JPWO2007001021A1 - 酵素活性の測定方法 - Google Patents

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Abstract

新規な修飾多糖、当該多糖が固着された固相、当該固相を利用した検体中のＮ−デアセチラーゼ活性、Ｎ−スルホトランスフェラーゼ活性及びＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ活性の検出方法並びにこれらの検出キット。

Description

本発明は、新規な修飾多糖、当該多糖が固着された固相、当該固相を利用した検体中のＮ−デアセチラーゼ活性、Ｎ−スルホトランスフェラーゼ活性及びＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ活性の検出方法並びにこれらの検出キットに関する。
本出願書類中で使用する略号は以下の通りである。
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）
ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）
ＧｌｃＡ：グルクロン酸（ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）
ＧｌｃＮ：グルコサミン（ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）
ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）
ＨＥＰＥＳ：２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸（２−［４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）
ＨＰ：ヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）
ＨＲＰ：ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）
ＨＳ：ヘパラン硫酸（ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ）
ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ）
ＭＥＳ：２−モルホリノエタンスルホン酸（２−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）
ＮＡＨ：Ｎ−アセチルヘパロサン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ ｈｅｐａｒｏｓａｎ）
ＮＤ：Ｎ−デアセチラーゼ（Ｎ−ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ）
ＮＤＳＴ：Ｎ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ（Ｎ−ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ／Ｎ−ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）
ＰＡＰＳ：５’−ホスホアデノシン ３’−ホスホリン酸（５’−ｐｈｏｓｐｈｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ ３’−ｐｈｏｓｐｈｏｓｕｌｆａｔｅ）
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）
ＰＤＰ：２−ピリジルジスルフィドプロピオニル（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｓｕｌｆｉｄｅｐｒｏｐｉｏｎｙｌ）
ＲＩＡ：ラジオイムノアッセイ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）
ＳＰＤＰ：Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）
ＳＳ結合：ジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）
ＳＴ：Ｎ−スルホトランスフェラーゼ（Ｎ−ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）
ＴＢＳ：トリス塩酸緩衝生理食塩液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）
ＴＭＢ：３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）
ＮＤＳＴは、ＨＰやＨＳの合成に関与する酵素であり、ＮＤ活性とＳＴ活性を併せ持つ酵素である。ＮＤＳＴには４種類のバリアント（ＮＤＳＴ１、ＮＤＳＴ２、ＮＤＳＴ３、ＮＤＳＴ４）が存在し、その基質特異性等が各々異なることが報告されている。例えば、ＮＤＳＴ３のＮＤ活性は高くＳＴ活性は低い。一方でＮＤＳＴ４のＮＤ活性は弱くＳＴ活性は極めて高い（非特許文献１）。
ＮＤＳＴ１ノックアウトマウスは新生児致死性であることが報告されている。一方、ＮＤＳＴ２ノックアウトマウスでは致死性を示さないが、肥満細胞内での顆粒の減少、ＨＰ負電荷の減少、ヒスタミン含量が１／１７０に減少するなどの変化が報告されている（非特許文献２〜８）。したがって、ＮＤＳＴがこのような生体内での現象に起因する疾患に関与している可能性がある。
ＮＤＳＴの活性測定方法としては、ラジオアイソトープで標識した基質を用いる測定方法が知られている。この方法によれば、ＧｌｃＮＡｃ残基におけるアセチル基がラジオアイソトープ（３Ｈ）で標識されたＮＡＨ（基質）を用いて、酵素作用により当該ＮＡＨより遊離したＣＨＣ３ＯＯ３Ｈ量を測定することでＮＤＳＴにおけるＮＤ活性を測定し、また、ラジオアイソトープ（３５Ｓ）で標識されたＰＡＰＳとＮ−脱硫酸化ＨＰまたはＮ−脱硫酸化ＨＳを用い、酵素作用によって取り込まれた当該多糖のＮ−硫酸量（３５Ｓ）を測定することでＮＤＳＴのＳＴ活性を測定する（非特許文献１、１２〜１５、特許文献１）。
またラジオアイソトープを使用しないＮＤＳＴの活性測定方法も知られているが、モノクローナル抗体ＪＭ４０３（非特許文献９〜１０）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法と反応生成物のヘパリナーゼ消化物を用いたＨＰＬＣ法が報告されているのみである。
前者の測定方法はＮＤにより生成した脱Ｎ−アセチル部位と抗体ＪＭ４０３とが反応することを利用した方法であるが、サンドイッチ法であるため少なくとも２つ以上のエピトープを必要とする。また、この方法ではＳＴ活性を検出することができない（非特許文献１１）。
後者の測定方法は、ＮＤ活性及びＳＴ活性によって生成した脱Ｎ−アセチル化ＮＡＨ及びＮ−硫酸化ＮＡＨをヘパリナーゼ消化することによって得られる不飽和二糖を、非特許文献１６に記載の「２・８グリコサミノグリカン分解酵素とＨＰＬＣを組み合わせた構造解析」などを用いて脱Ｎ−アセチル化度やＮ−硫酸化度を算出する方法であるが、クロマトグラフィーやスクリーニングなど多検体の活性を測定する方法には適さない（特許文献２、非特許文献１７）。
ＮＤ、ＳＴ及びＮＤＳＴの活性を簡便、迅速、高感度、高精度かつ安価に測定することができれば、このような酵素が関与する疾患やそのリスクの検知、病態把握等を容易に行うことができるのみならず、当該酵素の活性に変化を与える物質（阻害剤や賦活化剤など）のスクリーニング等も効率的に行うことができる。
米国特許出願公開第２００３／０１０９５０１号明細書 米国特許出願公開第２００４／００４３４４７号明細書 アイカワ、Ｊ（Ａｉｋａｗａ，Ｊ．）ら、２００１年、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２７６巻、第８号、ｐ．５８７６−５８８２ ハンフリーズ、ＤＥ（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｄ．Ｅ．）ら、１９９９年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第４００巻、ｐ．７６９−７７２ フォースバーグ、Ｅ（Ｆｏｒｓｂｅｒｇ，Ｅ．）ら、１９９９年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第４００巻、ｐ．７７３−７７６ リンギバル、Ｍ（Ｒｉｎｇｉｖａｌｌ，Ｍ．）ら、２０００年、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２７５巻、第３４号、ｐ．２５９２６−２５９３０ ピカス、ＤＳ（Ｐｉｋａｓ，Ｄ．Ｅ．）ら、２０００年、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第３９巻、ｐ．４５５２−４５５８ フクダ、Ｍ（Ｆｕｋｕｄａ，Ｍ．）ら、２００１年、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２７６巻、第５１号、ｐ．４７７４７−４７７５０ エスコ、ＪＤ（Ｅｓｋｏ，Ｊ．Ｄ．）ら、２００１年、ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲーション（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）、第１０８巻、ｐ．１６９−１７３ フォースバーグ、Ｅ（Ｆｏｒｓｂｅｒｇ，Ｅ．）ら、２００１年、ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲーション（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）、第１０８巻、ｐ．１７５−１８０ バンデンボーン、Ｊ（ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｏｒｎ，Ｊ）ら、１９９２年、キドニー インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、第４１巻、ｐ．１１５−１２３ バンデンボーン、Ｊ（ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｏｒｎ，Ｊ）ら、１９９５年、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２７０巻、第５２号、ｐ．３１３０３−３１３０９ バンデンボーン、Ｊ（ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｏｒｎ，Ｊ）ら、２００３年、グライコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第１３巻、第１号、ｐ．１−１０ ブランダン、Ｅ（Ｂｒａｎｄａｎ，Ｅ．）ら、１９８８年、ジャーナル オブバイオロジカル ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２６３巻、第５号、ｐ．２４１７−２４２２ ベイメ、ＫＪ（Ｂａｍｅ，Ｋ．Ｊ．）ら、１９９１年、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２６６巻、第１６号、ｐ．１０２８７−１０２９３ ベイメ、ＫＪ（Ｂａｍｅ，Ｋ．Ｊ．）ら、１９９１年、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２６６巻、第１９号、ｐ．１２４６１−１２４６８ ベルダゴ、ＤＥ（Ｖｅｒｄｕｇｏ，Ｄ．Ｅ．）ら、２００２年、アナリティカル バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第３０７巻、ｐ．３３０−３３６ 新生化学実験講座３、糖質ＩＩ（東京化学同人刊、１９９１年）ｐ４９−６２ サリバス、ＡＳ（Ｓａｒｉｂａｓ，Ａ．Ｓ．）ら、２００４年、グライコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第１４巻、第１２号、ｐ．１２１７−１２２８
本発明は、ＨＰ／ＨＳの生合成に関与する酵素群、特に、ＮＤ、ＳＴ及びＮＤＳＴの活性を簡便、迅速、高感度、高精度かつ安価に測定することができる方法及びキット並びにこれらの酵素の活性を変化させる物質のスクリーニング方法等を提供することを課題とする。
本発明の発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＮＡＨ又はその誘導体に特定の物質が結合した修飾多糖を新たに製造し、これを用いたところＮＤ、ＳＴ及びＮＤＳＴの活性を簡便、迅速、高感度、高精度かつ安価に測定できることを見出した。そしてこれに基づいて、ＮＤ、ＳＴ及びＮＤＳＴの活性を簡便、迅速、高感度、高精度かつ安価に測定することができる方法及びキット並びにこれらの酵素の活性を変化させる物質のスクリーニング方法を提供するに至り、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、下記の群から選択される物質が、ＮＡＨ又はその誘導体に結合していることを特徴とする、修飾多糖（以下、「本発明多糖」という。）を提供する。（群）蛋白質、ビオチン、抗原物質
この結合は、前記の物質とＮＡＨ又はその誘導体の還元末端との間に形成されているものが好ましい。またこのうち蛋白質との結合は、共有結合又はアフィニティー結合であるものが好ましい。この共有結合はＳＳ結合又はアミド結合であるものが好ましく、このアフィニティー結合はビオチン・アビジン結合であるものが好ましい。また、この蛋白質は分子量１．５万〜２０万の可溶性の蛋白質であるものが好ましい。この「分子量１．５万〜２０万の可溶性の蛋白質」は、免疫グロブリン、アビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、アルブミン又はカゼインであるものが好ましい。このアルブミンは、血清アルブミン又は卵白アルブミンであるものが好ましい。またＮＡＨの誘導体は、下記（１）〜（３）からなる群から選ばれる物質であるものが好ましい。
（１）Ｎ−脱硫酸化ＨＰ又はＮ−脱硫酸化／Ｎ−アセチル化ＨＰ
（２）Ｎ−脱硫酸化ＨＳ又はＮ−脱硫酸化／Ｎ−アセチル化ＨＳ
（３）脱Ｎ−アセチル化ＮＡＨ
また本発明は、本発明多糖が固着された固相（以下、「本発明固相」という。）を提供する。
また本発明は、下記ステップ（ａ）及び（ｂ）を少なくとも含む、検体中のＮＤ活性の検出方法（以下、「本発明ＮＤ検出方法」という。）を提供する。
ステップ（ａ）：本発明固相に、検体を接触させるステップ
ステップ（ｂ）：前記固相に固着された本発明多糖における、脱Ｎ−アセチル化を検出するステップ。
この脱Ｎ−アセチル化の検出は、本発明固相に「ＮＡＨ又はその誘導体におけるＧｌｃＮ残基（すなわち、脱Ｎ−アセチル化されたＧｌｃＮＡｃ残基）に結合する蛋白質」を接触させることにより行われることが好ましい。また、ＮＡＨ又はその誘導体におけるＧｌｃＮ残基に結合する「蛋白質」は、抗体であることが好ましい。また、ＮＡＨ又はその誘導体におけるＧｌｃＮ残基に結合する抗体は、モノクローナル抗体ＪＭ４０３であることが好ましい。
また本発明は、下記の構成成分（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含む、検体中のＮＤ活性の検出キット（以下、「本発明ＮＤ検出キットという。）を提供する。
（Ａ）本発明多糖
（Ｂ）ＮＡＨ又はその誘導体におけるＧｌｃＮ残基（すなわち、脱Ｎ−アセチル化されたＧｌｃＮＡｃ残基）に結合する蛋白質
この本発明多糖は、固相に固着されているものが好ましい。また、ＮＡＨ又はその誘導体におけるＧｌｃＮ残基に結合する「蛋白質」は、抗体であることが好ましい。また、ＮＡＨ又はその誘導体におけるＧｌｃＮ残基に結合する抗体は、モノクローナル抗体ＪＭ４０３であることが好ましい。
また本発明は、下記ステップ（ｃ）及び（ｄ）を少なくとも含む、検体中のＳＴ活性の検出方法（以下、「本発明ＳＴ検出方法」という。）を提供する。
ステップ（ｃ）：本発明固相に、検体と硫酸基供与体とを接触させるステップ。
ステップ（ｄ）：前記固相に固着された本発明多糖における、Ｎ−硫酸化を検出するステップ。
このＮ−硫酸化の検出は、本発明固相に「ＮＡＨ又はその誘導体におけるＮ−硫酸化されているＧｌｃＮ残基に結合する蛋白質」を接触させることにより行われることが好ましい。また、ＮＡＨ又はその誘導体におけるＮ−硫酸化されているＧｌｃＮ残基に結合する「蛋白質」は、抗体であることが好ましい。また、ＮＡＨ又はその誘導体におけるＮ−硫酸化されているＧｌｃＮ残基に結合する抗体は、モノクローナル抗体Ｆ５８−１０Ｅ４又はモノクローナル抗体ＨｅｐＳＳ−１であることが好ましい。なかでも、モノクローナル抗体Ｆ５８−１０Ｅ４を好ましく用いることができる。
また本発明は、下記の構成成分（Ａ）及び（Ｃ）を少なくとも含む、検体中のＳＴ活性の検出キット（以下、「本発明ＳＴ検出キットという。）を提供する。
（Ａ）本発明多糖
（Ｃ）ＮＡＨ又はその誘導体におけるＮ−硫酸化されているＧｌｃＮ残基に結合する蛋白質
この本発明多糖は、固相に固着されているものが好ましい。また、ＮＡＨ又はその誘導体におけるＮ−硫酸化されているＧｌｃＮ残基に結合する「蛋白質」は、抗体であることが好ましい。また、ＮＡＨ又はその誘導体におけるＮ−硫酸化されているＧｌｃＮ残基に結合する抗体は、モノクローナル抗体Ｆ５８−１０Ｅ４又はモノクローナル抗体ＨｅｐＳＳ−１であることが好ましい。なかでも、モノクローナル抗体Ｆ５８−１０Ｅ４を好ましく用いることができる。
また本発明は、本発明ＮＤ検出方法によって検体中のＮＤ活性を検出し、かつ、本発明ＳＴ検出方法によって検体中のＳＴ活性を検出することを特徴とする、検体中のＮＤＳＴ活性の検出方法（以下、「本発明ＮＤＳＴ検出方法」という。）を提供する。
また本発明は、下記の構成成分（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を少なくとも含む、検体中のＮＤＳＴ活性の検出キット（以下、「本発明ＮＤＳＴ検出キット」という。）を提供する。
（Ａ）本発明多糖
（Ｂ）ＮＡＨ又はその誘導体におけるＧｌｃＮ残基（すなわち、脱Ｎ−アセチル化されたＧｌｃＮＡｃ残基）に結合する蛋白質
（Ｃ）ＮＡＨ又はその誘導体におけるＮ−硫酸化されているＧｌｃＮ残基に結合する蛋白質
この本発明多糖は、固相に固着されているものが好ましい。また、ＮＡＨ又はその誘導体におけるＧｌｃＮ残基に結合する「蛋白質」は、抗体であることが好ましい。また、ＮＡＨ又はその誘導体におけるＧｌｃＮ残基に結合する抗体は、モノクローナル抗体ＪＭ４０３であることが好ましい。
また、ＮＡＨ又はその誘導体におけるＮ−硫酸化されているＧｌｃＮ残基に結合する「蛋白質」は、抗体であることが好ましい。また、ＮＡＨ又はその誘導体におけるＮ−硫酸化されているＧｌｃＮ残基に結合する抗体は、モノクローナル抗体Ｆ５８−１０Ｅ４又はモノクローナル抗体ＨｅｐＳＳ−１であることが好ましい。なかでも、モノクローナル抗体Ｆ５８−１０Ｅ４を好ましく用いることができる。
また本発明は、下記ステップ（ｅ）〜（ｇ）を少なくとも含む、下記の酵素群から選択される１又は２以上の酵素の活性を変化させる物質のスクリーニング方法（以下、「本発明スクリーニング方法」という。）を提供する。
ステップ（ｅ）：下記の酵素群から選択される１又は２以上の酵素の活性を変化させる可能性のある試験物質を、当該酵素と共存させるステップ。
ステップ（ｆ）：ステップ（ｅ）により得られる「前記試験物質と前記酵素との共存物」を検体とし、本発明ＮＤ検出方法、本発明ＳＴ検出方法及び本発明ＮＤＳＴ検出方法のいずれかの方法によって、前記酵素の活性を検出するステップ。
ステップ（ｇ）：ステップ（ｆ）により検出された酵素の活性と、ステップ（ｅ）で用いた酵素を検体としてステップ（ｆ）と同一の方法によって検出される酵素の活性とを比較して、下記の酵素群から選択される１又は２以上の酵素の活性を変化させる試験物質を選択するステップ。
（酵素群）ＮＤ、ＳＴ、ＮＤＳＴ
本発明多糖は、本発明固相の素材とすることができ極めて有用である。本発明固相は、本発明の各種検出方法や各種検出キットに用いることができ、極めて有用である。本発明ＮＤ検出方法、本発明ＳＴ検出方法及び本発明ＮＤＳＴ検出方法は、いずれも簡便、迅速、特異的、高感度、高精度かつ安価にＮＤ活性、ＳＴ活性又はＮＤＳＴ活性を定量性・再現性よく検出することができ、極めて有用である。また本発明ＮＤ検出キット、本発明ＳＴ検出キット及び本発明ＮＤＳＴ検出キットは、いずれも前記の検出方法の実施をさらに簡便かつ迅速なものとすることから、極めて有用である。また本発明スクリーニング方法は、ＮＤ、ＳＴ又はＮＤＳＴの活性を変化させる物質を、簡便、迅速、高感度、高精度かつ安価にスクリーニングすることができ、極めて有用である。さらに本発明は、ＮＤＳＴ等の酵素活性の異常に起因する疾患の検知やそのリスクの検知、病態把握等にも活用しうるものであり、極めて有用である。
ＮＡＨ−ＳＳ−ＢＳＡ固相化プレートを用いた場合における、ＮＤ活性の用量依存性を示す図である。 ＮＡＨ−ＣＯＯＨ−ＢＳＡ固相化プレートを用いた場合における、ＮＤ活性の用量依存性を示す図である。 ＮＡＨ−ＳＳ−ＢＳＡ固相化プレートを用いた場合における、ＮＤ活性の反応時間依存性を示す図である。 ＮＡＨ−ＳＳ−ＢＳＡ固相化プレートを用いた場合における、ＳＴ活性（ＮＤＳＴ活性）の用量依存性及びＰＡＰＳ依存性を示す図である。 ＮＡＨ−ＳＳ−ＢＳＡ固相化プレートを用いた場合における、ＳＴ活性（ＮＤＳＴ活性）の反応時間依存性及び熱処理による影響を示す。 「ＮＡＨ−ビオチンがアビジンを介して固着されたプレート」を用いた、ＮＤ活性の用量依存性を示す図である。 「ＮＡＨ−ビオチンがアビジンを介して固着されたプレート」を用いたＮＤ活性の測定における、ｐＨの影響を示す図である。 「ＮＡＨ−ビオチンがアビジンを介して固着されたプレート」を用いた、ＮＤ活性の阻害剤のスクリーニングの結果を示す図である。 サンドイッチＥＬＩＳＡを用いた、ＮＤ活性の検出結果を示す図である。
以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。
＜１＞本発明多糖
本発明多糖は、下記の群から選択される物質が、ＮＡＨ又はその誘導体に結合していることを特徴とする、修飾多糖である。
（群）蛋白質、ビオチン、抗原物質
ここにいう「蛋白質」は特に限定されないが、分子量１．５万〜２０万の可溶性の蛋白質であることが好ましく、分子量１．５万〜１０万の可溶性蛋白質であることがより好ましく、分子量１．５万〜７万の可溶性蛋白質であることがより好ましい。ここで、「可溶性」とは、蛋白質が室温において水、生理的塩類溶液（生理食塩水など）、緩衝液等の水性溶媒に溶解可能であることを意味する。分子量１．５万〜２０万の可溶性の蛋白質としては、免疫グロブリン、アビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、アルブミン又はカゼインを例示することができる。また分子量１．５万〜１０万や分子量１．５万〜７万の可溶性蛋白質としては、アビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、アルブミン又はカゼインを例示することができる。なかでも、アルブミン又はカゼインが好ましい。
この「アルブミン」としては、血清アルブミン又は卵白アルブミンを例示することができる。
また、ここにいう「ＮＡＨ」は、当技術分野においてＮＡＨであると認識されるものである限りにおいて特に限定されない。ＮＡＨは、ＧｌｃＡ残基とＧｌｃＮＡｃ残基とが交互にグリコシド結合した糖鎖である。ＧｌｃＡ残基とＧｌｃＮＡｃ残基との間の結合はβ１，４グリコシド結合であり、ＧｌｃＮＡｃ残基とＧｌｃＡ残基との間の結合はα１，４グリコシド結合である。ＮＡＨの一般式としては、以下の（１）又は（２）で表すことができる。
（４ＧｌｃＡβ１−４ＧｌｃＮＡｃα１）ｎ （１）
（４ＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＡβ１）ｎ （２）
（式中、ｎは任意の整数を示す。）
本発明多糖の原料とするＮＡＨは、公知のものを用いることができる。その由来も特に限定されず、例えば天然物由来のものでも、酵素学的に又は化学的に合成したものであってもよい。天然物由来のものとしては、ＮＡＨを産生するバクテリア由来のものを例示することができる。このようなバクテリアとしてはある種の大腸菌やパスツレラ属細菌が上げられる。具体的には、例えば、大腸菌Ｋ５株やパスツレラ マルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｓｉｄａ）を例示することができる。ＮＡＨは、例えば特開２００４−１８８４０号公報に記載の方法で製造することができる。
また、本出願書類において「ＮＡＨの誘導体」とは、ＮＡＨの糖鎖骨格は維持しつつ、さらに他の官能基を保持していたり、逆にＮＡＨの糖鎖骨格において本来保持されているべき官能基が失われているものなど、何らかの修飾がなされているものすべてを意味する。したがって、ＮＡＨに硫酸基が保持されているもの、ＮＡＨからアセチル基が脱離したもの、ウロン酸がエピ異性体となっているものなどは、いずれも「ＮＡＨの誘導体」の概念に包含されるが、これらに限定されるものではない。また本出願書類における「ＮＡＨの誘導体」の用語は、ＮＡＨを原材料としてこれを修飾することにより得られるものはもちろん、ＮＡＨを原材料としないで得られるものも含む概念である。
「ＮＡＨの誘導体」としては、なかでも下記（１）〜（３）からなる群から選ばれる物質が好ましい。
（１）Ｎ−脱硫酸化ＨＰ又はＮ−脱硫酸化／Ｎ−アセチル化ＨＰ
（２）Ｎ−脱硫酸化ＨＳ又はＮ−脱硫酸化／Ｎ−アセチル化ＨＳ
（３）脱Ｎ−アセチル化ＮＡＨ
ここで「Ｎ−脱硫酸化ＨＰ」とは、ＨＰにおけるＧｌｃＮ残基の２位アミノ基に結合した硫酸基が脱硫酸化されたＨＰをいい、「Ｎ−脱硫酸化／Ｎ−アセチル化ＨＰ」とは、ＨＰにおけるＧｌｃＮ残基の２位アミノ基に結合した硫酸基が脱硫酸化された後、ＧｌｃＮ残基の２位アミノ基がアセチル化されたＨＰをいう。また「Ｎ−脱硫酸化ＨＳ」とは、ＨＳにおけるＧｌｃＮ残基の２位アミノ基に結合した硫酸基が脱硫酸化されたＨＳをいい、「Ｎ−脱硫酸化／Ｎ−アセチル化ＨＳ」とは、ＨＳにおけるＧｌｃＮ残基の２位アミノ基に結合した硫酸基が脱硫酸化された後、ＧｌｃＮ残基の２位アミノ基がアセチル化されたＨＳをいう。また「脱Ｎ−アセチル化ＮＡＨ」とは、ＮＡＨにおけるＧｌｃＮＡｃ残基が脱Ｎ−アセチル化されたＮＡＨをいう。Ｎ−脱硫酸化ＨＰ、Ｎ−脱硫酸化ＨＳ、Ｎ−脱硫酸化／Ｎ−アセチル化ＨＰ及びＮ−脱硫酸化／Ｎ−アセチル化ＨＳは、ＨＰやＨＳを原料として、特開２００３−１１３０９０号公報に記載された方法に従って製造することができる。また「脱Ｎ−アセチル化ＮＡＨ」は、ＮＡＨを原料として、Ｌｅａｌｉ，Ｄ．らの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，４１，３７９００−３７９０８（２００１））あるいは、Ｓｈａｋｌｅｅ，Ｐ．Ｋ．らの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２１７，１８７−４９７（１９８４））などに従って化学的に製造することができる。また、Ａｉｋａｗａ，Ｊ．らの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４（５），２６９０−２６９５（１９９９））などに従って調製したヒトＮＤＳＴをＮＡＨに作用させて酵素的に製造することもできる。
本発明多糖の原料とすることができるＮＡＨ又はその誘導体の重量平均分子量も特に限定されず、硫酸基やアセチル基等の有無、他の化合物の付加の有無等によっても変動しうるが、例えば、硫酸基等や他の化合物の付加による影響を排除して純粋にＮＡＨ糖鎖のみの重量平均分子量として換算した場合には、１，５００〜５０万のものが好ましく、４，０００〜２０万のものがより好ましく、１万〜２０万のものがより好ましく、２万〜１５万のものがより好ましく、２万〜１０万のものがより好ましく、２万〜８万のものがさらに好ましい。
本発明多糖は、前記の群から選択される物質が、このようなＮＡＨ又はその誘導体に結合していることを特徴とする。ここにいう「結合」の様式は、前記の群から選択される物質とＮＡＨ又はその誘導体とが水溶液中においても解離しない強度以上の強度を有する結合である限りにおいて特に限定されない。このような結合としては、例えば、２個の原子がいくつかの電子を共有してつくる共有結合や、２個の分子間における親和性により形成されるアフィニティー結合等を例示することができる。前記の群から選択される物質が蛋白質である場合、共有結合としては、ＳＳ結合、アミノアルキル結合、アミド結合等が例示される。また前記の群から選択される物質が蛋白質である場合、アフィニティー結合としては、ビオチン・アビジン結合（ビオチンとアビジンとの間の結合）を例示することができる。なお、本出願書類における「アビジン」の用語には、ストレプトアビジンも当然に包含される。
このような結合を形成させる方法は、公知の方法を採用することができる。
また、前記の群から選択される物質がビオチンである場合には、例えばＮＡＨ又はその誘導体を原料とし、Ｏｓｍｏｎｄ，Ｒ．Ｉ．Ｗ．らの方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１０，１９９−２０７（２００２））に従って、ＮＡＨ又はその誘導体のビオチン化誘導体を製造することができる。この方法によれば、ＮＡＨ又はその誘導体の還元末端にビオチンを共有結合させることができる。
また、前記の群から選択される物質が抗原物質である場合には、その抗原物質の種類に応じて、ＮＡＨ又はその誘導体との結合のさせ方を選択することができる。例えば抗原物質がペプチドである場合には、前述の蛋白質を結合させる方法と同じ方法を採用することができる。なお、本出願書類において「抗原物質」とは、これを免疫原としたときにこれに対する抗体が産生される物質（抗原となる物質）を意味する。
本発明多糖は、所望の構造のＮＡＨ又はその誘導体を製造した後、これを前記の群から選択される物質と結合させることによって製造しても良く、また所望のＮＡＨ又はその誘導体の原料となる多糖を予め前記の群から選択される物質と結合させ、その後、その糖鎖部分を前述の各種糖鎖修飾法等によって所望の構造となるよう改変して製造しても良い。
また、このような本発明多糖をさらに別の物質と結合させても良い。例えば、ＮＡＨ又はその誘導体に免疫グロブリンが結合している本発明多糖について、当該免疫グロブリン部分を介してプロテインＡやプロテインＧに結合させてもよく、ＮＡＨ又はその誘導体にプロテインＡやプロテインＧが結合している本発明多糖について、当該プロテインＡ又はプロテインＧ部分を介して免疫グロブリンに結合させてもよい。また、ＮＡＨ又はその誘導体にアビジンが結合している本発明多糖について、当該アビジン部分を介してビオチンに結合させてもよく、ＮＡＨ又はその誘導体にビオチンが結合している本発明多糖について、当該ビオチン部分を介してアビジンに結合させてもよい。また、ＮＡＨ又はその誘導体に抗原物質が結合している本発明多糖について、当該抗原物質部分を介してこれに対する抗体に結合させてもよく、ＮＡＨ又はその誘導体に抗体が結合している本発明多糖について、当該抗体部分を介してこれに対する抗原物質に結合させてもよい。このようにして得られる物質も、本発明多糖に包含される。
前記のような共有結合を形成させる方法は、公知の方法を採用することができる。以下に、蛋白質とＮＡＨとを共有結合させる方法についてその一例を示すが、これらに限定されるものではない。
例示（１）：シアノ水素化ホウ素ナトリウム等を用いて還元アミノ化したＮＡＨに、ＳＰＤＰを添加してＰＤＰ化ＮＡＨを得、これにジチオスレイトール等を添加してＳＨ−ＮＡＨを得る。一方、蛋白質にＳＰＤＰを添加してＰＤＰ化蛋白質を得る。次いで、両者を接触させてコンジュゲーション反応（ＳＨ−ＮＡＨが還元剤となってＰＤＰ化蛋白質を還元する際、両者が結合する。）を行うことにより、蛋白質をＮＡＨの還元末端に共有結合させる方法。これにより生じる共有結合は、ＳＳ結合である。
例示（２）：「シアノ水素化ホウ素ナトリウム等を用いて還元アミノ化したＮＡＨ」と蛋白質にＥＤＣを添加し、コンジュゲーション反応（ＥＤＣが活性化剤として作用して両者が結合する。）を行うことにより、蛋白質のカルボキシル基とＮＡＨの還元末端に導入されたアミノ基とを共有結合させる方法。これにより生じる共有結合は、アミド結合である。
例示（３）：ＮＡＨの還元末端のホルミル基と蛋白質のアミノ基とを反応させてシッフ塩基を形成後、トリメチルアミンボラン等の還元剤を用いて還元し、共有結合させる方法。これにより形成される共有結合は、アミノアルキル結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）である。
例示（４）：ＮＡＨの還元末端を還元した後、過ヨウ素酸酸化して遊離ホルミル基を導入し、これと蛋白質のアミノ基とを反応させてシッフ塩基を形成後、トリメチルアミンボラン等の還元剤を用いて還元し、共有結合させる方法。これにより形成される共有結合は、アミノアルキル結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）である。
例示（５）：ＮＡＨと蛋白質のアミノ基とをベンゾキノン等を用いて共有結合させる方法。
また前記のようなアフィニティー結合を形成させる方法も、公知の方法を採用することができる。以下に、蛋白質とＮＡＨとをアフィニティー結合させる方法についてその一例を示すが、これらに限定されるものではない。
例示（６）：シアノ水素化ホウ素ナトリウム等を用いて還元アミノ化することによってＮＡＨの還元末端に生じたアミノ基部位又はＮＡＨのカルボキシル基部位にビオチンを結合させる。一方、蛋白質にアビジンを結合させ、両者を接触させることによりアフィニティー結合（ビオチン・アビジン結合）させる方法。
例示（７）：ＮＡＨを例示（１）から例示（５）のいずれかの方法でアビジンと結合させる方法。また必要に応じてさらに、アミノ基又はカルボキシル基に対して特異的に結合するビオチン誘導体（ピアス社）を蛋白質と反応させることによって、蛋白質のアミノ基又はカルボキシル基部位にビオチンを結合させ、次いで、これをアビジンが結合したＮＡＨと接触させることによりアフィニティー結合（ビオチン・アビジン結合）させる方法。
例示（８）：ＮＡＨを例示（１）から例示（５）のいずれかの方法で各種抗原物質（例えば、抗原性ペプチド（例えばワクチン）等）と結合させる。次いで、これとこの抗原物質に対する抗体とを接触させることによりアフィニティー結合（抗原・抗体結合）させる方法。
例示（９）：ＮＡＨを例示（１）から例示（５）のいずれかの方法で各種抗体（例えば、抗ＢＳＡ抗体等）と結合させる。また必要に応じてさらにこれとこの抗体に対する抗原蛋白質とを接触させることによりアフィニティー結合（抗原・抗体結合）させる方法。
例示（１０）：ＮＡＨを例示（１）から例示（５）のいずれかの方法でプロテインＡ（又はプロテインＧ）と結合させる。また必要に応じてさらにこれと免疫グロブリン（ＩｇＧ等）とを接触させることによりアフィニティー結合（プロテインＡ（又はプロテインＧ）・免疫グロブリン結合）させる方法。
例示（１１）：ＮＡＨを例示（１）から例示（５）のいずれかの方法で免疫グロブリン（ＩｇＧ等）と結合させる。また必要に応じてさらにこれとプロテインＡ（プロテインＧ）とを接触させることによりアフィニティー結合（プロテインＡ（又はプロテインＧ）・免疫グロブリン結合）させる方法。
また本発明多糖における「結合」は、前記の群から選択される物質と、ＮＡＨ又はその誘導体の還元末端との間に形成されていることが好ましい。
このような方法等で前記の群から選択される物質とＮＡＨ又はその誘導体とを結合させることにより、前記の群から選択される物質がＮＡＨ又はその誘導体に結合していることを特徴とする修飾多糖（本発明多糖）を製造することができる。
＜２＞本発明固相
本発明固相は、本発明多糖が固着された固相である。本発明多糖については、前記で説明した通りである。
本発明多糖が固着される固相は、本発明多糖を固着させることができ、かつ、水、検体や反応液に不溶性である限りにおいて特に限定されない。固相の形状としては、プレート（例えばマイクロプレートのウェル等）、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル、微粒子状固相担体（ゼラチン粒子、カオリン粒子、ラテックス等の合成ポリマー粒子等）等を例示することができる。なかでも、正確な定量性と使用上の簡便性の点から、マイクロプレートが望ましい。
固相の材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ニトロセルロース、ナイロン、ポリアクリルアミド、ポリアロマー、ポリエチレン、ガラス、アガロース等が例示される。これらの中でも、ポリスチレンを材質としたプレートが好ましい。
このような固相の表面に本発明多糖を固着させる方法としては、物理的吸着法、アフィニティー結合法、共有結合法、包括法などの一般的な方法（例えば、固定化酵素、１９７５年、講談社発行、第９〜７５頁参照）を応用することができる。
これらの中でも、物理的吸着法が、操作が簡便かつ頻用されていることから好ましい。
また、前記の群から選択される物質（本発明多糖の分子に含有されている）とアフィニティーを有する物質を固相に固着させておき、これを介して本発明多糖を固相に固着させても良い。例えば本発明多糖において免疫グロブリンが結合している場合には固相に固着されたプロテインＡ（又はプロテインＧ）を介して、本発明多糖においてプロテインＡ（又はプロテインＧ）が結合している場合には固相に固着された免疫グロブリンを介して、本発明多糖においてアビジンが結合している場合には固相に固着されたビオチンを介して、本発明多糖においてビオチンが結合している場合には固相に固着されたアビジンを介して、本発明多糖において抗原物質が結合している場合には固相に固着された当該抗原物質に対する抗体を介して、本発明多糖に抗体が結合している場合には固相に固着された抗原物質（当該抗体の抗原）を介して、それぞれ本発明多糖を固相に固着させることもできる。
本発明多糖や「前記の群から選択される物質とアフィニティーを有する物質」の固相への物理的吸着の具体的方法の一例として、例えば、本発明多糖や「前記の群から選択される物質とアフィニティーを有する物質」の緩衝液溶液（ｐＨ７〜９程度の緩衝液（例えばリン酸緩衝液、ＰＢＳ、炭酸緩衝液等））を固相に接触させて０℃〜１０℃程度、好ましくは０℃〜５℃程度で、６時間〜２４時間程度、好ましくは１０時間〜２０時間程度静置する方法が例示される。「前記の群から選択される物質とアフィニティーを有する物質」を固相に接触させた場合には、その後、本発明多糖を加えて当該物質とアフィニティー結合させる。これにより、本発明多糖が固着された本発明固相を得ることができる。
また必要に応じて、この後に固相の表面を洗浄液で洗浄してもよい。この洗浄は、固相に固着している本発明多糖が解離しない条件で行われる限りにおいて特に限定されない。洗浄液としては緩衝液（例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＰＢＳ等）等を用いることができる。
また必要に応じて、この後にブロッキング物質を固相に接触させて、本発明多糖が固着していない部分を被覆しておくことが好ましい。このようなブロッキング物質としては、ＢＳＡ、ゼラチン、カゼイン、スキムミルク、ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ（商品名；生化学工業株式会社製）等が例示される。これらは単独の成分で用いてもよく、２種以上の成分として用いてもよい。ブロッキングの具体的方法の一例として、例えば、ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ（商品名；生化学工業株式会社製）の溶液を固相に接触させ、０℃〜３７℃程度、好ましくは１０℃〜３０℃程度で、３０分間〜２時間程度静置する方法が例示される。必要に応じてブロッキング溶液に防腐剤等を共存させてもよい。
また必要に応じて、この後にブロッキング物質等を除去するために前記のような洗浄液で洗浄してもよい。またこの後に、プレートを１０℃〜３７℃程度で乾燥させてもよい。
＜３＞本発明ＮＤ検出方法
本発明ＮＤ検出方法は、下記ステップ（ａ）及び（ｂ）を少なくとも含む、検体中のＮＤ活性の検出方法である。
ステップ（ａ）：本発明固相に、検体を接触させるステップ
ステップ（ｂ）：前記固相に固着された本発明多糖における、脱Ｎ−アセチル化を検出するステップ。
なお本出願書類において「検出」の用語は、その対象となるものを何らかのかたちで見つけ出すことを意味する。したがって、本出願書類における「検出」の用語は、その検出対象の存否（有無）を見つけ出すことのみならず、その検出の対象を定量的に見つけ出すこと（検出対象を定量的に測定すること）をも含む概念である。
以下、ステップごとに説明する。
１．ステップ（ａ）
ステップ（ａ）は、本発明固相に、検体を接触させるステップである。本発明固相については、前記で説明した通りである。
ここにいう「検体」は、ＮＤ活性を有する酵素が含有されているか、又は含有されている可能性があるものであればよい。また、この検体中のＮＤ活性を有する酵素は、予め単離・精製等の処理が施されている必要もない。すなわち、検体中にＮＤ活性を保持する酵素以外の酵素その他の蛋白質成分等が含有されていても、本発明ＮＤ検出方法によればＮＤ活性を特異的に検出することができる。
また、固相と検体との接触方法は、当該固相に固着された本発明多糖の分子と、検体中に存在するＮＤ活性を有する酵素の分子とが接触する限りにおいて特に限定されない。例えば、固相に検体を添加して接触させても良く、また検体に固相を添加して接触させても良く、別体の容器に両者を同時に添加しても良い。接触の方法はこれらに限定されるものではなく、固相の形状や材質等に応じて当業者が適宜決定することができる。
これら両者を接触させた後、固相に固着された本発明多糖の分子と検体中に存在するＮＤ活性を有する酵素の分子とを十分に反応させるためにインキュベートすることが好ましい。
インキュベートの温度は、酵素反応が起こる温度である限りにおいて特に限定されず、その一例として室温が例示される。インキュベートの時間も、前記の両者が十分に反応する限りにおいて特に限定されないが、１５〜１２０分間程度、より好ましくは３０〜６０分間程度を例示することができる。
反応後、固相と液相を分離する。必要に応じて、固相の表面を洗浄液で洗浄することが好ましい。この洗浄は、固相に固着している本発明多糖が解離しない条件で行われる限りにおいて特に限定されない。洗浄液としては、例えば、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）系界面活性剤等の非イオン性界面活性剤を含有する緩衝液（例えばトリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＰＢＳ等）を例示することができる。
本発明固相と検体とを接触させることにより、検体中に存在するＮＤ活性を有する酵素が固相に固着された本発明多糖に作用して、当該多糖の分子中（糖鎖部分）に複数個存在するＧｌｃＮＡｃ残基が脱Ｎ−アセチル化される。そして、検体中に存在する酵素のＮＤ活性が高ければ高いほど、これに対応して、固相に固着された本発明多糖の分子中（糖鎖部分）に存在する多くのＧｌｃＮＡｃ残基が脱Ｎ−アセチル化されることになる。
２．ステップ（ｂ）
ステップ（ｂ）は、前記固相に固着された本発明多糖における、脱Ｎ−アセチル化を検出するステップである。
検体中に存在する酵素がＮＤ活性を保持していれば、ステップ（ａ）において固相に固着された本発明多糖の分子中（糖鎖部分）に存在するＧｌｃＮＡｃ残基が脱Ｎ−アセチル化される。また、検体中に存在する酵素のＮＤ活性が高ければ、それだけ多くのＧｌｃＮＡｃ残基が脱Ｎ−アセチル化されることになる。ステップ（ｂ）では、このステップ（ａ）を経た固相に固着された本発明多糖における脱Ｎ−アセチル化を検出することによって、検体中に存在するＮＤ活性を検出せんとするものである。
固相に固着された本発明多糖における脱Ｎ−アセチル化の検出手法も特に限定されず、例えば物理化学的方法（例えばクロマトグラフィー法など）、化学的方法（例えばアミノ基検出法）、生物学的方法（例えば、免疫測定法などの生物学的なアフィニティーを利用した方法）等によって行うことができる。なかでも、簡便性や迅速性等の観点から、生物学的なアフィニティーを利用した方法によって行うことが好ましい。
生物学的なアフィニティーによって脱Ｎ−アセチル化を検出する場合には、本発明固相に「ＮＡＨ又はその誘導体におけるＧｌｃＮ残基（すなわち、脱Ｎ−アセチル化されたＧｌｃＮＡｃ残基）に結合する蛋白質」を接触させることにより行うことができる。このような蛋白質は、抗体であることが好ましい。
したがってかかる検出は、免疫測定法によって行うことが好ましい。免疫測定法としては、ＥＬＩＳＡやＲＩＡ等が例示されるが、いずれの方法も採用することができる。
ここで用いる「抗体」の概念には、抗体自体はもちろん、その抗原結合部位（Ｆａｂ）を保持する抗体のフラグメントも包含される。またここにいう「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよいが、特異性、均質性、再現性、大量かつ永続的な生産性等の観点からすると、モノクローナル抗体であることが好ましい。
ここでは、例えばモノクローナル抗体ＪＭ４０３を用いることができる。モノクローナル抗体ＪＭ４０３は、Ｋｉｄｎｅｙ，Ｉｎｔ．，４１，ｐ１１５（１９９２）に記載の方法により製造することができる。また、モノクローナル抗体ＪＭ４０３は、生化学工業株式会社から販売されており、これを使用することもできる。
ここにおける「接触」の方法は、ステップ（ａ）における説明と同様である。
また、両者を接触させた後、生物学的なアフィニティーによる結合を十分にさせるためにインキュベートすることが好ましい。インキュベートの温度は、生物学的なアフィニティーによる結合が起こる温度である限りにおいて特に限定されず、２℃〜３７℃程度、好ましくは４℃〜２５℃程度が例示される。インキュベートの時間は、前記両者が十分に反応する限りにおいて特に限定されないが、０．５〜２時間程度、好ましくは１〜１．５時間程度を例示することができる。
反応後、固相と液相を分離する。必要に応じて、固相の表面を洗浄液で洗浄することが好ましい。この洗浄の要領は、ステップ（ａ）における酵素反応後の洗浄の要領と同様である。
「ＮＡＨ又はその誘導体におけるＧｌｃＮ残基（すなわち、脱Ｎ−アセチル化されたＧｌｃＮＡｃ残基）に結合する蛋白質」は、検出を容易とするために標識物質で標識されているか又は標識されるものであってもよい。標識に用いることができる標識物質は、通常の蛋白質の標識に使用可能なものであれば特に限定されないが、例えば酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼなど）、放射性同位元素（１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈなど）、蛍光色素（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、ジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リスアミンローダミンＢ（Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、フィコエリスリン（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ；ＰＥ）、ウンベリフェロン、ユーロピウム、フィコシアニン、トリカラー、シアニンなど）、化学発光物質（ルミノールなど）、ハプテン（ジニトロフルオロベンゼン、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、２，４−ジニトロアニリンなど）、特異的結合対（ビオチンとアビジン類（ストレプトアビジンなど）、レクチンと糖鎖、アゴニストとアゴニストの受容体、ＨＰとアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）のいずれか一方の物質等が例示される。
また、「ＮＡＨ又はその誘導体におけるＧｌｃＮ残基（すなわち、脱Ｎ−アセチル化されたＧｌｃＮＡｃ残基）に結合する蛋白質」を、固相に固着された本発明多糖におけるＧｌｃＮ残基に結合させた後、さらに当該蛋白質に結合する第２の蛋白質（二次抗体等）を用いて検出してもよい。この第２の蛋白質（抗体等）は、前記のような標識物質で予め標識されていることが好ましい。
このような「ＮＡＨ又はその誘導体におけるＧｌｃＮ残基（すなわち、脱Ｎ−アセチル化されたＧｌｃＮＡｃ残基）に結合する蛋白質」や、これに結合する第２の蛋白質（二次抗体等）に結合している標識物質を検出することによって、固相に固着された本発明多糖におけるＧｌｃＮＡｃ残基の脱Ｎ−アセチル化を検出することができる。
標識物質を検出する方法は、標識物質の種類に応じた公知の検出手段を適宜選択することができる。例えば、標識物質として特異的結合対の一方の物質（例えばビオチン）を使用した場合には、これに特異的に結合する他方の物質（例えばストレプトアビジン）を結合させた酵素（例えばペルオキシダーゼ等）を添加して、特異的結合対を形成せしめる。次いで、これに該酵素の基質（例えば過酸化水素（酵素がペルオキシダーゼの場合））及び発色物質（例えばＴＭＢや、ジアミノベンチジン等）を添加して、酵素反応による生成物の発色の度合いを吸光度で測定することによって、標識物質を検出することができる。
また、例えば標識物質として放射性同位元素、蛍光色素又は化学発光物質を使用した場合には、放射能のカウント、蛍光強度、蛍光偏光、発光強度等を測定する方法などが例示される。
このような標識物質の検出を介して、固相に固着された本発明多糖におけるＧｌｃＮＡｃ残基の脱Ｎ−アセチル化を検出することができ、これによって検体中のＮＤ活性を検出することができる。標識物質が多く検出されたとすれば、それだけ脱Ｎ−アセチル化の程度が高いこと、すなわち検体中のＮＤ活性が高いこと意味することになる。
ＮＤ活性の定性的な検出（ＮＤ活性の存否（有無）の検出）を望む場合には、標識物質の検出の有無をそのまま検出結果とすることができる。また、ＮＤ活性の定量的な検出（ＮＤ活性の程度や、ＮＤ活性を有する酵素の濃度の測定など）を望む場合には、吸光度、放射能のカウント、蛍光強度、発光強度などをそのままＮＤ活性の量の指標とすることができる。また、ＮＤ活性を有する既知濃度の酵素の標準溶液を用いて予め検量線又は関係式を作成しておき、これを用いて検体中のＮＤ活性を有する酵素の濃度を求めることもできる。
＜４＞本発明ＮＤ検出キット
本発明ＮＤ検出キットは、下記の構成成分（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含む、検体中のＮＤ活性の検出キットである。
（Ａ）本発明多糖
（Ｂ）ＮＡＨ又はその誘導体におけるＧｌｃＮ残基（すなわち、脱Ｎ−アセチル化されたＧｌｃＮＡｃ残基）に結合する蛋白質
本発明多糖については、前記で説明した通りである。本発明多糖は、使用時に固相に固着させるものであってもよく、予め固相に固着されているものであってもよいが、予め固相に固着されているものが好ましい。
また、「ＮＡＨ又はその誘導体におけるＧｌｃＮ残基（すなわち、脱Ｎ−アセチル化されたＧｌｃＮＡｃ残基）に結合する蛋白質」ついても、前記で説明した通りである。したがって、このような蛋白質として抗体を例示することができ、このような抗体としてモノクローナル抗体ＪＭ４０３を例示することができる。
本発明ＮＤ検出キットは、本発明ＮＤ検出方法に従って用いることができる。
本発明ＮＤ検出キットは、前記の構成成分を少なくとも含む限りにおいて、さらに検量線や関係式作成の標準となる既知濃度のＮＤ活性を有する酵素の標準品や、標識物質の検出試薬等を構成として加えることができる。また、これらの構成の他に、前記のブロッキング物質、前記の洗浄液、酵素反応停止液等が含まれていてもよい。さらに本発明ＮＤ検出キットには、検出バッチ同士の実施レベルを一定水準に保つための陽性コントロール（ＱＣコントロール）を含有させることもできる。
これらの構成成分は、例えばそれぞれ別体の容器に収容しておき、使用時に本発明ＮＤ検出方法に従って使えるキットとして保存しておくことができる。
＜５＞本発明ＳＴ検出方法
本発明ＳＴ検出方法は、下記ステップ（ｃ）及び（ｄ）を少なくとも含む、検体中のＳＴ活性の検出方法である。
ステップ（ｃ）：本発明固相に、検体と硫酸基供与体とを接触させるステップ。
ステップ（ｄ）：前記固相に固着された本発明多糖における、Ｎ−硫酸化を検出するステップ。
本発明ＳＴ検出方法の説明については、前記の本発明ＮＤ検出方法における「ＮＤ」を「ＳＴ」に、「脱Ｎ−アセチル化」を「Ｎ−硫酸化」に、「ＧｌｃＮＡｃ残基」を「ＧｌｃＮ残基」に、「ＮＡＨ又はその誘導体におけるＧｌｃＮ残基に結合する蛋白質」を「ＮＡＨ又はその誘導体におけるＮ−硫酸化されているＧｌｃＮ残基に結合する蛋白質」に、「モノクローナル抗体ＪＭ４０３」を「モノクローナル抗体Ｆ５８−１０Ｅ４又はモノクローナル抗体ＨｅｐＳＳ−１」にそれぞれ読み替えたものと同じである。なかでも、モノクローナル抗体Ｆ５８−１０Ｅ４を好ましく用いることができる。モノクローナル抗体Ｆ５８−１０Ｅ４は、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１１９，ｐ９６１（１９９２）に記載の方法で製造することができる。また、モノクローナル抗体Ｆ５８−１０Ｅ４及びモノクローナル抗体ＨｅｐＳＳ−１は、いずれも生化学工業株式会社から販売されており、これを使用することもできる。
なお、本発明ＳＴ検出方法においては「硫酸基供与体」を用いる必要がある。ここで用いることができる硫酸基供与体は、硫酸基受容体となる本発明多糖に対して硫酸基を供与する能力を有する物質である限りにおいて特に限定されないが、ＰＡＰＳが好ましい。
＜６＞本発明ＳＴ検出キット
本発明ＳＴ検出キットは、下記の構成成分（Ａ）及び（Ｃ）を少なくとも含む、検体中のＳＴ活性の検出キットである。
（Ａ）本発明多糖
（Ｃ）ＮＡＨ又はその誘導体におけるＮ−硫酸化されているＧｌｃＮ残基に結合する蛋白質
本発明ＳＴ検出キットは、本発明ＳＴ検出方法に従って用いることができる。
本発明ＳＴ検出キットの説明については、前記の本発明ＮＤ検出キットにおける「ＮＤ」を「ＳＴ」に、「ＮＡＨ又はその誘導体におけるＧｌｃＮ残基に結合する蛋白質」を「ＮＡＨ又はその誘導体におけるＮ−硫酸化されているＧｌｃＮ残基に結合する蛋白質」に、「モノクローナル抗体ＪＭ４０３」を「モノクローナル抗体Ｆ５８−１０Ｅ４又はモノクローナル抗体ＨｅｐＳＳ−１」にそれぞれ読み替えたものと同じである。なかでも、モノクローナル抗体Ｆ５８−１０Ｅ４を好ましく用いることができる。また、本発明ＳＴ検出キットは、さらに硫酸基受容体を構成成分として含んでいてもよい。硫酸基受容体の説明は、前記の本発明ＳＴ検出方法における説明と同じである。
＜７＞本発明ＮＤＳＴ検出方法
本発明ＮＤＳＴ検出方法は、本発明ＮＤ検出方法によって検体中のＮＤ活性を検出し、かつ、本発明ＳＴ検出方法によって検体中のＳＴ活性を検出することを特徴とする、検体中のＮＤＳＴ活性の検出方法である。
このように、本発明ＮＤ検出方法と本発明ＳＴ検出方法を組み合わせて用いることにより、ＮＤ活性とＳＴ活性を併せ持つＮＤＳＴの活性を検出することができる。
本発明ＮＤＳＴ検出方法は、少なくとも本発明ＮＤ検出方法と本発明ＳＴ検出方法とを実施するステップが含まれていればよく、他のステップをさらに含んでいてもよい。また本発明ＮＤＳＴ検出方法における、本発明ＮＤ検出方法と本発明ＳＴ検出方法の実施の順番も特に限定されない。すなわち、前者を先に実施しても良く、後者を先に実施してもよく、両者を同時に実施してもよい。
そして、本発明ＮＤ検出方法によって検体中にＮＤ活性が検出され、かつ、本発明ＳＴ検出方法によって検体中にＳＴ活性が検出された場合には、検体中にＮＤＳＴ活性が存在すると判定することができる。またこれらの活性のうち一方のみが検出された場合には、検体中にＮＤ活性は存在するがＳＴ活性は存在しない、又はＳＴ活性は存在するがＮＤ活性は存在しない、と判定することができる。
また、ＮＤ活性とＳＴ活性を定量的に検出することによって、検体中に存在するＮＤＳＴ活性の特性（例えば、当該ＮＤＳＴはＮＤ活性に比してＳＴ活性が高いとか、当該ＮＤＳＴはＮＤ活性とＳＴ活性が同等であるとか）をも検出することができる。
＜８＞本発明ＮＤＳＴ検出キット
本発明ＮＤＳＴ検出キットは、下記の構成成分（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を少なくとも含む、検体中のＮＤＳＴ活性の検出キットである。
（Ａ）本発明多糖
（Ｂ）ＮＡＨ又はその誘導体におけるＧｌｃＮ残基（すなわち、脱Ｎ−アセチル化されたＧｌｃＮＡｃ残基）に結合する蛋白質
（Ｃ）ＮＡＨ又はその誘導体におけるＮ−硫酸化されているＧｌｃＮ残基に結合する蛋白質
本発明多糖については、前記で説明した通りである。本発明多糖は、使用時に固相に固着させるものであってもよく、予め固相に固着されているものであってもよいが、予め固相に固着されているものが好ましい。
また、「ＮＡＨ又はその誘導体におけるＧｌｃＮ残基（すなわち、脱Ｎ−アセチル化されたＧｌｃＮＡｃ残基）に結合する蛋白質」についても、前記で説明した通りである。したがって、このような蛋白質として抗体を例示することができ、このような抗体としてモノクローナル抗体ＪＭ４０３を例示することができる。
また、「ＮＡＨ又はその誘導体におけるＮ−硫酸化されているＧｌｃＮ残基に結合する蛋白質」についても、前記で説明した通りである。したがって、このような蛋白質として抗体を例示することができ、このような抗体としてモノクローナル抗体Ｆ５８−１０Ｅ４又はモノクローナル抗体ＨｅｐＳＳ−１を例示することができる。なかでも、モノクローナル抗体Ｆ５８−１０Ｅ４を好ましく用いることができる。
また、本発明ＳＴ検出キットは、さらに硫酸基受容体を構成成分として含んでいてもよい。硫酸基受容体の説明は、前記の本発明ＳＴ検出方法における説明と同じである。
本発明ＮＤＳＴ検出キットは、本発明ＮＤＳＴ検出方法に従って用いることができる。
本発明ＮＤＳＴ検出キットは、前記の構成成分を少なくとも含む限りにおいて、さらに検量線や関係式作成の標準となる既知濃度のＮＤＳＴ活性を有する酵素の標準品や、標識物質の検出試薬等を構成として加えることができる。また、これらの構成の他に、前記のブロッキング物質、前記の洗浄液、酵素反応停止液等が含まれていてもよい。さらに本発明ＮＤ検出キットには、検出バッチ同士の実施レベルを一定水準に保つための陽性コントロール（ＱＣコントロール）を含有させることもできる。
これらの構成成分は、例えばそれぞれ別体の容器に収容しておき、使用時に本発明ＮＤＳＴ検出方法に従って使えるキットとして保存しておくことができる。
＜９＞本発明スクリーニング方法
本発明スクリーニング方法は、下記ステップ（ｅ）〜（ｇ）を少なくとも含む、下記の酵素群から選択される１又は２以上の酵素の活性を変化させる物質のスクリーニング方法である。
ステップ（ｅ）：下記の酵素群から選択される１又は２以上の酵素の活性を変化させる可能性のある試験物質を、当該酵素と共存させるステップ。
ステップ（ｆ）：ステップ（ｅ）により得られる「前記試験物質と前記酵素との共存物」を検体とし、本発明ＮＤ検出方法、本発明ＳＴ検出方法及び本発明ＮＤＳＴ検出方法のいずれかの方法によって、前記酵素の活性を検出するステップ。
ステップ（ｇ）：ステップ（ｆ）により検出された酵素の活性と、ステップ（ｅ）で用いた酵素を検体としてステップ（ｆ）と同一の方法によって検出される酵素の活性とを比較して、下記の酵素群から選択される１又は２以上の酵素の活性を変化させる試験物質を選択するステップ。
（酵素群）ＮＤ、ＳＴ、ＮＤＳＴ
本発明スクリーニング方法は、本発明ＮＤ検出方法、本発明ＳＴ検出方法又は本発明ＮＤＳＴ検出方法を、ＮＤ、ＳＴ又はＮＤＳＴの活性を変化させる物質のスクリーニング方法に応用したものである。
ステップ（ｅ）は、これらの酵素の活性を変化させる可能性がある試験物質を、当該酵素と共存させるステップである。この「共存」の様式は、当該可能性がある試験物質の分子と、当該酵素の分子とが接触する状態にある限りにおいて特に限定されない。試験物質をどの酵素と共存させるかは、スクリーニングの目的に応じて当業者が適宜選択することができる。例えば、ＮＤ活性を変化させる物質のスクリーニングを行う場合には当該活性を変化させる可能性がある物質をＮＤと共存させればよく、ＳＴ活性を変化させる物質のスクリーニングを行う場合には当該活性を変化させる可能性がある物質をＳＴと共存させればよく、ＮＤＳＴ活性を変化させる物質のスクリーニングを行う場合には当該活性を変化させる可能性がある物質をＮＤＳＴと共存させればよい。
ここで、試験物質と共存させるＮＤ、ＳＴ又はＮＤＳＴは、いずれも、例えばアイカワ、Ｊ（Ａｉｋａｗａ，Ｊ．）ら、２００１年、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２７６巻、第８号、ｐ．５８７６−５８８２に記載の方法で製造することができる。試験物質と共存させるＮＤ、ＳＴ又はＮＤＳＴの種類や由来等は、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。例えば、ヒト由来のＮＤＳＴを用いる場合には、その目的に応じてＮＤＳＴ１、ＮＤＳＴ２、ＮＤＳＴ３、ＮＤＳＴ４等の中から用いる酵素を適宜選択することができる。またこれらの酵素も、公知の方法（例えば、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２６（２），ｐ２３９−２４４（１９９５）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３３２（ｐｔ２），ｐ３０３−３０７（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４（５），ｐ２６９０−２６９５（１９９９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（８），ｐ５８７６−５８８２（２００１）等参照）で製造することができる。また置換、欠失、挿入、転位等の変異が導入された酵素や、他のペプチド等と融合させた酵素等を用いてもよい。
なお、酵素としてＳＴ又はＮＤＳＴを選択する場合には、さらに硫酸基受容体も共存させることになる。硫酸基受容体の説明は、前記の本発明ＳＴ検出方法における説明と同じである。
ステップ（ｆ）は、ステップ（ｅ）により得られる「前記試験物質と前記酵素との共存物」を検体として、本発明ＮＤ検出方法、本発明ＳＴ検出方法及び本発明ＮＤＳＴ検出方法のいずれかの方法によって、前記酵素の活性を検出するステップである。どの検出方法を採用するかは、スクリーニングの目的に応じて当業者が適宜選択することができる。例えば、ＮＤ活性を変化させる物質のスクリーニングを行う場合には本発明ＮＤ検出方法を、ＳＴ活性を変化させる物質のスクリーニングを行う場合には本発明ＳＴ検出方法を、ＮＤＳＴ活性を変化させる物質のスクリーニングを行う場合には本発明ＮＤＳＴ方法をそれぞれ採用すればよい。これにより、前記試験物質の存在下における前記酵素の活性を検出することができる。
ステップ（ｇ）は、ステップ（ｆ）により検出された酵素の活性（試験物質の共存下における酵素の活性）と、ステップ（ｅ）で用いた酵素を検体としてステップ（ｆ）と同一の方法によって検出される酵素の活性（試験物質の非共存下における酵素の活性）とを比較して、前記の酵素群から選択される１又は２以上の酵素の活性を変化させる試験物質を選択するステップである。「ステップ（ｆ）により検出された酵素の活性（試験物質の共存下における酵素の活性）」と「ステップ（ｅ）で用いた酵素を検体としてステップ（ｆ）と同一の方法によって検出される酵素の活性（試験物質の非共存下における酵素の活性）」との間に差が見出された場合には、当該試験物質は前記酵素の活性を変化させる物質であるとして選択することができる。
例えば、試験物質の共存下における酵素の活性が、試験物質の非共存下における酵素の活性よりも高い場合には、当該物質は酵素活性の促進物質であるとして選択することができる。また試験物質の共存下における酵素の活性が、試験物質の非共存下における酵素の活性よりも低い場合には、当該物質は酵素活性の阻害物質であるとして選択することができる。両者間に差がない場合には、当該物質は酵素活性に対して影響を及ぼさない物質として同定することができる。
また、試験物質の共存下における酵素の活性と、試験物質の非共存下における酵素の活性との間に差が見いだされた場合には、その差の程度を定量的に調べることにより、酵素活性の促進物質又は阻害物質としての能力の指標としてもよい。
以下、本発明を実施例により具体的に詳説するが、本発明はこれら何ら限定されるものではない。
なお本実施例において使用したＮＤＳＴは、以下の通り調製した。
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３３２（ｐｔ２），ｐ３０３−３０７（１９９８）に記載の方法でヒト由来のＮＤＳＴ２をクローニングした。クローニングされたＮＤＳＴ２をコードするＤＮＡは配列番号１に記載の塩基配列を有し、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質（ＮＤＳＴ２）をコードしている。
この塩基配列からＮ末端側の膜貫通領域をコードする部分を除去し、配列番号２におけるアミノ酸番号７９〜８８３で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質（膜貫通領域が除去されたＮＤＳＴ２）を発現させるために、以下の操作を行った。
（１）２５μｌの反応系で、バキュロウイルスのｇｐ６７シグナルペプチドをコードする配列を保持するベクターＤＮＡ、ｐＡｃＳｅｃＧ２Ｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）２５０ｎｇを鋳型にして５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＣＴＡＡＡＡＡＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴＡＧＴＡＡＡＴＣＡＧ−３’（配列番号３）の配列を有する短鎖ＤＮＡ５ｐｍｏｌと５’−ＣＡＣＧＧＧＴＴＣＡＧＴＴＣＧＡＧＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣＡＡＡＧＧＣＡＧＡＡＴＧＣＧＣＣＧＣ−３’（配列番号４）の配列を有する短鎖ＤＮＡ５ｐｍｏｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（Ｔａｋａｒａ社、日本）１．２５ｕｎｉｔｓを用いたＰＣＲを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ４）ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．００１％ＢＳＡ、２００μＭ ｄＮＴＰの存在下、サーマルサイクラーを用いて、９５℃２分を１サイクル、９５℃３０秒−５２．５℃３０秒−７２℃１分を１０サイクル、７２℃１０分を１サイクル行わせ、ロブスターＬ２１配列（ＡＡＣＴＣＣＴＡＡＡＡＡＡＣＣＧＣＣＡＣＣ）（配列番号５）とｇｐ６７シグナルペプチド（３９アミノ酸）をコードするＤＮＡの特異的増幅を行った。
（２）２５μｌの反応系で、ベクター中にヒトＮＤＳＴ２を保持するプラスミドＤＮＡ ｐＣＲｈＮＤＳＴ２＃５ ２５０ｎｇを鋳型にして５’−ＧＡＧＡＣＡＧＣＴＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣＣＣＧＴＧＧ−３’（配列番号６）の配列を有する短鎖ＤＮＡ５ｐｍｏｌと５’−ＣＴＧＧＴＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＴＧＴＣＡＧＣＣＣＡＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣ−３’（配列番号７）の配列を有する短鎖ＤＮＡ ５ｐｍｏｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（Ｔａｋａｒａ社、日本）１．２５ｕｎｉｔｓを用いたＰＣＲを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ ＫＣｌ，６ｍＭ（ＮＨ４）ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．００１％ＢＳＡ、２００μＭ ｄＮＴＰの存在下、サーマルサイクラーを用いて、９５℃２分を１サイクル、９５℃３０秒−５２．５℃３０秒−７２℃５分を２０サイクル、７２℃１０分を１サイクル行わせ、ヒトＮＤＳＴ２の８０５アミノ酸（配列番号２におけるアミノ酸番号７９〜８８３）をコードするＤＮＡの特異的増幅を行った。
（３）２５μｌの反応系で、上記（１）で得られた反応液２μｌと上記（２）で得られた反応液０．５μｌ中のＤＮＡを鋳型にして、５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＣＴＡＡＡＡＡＡＣＣＧＣＣＡＣ−３’（配列番号８）の配列を有する短鎖ＤＮＡ５ｐｍｏｌと５’−ＣＴＧＧＴＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＴＧＴＣＡＧＣＣＣＡＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣ−３’（配列番号７）の配列を有する短鎖ＤＮＡ５ｐｍｏｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（Ｔａｋａｒａ社、日本）１．２５ｕｎｉｔｓを用いたＰＣＲを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ４）ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．００１％ＢＳＡ、２００μＭ ｄＮＴＰ存在下、サーマルサイクラーを用いて、９５℃２分を１サイクル、９５℃３０秒−５２．５℃３０秒−７２℃６分を３０サイクル、７２℃１０分を１サイクル行わせ、ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチド（３９アミノ酸）とヒトＮＤＳＴ２の８０５アミノ酸（配列番号２におけるアミノ酸番号７９〜８８３）をコードする融合ＤＮＡの特異的増幅を行った。
（４）前記（３）で得られた融合ＤＮＡを含む反応液１０μｌ及びベクターＤＮＡ、ｐＦａｓｔＢａｃ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）１μｇに、制限酵素ＢａｍＨＩとＮｏｔＩを１０ｕｎｉｔｓずつ加え、３７℃で２時間反応させた。反応産物をＴＡＥアガロース電気泳動に付し、目的の大きさのＤＮＡ断片をＧｅｎｅｃｌｅａｎ ＩＩ ｋｉｔを用いて精製し、ＴＥ緩衝液１０μｌ中に回収した。得られたＤＮＡ１μｌずつを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ社、日本）を用いた４℃、２０時間、１０μｌの反応系で、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで同時に消化したｐＦａｓｔＢａｃ−１に、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで同時に消化したロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチド（３９アミノ酸）及びヒトＮＤＳＴ２ ８０５アミノ酸（配列番号２におけるアミノ酸番号７９〜８８３）をコードする融合ＤＮＡをライゲーションした。反応液２μｌを用いて、常法により大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）４０μｌを形質転換し、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む１．５％寒天含有ＬＢ培地上で、形質転換体のコロニーを選択した。得られた大腸菌のコロニーから、大腸菌が保持するプラスミドＤＮＡを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）１００μｌに回収した。ベクターＤＮＡに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析を、常法によってヒトＮＤＳＴ２に特異的な短鎖ＤＮＡを用いて行った。
その結果、ロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチド（３９アミノ酸）及びヒトＮＤＳＴ２ ８０５アミノ酸（配列番号２におけるアミノ酸番号７９〜８８３）をコードする融合ＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化した断片２５７７ｂｐと、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化したｐＦａｓｔＢａｃ−１とのライゲーション産物で形質転換した大腸菌１２８クローンより、目的のＤＮＡ断片を保持すると考えられる２クローン（ｐＦＢ１−ＧＰ６７ｈＮＤＳＴ２ＳＯＬ（７９Ｅ）＃５及びｐＦＢ１−ＧＰ６７ｈＮＤＳＴ２ＳＯＬ（７９Ｅ）＃１２３）を同定した。ＤＮＡの塩基配列解析を行い、前記２クローンが予想されるＤＮＡの塩基配列と完全に一致することを確認した。
（５）前記（４）で得られたＤＮＡを大腸菌ＤＨ１０ＢＡＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）に導入し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のプロトコールに従い、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、７μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む１．５％寒天含有ＬＢ培地上で、形質転換体のコロニーを選択した。
得られた大腸菌のコロニーを５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＴｅｒｉｆｉｃ−Ｂｒｏｔｈ培地（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）１．５ｍｌに接種し、３７℃２０時間の振盪培養を行った。得られた培養液を容量１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した後、冷却遠心機を用いて、４℃にて８０００回転で、２分間遠心して大腸菌菌体を沈澱として回収した。この菌体を１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１５０μｌに懸濁したのち、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む２００ｍＭ ＮａＯＨ １５０μｌを加え、緩やかに混和し室温で５分間静置した。次に、３．０Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５．５）１５０μｌを加え、良く混和した後、冷却遠心機を用いて、４℃にて１５０００回転で、１０分間遠心して上清画分を回収した。上清４５０μｌにあらかじめＴＥ緩衝液で飽和されているフェノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）４５０μｌを加えて、ボルテックスミキサーにより激しく混和した後、冷却遠心機を用いて、４℃にて、１５０００回転で、５分間遠心して上層画分を回収した。上層画分４００μｌにエタノール１ｍｌを加えて混和した後、室温で１０分間静置した。その後、冷却遠心機を用いて、４℃にて、１５０００回転で、５分間遠心して上清を除去した後、沈澱に７０％（ｖ／ｖ）エタノール１ｍｌを加え混和した後、冷却遠心機を用いて、４℃にて１５０００回転で、５分間遠心して上清を除去した。残った沈澱に、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１５０μｌを加え、懸濁したのち、３７℃で２０分間反応させた。次に、あらかじめＴＥ緩衝液で飽和されているフェノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）１００μｌを加えて、ボルテックスミキサーにより激しく混和した後、冷却遠心機を用いて、４℃にて１５０００回転で、５分間遠心して上層画分を回収した。上層画分１００μｌにエタノール２５０μｌと３Ｍ酢酸ナトリウム１０μｌを加え混和した後、冷却遠心機を用いて、４℃にて、１５０００回転で、５分間遠心して上清を除去した。次に、沈澱に７０％（ｖ／ｖ）エタノール１ｍｌを加え混和した後、冷却遠心機を用いて、４℃にて１５０００回転で、５分間遠心して上清を除去した。残った沈澱に、ＴＥ緩衝液１００μｌを加え、懸濁した。
その結果、前記（４）で得られたＤＮＡ ｐＦＢ１−ＧＰ６７ｈＮＤＳＴ２ＳＯＬ（７９Ｅ）＃１２３を大腸菌ＤＨ１０ＢＡＣに導入し、薬剤耐性及びＰＣＲ法を指標に目的のクローン（ｐＦＢ１−ＧＰ６７ｈＮＤＳＴ２ＳＯＬ（７９Ｅ）＃１２３−４）を得た。
（６）まず、ヨトウガＳｆ９細胞１００万個をＳＦ−９００ＩＩ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）２ｍｌに懸濁した後、６ウェルのプレートに移し、２８℃で１時間静置し、細胞をプレートに接着させた。次に、前記（５）で得られたＤＮＡ（バキュロウイルスゲノムＤＮＡに組み込まれたロブスターＬ２１配列、ｇｐ６７シグナルペプチド及びヒトＮＤＳＴ２ ８０５アミノ酸）１０μｇをＳｆ−９００ＩＩ無血清培地２００μｌに希釈したものと、ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）６μｌをＳｆ−９００ＩＩ無血清培地２００μｌに希釈したものとを混和し、室温で３０分間静置した。あらかじめプレートに接着させたＳｆ９細胞をＳｆ−９００ＩＩ無血清培地２ｍｌで洗浄した後、ＤＮＡとｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎの混和液２００μｌにＳｆ−９００ＩＩ無血清培地８００μｌを混ぜたものを加えた。２８℃で５時間静置した後、培地を吸引除去して、新しいＳｆ−９００ＩＩ無血清培地２ｍｌを加えて、さらに２８℃で３日間培養したのち、培養上清を回収し、バキュロウイルスのストック液とした。
（７）１０００万個のＳｆ２１細胞をＳＦ−９００ＩＩ（血清含有培地）１０ｍｌに懸濁した後、Ｔ−７５フラスコにまき、１時間静置した。培地２ｍｌを残して吸引除去し、前記（６）で得られたバキュロウイルスのストック液１ｍｌを添加し１時間ゆるやかに震盪させることによってウイルスストック液をＳｆ２１（血清含有培地）に感染させた。その後、ＳＦ−９００ＩＩ（血清含有培地）８ｍｌを加え、２８℃で３日間培養した。
（８）回収した培地を遠心して、細胞を除いた画分を培養上清とした。培養上清をアミコンＵｌｔｒａ−１５ ３００００ＭＷＣＯ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）にかけ、冷却遠心機を用いた遠心により分子量３万以上の画分を回収し、濃縮培養上清とした。
これによって得られたＮＤＳＴ２（配列番号２におけるアミノ酸番号７９〜８８３で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質（膜貫通領域が除去されたＮＤＳＴ２））を含有する溶液を、以下「ＮＤＳＴ酵素液」という。
（実施例１）本発明多糖の製造
（１）ＮＡＨの製造
ＮＡＨは、大腸菌Ｋ５を用いて特開２００４−１８８４０号に記載されている方法に従って製造した。製造されたＮＡＨの特徴を以下に示す。
・ゲルろ過クロマトグラフィー法により測定した重量平均分子量（Ｍｗ）：４４，７１０
・ゲルろ過クロマトグラフィー法により測定した数平均分子量（Ｍｎ）：３６，７１４
・分子量分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）：１．２１２
・臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）比色定量法により測定した核酸含量：０．０９％
・ローリー法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３，２６５（１９５１））により測定した蛋白質含量：２．３８％
２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（２，４，６−ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ；２，４，６−ＴＮＢＳ）法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ．，１４１，３５８（１９６７））によって測定した遊離アミンのモル数：０．０２６μＭ／ｍｇ
ここで、ゲルろ過クロマトグラフィーは、Ａｒａｉ，Ｍ．らの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１１７，６０−７０，１９９２）に従って行った。分子量が既知のコンドロイチン硫酸ナトリウム（重量平均分子量３９，１００、１８，０００、８，０５０；いずれも生化学工業株式会社製）およびヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量１０４，０００；生化学工業株式会社製）を標準品として、高速液体クロマトグラフィーを用いたゲルろ過クロマトグラフィーでのそれらの溶出時間をデータ解析ソフトウェア（ＧＰＣ−８０２０ 東ソー株式会社）で解析することによって得られる式に、試料の溶出時間を当てはめることにより重量平均分子量及び数平均分子量を決定した。カラムは、ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ４０００ＰＷＸＬ、Ｇ３０００ＰＷＸＬ及びＧ２５００ＰＷＸＬ（各φ７．８×３００ｍｍ、東ソー株式会社）を連結したものを用いた。溶媒として０．２ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液を用い、流速は０．６ｍｌ／分とし、検出器は示差屈折率検出器（ＲＩ−８０２０、東ソー株式会社）を用いた。
（２）蛋白質（ＢＳＡ）がＮＡＨの還元末端に共有結合（ＳＳ結合）した本発明多糖の製造
（２−１）チオプロピオニルＮＡＨ（以下、「ＳＨ−ＮＡＨ」という。）の調製
実施例１で調製したＮＡＨを５０ｍｇ秤量し、２ｍｌの２Ｍ塩化アンモニウム水溶液に溶解した。この溶液に２５ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、７０℃で２日間、還元アミノ化反応を行った。この反応後の溶液に、１３ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加して、さらに２日間同一の条件で反応させた。氷浴中で冷却した後、４００μｌの酢酸を添加することによって反応を完全に停止させた。
生成した還元アミノ化ＮＡＨ（以下、「ＲＡ−ＮＡＨ」という。）を２倍量のエタノールを用いた溶媒沈殿法で回収した。回収した沈殿をエタノールで洗浄した後、凍結乾燥した。これにより、３９．５ｍｇのＲＡ−ＮＡＨ凍結乾燥品を得た。
得られたＲＡ−ＮＡＨを１０．４ｍｇ秤量し、２ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。この溶液に８０μｌの５ｍＭ ＳＰＤＰ（ＳＩＧＭＡ社）（エタノール溶液）を添加して、室温で３０分間、ＰＤＰ化反応を行った。その後、過剰のＳＰＤＰを除くために、この反応液を蒸留水に対して一晩透析した後、凍結乾燥した。これにより、９．５ｍｇの２−ピリジルジスルフィドプロピオニル化ＮＡＨ（以下、「ＰＤＰ−ＮＡＨ」という。）凍結乾燥品を得た。
得られたＰＤＰ−ＮＡＨを９．５ｍｇ秤量し、１ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム−０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解した。この溶液に終濃度が２５ｍＭとなるようにジチオスレイトールを添加して、室温で６０分間、還元反応を行った。
生成したＳＨ−ＮＡＨを２倍量のエタノールを用いた溶媒沈殿法で回収した。回収した沈殿をエタノール洗浄した後、凍結乾燥した。８．３ｍｇのＳＨ−ＮＡＨ凍結乾燥物を得た。
（２−２）２−ピリジルジスルフィドプロピオニル化ＢＳＡ（以下、「ＰＤＰ−ＢＳＡ」という）の調製
ＢＳＡ（１００ｍｇ、ＳＩＧＭＡ社）を終濃度２．５ｍｇ／ｍｌになるように０．１Ｍ塩化ナトリウム−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。この溶液に終濃度が２３８μＭになるように５ｍＭ ＳＰＤＰ（エタノール溶液）を添加した後、室温で３０分間、ＰＤＰ化反応を行った。過剰のＳＰＤＰを除くために、この反応液を蒸留水に対して一晩透析した後、凍結乾燥した。これにより、１０４．２ｍｇの２−ピリジルジスルフィドプロピオニル化ＢＳＡ（以下、「ＰＤＰ−ＢＳＡ」という。）凍結乾燥品を得た。
（２−３）共有結合（ＳＳ結合）の形成（本発明多糖の調製）
前記において調製したＳＨ−ＮＡＨ（１．５ｍｇ）とＰＤＰ−ＢＳＡ（０．７５ｍｇ）とを、１ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、室温で２時間、コンジュゲーション反応を行った。反応により生成するピリジル−２−チオンを除くため、反応後の溶液を蒸留水に対して一晩透析した後、凍結乾燥した。これにより、蛋白質（ＢＳＡ）がＮＡＨの還元末端に共有結合（ＳＳ結合）している本発明多糖（以下、「ＮＡＨ−ＳＳ−ＢＳＡ」という）を１．９ｍｇ得た。
（３）ビオチンがＮＡＨの還元末端に結合した本発明多糖の製造
前記で得られたＲＡ−ＮＡＨ（１０ｍｇ）を０．５ｍｌの０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液に溶解し、次いで３ｍｇのｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（ピアス社製）を添加して、４℃で一晩インキュベートした。その後蒸留水に対して一晩透析した後、透析内液を凍結乾燥して、ビオチンがＮＡＨの還元末端に結合している本発明多糖（以下、「ＮＡＨ−ビオチン」という）を得た（８ｍｇ）。
（実施例２）本発明固相（ＮＡＨ−ＳＳ−ＢＳＡが固着された固相）の製造
実施例１で製造したＮＡＨ−ＳＳ−ＢＳＡを、ＰＢＳ（−）で１μｇ／ｍＬに希釈した。この希釈後の溶液を、マキシソープ（登録商標）９６ウェルマイクロプレート（ＮＡＬＧＥ ＮＵＮＣ社製）の各ウェルに１００μＬずつ添加して、４℃で１４〜１８時間静置することによってウェルの表面上に均一にコーティングした。
このプレートをＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、ブロッキング物質としてＡｐｐｌｉｅＤｕｏ（商品名；生化学工業株式会社製）を５倍希釈した溶液を、また防腐剤として０．０５％プロクリン（登録商標）３００（ＳＵＰＥＬＣＯ社製）を含有するリン酸緩衝液（上記ＰＢＳ（−）のうち、塩化ナトリウム、塩化カリウムを含有しないもの。ｐＨ７．２〜７．５；以下「ＰＢ」という。）をそれぞれ添加し、常温で２時間静置した。
静置後、ブロッキング物質を十分に除去し、３７℃で２時間乾燥させることによって、ＮＡＨ−ＳＳ−ＢＳＡがウェルに固着されたプレートを得た。プレートは乾燥剤とともにアルミラミネート袋に封入して、冷蔵保存した。
（実施例３）蛋白質（ＢＳＡ）が、ＮＡＨのカルボキシル基に共有結合（アミド結合）している本発明多糖の製造
実施例１で調製したＮＡＨを含有する溶液、及びＢＳＡ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ社製）を含有する溶液を、それぞれ、濃度１０ｍｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）を溶媒として調製した。また、ＥＤＣ（ＰＩＥＲＣＥ社製）の１００ｍｇ／ｍｌ溶液を、０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）を溶媒として調製した。
前記のＮＡＨ溶液（３００μｌ）及びＢＳＡ溶液（１５０μｌ）を混合した。混合液に４μｌのＥＤＣ溶液を添加した後、室温で２０時間、コンジュゲーション反応を行った。
反応後の溶液を蒸留水に対して一晩透析した後、凍結乾燥した。これにより、蛋白質（ＢＳＡ）が、ＮＡＨのヘキスロン酸残基に保持されているカルボキシル基に共有結合（アミド結合）している本発明多糖（以下、「ＮＡＨ−ＣＯＯＨ−ＢＳＡ」という）凍結乾燥物を３．５ｍｇ得た。
（実施例４）本発明固相（ＮＡＨ−ＣＯＯＨ−ＢＳＡが固着された固相）の製造
実施例２における「ＮＡＨ−ＳＳ−ＢＳＡ」の代わりに「ＮＡＨ−ＣＯＯＨ−ＢＳＡ」を用いて、実施例２と同様にＮＡＨ−ＣＯＯＨ−ＢＳＡがウェルに固着されたプレートを得た。プレートは乾燥剤とともにアルミラミネート袋に封入して、冷蔵保存した。
（実施例５）ＮＤ活性の測定
実施例２および４で調製したプレートを、０．０５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（ＩＣＩ社の商標Ｔｗｅｅｎ２０に相当する製品；和光純薬工業株式会社製）を含有するＰＢＳ（−）（以下、「洗浄液」という）３００μＬで３回洗浄した。
その後、０．０５Ｍ ＭＥＳ、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２及び１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する溶液（以下、「酵素反応液１」という）（ｐＨ６．５）を用いて、ＮＤＳＴ酵素液を１０倍から５１２０倍に倍々で希釈した溶液を各ウェルに５０μＬずつ添加し、３７℃で６０分間静置して酵素反応させた。
酵素反応終了後、ウェルを洗浄液で３回洗浄した。その後、ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ（商品名；生化学工業株式会社製）を２０倍希釈した溶液及び０．０５％プロクリン３００とを含有するＰＢＳ（−）（以下、「反応液」という）で１μｇ／ｍＬに調製したモノクローナル抗体ＪＭ４０３（生化学工業株式会社）の溶液を、各ウェルに１００μＬずつ添加した。その後、プレートを常温（１５〜２５℃）で６０分間静置して抗原抗体反応させた。反応液のみを含有するウェルをブランクとした。
反応後、ウェルを洗浄液で３回洗浄し、反応液で２００００倍に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ＋Ｍ抗体（ＪＡＣＫＳＯＮ社製）の溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加した。その後、プレートを常温で６０分間静置して抗原抗体反応させた。
反応後、このプレートを洗浄液で３回洗浄し、ペルオキシダーゼの基質としてＴＭＢ溶液（ＢＩＯＦＸ社製）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、常温で３０分間反応させ、発色させた。その後、反応停止液（ＢＩＯＦＸ社製）を各ウェルに１００μＬずつ添加して反応を停止させた後、波長４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）におけるＴＭＢ分解物の吸光度をウェルリーダーＳＫ６０３（登録商標；生化学工業株式会社販売）で測定した。
モノクローナル抗体ＪＭ４０３は、ＮＡＨ分子におけるＧｌｃＮ残基（すなわち、脱Ｎ−アセチル化されたＧｌｃＮＡｃ残基）部分を認識する。ＮＤ活性が高ければ、その分、固相化された本発明多糖における脱Ｎ−アセチル化部位が増加することから、この脱Ｎ−アセチル化された部分をモノクローナル抗体ＪＭ４０３で検知することにより、脱Ｎ−アセチル化の程度（ＮＤ活性）を検知することができる。したがって本実施例では、モノクローナル抗体ＪＭ４０３の反応性をＮＤ活性として表すこととした。
このＮＤ活性は、測定された吸光度から、ブランクにおける吸光度を差し引いた値として算出した。ＮＡＨ−ＳＳ−ＢＳＡがウェルに固着されたプレートを用いた結果を図１に、ＮＡＨ−ＣＯＯＨ−ＢＳＡがウェルに固着されたプレートを用いた結果を図２にそれぞれ示す。
図１及び図２から、いずれもＮＤＳＴの用量依存的な（ＮＤＳＴ酵素液の希釈率に反比例した）ＮＤ活性が観察された。また、ＮＡＨの還元末端にＢＳＡを結合したＮＡＨ−ＳＳ−ＢＳＡを固相化したプレートでは１２８０倍希釈した酵素液でもＮＤ活性を確認することができ（図１）、ＮＡＨ−ＣＯＯＨ−ＢＳＡを固相化したプレート（図２、３２０倍希釈率でＮＤ活性を確認）に比して、ＮＤ活性を高感度に測定できることが示された。
（実施例６）ＮＤ活性の反応時間の依存性
実施例２で調製したプレート（ＮＡＨ−ＳＳ−ＢＳＡ固相化プレート）を３００μＬの洗浄液で３回洗浄した後、酵素反応液１を用いて１６０倍に希釈したＮＤＳＴ酵素液を各ウェルに５０μＬずつ添加した。その後３７℃で０、１０、２０、３０、４０又は６０分間静置して酵素反応させた。
反応終了後、ウェルを洗浄液で３回洗浄し、反応液で１μｇ／ｍＬに調製したモノクローナル抗体ＪＭ４０３（生化学工業株式会社）の溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加した。その後、プレートを常温（１５〜２５℃）で６０分間静置して抗原抗体反応させた。反応液のみを含有するウェルをブランクとした。
なお、酵素反応液１におけるｐＨを８．０に調製したもの、又は、ＮＤＳＴ酵素液に代えて予め１分間煮沸したＮＤＳＴ酵素液を用いたものについても同様に実験した。
以後は、実施例５と同じ方法でＨＲＰ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ＋Ｍ抗体を反応させ、次いでＴＭＢ溶液で発色させ、次いで吸光度を測定して、ＮＤ活性を算出した。結果を図３に示す。なお図３中の黒菱形印は酵素反応液１としてｐＨ６．５のものを用いた実験、黒正方形印は酵素反応液１としてｐＨ８．０のものを用いた実験、白三角印は予め１分間煮沸したＮＤＳＴ酵素液を用いた実験のデータをそれぞれ示す。
図３から、ｐＨ６．５及びｐＨ８．０の酵素反応液１を用いた場合、いずれも時間依存的にＮＤ活性が認められた。またｐＨ６．５の酵素反応液１は、ｐＨ８．０の酵素反応液１を用いた場合よりもさらに反応性が高かった。なお、１分間煮沸したＮＤＳＴ酵素液ではＮＤ活性が失活することが確認された。このことから、ＮＤ活性を測定する際の酵素反応時の溶液のｐＨは６〜７とすることが好ましいことが示された。
（実施例７）ＳＴ活性の測定
実施例２で調製したプレート（ＮＡＨ−ＳＳ−ＢＳＡ固相化プレート）を３００μＬの洗浄液で３回洗浄した。
その後、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び０．１ｍＭ ＰＡＰＳを含有するｐＨ７．４の溶液（以下、「酵素反応液２」という）を用いて、ＮＤＳＴ酵素液を２倍から１２８倍に倍々希釈した溶液を各ウェルに５０μＬずつ添加し、３７℃で３０分間静置して酵素反応させた。
酵素反応終了後、ウェルを洗浄液で３回洗浄した。その後、反応液で１μｇ／ｍＬに調製したモノクローナル抗体Ｆ５８−１０Ｅ４（生化学工業株式会社）の溶液を、各ウェルに１００μＬずつ添加した。
その後、プレートを常温（１５〜２５℃）で６０分間静置して抗原抗体反応させた。反応液のみを含有するウェルをブランクとした。
なお、ＰＡＰＳを含有しない酵素反応液２を用いたものについても同様に実験した。以後は、実施例５と同じ方法でＨＲＰ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ＋Ｍ抗体を反応させ、次いでＴＭＢ溶液で発色させ、次いで吸光度を測定して、ＳＴ活性を算出した。結果を図４に示す。
図４から、ＮＤＳＴの用量依存的な（ＮＤＳＴ酵素液の希釈率に反比例した）ＳＴ活性が観察された。またＰＡＰＳの非存在下では、ＳＴ活性は検知できず、この酵素反応はＰＡＰＳ依存性の酵素反応であることも確認された。
（実施例８）ＳＴ活性の反応時間の依存性
実施例２で調製したプレート（ＮＡＨ−ＳＳ−ＢＳＡ固相化プレート）を３００μＬの洗浄液で３回洗浄した後、酵素反応液２を用いて８倍に希釈したＮＤＳＴ酵素液を各ウェルに５０μＬずつ添加した。その後３７℃で０、１０、２０、３０、４０又は６０分間静置して酵素反応させた。
反応終了後、ウェルを洗浄液で３回洗浄し、反応液で１μｇ／ｍＬに調製したモノクローナル抗体Ｆ５８−１０Ｅ４（生化学工業株式会社）の溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加した。その後、プレートを常温（１５〜２５℃）で６０分間静置して抗原抗体反応させた。反応液のみを含有するウェルをブランクとした。
なお、ＮＤＳＴ酵素液に代えて予め１分間煮沸したＮＤＳＴ酵素液を用いたものについても同様に実験した。
以後は、実施例５と同じ方法でＨＲＰ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ＋Ｍ抗体を反応させ、次いでＴＭＢ溶液で発色させ、次いで吸光度を測定して、ＳＴ活性を算出した。結果を図５に示す。なお図５中の黒菱形印は煮沸処理していないＮＤＳＴ酵素液を用いた実験、黒正方形印は予め１分間煮沸したＮＤＳＴ酵素液を用いた実験のデータをそれぞれ示す。
図５から、反応時間依存的なＳＴ活性が認められた。なお、１分間煮沸したものでは酵素蛋白質の熱変性によりＳＴ活性が失活することが確認された。
また、実施例７は直接的にはＳＴ活性を検出しているものであるが、ＮＤＳＴが、脱Ｎ−アセチル化を引き起こした後にＮ−硫酸化を引き起こす酵素であることを考慮すれば、ＳＴ活性が検知されたということは、その前提として脱Ｎ−アセチル化が引き起こされたことを意味しているといえる。したがって、この方法によるＳＴ活性の検出は、ＮＤ活性をも含めたＮＤＳＴ活性の検出をも同時に行うことができるものである。
また、本発明ＮＤ検出方法によって検体中のＮＤ活性を検出し、更に、本発明ＳＴ検出方法によって検体中のＳＴ活性を検出することにより、より確実にＮＤＳＴ活性の検出を行うこともできる。
（実施例９）本発明固相（ＮＡＨ−ビオチンが、アビジンを介してプレートに固着された固相）の製造
ストレプトアビジン（ＪＡＣＫＳＯＮ社製）を、ＰＢＳ（−）で２０μｇ／ｍＬに希釈した。この希釈後の溶液を、マキシソープ（登録商標）９６ウェルマイクロプレート（ＮＡＬＧＥ ＮＵＮＣ社製）の各ウェルに５０μＬずつ添加して、４℃で１４〜１８時間静置することによってウェルの表面上に均一にコーティングした。
このプレートをＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、ブロッキング物質としてＡｐｐｌｉｅＤｕｏ（商品名；生化学工業株式会社製）を５倍希釈した溶液を、また防腐剤として０．０５％プロクリン（登録商標）３００（ＳＵＰＥＬＣＯ社製）を含有するＰＢをそれぞれ添加し、常温で２時間静置した。
静置後、ブロッキング物質を十分に除去し、３７℃で２時間乾燥させることによって、ストレプトアビジンがウェルに固着されたプレートを得た（ストレプトアビジン固相化プレート）。
このストレプトアビジン固相化プレートを０．０５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（ＩＣＩ社の商標、Ｔｗｅｅｎ２０に相当する製品；和光純薬工業株式会社製）を含有するＴＢＳ（以下、「Ｔ−ＴＢＳ」という）３００μＬで３回洗浄した。その後、実施例１で製造したＮＡＨ−ビオチンをＡｐｐｌｉｅＤｕｏ（商品名；生化学工業株式会社製）を２０倍希釈した溶液及び０．０５％プロクリン３００とを含有するＴＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し、各ウェルに１００μＬずつ添加し、３７℃で３０分間静置して反応させた。
反応後、ウェルをＴ−ＴＢＳで３回洗浄して、「ＮＡＨ−ビオチンがアビジンを介してプレートに固着された固相」を製造した。
（実施例１０）ＮＤ活性の測定
実施例９で製造したプレートを用いて、実施例５と同様にＮＤＳＴ酵素のＮＤ活性を測定した。なお本実施例においては、陰性対照として、ヒトＮＤＳＴ２ ＤＮＡを組み込んでいないバキュロウイルスのみを感染させて得られた培養上清を前記実施例（８）と同様に濃縮したものを使用した（ｍｏｃｋ）。ｍｏｃｋはＮＤＳＴ酵素液と同様に希釈して測定した。結果を図６に示す。なお、図６中の黒丸印はＮＤＳＴ酵素を用いた結果を、白丸印はｍｏｃｋについての結果をそれぞれ示す。
図６から、ＮＤＳＴの用量依存的な（ＮＤＳＴ酵素液の希釈率に反比例した）ＮＤ活性が観察された。また、本プレートでは１２８０倍希釈した酵素液でもＮＤ活性を確認することができ、ＮＤ活性を高感度に測定できることが示された。また、ｍｏｃｋとの差を算出することにより、より正確にＮＤ活性を測定できることが示された。
（実施例１１）ＳＴ活性の測定
実施例９で製造したプレートを用いて、実施例７と同様にＮＤＳＴ酵素のＳＴ活性を測定した。なお本実施例においては、酵素反応液２、及び酵素反応液２中のＨＥＰＥＳに代えてＭＥＳを用いてｐＨ６．５に調整したものの何れか一方の酵素反応液を用いた。結果を図７に示す。なお、図７中の菱形印は酵素反応液２（ｐＨ７．４）を用いた結果を、正方形印はｐＨ６．５に調整した酵素反応液を用いた結果をそれぞれ示す。
図７から、酵素反応液のｐＨを６．５に調整したものを用いた方が、ＳＴ活性をより高感度に測定できることが示された。このことから、ＳＴ活性を測定する際の酵素反応時の溶液のｐＨは６〜７とすることが好ましいことが示された。
（実施例１２）酵素活性（ＮＤ活性）に影響を与える物質のスクリーニング
酵素反応液１を用いて以下の６種類の試験物質をそれぞれ２００、２０、２μｇ／ｍＬに希釈した。これらを実施例９で製造した固相（プレート）の各ウェルに２５μＬずつ添加した後すぐに「酵素反応液１で４０倍に希釈したＮＤＳＴ酵素液」を各ウェルに２５μＬずつ添加した（各試験物質の最終濃度１００、１０、１μｇ／ｍＬ、酵素液の最終希釈倍率８０倍）。
（試験物質）（括弧内は、図８中における略号を示す。）
・ＮＡＨ
・ブタ小腸由来ＨＰ（ＨＰ）
・Ｎ−硫酸化／完全脱Ｏ−硫酸化ＨＰ（ＮＳＤＳ−ＨＰ）
・鶏冠由来ヒアルロン酸（重量平均分子量１００ＫＤａ；ＨＡ）
・部分的脱Ｎ−アセチル化ＮＡＨ（ＰＤＮＡＣ−ＮＡＨ）
・ウシ腎臓由来ＨＳ（ＨＳＢＫ）
その後３７℃で６０分間静置して酵素反応させた。なお、試験物質を添加しないウェルは酵素反応液１のみを添加した。
反応終了後、ウェルをＴ−ＴＢＳで３回洗浄し、ＴＢＳで１μｇ／ｍＬに調製したモノクローナル抗体ＪＭ４０３（生化学工業株式会社）の溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加した。その後、プレートを常温（１５〜２５℃）で６０分間静置して抗原抗体反応させた。
反応後、Ｔ−ＴＢＳで３回洗浄し、ＴＢＳで２００００倍に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ＋Ｍ抗体を各ウェルに１００μＬずつ添加した。その後、プレートを常温で６０分間静置して抗原抗体反応させた。
反応後、このプレートをＴ−ＴＢＳで３回洗浄し、ＴＭＢ溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加し、常温で３０分間反応させ、発色させた。その後、反応停止液を各ウェルに１００μＬずつ添加して反応を停止させ、実施例５と同じ方法で吸光度を測定した。
また変化率（％）は、以下の計算式によって算出した。
変化率（％）＝１００ｘ（各試験物質を添加しない場合における吸光度の値−各試験物質を各濃度添加した場合における吸光度の値）／各試験物質を添加しない場合における吸光度の値）。
なお、モノクローナル抗体ＪＭ４０３は、ＮＡＨにおけるＧｌｃＮ残基（すなわち、脱Ｎ−アセチル化されたＧｌｃＮＡｃ残基）に結合することから、検出された吸光度の値が高いほどＮＡＨにおけるＧｌｃＮ残基の数が多い（すなわち、脱Ｎ−アセチル化されたＧｌｃＮＡｃ残基の数が多い）、すなわちＮＤ活性が高いことを意味する。逆に、検出された吸光度の値が低いほどＮＡＨにおけるＧｌｃＮ残基の数が少ない（すなわち、脱Ｎ−アセチル化されたＧｌｃＮＡｃ残基の数が少ない）、すなわちＮＤ活性が低いことを意味する。
そして、もし試験物質がＮＤ活性を阻害するものであれば、上記の変化率（％）は正の数となる。そしてその変化率の値が高ければ高いほど当該試験物質のＮＤに対する阻害能が高いこととなる。結果を図８に示す。なお図８中、白色のカラムは試験物質の最終濃度が１００μｇ／ｍＬの場合の結果、黒色のカラムは同じく１０μｇ／ｍＬの場合の結果、斜線のカラムは同じく１μｇ／ｍＬの結果をそれぞれ示す。
図８から、ＮＡＨ、ＨＰ、ＮＳＤＳ−ＨＰ及びＨＳＢＫは、濃度依存的にＮＤ活性を阻害する作用を有することが示された。一方、ＨＡ及びＰＤＮＡＣ−ＮＡＨは、ＮＤ活性を阻害する作用をほとんど有していなかった。
以上の結果から、ＮＤ活性を阻害する物質（ＮＤの阻害剤）としてＮＡＨ、ＨＰ、ＮＳＤＳ−ＨＰ及びＨＳＢＫを選択することができた。
また、ＮＡＨ、ＨＰ、ＮＳＤＳ−ＨＰ及びＨＳＢＫのなかでも、ＮＤ活性に対する阻害能が最も高いものとしてＨＳＢＫを、次いでＨＰ及びＮＳＤＳ−ＨＰを、最も低いものとしてＮＡＨを選択することができた。
（実施例１３）ＳＴ活性測定用の基質の検討
ＮＡＨに代えてＨＳＢＫを用い、実施例１（３）に記載の方法に従って、ビオチンがＨＳＢＫの還元末端に結合している多糖を調製した。次いで、これを実施例９に記載の方法に従ってプレートに固相化した。
また、実施例１（１）に記載の方法を用いてＮＡＨを製造し、これを用いてＮ−脱アセチル化ヘパロザンを調製し、次いでこれを用いてさまざまなロットのＮ−硫酸化ヘパロザンを調製した。
このＮ−脱アセチル化ヘパロザンは、ＮＤＳＴ２等の酵素反応を用いた方法や化学反応を用いた方法で調製することができる。化学的なグリコサミノグリカンの脱アセチル化方法として、ヒドラジン分解法（Ｐａｔｒｉｃｋ，Ｎ．ａｎｄ Ｃｏｎｒａｄ，Ｈ．Ｅ．，Ｂｉｏｃｈｅ．Ｊ．，２１７，１８７，（１９８４））とアルカリ加水分解法（Ｌｅａｌｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，３７９００（２００１））が知られているが、ここでは後者の方法で調製した。具体的には、ＮＡＨを２Ｍ水酸化ナトリウム溶液に終濃度が１０ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、６０℃で２から２４時間加熱した。加熱時間を調整することによって、脱アセチル化度の異なったＮ−脱アセチル化ヘパロザンを調製した。
次いで、このＮ−脱アセチル化ヘパロザンを上記のＬｅａｌｉ，Ｄ．らの方法に従ってＮ−硫酸化することにより、さまざまなロットのＮ−硫酸化ヘパロザンを調製した。具体的には、ＮＡＨのＮ−脱アセチル化反応終了液（Ｎ−脱アセチル化ヘパロザンを含有する）を中和した後、炭酸ナトリウムと三酸化イオウ・ピリジン複合体（ＰＳＴＣ）を終濃度がそれぞれ１５ｍＭと１０ｍＭになるように添加し、４０℃でインキュベートした。その後１時間ごとに２．５ｍＭ（終濃度）相当のＰＳＴＣを添加し、５時間反応を行った。これにより、９ロットのＮ−硫酸化ヘパロザンが得られた。これらを被験物質として用いた。
ＨＳＢＫが固相化されたプレートに、モノクローナル抗体Ｆ５８−１０Ｅ４（終濃度：１μｇ／ｍｌ）と９ロットのＮ−硫酸化ヘパロザン（２０μｇ／ウェル；カルバゾール法によるウロン酸含量をもとに補正した値）を添加して実施例７に記載の条件で抗原抗体反応させ、実施例７に記載の方法で吸光度を測定した。これは、いわゆる阻害法による測定である。抗原抗体反応液中のＮ−硫酸化ヘパロザンの濃度が０であれば、モノクローナル抗体Ｆ５８−１０Ｅ４は実質的に全て固相化されたＨＳＢＫに結合し、検出される吸光度が高くなる。一方、抗原抗体反応液中に過剰濃度のＮ−硫酸化ヘパロザンが存在すれば、モノクローナル抗体Ｆ５８−１０Ｅ４は実質的に全て抗原抗体反応液中のＮ−硫酸化ヘパロザンに結合し（固相化されたＨＳＢＫには実質的に結合せず）、検出される吸光度が低くなる。
抗原抗体反応液中のＮ−硫酸化ヘパロザン濃度が０の場合の吸光度を「阻害率０％」、抗原抗体反応液中にＮ−硫酸化ヘパロザンが過剰濃度で存在する場合の吸光度を「阻害率１００％」として、９ロット分のＮ−硫酸化ヘパロザンについて阻害率を算出した。結果を表１に示す。なお、Ｎ−硫酸化ヘパロザンに代えてＨＳＢＫを用いた結果も併せて示す。
なお表１中の「Ｍｗ」及び「Ｍｗ／Ｍｎ」は、実施例１（１）に記載の方法で求めた数値である。また、各ロットのＮ−硫酸化ヘパロザン分子における「ｄｅＮＡｃ−０Ｓ」（ＮＡＨを構成する二糖単位（ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮ）において、Ｎ位が脱硫酸化されておりかつ硫酸基を保持しないもの）、「０Ｓ」（ＮＡＨを構成する二糖単位（ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮ）において、硫酸基を保持しないもの）、及び「ＮＳ」（ＮＡＨを構成する二糖単位（ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮ）において、Ｎ位が硫酸化されているもの）の質量比（％）は、イオン交換クロマトグラフィーによって求めた。イオン交換クロマトグラフィーの条件等は以下の通りである；
硫酸化多糖および低分子化硫酸化多糖の分解酵素（ヘパリチナーゼ、ヘパリチナーゼＩ及びヘパリチナーゼＩＩ（いずれも生化学工業株式会社製）の混合物）による消化を行った後の溶液５０μｌを、ＨＰＬＣ（医理化、モデル８５２型）を用いて分析した。強アニオン交換体カラム（ダイオネックス社、ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ−１カラム４．０ｍｍ×２５０ｍｍ）を使用し、２３２ｎｍでの吸光度を測定した。４〜１２糖スタンダードを基準とし（Ｙａｍａｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，８６９６−８７０６，（１９９５））、流速１ｍｌ／分で、塩化リチウムを用いたグラジエント系（５０ｍＭ→２．５Ｍ）を用いる方法に準拠した（Ｋａｒｉｙａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０３Ｂ，４７３，（１９９２））。
なお、脱アセチル化二糖（ｄｅＮＡｃ−０Ｓ）の割合が高かったロット４及び５のＮ−硫酸化ヘパロザンについては、上記方法に従って再度Ｎ−硫酸化した。また、ロット１、３及び４のＮ−硫酸化ヘパロザンについては、以下の方法によりＮＤＳＴ酵素液で処理することで再度Ｎ−硫酸化した；
Ｎ−硫酸化ヘパロザンに、ＮＤＳＴ酵素液を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び０．１ｍＭ ＰＡＰＳを含有する溶液で１０倍希釈した溶液を添加し、３７℃で１時間インキュベートする。
これらの物質についても、同様に阻害率を算出した。ＮＤＳＴ酵素液によって再度Ｎ−硫酸化したものを用いた結果を表１中の「ＮＤＳＴ」に、三酸化イオウ・ピリジン複合体（ＰＳＴＣ）によって再度硫酸化したものを用いた結果を表１中の「再ＮＳ」に、それぞれ示す。
Figure 2007001021
表１のロット２、６、７、８及び９の結果から、モノクローナル抗体Ｆ５８−１０Ｅ４は、平均重量分子量２０ｋＤａ以上で、かつＮ−硫酸化構造（ＮＳ）が４５％以上のＮ−硫酸化ヘパロザンをヘパラン硫酸と同等に認識することが示された。また、脱アセチル化構造（ｄｅＮＡｃ−０Ｓ）が３０％を超えたＮ−硫酸化ヘパロザンはＮＳがたとえ６０％以上存在しても、当該抗体によって認識されないが、ＮＤＳＴによりＮ−硫酸化されることによって反応性が向上した（ロット３の結果）。さらに、ｄｅＮＡｃ−０Ｓが３０％を超えたロット４の当該抗体に対する反応性は低かったが、その反応性はＮＤＳＴによるＮ−硫酸化もしくは、化学的な再Ｎ−硫酸化によってヘパラン硫酸と同等になった。このことから、本発明におけるＳＴ活性を測定する際の基質（固相化させるもの）として用いるＮ−アセチル化ヘパロザン誘導体は、平均重量分子量２０ｋＤａ以上で、脱アセチル化構造が３０％を超えたものが好ましく、さらに脱アセチル化構造が３５％を超えたものがより好ましいことが示された。
（実施例１４）本発明ＮＤ検出キットの作製
以下の構成からなる本発明ＮＤ検出キットを作製した。
１．実施例２で製造したＮＡＨ−ＳＳ−ＢＳＡ固相化プレート １枚
２．モノクローナル抗体ＪＭ４０３ １本
３．ＨＲＰ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ＋Ｍ抗体 １本
４．ＴＭＢ溶液 １本
５．実施例５に記載の反応停止液 １本
６．実施例５に記載の酵素反応液１ １本
７．実施例５に記載の洗浄液 １本
８．ＮＤＳＴ標準溶液 １セット
（実施例１５）本発明ＳＴ検出キットの作製
以下の構成からなる本発明ＳＴ検出キットを作製した。
１．実施例２で製造したＮＡＨ−ＳＳ−ＢＳＡ固相化プレート １枚
２．モノクローナル抗体Ｆ５８−１０Ｅ４ １本
３．ＨＲＰ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ＋Ｍ抗体 １本
４．ＴＭＢ溶液 １本
５．実施例５に記載の反応停止液 １本
６．実施例７に記載の酵素反応液２ １本
７．実施例５に記載の洗浄液 １本
８．ＮＤＳＴ標準溶液 １セット
（実施例１６）本発明ＮＤＳＴ検出キットの作製
以下の構成からなる本発明ＮＤＳＴ検出キットを作製した。
１．実施例２で製造したＮＡＨ−ＳＳ−ＢＳＡ固相化プレート １枚
２．モノクローナル抗体ＪＭ４０３ １本
３．モノクローナル抗体Ｆ５８−１０Ｅ４ １本
４．ＨＲＰ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ＋Ｍ抗体 １本
５．ＴＭＢ溶液 １本
６．実施例５に記載の反応停止液 １本
７．実施例５に記載の酵素反応液１ １本
８．実施例７に記載の酵素反応液２ １本
９．実施例５に記載の洗浄液 １本
１０．ＮＤＳＴ標準溶液 １セット
（実施例１７）本発明ＮＤ検出キットの作製
実施例１４における「実施例２で製造したＮＡＨ−ＳＳ−ＢＳＡ固相化プレート」を「実施例９で製造したＮＡＨ−ビオチンがアビジンを介して固着されたプレート」に代えて、本発明ＮＤ検出キットを作製した。
（実施例１８）本発明ＳＴ検出キットの作製
実施例１５における「実施例２で製造したＮＡＨ−ＳＳ−ＢＳＡ固相化プレート」を「実施例９で製造したＮＡＨ−ビオチンがアビジンを介して固着されたプレート」に代えて、本発明ＳＴ検出キットを作製した。
（実施例１９）本発明ＮＤＳＴ検出キットの作製
実施例１６における「実施例２で製造したＮＡＨ−ＳＳ−ＢＳＡ固相化プレート」を「実施例９で製造したＮＡＨ−ビオチンがアビジンを介して固着されたプレート」に代えて、本発明ＮＤＳＴ検出キットを作製した。
（試験例１）サンドイッチＥＬＩＳＡを用いたＮＤ活性の測定
（１）サンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートの製造
モノクローナル抗体ＪＭ４０３（生化学工業株式会社）を、ＰＢＳ（−）で２０μｇ／ｍＬに希釈した。この希釈後の溶液を、マキシソープ（登録商標）９６ウェルマイクロプレート（ＮＡＬＧＥ ＮＵＮＣ社製）の各ウェルに５０μＬずつ添加して、４℃で１４〜１８時間静置することによってウェルの表面上に均一にコーティングした。
このプレートをＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、ブロッキング物質として防腐剤として０．０５％プロクリン（登録商標）３００（ＳＵＰＥＬＣＯ社製）を含有させたＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）をそれぞれ添加し、常温で２時間静置した。
静置後、ブロッキング物質を十分に除去し、３７℃で２時間乾燥させることによって、モノクローナル抗体ＪＭ４０３がウェルに固着されたプレートを得た。プレートは乾燥剤とともにアルミラミネート袋に封入して、冷蔵保存した。
（２）ビオチン標識ＪＭ４０３の製造
モノクローナル抗体ＪＭ４０３（生化学工業株式会社）を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）で一晩透析後、回収し、０．１Ｍ炭酸緩衝液で１ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解したＬＣ−ビオチン（ｐｉｅｒｃｅ社製）を質量比８０：１（モノクローナル抗体ＪＭ４０３：ＬＣ−ビオチン）の割合で、室温、４時間撹拌反応させた。反応後の溶液をＰＢＳ（−）で一晩透析した。透析後の溶液を回収し、０．０５％の濃度になるようにアジ化ナトリウム（和光純薬社製）を加え、冷蔵保存した。これによりビオチン標識されたモノクローナル抗体ＪＭ４０３（以下、「ビオチン標識ＪＭ４０３」という）を得た。
（３）サンドイッチＥＬＩＳＡによるＮＤ活性の測定
０．０５Ｍ ＭＥＳ、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２及び１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するｐＨ６．５の溶液を３０μＬ、ＮＤＳＴ酵素原液を２０μＬ、ＮＡＨを１０００、５００、２５０、１２５又は６２．５μｇ／ｍＬの濃度に蒸留水で溶解した溶液を１０μＬおよび蒸留水４０μＬを試験管に添加し、撹拌後３７℃で６０分間静置して酵素反応させた。ブランクとしてＮＡＨ溶液の代わりに蒸留水を１０μＬ添加し、同様に反応させた。
反応後、４５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ溶液（ｐＨ９．０）を５０μＬ加え、酵素反応を停止させた（以下、「酵素反応停止液」という）。
上記サンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートを、洗浄液３００μＬで３回洗浄した。
その後、酵素反応停止液を各ウェルに１００μＬずつ添加し、３７℃で６０分間静置して抗原−固相化抗体の複合体を形成させた。
反応後、ウェルを洗浄液で３回洗浄し、１％ ＢＳＡおよび０．０５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むＰＢＳ（−）（以下、「反応液２」という）で１μｇ／ｍＬに調製したビオチン標識ＪＭ４０３の溶液を、各ウェルに１００μＬずつ添加した。その後、プレートを３７℃で６０分間静置して抗体−抗原−固相化抗体のサンドイッチ状の複合体を形成させた。
反応後、ウェルを洗浄液で３回洗浄し、反応液２で１０００倍に希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ社製）の溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加した。その後、プレートを常温で３０分間静置してビオチン標識サンドイッチ状複合体−ストレプトアビジンの複合体を形成させた。
反応後、このプレートを洗浄液で３回洗浄し、ペルオキシダーゼの基質としてＴＭＢ溶液（ＭＯＳＳ社製）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、３７℃で１５分間反応させ、発色させた。その後、１Ｍ ＨＣｌ（和光純薬工業株式会社製）を各ウェルに１００μＬずつ添加して反応を停止させた後、波長４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）におけるＴＭＢ分解物の吸光度をウェルリーダーＳＫ６０３（登録商標；生化学工業株式会社販売）で測定した。
モノクローナル抗体ＪＭ４０３は、ＮＡＨにおけるＧｌｃＮ残基（すなわち、脱Ｎ−アセチル化されたＧｌｃＮＡｃ残基）を認識する。ＮＤ活性が高ければ、ＮＡＨにおける脱Ｎ−アセチル化部位が増加し、この脱Ｎ−アセチル化された部分はモノクローナル抗体ＪＭ４０３とビオチン標識ＪＭ４０３とでサンドイッチすることにより検知できることから、脱Ｎ−アセチル化の程度（ＮＤ活性）を検知することができる。したがって本試験例では、モノクローナル抗体ＪＭ４０３とビオチン標識ＪＭ４０３でサンドイッチされて検知された反応性をＮＤ活性として表すこととした。
このＮＤ活性は、測定された吸光度から、ブランクにおける吸光度を差し引いた値として算出した。結果を図９に示す。
図９から、ＮＤ活性は観察されたものの、ＮＡＨの用量依存的な（ＮＡＨの濃度に比例した）ＮＤ活性は観察されなかった。またその吸光度は、ＮＡＨ−ＳＳ−ＢＳＡ固相化プレート又はＮＡＨ−ＣＯＯＨ−ＢＳＡ固相化プレートを用いた場合に比して低かったことから（０．６〜０．７程度）、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＮＤ活性の検出は感度が低いことが示された。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱すること無く様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２００５年６月２８日出願の日本特許出願（特願２００５−１８８９７３）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
本発明は、ＮＤ活性、ＳＴ活性又はＮＤＳＴ活性の検出に利用することができる。また本発明は、ＮＤ、ＳＴ又はＮＤＳＴの活性を変化させる物質のスクリーニングにも利用することができ、これにより新たな医薬素材等の探索等にも利用することができる。また本発明は、ＮＤＳＴ等の酵素活性の異常に起因する疾患の検知やそのリスクの検知、病態把握等にも活用しうる。

Claims (34)

  1. 下記の群から選択される物質が、Ｎ−アセチルヘパロサン又はその誘導体に結合していることを特徴とする、修飾多糖。
    （群）蛋白質、ビオチン、抗原物質
  2. 結合が、前記の物質と、Ｎ−アセチルヘパロサン又はその誘導体の還元末端との間に形成されていることを特徴とする、請求項１に記載の修飾多糖。
  3. 蛋白質との結合が、共有結合又はアフィニティー結合である、請求項１又は２に記載の修飾多糖。
  4. 共有結合が、ジスルフィド結合、アミノアルキル結合又はアミド結合である、請求項３に記載の修飾多糖。
  5. アフィニティー結合が、ビオチン・アビジン結合である、請求項３に記載の修飾多糖。
  6. 蛋白質が、分子量１．５万〜２０万の可溶性の蛋白質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の修飾多糖。
  7. 分子量１．５万〜２０万の可溶性の蛋白質が、免疫グロブリン、アビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、アルブミン又はカゼインである、請求項６に記載の修飾多糖。
  8. アルブミンが、血清アルブミン又は卵白アルブミンである、請求項７に記載の修飾多糖。
  9. Ｎ−アセチルヘパロサンの誘導体が、下記（１）〜（３）からなる群から選ばれる物質である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の修飾多糖。
    （１）Ｎ−脱硫酸化ヘパリン又はＮ−脱硫酸化／Ｎ−アセチル化ヘパリン
    （２）Ｎ−脱硫酸化ヘパラン硫酸又はＮ−脱硫酸化／Ｎ−アセチル化ヘパラン硫酸
    （３）脱Ｎ−アセチル化ヘパロサン
  10. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の修飾多糖が固着された固相。
  11. 下記ステップ（ａ）及び（ｂ）を少なくとも含む、検体中のＮ−デアセチラーゼ活性の検出方法。
    ステップ（ａ）：請求項１０に記載の固相に、検体を接触させるステップ
    ステップ（ｂ）：前記固相に固着された請求項１〜９のいずれか１項に記載の修飾多糖における、脱Ｎ−アセチル化を検出するステップ。
  12. 脱Ｎ−アセチル化の検出が、請求項１０に記載の固相に「Ｎ−アセチルヘパロサン又はその誘導体におけるグルコサミン残基に結合する蛋白質」を接触させることにより行われる、請求項１１に記載の検出方法。
  13. Ｎ−アセチルヘパロサン又はその誘導体におけるグルコサミン残基に結合する「蛋白質」が、抗体である、請求項１２に記載の検出方法。
  14. Ｎ−アセチルヘパロサン又はその誘導体におけるグルコサミン残基に結合する抗体が、モノクローナル抗体ＪＭ４０３である、請求項１３に記載の検出方法。
  15. 下記の構成成分（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含む、検体中のＮ−デアセチラーゼ活性の検出キット。
    （Ａ）請求項１〜９のいずれか１項に記載の修飾多糖
    （Ｂ）Ｎ−アセチルヘパロサン又はその誘導体におけるグルコサミン残基に結合する蛋白質
  16. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の修飾多糖が、固相に固着されていることを特徴とする、請求項１５に記載の検出キット。
  17. Ｎ−アセチルヘパロサン又はその誘導体におけるグルコサミン残基に結合する「蛋白質」が、抗体である、請求項１５又は１６に記載の検出キット。
  18. Ｎ−アセチルヘパロサン又はその誘導体におけるグルコサミン残基に結合する抗体が、モノクローナル抗体ＪＭ４０３である、請求項１７に記載の検出キット。
  19. 下記ステップ（ｃ）及び（ｄ）を少なくとも含む、検体中のＮ−スルホトランスフェラーゼ活性の検出方法。
    ステップ（ｃ）：請求項１０に記載の固相に、検体と硫酸基供与体とを接触させるステップ。
    ステップ（ｄ）：前記固相に固着された請求項１〜９のいずれか１項に記載の修飾多糖における、Ｎ−硫酸化を検出するステップ。
  20. Ｎ−硫酸化の検出が、請求項１０に記載の固相に「Ｎ−アセチルヘパロサン又はその誘導体におけるＮ−硫酸化されているグルコサミン残基に結合する蛋白質」を接触させることにより行われる、請求項１９に記載の検出方法。
  21. Ｎ−アセチルヘパロサン又はその誘導体におけるＮ−硫酸化されているグルコサミン残基に結合する「蛋白質」が、抗体である、請求項２０に記載の検出方法。
  22. Ｎ−アセチルヘパロサン又はその誘導体におけるＮ−硫酸化されているグルコサミン残基に結合する抗体が、モノクローナル抗体Ｆ５８−１０Ｅ４又はモノクローナル抗体ＨｅｐＳＳ−１である、請求項２１に記載の検出方法。
  23. 下記の構成成分（Ａ）及び（Ｃ）を少なくとも含む、検体中のＮ−スルホトランスフェラーゼ活性の検出キット。
    （Ａ）請求項１〜９のいずれか１項に記載の修飾多糖
    （Ｃ）Ｎ−アセチルヘパロサン又はその誘導体におけるＮ−硫酸化されているグルコサミン残基に結合する蛋白質
  24. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の修飾多糖が、固相に固着されていることを特徴とする、請求項２３に記載の検出キット。
  25. Ｎ−アセチルヘパロサン又はその誘導体におけるＮ−硫酸化されているグルコサミン残基に結合する「蛋白質」が、抗体である、請求項２３又は２４に記載の検出キット。
  26. Ｎ−アセチルヘパロサン又はその誘導体におけるＮ−硫酸化されているグルコサミン残基に結合する抗体が、モノクローナル抗体Ｆ５８−１０Ｅ４又はモノクローナル抗体ＨｅｐＳＳ−１である、請求項２５に記載の検出キット。
  27. 請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法によって検体中のＮ−デアセチラーゼ活性を検出し、かつ、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法によって検体中のＮ−スルホトランスフェラーゼ活性を検出することを特徴とする、検体中のＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ活性の検出方法。
  28. 下記の構成成分（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を少なくとも含む、検体中のＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ活性の検出キット。
    （Ａ）請求項１〜９のいずれか１項に記載の修飾多糖
    （Ｂ）Ｎ−アセチルヘパロサン又はその誘導体におけるグルコサミン残基に結合する蛋白質
    （Ｃ）Ｎ−アセチルヘパロサン又はその誘導体におけるＮ−硫酸化されているグルコサミン残基に結合する蛋白質
  29. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の修飾多糖が、固相に固着されていることを特徴とする、請求項２８に記載の検出キット。
  30. Ｎ−アセチルヘパロサン又はその誘導体におけるグルコサミン残基に結合する「蛋白質」が、抗体である、請求項２８又は２９に記載の検出キット。
  31. Ｎ−アセチルヘパロサン又はその誘導体におけるグルコサミン残基に結合する抗体が、モノクローナル抗体ＪＭ４０３である、請求項３０に記載の検出キット。
  32. Ｎ−アセチルヘパロサン又はその誘導体におけるＮ−硫酸化されているグルコサミン残基に結合する「蛋白質」が、抗体である、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の検出キット。
  33. Ｎ−アセチルヘパロサン又はその誘導体におけるＮ−硫酸化されているグルコサミン残基に結合する抗体が、モノクローナル抗体Ｆ５８−１０Ｅ４又はモノクローナル抗体ＨｅｐＳＳ−１である、請求項３２に記載の検出キット。
  34. 下記ステップ（ｅ）〜（ｇ）を少なくとも含む、下記の酵素群から選択される１又は２以上の酵素の活性を変化させる物質のスクリーニング方法。
    ステップ（ｅ）：下記の酵素群から選択される１又は２以上の酵素の活性を変化させる可能性のある試験物質を、当該酵素と共存させるステップ。
    ステップ（ｆ）：ステップ（ｅ）により得られる「前記試験物質と前記酵素との共存物」を検体とし、請求項１１〜１４、請求項１９〜２２及び請求項２７のいずれか１項に記載の方法によって、前記酵素の活性を検出するステップ。
    ステップ（ｇ）：ステップ（ｆ）により検出された酵素の活性と、ステップ（ｅ）で用いた酵素を検体としてステップ（ｆ）と同一の検出方法によって検出される酵素の活性とを比較して、下記の酵素群から選択される１又は２以上の酵素の活性を変化させる試験物質を選択するステップ。
    （酵素群）Ｎ−デアセチラーゼ、Ｎ−スルホトランスフェラーゼ、Ｎ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ
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