CN105560285A

CN105560285A - 神经干细胞在介导影响p25和p35蛋白表达中的应用

Info

Publication number: CN105560285A
Application number: CN201610015569.4A
Authority: CN
Inventors: 田雨光; 顾为望; 王玉珏; 吴清洪; 徐名衬
Original assignee: Songshan Lake Pearl Laboratory Animal Sci & Tech Co Ltd Dongguan
Current assignee: Songshan Lake Pearl Laboratory Animal Sci & Tech Co Ltd Dongguan
Priority date: 2016-01-11
Filing date: 2016-01-11
Publication date: 2016-05-11

Abstract

本发明涉及神经干细胞在介导影响P25和P35蛋白表达中的应用，公开了神经干细胞在制备P25和/或P35蛋白表达调控剂方面的应用，以及神经干细胞在制备缺血缺氧性脑病等脑损伤或神经变性疾病治疗药物方面的应用。本发明研究显示，神经干细胞（neural？stem？cells，NSC）能够调控P25、P35蛋白的表达变化，具体是上调P35蛋白表达、下调P25蛋白表达，抑制Cdk5的过度激活，从而对脑损伤起到保护治疗作用，对缺血缺氧性脑病等疾病有显著的疗效。本发明为HIE等脑损伤或神经变性疾病的治疗提供了一种新的治疗途径和药物开发基础，给缺血缺氧性脑病等相关疾病患者带来新希望。

Description

神经干细胞在介导影响P25和P35蛋白表达中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及神经干细胞在介导P25和P35蛋白表达从而促进缺血缺氧性脑病新生大鼠神经功能恢复方面的应用。

背景技术

围产期窒息所致缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemicencephalopathy，HIE）是一种常见的脑损伤疾病，该病是新生儿期危害最大的常见病之一，常引起新生儿死亡和严重神经系统发育障碍。据统计，我国新生儿HIE发生率约为活产儿的3‰～6‰，其中15%～20%在新生儿期死亡，存活者中20%～30%可能遗留不同程度的神经系统后遗症。另外，还有包括阿尔茨默氏病、肌萎缩侧索硬化症、帕金森病等各种神经变性疾病，已严重威胁人类的健康，

目前为止，针对脑损伤和神经系统变性性疾病，尚无有效的治疗手段。研究显示，P35和P25蛋白是细胞周期素依赖蛋白激酶5（Cdk5）的调节亚基，Cdk5在哺乳动物海马神经元的学习和记忆功能中发挥重要作用。生理状态下，CDk5在p35等调节亚基的信号作用下锚定于膜上，磷酸化膜性底物，通过平衡促凋亡和促存活信号转导通路，在神经元发育、迁移、神经元存活中发挥重要作用。也有研究显示，P35蛋白是大脑皮层中cdk5的特异性激活剂，能够被钙激活中性蛋白（calpain）分解为P25并与cdk5结合使之激活，参与神经细胞的歉意、分化、细胞凋亡和信号传导等过程。而Cdk5在多种人类神经退行性疾病中起非常重要的作用，可能是构成包括阿尔茨默氏病、肌萎缩侧索硬化症、帕金森病等神经变性疾病的主要分子病理基础。

因此，针对P35和P25蛋白的调控从而治疗相关的脑损伤和神经变性疾病，是一种探索脑类疾病治疗药物的新方向和有效途径。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有HIE等脑损伤或神经变性疾病治疗技术的缺陷和不足，提供一种能够针对调控P35和P25蛋白的表达，从而实现HIE等脑损伤或神经变性疾病治疗目的的药物。本发明研究显示，神经干细胞（neuralstemcells，NSC）能够调控P25、P35蛋白的表达变化，具体是上调P35蛋白表达、下调P25蛋白表达，抑制Cdk5的过度激活，从而对脑损伤起到保护治疗作用，对缺血缺氧性脑病等疾病有显著的疗效。

本发明的目的是提供神经干细胞在制备P25和/或P35蛋白表达调控剂方面的应用。

本发明另一目的是提供神经干细胞在制备脑损伤或神经变性疾病治疗药物方面的应用。

本发明再一目的是提供神经干细胞在制备缺血缺氧性脑病治疗药物方面的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

神经干细胞在制备P25和/或P35蛋白表达调控剂方面的应用。

具体地，是神经干细胞在制备P25蛋白表达抑制剂方面的应用，以及神经干细胞在制备P35蛋白表达促进剂方面的应用。

神经干细胞在制备脑损伤或神经变性疾病治疗药物方面的应用。

其中，所述脑损伤或神经变性疾病是指P25和/或P35蛋白参与调控的脑损伤或神经变性疾病。

更具体地，所述脑损伤或神经变性疾病是指缺血缺氧性脑病

另外，在针对缺血缺氧性脑病治疗药物时，所述药物是指能够保护和/或恢复脑缺血损伤的药物。

更进一步地，所述药物是指能够保护和/或恢复脑缺血损伤，且能够上调P35蛋白表达、下调P25蛋白表达的药物。

本发明为了探讨神经干细胞对P25、P35蛋白表达变化的影响，以及对缺血缺氧性脑病新生大鼠的治疗作用，选取了60只新生7天SD大鼠，按随机数表法分为3组：SHAM组（对照组）：20只，按HIE模型制作过程施予假手术，不给予其他干预。HIE+PBS组（缺血组）：20只，先制成HIE模型，然后给予PBS作为安慰治疗；HIE+NSC组（治疗组）20只，先制成HIE模型，然后给予NSC治疗。分别于干预后第5、7、14、21天进行神经行为学检测（RotarodTest旋转实验和Morris水迷宫测试）。21日后处死采用组织切片HE染色，观察新生大鼠脑损伤的病理变化。组织匀浆法提取海马蛋白，Westernblot法检测海马区P35、P25蛋白的表达。

RotarodTest结果显示造模后第5天模型组与治疗组大鼠在转轮中坚持时间明显下降，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）；造模后第7、14、21天，模型组与治疗组大鼠在转轮中坚持时间明显升高，其中治疗组升高趋势明显高于缺血组（P<0.05），第21天模型组与治疗组大鼠在转轮中坚持时间比较差异有统计学意义（P<0.05）。Morris水迷宫结果显示3大鼠的逃避潜伏期随训练天数增加而逐渐缩短，前5天的总体学习成绩的组间差异有统计学意义（P<0.01）。第7天开始治疗组时间逐渐缩短，第21天治疗组与缺血组大鼠的逃避潜伏期在各个时间点的差异均有统计学意义（P<0.05）。模型组大鼠出现海马区神经元水肿、核染色质结构不清、空泡形成等病理变化，而治疗组病理损伤明显减轻。Westernblot结果显示与对照组相比缺血组P35表达减少，P25表达增加（P<0.05），而治疗组与缺血组相比较P35表达增多，P25表达减少（P<0.05）。

综上所述，显示，神经干细胞（neuralstemcells，NSC）能够调控P25、P35蛋白的表达变化，具体是上调P35蛋白表达、下调P25蛋白表达，抑制Cdk5的过度激活，从而对脑损伤起到保护治疗作用，可促进大鼠缺血脑损伤后神经功能恢复，对缺氧性脑病等疾病有显著的疗效。因此，上述应用均应在本发明的保护范围之内。

本发明具有以下有益效果：

本发明研究显示，神经干细胞（neuralstemcells，NSC）能够调控P25、P35蛋白的表达变化，具体是上调P35蛋白表达、下调P25蛋白表达，抑制Cdk5的过度激活，从而对脑损伤起到保护治疗作用，对缺血缺氧性脑病等疾病有显著的疗效。

本发明为HIE等脑损伤或神经变性疾病的治疗提供了一种新的治疗途径和药物开发基础，给缺血缺氧性脑病等相关疾病患者带来新希望。

另外，本发明还为研究Cdk5在HIE脑损伤中的作用及神经干细胞的治疗机制提供了新思路，研究结果揭示了Cdk5在HIE脑损伤中发挥促凋亡作用，而神经干细胞可以阻断Cdk5及其信号转导通路从而预防或减轻HEI脑损伤。

附图说明

图1为3组大鼠造模后不同时间点旋转试验检测结果。

图2为3组大鼠造模后不同时间点逃避潜伏期检测结果。

图3为3组大鼠造模后第21天海马脑片HE染色结果（200倍）。

图4为3组大鼠海马P35和P25蛋白表达电泳图。

图5为3组大鼠海马P35和P25蛋白定量表达分析结果（*表示P<0.05）。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明实施例部分的统计学方法采用SPSS13.0统计软件处理。计量资料采用均数±标准差表示，各组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用Student’st-test进行检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

实施例1

1、实验动物及分组：

选择7日龄SD大鼠60只，雌雄各半，体重50-60g，由南方医科大学实验动物中心提供（SYXK(粤)2011-0074），按随机数字表法分为3组：

（1）HIE+PBS组（缺血组）：20只，HIE造模成功后PBS作为安慰治疗；

（2）SHAM组（对照组）；20只，仅按HIE模型制作过程施予假手术，不给予其他干预；

（3）HIE+NSC组（治疗组）：20只，HIE造模成功后给予NSC治疗。

2、主要仪器设备与试剂

（1）主要仪器：转棒仪（Rotarod，济南益延科技发展有限公司，YLS-4C）；RD1101-MWM-G鼠博士MORRIS水迷宫视频分析系统（上海移数信息科技有限公司）；海力孚HF-240全自动生化分析仪；立体定位仪（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，68000型）；微量注射泵（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，KdSientific310）；倒置相差显微镜（日本Olympus公司，CX31）；电泳仪（瑞典Amersham公司；EttanDALTsix）；低温离心机/凝胶图像分析仪（美国安莱公司，AlphaEmager2200）。

（2）主要试剂：蛋白酶抑制剂cocktail购自美国sigma公司；PVDF膜购自美国Millipore公司。P25/P35（C-19）多克隆抗体购自美国CellSignaling公司；β-actin购自威佳公司；辣根过氧化物酶标记二抗购自中杉金桥公司；Westernblot化学发光检测试剂盒购自凯基生物公司；神经干细胞由广东省脐带血造血干细胞库提供，移植时PBS洗涤细胞3次，终浓度调节为0.5×10⁵/μL备用。

3、HIE模型的建立

实验大鼠仰卧固定后经10%水合氯醛（400mg/kg）腹腔注射麻醉后，在解剖显微镜下行颈正中切口，分离出右侧颈总动脉后双重结扎，并从两重结扎线中间剪断血管，缝合切口。术后约2～3h将大鼠置于37℃恒温水浴的密闭缺氧箱中，向缺氧箱中持续通入8%O₂+92%N₂的混合气体，气流量1L/min，维持1.5h。苏醒后返回母鼠身边继续喂养。

4、脑立体定位仪下侧脑室移植NSCs和PBS的注射

本研究选择在通过苍白球中心的鼠脑横断切面，以左侧尾状核为目标区进行穿刺注射。大鼠脑缺血后24小时，大鼠经10%水合氯醛（400mg/kg）腹腔注射麻醉后，俯卧位固定于脑立体定位仪，头皮正中切开，分离骨膜，暴露前囟，于颅骨背侧前囟后1.0mm，左旁开3.5mm处钻一直径为2.0mm的小孔，大鼠严格按照立体定位图谱，前囟后1.0mm，左旁开3.5mm，进针深度5.0mm位置进行穿刺。治疗组以0.2μL/min的速度恒速注射3μL神经干细胞，注射完毕后，留针5min，缓慢移出针头。以同样方法注射等量PBS到对照组。

5、行为学检测

（1）旋转实验（Rotarodtest）：

实验装置有5个隔间，每个隔间的宽度为6.5cm。每个隔间有红外探测和独立的测量系统装置，能检测到小鼠的跌落情况。程序化控制转棒仪的转速，将实验鼠放于Rotarod仪上，5min内转速逐渐增加（4r/min匀速增加至40r/min），直至大鼠从Rotarod仪上落下记录相应时间。对每只大鼠进行3次测试，取其平均值与正常大鼠下落时间的百分比作为反映小运动功能的指标，数值越低，反映大鼠运动功能损伤越严重。

旋转实验结果如附图所示1。造模后第5、7、14、21天时，对照组大鼠在转轮中坚持时间变化趋势不明显，基本保持在正常水平，各时间点间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；而缺血组与治疗组大鼠在转轮中坚持时间的变化呈现出先急剧下降后缓慢升高的变化趋势，各时间点间比较差异有统计学意义（P<0.05）。

造模后第5天起，缺血组与治疗组大鼠在转轮中坚持时间明显下降，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），2组间差异无统计学意义（P＞0.05）；造模后第7、14、21天，缺血组与治疗组大鼠在转轮中坚持时间明显升高，其中治疗组升高趋势明显高于缺血组，虽与对照组比较差异仍有统计学意义（P<0.05），但在第21天缺血组与治疗组大鼠在转轮中坚持时间比较差异有统计学意义（P<0.05）。

（2）Morris水迷宫实验

Morris水迷宫由平台、圆形水池和记录装置组成。水池的直径135cm，高60cm，池壁黑色，将水池分为东北、东南、西南和西北4个象限。平台置于任意一个象限的中央．每个象限的边1/2弧度处标记为小鼠入水点。每天开始实验时，在水池里注水35cm深，水温维持在（20±5）℃。实验期间迷宫四周参照物保持不变。水迷宫实验系统包括CCD摄像头、视频采集卡和水迷宫采集分析系统。所有实验大鼠均进行隐蔽平台实验5d、探索实验1d，以评价各组大鼠学习和记忆能力的变化及干预后的影响。

Morris水迷宫实验结果如附图2所示。造模后第5、7、14、21天时，对照组大鼠逃避潜伏期时间变化趋势不明显，基本保持在正常水平，各时间点间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；而缺血组与治疗组大鼠逃避潜伏期时间变化呈现出延长的变化趋势，各时间点间比较差异有统计学意义（P<0.05）。

造模后第5天起，缺血组与治疗组大鼠避潜伏期时间变化与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），2组间差异有统计学意义（P<0.05）；造模后第7、14、21天，缺血组与治疗组大鼠避潜伏期时间有所下降，其中治疗组下降趋势明显高于缺血组（P<0.05），第21天缺血组与治疗组大鼠避潜伏期时间变化比较差异有统计学意义（P<0.05）。

6、HE染色：

（1）干预后第21天，每组各取实验大鼠10只，用10%水合氯醛（400mg/kg）腹腔注射麻醉后处死、将脑组织置于4%多聚甲醛中固定48h后进行石蜡包埋及切片，切片厚度为5μm。石蜡切片经常规脱蜡、水合后，HE染色、梯度乙醇脱水、二甲苯透明后封片观察。

（2）HE染色结果如附图3所示。结果显示对照组大鼠海马区内神经元细胞包膜完整，核大而圆细胞间隙正常，细胞突起清晰可见；缺血组大鼠海马区神经元水肿、核染色质结构不清、空泡形成、室管膜细胞重度水肿；而治疗组较缺血组损伤较轻，海马区神经元轻度水肿，未见明显空泡。

7、Westernblot检测

（1）第21天，每组另取实验大鼠10只，大鼠称重，用10%水合氯醛（400mg/kg）腹腔注射麻醉后处死，取海马组织约200mg，加入1mL裂解液，置于冰面上匀浆裂解，匀浆时加入蛋白酶抑制剂cock-tail。在4℃、15000r/min离心10min，取上清液。

（2）Westernblotting分析结果如附图4所示，各组大鼠在相对分子质量35000、25000位置均显示一条清晰的黑色条带，其中治疗组、缺血组P35蛋白条带印迹染色较对照组浅P25蛋白条带印迹染色较对照组深。

8、Bradford法进行蛋白定量（Bio-radproteinassay）

（1）配置10%的SDS-Page胶，将样品用电泳缓冲液稀释后煮沸浓缩，按顺序加入泳道中。待溴酚蓝染料前沿到达分离胶底部，取下凝胶，用Bio-Red电转膜仪将蛋白转移至PVDF膜上。转移完毕，5%脱脂奶粉封闭1h，置于P25/P35抗体（1：1000）稀释液4℃下孵育过夜。加ECL（Pieces）发光剂，于凝胶成像仪中成像，用FluorChemSP软件对结果进行分析，β-actin作为内参照。

（2）定量分析结果如附图5所示：与对照组比较，治疗组P35、P25蛋白表达水平变化不明显，差异无统计学意义（P>0.05）；缺血组P35蛋白表达水平较对照组、治疗组明显下降，P25蛋白表达水平较对照组、治疗组明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。

综上所述，本发明通过结扎单侧颈动脉构建HIE模型，并通过旋转和水迷宫实验对神经干细胞治疗新生大鼠HIE损伤动物模型进行了行为学观察，研究结果表明，模型组大鼠与假手术组相比较运动功能明显下降，而治疗组的运动功能得到明显的恢复。病理结果显示，与假手术组相比较，模型组和治疗组在不同时间点皮质区均可见海马区神经元水肿、核染色质结构不清、空泡形成，但缺血组相比治疗组凋亡细胞数均逐渐减少。

同时，本发明还发现HIE损伤可导致海马神经元的损伤，并介导P35蛋白表达降低和P25蛋白表达升高。机制为：HIE损伤导致DNA损伤，通过一系列信号转导，激活蛋白水解酶，将P35水解为P25和P25-Cdk5复合物使Cdk5过度激活，使底物过度磷酸化，导致神经元变性坏死。而神经干细胞可以上调P35蛋白表达，下调P25蛋白表达，抑制Cdk5的过度激活从而对脑缺血再灌注所造成的损伤起到一定的保护作用。

Claims

1.神经干细胞在制备P25和/或P35蛋白表达调控剂方面的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，是神经干细胞在制备P25蛋白表达抑制剂方面的应用。

3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，是神经干细胞在制备P35蛋白表达促进剂方面的应用。

4.神经干细胞在制备脑损伤或神经变性疾病治疗药物方面的应用。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述脑损伤或神经变性疾病是指P25和/或P35蛋白参与调控的脑损伤或神经变性疾病。

6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，是神经干细胞在制备缺血缺氧性脑病治疗药物方面的应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述药物是指能够保护和/或恢复脑缺血损伤的药物。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述药物是指能够保护和/或恢复脑缺血损伤，且能够上调P35蛋白表达、下调P25蛋白表达的药物。