JPWO2007136042A1

JPWO2007136042A1 - 脳損傷改善剤

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Publication number: JPWO2007136042A1
Application number: JP2008516688A
Authority: JP
Inventors: 敦彦大平; 義朗佐藤; 圭子中西; 前田　浩; 浩前田
Original assignee: Aichi Prefecture; Seikagaku Corp
Current assignee: Aichi Prefecture; Seikagaku Corp
Priority date: 2006-05-19
Filing date: 2007-05-21
Publication date: 2009-10-01
Anticipated expiration: 2027-05-21
Also published as: CA2652675C; CN101489582A; JP5279491B2; US20090196858A1; KR101368742B1; KR20090018821A; EP2042190A4; WO2007136042A1; CN101489582B; CA2652675A1; EP2042190A1

Abstract

本発明は、コンドロイチン硫酸分解酵素と、神経幹／前駆細胞の少なくとも一方を有効成分として含有する、酸素欠乏により引き起こされる脳損傷の改善用の医薬組成物を提供する。

Description

本発明は、酸素欠乏により惹起される脳損傷の改善および抑制剤等に関する。

日本人の三大死因として知られている脳卒中の１つである、血栓性脳梗塞や塞栓性脳梗塞のような虚血性脳疾患は、飽食と運動不足である現代人の生活習慣の点からも問題となっており、当該疾患の対応手段について研究が盛んである。また、医療技術の進歩により未熟児や病的新生児の生存率及び予後は飛躍的に改善しつつあるにも係わらず、新生児における虚血性脳疾患の１つである低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）の発生は依然として多く、出生１０００人あたり２〜４人の罹患率である。このＨＩＥは脳性麻痺の主たる原因となっているが、有効な治療法は現在のところ脳低体温療法のみであり、更に、このような周産期の脳損傷に起因する脳性麻痺などの疾患は、近年の低出生体重児の増加に伴い増加傾向にあり、新生児医療の分野においては問題となっている。そして、このような酸素欠乏に起因する脳損傷の抑制方法の開発が望まれている。

一方、近年、幹細胞を用いた再生医療が、「失われた細胞を再生して補う」という観点に基づく新しい治療法として注目されており、多くの疾患や臓器の損傷について研究開発が盛んに行われ、臨床応用されつつある。
神経系における再生医療に関する研究成果として、神経幹／前駆細胞を成体ラットやサルの脊髄の損傷部位に移植することにより脊髄の損傷部位の修復に有効であることや、成体ラットの打撲による脊髄の損傷部位において、神経幹／前駆細胞の移植と共にコンドロイチナーゼＡＢＣを投与すると損傷した脊髄の再生により有効であると報告されている（非特許文献１）。しかし、これらは脊髄に対する効果であり、脳に対する効果は報告されておらず、また、成体の脳への発達段階であり、成体の脳と比較し重さも軽く、神経回路も未発達である新生仔の脳における適用及び効果については一切報告されていない。また、神経移植片とコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素を用いることにより、シュワン細胞基底層での軸索伸張を促進し、切断された神経を修復すると報告されている（特許文献１）。しかし、この報告は、末梢神経における外科的処置が必要とされている神経断裂への処置において、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンで前もって処理した移植片を用いる実験結果であり、中枢神経における低酸素状態により惹起される損傷への適用については報告が無い。

特表２００５−５００３７５号公報ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（European Journal of Neuroscience）、フェデレーション・オブ・ヨーロピアン・ニューロサイエンス・ソサイエティーズ（Federation of European Neuroscience Societies）、２００５年、第２２巻、ｐ．３０３６−３０４６

本発明は、脳細胞へ酸素供給が十分に行われないために引き起こされる脳損傷を有効に改善等するツールを提供することを課題とする。

本発明者らは、低酸素性及び虚血性脳障害に対する処置について再生医療の観点から鋭意検討を行った。その結果、酸素欠乏（低酸素状態）により惹起される脳損傷において、コンドロイチン硫酸分解酵素と神経幹／前駆細胞とを併用することにより、脳損傷の改善が見られることを見出し、本発明に至った。

すなわち、本発明によれば、下記が提供される。
（１）コンドロイチン硫酸分解酵素と、神経幹細胞および神経前駆細胞の何れか少なくとも一方とを有効成分として含有する、酸素欠乏により引き起こされる脳損傷の改善用の医薬。
（２）酸素欠乏により引き起こされる脳損傷が、低酸素虚血により引き起こされるものである、（１）に記載の医薬。
（３）コンドロイチン硫酸分解酵素が、コンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＡＣ及びヒアルロニダーゼからなる群より選択される一又は複数の酵素であることを特徴とする、（１）または（２）に記載の医薬。
（４）コンドロイチン硫酸分解酵素が、コンドロイチン硫酸の構成二糖単位において、Ｎ−アセチルガラクトサミンの４位水酸基が硫酸化されている構成二糖単位から成るコンドロイチン硫酸を分解する酵素である、（１）または（２）に記載の医薬。
（５）コンドロイチン硫酸分解酵素が、コンドロイチナーゼＡＢＣまたはコンドロイチナーゼＡＣ類である（１）または（２）に記載の医薬。
（６）コンドロイチン硫酸分解酵素がコンドロイチナーゼＡＢＣである、（１）または（２）に記載の医薬。
（７）神経幹細胞および神経前駆細胞が脳由来であることを特徴とする、（１）〜（６）のいずれか一項に記載の医薬。
（８）神経幹細胞および神経前駆細胞が培養された神経幹細胞および神経前駆細胞である、（１）〜（６）のいずれか一項に記載の医薬。
（９）成体への発達過程にある脳に適用されることを特徴とする、（１）〜（８）のいずれか一項に記載の医薬。
（１０）新生児又は新生仔の脳に適用されることを特徴とする、（１）〜（８）のいずれか一項に記載の医薬。
（１１）新生児低酸素性虚血性脳症改善剤である、（１）〜（１０）のいずれか一項に記載の医薬。
（１２）脳の梗塞領域の低減剤である、（１）〜（１０）のいずれか一項に記載の医薬。
（１３）脳組織の保護剤である、（１）〜（１０）のいずれか一項に記載の医薬。
（１４）コンドロイチン硫酸分解酵素を有効成分とする酸素欠乏により引き起こされる脳損傷の改善補助剤。
（１５）（１）〜（１３）のいずれか一項に記載の医薬の製造のための、コンドロイチン硫酸分解酵素と、神経幹細胞および神経前駆細胞の何れか少なくとも一方との使用。
（１６）（１４）に記載の改善補助剤の製造のための、コンドロイチン硫酸分解酵素の使用。
（１７）コンドロイチン硫酸分解酵素と、神経幹細胞および神経前駆細胞の何れか少なくとも一方とを含む、酸素欠乏により引き起こされる脳損傷の改善に使用するキット。
（１８）コンドロイチン硫酸分解酵素と、神経幹細胞および神経前駆細胞の何れか少なくとも一方とを脳の損傷部位に適用することを含む、酸素欠乏により引き起こされる脳損傷を処置する方法。

生後７日齢のＳＤ系ラットにおける酸素欠乏による脳損傷の状態を示す図である（写真）。CXは、大脳皮質(cerebral cortex)を表す。CA2は、海馬CA2野(hippocampal CA2 region)を表す。CA3は、海馬CA3野(hippocampal CA3 region)を表す。Denは、歯状回門(dentate hilus)を表す。THは、視床(thalamus)を表す。STは、線条体(striatum)を表す。神経幹細胞とＣ−ＡＢＣとの併用による効果（脳の重量比）を示す図である。神経幹細胞とＣ−ＡＢＣとの併用による効果（非梗塞部位の面積比）を示す図である。

以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
なお、本明細書における「神経幹／前駆細胞（neural stem/progenitor cell）」は、神経幹細胞（neural stem cell）単独、神経前駆細胞（neural progenitor cell）単独、及び「神経幹細胞と神経前駆細胞との共存物」を包含する意味であり、「神経前駆細胞」とは、神経細胞の前駆細胞を示す。

本発明のコンドロイチン硫酸分解酵素は、酸素欠乏により引き起こされる脳の損傷に対して効率的に損傷を改善や抑制等するために、後述の神経幹／前駆細胞と共に用いられるものである。
本発明に用いられるコンドロイチン硫酸分解酵素は、上述のように酸素欠乏（低酸素状態）により引き起こされる脳の損傷に対して用いられ、且つ、適用時に神経幹／前駆細胞と共に用いられるものである限りにおいて、特に限定されるものではない。

コンドロイチン硫酸分解酵素としては数々のものが知られており、具体的には、コンドロイチン硫酸を脱離反応によって分解する酵素と、コンドロイチン硫酸を加水分解する酵素とが挙げられる。前者はリアーゼとして分類されており、例えば、コンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＡＣ類（コンドロイチナーゼＡＣＩ、コンドロイチナーゼＡＣII、コンドロイチナーゼＡＣIII）、コンドロイチナーゼＣ及びコンドロイチン硫酸ＡＢＣエキソリアーゼなどが例示される。後者としては、例えば、ヒアルロニダーゼや特許第3759774号公報に記載されているヒト由来のコンドロイチン硫酸分解酵素などが例示され、ヒアルロニダーゼとしては、Trends in Glycoscience and glycotechnology 89(2004)pp171-185に記載されているヒアルロニダーゼ（HYAL4）が挙げられる。これらの酵素のいずれも、本発明において用いることができ、これらの酵素を一種だけでなく、複数種組み合わせて用いることも出来る。

なかでも、本発明に用いられるコンドロイチン硫酸分解酵素としては、コンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＡＣ類、ヒアルロニダーゼおよび特許第3759774号公報に記載されているヒト由来のコンドロイチン硫酸分解酵素が好ましく、リアーゼがより好ましく、コンドロイチナーゼＡＢＣおよびコンドロイチナーゼＡＣＩＩが最も好ましい。また、脳には、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチルガラクトサミンとから成るコンドロイチン硫酸の構成二糖単位において、Ｎ−アセチルガラクトサミンの４位水酸基が硫酸化されている構成二糖単位から成るコンドロイチン硫酸（コンドロイチン硫酸Ａ）が多く存在しており、本発明においては、当該コンドロイチン硫酸を分解する活性を有する酵素が好ましく選択される。

なお、特許第3759774号公報に記載されているヒト由来のコンドロイチン硫酸分解酵素とは、具体的には下記（１）〜（５）の理化学的性質を有する酵素である。
（１）作用：グリコサミノグリカンのＮ−アセチルヘキソサミニド結合を加水分解する。
（２）基質特異性：ｐＨ５において、コンドロイチン硫酸に作用し、ヒアルロン酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸及びヘパリンには作用しない。ｐＨ３．５において、コンドロイチン硫酸及びヒアルロン酸に作用する。
（３）至適反応ｐＨ：ｐＨ５付近（基質：コンドロイチン硫酸、緩衝液：０．１５ＭＮａＣｌを含む５０ｍＭクエン酸−Ｎａ₂ＨＰＯ₄緩衝液、温度：３７℃）
（４）等電点：ｐＨ５付近
（５）分子量：末端にアリル基を有するコンドロイチン硫酸鎖を共重合させたポリアクリルアミドゲルを用いたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、約３６ｋＤａである。

本発明において使用することができるコンドロイチン硫酸分解酵素の由来も、上述のコンドロイチン硫酸分解酵素である限りにおいて限定されない。酵素の由来としては、例えばヒト由来、動物由来、細菌由来等を例示することができる。また、天然物由来の酵素はもちろん、遺伝子工学的に製造した組換酵素等を例示することもできる。これらのいずれの由来の酵素も、本発明において使用することができる。

なかでも、本発明において好ましく用いられる酵素としては、例えば、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）由来のコンドロイチナーゼＡＢＣ、フラボバクテリウム・ヘパリナム（Flavobacterium heparinum）由来のコンドロイチナーゼＡＣI、アースロバクター・オーレッセンス（Arthrobacter aurescens）由来のコンドロイチナーゼＡＣII、フラボバクテリウム（Flavobacterium）sp. Hp 102株由来のコンドロイチナーゼＡＣII、フラボバクテリウム（Flavobacterium）sp. Hp 102株由来のコンドロイチナーゼＡＣIII、フラボバクテリウム（Flavobacterium）sp. Hp 102株由来のコンドロイチナーゼＣ、及びJ. Biol. Chem., 272, 9123-9130 （1997）に記載されているコンドロイチン硫酸ＡＢＣエキソリアーゼなどが挙げられる。なかでも、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）由来のコンドロイチナーゼＡＢＣおよびアースロバクター・オーレッセンス（Arthrobacter aurescens）由来のコンドロイチナーゼＡＣＩＩを最も好ましく用いることができる。

なお、コンドロイチナーゼ（コンドロイチン硫酸分解酵素）の「由来」とは、当該コンドロイチナーゼをコードする遺伝子を元来保有している生物を起源とすることをいう。従って、例えば、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）由来のコンドロイチナーゼＡＢＣとは、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）自体により産生されるものは当然含まれるが、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）から取得されたコンドロイチナーゼＡＢＣをコードする遺伝子に基づいて、遺伝子工学的手法によって他の細胞で産生させたようなものも含まれる。また必要に応じて、遺伝子工学的に変異を導入したようなものも包含される。例えば、ＷＯ２００７／０３８５４８に記載のコンドロイチナーゼＡＢＣＩの変異体(Chondroitinase ABCI Mutants)、ＷＯ２００４／１１０３６０に記載の変異体及びＷＯ２００４／１１０３５９に記載の融合タンパク質等が挙げられる。

本発明の神経幹／前駆細胞は、酸素欠乏により引き起こされる脳の損傷を改善や抑制等するために、前述のコンドロイチン硫酸分解酵素と共に用いられるものである。
本発明において用いることができる神経幹／前駆細胞は、上述のように酸素欠乏（低酸素状態）により引き起こされる脳の損傷に対して用いられ、且つ、適用時に前述のコンドロイチン硫酸分解酵素と共に用いられる、自己増殖能及び／又は分化能を有している神経幹／前駆細胞である限りにおいて特に限定されるものではない。このような神経幹／前駆細胞としては、再生医療の分野において通常用いられる神経幹／前駆細胞を用いることができる。
一般的に「神経幹細胞」とは、自己増殖能を有し、ニューロン、アストロサイト及びオリゴデンドロサイトという中枢神経系を構成する細胞に分化する能力を有している細胞と定義されており、「神経前駆細胞」とは、神経幹細胞から分裂した細胞で、未だ分化はしていないが、１〜２回程度の分裂の後、分化する細胞であると、当業界において認識されている。なお、神経幹細胞→神経前駆細胞→（成熟）神経細胞の順番で分化は行われる。

本発明において用いることができる神経幹／前駆細胞の種類は、当該神経幹／前駆細胞が移植される個体の種類、当該個体の脳の発達程度、年齢、損傷の部位、損傷の程度などに応じて、当業者が適宜設定することができる。例えば、神経幹細胞として、骨髄、末梢血、脳、脊髄、臍帯血、歯髄、血管などを由来とするものを用いることができる。なかでも、脊髄や脳などの神経系の組織を由来とするものがより好ましく、脳を由来とするものが特に好ましい。例えば、哺乳類の新生仔における移植においては、胎仔の脳原基に由来するものを用いることが特に好ましい。
なお、本明細書において「哺乳類」とは、ヒト及びヒト以外の哺乳動物の双方を包含する概念である。また、「新生仔」や「新生児」とは、出生から間もない個体を意味する。例えば、マウスやラットにおいては出生から７〜１０日程度の個体を指し、ヒトにおいては生後１ヶ月未満の個体を指す。

本発明において用いることができる神経幹／前駆細胞は事前に培養したものを用いることが可能である。培養するための培地や培養条件などは、当該神経幹／前駆細胞の種類や由来、当該細胞を移植する損傷部位などを考慮し、移植に足る量と質の神経幹／前駆細胞を得られる方法である限りにおいて特に限定されず、当業者が適宜設定することができる。例えば、再生医療の分野において通常用いられる神経幹／前駆細胞増殖用の培地や条件を用いることができるが、本発明においては、培養細胞を分化させない条件で培養するのが好ましい。例えば、培地としては細胞の生存及び増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、ビタミンなど）を含む基本培地を用いることができ、このような培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、F-12培地及びNeurobasal培地などを挙げることができる。また、増殖因子をさらに添加した培地が好ましく、このような増殖因子としては、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）又は白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）などが例示される。また、他にも、増殖促進のために培地添加物B27やN2 (Gibco社製)を添加するなど、培地の組成は当業者が必要に応じて適宜選択することができる。培養条件の一例としては、３７℃下における１０〜２０日間の培養を例示することができるが、培養の状態等を確認しつつ、当業者が適宜設定することが好ましい。

本発明は、酸素欠乏（低酸素状態）により引き起こされる脳損傷を改善および脳損傷の進行を抑制するために、当該損傷部位に対して、前記のコンドロイチン硫酸分解酵素と神経幹／前駆細胞とを共に適用するために用いられる。この「適用」の方法は、当該損傷部位に、コンドロイチン硫酸分解酵素と神経幹／前駆細胞とを共に存在せしめることができる方法である限りにおいて特に限定されない。
神経幹／前駆細胞については、例えば、目的とする部位に、神経幹／前駆細胞を再生医療の分野において通常用いられる方法によって移植する方法を採用することができる。より具体的には、例えば、リン酸緩衝生理食塩水に神経幹／前駆細胞を懸濁させ、この細胞懸濁液を注入／注射することによって目的部位へ移植する方法を例示することができる。
また、コンドロイチン硫酸分解酵素については、例えば、コンドロイチン硫酸分解酵素の溶液を注射にて投与する方法を例示することができる。

本発明において、「神経幹／前駆細胞と共にコンドロイチン硫酸分解酵素を用いる」、「コンドロイチン硫酸分解酵素と共に神経幹／前駆細胞を用いる」とは、損傷部位に対して一方の処置を行った後、一度処置を中断し、相当程度時間が経過した後に他方の処置を行うような場合を包含する趣旨ではなく、当業者が通常理解する範囲の「併用」という意味である。すなわち、損傷部位に対する一連の処置の流れの中で連続性を保っていればよく、例えば、神経幹／前駆細胞の移植の後にコンドロイチン硫酸分解酵素を投与するような場合、コンドロイチン硫酸分解酵素を投与した後に神経幹／前駆細胞の移植を行う場合、及び、両者を同時に移植（投与）する場合のいずれをも包含する。この適用（投与）方法に従うことにより、本発明は酸素欠乏により引き起こされる脳損傷を処置する方法を提供できる。なお、「処置」とは、酸素欠乏により引き起こされる脳損傷の治療、改善及び脳損傷の進行の抑制等の意味を包含する。

本発明において、酸素欠乏（低酸素状態）により引き起こされる脳損傷とは、脳内の酸素量や脳神経組織への酸素供給量の低下が原因となる脳損傷である限りにおいて特に限定されない。例えば、脳血管における血栓、脳血管における塞栓、脳血管の破断による脳内出血、脳血管の圧迫、循環器系の異常による血液循環の悪化、呼吸器系の閉塞、分娩期や出生時における仮死や脳出血などに伴う酸素低下状態や虚血状態が例示される。また、火災や水中などへの沈溺などのような外的環境要因による酸素供給量の低下に伴う脳損傷も例示される。この中でもとりわけ、低酸素虚血により引き起こされる脳損傷が好ましく挙げられる。

前述のように、本発明のコンドロイチン硫酸分解酵素と神経幹／前駆細胞とを共に用いることにより、酸素欠乏（低酸素状態）により引き起こされる脳損傷に対し効果的に改善および抑制の効果が発揮されるため、本発明は、脳の保護のためや酸素欠乏（低酸素状態）に起因する様々な疾患等に適用することができる。疾患としては、例えば、一過性脳虚血発作症候群（TIA症候群）、虚血性脳血管障害、新生児低酸素性虚血性脳症、かゆ状動脈硬化による血栓症、内頚動脈（分枝を含む）のかゆ状血栓性病変、脳梗塞、脳栓塞、脳出血、くも膜下出血、高血圧性脳症、脳低部異常血管網症、脳静脈・脳静脈洞閉塞症、全身性低血圧、無酸素性虚血性脳症、外傷性脳血管閉塞、脳震盪、脳挫傷、硬膜外血腫、硬膜下血腫、脳血管障害（脳出血、脳梗塞、くも膜下出血、高血圧脳症等）、脳炎、脳腫瘍などが挙げられる。

なかでも本発明は、成体への発達過程にあり、神経細胞の分化の程度も異なっており、神経回路が十分に機能していない新生児又は新生仔の脳における損傷に特に好適であり、分娩期や出生時における仮死や脳虚血、周産期の脳出血により引き起こされる脳障害などに極めて有用である。例えば、新生児低酸素性虚血性脳症の改善剤として特に好適である。
また、後述の実施例の通り、本発明によって酸素欠乏（低酸素状態）に伴う脳梗塞部位の拡大の抑制、脳梗塞領域の低減や改善、更に、脳の重量の増加により脳神経組織の再生や改善等の効果が発揮されており、脳機能を回復することができる可能性が示唆される。

本発明を疾患の治療に用いる際の用法や用量は、適用される対象個体（例えば、上記疾患患者など）の症状、脳損傷の状態、年齢や体重などを考慮し、当業者が適宜設定することができる。用法としては、例えば、前述の神経幹／前駆細胞の移植方法およびコンドロイチン硫酸分解酵素の投与方法に従い、神経幹／前駆細胞と共にコンドロイチン硫酸分解酵素を損傷部位へ適用する方法が挙げられる。なお、用量は医薬における通説のとおり対象個体の年齢や体重により大きく異なるが、一例として、コンドロイチナーゼＡＢＣとして０．０００１ユニット〜５００ユニットの用量を例示することができる。
なお、上記酵素活性における１ユニットとは、３７℃、ｐＨ８．０の条件下で、サメ軟骨由来コンドロイチン硫酸Ｃから１分間あたり１μモルの不飽和二糖を生成する酵素量である。

本発明は、本発明のコンドロイチン分解酵素と本発明の神経幹／前駆細胞とを構成成分として含有する、酸素欠乏（低酸素状態）に伴う脳損傷の改善に用いるための医薬組成物やキットの思想も包含し、例えば、本発明のコンドロイチン分解酵素と本発明の神経幹／前駆細胞とを構成成分として含有する新生児低酸素虚血性脳症改善剤、脳の梗塞領域の低減剤および脳組織の保護剤を提供することができる。
また、本発明は、コンドロイチン硫酸分解酵素と、神経幹／前駆細胞の少なくとも一方を有効成分として含有する新生児低酸素性虚血性脳症改善剤を提供することができ、更に、コンドロイチン硫酸分解酵素と、神経幹／前駆細胞の少なくとも一方を有効成分として含有する神経脳の梗塞領域の低減剤、及び、脳組織の保護剤も提供することが出来る。前述の通り、損傷部位にコンドロイチン硫酸分解酵素と神経幹／前駆細胞とを共に存在せしめることができる方法で用いる限りにおいて、例えば、これらの剤は、コンドロイチン硫酸分解酵素と神経幹／前駆細胞とを別個独立に生産及び梱包されていても良く、コンドロイチン硫酸分解酵素を有効成分とする上記剤又は神経幹／前駆細胞を有効成分とする上記剤のように各々単独の流通形態であっても構わない。つまり、本発明は、コンドロイチン硫酸分解酵素を有効成分とする酸素欠乏による脳損傷の改善補助剤として提供することも可能である。

以下、実施例により本発明を具体的に詳説する。しかしながら、これにより本発明の技術的範囲の限定を意図するものではない。

＜参考例１＞
＜ラット胎仔大脳由来の神経幹細胞の培養＞
Green Fluorescent Protein（GFP）遺伝子の導入により形質転換させた妊娠ラット（EGFPトランスジェニックラット、日本エスエルシー社製）から得た胎生１４日齢のラット胎仔を用いた。形質転換体のラット胎仔の脳原基よりGFPで標識された神経幹細胞を得た。得られた標識神経幹細胞を、神経幹細胞の選択的培養法であるNeurosphere法を用いて培養した。具体的には、標識神経幹細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で解離して調製した単一細胞浮遊液を、成長因子である繊維芽細胞増殖因子-２（FGF-2）と上皮細胞増殖因子（EGF）存在下で、DMEM/F-12（１：１）培地にて、温度37℃下で培養した。培養開始から６日後に、増殖した標識神経幹細胞により形成されている細胞塊（neurosphere）を、PBS中で物理的に解離させ、再び単一細胞浮遊液とした。

＜参考例２＞
＜新生児低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）モデルの作製＞
生後７日齢のＳＤ系ラットを用い、Riceらの方法（Rice JE 3rd, Vannucci RC, Brierley JB. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Ann Neurol,9:131-141.1981.）に従い新生児低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）モデルとなるラットを作製した。具体的には、右総頸動脈を２重結紮し切離したラットを８％酸素／９２％窒素の低酸素状態に２時間放置し、右脳のみがＨＩＥ状態であるラットを作製した。
作製したラットを屠殺し、脳の前端から5 mmの部分にて切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）とMAP2染色を行い、対照として低酸素状態を負荷していない生後７日齢のＳＤ系ラットについても同様に染色を行い、脳の形態及び梗塞部位の確認を行った（図１）。右脳がＨＩＥ状態であるラットのヘマトキシリン・エオジン染色とMAP2染色の結果は、それぞれ図１Ｃ、図１Ｄであり、対照ラットのヘマトキシリン・エオジン染色とMAP2染色の結果は、それぞれ図１Ａ、図１Ｂである。
図１より、明らかに右脳部分のみに広範囲にわたり梗塞が起きていることが確認された。

＜実施例１＞
参考例２に従い作製した右脳のみＨＩＥ状態のラットを３群に分け、各群にそれぞれ、神経幹細胞のみ、神経幹細胞とコンドロイチナーゼＡＢＣとを併用、及び、コンドロイチナーゼＡＢＣのみを以下の手順に従い投与した。なお、コンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｃ−ＡＢＣ）は生化学工業株式会社製を用い、また、投与する細胞数および投与容量は３群とも同一となるように調製した。
右脳のみＨＩＥ状態としてから２４時間後に、参考例１に従い調製した標識神経幹細胞の５×１０⁷cells／mL溶液5 μＬを、新生仔ラット頭部固定器と脳内注入器を使用し、Hamilton 27ゲージ針にて当該ラットの右大脳の脳質内のbregmaから前方2 mm、右側方2.5 mm及び硬膜から深さ4 mmに注入し、標識神経幹細胞を移植した。
同様の手順にて、０．１％となるようにウシ血清アルブミン（BSA）をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）へ溶解したBSA-PBS溶液に、コンドロイチナーゼＡＢＣを10 U/mLの濃度となるように溶解した溶液 2.5 μＬと、濃度1×１０⁸ cells／mLとなるように懸濁した標識神経幹細胞溶液2.5 μＬとを混合した液を投与した。
更に、同様の手順にて、５Ｕ／ｍＬのコンドロイチナーゼＡＢＣ５ μＬを投与した。
なお、参考例２により右脳のみＨＩＥ状態としたラットにＰＢＳを投与した群をコントロールとした。

標識神経幹細胞の移植及び／又はＣ−ＡＢＣの投与から７日後に、ラットを屠殺し、右脳及び左脳を摘出した。効果の評価は、脳の重量比と、非梗塞（非障害）部位の面積比の２種の指標を用いて行った（表１）。重量比に関するグラフは図２、面積比に関するグラフは図３に示した。なお、図２において各々、Ｃｅｌｌは神経幹細胞のみを投与、ＣＨ＋Ｃｅｌｌは神経幹細胞とＣ−ＡＢＣとの併用投与、ＣＨはＣ−ＡＢＣ単独投与、及び、Ｃｔｒｌはコントロールの結果を示し、図３におけるＣｅｌｌ、ＣＨ＋Ｃｅｌｌ及びＣｔｒｌについても同様である。
重量比については、次の通り算出した；摘出した右脳及び左脳それぞれの大脳皮質の重量を測定した。検体であるラットの個体差を補正するため、右大脳皮質の重量を正常状態である左大脳皮質の重量で除した値（重量比：wet weight）を評価に用いた（重量比＝右大脳皮質の重量／左大脳皮質の重量）。
また、非梗塞（非障害）部位の面積比については次の通り算出した；摘出した右脳及び左脳を光学顕微鏡用にパラフォルムアルデヒドによって固定し、各大脳の先端から５ｍｍの部分において冠状断の切片（中央部前頭断切片）を作製した。蛍光Nissl染色試薬を用いて当該切片をNissl染色した。染色後、光学顕微鏡を用い、Scion image（Scion Corporation製）による画像処理により定量的に右大脳半球及び左大脳半球それぞれの染色面積（非梗塞面積）を算出し、右大脳半球の染色面積を左大脳半球の染色面積で除した値（非梗塞面積比）を評価に用いた（非梗塞面積比＝右大脳半球の染色面積／左大脳半球の染色面積）。

重量比の比較では、対照における梗塞側の大脳半球の重量は、神経組織の変性脱落のため、正常側の大脳半球の重量の約６０％程度しかないが、神経幹細胞とＣ−ＡＢＣとを同時に併用した場合、梗塞側の大脳半球の重量は、正常側の大脳半球の重量と比較し、ほぼ９０％相当であった。一方、神経幹細胞の移植のみ、及び、Ｃ−ＡＢＣの投与のみによる重量比は、対照とほぼ変わらなかった。この結果は、新生仔ラットの低酸素虚血処理した脳に、神経幹／前駆細胞とＣ−ＡＢＣを同時に投与すると、神経組織の変性脱落が抑制されることを示している。
更に、脳細胞の正常状態である未変性領域を染色可能であるNissl染色による結果によると、非梗塞領域である正常領域は、対照と神経幹／前駆細胞の単独投与では２０〜３０％程度に過ぎなかったが、神経幹／前駆細胞とＣ−ＡＢＣを併用して投与した場合では５０％以上であり、梗塞巣の形成が効率良く抑制された。

これらの結果より、とりわけ、成体への発達過程（成長途中）である新生児又は新生仔の脳に対する酸素欠乏（低酸素状態）により引き起こされる損傷を効率良く改善するには、神経幹細胞の移植とコンドロイチナーゼＡＢＣの投与を併用することが非常に有用であることが示唆される。

＜実施例２＞
更に、本発明者は、コンドロイチナーゼＡＢＣの代わりに、同じくコンドロイチン硫酸分解酵素の１つであるアースロバクター・オーレッセンス（Arthrobacter aurescens）由来のコンドロイチナーゼＡＣＩＩについて実験を行った。
参考例２に従い作製した右脳のみＨＩＥ状態のラットを２群（各群４匹）に分け、それぞれ、神経幹細胞のみの処置と、神経幹細胞とコンドロイチナーゼＡＣＩＩとの併用処置を、細胞および酵素の投与量等を含めて上記実施例１の手順に従い行った。なお、コンドロイチナーゼＡＣＩＩは生化学工業株式会社製を用い、また、投与する細胞数および投与容量は両群とも同一となるように調製した。
標識神経幹細胞の移植及び／又はコンドロイチナーゼＡＣＩＩの投与から７日後に、ラットを屠殺し、右脳及び左脳を摘出した。効果の評価は、実施例１と同様に脳の重量比を指標に用いて行った（表２）。

神経幹細胞単独の処置よりも、神経幹細胞とコンドロイチナーゼＡＣＩＩとの併用処置の方が、脳の梗塞領域を減少する結果が得られた。
よって、コンドロイチナーゼＡＢＣもコンドロイチナーゼＡＣＩＩもコンドロイチン硫酸分解酵素の一種であることより、本実施例の結果から、神経幹細胞とコンドロイチン硫酸分解酵素との併用処置は、神経幹細胞のみの処置よりも酸素欠乏により惹起される脳損傷の改善に有効であると推測される。

本発明によれば、神経幹／前駆細胞の移植時にコンドロイチン硫酸分解酵素の投与を併せて行うことにより、酸素欠乏（低酸素状態）や虚血状態により引き起こされる脳の損傷を効果的に改善したり悪化を抑制することが可能となる。さらに本発明は、成体への発達過程にある脳におけるこのような障害に対して有用であり、例えば、分娩期や出生時における脳虚血や仮死、周産期の脳出血により惹起される新生児（仔）の脳障害に対して極めて有用である。

Claims

コンドロイチン硫酸分解酵素と、神経幹細胞および神経前駆細胞の何れか少なくとも一方とを有効成分として含有する、酸素欠乏により引き起こされる脳損傷の改善用の医薬。
酸素欠乏により引き起こされる脳損傷が、低酸素虚血により引き起こされるものである、請求項１に記載の医薬。
コンドロイチン硫酸分解酵素が、コンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＡＣ及びヒアルロニダーゼからなる群より選択される一又は複数の酵素であることを特徴とする、請求項１または２に記載の医薬。
コンドロイチン硫酸分解酵素が、コンドロイチン硫酸の構成二糖単位において、Ｎ−アセチルガラクトサミンの４位水酸基が硫酸化されている構成二糖単位から成るコンドロイチン硫酸を分解する酵素である、請求項１または２に記載の医薬。
コンドロイチン硫酸分解酵素が、コンドロイチナーゼＡＢＣまたはコンドロイチナーゼＡＣ類である請求項１または２に記載の医薬。
コンドロイチン硫酸分解酵素がコンドロイチナーゼＡＢＣである、請求項１または２に記載の医薬。
神経幹細胞および神経前駆細胞が脳由来であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬。
神経幹細胞および神経前駆細胞が培養された神経幹細胞および神経前駆細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬。
成体への発達過程にある脳に適用されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬。
新生児又は新生仔の脳に適用されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬。
新生児低酸素性虚血性脳症改善剤である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬。
脳の梗塞領域の低減剤である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬。
脳組織の保護剤である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬。
コンドロイチン硫酸分解酵素を有効成分とする酸素欠乏により引き起こされる脳損傷の改善補助剤。
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬の製造のための、コンドロイチン硫酸分解酵素と、神経幹細胞および神経前駆細胞の何れか少なくとも一方との使用。
請求項１４に記載の改善補助剤の製造のための、コンドロイチン硫酸分解酵素の使用。
コンドロイチン硫酸分解酵素と、神経幹細胞および神経前駆細胞の何れか少なくとも一方とを含む、酸素欠乏により引き起こされる脳損傷の改善に使用するキット。
コンドロイチン硫酸分解酵素と、神経幹細胞および神経前駆細胞の何れか少なくとも一方とを脳の損傷部位に適用することを含む、酸素欠乏により引き起こされる脳損傷を処置する方法。