CN101489582A - 脑损伤改善药 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于改善由缺氧引起的脑损伤的药物组合物，其包含硫酸软骨素降解酶以及神经干细胞和神经祖细胞中的至少一种作为活性成分。

Description

脑损伤改善药

发明领域

[0001]

本发明涉及用于改善和抑制由氧缺乏引起的脑损伤的药物或类似物。

背景技术

[0002]

缺血性脑病，如血栓性脑梗塞或栓塞性脑梗塞(即脑中风，在日本已知它是导致死亡的三个主要原因之一)，一直是由进食太多食物而运动少的现代人的生活习惯造成的一个问题，已有许多研究针对此疾病的治疗。与此同时，尽管医疗技术的进步导致大幅度提高了早产儿和患病新生儿的存活率和预后，但仍有高比例的新生儿患缺氧缺血性脑病(HIE)(一种缺血性脑部疾病)，发病率为每1000个新生婴儿有2至4个。HIE是脑性麻痹的主要原因，但目前，有效的医学疗法只有脑低温治疗。此外，在近年，随着低出生体重婴儿数目增加，这类疾病(包括由于围产期脑损伤而致的脑性麻痹)在增加，这成为新生儿护理领域的一个问题。因此，需要开发抑制这种由于氧缺乏引起的脑损伤的方法。

[0003]

另一方面，近年来，注意力一直集中在利用干细胞作为新型疗法的再生医学上，这是基于“通过再生补偿损失的细胞”的观点，在许多疾病和器官损伤方面已作了广泛的研究，其临床应用也已经开始。

再生医学在神经系统的研究业已显示，将神经干/祖细胞移植到成年大鼠或猴的脊髓损伤区域能有效地修复脊髓损伤区域，适用软骨素酶ABC并联合神经干/祖细胞移植到成年大鼠由碰伤所致的脊髓损伤区域，会更有效地使脊髓的损伤区域再生(非专利文件1)。然而，那些影响是针对脊髓的，还没有对大脑影响的报告。此外，没有任何关于在新生动物大脑中的应用和影响的报告，这些新生动物的大脑处于发育为成人或成体大脑的进程中，比成人或成体大脑轻，而且其神经回路未发育完全。此外，据报道，使用神经移植物和硫酸软骨素蛋白多糖降解酶可用于促进雪旺氏细胞基底层的轴突伸长，并修复被割伤的神经(专利文件1)。然而，这份报告基于用预先经硫酸软骨素蛋白多糖处理的移植物治疗周围神经中的神经断裂(其需要手术治疗)的实验结果，而没有任何有关中枢神经中因氧缺乏引起的损伤的应用报告。

[0004]

专利文件1：JP 2005-500375 A

非专利文件1：European Journal of Neuroscience，Federation ofEuropean Neuroscience Societies，2005，vol.22，p3036-3046

发明公开内容

[0005]

本发明的目的是提供用于有效地减轻由脑细胞氧供应不足引起的脑损伤的工具。

[0006]

本发明的发明人在以再生医学的观点治疗缺氧和缺血性脑损伤方面进行了广泛的研究。结果，本发明人发现，在由氧缺乏(缺氧状态)引起的脑损伤中可以通过同时使用硫酸软骨素降解酶和神经干/祖细胞来改善脑损伤，从而完成了本发明。

[0007]

也就是说，本发明提供了以下内容。

(1)用于减轻由氧缺乏引起的脑损伤的药物，其包含硫酸软骨素降解酶以及神经干细胞和神经祖细胞中的至少一种作为活性成分。

(2)依据(1)的药物，其中，由氧缺乏引起的脑损伤是由于缺血缺氧引起的。

(3)依据(1)或(2)的药物，其中，硫酸软骨素降解酶是选自软骨素酶ABC、软骨素酶AC和透明质酸酶中的一种或多种酶。

(4)依据(1)或(2)的药物，其中，硫酸软骨素降解酶降解包含硫酸软骨素的二糖组成单元的硫酸软骨素，在该单元中N-乙酰半乳糖胺4位的羟基被硫酸化。

(5)依据(1)或(2)的药物，其中，硫酸软骨素降解酶是软骨素酶ABC或软骨素酶AC酶系。

(6)依据(1)或(2)的药物，其中，硫酸软骨素降解酶是软骨素酶ABC。

(7)依据(1)至(6)中任一项的药物，其中，神经干细胞和神经祖细胞是来源于脑。

(8)依据(1)至(6)中任一项的药物，其中，神经干细胞是培养的神经干细胞，神经祖细胞是培养的神经祖细胞。

(9)依据(1)至(8)中任一项的药物，其中，所述药物施用于处于向成体脑发育进程中的脑。

(10)依据(1)至(8)中任一项的药物，其中，所述药物施用于新生婴儿或新生儿的脑。

(11)依据(1)至(10)中任一项的药物，该药物是用于改善新生儿缺氧缺血性脑病的药物。

(12)依据(1)至(10)中任一项的药物，该药物是用于减小大脑性梗塞区域的药物。

(13)依据(1)至(10)中任一项的药物，该药物是用于保护脑组织的药物。

(14)用于减轻由氧缺乏引起的脑损伤的辅助剂，其包含硫酸软骨素降解酶作为活性成分

(15)硫酸软骨素降解酶以及神经干细胞和神经祖细胞中的至少一种中制造依据(1)至(13)中任一项的药物中的应用。

(16)硫酸软骨素降解酶在制造依据(14)的用于减轻脑损伤的辅助剂中的应用。

(17)用于减轻由氧缺乏引起的脑损伤的药盒，其包含硫酸软骨素降解酶以及神经干细胞和神经祖细胞中的至少一种。

(18)治疗由氧缺乏引起的脑损伤的方法，其包括在脑损伤区域施用硫酸软骨素降解酶以及神经干细胞和神经祖细胞中的至少一种。

附图简述

[0008]

图1是显示在7日龄SD大鼠中由氧缺乏引起的脑损伤的状态图片(照片)。缩写“CX”是指大脑皮质。缩写“CA2”是指海马CA2区。缩写“CA3”是指海马CA3区。缩写“Den”是指齿状门。缩写“TH”是指丘脑。缩写“ST”是指纹状体。

图2是显示使用神经干细胞和C-ABC两者的效果(脑重量比率)的图。

图3是显示使用神经干细胞和C-ABC两者的效果(非梗塞面积比率)的图。

最佳实施方案的描述

[0009]

以下，借助本发明的实施方案对本发明作详细的说明。

本文所用的术语“神经干/祖细胞”包括单独的神经干细胞、单独的神经祖细胞、以及“神经干细胞和神经祖细胞的混合物”，本文所用的术语“神经祖细胞”是指神经元的前体细胞。

[0010]

本发明的硫酸软骨素降解酶与神经干/祖细胞一起使用(如下所述)，以有效地减轻或抑制由氧缺乏引起的脑损伤。

如上所述，在本发明中使用的硫酸软骨素降解酶并没有特别限定的，只要该酶用于由氧缺乏(缺氧状态)引起的脑损伤，并且在施用时可与神经干/祖细胞一起使用。

[0011]

各种硫酸软骨素降解酶是众所周知的，所述是没的具体实例包括通过消除反应降解硫酸软骨素的酶、和水解硫酸软骨素的酶。前者被分类为裂合酶，其例子包括软骨素酶ABC、软骨素酶AC酶系(chondritinase AC enzymes)(软骨素酶ACI、软骨素酶ACII和软骨素酶ACIII)、软骨素酶C和硫酸软骨素ABC外切裂合酶(exolyase)。后者的例子包括透明质酸酶和JP 3759774 B中描述的人源硫酸软骨素降解酶，透明质酸酶的例子包括透明质酸酶(HYAL4)，其描述见Trends inGlycoscience and glycotechnology 89(2004)pp171-185。所有这些酶都可用于本发明，这些酶可单独使用，或其中两种或两种以上组合使用。

[0012]

其中，用于本发明的硫酸软骨素降解酶优选是软骨素酶ABC、软骨素酶AC酶系、透明质酸酶或JP 3759774 B中描述的人源硫酸软骨素降解酶，更优选是裂合酶，最优选是软骨素酶ABC或软骨素酶ACII。在脑中，有大量的包含硫酸软骨素二糖组成单元的硫酸软骨素(硫酸软骨素A)，其中的二糖组成单元包含D-葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺，其中N-乙酰半乳糖胺4位的羟基被硫酸化。在本发明中，具有降解此类硫酸软骨素的活性的酶是优选的。

[0013]

在JP 3759774 B中描述的人源硫酸软骨素降解酶，具体是指具有下列(1)至(5)物理和化学特性的酶。

(1)反应：该酶水解氨基葡聚糖的N-乙酰氨基己糖苷键(N-acetylhexosaminide bond)。

(2)底物专一性：在pH 5时，该酶与硫酸软骨素发生反应，与透明质酸、硫酸角质素、硫酸肝素和肝素不发生反应。在pH 3.5时，该酶与硫酸软骨素和透明质酸发生反应。

(3)反应最适pH：约pH 5(底物：硫酸软骨素；缓冲液：含有0.15M氯化钠的50mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；温度：37℃)。

(4)等电点：约pH 5。

(5)分子量：在将其末端带有烯丙基团的硫酸软骨素链共聚而获得的在聚丙烯酰胺凝胶上进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳中约为36kDa。

[0014]

用于本发明的硫酸软骨素降解酶的来源没有特别限定的，只要这些酶是上面提及的硫酸软骨素降解酶。酶来源的实例包括人、动物和细菌。进一步，这些酶不仅包括自然产生的酶，还包括基因工程重组酶等等。那些酶的任一都可用于本发明。

[0015]

其中，在本发明中优选使用的酶包括例如来源于普通变形菌(Proteus vulgaris)的软骨素酶ABC、来源于肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)的软骨素酶ACI、来源于金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)的软骨素酶ACII、来源于黄杆菌(Flavobacterium sp.)Hp102菌株的软骨素酶ACII、来源于黄杆菌Hp102菌株的软骨素酶ACIII、来源于黄杆菌Hp102菌株的软骨素酶C和在J.Biol.Chem.，272，pp.9123-9130(1997)中描述的硫酸软骨素ABC外切裂合酶。当然，优选使用来源于普通变形菌的软骨素酶ABC和来源于金黄节杆菌的软骨素酶ACII。

[0016]

对于软骨素酶(硫酸软骨素降解酶)，本文所用术语“来源于”是指这种酶来源于原本具有编码此软骨素酶的基因的生物。因此，例如，来源于普通变形菌的软骨素酶ABC，不仅包括由普通变形菌本身产生的酶，而且也包括基于由普通变形菌获得的编码软骨素酶ABC的基因，通过基因工程技术在其它细胞中产生的酶。如果有必要，该酶还包括具有通过基因工程操作引入的突变的酶。其实例包括：WO 2007/038548中描述的软骨素酶ABCI突变体、WO2004/110360中描述的突变体和WO 2004/110359中描述的融合蛋白。

[0017]

本发明的神经干/祖细胞与上述硫酸软骨素降解酶一起使用，以减轻或抑制由氧缺乏引起的脑损伤。用于本发明的神经干/祖细胞没有特别限制，只要该细胞：如上所述用于由氧缺乏(缺氧状态)引起的脑损伤、在施用时与上述硫酸软骨素降解酶一起使用并具有自我增殖能力和/或分化能力。此类神经干/祖细胞包括在再生医学领域广泛使用的神经干/祖细胞。

一般来说，“神经干细胞”被定义为：具有自我增殖能力，并能够分化为构成中枢神经系统的细胞，如神经元、星形胶质细胞和少突神经胶质细胞；而“神经祖细胞”被定义：通过神经干细胞分裂得到、但被本领域技术人员认为在细胞分裂约一次或两次后有分化能力的未分化细胞。请注意，分化是按下列顺序进行：神经干细胞→神经祖细胞→(成熟)神经元。

[0018]

用于本发明的神经干/祖细胞的种类可由本领域技术人员依据神经干/祖细胞移植的个体种类、脑发育的程度、年龄、损伤区域、个体的损伤程度等等来适当地确定。例如，使用的神经干细胞可以是来源于骨髓、外周血、脑、脊髓、脐带血、牙髓、血管等。其中，神经干细胞优选是来源于神经组织，如脊髓、脑等，特别优选是来源于脑的神经干细胞。例如，在新生哺乳动物的移植情况下，特别优选使用来源于胎脑原基的神经干细胞。

本文所用术语“哺乳动物”包括：人类和非人类哺乳动物。此外，本文所用术语“新生儿”或“新生婴儿”是指刚刚出生后的个体。例如，就小鼠或大鼠而言，该术语是指是指从出生起约七到十天的个体，而就人类而言，该术语是指从出生起不到一个月的个体。

[0019]

用于本发明的神经干/祖细胞可预先培养。培养基、培养条件等没有特别的限定，只要能得到考虑到神经干/祖细胞的来源或种类、细胞移植的损伤区域等足以用于移植的数量和质量的神经干/祖细胞；可由本领域技术人员来确定。例如，可利用在再生医学领域广泛使用的用于神经干/祖细胞增殖的培养基和条件，但在本发明中，优选在培养细胞不进行分化的条件下进行培养。例如，培养基可以是含有细胞维持和增殖必需的一些必需组分无机盐、碳水化合物、激素、必需氨基酸、维生素等)的基础培养基，该培养基的例子包括：Dulbecco′s改进Eagle′s培养基(DMEM)、F-12培养基和Neurobasal培养基。此外，优选进一步补充生长因子的培养基，生长因子的例子包括：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)和白细胞迁移抑制因子(LIF)。此外，如果有必要，培养基的组成可由本领域技术人员适当选择：如添加培养基添加剂B27或N2(由Gibco生产)，以促进增殖。培养条件的实例包括：在37℃下10至20天，但该条件最好是由本领域技术人员确定，同时确定培养状态等。

[0020]

在本发明中，上述硫酸软骨素降解酶和神经干/祖细胞联合施用于损伤区域，以减轻氧缺乏(缺氧状态)引起的脑损伤，并抑制脑损伤发展。“施用”的方法并没有特别的限定，只要该方法能够使硫酸软骨素降解酶和神经干/祖细胞在损伤区域共存。

例如，对于神经干/祖细胞，可以采用在再生医学领域被广泛使用的将神经干/祖细胞移植到所需区域的方法。更具体地说，例如，可以例举通过以下步骤移植神经干/祖细胞到目标区域的方法：将神经干/祖细胞悬浮在磷酸缓冲盐水中，并添加/注射所得细胞悬液到该区域。

同时，对于硫酸软骨素降解酶，例如，可以例举通过以注射施用硫酸软骨素降解酶溶液的方法。

[0021]

在本发明中，短语“与神经干/祖细胞一起使用硫酸软骨素降解酶”和“与硫酸软骨素降解酶一起使用神经干/祖细胞”是指本领域技术人员所普遍理解的范围内的“同时使用”，而不是旨在包括下列情况：在损伤区域进行一种治疗，然后停止，在一定的时间间隔后再进行另一种治疗。也即，对损伤区域的一系列治疗是连续进行，该短语包括例如下列情形：在移植神经干/祖细胞后施用硫酸软骨素降解酶；在施用硫酸软骨素降解酶后移植神经干/祖细胞；以及两种治疗移植(施用)同时进行。依据该应用(施用)方法，本发明能够提供治疗氧缺乏引起的脑损伤的方法。本文所用术语“治疗”是指治疗和改善氧缺乏引起的脑损伤、抑制脑损伤发展等。

[0022]

在本发明中，氧缺乏(缺氧状态)引起的脑损伤并没有特别限定，只要所述脑损伤是在脑中的氧气量减少或对脑组织的氧气供应量减少所造成的。脑损伤的实例包括：脑血管血栓、脑血管栓塞、脑血管破裂造成的大脑内出血、脑血管压迫、循环系统异常造成的血液循环不良、呼吸系统梗阻以及因窒息而致的低氧和局部缺血性病症、大脑内出血或在产科分娩期间或出生时的类似情况。脑损伤的实例还包括：由于外部环境因素(如火灾和溺水)造成氧供应降低而致的脑损伤。其中，特别优选缺氧缺血所造成的脑损伤。

[0023]

如上所述，本发明中，当硫酸软骨素降解酶和神经干/祖细胞一起使用时，氧缺乏(缺氧状态)引起的脑损伤被有效地缓解和抑制。因此，本发明可用于保护脑和由氧缺乏(缺氧状态)引起的各种疾病。疾病的实例包括：一过性局部缺血发综合征(TIA综合征)、局部缺血性脑血管疾病、新生儿缺氧缺血性脑病、由于动脉粥样硬化引起的血栓、颈内动脉(包括分支)中粥样硬化血栓形成性病变、脑梗塞、脑栓塞、大脑内出血、蛛网膜下出血、高血压性脑病、脑底异常血管网病、脑静脉/脑静脉窦阻塞、系统性低血压、缺氧缺血性脑病、外伤性脑血管阻塞、脑震荡、脑挫伤、硬膜外血肿、硬膜下血肿、脑血管疾病(如大脑内出血、脑梗塞、蛛网膜下出血和高血压性脑病、脑炎和脑肿瘤。

[0024]

本发明对于在新生儿或新生婴儿脑中的损伤是特别适合的，新生儿或新生婴儿处于发育为成人的进程并有不同分化程度的神经元和功能不完全的神经回路，本发明对脑部疾病和由于在产科分娩期间或出生时窒息脑缺血和围产期大脑内出血引起的脑病都是非常有用的。例如，本发明特别适合作为改善新生儿缺氧缺血性脑病的药物。

正如下面的实施例所述，本发明提供了以下效应：如抑制由氧缺乏(缺氧状态)引起的脑梗塞区域的扩大、减少或减轻脑梗死区以及通过增加脑重量而再生或改善脑神经组织，本发明提出了恢复脑功能的可能性。

[0025]

在利用本发明治疗疾病时，其用法和用量可由本领域技术人员依据待施用个体(如患有任一上述疾病的患者)的症状、脑损伤的状态、年龄、体重等等作适当确定。作为用法，包括依据移植神经干/祖细胞的上述方法和施用硫酸软骨素降解酶的方法而在损伤区域将硫酸软骨素降解酶与神经干/祖细胞一起施用的方法。请注意，正如医学理论中指出的，剂量根据目标个体的年龄和体重而不同，但软骨素酶ABC剂量的实例包括0.0001单位至500个单位。

注意，上述酶活性的“1个单位”是指：在37℃、pH值8.0的条件下，每分钟由来源于鲨鱼软骨的硫酸软骨素C生产1微摩尔不饱和二糖的酶量。

本发明还包括用于改善由氧缺乏(缺氧状态)引起的脑损伤的一种药学上的药物组合物或药盒，其包括本发明的硫酸软骨素降解酶和本发明的神经干/祖细胞作为组分。本发明可提供：例如改善新生儿缺氧缺血性脑病的药物、减少脑梗塞区域的药物和保护脑组织的药物，所有这些都包含本发明的硫酸软骨素降解酶和本发明的神经干/祖细胞作为组分。

此外，本发明可提供用于改善新生儿缺氧缺血性脑病的药物，其包括硫酸软骨素降解酶以及神经干细胞和神经祖细胞中至少一种作为活性成分，并可进一步提供用于减少脑梗塞区域的药物和用于保护脑组织的药物，所有这些都包括硫酸软骨素降解酶以及神经干细胞和神经祖细胞中至少一种作为活性成分。如上所述，例如，在这些药物中的硫酸软骨素降解酶和神经干/祖细胞可以是独立制备和包装，只要该方法能够使硫酸软骨素降解酶和神经干/祖细胞在损伤区域共存，并且这些药物可像上述含有硫酸软骨素降解酶为活性成分的药物或上述含有神经干/祖细胞为活性成分的药物一样独立地分布。也就是说，本发明可以提供用于减轻氧缺乏引起的脑损伤的辅助剂，其包括硫酸软骨素降解酶作为活性成分。

实施例

[0027]

以下，本发明将通过实施例进行详细描述。然而，这些实施例不应该限制本发明的技术范围。

[0028]

<参比例1>

<来源于大鼠胎大脑的神经干细胞的培养>

使用从怀孕的大鼠中获得的14日龄胎鼠，该大鼠已通过引入绿色荧光蛋白(GFP)基因而被转化(EGFP转基因大鼠，由Japan SLC，Inc.制造)。从该转化体的每只胎鼠的初生脑中获得GFP标记的神经干细胞。由此产生的标记神经干细胞以神经球(neurosphere)方法进行培养，这是一种选择性培养神经干细胞的方法。具体而言，使通过将标记神经干细胞在磷酸盐缓冲液(PBS)中分离而制备的单细胞悬液，在DMEM/F-12培养基中于37℃温度下，在存在生长因子[成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)和表皮生长因子(EGF)]的情况下进行培养(1:1)。开始培养后6天，将由增殖的标记神经干细胞形成的神经球在PBS中物理性分离，从而再次制备单细胞悬液。

[0029]

<参比例2>

<制备新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)模型>

参照Rice等的方法(Rice JE 3rd，Vannucci RC，Brierley JB.未成熟对大鼠缺氧缺血性脑损伤的的影响.Ann Neurol，9：131-141.1981.)，由7日龄SD大鼠制备被用为新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)模型的大鼠。具体来说，将大鼠的右侧颈总动脉进行双重结扎，并在8％氧气/92％氮气的缺氧条件下保留创口2小时，以制备HIE仅发生在右脑的大鼠。

处死所产生的大鼠，在距脑前端(anterior end)5毫米距离的部分制备切片，用苏木精-伊红染色(HE染色法)和MAP2染色。作为对照，将未经受缺氧条件的7日龄SD大鼠以上述同样方式进行染色，观察大脑形状和梗死区域(图1)。右脑中有HIE的大鼠的苏木精-伊红染色和MAP2染色结果分别显示于图1C和图1D，对照组大鼠的苏木精-伊红染色和MAP2染色结果分别显示于图1A和图1B。

从图1可以明显看到，梗塞仅发生在右脑的广泛区域。

[0030]

<实施例1>

将依据参比例2制备的仅右脑有HIE的大鼠分成3组，按照以下程序，分别对相应的组施用：仅神经干细胞、神经干细胞和软骨素酶ABC两者、以及仅软骨素酶ABC。请注意，使用的软骨素酶ABC(C-ABC)是由Seikagaku Corporation生产的制品，将3组的施用细胞数量和酶的给药量调整为一致。

在仅右脑有HIE的大鼠制备后24小时，借助用于新生鼠的头夹紧装置和用于脑内注射的工具，用Hamilton 27号针，将依据参比例1制备的5μl标记神经干细胞溶液(5×10⁷细胞/毫升)，按照下列坐标位注射入大鼠的右脑室：前囟前方2毫米、前囟右侧2.5毫米、硬膜内4毫米深，从而移植标记神经干细胞。

以如上同样的方式，将软骨素酶ABC溶解在BSA-PBS溶液[其通过将牛血清白蛋白(BSA)以0.1％浓度溶解于磷酸缓冲盐水(PBS)]中而获得)，制备溶液，使软骨素酶ABC浓度为10U/ml。将由此得到的2.5μl溶液(10U/ml)与2.5μl标记神经干细胞悬液(1×10⁸个细胞/毫升)混合并施用。

此外，以如上同样的方式，施用5μl的5U/ml软骨素酶ABC。

通过对依据参比例2制备的仅右脑有HIE的大鼠施用PBS所获得的大鼠作为对照。

[0031]

在移植标记神经干细胞和/或施用C-ABC后的7天，处死大鼠，摘取左脑和右脑。用两个指标评价其影响：脑重量比和非梗塞(未损伤)区域的面积比(表1)。图2图示重量比，图3图示面积比。图2中，缩写“细胞”、“CH+细胞”、“CH”和“Ctrl”分别是指仅施用神经干细胞、施用神经干细胞和C-ABC两者、仅施用C-ABC和对照的结果。图2中的缩写“细胞”、“CH+细胞”、“CH”和“Ctrl”具有如上相同的含义。

重量比的计算如下：测量所摘取的左脑和右脑中的脑皮质的重量。为了校正试验鼠的个体差异，将正常状态下的右脑皮质重量除以左脑皮质重量(重量比：湿重)得到的值用于评价(重量比＝右脑皮质重量/左脑皮质重量)。

另一方面，非梗塞(未损伤)区域的面积比的计算如下：将所摘取的左脑和右脑用多聚甲醛固定以用于光学显微镜观察，用距离每一大脑边缘5毫米的部分制备冠状切片(大脑中心部分的额切片)。切片用荧光Nissl染色试剂进行Nissl染色。染色后，在光学显微镜下基于Scion图像(Scion Corporation制造)进行图像处理，以定量的方式计算左脑和右脑半球中的染色面积(非梗塞区域)，将右脑半球染色面积除以左脑半球染色面积得到的值用于评价(非梗塞面积比＝右脑半球染色面积/左脑半球染色面积)。

[0032]

[表1]

 

	神经干细胞	神经干细胞+软骨素酶ABC	软骨素酶ABC	对照
					重量比	0.67±0.17	0.88±0.19	0.61±0.14	0.61±0.10
面积比	0.27±0.18	0.55±0.27	未测量	0.23±0.14

[0033]

从重量比的比较发现：由于神经组织的变性和缺陷，对照组梗塞一侧大脑半球的重量只有正常一侧大脑半球重量的60％左右；而在使用神经干细胞和C-ABC的情况下，梗塞一侧大脑半球的重量达到正常一侧大脑半球重量的90％左右。另一方面，如果仅移植神经干细胞和仅施用C-ABC，则其重量比与对照的重量比是几乎相同的。此结果表明，对经过缺氧缺血性处理的胎鼠大脑共同施用神经干细胞和C-ABC，能够抑制神经组织的变性和缺陷。

此外，根据Nissl染色(用于染色脑细胞中非变性区域(正常状态))的结果发现，在对照和仅施用神经干/祖细胞的情况下，正常区域(非梗塞区域)约占20至30％，而在施用神经干细胞和C-ABC两者的情况下，正常区域占50％或以上，这表明，梗塞区域的形成被有效地抑制。

[0034]

所述结果表明，使用移植神经干细胞和施用软骨素酶ABC两者，对于有效地减轻脑中、尤其是对处于发育为成体进程中(成长过程中)的新生儿或新生婴儿的脑中由氧缺乏(缺氧状态)引起的脑损伤是非常有益的。

[0035]

<实施例2>

本发明的发明人进一步用来源于金黄节杆菌(Arthrobacteraurescens)的软骨素酶ACII代替软骨素酶ABC进行了实验，软骨素酶ACII是硫酸软骨素降解酶中的一种。

将依据参比例2制备的仅右脑有HIE的大鼠分成2组(每组4只大鼠)，如上述实施例1的同样程序(包括细胞和酶的剂量)，仅用神经干细胞治疗以及用神经干细胞和软骨素酶ACII两者治疗。请注意，使用的软骨素酶ACII是由Seikagaku公司生产的制品，将2组的施用的细胞数量和施用的酶量调整为一致。

在移植标记神经干细胞和/或施用软骨素酶ACII后的7天，处死大鼠，摘取左脑和右脑。用如上述实施例1的同样方法以大脑重量比作为指标评价影响(表2)。

[0036]

[表2]

 

	神经干细胞	神经干细胞+软骨素酶ACII
			重量比	0.43±0.08	0.50±0.06

[0037]

结果表明，与仅用神经干细胞的治疗相比，用神经干细胞和软骨素ACII两者的治疗能更有效地减少脑梗塞区域。

由于软骨素酶ABC和软骨素酶ACII都是硫酸软骨素降解酶，所以实施例的结果表明，与仅用神经干细胞的治疗相比，用神经干细胞和硫酸软骨素降解酶两者治疗，能更加有效地减轻由氧不足引起的脑损伤。

工业应用性

[0038]

根据本发明，通过在移植神经/祖细胞的同时施用硫酸软骨素降解酶，可有效地改善由氧缺乏(缺氧状态)或缺血引起的脑损伤，并可抑制损伤的恶化。此外，本发明对处于发育为成体过程中的这类脑损伤是有效的，举例来说，对在产科分娩过程中或在出生由窒息或脑缺血以及由围产期大脑内出血引起的新生儿(新生婴儿)脑疾病非常有效。

Claims (18)

1.用于减轻由氧缺乏引起的脑损伤的药物，其包含硫酸软骨素降解酶、以及神经干细胞和神经祖细胞中的至少一种作为活性成分。

2.依据权利要求1的药物，其中，由缺氧引起的脑损伤由缺氧缺血引起。

3.依据权利要求1或2的药物，其中，硫酸软骨素降解酶是选自软骨素酶ABC、软骨素酶AC和透明质酸酶中的一种或多种酶。

4.依据权利要求1或2的药物，其中，硫酸软骨素降解酶降解包含硫酸软骨素的二糖组成单元的硫酸软骨素，在该二糖组成单元中N-乙酰半乳糖胺4位的羟基被硫酸化。

5.依据权利要求1或2的药物，其中，硫酸软骨素降解酶是软骨素酶ABC或软骨素酶AC酶系。

6.依据权利要求1或2的药物，其中，硫酸软骨素降解酶是软骨素酶ABC。

7.依据权利要求1至6中任一项的药物，其中，神经干细胞和神经祖细胞来源于脑。

8.依据权利要求1至6中任一项的药物，其中，神经干细胞是培养的神经干细胞，神经祖细胞是培养的神经祖细胞。

9.依据权利要求1至8中任一项的药物，其中，该药物施用于处于发育为成人或成体脑进程中的脑。

10.依据权利要求1至8中任一项的药物，其中，该药物施用于新生婴儿或新生儿的脑。

11.依据权利要求1至10中任一项的药物，该药物是用于改善新生儿的缺氧缺血性脑病的药物。

12.依据权利要求1至10中任一项的药物，该药物是用于减小脑梗塞区域的药物。

13.依据权利要求1至10中任一项的药物，该药物是用于保护脑组织的药物。

14.用于减轻由氧缺乏引起的脑损伤的辅助剂，其包含硫酸软骨素降解酶作为活性成分。

15.硫酸软骨素降解酶以及神经干细胞和神经祖细胞中的至少一种在制造依据权利要求1至13中任一项的药物中的应用。

16.硫酸软骨素降解酶在制造依据权利要求14的用于减轻脑损伤的辅助剂中的应用。

17.用于减轻由氧缺乏引起的脑损伤的药盒，其包含硫酸软骨素降解酶以及神经干细胞和神经祖细胞中的至少一种。

18.治疗由氧缺乏引起的脑损伤的方法，其包括在脑损伤区域施用硫酸软骨素降解酶以及神经干细胞和神经祖细胞中的至少一种。

Images