CN105002216A - 一种持续分泌活性软骨素酶abc的人干细胞的制备方法及其试剂盒与临床应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种持续分泌活性软骨素酶ABC的人干细胞的制备方法，其中，所述方法包括构建无N端信号肽软骨素酶ABC基因并在基因3’端加上加入提高转录和翻译的基因片段，构建到病毒载体上，转染人干细胞制备成可持续分泌活性软骨素酶ABC的人干细胞，以促使人干细胞长期有效分泌骨素酶ABC，-20℃下长期下保存仍具有酶活性；本发明还提供了持续分泌活性软骨素酶ABC的人干细胞的临床应用，该人干细胞将从种子细胞与改善不利于神经再生的微环境两方面入手，有望对慢性神经退行性疾病的治疗达到“双管齐下”的效果。

Description

一种持续分泌活性软骨素酶ABC的人干细胞的制备方法及其试剂盒与临床应用

技术领域

本发明涉及一种制备持续分泌活性软骨素酶ABC的人干细胞的方法以及通过所述方法获得持续分泌活性软骨素酶ABC的人干细胞，特别地，本发明涉及的构建无N端信号肽软骨素酶ABC基因并在基因3’端加上加入提高转录和翻译的基因片段，使得人干细胞能持续分泌活性软骨素酶ABC；本发明的持续分泌活性软骨素酶ABC的人干细胞可以用于临床治疗慢性神经退行性疾病，针对性促进受损的轴突再生，未受损的神经环路发芽、增强连接，对受损的投射神经元的保护作用，有望对慢性神经退行性疾病达到“双管齐下”的治疗效果。

背景技术

软骨素酶ABC(chondroitinase ABC，chABC)来源于细菌，能够将硫酸软骨素氨基葡聚糖链(chondroitin sulfate glycosaminoglycans，CS-GAGs)链从核心蛋白上降解下来。在大鼠脊髓损伤处施以chABC椎管内治疗以分解CS-GAGs已被证明能促进轴突再生和功能恢复，近年来已有大量的文献证实了chABC对中枢神经系统损伤的治疗作用。

目前发现通过基因工程技术，如果直接以全基因序列转染入哺乳动物的细胞，很难被分泌到细胞外，因而起不到治疗效果，或是分泌至胞外了，但失去了酶的活性。chABC治疗应用的一个主要限制是chABC对温度很敏感，在37℃体温3～5天其活性即基本上完全丧失，由于chABC对温度的敏感，而且需要长时间给药，因而用于治疗就需要局部持续滴注或多次注射，这将大大增加病患的创伤和感染的风险。另外，目前chABC的给药途径大多采用鞘内注射的方式，而这对于深部的损伤将无能为力。因此，chABC临床应用前一个迫切需要解决的问题是其温度控制及空间的给药方式。

人干细胞具有分化为机体组织器官的细胞，同时其“归巢”特性使得干细胞迁移到组织器官损伤的部位进行修复，因而也成为药物靶向治疗很好的载体。本发明利用人干细胞修复和“归巢”特性，将构建好的能持续分泌并具有酶活性的软骨素酶ABC重组基因，使得人干细胞能持续分泌活性软骨素酶ABC。人干细胞来源方便，主要包括人基质干细胞、内皮祖细胞、神经干细胞和胚胎干细胞等，细胞培养获得简单，可以做到个体化，也可以作为异体规模化生产，是基因表达理想的载体，因而，本发明持续分泌活性软骨素酶ABC的人干细胞制备简单，修复中枢神经系统损伤的神经细胞，分泌的活性软骨素酶ABC改善不利于神经再生的微环境，有望对慢性神经退行性疾病的治疗达到“双管齐下”的效果，能个体化临床治疗，也能作为规模化生产的产品应用于临床治疗慢性神经退行性疾病。

发明内容

中枢神经系统损伤会启动一系列与形成瘢痕组织相关的细胞及分子间的反应，参与的细胞包括：星形胶细胞、小胶质细胞和少突胶质前体细胞等等，脑脊髓膜细胞或干细胞偶也参与其中，最终形成胶质瘢痕组织。胶质瘢痕的重要作用在于关闭受损的血脑屏障，阻止神经细胞损害的扩散，重建中枢神经系统物理和化学的完整性。然而，胶质瘢痕同时也对受伤神经轴突的再生形成了屏障。胶质瘢痕对轴突再生的影响除了空间阻碍等物理因素外，由瘢痕细胞分泌的蛋白多糖在损伤区的堆积是抑制轴突再生的重要因素。

硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitin sulphate proteoglycans，CSPGs)目前已知是一个阻碍神经轴突再生的重要因子。CSPGs由核心蛋白和CS-GAGs以共价键连接而成，主要由星形胶质细胞、少突胶质细胞和脑脊膜细胞分泌。其中，CS-GAGs是抑制轴突生长的主要结构基础。在发育过程中，CSPGs对神经元的生长起寻路和导向的作用，而在成年个体中，CSPGs在保持中枢神经系统的稳定性，限制其可塑性方面起重要作用。然而，中枢神经系统受伤后CSPGs的堆积是形成对轴突再生不利的局部微环境的一个重要因素。

本发明是我们长期基础研究和其他大量研究报道，发现了chABC对中枢神经系统损伤的治疗作用。chABC主要治疗机制：其可以消弱CSPGs受体介导的生长抑制作用，消弱CSPGs所激发的抑制生长的细胞内反应；解除CSPGs阻碍的有利于神经生长的细胞外基质在胶质瘢痕中的表达；释放被CSPGs禁锢的生长因子，解放这些生长因子进而促进神经再生；并调节免疫/炎症反应，因而针对慢性神经退行性疾病，促进受损的轴突再生，未受损的神经环路发芽、增强连接，对受损的投射神经元的保护作用。

根据chABC全基因序列转染入哺乳动物的细胞，很难被分泌到细胞外和没有酶活性，对温度很敏感以及给药方式等问题，本发明通过基因工程技术对chABC进行改造，构建无N端信号肽软骨素酶ABC基因并在基因3’端加上加入提高转录和翻译的基因片段，使得人干细胞能持续分泌活性软骨素酶ABC。

本发明提供了一种持续分泌活性软骨素酶ABC的人干细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括构建无N端信号肽软骨素酶ABC基因并在基因3’端加上加入提高转录和翻译的基因片段，构建到病毒载体上，转染人干细胞制备成可持续分泌活性软骨素酶ABC的人干细胞，以促使人干细胞长期有效分泌骨素酶ABC，将成为对慢性神经退行性疾病达到“双管齐下”的治疗效果。

本发明所述的持续分泌活性软骨素酶ABC的人干细胞，可持续分泌出有功能活性的软骨素酶ABC，重组病毒转染后分泌软骨素酶ABC至细胞培养上清液，并且病毒转染人干细胞传代到10代，在细胞培养上清液仍分泌出的软骨素酶ABC蛋白。

所述人干细胞持续分泌的软骨素酶ABC，将细胞培养上清液中软骨素酶ABC消化小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)，具有酶活性。

所述人基质干细胞持续分泌的软骨素酶ABC，其热稳定性检测发现在-20℃贮存4个月，酶的活性仍然具有很好的功能。

人干细胞具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点，研究证实干细胞可以迁移至组织器官损伤的部位进行修复，有希望作为安全的细胞载体用于疾病的生物治疗。

所述人干细胞包括人基质干细胞、人内皮祖细胞、人神经干细胞和人胚胎干细胞等，优选地，为人基质干细胞和人内皮祖细胞。由于人干细胞来源方便，细胞培养获得简单，可以从患者骨髓个体化获得，也可以作为异体规模化生产，这样一来制备持续分泌活性软骨素酶ABC的人干细胞简单，能做到个体化应用，也能作为规模化生产的产品。人神经干细胞来源人废弃脐带血、胎盘血或自体骨髓等，优选地，来源于人自体骨髓。

本发明所述的病毒载体，可以在细胞内稳定增殖和表达目的基因，主要为慢病毒、腺病毒、逆转录病毒等，优选地，选择慢病毒表达系统。

本发明还提供一种制备持续分泌活性软骨素酶ABC的人干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：

1)人干细胞基础培养基；

2)包装好的软骨素酶ABC过表达病毒载体；

3)消化细胞的酶；

4)细胞因子以及；

5)使用说明书；

其中，所述使用说明书包括本发明中所述的方法。培养获得人干细胞的来源为人废弃脐带血、胎盘血或自体骨髓等，优选地，来源于人自体骨髓。

所述的过表达病毒载体包括病毒、腺病毒、逆转录病毒等，优选地，选择慢病毒表达系统。

本发明还提供所述持续分泌活性软骨素酶ABC的人干细胞的应用，能用于从人干细胞修复慢性神经退行性疾病中损伤的神经细胞，分泌的活性软骨素酶ABC改善不利于神经再生的微环境，有望对慢性神经退行性疾病的治疗达到“双管齐下”的效果。

附图说明

图1表示重组chABC-3F构建的基因片段示意图

图2表示实施例1中制备的重组chABC-3F慢病毒转染hBMSC细胞在不同MOI值中chABC基因表达量及细胞存活率的影响图

图3表示实施例1中制备的转染细胞中chABC mRNA的表达进行荧光定量PCR检测结果图

图4表示实施例1中制备的转染细胞中chABC蛋白的表达进行westernblotting检测结果图

图5表示免疫荧光细胞化学检测flag标签在实施例1中制备的重组chABC-3F慢病毒转染hBMSC细胞中表达的细胞免疫荧光图

图6表示使用ELISA检测实施例1中制备的重组chABC-3F慢病毒转染hBMSC细胞中分泌至细胞培养上清液中的chABC蛋白的含量并比较第三代与第十代的hBMSC细胞培养上清液中目的蛋白表达的变化图

图7表示使用抗C4S抗体免疫荧光细胞化学检测实施例1中制备的重组chABC-3F慢病毒转染hBMSC细胞中chABC酶活性的细胞免疫荧光图

图8表示免疫荧光细胞化学检测实施例1中制备chABC慢病毒转染hBMSC细胞条件培养上清处理的NIH3T3细胞的细胞免疫荧光图。

图9显示免疫荧光细胞化学检测实施例1中制备chABC慢病毒转染hBMSC细胞条件培养上清与商售的细菌chABC蛋白在37℃下热稳定性的免疫荧光图。

具体实施方式

本发明提供了一种持续分泌活性软骨素酶ABC的人干细胞的制备方法，其中，所述方法包括构建无N端信号肽软骨素酶ABC基因并在基因3’端加上加入提高转录和翻译的基因片段，构建到病毒载体上，转染人干细胞制备成可持续分泌活性软骨素酶ABC的人干细胞。

本发明通过基因重组技术，经PCR技术扩增不含chABC aa 1-24细菌前导序列，基因3’端加上提高转录和翻译的Kozak-ATG序列，基因5’未端加上利于检测蛋白表达的3×Flag标签，并在3’和5’未端分别设计多个不同的酶切位点，构建成基因重组软骨素酶ABC，可能分泌到胞外，并翻译成具有酶活。

chABC基因重组后引入双酶切位点连接到病毒载体上，取对数生长期的293FT细胞，以(2～2.5)×10⁶细胞数接种于10cm的细胞培养皿中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养24小时，细胞融合度为60％～80％时利用Lipofectamine^TM2000转染进行病毒包装。转染分为2组：阳性组和对照组。48～72小时后收集病毒上清液，4℃、3000r/min离心5min后，用直径为0.45μm的滤膜过滤分装，用于细胞感染。将两组病毒上清分别感染人干细胞，同时加入工作液浓度为5μg/ml的聚凝胺以增加感染效率，次日去除含病毒的培养基，更换为干细胞完全培养基，感染后72小时荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(Greenfluorescent protein，GFP)的发光情况，GFP显色超过90％以上，表明携带重组chABC-3F目的基因病毒转染人干细胞成功，获得持续分泌活性软骨素酶ABC的人干细胞。

所述人干细胞包括人基质干细胞、人内皮祖细胞、人神经干细胞和人胚胎干细胞等，优选地，为人基质干细胞和人内皮祖细胞。人干细胞来源方便，细胞培养获得简单，可以从患者骨髓个体化获得，也可以作为异体规模化生产，这样一来制备持续分泌活性软骨素酶ABC的人干细胞简单，能做到个体化应用，也能作为规模化生产的产品。人干细胞来源人废弃脐血、胎盘血、脐带、自体骨髓等体外培养获得的，优选地，来源于人自体骨髓。

本发明所述的病毒载体，可以在细胞内稳定增殖和表达目的基因，主要为慢病毒、腺病毒、逆转录病毒等，优选地，选择慢病毒表达系统，例如pPACK-REV、pPACK-GAG和pVSV-G；pGC-LV、pHelper 1.0和pHelper 2.0以及pspax2、pMD2G和pHBLV^TM等，均为商业化产品，从商业公司可以购买到。

所述人干细胞过表达软骨素酶ABC，可持续分泌出有功能活性的软骨素酶ABC，即病毒转染后分泌软骨素酶ABC至细胞培养上清液，并且病毒转染人干细胞传代到10代，在细胞培养上清液仍分泌出的软骨素酶ABC蛋白；并将持续分泌活性软骨素酶ABC的人干细胞培养上清液中软骨素酶ABC消化小鼠胚胎成纤维细胞，具有酶活性。

本发明通过对分泌活性软骨素酶ABC的人干细胞培养上清液进行热稳定分析，发现在37℃下分别放置0小时、16小时、24小时、40小时，然后处理小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3细胞后的免疫荧光强度；提示chABC慢病毒转染后hBMSC细胞条件培养上清液中chABC-3F酶的稳定性与商售的chABC类似，在37℃环境下存放时间越久，酶的活性有明显的下降趋势。所述人基质干细胞持续分泌的软骨素酶ABC在4℃放置4个月后，酶的活性有明显下降，但是发现在-20℃贮存4个月，chABC-3F酶的话性仍然具有很好的功能。

本发明还提供了一种制备持续分泌活性软骨素酶ABC的人干细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1)人干细胞基础培养基；

2)包装好的软骨素酶ABC过表达病毒载体；

3)消化细胞的酶；

4)细胞因子以及；

5)使用说明书；

其中，所述使用说明书包括本发明中所述的方法。培养获得所述人干细胞包括人基质干细胞、人内皮祖细胞、人神经干细胞和人胚胎干细胞等，优选地，为人基质干细胞和人内皮祖细胞。人干细胞来源人废弃脐血、胎盘血、脐带、自体骨髓等体外培养获得的，优选地，来源于人自体骨髓。

所述的过表达病毒载体包括病毒、腺病毒、逆转录病毒等，优选地，选择慢病毒表达系统。

本发明还提供持续分泌活性软骨素酶ABC的人干细胞的应用，能用于从人干细胞修复慢性神经退行性疾病中损伤的神经细胞，分泌的活性软骨素酶ABC改善不利于神经再生的微环境，对慢性神经退行性疾病产生促进受损的轴突再生，未受损的神经环路发芽、增强连接，对受损的投射神经元的保护作用，达到“双管齐下”的治疗效果。

以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。

实施例1 重组chABC-3F慢病毒载体的构建及人基质干细胞的制备

将chABC-3F序列从pCAGIP-chABC-3xFlag质粒(由美国西北大学MichaelKlüppel教授馈赠)中扩增下来，将chABC-3F目的片段和pLenti6.3_MCS载体PacI/AscI双酶切后，在T4DNA连接酶(日本TAKARA公司)作用下，与双链chABC-3F于4℃12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a(美国Invitrogen公司)后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。

取细胞状态良好，处于对数生长期的293T细胞，细胞计数后，按照每个10cm的培养皿6×10⁶个细胞数接种于培养皿中，37℃，5％CO₂的培养箱中培养过夜。第二天转染前移去培养液，换5ml Opti-MEM培养液。取9ug PackagingMix(Invitrogen)和3ug慢病毒表达质粒加入1.5ml Opti-MEM(经37℃预热)中，轻轻混匀，取36ul lipofectamine2000加入1.5ml Opti-MEM中，轻轻混匀，室温放置5min；轻轻混合质粒溶液和lipofectamine 2000稀释液，置室温20min。将3ml质粒脂质体复合物小心地加入到人基质干细胞(human mesenchymalstem cells，hBMSCs)培养皿中，轻轻混匀，37℃，5％CO₂的培养箱中孵育6个小时后，更换完全培养液DMEM(含10％胎牛血清)。48h后收集细胞培养上清，3000rpm离心10min，去除细胞和碎片，并用0.45um的滤器过滤(美国BD公司)。将病毒原液在50000g下超速离心2小时，去除上清，重悬于opti-MEM培养液中，滴度测定后分装成小管保存于-80℃。

图1中为重组chABC-3F构建的基因片段示意图。合成的chABC慢病毒质粒中chABC cDNA序列来自pCAGIP-chABC-3×Flag质粒，可编码细菌chABC蛋白的第25-1021位蛋白序列，此chABC cDNA序列去除了一般细菌chABC蛋白中的N末端分泌信号。在chABC cDNA序列前的5’端，插入有一个优选的可在真核细胞中高效表达的KOZAK-ATG序列；而在chABC cDNA序列后连接有一个3×Flag标签蛋白序列，其后连接的是数个终止子。上述cDNAs序列前后连接有多个外源性限制性酶切位点，以利于其亚克隆至慢病毒载pLenti6.3_MCS中，上述的cDNAs序列经测序进行验证基因序列正确。

实施例2 重组chABC-3F慢病毒转染人基质干细胞最佳感染复数分析

通过qPCR方法检测实施例1中pLenti6.3-chABC-3F转染人BMSCs后细胞中目的基因表达水平，确定pLenti6.3-chABC-3F转染人骨髓间充质干细胞的最佳感染复数(multiplicity ofinfection，MOI)值。

实验前一天将hBMSC细胞按1×10⁶个接种于六孔板各孔中，培养过夜。实验开始，预先从-80℃取出慢病毒液室温融化。按照6孔板中的hBMSCs的数量，分别加入慢病毒液，使MOI值分别＝100、500、1000。加入8ug/ml polybrene，在37℃，5％的CO₂的培养箱中培养4-6小时。然后弃去含慢病毒的旧培养基，更换新鲜的完全培养基，37℃，5％的CO₂的培养箱中继续培养3天，用PBS清洗两遍后收集细胞进行qPCR检测。每孔细胞样品中各加入1ml Trizol液，用枪头吹吸混匀，尽量让细胞全部裂解，室温放置5分钟。每管中各加入0.2ml氯仿，盖紧离心管，反复颠倒混匀15秒，12000g，4℃离心10分钟。取上层水相于一新的离心管中，每管中各加0.5ml异丙醇，轻轻混匀，室温放置10分钟，12000g，4℃离心10分钟。弃去上清液，每管中加入1ml的75％的酒精轻轻洗涤沉淀，12000g，4℃离心10分钟。小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟；然后将RNA溶于水中，55℃-60℃水溶10分钟。

RNA逆转录反应：取一灭菌的无RNA酶的EP管，每个样本按照逆转录反应试剂盒使用说明书(美国Invitrogen公司)，得到的cDNA，保存在-20℃备用。cDNA使用荧光定量PCR试剂盒，按照使用说明书(美国Invitrogen公司)检测目的基因chABC-3F表达水平。

图2中通过检测不同MOI值对hBMSC细胞中chABC基因表达量及细胞存活率的影响发现，hBMSC细胞中chABC基因表达量随着MOI值增加而增加，但转染细胞的存活量却随着MOI值增加而减少。与空病毒对照组相比，MOI值100时转染的hBMSC细胞chABC基因表达量约增高10倍，细胞存活率约90％；MOI值500时chABC基因表达量明显增高达90倍，细胞存活率约80％；MOI值1000时chABC基因表达量增高可高达150倍，细胞存活率约70％。为保证转染细胞的存活状态及较高的目的基因表达量，并尽量节约慢病毒质粒的使用，实验最终选用MOI值为500。

实施例3 重组chABC-3F慢病毒转染人基质干细胞中chABC-3F基因和蛋白表达检测

将上述实施例2中提取的RNA逆转录后进行荧光定量PCR检测和蛋白分析。荧光定量PCR检测chABC-3F基因表达方法与实施例2中一样。

分泌chABC-3F蛋白印迹western blotting分析具体步骤如下：

蛋白抽提：收集用实施例1制备的pLenti6.3-chABC-3F转染人BMSCs细胞悬液后1000rpm离心10分钟，弃培养液，PBS清洗3次。根据细胞量加入相应的抽提缓冲液，冰上轻摇15min。收集裂解液到EP管中，14,000rpm离心15min。取上清到新的EP管中。蛋白样品浓度测定：参照南京凯基的BCA蛋白定量试剂盒(KGPBCA)说明书进行。将提取好样品的蛋白溶液和5×上样缓冲液按5∶1混合，煮沸5min。配制5％积沉胶，8％分离胶，每孔上样量约为10ng。电泳：80V恒压50分钟，120V恒压电泳至溴酚蓝刚出胶底部止，PVDF膜甲醇预处理3～5秒，放至转印液浸润半小时。取出凝胶，将其放至滤纸上，形成凝胶转印堆积层并去除气泡。低温条件下(4℃)，100V恒压60～120分钟。取出杂交膜，TBST漂洗5分钟，三次；5％脱脂奶粉溶液室温封闭1小时；TBST洗膜5min，三次。合适的一抗稀释浓度(Anti-Flag-M2 antibody(1∶1000)，chABCAntibody(1E10)[Biotin](1∶200))4℃过夜。TBST洗膜5min，三次；二抗稀释液37℃孵育1h；TBST洗膜5min，三次；蒸馏水漂洗膜2min，弃去液体。共洗三次。将杂交膜置于一透明塑料板上，用一干净移液器将化学荧光发光底物均匀地加到膜的表面，并使反应持续5min。用滤纸吸去膜表面多余的ECL发光液，暗室中用胶片显影，定影，并拍照。

通过细胞免疫荧光方法检测用实施例1制备的pLenti6.3-chABC-3F转染hBMSCs细胞中chABC的免疫荧光表达水平。具体方法为：将各组细胞传代到载玻片上培养约24小时，PBS洗5分钟；10％正常山羊血清室温湿盒封闭30分钟；一抗(anti-flag-m2 antibody(sigma))4℃孵育过夜。PBS洗3次，每次5分钟，荧光二抗(Anti-Mouse IgG(Fab specific)F(ab’)2 fragment-FITC antibodyproduced in goat，sigma，1∶100)室温湿盒避光孵育1小时。PBS洗3次，每次5分钟，避光操作；DAPI(Sigma，D9564，0.5ug/ml)室温湿盒避光孵育3分钟；PBS洗1次，5分钟。去离子水洗2次，每次5分钟；加抗淬灭荧光剂封片后拍照。

图3中A为对转染细胞中chABC mRNA的表达进行荧光定量PCR检测，与空白细胞对照组及空病毒转染对照组相比，chABC转染组中hBMSC细胞中chABC mRNA的表达量明显增高。

图4中为通过Western blotting检测，显示chABC转染组细胞中具有chABC-3F蛋白显著表达，其中第一列为空病毒转染对照组，第二列为chABC转染组，第三列为商售的细菌chABC蛋白。

图5中免疫荧光细胞化学检测flag标签在细胞中的表达(绿色荧光)，细胞核以DAPI复染(蓝色荧光)。未转染病毒的第三代(A)和第十代(C)hBMSCs不表达chABC-3F蛋白，而转染后的第三代(B)和第十代(D)hBMSCs均成功表达chABC-3F蛋白，目的蛋白chABC主要表达在胞浆和突起中。(标尺长度50μm。)

实施例4 重组chABC-3F慢病毒转染人基质干细胞中chABC-3F酶活性分析

通过ELISA方法检测用实施例1制备的pLenti6.3-chABC-3F转染人BMSCs细胞上清条件培养基中chABC-3F的表达情况。用1×PBS稀释Capture antibody到2ug/ml。往96孔板的每孔中加100ul。用封孔膜封板，4℃聚集(孵育)过夜。甩尽平板中的液体，用纯净水彻底冲洗平板，确保每个孔都被装满纯净水，甩尽液体，用这种方式快速连续洗涤3次。最后一次洗涤后，通过在干净纸巾上拍打平板来去除残余的水分，然后擦拭平板表面。每孔加100ul稀释试剂封板(1×PBS中含有1％BSA)，室温孵育1h。抽走封板缓冲液，每孔加200ul(1×PBS+0.1％Triton 100)，室温孵育10min，在进行下一步前立即吸走。每孔加100ul细胞上清液，用封孔膜封板，在平板振荡器上轻轻混匀孵育2h。抽走上清液，用1×PBS+0.1％Triton 100每孔加200ul洗涤3次，5分钟洗涤抽走。用稀释试剂稀释待测抗体NBP1-96141B稀释到1.0ug/ml，在所有孔中加100ul工作稀释品。用封孔膜封板，室温下在平板振荡器上轻轻混匀孵育1h。抽走上清液，用1×PBS+0.1％Triton 100每孔加200ul，暗室中用酶结合物稀释液(3b)稀释浓缩酶结合物(3a)：1∶100后，每孔中加100ul工作稀释用封孔膜封板，室温下在平板振荡器上轻轻混匀孵育30min。用1×PBS+0.1％Triton 100每孔加200ul洗涤5次，每次5min，接着用纯净水进行最后一次短暂的冲洗后甩尽平板里的水，在干净纸巾上拍打平板来去除残余的水分。每孔加150ul显色剂平板振荡器上避光室温孵育，有显色反应后，每孔加50ul终止液，用微型板块分光光度计在492nm波长下读取吸光度值，加入终止液10min内读数。

通过细胞免疫荧光方法检测用实施例1制备的pLenti6.3-chABC-3F转染人BMSCs细胞上清条件培养基中chABC-3F的酶活性。转染人BMSCs在100毫米培养皿用10ml完全生长培养基，培养4天后，收集第一批上清液；加入新培养液培养2天，收集并与第一批合并过滤(0.22μm滤膜)，成为条件培养基。

37℃下条件培养基培养NIH3T3细胞，4％多聚甲醛室温固定10分钟；PBS洗3次，每次5分钟，10％正常山羊血清PBS室温封闭30分钟，加入一抗(小鼠单克隆抗-C4S抗体，MAB2030，MILLIPORE，1∶100)4℃孵育过夜。过夜后用PBS洗3次，每次5分钟，荧光二抗(Anti-Mouse IgG(Fab specific)F(ab′)2fragment-FITC antibody produced in goat，sigma，F8521，1∶100)室温湿盒避光孵育1小时，用PBS洗3次，每次5分钟。加入DAPI(Sigma，D9564，0.5ug/ml)室温湿盒避光孵育3分钟，用PBS洗1次，5分钟，再加入去离子水洗2次，每次5分钟，然后抗荧光淬灭剂封片。

图6为对chABC转染组hBMSC细胞进行反复传代培养至第十代，使用ELISA检测被分泌至细胞培养上清液中的chABC蛋白的含量并比较第三代与第十代的hBMSC细胞培养上清液中目的蛋白表达的变化。条图显示第一条为空病毒转染对照组的细胞培养上清液，第二条为第三代的chABC转染组的细胞培养上清液，第三条为第十代的chABC转染组的细胞培养上清液。结果显示，chABC转染后的第三代细胞可以分泌出约2.0ng/ml的chABC。传代至第十代后细胞依然可以分泌出的chABC蛋白。

图7为明确chABC蛋白的酶活性，可使用抗C4S抗体作为一抗检测被chABC酶消化后NIH3T3细胞的免疫荧光。用chABC转染后的细胞条件培养上清液处理NIH3T3细胞，以明确条件培养上清液中是否含有功能性的chABC酶。其中图中蓝色为DAPI染色的细胞核。A图显示的是空病毒转染对照组中没有免疫荧光的表达。而B图为商售的细菌chABC蛋白消化NIH3T3细胞后检测到的免疫荧光表达。C和D图分别为用chABC转染后的第三代和第十代细胞的条件培养上清液分别处理后NIH3T3细胞的免疫荧光表达，可以看出在chABC转染后细胞的条件培养上清液中含有功能活性的chABC酶，并且长期传代后hBMSC细胞依然可以分泌出有功能活性的chABC(图中绿色)。(标尺长度100μm。)

实施例5 重组chABC-3F慢病毒转染人基质干细胞中chABC-3F酶热稳定性分析

实施例4中chABC-3F慢病毒转染人基质干细胞培养上清部分存储在4℃和-20℃四个月，以及在37℃分别放置0h、16h、24h、40h，为检测分泌酶的稳定性。通过免疫荧光检测方法检测chABC-3F的酶活性，以分析其热稳定性，实验方法与实施例4中相同。

图8显示chABC慢病毒转染后hBMSC细胞条件培养上清处理的NIH3T3细胞表达出强的免疫荧光。B.chABC慢病毒转染后hBMSC细胞条件培养上清分别在4℃放置4个月后，酶的活性有明显下降，表现在抗C4S荧光强度明显下降。C.而条件上清在-20℃贮存4个月，酶的活性仍然得到较好的保存。

图9显示A-D为使用商售的细菌chABC蛋白1mU/ml，在37℃下分别放置0小时、16小时、24小时、40小时，然后处理NIH3T3细胞后的免疫荧光强度，E-H为显示使用chABC慢病毒转染后hBMSC细胞条件培养上清，在37℃下分别放置0小时、16小时、24小时、40小时，然后处理NIH3T3细胞后的免疫荧光强度。结果提示条件培养上清液中chABC-3F酶的稳定性与商售的chABC类似，在37℃环境下存放时间越久，酶的活性有明显的下降趋势。(标尺长度100μm。)

Claims (10)

1.一种持续分泌活性软骨素酶ABC的人干细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括构建无N端信号肽软骨素酶ABC基因并在基因3’端加上加入提高转录和翻译的基因片段，构建到病毒载体上，转染人干细胞制备成可持续分泌活性软骨素酶ABC的人干细胞，以促使人干细胞长期有效分泌骨素酶ABC，并于-20℃下贮存4个月后其仍具有酶活性。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，通过PCR技术扩增不含chABC aa 1-24细菌前导序列，基因3’端加上提高转录和翻译的Kozak-ATG序列，基因5’未端加上利于检测蛋白表达的3×Flag标签，并在3’和5’未端分别设计不同的酶切位点，构建成具有分泌活性的软骨素酶ABC基因，经酶切位点连接到病毒载体上，包装到病毒表达系统上后转染人干细胞，获得持续分泌活性软骨素酶ABC的人干细胞。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述人干细胞包括人基质干细胞、人内皮祖细胞、人神经干细胞或人胚胎干细胞；优选地，其为人基质干细胞或人内皮祖细胞。

4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述人干细胞来源人废弃脐血、胎盘血、脐带或自体骨髓体外培养获得的，优选地，其来源于人自体骨髓。

5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述人干细胞过表达软骨素酶ABC，可持续分泌出有功能活性的软骨素酶ABC，即病毒转染后分泌软骨素酶ABC至细胞培养上清液，并且病毒转染人干细胞传代到10代，在细胞培养上清液仍分泌出的软骨素酶ABC蛋白。

6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述人干细胞持续分泌的软骨素酶ABC，将细胞培养上清液中软骨素酶ABC消化小鼠胚胎成纤维细胞，具有酶活性。

7.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述人干细胞持续分泌的软骨素酶ABC，其热稳定性检测发现在-20℃贮存4个月，酶的活性仍然具有很好的功能。

8.一种重组chABC-3F慢病毒载转染人基质干细胞的制备方法，其特征在于，

将chABC-3F序列从pCAGIP-chABC-3xFlag质粒中扩增下来，将chABC-3F目的片段和pLenti6.3_MCS载体PacI/AscI双酶切后，在T4DNA连接酶作用下，与双链chABC-3F于4℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定；

取细胞状态良好、处于对数生长期的293T细胞，细胞计数后，按照每个10cm的培养皿6×10⁶个细胞数接种于培养皿中，37℃，5％CO₂的培养箱中培养过夜；第二天转染前移去培养液，换5ml Opti-MEM培养液；取9ug PackagingMix和3ug慢病毒表达质粒加入1.5ml Opti-MEM中，混匀，取36ullipofectamine2000加入1.5ml Opti-MEM中，混匀，室温放置5min；混合质粒溶液和lipofectamine 2000稀释液，置室温20min；将3ml质粒脂质体复合物小心地加入到人基质干细胞(human mesenchymal stem cells，hBMSCs)培养皿中，混匀，37℃，5％ CO₂的培养箱中孵育6个小时后，更换含10％胎牛血清的完全培养液DMEM；48h后收集细胞培养上清，3000rpm离心10min，去除细胞和碎片，并用0.45um的滤器过滤；将病毒原液在50000g下超速离心2小时，去除上清，重悬于opti-MEM培养液中，滴度测定后分装成小管保存于-80℃；

合成的chABC慢病毒质粒中chABC cDNA序列来自CAGIP-chABC-3×Flag质粒，可编码细菌chABC蛋白的第25-1021位蛋白序列，所述chABC cDNA序列去除了一般细菌chABC蛋白中的N末端分泌信号；在chABC cDNA序列前的5’端，插入有一个在真核细胞中高效表达的KOZAK-ATG序列；而在chABCcDNA序列后连接有一个3×Flag标签蛋白序列，其后连接的是数个终止子；所述cDNAs序列前后连接有多个外源性限制性酶切位点，以利于其亚克隆至慢病毒载体pLenti6.3_MCS中，所述cDNAs序列经测序进行验证基因序列正确。

9.一种制备权利要求1-8中任一项所述的持续分泌活性软骨素酶ABC的人干细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1)人干细胞基础培养基；

2)包装好的软骨素酶ABC过表达病毒载体；

3)消化细胞的酶；

4)细胞因子以及；

5)使用说明书；

其中，所述使用说明书包括权利要求1-8任一项所述的方法。

10.一种如权利要求1-9任一项所述持续分泌活性软骨素酶ABC的人干细胞及其应用。