクロ[4.1.0]−ヘプト−3−イル)エチル]シラン(2−(3,4−エポキシシクロヘキシル)−エチルトリメトキシシラン)(Trimethoxy[2−(7−oxabicyc1o[4.1.0]−hepto−3−yl)ethy1]silane;EpoPS)7.5μ1、および28重量%アンモニア水溶液675μ1と混合して、95℃で3時間反応させた。得られた溶液(反応終了液)を、高速遠心機(10,000×g、5分間)にて遠沈させて得られたペレットに対して70%エタノールと蒸留水を使用した洗浄を数回繰り返した。遠沈させた粒子を超音波破砕機にて撹拌し、このシリカ球を電子顕微鏡で観察したところ、平均粒径1160nm、サイズ制御率約10.3%の粒子が作製できたことを確認した。
3−チオシシアナトプロピルトリエトキシシラン(3−Thiocyanatopropyl triethoxysilane;TCPS)7.5μ1、および28重量%アンモニア水溶液675μ1と混合して、99℃で3時間反応させた。得られた溶液(反応終了液)を、高速遠心機(10,000×g、5分間)にて遠沈させペレットに対して70%エタノールと蒸留水を使用した洗浄を数回繰り返した。遠沈させた粒子を超音波破砕機にて攪拌し、このシリカ球を電子顕微鏡で観察し粒子が作製できたことを確認した。平均粒径296nm、サイズ制御率35.1%の粒子が作成できたことを確認した。
3−アクリルオキシプロピルトリメトキシシラン(3−Acryloxypropyl)trimethoxysilane;AcPS)10μ1に28重量%アンモニア水溶液を加えて1m1として混合して、25℃で3日間反応させた。得られた溶液(反応終了液)を、高速遠心機(10,000×g、5分間)にて遠沈させペレットに対して70%エタノールと蒸留水を使用した洗浄を数回繰り返した。遠沈させた粒子を超音波破砕機にて撹拌し、このシリカ球を電子顕微鏡で観察したところ、平均粒径540nm、サイズ制御率約18.5%の粒子が作製できたことを確認した。
(比較例−特許文献2に記載の方法の条件に従い粒子形成を試みた場合)
特許文献2のTrauらの方法の条件に従い、本願において粒子の作製に成功している6つの新規シリカ粒子の作製を試みた。酸処理(シリカ化合物(MPS、AcPSなど)100μ1、蒸留水800μ1、0.1M HClと混合して、25℃で1200rpmの攪拌下にて反応)を2日間行った後、アンモニアによる塩基処理を行った。塩基処理(酸処理を行ったシリカ溶液 90μ1に蒸留水100μ1、28重量%アンモニア水溶液0.75μ1と混合して反応)の開始後15分間、30分間、8時間経過したサンプルを電子顕微鏡で観察を行った。
(1)スクシンイミジルエステル化合物として、Rhodamine RedTM*(約5mg)を50μlのDMSO溶液に溶解した後、アミノ基を有する3−アミノプロピル−トリメトキシシラン(APS)を上記Rhodamine RedTM C2 maleimideと等モルになるように加え、約2時間、チューブミキサーを用いて遮光下にて攪拌して反応させて、ローダミン(標識分子)含有シリカ化合物を調製した。
次いで、ローダミン(標識分子)含有シリカ化合物からローダミン(標識分子)含有シリカ球を調製した。具体的には、上記で得られたローダミン(標識分子)含有シリカ化合物を含む反応溶液から7μlとMPS7.5μl、および27重量%アンモニア水溶液を約675μl加えて、100℃で約11時間反応した。得られた溶液(反応終了液)を、高速遠心機(10,000×g、5分間)にて遠沈させペレットに対して70%エタノールと蒸留水を使用した洗浄を数回繰り返した。遠沈させた粒子を超音波破砕機にて攪拌し、このシリカ球を蛍光顕微鏡で観察し粒子がローダミンの蛍光を発していることを確認した。
(1)イソチオシアネートを用いたローダミン(標識分子)含有シリカ化合物の調製
イソチオシアネートとして、Rhodamine RedTM*(約5mg)を50μlのDMSO溶液に溶解した後、アミノ基を有する3−アミノプロピル−トリメトキシシラン(APS)を上記Rhodamine RedTM C2 maleimideと等モルになるように加え、約2時間、チューブミキサーを用いて遮光下にて攪拌して反応させて、ローダミン(標識分子)含有シリカ化合物を調製した。
次いで、ローダミン(標識分子)含有シリカ化合物からローダミン(標識分子)含有シリカ球を調製した。
次の通り、(a) 5−カルボキシテトラメチルローダミン(5−carboxytetramethylrhodamine;TAMRA)(標識分子)含有シリカ化合物を事前に調製し、得られた該シリカ化合物を用いて(b) TAMRA(標識分子)含有シリカ球を調製した。
(a)TAMRA(標識分子)含有シリカ化合物の調製
スクシンイミジルエステル化合物として、5−カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル(5−carboxytetramethylrhodamine syccinimidyl ester;5−TAMRA−SE)(約1.7mg)を85μlのDMSO溶液に溶解した後、アミノ基を有するシリカ化合物として3−(アミノプロピル)トリエトキシシラン[3−(aminopropyl)triethoxysilane](APS)を、上記5−TAMRA−SEと等モルになるように添加混合し、2時間、チューブミキサーを用いて遮光下にて攪拌し反応させることにより、TAMRA(標識分子)含有シリカ化合物を調製し、次(b)のシリカ球の調製に供した。
上記(a)で得たTAMRA(標識分子)含有シリカ化合物を含む反応溶液に30μlに、MPS 30μl、及び27重量%のアンモニア水溶液を約675μlを添加混合の後、95℃で約10時間、反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(10,000×g、5分間)かけ、そのペレットを採取した。該ペレットは、70%エタノールと蒸留水とを交互に使用し洗浄した。洗浄は遠心にて、合計6回、繰り返し行った。採取したペレット(シリカ粒子)を超音波破砕機にて攪拌・分散の後、サンプリングして蛍光顕微鏡で観察し、粒子がTAMRAの蛍光を発していることを確認した。
(27−2487−2)
次の通り、(a)Alexa Fluor 647(標識分子)含有シリカ化合物を事前に調製し、得られた該シリカ化合物を用いて(b)Alexa Fluor 647(標識分子)含有シリカ球を調製した。
(a)Alexa Fluor 647(標識分子)含有シリカ化合物の調製
マレイミド化合物として、 Alexa Fluor 647 C2−maleimide(約1mg)を50μlのDMSO溶液に溶解した後、チオール基を有する(3−メルカプトプロピル)−トリメトキシシラン((3−Mercaptopropyl)−trimethoxysilan)を、上記 Alexa Fluor 647 C2−maleimideと等モルになるように添加混合し、2時間、チューブミキサーを用いて遮光下にて攪拌し反応させることにより、Alexa Fluor 647(標識分子)含有シリカ化合物を調製し、次(b)のシリカ球の調製に供した。
上記(a)で得たAlexa Fluor 647(標識分子)含有シリカ化合物を含む反応溶液3μlに、MPS 10μl、2−プロパノロール 約337.5μl及び27重量%のアンモニア水溶液を約337.5μlを添加混合の後、100℃で約2時間、反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(10,000×g、5分間)かけ、そのペレットを採取した。該ペレットは、70%エタノールと蒸留水とを交互に使用し洗浄した。洗浄は遠心にて、合計6回、繰り返し行った。採取したペレット(シリカ粒子)を超音波破砕機にて攪拌・分散の後、サンプリングして蛍光顕微鏡で観察し、粒子がAlexa Fluor 647の蛍光を発していることを確認した。
(32−2838−B)
次の通り、(a) DY 635(標識分子)含有シリカ化合物を事前に調製し、得られた該シリカ化合物を用いて(b)DY 635(標識分子)含有シリカ球を調製した。
(a)DY 635(標識分子)含有シリカ化合物の調製
スクシンイミジルエステル化合物として、DY 635 N−hydroxysuccinimide ester(約1mg)を25μlのDMSO溶液に溶解した後、アミノ基を有するシリカ化合物として3−(アミノプロピル)トリエトキシシラン[3−(aminopropyl)triethoxysilane(APS)]を、上記DY 635と等モルになるように添加混合し、2時間、チューブミキサーを用いて遮光下にて攪拌し反応させることにより、DY 635(標識分子)含有シリカ化合物を調製し、次(b)のシリカ球の調製に供した。
上記(a)で得たDY 635(標識分子)含有シリカ化合物を含む反応溶液に5μlに、MPS 7.5μl、及び27重量%のアンモニア水溶液を約675μlを添加混合の後、100℃で約12時間、反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(10,000×g、5分間)かけ、そのペレットを採取した。該ペレットは、70%エタノールと蒸留水とを交互に使用し洗浄した。洗浄は遠心にて、合計6回、繰り返し行った。採取したペレット(シリカ粒子)を超音波破砕機にて攪拌・分散の後、サンプリングして蛍光顕微鏡で観察し、粒子がDY 635の蛍光を発していることを確認した。
(28−2560−1)
次の通り、(a) DY 495(標識分子)含有シリカ化合物を事前に調製し、得られた該シリカ化合物を用いて(b)DY 495(標識分子)含有シリカ球を調製した。
(a)DY 495(標識分子)含有シリカ化合物の調製
スクシンイミジルエステル化合物として、 DY 495−X/5−N−hydroxysuccinimide ester(約5mg)を25μlのDMSO溶液に溶解した後、アミノ基を有するシリカ化合物として3−(アミノプロピル)トリエトキシシラン[3−(aminopropyl)triethoxysilane (APS)を、上記DY 495と等モルになるように添加混合し、2時間、チューブミキサーを用いて遮光下にて攪拌し反応させることにより、DY 495(標識分子)含有シリカ化合物を調製し、次(b)のシリカ球の調製に供した。
上記(a)で得たDY 495(標識分子)含有シリカ化合物を含む反応溶液に10μlに、MPS 10μl、2−プロパノロール 約337.5μl及び27重量%のアンモニア水溶液を約337.5μlを約675μlを添加混合の後、100℃で約11時間、反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(10,000×g、5分間)かけ、そのペレットを採取した。該ペレットは、70%エタノールと蒸留水とを交互に使用し洗浄した。洗浄は遠心にて、合計6回、繰り返し行った。採取したペレット(シリカ粒子)を超音波破砕機にて攪拌・分散の後、サンプリングして蛍光顕微鏡で観察し、粒子がDY 495の蛍光を発していることを確認した。
(29−2576−2)
次の通り、(a) DY 505(標識分子)含有シリカ化合物を事前に調製し、得られた該シリカ化合物を用いて(b)DY 505(標識分子)含有シリカ球を調製した。
(a)DY 505(標識分子)含有シリカ化合物の調製
スクシンイミジルエステル化合物として、 DY 505X/5−N−hydroxysuccinimide ester(約5mg)を25μlのDMSO溶液に溶解した後、アミノ基を有するシリカ化合物として3−(アミノプロピル)トリエトキシシラン[3−(aminopropyl)triethoxysilane (APS)を、上記DY 505と等モルになるように添加混合し、2時間、チューブミキサーを用いて遮光下にて攪拌し反応させることにより、DY 505(標識分子)含有シリカ化合物を調製し、次(b)のシリカ球の調製に供した。
上記(a)で得たDY 505(標識分子)含有シリカ化合物を含む反応溶液に14μlに、MPS 15μl、及び27重量%のアンモニア水溶液を約675μlを添加混合の後、95℃で約12時間、反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(10,000×g、5分間)かけ、そのペレットを採取した。該ペレットは、70%エタノールと蒸留水とを交互に使用し洗浄した。洗浄は遠心にて、合計6回、繰り返し行った。採取したペレット(シリカ粒子)を超音波破砕機にて攪拌・分散の後、サンプリングして蛍光顕微鏡で観察し、粒子がDY 505の蛍光を発していることを確認した。
(27−2488−1)
次の通り、粒子に色素をドープさせる方法にてTris dichlororuthenium (II) hexahydrate(標識分子)含有シリカ球を調製した。
図22および図23において、図22は色素あり、図23は色素なし、です。図23と比較して図22ではFL2、FL3において蛍光発光により優位にピークが移動しているのが確認できた。粒子に色素が良好に取り込まれ、蛍光を発していることが確認できた。
(MPS NPの形成速度)
MPS NPの形成速度を、透過型電子顕微鏡(TEM)を使用して同じ条件下のTEOS NPの形成速度と比較した。
TEOS NPは、反応開始後9時間で明確に観察可能であった(図9a〜図9c)。このTEMによる研究結果において、TEOS NPは、1日経過後2日目までに有意に変化しなかった。したがって、TEOS NPは、反応時間の最初の9時間以内で完全に形成されると判断される。これとは対照的には、MPS粒子の形成は、違った形で進行する。9時間経過後に、その生成物の界面部分は不明瞭であり、そのうちのいくつかは互いに融合しおり、また別のものは別個のものとなっていた(図9d)。ついで、70%エチルアルコール/水でその生成物を洗浄して、その後遠心分離(10,000×g5分間)にかけると、ナノ粒子は回収されなかった。2日後に、明確なMPS NPが観察された(図9eおよび図9f)。これらの結果は、同じ条件下でMPS NPの形成がTEOS NPの形成より遅いことを示している。
MPSについての粒子成長過程がTEOSの粒子形成過程とは異なるものであると考えられる。ストーバー法によるTEOS NPの形成は、水酸化アンモニウムによるシリカ前駆体の加水分解で開始されて、その後、自己重合(self−polymerization)、シリカマトリクスの形成、TEOS NPの沈殿と続く。MPS NPが形成される詳細な機構は明らかになっていない。MPS反応混合物は、数時間で濁ったが、MPS粒子は、洗浄工程後に回収されなかった。まずMPSミセルが形成されて、その後、ミセル中で水酸化アンモニウムによるMPSの加水分解および重合が起こり、ナノ粒子が形成されるという、1つの過程が想定される。TEOSナノ粒子と比較した場合に、MPSナノ粒子は、反応混合物中のMPSの濃度に依存してサイズに広い分布が見られる。すなわち、TEOS NPとMPS NPのサイズ分布は異なっている。
発明者らは、以下のように蛍光色素を含むMPS NPおよびTEOS NPを合成した。
(ナノシリカ粒子のゼータ電位)
(ナノ粒子) (ゼータ電位)
−−−−−−−−−−−−−−−−
TEOS NP −38.7
ローダミンレッド含有TEOS NP −36.0
MPS NP −52.2
ローダミンレッド含有MPS NP −52.1
ローダミンレッド表層提示MPS NP −32.2
NeutrAvidin表層提示MPS NP −19.2
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
表4に示されるように、MPS NPのゼータ電位は、TEOS NPのゼータ電位よりもずっと負である。TEOS粒子ではOH基、MPS粒子ではOH基に加えてSH基が表面に存在することによりゼータ電位の違いができると考えられる。構造としては、TEOS粒子と比較して、MPS粒子は多数のSH基が表面に存在していることが理解される。ローダミンレッドをその中に含む、MPS NPおよびTEOS NPのゼータ電位は、それぞれにおいて、色素がない場合のデータ電位とさほど差異はなかった。他方、ローダミンレッド−マレイミド結合体またはNeutrAvidinマイレイミド結合体で表層処理したMPS NPのゼータ電位は、実質的に低下した。これらの結果により、ローダミンレッドを粒子内に取り込んだNPは、表層における蛍光色素の存在を示さず、その結果、そのゼータ電位に影響を与えないことを示している。本明細書でこれ以降に議論するように、チオールマレイミド反応を介してMPS NPの表層にタンパク質を結合体化すると、効果があり、NPのゼータ電位を有意に変化させ得る。なんら追加手順によらなくとも、調製したままでその表層上にはチオール残基が存在することから、MPS NPは、特別な存在であるといえる。これらは、TEOS NPと比較してゼータ電位においてずっと負である。
発明者らは、フローサイトメトリー、蛍光画像分析および蛍光顕微鏡を使用することで、MPS NPの表層改変特性を調べた。MPS NPの表層とTEOS NPの表層をその簡便性について比較するために、発明者らは、これらのNPを使用してドットブロッティングを実施した。等量のNPの各々を、ガラススライド上に滴下して乾燥させ、次いで、Cy3結合体加抗ヤギIgGを含む溶液と反応させて、蛍光画像分析装置で調べた。MPS NPのスポットは、TEOS NPのスポットと比べて、Cy3結合体加抗ヤギIgGに由来する強度が顕著に高いことを示した(図13a)。このMPSの蛍光強度は、TEOS NPの約3倍であった(図13b)。これらの結果は、スライドガラス上のMPS NPが、TEOS NPよりも多い量の蛋白質を吸着し得ることを示した。さらに、改変したMPS NPがあるガラススライドは、蛋白質吸着を有意に改善しており、これによって、MPS NPがチップベース技術にとって有益なものとなる可能性が示された。次いで、発明者らは、実施して、溶液中でのMPS NPおよびTEOS NPの表層特性を比較した。このNP溶液は、緑色蛍光蛋白質(GFP)またはフィコエリトリン結合体化ストレプトアビジンのいずれかを含む蛋白質溶液と混合した。GFPまたはフィコエリトリン結合体化ストレプトアビジンと混合した後に、MPS NPに関するフローサイトメトリーピークが、TEOS NPと比較してGFPからの蛍光のために右側に顕著にシフトした(図14)。これらの知見によって、MPS NPが、溶液中においてTEOS NPと比べてより効率的に蛋白質を吸着することが示された。顕微鏡による観察を、表層上の蛋白質により改変したMPS NPの分散を評価するために実施した。GFPを含む溶液と混合されたこれらのMPS NP溶液は、はっきりとした蛍光を示してNPが良好に分散したことを示している(図14)。これらの知見によって、TEOS NPと比較したときに、MPS NPはGFPで非常に効率的に改変され得るが、他方で、TEOS NPよりも良好な分散性を保持していることが示された。GFPで改変されたMPS NPは、フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡により検出および観察され得た。MPS NPを用いたフローサイトメトリーを使用するビーズアッセイを含む生物学的研究でのMPS NPの潜在する有用性は、おおいに期待できる。
本発明のMPSシリカ粒子に対して蛍光標識した蛋白と直接反応させ粒子上に結合させた後、フローサイトメトリーで評価する一次反応検出、並びに抗原溶液を反応させ粒子上に結合させた後、洗浄し蛍光標識した抗体と反応させる二次反応検出を行った。
種々の濃度(39.1〜10,000ng/ml)のFITC標識抗ヒツジ抗体IgG溶液を作製した。各濃度のFITC標識抗ヒツジ抗体IgG溶液5μlと粒子溶液5μlをフローサイトメーター用試験管に加え、よく混和した後、(特に反応のための時間を加えず)490μlの蒸留水で希釈しフローサイトメトリーで測定を行った。
図16は、短時間でFITC標識抗ヒツジ抗体IgG溶液が濃度依存的に粒子に結合していることを示し、上段のグラフは、FITC標識抗ヒツジ抗体IgG溶液の濃度とその結合により粒子より検出された蛍光強度の相関であって、その縦軸は、蛍光強度であり、横軸は、FITC標識抗ヒツジ抗体IgG溶液の濃度である。また、下段のグラフは、チャートであり、抗体濃度により各ピークが濃度依存的に変化していることを示す。測定対象溶液が5μlと微量の資料に対して数十ng/mlから数μg/mlまで濃度依存的に迅速に測定することができた(下記の表に示した結果をプロットしたものが図16の上段のグラフであり、フローサイトメトリーの所見が下段である。10000 ng/mlは下図最も右の青に対応してしている)。
---------------------------------------------------
39.0625 1.59
78.125 2.09
156.25 3.59
312.5 6.43
625 20.48
1250 54.32
2500 90.31
5000 119.38
10000 147.3
---------------------------------------------------
・実験2
種々の濃度(0.01〜100ng/ml)FITC標識抗ヒツジ抗体IgG溶液を作製した。各濃度のFITC標識抗ヒツジ抗体IgG溶液600μlと粒子溶液5μlをフローサイトメーター用試験管に加え、よく混和した後、10分間反応させた後フローサイトメトリーで測定を行った。
Ab (ng/ml) GeoMean
---------------------------------------------------
0.01 1.81
0.03 4.16
0.1 11.71
0.3 51.59
1 178.94
3 530.67
10 1245.35
30 2033.65
100 2911.65
---------------------------------------------------
・実験3
粒子溶液5μlに抗種々の濃度(20〜10,000ng/ml)のヒツジ抗グルタチオン−S−トランスフェラーゼ抗体溶液を混合した後、5mg/mlウシ血清アルブミン水溶液 5μlを加え、ブロッキングを行った。次に25μg/ml FITC標識抗ヒツジ抗体IgG溶液5μlを加え、よく混和した後、(特に反応のための時間を加えず)480μlの蒸留水で希釈しフローサイトメトリーで測定を行った。
---------------------------------------------------
Ab (ng/ml) GeoMean
---------------------------------------------------
9.766 3.53
19.53125 3.75
39.0625 5.21
78.125 10.95
156.25 26.55
312.5 52.22
625 97.39
1250 230.32
2500 332.37
5000 393.91
10000 419.14
---------------------------------------------------
したがって、本発明により得られた粒子を用いて定量が可能であると解釈することができ、本発明の「ポアの無い粒子」では、有効付着表面積は単純に粒子の粒径に依存するため定量的な実験において有利であることが実証された。また、微量迅速反応系にて数十ng〜1μg/mlまでの標識抗体が検出でき、量依存性が確認できた。これまで、フローサイトメトリーでの定量はポアのある粒子を用いたものでも、未だ一般化されていない。その理由として有効付着表面積の制御の難しさのためのである。それに加えて、この従来法においては、フローサイトメトリーでの定量で必要とされる散乱光(FSC、SCC)に関して定量に適したシグナルが再現性よく得られるとの報告はこれまで行われていない。したがって、従来技術を用いた限りでは、蛍光変動のある粒子群の特定が困難であるため、正確な定量が困難であるとの欠点を解消しきれないと考えられる。フローサイトメトリーにおいてはまず散乱光で粒子群の特定を行い、その後、その粒子群の蛍光の変化を測定する、という方法が一般的である。したがって、散乱光評価が不十分なこれまでの技術では、本発明のとは対照的に、ビーズアッセイへ良好な適用が望めないことは明らかである(例えば、特許文献2においてフローサイトメトリーの従来法による結果が示されているが、粒子のシグナルは極めて広範囲に分布しており、各パラメーターの相関は認められない)。このような点に鑑みて、本発明のシリカ粒子は、ハイスループット解析のための粒子のサイズや蛍光の違いによるバーコード化に関しても利用できることを示している。
(本発明の粒子と市販標準ビーズとの比較)
フローサイトメトリーを用いて粒子のサイズ分布を評価した。市販標準ビーズであるPolyscience社のFluoresbriteとの比較も行った。フローサイトメトリーのパラメーターは側方散乱(SSC)とした。その他の比較実験の手順・条件・プロトコルは、以下のとおりである。本発明のチオールシリカ粒子(MPS、MPES、MPDMS)は実施例2または実施例5に記載されるように)合成した。粒子の希釈を行いフローサイトメトリーFACS CaliburHGにて測定・評価した。
すなわち、0.25μmから6μmのビーズの直径とFSC並びにSSCの値をプロット(図21左)すると3μm以上ではFSC、SSC共サイズと相関するのに対して2μm以下(図21右)ではFSCよりむしろSSCがサイズがよく相関することが分かったことから側方散乱光を利用した。
さらに、中段は、各粒子の電子顕微鏡像を示す。(図19;左上;YG1,右上:YG−0.75,左下;YG−0.5,右下;YG−0.2。図20;左上;33−2894−6,右上:33−2899−1,左下;33−2899−2,右下;33−2909−3。)。この顕微鏡像から、各粒子ともサイズが良好に制御されているであることがわかる。これらの使用したシリカ粒子は実施例2〜5、13〜17に記載されるように合成した。
上述の「ビーズアッセイへの応用の実施例および比較例「市販標準ビーズとの比較」の結果は、フローサイトメトリーによる評価と電子顕微鏡による評価の結果に若干の解離はあるものの、市販標準ビーズと本発明のビーズ共に良好なサイズ制御が確認できた。またフローサイトメトリーにおける評価において本発明の粒子は市販標準ビーズと比べほぼ良好な所見であった。
本発明のナノシリカ粒子(MPES)について、BET法を使用して、その細孔分布および比表面積の測定を行った。測定機器は、ベックマン・コールター社製 比表面積細孔分布測定装置SA−3100を使用した。細孔容積は、0.0159(m3/g)であった。細孔容積はポアが少ないほど低い。種々の可能性を考えたとしても、本発明のナノシリカ粒子の細孔容積は、少なくとも0.1(m3/g)以下である。細孔容積に関しては、粒子のサイズに影響されることは少なく、ポアの少ない粒子としての特徴づけが可能と考えられる。
MPS4.75μl、EpoS 6.25μl及び28重量%アンモニア水溶液455μlをそれぞれ添加混合し、高温(ヒートブロックにて99℃)で6時間反応させた。次いで、反応終了液を電子顕微鏡で観察した。その結果、ナノシリカ粒子の形成が確認された。
MPS 0.59μl、MPDMS 0.59μl及び28重量%アンモニア水溶液462μlをそれぞれ添加混合し、25度で24時間反応させた。次いで、反応終了液を電子顕微鏡で観察した。その結果、ナノシリカ粒子の形成が確認された。
MPES0.59μl、MPDMS0.94μl及び28重量%アンモニア水溶液451μlをそれぞれ添加混合し、25度で24時間反応させた。次いで、反応終了液を電子顕微鏡で観察した。その結果、ナノシリカ粒子の形成が確認された。
使用するシリカ粒子は実施例6に記載されるように合成した。ローダミン含有ナノシリカ粒子をマウス(Balbc/6J,9週齢、雄)に腹腔内投与を行った。投与の翌日、腹腔内の細胞を回収した。得られた細胞を蛍光顕微鏡で観察したところ図の様にローダミンの蛍光を認める細胞が観察できた。さらに腹腔内の細胞を電子顕微鏡にて観察を行ったところ図に示した通り、ナノシリカ粒子が細胞質に認められた。これらはマクロファージの貪食能を利用して蛍光ナノシリカ粒子をプローブとして細胞を標識できることを示している。また標識した細胞は蛍光顕微鏡にてその蛍光、電子顕微鏡にて粒子像として検出できる。
問わず定性試験や定量試験用の標識体あるいはマーカー等として提供かつ利用できる。
定性試験、定量試験、診断等での有力かつ強力な手段を提供する。
図面の簡単な説明
[0012]
[図1]図1において、(a)は、参考例1において得られた電子顕微鏡像である。(b)は、実施例2において得られた電子顕微鏡像である。(c)は、実施例4において得られた電子顕微鏡像である。(d)は、実施例6−1において得られた電子顕微鏡像である。(e)は、実施例7において得られた蛍光顕微鏡である。
[図2]図2において、(a)は、本発明の蛍光性シリカ粒子の蛍光顕微鏡像である。ここで、3.4Mの3−メルカプトプロピルトリエトキシシラン(3−Mercaptopropyltriethoxysilane)10μl、10mM Rhodamine RedTM C2 maleimide 5μl、イソプロパノール溶液245μl、および28重量%アンモニア水溶液245μlと混合して、100℃で3時間反応させた。得られた溶液(反応終了液)を、合計6回、繰り返し行った。採取したペレット(シリカ粒子)を超音波破砕機にて攪拌・分散の後、サンプリングして蛍光顕微鏡で観察し、粒子がローダミンの蛍光を発していることを確認した。(b)は、実施例12のフローサイトメトリーの結果を示す。
[図3]図3は、MPES由来チオール含有粒子の電子顕微鏡像を示す。(A)3−メルカプト−プロピルトリエトキシシラン10μ1、および28重量%アンモニア水溶液990μ1を混合して、100℃で3時間反応させ、得られ溶液(反応終了液)を、高速遠心機(10,000×g;5分間)にて遠沈させ、得られたペレットに対して70%エタノールと蒸留水を使用した洗浄を数回繰り返して、遠沈させた粒子を超音波破砕機にて攪拌し、このシリカ球を電子顕微鏡で観察した結果である。平均粒径515nm、サイズ制御率約16%粒子が作製された。(B)3−メルカプト−プロピルトリエトキシシラン10μ1、およびイソプロパノール溶液445μ1、および28重量%アンモニア水溶液445μ1を添加混合して、100℃で3時間反応させ、得られ溶液(反応終了液)を、高速遠心機(10,000×g;5分間)にて遠沈させ、得られたペレットに対して70%エタノールと蒸留氷を使用した洗浄を数回繰り返し、遠沈させた粒子を超音波破砕機にて撹拌して、このシリカ球を電子顕微鏡で観察した結果である。平均粒径1130nm、サイズ制御率約13%の粒子が作製できたことを確認した。
[図4]図4は、MPDMS由来チオール含有粒子の電子顕微鏡像を示す。(3−メルカ
参考例1
[0044]
(MPSによるシリカ粒子の作製)
水125μlに、エタノール500μl、MPS7.5μl及び28重量%アンモニア水溶液50μlをそれぞれ添加混合し、室温で48時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(10,000×g、5分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレット(シリカ粒子)を超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし電子顕微鏡で観察した。その結果、ナノシリカ粒子の形成が確認された。
実施例2
[0045]
(平均粒径が500nm以下(サイズ制御率±20%以下)のシリカ粒子の作製)
MPS7.5μlに、28重量%アンモニア水溶液675μlを添加混合し、90℃で9時間反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(10,000xg、5分間)にかけ、そのペレットを採取した。得られたペレットは、70容量%エタノールと蒸留水とを用い、それぞれ交互に3回、合計6回、遠心による洗浄を繰返した。次に、洗浄済みペレット(シリカ粒子)を超音波破砕機にて攪拌の後、サンプリングし、電子顕微鏡で観察した。その結果、シリカ粒子の平均粒径は360nm、そのサイズ制御率は約19%であり、良好なサイズ制御下でのシリカ粒子の作製が確認された。
実施例3
[0046]
(MPS変量によるシリカ粒子の粒径の調節)
28重量%アンモニア水溶液675μl(一定量)に対し、用いるMPS量を変量させることにより、シリカ粒子の粒径の調整・調節を行った。尚、上記のMPS量の変量以外は、実施例2の記載と全く同様にして、シリカ粒子(MPS粒子)を生成させた。その結果を表1に示す。MPS濃度の増加に伴い、粒径が増大した。即ち、MPS濃度と粒径との間には、正の相関があった。
[0047]
[表1]
マレイミド化合物として、Rhodamine RedTM C2 maleimide(約5mg)を50μlのDMSO溶液に溶解した後、チオール基を有する(3−メルカプトプロピル)−トリメトキシシラン((3−Mercaptopropyl)−trimethoxysilan)を、上記Rhodamine RedTM C2 maleimideと等モルになるように添加混合し、2時間、チューブミキサーを用いて遮光下にて攪拌し反応させることにより、ローダミン(標識分子)含有シリカ化合物を調製し、次((b)のシリカ球の調製に供した。)
(b)ローダミン標識分子含有シリカ球の調製
上記(a)で得たローダミン(標識分子)含有シリカ化合物を含む反応溶液に7μlに、MPS 7.5μl、及び27重量%のアンモニア水溶液を約675μlを添加混合の後、100℃で約11時間、反応させた。次いで、反応終了液を高速遠心機(10,000×g、5分間)かけ、そのペレットを採取した。該ペレットは、70%エタノールと蒸留水とを交互に使用し洗浄した。洗浄は遠心にて、合計6回、繰り返し行った。採取したペレット(シリカ粒子)を超音波破砕機にて攪拌・分散の後、サンプリングして蛍光顕微鏡で観察し、粒子がローダミンの蛍光を発していることを確認した。
[0052]
この確認は従来技術と比較して非常に有益な特性を本発明が有することを意味する。すなわち、アミノ基と反応するN−ヒドロキシスクシンイミドエステルと蛍光色素が結合したものとAPSのアミノ基を反応させることによりAPS−蛍光色素共役体を形成させ、それとTEOSなどを用いたシリカ粒子作成の際に混ぜ込むことにより蛍光色素を含有したシリカ粒子などの場合には、未反応のAPSのアミノ基(正電荷)がシリカのSi−O−(負電荷)と中和してしまい粒子の表面電荷の低下により粒子凝集が起っていたが、本実施例においては、チオール基と反応するマレイミドと蛍光色素が結合したものとMPSのチオール基を反応させることによりMPS−蛍光色素共役体を形成させ、それとMPSを用いたシリカ粒子作製の際に混ぜ込むことにより蛍光色素を含有したMPSシリカ粒子を凝集を引き起こすことなく作製することできた。
(実施例6−2)
[0053]
(一段階反応による色素を含有するシリカ粒子を作製方法)
3.4Mの3−メルカプトプロピルトリエトキシシラン(3−Mercaptopropyltriethoxysilane)10μl、10mM Rhodamine RedTM C2 maleimide 5μl、イソプロパノ
粒径1130nm、サイズ制御率約13%の粒子が作製できたことを確認した。
参考例14
[0062]
(MPDMS由来チオール含有粒子の作製)
(A)(3−メルカプトプロピル)メチルジメトキシシラン(3−Mercaptopropyl)methyldimethoxysilane;MPDMS)10μ1に28重量%アンモニア水溶液を加えて1m1として混合して、25℃で3日間反応させた。得られた溶液(反応終了液)を高速遠心機(10,000×g;5分間)にて遠沈させ、得られたペレットに対して70%エタノールと蒸留水を使用した洗浄を数回繰り返した。遠沈させた粒子を超音波破砕機にて攪拌して、このシリカ球を電子顕微鏡で観察したところ、平均粒径750nm、サイズ制御率約16%の粒子が作製できたことを確認した。
実施例15
[0063]
(EpoPSによるシリカ粒子の作製)
トリメトキシ[2−(7−オキサビシクロ[4.1.0]−ヘプト−3−イル)エチル]シラン(2−(3,4−エポキシシクロヘキシル)−エチルトリメトキシシラン)(Trimethoxy[2−(7−oxabicyclo[4.1.0]−hepto−3−yl)ethyl]silane;EpoPS)7.5μ1、および28重量%アンモニア水溶液675μ1と混合して、95℃で3時間反応させた。得られた溶液(反応終了液)を、高速遠心機(10,000×g、5分間)にて遠沈させて得られたペレットに対して70%エタノールと蒸留水を使用した洗浄を数回繰り返した。遠沈させた粒子を超音波破砕機にて撹拌し、このシリカ球を電子顕微鏡で観察したところ、平均粒径1160nm、サイズ制御率約10.3%の粒子が作製できたことを確認した。
実施例16
[0064]
(TCPSによるシリカ粒子の作製)
3−チオシシアナトプロピルトリエトキシシラン(3−Thiocyanatopropyl triethoxysilane;TCPS)7.5μ1、および28重量%アンモニア水溶液675μ1と混合して、99℃で3時間反応させた。得られた溶液(反応終了液)を、高速遠心機(10,000×g、5分間)にて遠沈させペレットに対して70%エタノールと蒸留水を使用した洗浄を数回繰り返した。遠沈させた粒子を超音波破砕機にて攪拌し、このシリカ球を電子顕
微鏡で観察し粒子が作製できたことを確認した。平均粒径296nm、サイズ制御率35.1%の粒子が作成できたことを確認した。
参考例17
[0065]
(AcPS由来チオール含有粒子の作製)
3−アクリルオキシプロピルトリメトキシシラン(3−Acryloxypropyl)trimethoxysilane;AcPS)10μ1に28重量%アンモニア水溶液を加えて1m1として混合して、25℃で3日間反応させた。得られた溶液(反応終了液)を、高速遠心機(10,000×g、5分間)にて遠沈させペレットに対して70%エタノールと蒸留水を使用した洗浄を数回繰り返した。遠沈させた粒子を超音波破砕機にて撹拌し、このシリカ球を電子顕微鏡で観察したところ、平均粒径540nm、サイズ制御率約18.5%の粒子が作製できたことを確認した。
[0066]
(比較例2)
(比較例−特許文献2に記載の方法の条件に従い粒子形成を試みた場合)
特許文献2のTrauらの方法の条件に従い、本願において粒子の作製に成功している6つの新規シリカ粒子の作製を試みた。酸処理(シリカ化合物(MPS、AcPSなど)100μ1、蒸留水800μ1、0.1M HClと混合して、25℃で1200rpmの攪拌下にて反応)を2日間行った後、アンモニアによる塩基処理を行った。塩基処理(酸処理を行ったシリカ溶液90μ1に蒸留水100μ1、28重量%アンモニア水溶液0.75μ1と混合して反応)の開始後15分間、30分間、8時間経過したサンプルを電子顕微鏡で観察を行った。
[0067]
以下の表は、特許文献2において記載された方法の条件により本発明の粒子(MPS、MPES、MPDMS、AcPS、EpoS、TcPS)を試みた場合の粒子作製結果である。粒子形成あり(○)、なし(×)、未成熟粒子あり(△)を示すものである。ここで示した時間は、酸処理(2日間)の後に行った、塩基処理開始後の経過時間(15分間、30分間、8時間)である。
[0068]
[表2A]
Claims (12)
- メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPS)、メルカプトプロピルトリエトキシシラン(MPES)、メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン(MPDMS)、トリメトキシ[2−(7−オキサビシクロ[4.1.0]−ヘプト−3−イル)エチル]シラン(EpoPS)、チオシシアナトプロピルトリエトキシシラン(TCPS)およびアクリルオキシプロピルトリメトキシシラン(AcPS)からなる群より選択される1種または数種のシリカ化合物を含む、シリカ粒子。
- 機能性物質を表層または内部に含む、請求項1に記載のシリカ粒子であって、
該機能性物質が、蛍光性物質、蛋白質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖鎖およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、シリカ粒子。 - 該機能性物質が、蛍光性物質である場合、
該蛍光性物質は、ローダミンレッド、フルオロセイン、ヘキサン酸−6−(テトラメチルローダミン-5-カルボキサミド)、ヘキサン酸−5−(テトラメチルローダミン-5-カルボキサミド)、Alexa Fluor 647、DY 635、DY 485、DY 495、DY 505およびトリスジクロロツテニウム(II)ヘキサハイドレートからなる群より選択され、
該蛍光性物質は、単独、またはN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、イソチオシアネート(ITC)およびマレイミドから選択される化合物と結合している形態で内部に含まれるかまたは表層に存在する、
請求項2に記載のシリカ粒子。 - 請求項1〜3のいずれか1項に記載されたシリカ粒子を含む、シリカ粒子群。
- フローサイトメトリー、サイズマーカー、ビーズアッセイおよびプローブに使用される、請求項1〜3のいずれかに記載のシリカ粒子、または請求項4に記載のシリカ粒子群を含む、標準マーカー。
- 請求項1〜3のいずれかに記載のシリカ粒子、または請求項4に記載のシリカ粒子群を含む、核酸または蛋白質の合成または細胞培養の用途で使用される、支持体。
- シリカ粒子またはシリカ粒子群の作製方法であって、
(a)シリカ化合物とアンモニア水溶液との混合物を作製する工程;および
(b)所定の温度条件下で該シリカ化合物と該アンモニア水溶液を反応させる工程;
を包含する、方法であり、
ここで、該シリカ化合物は、メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPS)、メルカプトプロピルトリエトキシシラン(MPES)、メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン(MPDMS)、トリメトキシ[2−(7−オキサビシクロ[4.1.0]−ヘプト−3−イル)エチル]シラン(EpoPS)、チオシシアナトプロピルトリエトキシシラン(TCPS)およびアクリルオキシプロピルトリメトキシシラン(AcPS)からなる群より選択される1種または数種のシリカ化合物であり、
工程(a)および(b)における、アンモニア水溶液および温度条件は、
(i)高温(80〜100℃の温度範囲);または
(ii)高アンモニア濃度(最終濃度25%以上)
のいずれかまたは両方の条件を満たすように実施される、方法。 - 前記工程(b)がイソプロパノール存在下で実施される、請求項7に記載の方法。
- 前記温度条件が室温であるか、またはアンモニア水溶液の濃度が、最終濃度2%以上
5%以下である低アンモニア濃度である、請求項7に記載の方法。 - シリカ粒子群であって、
(1)ナノサイズからミクロンサイズ範囲である5nm〜5μmに調節された平均粒径を有することと
(2)粒径分布幅が平均粒径の±25%以内にある狭域分布性であること
との特徴を有する、シリカ粒子群。 - 請求項1〜3のいずれかに記載されるシリカ粒子を含む、請求項10に記載のシリカ粒子群。
- 請求項1〜3のいずれかに記載されるシリカ粒子であって、
(1)無孔性であること;
(2)マクロポアを含まないこと;
(3)実質的に球状であること;
(4)20nm以上のポアを含まないこと;
(5)細孔容積が、0.1(m3/g)以下である;および
(6)粒径が5nm〜5μmの範囲であること
からなる群より選択される1つ以上の特徴を有する、シリカ粒子。
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