CN115006430A - 视网膜色素上皮细胞与间充质干细胞在制备治疗视网膜退行性疾病的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了视网膜色素上皮细胞与间充质干细胞在制备治疗视网膜退行性疾病的药物中的应用。胎儿来源的视网膜色素上皮细胞与间充质干细胞在制备治疗视网膜退行性疾病的药物中的应用。所述的视网膜退行性疾病优选老年性黄斑变性。本发明将胎儿来源的视网膜色素上皮细胞与间充质干细胞共同移植治疗视网膜退行性疾病模型小鼠，比单纯的fRPE和单纯的MSC移植治疗，对视网膜损伤后修复功能效果更好。并且，共同移植比单纯一种细胞的移植，移植后存活的细胞数更多，光感受器细胞解救效果更强。并且，共同移植显著抑制了退行性疾病模型小鼠的炎症反应，并促进内源性生长因子的分泌。

Description

视网膜色素上皮细胞与间充质干细胞在制备治疗视网膜退行 性疾病的药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及视网膜色素上皮细胞与间充质干细胞在制备治疗视网膜退行性疾病的药物中的应用。
背景技术
老年性黄斑变性(AMD)是一种渐进性发展的视网膜变性疾病，以黄斑区受损及中心视力丢失为主要特征，是引起老年人视力丧失的主要原因，大多数患者的视力丢失发生在晚期AMD。近年来，抗新生血管疗法对湿性AMD有较好的疗效，但对干性AMD仍无有效治疗手段。
随着再生医学与干细胞研究的迅猛发展，视网膜色素上皮细胞(retinal pigmentepithelium,RPE)替代治疗成为了视网膜退行性疾病治疗的研究热点，国内外部分临床研究机构已开展临床试验。迄今已报道了多种细胞来源的RPE移植，主要有患者自体RPE细胞移植、胚胎RPE细胞移植，以及胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs、)诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs，)以及间充质干细胞来源的RPE细胞移植，这些细胞移植在动物实验中均显示出明确的治疗作用。目前国际上关于RPE移植的研究可以回答RPE移植治疗的安全性问题，并在一定程度揭示其有效性。但是仍存在许多亟待解决的问题，比如RPE细胞移植后移植细胞无法长久存活，移植疗效有待进一步加强等。
间充质干细胞长期的抗炎症、促增殖、抗凋亡作用使之成为多种疾病中细胞移植的经典细胞来源。近期在多种研究中表明MSC可被用于联合移植，且较单一移植有较好的疗效，如MSC和造血干细胞联合移植治疗再生障碍性贫血、MSC和神经干细胞联合移植治疗帕金森病及多发性硬化等。fRPE作为细胞移植来源具有无成瘤性、免疫源性低等优点。近年来我们研究团队在胎儿RPE细胞的体外大量扩增，移植细胞质量标准控制、GMP生产等方面取得了显著进步，并已培养获得符合GMP标准的胎儿来源的RPE细胞(已获得伦理委员会批准。)因此，本课题将MSC与胎儿RPE细胞联合移植至视网膜下腔，验证联合移植能够促进细胞存活并提高移植的长期疗效，为干性AMD等视网膜退行性疾病提供安全、长期、有效的细胞替代治疗。
发明内容
本发明的目的是根据现有技术的上述不足，提供视网膜色素上皮细胞与间充质干细胞在制备治疗视网膜退行性疾病的药物中的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
视网膜色素上皮细胞与间充质干细胞在制备治疗视网膜退行性疾病的药物中的应用。
作为本发明的一种优选，所述的视网膜退行性疾病为老年性黄斑变性。
作为本发明的一种优选，所述的视网膜色素上皮细胞为胎儿来源的视网膜色素上皮细胞。
一种治疗视网膜退行性疾病的组合物，其特征在于，包含视网膜色素上皮细胞与间充质干细胞。
作为本发明的一种优选，所述的视网膜色素上皮细胞为胎儿来源的视网膜色素上皮细胞。
有益效果：
本发明将胎儿来源的视网膜色素上皮细胞(fRPE)与间充质干细胞(MSC)共同移植治疗视网膜退行性疾病模型小鼠，比单纯的fRPE和单纯的MSC移植治疗，对视网膜损伤后修复功能效果更好。并且，本课题组的研究证明，胎儿来源的视网膜色素上皮细胞(fRPE)与间充质干细胞(MSC)共同移植比单纯一种细胞的移植，移植后存活的细胞数更多，光感受器细胞解救效果更强。并且，共同移植显著抑制了退行性疾病模型小鼠的炎症反应，并促进内源性生长因子的分泌。本课题组的研究为进一步提高干细胞治疗视网膜退行性疾病的疗效提供解决方案和新思路。
附图说明
图1.MSC与RPE联合移植组较单一移植组对小鼠视功能有显著改善作用。
A为每组代表性的ERG波形图，B表示移植后7、30、90天后各组a波波幅变化情况，C表示移植后7、30、90天后各组b波波幅变化情况。
图2.联合移植RPE+MSC比单独移植RPE视网膜厚度明显增多。移植30天后不同处理组的小鼠OCT图片，进行同一部位视网膜厚度定量分析。说明联合移植细胞可以改善碘酸钠损伤小鼠的视网膜结构。
图3.联合移植细胞可以改善碘酸钠损伤小鼠的视网膜结构。对不同组中视神经周围同一部位HE染色图片及视网膜各层厚度的定量分析，结果显示联合移植fRPE+MSC比单独移植fRPE视网膜厚度明显增多。
图4.联合移植可以增加移植细胞存活。通过免疫荧光染色分析，发现联合移植较单独移植，受体视网膜下腔Stem121表达阳性的移植细胞和Best1表达阳性的移植细胞更多。
图5.联合移植可减少光感受器细胞凋亡。
A:通过qPCR检测分析，发现联合移植后光感受器相关基因Crx和Rhodopsin表达量显著增高；B:通过qPCR检测分析，发现联合移植后细胞凋亡相关基因Casepase3减少。
图6.联合移植可减少炎症因子表达，增加生长因子表达
A：视网膜炎症标记物Iba1和F4/80的表达水平，B：内源性生长因子BDNF和NGF表达水平
具体实施方式
实施例1
成功建立碘酸钠损伤的干性AMD模型，并用ERG验证，小鼠尾静脉注射碘酸钠后，ERG a波及b波波幅明显降低。之后将细胞移植入碘酸钠损伤的小鼠模型视网膜下腔中，我们发现MSC与fRPE联合移植组较单一移植组对小鼠视功能有显著改善作用。ERG结果显示联合移植组的a波、b波较单独移植组明显增高(图1)。
为了观察细胞移植治疗前后干性AMD小鼠模型的视网膜结构，以验证细胞共移植引起的光感受器恢复效果，我们建立碘酸钠损伤的干性AMD模型，并将细胞移植入碘酸钠损伤的小鼠模型视网膜下腔中。移植后1个月，我们行眼部光学相干断层扫描(OCT)检查及视网膜切片苏木精-伊红(HE)染色。根据OCT的结果，视网膜厚度(从内界膜到RPE层)在碘酸钠处理组明显降低(图2)。HE染色显示碘酸钠处理后小鼠视网膜厚度减少,表现出不规则的光感受器外节形态,和中断的RPE层(图3c)。检测不同细胞移植组的视网膜外核层(ONL)、内核层(INL)和总视网膜厚度，观察不同细胞移植组对视网膜的形态学保护作用。同时，OCT结果显示，与碘酸钠造模组相比，各细胞移植组视网膜厚度明显增加。此外，fRPE+MSC共移植组的视网膜厚度明显优于fRPE细胞和MSC细胞单独移植组(P<0.01)(图2)。HE结果还显示,在所有细胞移植组，视网膜厚度均超过碘酸钠造模组(图3)。此外,和fRPE、间充质干细胞单独移植组相比，视网膜ONL层的拯救效果在fRPE与MSC细胞联合移植组更明显。移植1个月后，和对照组相比，fRPE与MSC细胞联合移植组以及fRPE细胞单独移植组的视网膜INL层厚度也显著恢复。
在细胞移植后30天使用免疫荧光技术阐明联合移植MSC细胞对移植的fRPE细胞的保护作用。作为移植细胞的标记物，使用人类特异性标记物STEM121染色(图4A)标记移植物，使用BEST1染色(图4B)区分fRPE细胞和MSC细胞。通过计算每只眼的平均STEM121阳性细胞数量，我们发现fRPE+MSC共移植组的STEM121阳性细胞数量明显高于fRPE单独移植组及间充质干细胞单独移植组(图4C)。为了检测移植的fRPE细胞在不同移植组中的存活情况，我们还计算了每只眼BEST1+细胞的平均数量。我们发现，fRPE+MSC联合移植组的BEST1+细胞数量明显高于fRPE移植组(图4D)。这些结果表明，联合移植能够促进移植存活，尤其是与fRPE细胞相关的移植存活。
移植后30天后对小鼠视网膜进行qPCR检测，验证不同细胞移植对光感受器细胞的拯救效果。结果显示，所有细胞移植组的杆状光受体标记物(Crx和rhodopsin)表达均高于碘酸钠造模组。此外，该标记物的表达水平在fRPE+MSC共移植组中显著高于fRPE和MSC移植组(图5A)。这些数据表明，与单细胞型移植组相比，fRPE+MSC共移植组具有更好的光感受器细胞保护效果。我们还通过qPCR检测视网膜caspase 3的相对表达水平，以阐明对细胞凋亡的缓解是否可以归因于细胞的保护作用。我们的结果表明，细胞移植，尤其是共移植组，可以逆转碘酸钠诱导Caspase 3表达的增加(图5B)。
由于小胶质细胞在视网膜功能障碍中起着至关重要的作用，我们通过qPCR分析了细胞移植后30天小胶质细胞/巨噬细胞因子Iba1和F4/80的表达水平。我们的数据显示，与碘酸钠造模组和fRPE移植组相比，fRPE+MSC细胞联合移植组中Iba1和F4/80因子的相对表达水平下降更多(图6A)。值得注意的是，与碘酸钠造模组相比，单一细胞型移植组Iba1相对表达量增加，这种作用可能与手术损伤有关，这可以通过在碘酸钠处理后增加注射PBS组代替细胞移植的实验组来验证。此外，我们通过qPCR检测内源性神经营养因子的表达水平，我们发现神经生长因子和脑源性神经生长因子在细胞移植后表达水平升高，尤其是在共移植组升高更明显。此外，联合细胞移植组神经生长因子表达水平明显高于fRPE单独移植组。

Claims (5)

1.视网膜色素上皮细胞与间充质干细胞在制备治疗视网膜退行性疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的视网膜退行性疾病为老年性黄斑变性。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的视网膜色素上皮细胞为胎儿来源的视网膜色素上皮细胞。
4.一种治疗视网膜退行性疾病的组合物，其特征在于，包含视网膜色素上皮细胞与间充质干细胞。
5.根据权利要求4所属的组合物，其特征在于，所述的视网膜色素上皮细胞为胎儿来源的视网膜色素上皮细胞。
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