JPWO2004015055A1 - 単一細胞操作支援ロボット - Google Patents
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Abstract
Description
それゆえこの発明は、作業者が自ら実行することが困難な作業を作業者の指示に従って実行することによって多目的な単一細胞操作作業を支援するロボットを提供することを目的とする。またこの発明は、多くの単一細胞をナンバリングして識別可能にするロボットを提供することを目的とする。
かかる単一細胞操作支援ロボットにあっては、顕微鏡と、単一細胞に試料を注入する試料注入手段を顕微鏡のステージ上に設けられた細胞収納用マイクロウェルに対して相対移動させる試料注入移動手段と、単一細胞を保持する細胞保持手段を顕微鏡のステージ上にそれぞれ設けられた細胞収納用マイクロウェルおよび単一細胞刺激装置と試料注入手段とのそれぞれに対し相対移動させる細胞移動手段と、単一細胞刺激装置と、顕微分光計測装置等の単一細胞計測装置との内の少なくとも一つの作動を、少なくとも一つのコンピュータが、あらかじめ与えられたプログラムに基づき自動制御するとともに、それら顕微鏡と試料注入移動手段と細胞移動手段と単一細胞刺激装置と単一細胞計測装置との内の少なくとも一つを、マニュアル操作手段がコンピューターに信号を入力して作動させる。
従って、この発明の単一細胞操作支援ロボットによれば、高い位置精度と迅速な移動とが要求される、単一細胞の保持・移動や、単一細胞に近接する位置への試料注入手段の移動や、それらの作業の間の顕微鏡の倍率変更や、単一細胞の刺激や、その後の、顕微分光計測装置等の単一細胞計測装置による計測を自動的に行うことができるので、所要に応じてそれらの操作の一部または全てを自動化し得て、作業者の負担を大幅に削減することができ、これにより作業者は、特に注意を要する単一細胞内への試料の注入や計測結果の分析判断等の作業に専念することができる。
なお、この発明の単一細胞操作支援ロボットにおいては、前記細胞収納用マイクロウェルが、1個の単一細胞に対する専用ウェルとしてそれぞれ使用し得る複数のウェルが所定配置で並べて配置されているマルチマイクロウェルであると好ましい。一連の細胞操作を通じて複数のウェルをそれぞれ1個の単一細胞に対する専用ウェルとして使用でき、しかも複数のウェルが所定配置で並べて配置されているので、複数の単一細胞をそれらを収納するウェルの位置に基づきナンバリングして識別し得て、より条件設定の細かい細胞操作を行い得るからである。
また、この発明の単一細胞操作支援ロボットにおいては、前記試料注入移動手段が、前記顕微鏡のステージ上に設けられて前記細胞収納用マイクロウェルおよび単一細胞刺激装置を前記ステージに対し移動させるオートステージを有していると好ましい。試料注入手段側の移動範囲を狭め得て、細胞移動手段との干渉を容易に防止し得るからである。
さらに、この発明の単一細胞操作支援ロボットにおいては、前記試料注入移動手段が、前記試料注入手段を前記ステージに対し移動させるマニピュレーターを有していると好ましい。より細かい注入操作ができるからである。
さらに、この発明の単一細胞操作支援ロボットにおいては、前記細胞移動手段が、前記顕微鏡のステージ上に設けられて前記細胞収納用マイクロウェルおよび単一細胞刺激装置を前記ステージに対し移動させるオートステージを有していると好ましい。細胞保持手段側の移動範囲を狭め得て、試料注入移動手段との干渉を容易に防止し得るからである。そして、そのオートステージは前記試料注入移動手段と共用すると、移動のための機構を簡略化し得て、スペース効率上および製作コスト上、より好ましい。
そして、この発明の単一細胞操作支援ロボットにおいては、前記細胞移動手段が、前記細胞保持手段を前記ステージに対し移動させるマニピュレーターを有していると好ましい。より細かい移動操作ができるからである。
さらに、この実施例の単一細胞操作支援ロボットは、顕微鏡1と顕微分光計測装置10との内の少なくとも一つの作動をあらかじめ与えられたプログラムに基づき自動制御するパーソナルコンピューター(PC)11と、単一細胞刺激装置5と試料注入移動装置7と細胞移動装置9とオートステージ2との内の少なくとも一つの作動をあらかじめ与えられたプログラムに基づき自動制御するもう一つのパーソナルコンピューター(PC)12と、作業者による操作に基づきPC11,12に信号を入力して顕微鏡1と単一細胞刺激装置5と試料注入移動装置7と細胞移動装置9と顕微分光計測装置10とオートステージ2との内の少なくとも一つを上記操作に対応させて作動させるマニュアル操作手段としての、二つのジョイスティック型コントローラー13,14およびキーボード15とインターフェース16とを有するマニュアル操作装置17と、を具えている。なお、作業者Pは、顕微鏡1を覗きながらあるいは顕微鏡像のモニター画像を見ながら、ジョイスティック型コントローラー13,14を操作することで、オートステージ2、試料注入移動装置7および細胞移動装置9の作動を制御することができる。そしてPC11,12は、インターフェース16を介した上記各要素の監視、自動制御およびマニュアル制御、計測データの記録および画像処理等に必要な演算や解析を行う。
この実施例の単一細胞操作支援ロボットでは、顕微鏡1には、オリンパス光学工業株式会社製の、落射蛍光装置(励起光照射装置)付きの倒立型蛍光顕微鏡IMT−2を用いる。また、オートステージ2は、中央精機株式会社製の通常の2軸直交座標型移動テーブル(2軸電動制御)からなる。さらに、試料注入移動装置7は、エッペンドルフ社製の3自由度マニピュレーター(x,y,z軸、xy平面からの角度θの内の3自由度を電動制御)で株式会社ナリシゲ製の1軸直線作動型マイクロマニピュレーター(手動操作油圧作動式)を支持し、その1軸直線作動型マニピュレーターで通常のインジェクションホルダーを支持してなり、単一細胞に試料を注入するガラスキャピラリー6は、そのインジェクションホルダーに取り付けて4自由度で移動可能としている。
またこの実施例の単一細胞操作支援ロボットでは、細胞移動装置9は、通常の3軸直交座標型マニピュレーターで1軸直線作動型マニピュレーターを支持し、その1軸直線作動型マニピュレーターで通常のインジェクションホルダーを支持してなり、単一細胞を保持するもう一つのガラスキャピラリー8は、そのインジェクションホルダーに取り付けて4自由度で移動可能としている。
さらにこの実施例の単一細胞操作支援ロボットでは、細胞収納用マルチマイクロウェル4は、顕微鏡視野内において、ウェル内溶液中への細胞1個の収納、ウェル内での刺激印加の操作、細胞の光学的・電気的・電気化学的・物理的測定、ウェルから他の場所への移送等を行うため、塩化ビニル板の表面に単一細胞の収納用の直径約100μmの窪みであるウェル4aを所定の2箇所に所定間隔で縦5個×横10個ずつ合計100個並べて形成したマルチマイクロウェルであり、また単一細胞刺激装置5は、細胞収納用マルチマイクロウェルから取り出した細胞に、顕微鏡視野内の他所で、電気的・熱的・機械的あるいは化学的刺激を印加する微小デバイスであり、図1に示す例では、細胞に電気的刺激を印加するために、図8に示すように2枚のPt(プラチナ)板電極5aをそれぞれアクリル板5bと透析膜5cとで挟み、各Pt板電極5aにPtリード線5dを設けてなるものである。なお、ここでは試料注入移動装置7も、細胞収納用マルチマイクロウェル内に挿入されて細胞に電気的,熱的,機械的または化学的刺激を印加する微小デバイスとなり、単一細胞刺激装置を構成する。
そして、この実施例の単一細胞操作支援ロボットでは、顕微分光計測装置10には、東京農工大学と株式会社ジェネシアとが共同で開発し、既に公知にした、空間解像度が1μm×1μm以上、波長分解能が400nm〜800nmの範囲で5nm以上、時間分解能が5秒毎に1画像記録可能、という性能を有するスペクトロイメージング装置を用いる。
次に、上記実施例の単一細胞操作支援ロボットを使用した、イネ単一細胞への遺伝子導入とCa2+導入刺激による遺伝子発現実験について説明する。
〔細胞の培養〕
イネ(Oryza sativa L.japonica cv.Nipponbare)の種籾を培養し、カルス化させたものを1.0mmメッシュの金網で濾別して用いた。100mlフラスコに27mlの専用培地を入れ、そこで回転培養(100rpm、25℃、暗所)した。一週毎に継代して培養を続け、最終の継代後、4日目の培養細胞を以下の実験に用いた。
〔プラスミドの調製(プラスミドとは環状DNAで、このリングの中に遺伝子を組み込むことができる)〕
クロンテック(CLONTECH)社より購入したプラスミド35S−GFPは、植物細胞の中ではいつでも遺伝子発現をさせることができる「35S」と呼ばれるプロモーターにグリーン蛍光タンパク(green fluorescent protein;GFP)の遺伝子を結合させたものが組み込まれている。従って、これを植物細胞に導入すれば細胞内にGFPが生成し緑色の蛍光を発するようになる。
このプラスミドの35Sプロモーターの部分を、イネキチナーゼ(CHI)遺伝子のプロモーターと入れ換えたものである、図2に示す如きpCHI−GFPを作成し、以後の実験で使用した。これを導入した細胞では、エリシター(カビの細胞壁の構成成分であるキチンの構造をもったオリゴ糖)を作用させると、元々キチナーゼ遺伝子が発現するはずであるが、キチナーゼの代わりにGFPの遺伝子が組み込まれているので、「キチナーゼ遺伝子発現」の情報が「GFP」の生成によって可視化できる。これを顕微蛍光計測する。
〔イネプロトプラストの調製〕
植え継ぎ後4日のイネカルスを用いてプロトプラストを調製した。即ち、カルス懸濁液から上清を除去した後、洗い液(0.4Mマンニトール溶液)を加え洗浄した。これに、酵素液10mlを加え、30℃、30rpm、暗所で一時間振とうし、引き続き2時間、30℃で静置培養した。培養後、プロトプラストは、40μmφのナイロンメッシュを通して、50ml遠心管に回収した。次に、遠心管を再度、1000rpmで60秒遠心し、プロトプラストを沈殿させた。上清の酵素液を除去した後、プロトプラスト用培地を5ml加えてプロトプラストを懸濁させた。プロトプラストとは細胞壁を除去した細胞であるが、以下では単に「細胞」と表記することとする。
なお、上記洗い液と酵素液の組成は次の通りである。
a.洗い液(0.4Mマンニトール溶液)
マンニトール 36.43g
蒸留水 500ml
b.酵素液(pH5.6)
ペクトリアーゼ Y−23 0.05g
セルラーゼ オノズカ RS 2.0g
CaCl2−2H2O 0.23ml
Kデキストランサルフェート 0.1g
マンニトール 9.0g
蒸留水 200ml
〔細胞の保持および移動に用いるガラスキャピラリー6の作製〕
一本型ガラスキャピラリー(直径1mm)(GD−1、株式会社ナリシゲ製)をエタノールで洗浄し、3時間乾熱機で滅菌した。これを二段引きプラー(PP83、株式会社ナリシゲ製)で引き、さらにマイクロフォージ(MF−83、株式会社ナリシゲ製)で先端を丸めた。最終的にキャピラリーの先端部は外径=約50μm、内径=約20μmになるようにした。
〔細胞の刺入に用いるガラスキャピラリー8の作製〕
滅菌したガラスキャピラリーをレーザープラー(P−2000、SUTTER INSTRUMENT Co.)で引き、先端径が1μm以下になるようにした。
〔プラスミドのインジェクション〕
図3に示すように、先ず、1.0μg・μl−1に調整したプラスミド35S−GFP溶液を、細胞刺入用のガラスキャピラリー8内に注入した。このガラスキャピラリー8を前記インジェクションホルダーに保持させるとともにピコポンプに接続して、窒素ガスの圧力をかけてGFPの遺伝子Geを注入できるようにした。一方、細胞保持用のガラスキャピラリー6は、もう一方の前記インジェクションホルダーに固定し、内部を純水で充填するとともにインジェクターに接続して、そのインジェクターで細胞Ceを吸引保持できるようにした。
次いで、マルチマイクロウェル4を装着した培養ディッシュ3を、顕微鏡1のステージ1a上に載せて固定し、図3中▲1▼で示すように、ディッシュ3の底に分散された細胞(直径約20〜30μm)Ce1個を選び、これを図3中▲2▼で示すように、細胞保持用のガラスキャピラリー6で吸引保持した。この細胞Ceの原形質内に試料注入移動装置7を用いて、図3中▲3▼で示すように細胞刺入用のガラスキャピラリー8を刺入し、ピコポンプでガラスキャピラリー8内に圧力をかけて遺伝子Geを細胞内部に注入した。遺伝子注入(マイクロインジェクション)を行った細胞Ceは、PC12で自動制御したオートステージ2と細胞移動装置9の各マニピュレーターとにより、図3中▲4▼,▲5▼で示すように移動させて、マルチマイクロウェル4の所定番地のウェル4a内に収納し、ナンバリング(番号付け)した。このようにして50個あるいは100個の細胞に対するマイクロインジェクション及び細胞収納操作を終了した後、図3中▲6▼で示すように、それらの細胞Ceを25℃で24時間静置培養した。
〔Ca2+の細胞内インジェクション〕
24時間の培養によって、細胞Ceはウェルの底面に接着した。この細胞Ceに試料注入移動装置7を用いて、図4に示すように、CaCl2(1μM,10μM,または100μM)を充填した細胞刺入用のガラスキャピラリー8を刺入し、Ca2+を注入した。その後さらに24時間25℃で培養を続けた後、図5に示すように、顕微鏡1及び顕微分光分析装置10を用いて細胞Ceを撮影し、GFPの生成の有無を顕微蛍光計測で調べた。なお、図中符号18はグリズム、19はCCDカメラを示す。
〔キチナーゼ遺伝子の発現測定〕
Ca2+のインジェクションによってキチナーゼ遺伝子が発現した頻度は、CaCl2の濃度が1μM,10μM,100μMのときそれぞれ、18%(50細胞中9個),12%(50細胞中6個),0%(50細胞中0個)であった。
最後に、上記実施例の単一細胞操作支援ロボットを使用した、イネ単一細胞への遺伝子導入と電気的刺激による遺伝子発現実験について説明する。なお、細胞の培養と、プラスミドの調製と、イネプロトプラストの調製と、細胞の保持および移動に用いるキャピラリー6の作製と、細胞刺入用のキャピラリー8の作製との手順は、先の実験と同様ゆえ説明を省略する。
〔プラスミドのインジェクション〕
図6に示すように、各ウェル4aの直径が100〜200μmであるマルチマイクロウェル4に細胞Ceを収納する以外は、先の実験と同様である。
〔Fura2の細胞内への導入〕
マルチマイクロウェル4で培養した細胞に対して、DMSOに溶解させたFura2−AM(DOJINDO)を終濃度4μMになるように添加し、これを30℃、暗所、静置にて1時間取り込ませた。そして細胞外液を新鮮な培地と交換した後、以下の電気刺激実験を行った。
〔電気刺激の印加〕
図7中▲1▼で示すように、マルチマイクロウェル4内の細胞Ceを、ホールド用のキャピラリー6で保持し、図7中▲2▼〜▲4▼で示すように、図8に示す如き単一細胞刺激装置5のPt板電極5a間に移動して、図7中▲5▼で示すように静置し、Pt電極5a間にパルサー5eからアイソレーター5fおよびPtリード線5dを介して30Vの直流パルス電圧を30秒間印加した。この電気的刺激の印加後、図9中▲1▼〜▲5▼で示すようにして細胞Ceを再び元のウェル4aに収納し、25℃で24時間培養した。
〔キチナーゼ遺伝子の発現測定〕
先の実験と同様にして顕微蛍光計測で100個の細胞を調べた結果、電気的刺激によって細胞内Ca2+濃度の一過性の上昇(25秒程度でピークに達し、50秒後に元のレベルにもどった)が見られた細胞が6個あった。これらの細胞は全て遺伝子も発現した。次のケースは、徐々に増大するパターン(100秒くらいでピークに達し、その後徐々に減少したが元のレベルには戻らなかった)を示した細胞が2個認められた。この細胞でも遺伝子発現が認められた。一方、Ca2+濃度変化の見られなかった細胞では、遺伝子発現が認められなかったが、最後にエリシターを作用させたところ、遺伝子発現がみとめられたものが6個あった。以上の結果、電気的刺激によってCa2+の細胞内への流入を介してキチナーゼ遺伝子発現が誘導されることが示された。
かくしてこの実施例の単一細胞操作支援ロボットによれば、高い位置精度と迅速な移動とが要求される、単一細胞Ceの保持・移動や、単一細胞Ceに近接する位置への細胞刺入用ガラスキャピラリー8の移動や、単一細胞Ceの刺激や、その後の顕微分光計測等を自動的に行うことができるので、所要に応じてそれらの操作の一部または全てを自動化し得て、作業者の負担を大幅に削減することができ、これにより作業者は、特に注意を要する単一細胞Ce内への試料(遺伝子やCa2+)の注入や計測結果の分析判断等の作業に専念することができる。
しかもこの実施例の単一細胞操作支援ロボットによれば、細胞収納用マイクロウェルが、1個の単一細胞に対する専用ウェルとしてそれぞれ使用し得る複数のウェル4aが所定配置で並べて配置されたマルチマイクロウェル4であることから、一連の細胞操作を通じて複数のウェル4aをそれぞれ1個の単一細胞に対する専用ウェルとしで使用でき、しかも複数のウェル4aが所定配置で並べて配置されているので、複数の単一細胞をそれらを収納するウェル4aの位置に基づきナンバリングして識別し得て、より条件設定の細かい細胞操作を行うことができる。
またこの実施例の単一細胞操作支援ロボットによれば、試料注入移動手段が、顕微鏡1のステージ1a上に設けられて細胞収納用マルチマイクロウェル4および単一細胞刺激装置5をステージ1aに対し移動させるオートステージ2を有しているので、試料注入移動装置7によるガラスキャピラリー8の移動範囲を狭め得て、細胞移動装置9との干渉を容易に防止することができる。
さらにこの実施例の単一細胞操作支援ロボットによれば、試料注入移動手段を構成する試料注入移動装置7が、ガラスキャピラリー8をステージ1aに対し移動させるマニピュレーターを有しているので、より細かい注入操作ができる。
さらにこの実施例の単一細胞操作支援ロボットによれば、細胞移動手段が、顕微鏡1のステージ1a上に設けられて細胞収納用マルチマイクロウェル4および単一細胞刺激装置5をステージ1aに対し移動させるオートステージ2を有しているので、細胞移動装置9によるガラスキャピラリー6の移動範囲を狭め得て、試料注入移動装置7との干渉を容易に防止することができる。そして細胞移動手段が、そのオートステージ2を試料注入移動手段と共用しているので、移動のための機構を簡略化し得て、スペース効率を高め得るとともに製作コストを削減することができる。
そしてこの実施例の単一細胞操作支援ロボットによれば、細胞移動手段を構成する細胞移動装置9が、ガラスキャピラリー6をステージ1aに対し移動させるマニピュレーターを有しているので、より細かい移動操作ができる。
以上、図示例に基づき説明したが、この発明は上述の例に限定されるものでなく、例えば、試料注入移動手段及び細胞移動手段をオートステージ2なしでマニピュレータのみで構成しても良く、また試料を注入するインジェクターの操作も電磁ソレノイド等で行ってコンピューター制御で自動化しても良い。さらにマニュアル操作手段は押しボタンスイッチや足踏みスイッチ等を有していても良い。また顕微鏡1はパーソナルコンピューター11により自動制御またはマニュアル制御される対物レンズ倍率電動切換え装置を具えていても良い。そして単一細胞計測装置は顕微分光計測装置以外のものでも良い。
Claims (6)
- 顕微鏡と、
前記顕微鏡のステージ上にそれぞれ設けられた細胞収納用マイクロウェルおよび単一細胞刺激装置と、
単一細胞に試料を注入する試料注入手段を前記細胞収納用マイクロウェルに対して相対移動させる試料注入移動手段と、
単一細胞を保持する細胞保持手段を前記細胞収納用マイクロウェルと前記単一細胞刺激装置と前記試料注入手段とのそれぞれに対し相対移動させる細胞移動手段と、
前記顕微鏡に組み合わされた単一細胞計測装置と、
前記顕微鏡と前記試料注入移動手段と前記細胞移動手段と前記単一細胞刺激装置と前記単一細胞計測装置との内の少なくとも一つの作動をあらかじめ与えられたプログラムに基づき自動制御する少なくとも一つのコンピューターと、
作業者による操作に基づき前記コンピューターに信号を入力して前記顕微鏡と前記試料注入移動手段と前記細胞移動手段と前記単一細胞刺激装置と前記単一細胞計測装置との内の少なくとも一つを前記操作に対応させて作動させるマニュアル操作手段と、
を具えてなる、単一細胞操作支援ロボット。 - 前記細胞収納用マイクロウェルは、1個の単一細胞に対する専用ウェルとしてそれぞれ使用し得る複数のウェルが所定配置で並べて配置されているマルチマイクロウェルであることを特徴とする、請求の範囲第1項記載の単一細胞操作支援ロボット。
- 前記試料注入移動手段は、前記顕微鏡のステージ上に設けられて前記細胞収納用マイクロウェルおよび単一細胞刺激装置を前記ステージに対し移動させるオートステージを有することを特徴とする、請求の範囲第1項記載の単一細胞操作支援ロボット。
- 前記試料注入移動手段は、前記試料注入手段を前記ステージに対し移動させるマニピュレーターを有することを特徴とする、請求の範囲第1項記載の単一細胞操作支援ロボット。
- 前記細胞移動手段は、前記顕微鏡のステージ上に設けられて前記細胞収納用マイクロウェルおよび単一細胞刺激装置を前記ステージに対し移動させるオートステージを有することを特徴とする、請求の範囲第1項記載の単一細胞操作支援ロボット。
- 前記細胞移動手段は、前記細胞保持手段を前記ステージに対し移動させるマニピュレーターを有することを特徴とする、請求の範囲第1項記載の単一細胞操作支援ロボット。
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